ES2300150T3 - Gen que participa en la produccion del acido homo-glutamico y utilizacion del mismo. - Google Patents

Gen que participa en la produccion del acido homo-glutamico y utilizacion del mismo. Download PDF

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Abstract

Un ADN puro aislado que contiene un gen que participa en la producción de ácido L-homoglutámico, obtenible de una bacteria perteneciente a Flavobacterium lutescens, o un modificador que hibrida con el gen en condiciones restrictivas y tiene una función capaz de recuperar la capacidad productora de ácido L-homoglutámico de un mutante de Flavobacterium lutescens que carece de capacidad productora, donde el gen que participa en la producción de ácido L-homoglutámico es un ADN que codifica parcial o totalmente al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste en una proteína que tiene actividad L-lisina:ácido 2-oxoglutárico 6-aminotransferasa (a) y una proteína que tiene actividad deshidrogenasa de ácido piperidino-6-carboxílico (b), donde el último ADN es un ADN que contiene la secuencia de bases continua desde la base 801 a la base 2276 del SEQ ID NO: 1 (a) o un ADN que contiene la secuencia de bases continua desde la base 2855 a la base 4384 del SEQ ID NO: 3 (b).

Description

Gen que participa en la producción del ácido homo-glutámico y utilización del mismo.
Campo técnico
Esta invención se refiere a manipulación génica, y más específicamente, se refiere a un ADN que contiene un gen que participa en la producción de ácido L-homoglutámico (también referido como ácido L-2-aminoadípico o ácido L-\alpha-aminoadípico), y a un sistema de producción de ácido L-homoglutámico (en adelante, referido meramente como ácido homoglutámico) que lo utiliza.
Técnica antecedente
El ácido homoglutámico se encuentra ampliamente en organismos tales como plantas que incluyen Cholera vibrio como bacteria y el maíz (Zea mays), los embriones de ranas. El ácido homoglutámico actúa como un intermedio de la biosíntesis de lisina en hongos, etc. y como precursor en la biosíntesis de antibióticos beta-lactámicos. Adicionalmente, el ácido homoglutámico también es útil como intermedio sintético de diversos medicamentos incluyendo los derivados de metotrexato (WO 92/09436).
Puesto que la preparación de ácido homoglutámico mediante síntesis química necesita resolución óptica y una reacción de múltiples etapas, no es un método útil desde el aspecto de los costes. Por otra parte, se conoce un procedimiento de preparación de ácido homoglutámico a partir de L-lisina utilizando un microorganismo perteneciente al género Agrobacterium, Klebsiella, Alcaligenes, Brevibacterium o Bacillus (Publicación de Patente Japonesa Abierta a la Inspección Pública Núm. 6-181787). Parte de los autores de la presente invención también propusieron un procedimiento para la preparación de ácido homoglutámico a partir de L-lisina utilizando un microorganismo perteneciente al género Flavobacterium (Publicación WO 96/31616). No obstante, incluso en el procedimiento en el que se utiliza semejante microorganismo, se desea fervorosamente un procedimiento capaz de preparar ácido homoglutámico más eficazmente.
De este modo, los autores de la presente invención pretendieron reforzar el sistema de producción de ácido homoglutámico en cualquiera de los microorganismos anteriores, por ejemplo mediante manipulación génica. Cuando se realiza una revisión de la información provechosa sobre la manipulación, por ejemplo, como parte de las búsquedas de rutas biosintéticas de cefamicina C, se confirman la presencia de lisina-6-aminotransferasa y L-\Delta^{1}-piperidino-carboxilato deshidrogenasa que participan en la conversión de L-lisina en ácido alfa-aminoadípico (o ácido homoglutámico) de Streptomyces clavuligerus como actinomiceto productor de cefamicina C, y en cuanto a la primera, la presencia de la posición del gen que codifica la enzima, etc. (Fuente et al., Biochem. J. (1997) 327, 59-64).
Por otra parte, Madduri et al. (Journal of Bacteriology (1991) 173(3), 985-988) informan de la clonación y localización de un gen que dirige la lisina \varepsilon-aminotransferasa, una enzima que inicia la biosíntesis de \beta-lactama en Streptomyces spp. Asimismo establecen que en actinomicetos que producen antibióticos \beta-lactámicos de tipo cefemo, la lisina \varepsilon-aminotransferasa es la enzima inicial en la conversión de lisina en ácido \alpha-aminoadípico. Los autores utilizaron un procedimiento de dos etapas ("paseo cromosómico") para escrutar una genoteca lambda para ADN genómico de Streptomyces clavuligerus en cuanto a fragmentos que expresaron actividad lisina \varepsilon-aminotransferasa en S. lividans. El análisis de restricción del ADN clonado confirmó la localización del supuesto gen lat en la agrupación de genes de biosíntesis de \beta-lactama, más o menos a medio camino entre pcbC, el gen estructural para la isopenicilina N sintetasa, y el supuesto gen cefE que codifica la desacetoxicefalosporina C sintetasa.
En cuanto a Flavobacterium lutescens (que fue identificado de nuevo a partir de Flavobacterium fuscum) IFO 3084 utilizado en el bioanálisis de L-lisina, se sabe que está presente la 2-oxoglutarato 6-aminotransferasa [o lisina 6-aminotransferasa (en adelante referida también como LAT)] que cataliza la siguiente ruta (Soda et al., Biochemistry 7 (1968), 4102-4109, ídem. 4110-4119).
1
En el bioanálisis anterior, se mide la absorbancia del producto obtenido haciendo reaccionar ácido piperidino-6-carboxílico (en adelante, también referido como P6C) con o-aminobenzaldehído. En otro bioanálisis de L-lisina, se utiliza la actividad L-lisina 6-deshidrogenasa de Agrobacterium tumefaciens (Misono et al., J. Biochem. (Tokyo) 105 (1989), 1002-1008).
La cepa IFO 3084 anterior se utiliza comúnmente en el bioanálisis de L-lisina mencionado antes, y su método de utilización también está establecido. Por lo tanto, si la cepa IFO 3084 tenía un gen que codificaba una proteína que tenía actividad P6C (o, el semialdehído de ácido 2-aminoadipico que se dice que está en un estado de equilibrio cuantitativo con P6C en el ser vivo) deshidrogenasa (en adelante, referida también meramente como deshidrogenasa), además de LAT, la cepa sería una bacteria candidato para la clonación génica que satisfaría el objeto de la presente invención, esto es el objeto de proporcionar un gen que participa en la producción de ácido homoglutámico.
Por otra parte, Yagi et al. (Biochimica et Biophysica Acta (1980) 614(1), 63-70) describen un procedimiento de purificación novedoso de L-lisina 6-aminotransferasa de Flavobacterium lutescens, que tiene un peso molecular de aproximadamente 116.000, donde la cromatografía de afinidad con L-lisilacetamidododecil-Sefarosa 6B fue sustituida por tratamiento con calor.
Coque et al. (Journal of Bacteriology (1991) 173(19), 6258-6264) descubrieron un gen que codificaba lisina 6-aminotransferasa y encontraron que este gen se localizaba aguas arriba de los genes pcbAB (que codifica \alpha-aminoadipil-cisteinil-valina sintetasa) y pcbC (que codifica isopenicilina-N sintetasa) en la agrupación de genes biosintéticos de cefamicina tempranos en Nocardia lactamdurans. Este gen contiene un marco de lectura abierto de 1.353 nucleótidos (G+C 71,4%) que codifica una proteína de 450 aminoácidos con una masa molecular deducida de 48.811 Da. La expresión de fragmentos de ADN que portan el gen lat de Streptomyces lividans condujo a una elevada actividad lisina 6-aminotransferasa que estaba ausente de S. lividans no transformado. La enzima fue purificada parcialmente a partir de S. lividans (pULBS8) y mostró una masa molecular de 52.800 Da calculada mediante filtración en gel con Sephadex y electroforesis en gel de poliacrilamida. Las secuencias de ADN que hibridaban fuertemente con el gen lat de N. lactamdurans se encontraron en cuatro especies de Streptomyces productoras de cefamicina pero no en otros cuatro actinomicetos que no se sabe que producen \beta-lactamas, sugiriendo que el gen es específico para la biosíntesis de \beta-lactama y que no está implicado en el catabolismo general de la lisina. La proteína codificada por el gen lat mostró similitud con las orinitina-5-aminotransferasas y las N-acetilornitina-5-aminotransferasas y contenía una secuencia de aminoácidos consenso de unión a piridoxalfosfato en torno a la Lys 300 de la proteína. Se comentan las implicaciones evolutivas del gen lat como verdadero gen biosintético de \beta-lactama.
Descripción de la invención
Los autores de la presente invención han intentado clonar el gen (lat) de la lisina-6-aminotransferasa (LAT) de Flavobacterium lutescens y, de acuerdo con las circunstancias, un gen que codifica una proteína que tiene actividad deshidrogenasa sobre P6C de la bacteria. No obstante, como métodos de clonación utilizados regularmente para semejante caso, en las primeras investigaciones han fracasado el método de obtención de un gen buscado de las secuencias consenso de ADN entre aminotransferasas y otras bacterias, y el método de utilización de la información obtenida de la secuenciación de aminoácidos resultante de una proteína purificada, y similares.
No obstante, inesperadamente, han encontrado que cuando se utiliza el sistema anfitrión-vector seleccionado finalmente por el autor de la presente invención, se puede clonar un gen capaz al menos de participar en la producción de ácido homoglutámico, más específicamente un gen que codifica una proteína que tiene actividad deshidrogenasa sobre P6C mediante clonación con pistola génica. Han encontrado también que un modificador que tiene cierta homología (o identidad) con el gen funciona de un modo similar.
Por otra parte, en la publicación de Soda et al., Biochemistry 7 (1968), 4110-4119 se describe un procedimiento de obtención de LAT cristalina de peso molecular 116.000 de Achromobactor liquidum(= Flavobacterium lutescens), y Yagi et al., en J. Biochem. 87 (1980), 1395-1402 describen que la LAT de Flavobacterium lutescens está formada por cuatro subunidades no idénticas A, B1, B2 y C. Estas primeras búsquedas de clonación de un gen que codifica una proteína que tiene actividad LAT utilizando la información obtenida de la secuenciación de aminoácidos de la proteína LAT purificada, basada en estas descripciones, no han tenido éxito. No obstante, utilizando un procedimiento completamente diferente de los procedimientos descritos en estas referencias de la técnica anterior, los autores de la presente invención han purificado proteínas que tienen actividad LAT de Flavobacterium lutescens, han determinado las secuencias de aminoácidos de las proteínas obtenidas, y han clonado los genes objetivo utilizando estas informaciones de la secuencia, y como resultado han tenido éxito al clonar un gen que codifica LAT (lat). La invención se basa en los descubrimientos anteriores.
De este modo, de acuerdo con la invención se proporciona un ADN puro aislado que contiene un gen que participa en la producción de ácido homoglutámico cuyo gen se puede obtener de una bacteria perteneciente al género Flavobacterium lutescens, o un modificador que hibrida con el gen en condiciones restrictivas y tiene una función capaz de recuperar la capacidad productora de ácido homoglutámico de un mutante que carece de la capacidad productora.
Más específicamente, el gen que participa en la producción de ácido homoglutámico es un ADN que codifica parcialmente o totalmente al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste en una proteína que tiene actividad LAT y una proteína que tiene actividad deshidrogenasa, o un modificador de la misma.
En particular, la invención proporciona un ADN puro aislado que contiene un gen que participa en la producción de ácido L-glutámico, obtenible a partir de una bacteria perteneciente a Flavobacterium lutescens, o un modificador que hibrida con el gen en condiciones restrictivas y tiene una función capaz de recuperar la capacidad productora de ácido L-homoglutámico de un mutante de Flavobacterium lutescens que carece de capacidad productora,
donde el gen que participa en la producción de ácido L-glutámico es un ADN que codifica parcialmente o totalmente al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste en una proteína que tiene actividad L-lisina: ácido 2-oxoglutárico 6-aminotransferasa y una proteína que tiene actividad ácido piperidino-6-carboxílico deshidrogenasa,
donde el último ADN es un ADN que contiene la secuencia de bases continua desde la base 801 a la base 2276 del SEQ ID NO: 1 o un ADN que contiene la secuencia de bases continua desde la base 2855 a la base 4384 del SEQ ID NO: 3.
La invención también se refiere a un plásmido autónomamente replicante o replicante por integración que porta el ADN, y un transformante obtenido por transformación con el plásmido recombinante, y un procedimiento de producción de ácido homoglutámico que utiliza el transformante.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un dibujo que muestra los resultados analíticos mediante cromatografía en capa fina de la producción de ácido homoglutámico por mutantes de F. lutescens. St es el ácido homoglutámico (HG) patrón, las Calles 1 a 4, las Calles 5 a 7, las Calles 8 a 10, la Calle 11, y las Calles 12 y 13 muestran los resultados analíticos de los primeros mutantes, los segundos mutantes, los terceros mutantes, la cepa de tipo salvaje y los primeros mutantes que tienen el plásmido pCF704, respectivamente.
La Figura 2 es un gráfico que muestra la actividad lisina 6 aminotransferasa (LAT) de mutantes de F. lutescens. Salvaje, 1º, 2º y 3º muestran las actividades LAT de la cepa de tipo salvaje, el primer mutante, el segundo mutante y el tercer mutante, respectivamente.
La Figura 3 muestra los resultados de los análisis mediante cromatografía en capa fina que muestran la complementariedad de la productividad de ácido homoglutámico de los mutantes de carecen de productividad de ácido homoglutámico por el plásmido pCF213.
HG y Lys muestran la posición desplazada del ácido homoglutámico y la posición desplazada de la L-lisina, y St; 1º pCF213, 2º pCF213 y 3º pCF213; pCF213 Salvaje y pCF704 Salvaje; 1º pCF704 y 2º pCF704; y 1º pCF111 son los resultados de los análisis de TLC de la sustancia patrón de ácido homoglutámico; los caldos de cultivo de los mutantes primero, segundo y tercero que tienen pCF 213, respectivamente; los caldos de cultivo de las cepas de tipo salvaje que tienen pCF 213 y pCF 704, respectivamente; los caldos de cultivo que tienen los mutantes primero y segundo que tienen pCF 704, respectivamente; y los caldos de cultivo del primer mutante que tiene pCF 111; respectivamente.
La Figura 4 es un gráfico que muestra la productividad de ácido homoglutámico con el lapso de tiempo de F. lutescens IFO 3084 (pCF213) (en el dibujo, representado por pCF213) y E. lutescens IFO 3084 (pCF704) (en el dibujo, representado por pCF704).
La Figura 5 es un gráfico que muestra la presencia de la posición del ORF encontrada basándose en la secuencia de bases de la región del inserto pCF213.
La Figura 6 es un gráfico que muestra las relaciones entre las fracciones de elución mediante el tratamiento de la columna MonoQ HR5/5 en 3(6) del Ejemplo 2 y las actividades LAT relativas.
La Figura 7 es una fotografía en lugar de un dibujo que muestra los resultados de la PAGE Nativa (A) y la SDS-PAGE (B) de las fracciones activas para LAT utilizando Multigel 4/20 y 10/20, en 3(7) del Ejemplo 2. En el dibujo, M es un marcador de peso molecular, C representa el producto ultra-filtrado obtenido en 3(5) del Ejemplo 2, y las figuras representan los números de las respectivas fracciones.
La Figura 8 es un gráfico que muestra las actividades LAT relativas en mutantes que carecen de productividad de ácido homoglutámico y cepas de tipo salvaje por diversos plásmidos.
La Figura 9 es un gráfico que muestra la productividad de ácido homoglutámico con el lapso de tiempo de F. lutescens IFO 3084 transformado con diversos plásmidos.
Realizaciones específicas de la invención
En cuanto a los orígenes de los genes de acuerdo con la invención, se puede utilizar cualquiera de las cepas de Flavobacterium lutescens (en adelante, también referidas como F. lutescens) que incluyen mutantes espontáneos con tal que puedan proporcionar un gen que participe en la producción de ácido homoglutámico cuyo gen puede ser expresado, por ejemplo, en F. lutescens como anfitrión. No obstante, se menciona como preferida la cepa IFO 3084 que es fácil de obtener y cuyas condiciones de manipulación adecuadas tales como el cultivo están establecidas.
El gen que participa en la producción de ácido homoglutámico en la invención representa cualquier gen capaz de participar en el sistema de conversión de dos fases a partir de L-lisina a ácido homoglutámico vía P6C o 6-semiladehído de ácido 2-aminoadípico que está químicamente en una relación de equilibrio con P6C (la primera fase: actividad LAT, la última fase: actividad deshidrogenasa). Antes que nada, como ejemplos específicos de genes que codifican una proteína que tiene actividad deshidrogenasa que es el último sistema de conversión, se pueden mencionar genes que se pueden obtener utilizando el sistema anfitrión-vector establecido por los autores de la presente invención basándose en la siguiente estrategia.
El establecimiento de un sistema anfitrión-vector adecuado de F. lutescens es necesario para llevar a cabo la manipulación génica de F. lutescens, pero para ello se necesita resolver los tres problemas siguientes.
(1) Obtener un replicón que pueda replicar autónomamente en F. lutescens.
(2) Obtener un marcador de resistencia a un fármaco que pueda ser expresado y funcione en F. lutescens.
(3) Establecer un método de introducción de ADN en F. lutescens.
Afortunadamente, los problemas (1) y (2) anteriores pudieron ser resueltos al descubrir que se puede utilizar pBBR122, puesto a la venta recientemente por Mo Bi Tec corporation, que replica autónomamente en una amplia gama de bacterias Gram-negativas y que tiene resistencia a la kanamicina y al cloramfenicol. Para solucionar el problema (3) anterior, primero, se convierte en un pre-requisito establecer un método de introducción del plásmido pBBR122 en F. lutescens. Sin embargo, se realizó el examen basándose en el método de introducción de ADN en E. coli mediante el método de electroporación, como resultado una colonia de F. lutescens se desarrolló en una placa L que contenía 20 \mug/ml de kanamicina, y cultivando en líquido esto y extrayendo los plásmidos mediante el método del SDS alcalino, se confirmó que pBBR122 se mantenía establemente en F. lutescens. De este modo, también se resolvió el problema (3). En cuanto al sistema anfitrión-vector, se ha sabido que cuando se utilizan otras bacterias como anfitrión, (a) la eficacia de transformación es muy elevada y (b) se puede insertar un fragmento de ADN de un tamaño adecuado en pBBR122 (J. Bac. 178 (1996), 1053-1060), pero se reveló que (a) y (b) anteriores también son posibles en F. lutescens, y adicionalmente fue posible amplificar el gen obtenido en F. lutescens, y por otra parte, también fue posible obtener un gen que codifica una proteína que tiene actividad deshidrogenasa sobre P6C mediante clonación con pistola génica. Para facilitar la operación, se preparó pCF704 en el que se había introducido el sitio de multiclonación pUC19 en lugar del gen de resistencia al cloramfenicol de pBBR122, y esto se utilizó como vector.
Después, con el fin de establecer un sistema para evaluar un gen obtenido y amplificado, se indujo una mutación en F. lutescens IFO 3084 con N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), y se realizó un escrutinio utilizando una placa MEM (pH 7,0) que contenía eosina Y.
De este modo, se obtuvieron el primer mutante que no producía ácido homoglutámico en absoluto, y los mutantes segundo y tercero que solamente producían un poco de ácido homoglutámico. En el primer mutante que no producía ácido homoglutámico en absoluto, se confirmó que la actividad lat era igual a la de la cepa de tipo salvaje, y en el segundo y tercer mutantes que sólo producían un poco de ácido homoglutámico, solamente se confirmó una ligera actividad lat. Esto es, existe la posibilidad de que el primer mutante esté sufriendo ciertos daños en los genes distintos de lat que participan en la producción de ácido homoglutámico, y por otra parte los mutantes segundo y tercero están sufriendo ciertos daños al menos en lat.
Después, el ADN del genoma de la cepa de tipo salvaje fue parcialmente digerido con SauIIIAI, y los fragmentos de 6-8 kpb se insertaron en el sitio BamHI de pCF704, respectivamente, para preparar una genoteca de ADN. Estos plásmidos se introdujeron en el primer, segundo y tercer mutantes, respectivamente, y se escrutaron las cepas que recuperaron la capacidad de producir ácido homoglutámico. En esta ocasión, se utilizó un método que comprende recoger las colonias ennegrecidas en una placa con MEM (pH 7,0) que contenía eosina Y, utilizada para escrutar los mutantes, y confirmar la capacidad para producir ácido homoglutámico de las mismas mediante TLC. Como representantes de estos mutantes, se depositó el segundo mutante (2º mutante de Flavobacterium lutescens) el 6 de Julio de 1998 en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, y se le asignó el número de acceso de FERM P-16874, y se depositó el primer mutante (1^{er} mutante de Flavobacterium lutescens) el 10 de Junio de 1999 en el Instituto, y se le asignó el número de acceso de FERM P-17419, y estas cepas se guardan allí. Esta cepa FERM P-16874 y cepa FERM P-17419 se transfirieron el 26 de Julio de 1999 a su depósito de la autoridad del depósito internacional del Tratado de Budapest en el Instituto, y se les han asignado los números de acceso FERM BP-6798 y FERM BP-6799, respectivamente.
Como resultado, se obtuvieron una cepa que tenía un plásmido que complementaba la productividad de ácido homoglutámico del primer mutante y una cepa que tenía un plásmido que complementaba parcialmente la productividad de ácido homoglutámico del segundo mutante. Sin embargo, los plásmidos de estas cepas, concretamente el plásmido de la cepa que complementaba el segundo mutante eran propensos a ser suprimidos, y adicionalmente se necesitaba un escrutinio adicional para obtener un plásmido estable. Como resultado del análisis del fragmento de ADN mediante tratamiento con enzimas de restricción, se reveló que el plásmido obtenido de este modo designado pCF111 que complementa el primer mutante y complementa parcialmente el segundo mutante y el plásmido designado pCF213 eran aparentemente el mismo plásmido.
Por otra parte, pCF111 y pCF213 se transformaron de nuevo en los mutantes primero, segundo y tercero, respectivamente, y se verificó la capacidad de producir ácido homoglutámico. Como resultado, ambos plásmidos complementaban el primer mutante, pero solamente complementaban parcialmente el segundo y tercer mutantes.
Basándose en el ensayo de complementación, se reveló que en un plásmido que recupera suficientemente la capacidad de producción de ácido homoglutámico de un mutante que carece de productividad de ácido homoglutámico, está presente un gen que participa al menos en la producción de ácido homoglutámico, más específicamente algún gen distinto de lat.
De este modo, no limitado a esto, pero como uno de los "genes que participan en la producción de ácido homoglutámico", se puede mencionar un gen que está contenido en la porción de inserto del plásmido pCF213 y que codifica una proteína que tiene actividad deshidrogenasa. Por ejemplo, este gen está presente en la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 3.
Por otra parte, se puede clonar un gen que participa en la conversión del primero, esto es que codifica una proteína que tiene actividad LAT de acuerdo con la invención como sigue.
Se cultiva F. lutescens en ciertas condiciones de cultivo, la cepa obtenida se fractura, la dispersión de la fractura se centrifuga para separar las células fracturadas, y a partir del extracto celular así obtenido, se aísla la proteína deseada y se purifica mediante tratamiento por ultracentrifugación, precipitación con sulfato de amonio, precipitación por adición de sal, cromatografía en columna de intercambio iónico, cromatografía en columna de afinidad, ultrafiltración, electroforesis, etc.
A partir de los resultados analíticos de la secuencia de aminoácidos del extremo N de la proteína purificada, se diseñan los cebadores de ADN, y se lleva a cabo la PCR del ADN del genoma de la cepa de F. lutescens (IFO 3084). Basándose en el fragmento de ADN amplificado mediante PCR se lleva a cabo una PCR adicional, y de ese modo se obtiene la región vecina de ambos lados externos del fragmento de ADN. De este modo, se obtiene un ADN que codifica la proteína deseada de la invención.
Así, se hace posible proporcionar un ADN que codifica una proteína que tiene actividad LAT como otro gen que participa en la producción de ácido L- homoglutámico. Esto es, como otro gen de la invención, se puede mencionar, por ejemplo, uno que tiene una secuencia que compone la región de la secuencia de bases del SEQ ID NO: 1. El extremo N de la correspondiente proteína purificada es Ser como se muestra en el SEQ ID NO: 1, pero se considera que la Met N-terminal es modificada después de la traducción.
Adicionalmente, el ADN que contiene un gen que participa en la producción de ácido homoglutámico de acuerdo con la invención incluye un ADN que contiene al menos un gen que codifica una proteína que tiene actividad deshidrogenasa y un gen que codifica una proteína que tiene actividad LAT.
Además, el gen referido en la invención también incluye un modificador de ambos genes anteriores que tiene una secuencia de bases que hibrida con uno de ambos genes en ciertas condiciones de hibridación, por ejemplo, en condiciones restrictivas, a 60ºC en 2 x SSC (en solución salina normalizada con ácido cítrico), preferiblemente a 60ºC en 0,5 x SSC, concretamente preferiblemente 60ºC en 0,2 x SSC, y tiene una función capaz de recuperar la capacidad productora de ácido homoglutámico de un mutante de F. lutescens que carece de capacidad productora.
Más específicamente, un modificador de un gen que codifica una proteína que tiene actividad deshidrogenasa es uno que muestra una identidad de al menos 70% con la secuencia de bases desde la base 2855 a la base 4387 del SEQ ID NO: 3, y un modificador de un gen que codifica una proteína que tiene actividad LAT es uno que muestra una identidad de al menos 50%, preferiblemente 70%, más preferiblemente 95% con la secuencia de bases desde la base 545 a la base 2658 (región codificante) del SEQ ID NO: 1.
Tales modificadores incluyen uno en el que una o varias bases son eliminadas o añadidas o parte de las bases son remplazadas por otras bases, en el extremo 5' o en el extremo 3' o a medio camino de una de ambas secuencias anteriores. El modificador donde parte de las bases son remplazadas por otras bases también incluye un modificador que codifica la misma proteína pero tiene una secuencia de bases diferente de las de los genes anteriores debido a la degeneración del código genético.
Se recomienda realizar la sustitución de una base distinta de la sustitución seguida por la degeneración del código genético, considerando las secuencias de aminoácidos estimadas codificadas por ambos genes anteriores, de manera que tengan una forma similar a la de la totalidad de la proteína, basándose en la similitud de la cadena lateral de cada aminoácido, por ejemplo carácter hidrófobo, carácter hidrófilo, carga, tamaño, etc. De este modo, se obtendrá con una probabilidad considerablemente alta un modificador que tiene una función igual a la función de uno de los genes anteriores, esto es una función capaz de recuperar la capacidad de producción de ácido homoglutámico de un mutante de F. lutescens que carece de la capacidad productora.
El modificador de acuerdo con la invención se puede sintetizar utilizando un sintetizador de ácido nucleico o se puede preparar mediante mutagénesis puntual o mutagénesis dirigida al sitio conocidas per se, considerando las secuencias de bases de ambos genes anteriores o las secuencias de aminoácidos estimadas codificadas por ellos.
De acuerdo con la invención, también se puede proporcionar un plásmido recombinante que porta el gen o modificador anterior. Semejante plásmido puede ser uno autónomamente replicante que contiene, además del gen o modificador anterior, una secuencia autónomamente replicante, una secuencia promotora, una secuencia terminadora, un gen de resistencia a fármacos, etc. Adicionalmente, el plásmido puede ser un plásmido de tipo integración que contiene una secuencia homóloga a cierta región del genoma del anfitrión que se pretende utilizar. Como ejemplo del plásmido recombinante autónomamente replicante que porta un ADN que contiene un gen que codifica una proteína que tiene actividad deshidrogenasa, se puede mencionar un plásmido pBBR122, o uno que comprende el plásmido pBBR122 que tiene insertado en cierto sitio del mismo un sitio de multiclonación o que tiene un sitio de multiclonación sustituido por cierto sitio o región y que tiene insertado el gen o modificador anterior utilizando el sitio de multiclonación. Como ejemplos específicos de tales plásmidos, se pueden mencionar los plásmidos denominados pCF111 y pCF213 de la memoria. Se puede obtener pCF213 mediante un método de aislamiento de plásmidos conocido per se a partir de Flavobacterium lutescens IFO 3084 (pCF213) que se depositó el 11 de Marzo de 1998 en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, y se le asignó el número de acceso de FERM P-16699, y después se transfirió al depósito internacional del Tratado de Budapest, y se le asignó el número de acceso de FERM BP-6797. También se puede construir un plásmido recombinante que porta un ADN que contiene un gen que codifica una proteína que tiene actividad LAT y un plásmido recombinante que porta un ADN que contiene ambos genes de la misma manera que pCF213.
De acuerdo con la invención, también se puede proporcionar adicionalmente un transformante obtenido transformando una bacteria perteneciente al género Flavobacterium como anfitrión con el plásmido recombinante anterior. En cuanto a la bacteria anfitriona perteneciente al género Flavobacterium, se puede utilizar cualquier cepa de cualquier especie con tal que satisfaga el objeto de la invención, pero se pueden mencionar, como preferidas F. lutescens IFO 3084 y F. lutescens SP.7-1 (FERM BP-5457).
De este modo, como ejemplo específico del transformante anterior, se puede mencionar uno obtenido transformando F. lutescens IFO 3084 o F. lutescens SP.7-1 con pCF213, y F. lutescens IFO 3084 (pCF213) se deposita como FERM BP-6797 con la autoridad de depósito internacional del Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología
Humana.
De acuerdo con la invención, también se proporciona un procedimiento de producción de ácido homoglutámico utilizando el transformante. En el procedimiento, se pone en contacto el transformante en un medio de crecimiento con L-lisina o en algún caso P6C (o 6-semiladehído 2-aminoadipico) como sustancia de partida, o se pone en contacto el material de partida con un transformante desarrollado o células tratadas del mismo (p. ej., células tratadas con un disolvente orgánico, un extracto celular, células tratadas inmovilizadas) para convertir el material de partida en ácido homoglutámico.
Como fuentes de carbono del medio, se puede utilizar cualquiera de las fuentes de carbono con tal que sean utilizables por el transformante, y cuando se utiliza F. lutescens como anfitrión, se pueden utilizar, por ejemplo, sacáridos tales como glucosa, fructosa, sacarosa y dextrina, alcoholes de azúcares tales como glicerol y sorbitol, y ácidos orgánicos tales como ácido fumárico y ácido cítrico, y es deseable que la cantidad de adición de estas fuentes de carbono sea, normalmente, del orden de 0,1 a 10% en peso (en adelante, abreviado como %).
Como fuentes de nitrógeno del medio, se pueden utilizar, por ejemplo, sales de amonio de ácidos inorgánicos tales como cloruro de amonio, sulfato de amonio y fosfato de amonio, sales de amonio de ácidos orgánicos tales como fumarato de amonio y citrato de amonio, y adicionalmente fuentes de nitrógeno naturales tales como extracto de carne, extracto de levadura, aguas madre de infusión de maíz y producto hidrolizado de caseína, y es deseable que la cantidad de adición de estas fuentes de nitrógeno sea, normalmente, del orden de 0,1 a 10%.
Como sales inorgánicas, se pueden utilizar, por ejemplo, sales de metales alcalinos de ácido fosfórico tales como fosfato de potasio y fosfato de sodio, cloruros de metales alcalinos tales como cloruro de potasio y cloruro de sodio, y sales metálicas de ácido sulfúrico tales como sulfato de magnesio y sulfato ferroso, y es deseable que la cantidad de adición de estas sales inorgánicas sea, normalmente, del orden de 0,001 a 1%.
Entre ellos, se prefiere el cultivo líquido utilizando un medio de crecimiento habitual para bacterias, y son particularmente eficaces glucosa, maltosa, almidón, etc., como fuentes de carbono y sulfato de amonio, peptona, extracto de levadura, extracto de carne, harina de soja, etc., como fuentes de nitrógeno. Además, normalmente se utilizan fosfato de potasio, sulfato de magnesio, sal de mesa, etc., como sales inorgánicas.
Se recomienda llevar a cabo el cultivo del microorganismo en un medio de 20 a 40ºC, preferiblemente de 28 a 37ºC y a un pH de 5 a 9, preferiblemente de 6 a 8 en condiciones aerobias.
El contacto durante el cultivo del transformante desarrollado con la sustancia de partida se lleva a cabo añadiendo previamente la sustancia de partida al medio o añadiendo apropiadamente la sustancia de partida durante el cultivo. El contacto también se puede realizar, una vez completado el cultivo, agitando o sacudiendo las células recogidas o las células tratadas y la sustancia de partida en un medio o un tampón adecuado, si fuera necesario con la adición de coenzimas adecuados, etc., en un reactor, o haciendo fluir el material que contiene la sustancia de partida sobre las células inmovilizadas.
Se toma como ejemplo el caso en el que se ponen en contacto el transformante y L-lisina durante el cultivo, y se describe más específicamente más abajo. El transformante se inocula en un medio y se cultiva, por ejemplo de 20 a 40ºC durante 12 a 120 horas para obtener un caldo de cultivo de la cepa que contiene 10^{6} a 10^{10} microorganismos como transformante por ml. Se añade la L-lisina sustancia de partida en forma de una solución en agua o un disolvente coadyuvante o L-lisina tal cual sin disolver de manera que la concentración final puede ser normalmente de 0,5 a 30 mg/ml, y la reacción se lleva a cabo normalmente de 20 a 40ºC durante 18 horas a 7 días, preferiblemente 18 horas a 5 días. Después, se puede obtener el ácido homoglutámico mediante métodos de purificación normales, por ejemplo, diversas cromatografías de intercambio iónico utilizando resinas de intercambio catiónico, resinas de intercambio aniónico, etc., cromatografía de adsorción utilizando HP20, etc., precipitación o cristalización utilizando disolventes y temperatura, y similares.
La forma y el tiempo de adición de la L-lisina que se va a añadir no están particularmente limitados, pero preferiblemente se utiliza L-lisina en forma de monohidrocloruro en vista de la solubilidad, y se puede añadir al inicio del cultivo o durante el cultivo, p. ej., del 1^{er} día al 5º día.
De acuerdo con la invención se proporciona un ADN que contiene un gen que participa en la producción de ácido homoglutámico cuyo gen convierte la L-lisina en ácido homoglutámico. Este ADN es útil en un procedimiento de producción microbiológica de ácido homoglutámico. De acuerdo con la invención también se proporciona un procedimiento de producción de ácido homoglutámico por medio de un transformante capaz de producir ácido homoglutámico eficazmente, y su uso.
En adelante, se describe la invención más detalladamente por medio de ejemplos específicos. Estos ejemplos específicos se proporcionan para facilitar la comprensión de la invención, y no se pretende restringir la invención a ellos.
Ejemplo 1 Clonación de un gen que codifica una proteína que tiene actividad deshidrogenasa, etc. 1. Obtención de una cepa no productora de ácido homoglutámico
Se inoculó la cepa IFO 3084 de F. lutescens en 3 ml de medio L (polipeptona al 1,0%, extracto de levadura al 0,5%, NaCl al 0,5%, glucosa al 0,1%, pH 7,2), y se cultivo con sacudimiento a 32ºC durante la noche. Se inocularon 100 \mul del caldo de cultivo en forma de inóculo en 50 ml de medio L, y se cultivó con sacudimiento a 32ºC durante 4,5 horas. Las células se recogieron de este caldo de cultivo mediante centrifugación a 5.000 x g durante 10 minutos, se lavó una vez con tampón fosfato 0,2 M (pH 6,0), y se suspendió en 6 ml de tampón fosfato 0,2 M (pH 6,0). Se añadieron 50 \mul de NTG de 80 mg/ml a esta suspensión celular, y se llevó a cabo el cultivo con sacudimiento a 32ºC durante 20 minutos. Las células recogidas de este caldo de cultivo se lavaron una vez con tampón fosfato 0,2 M (pH 6,0), y se inoculó toda la cantidad en 50 ml de medio L y se cultivaron con sacudimiento durante la noche a 32ºC. Se vertieron porciones de 500 \mul de este caldo de cultivo, respectivamente, se añadieron porciones de 500 \mul de solución de glicerol al 60%, y las mezclas se mezclaron bien, respectivamente, y después se almacenaron liofilizadas a -70ºC. Las mezclas almacenadas liofilizadas son referidas como suspensiones de almacenamiento de mutante.
Esta suspensión de almacenamiento de mutante se diluyó 10^{6} con NaCl al 0,85%, se realizaron frotis en medio agar MEM (polipeptona al 0,5%, extracto de levadura al 0,2%, lisina-HCl al 1,0%, Azul de Metileno al 0,006%, eosina Y al 0,04% y agar al 1,5%, pH 7,2) en placas Petri de 8 cm, y se llevó a cabo el cultivo a 32ºC durante 3 días. Se inocularon las colonias de color blanco entre las colonias desarrolladas en porciones de 1 ml de medio de escrutinio (polipeptona al 1,0%, extracto de levadura al 0,2%, lisina-HCl al 1,0%, pH 7,2), y se cultivaron con sacudimiento a 32ºC durante 2 días. Se trasfirieron 3 \mul de cada cultivo a una placa para TLC de gel de sílice, y se secaron. Esta placa se desarrolló con un sistema disolvente que consistió en butanol, ácido acético y agua (3:1:1), y se sometió a coloración con ninhidrina, y de ese modo se verificó en cada calle la presencia o ausencia de ácido homoglutámico. De este modo, a partir de los mutantes se separaron el primer mutante (FERM BP-6799) que no producía ácido homoglutámico en absoluto, y el segundo mutante (FERM BP-6798) y el tercer mutante que producían sólo una pequeña cantidad de ácido homoglutámico. Los resultados obtenidos verificando la capacidad de estos mutantes para convertir L-lisina en ácido homoglutámico (o productividad de ácido homoglutámico) mediante análisis de TLC se muestran en la Figura 1. En la Figura 1, el ácido homoglutámico se representa mediante HG (este es el caso también en otros dibujos). Los resultados del análisis de actividad LAT en estos mutantes se muestran en la Figura 2.
2. Construcción de un sistema anfitrión-vector y un sistema de transformación
Se inoculó la cepa IFO 3084 de F. lutescens en 3 ml de medio L, y se cultivó con sacudimiento a 32ºC durante la noche. Se inocularon 100 \mul del caldo de cultivo como inóculo en 50 ml de medio L, y se cultivaron con sacudimiento a 32ºC durante 4,5 horas. Las células se recogieron de este caldo de cultivo mediante centrifugación a 5.000 x g durante 10 minutos, se lavaron una vez con solución de glicerol al 10%, y se suspendieron en 3 ml de solución de glicerol al 10%. Se vertieron 200 \mul de esta suspensión, y se almacenaron liofilizados a -70ºC. Las suspensiones almacenadas liofilizadas son referidas como suspensiones de almacenamiento Electrocell. Esta suspensión de almacenamiento se congeló sobre hielo, y se añadió 1 \mul de una solución de 200 \mug/ml de Broad Host Range Vector pBBR122 (Mo Bi Tec incorporation) en TE. La mezcla se puso en una Electrocuvette (BIORAD incorporation) de 0,2 cm, se administró una vez un pulso eléctrico en condiciones de 2,4 kV, 200 OMEGA y 25 \muF utilizando Gene Pulser II (BIORAD incorporation). Después se colocaron las células en un tubo Falcon, se añadió 1 ml de medio L enfriado con hielo, y se cultivó con sacudimiento a 32ºC durante 2 horas. Se realizaron frotis del caldo de cultivo sobre medio agar L (polipeptona al 1,0%, extracto de levadura al 0,5%, NaCl al 0,5%, glucosa al 0,1%, agar al 1,5%, pH 7,2) que contenía 20 \mug/ml de kanamicina, y se cultivó a 32ºC durante 3 días. Se obtuvo transformante en una cantidad de 2,4 x 10^{5}.
3. Construcción de un plásmido pCF704
Se sintetizaron un cebador que tenía un sitio EcoRI y un cebador que tenía un sitio NcoI (Pharmacia incorporation), y se amplificaron el sitio de multiclonación y 95 pb de su región vecina de pUC18, utilizando polimerasa Taq (Pharmacia incorporation) y PCR Thermal Cycler PERSONAL (Takara company). Este fragmento de ADN se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y NcoI, y el producto digerido se ligó a los sitios EcoRI y NcoI de pBBR122 utilizando Ligation Kit versión 2 (Takara company). Se transformó una célula competente de E. coli JM109 (Takara company) con esta mezcla de reacción, y a partir del transformante resultante, se preparó un plásmido pCF704 utilizando QIAGEN Plasmid Midi Kit.
4. Construcción de un plásmido pCF213
El ADN del genoma de la cepa IFO 3084 de F. lutescens se extrajo y se purificó de acuerdo con QIAGEN Blood y Cell Culture DNA Kit. Este ADN del genoma se descompuso parcialmente con una enzima de restricción SauIIIAI, y los fragmentos de 6 a 8 kpb resultantes se cortaron del gel de agarosa, y los ADN se recuperaron y purificaron utilizando Ultrafree C3 Unit 0,45 \mum (Millipore corporation) y se disolvieron en solución TE. La solución resultante es referida como solución de ADN Inserto. Por otra parte, se digirió pCF704 con una enzima de restricción BamHI, y el producto digerido se desfosforiló con fosfatasa alcalina. El producto digerido resultante y la solución de ADN Inserto se sometieron a reacción de ligación utilizando Ligation Kit versión 2 (Takara company), y la mezcla de reacción se utilizó como una genoteca de ADN.
Esta genoteca de ADN se añadió a la suspensión de almacenamiento Electrocell del segundo mutante, y de nuevo se administró un pulso eléctrico. Las células resultantes se colocaron en un tubo Falcon, se añadió 1 ml de medio L enfriado con hielo, y se llevó a cabo el cultivo con sacudimiento a 32ºC durante 2 horas. Se inoculó toda la cantidad de este caldo de cultivo en 50 ml de medio L que contenía 20 \mug/ml de kanamicina, y se llevó a cabo el cultivo con sacudimiento a 32ºC durante 2 días. Se vertieron porciones de 500 \mul del caldo de cultivo, respectivamente, y porciones de 500 \mul de solución de glicerol al 60% y se mezclaron bien, respectivamente, y las mezclas se almacenaron liofilizadas a -70ºC. Las mezclas almacenadas liofilizadas son referidas como suspensiones de almacenamiento de cepas complementarias.
Esta suspensión de almacenamiento de cepas complementarias se diluyó 10^{3} con NaCl al 0,85%, y se realizaron frotis de porciones de 100 \mul de la dilución en medio agar MEM de pH 7,0 (polipeptona al 0,5%, extracto de levadura al 0,2%, lisina-HCl al 1,0%, Azul de Metileno al 0,006%, eosina Y al 0,04% y agar al 1,5%, pH 7,0) en placas Petri de 8 cm, y se llevó a cabo el cultivo a 32ºC durante 3 días. Las partes de color negro de las células desarrolladas sobre las superficies completas son referidas como células de mezcla de cepas complementarias. Las respectivas células de mezclas de cepas complementarias se inocularon en porciones de 3 ml del medio de escrutinio, y se cultivaron con sacudimiento a 32ºC durante 2 días. Se añadieron gota a gota porciones de 3 \mul de cada uno de los caldos de cultivo a cada calle de una placa de TLC en gel de sílice, y se secaron. Esta placa se desarrolló con un sistema disolvente que consistía en butanol, ácido acético y agua (3:1:1), y se sometió a coloración con ninhidrina, y de ese modo se verificó la presencia o ausencia de ácido homoglutámico en cada calle. De este modo, se seleccionaron las células de mezclas de cepas complementarias que habían recuperado la capacidad para producir ácido homoglutámico y se separaron en colonias individuales, y se seleccionaron las cepas que habían recuperado la capacidad para producir ácido homoglutámico, y se hizo referencia a ellas como cepas complementarias. Uno de los plásmidos preparados a partir de estas cepas complementarias utilizando QIAGEN Plasmid Midi Kit se denominó pCF213. Se insertaron aproximadamente 6,5 kpb de un ADN inserto en pCF213. Junto con la complementariedad de un plásmido pCE111 obtenido por separado en cada mutante, se examinó la complementariedad del pCF213 anterior, y los resultados se muestran en la Figura 3.
5. Potenciación de la capacidad de producción de ácido homoglutámico por medio de pCF213
La cepa obtenida transformando una cepa IFO 3048 de F. lutescens de tipo salvaje con pCF704 se denominó cepa pCF 704 Salvaje, y la cepa obtenida transformando una cepa IFO 3084 de F. lutescens de tipo salvaje con pCF213 se denominó cepa pCF 213 Salvaje. Cada una de las cepas se inoculó en 3 ml de medio de escrutinio que contenía 20 \mug/ml de kanamicina, y se cultivó con sacudimiento a 32ºC durante la noche. Se inocularon porciones de 100 \mul de cada uno de los caldos de cultivo como inóculos en porciones de 25 ml de un medio de producción (polipeptona al 1,5%, extracto de levadura al 0,5%, lisina-HCl al 2,0%, pH no ajustado), y se cultivaron con sacudimiento a 32ºC durante 24 horas, 48 horas y 72 horas, respectivamente. Se analizó la cantidad de ácido homoglutámico del sobrenadante de cada uno de los caldos de cultivo mediante HPLC. Esto es, el caldo de cultivo se diluyó con agua destilada de manera que la concentración de aminoácido total estuviera en el orden de 1.000 mg/L, y se transfirieron 50 \mul de la dilución a un tubo de ensayo y se concentró hasta sequedad a presión reducida. A esto se le añadieron 50 \mul de una solución obtenida mezclando isotiocianato de fenilo, trietilamina, etanol y agua destilada 1:1:7:2, y la mezcla se agitó para disolver el residuo, se dejó a la temperatura ambiente durante 10 minutos, y se concentró hasta sequedad a presión reducida. El residuo se disolvió en 500 \mul de Solución A como fase móvil de HPLC, y se inyectaron 5 \mul de la solución. Las condiciones de la HPLC se muestran más abajo.
Columna: TSK-GEL super-ODS 4.6ID x 50 mm.
Fase Móvil:
\quad
Solución A Mezcla de una solución obtenida ajustando acetato de sodio 140 mM-trietilamina al 0,05% a pH 6,2 con ácido acético glacial: acetonitrilo 1.000: 40
\quad
Solución B acetonitrilo al 70%
Velocidad de Flujo: 2,0 ml/min
Condiciones de Elución: gradiente de velocidad de flujo fijada, gradiente lineal de 2% a 40% de Solución B en 0 a
{}\hskip0.4cm 7 minutos, 100% de Solución B en más de 7 minutos
Detección: UV 254 nm
Temperatura: 40ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
En estas condiciones, el tiempo de retención del ácido homoglutámico fue de 1,3 minutos, y el de la lisina fue de 7,7 minutos.
Como se observa a partir de los resultados mostrados en la Figura 4, la cepa pCF213 de tipo salvaje tiene una capacidad de producción de ácido homoglutámico 1,5 veces mayor que la de la cepa pCF704 de tipo salvaje.
6. Determinación de la secuencia de bases génica de la región del inserto pCF213
Se determinó la secuencia de bases de la región del inserto pCF213 de acuerdo con el método del paseo con cebadores utilizando ABIPRISM 377XL DNA Sequencer (Perkin Elmer corporation). Esta secuencia de bases se muestra en el SEQ ID NO: 3.
El marco de lectura abierto (ORF) de la secuencia de bases determinada se determinó utilizando el método de Bibb et al. (Gene 30, 157 (1984)). Como resultado, se encontró el ORF mostrado en la Figura 5.
7. Análisis del sitio NotI de aproximadamente 2,5 kpb en la región del inserto pCF213
Se llevó a cabo el análisis del sitio NotI de aproximadamente 2,5 kpb (la secuencia de bases desde 2077 a 4578 en el SEQ ID NO: 3) en la región del inserto pCF213. Este sitio NotI de aproximadamente 2,5 kpb se cortó del gel de agarosa, y el ADN se recuperó y se purificó utilizando Ultrafree C3 Unit 0,45 \mum (Millipore corporation) y se disolvió en solución TE, y los extremos se volvieron romos de acuerdo con el DNA Blunting Kit (Takara company), y se hizo referencia a la solución como Solución de ADN Inserto. Por otra parte, se digirió pCF704 con una enzima de restricción HincII y después se desfosforiló con fosfatasa alcalina. Esta y la solución de ADN Inserto se sometieron a reacción de ligación utilizando Ligation Kit versión 1 (Takara company). Se transformó la cepa IFO 3084 de F. lutescens con esta mezcla de reacción, y se preparó un plásmido pCF235 a partir del transformante utilizando QUIAGEN Plasmid Midi Kit.
El primer mutante, transformado con pCF235 se inoculó en 3 ml del medio de escrutinio, y se cultivó con sacudimiento a 32ºC durante 2 días. Se añadieron gota a gota porciones de 3 \mul de este caldo de cultivo a cada calle de una placa de gel de sílice para TLC y se secaron. Esta placa se desarrolló con un sistema disolvente que consistía en butanol, ácido acético y agua (3:1:1) y se sometió a coloración con ninhidrina, y se verificó la presencia o ausencia de ácido homoglutámico en cada calle. Como resultado, se reveló que el primer mutante transformado con pCF235 recuperó la capacidad de producción de ácido homoglutámico.
En la secuencia de ADN de aproximadamente 2,5 kpb integrada en pCF235 estaba presente un ORF que codificaba 510 aminoácidos partiendo del ATG 2855º de la secuencia de bases del SEQ ID NO: 3 y terminando en el TAA 4387º. Esta secuencia de aminoácidos se sometió a búsqueda de homología mediante BLAST, y como resultado mostró una elevada homología con diversas aldehído deshidrogenasas, y adicionalmente mostró una homología elevada con la secuencia de aminoácidos de la ácido piperidino-6-carboxílico deshidrogenasa de Streptomyces dlavuligerus registrada recientemente en la bases de datos (J. Bac., Vol. 180, Núm. 17, 4753-4756 (1998)) a lo largo de toda la secuencia de aminoácidos. Tomando en consideración que el primer mutante transformado con pCF235 recuperó la capacidad productora de ácido homoglutámico y que la capacidad productora de ácido homoglutámico de la cepa pCF213 de tipo salvaje se elevó, se puede considerar que la proteína codificada por este ORF tiene ácido piperidino-6-carboxílico deshidrogenasa.
Ejemplo 2 Clonación de un gen que codifica una proteína que tiene actividad LAT, etc 1. Análisis de la actividad LAT
Se disolvieron lisina-HCl (73 mg) y 59 mg de ácido 2-cetoglutárico en 1 ml de tampón fosfato 0,2 M (pH 7,3) que contenía fosfato de piridoxal 0,5 mM, y se hizo referencia a la solución como solución de reacción. La solución de reacción (28,75 \mul) se añadió a 260 \mul de la solución de enzima, y la mezcla se dejó a 32ºC durante 1 hora. Se añadieron 151,8 \mul de una solución de ácido tricloroacético al 5% en etanol para interrumpir la reacción, la mezcla de reacción se centrifugó, se añadieron 90 \mul de tampón fosfato 0,2 M (pH 7,3) que contenía o-aminobenzaldehído 4 mM a 60 \mul del sobrenadante, y la mezcla se dejó a 37ºC durante 1 hora. Se analizó a A465 de la mezcla, y las fracciones que tenían una A465 relativamente elevada fueron referidas como fracciones activas para LAT.
2. Cultivo de la cepa
Se cultivó con sacudimiento la cepa IFO 3084 de F. lutescens a 32ºC durante la noche. Se inoculó el caldo de cultivo (50 ml) como inóculo en 10 L de medio flavo-M9 (Na_{2}HPO_{4} al 0,6%, KH_{2}PO_{4} al 0,3%, NH_{4}Cl al 0,1%, NaCl al 0,2%, polipeptona al 1,0%, extracto de levadura al 0,5%, lisina-HCl al 0,5%, silicona KM75 al 0,005%, MgSO_{4} al 0,025%, CaCl_{2} al 0,0015%, pH 7,2) en un fermentador de jarra de 30 L, y se cultivó con agitación aireada durante 17 horas. El caldo de cultivo resultante (5 L) se centrifugó (1.000 x g, 10 minutos) para recoger las células, y las células se lavaron dos veces con tampón fosfato 0,01M (pH 7,2). Las células se suspendieron en el mismo tampón y se sometieron a fractura ultrasónica. Las células fracturadas se separaron mediante centrifugación (1.000 x g, 10 minutos) para obtener un extracto celular. El extracto celular se ultracentrifugó (16.000 x g, 90 minutos), y la fracción sobrenadante se sometió a las siguientes operaciones de purificación.
3. Purificación de enzima
Todas las operaciones de purificación siguientes se llevaron a cabo a 4ºC, a menos que se indique de otro modo.
(1) Fraccionamiento con sulfato de amonio
La fracción de sobrenadante (600 ml) obtenida en el Ejemplo 1 se purificó mediante precipitación con sulfato de amonio. Los productos precipitados formados en las fracciones con una saturación de 30% a una saturación de 80% se recogieron por centrifugación (1.000 x g, 30 minutos), y se disolvieron en tampón fosfato 0,01 M (pH 7,2), y la solución se sometió a diálisis frente al mismo tampón.
(2) Precipitación por adición de sal
La solución de enzima sometida a diálisis (10 ml) se vertió en 4 columnas PD10 (Amersham Pharmacia) y se hizo eluir y se precipitó por adición de sal con tampón Tris-HCl 0,1 M (pH 7,4) que contenía fosfato de piridoxal 0,5 mM.
(3) Cromatografía en columna QAE-TOYOPEAL550C
La solución de enzima sometida a precipitación por adición de sal se vertió en una columna QAE-TOYOPEAL550C (TOSOH) (DIAMETRO 5,5 x 6,0 cm) previamente equilibrada con tampón Tris-HCl 0,1 M (pH 7,4) que contenía fosfato de piridoxal 0,5 mM, se lavó con el mismo tampón, y se hizo eluir por medio de 2 L de gradiente lineal de cloruro de sodio (0 a 1,0 M) utilizando el mismo tampón, y se recogieron las fracciones activas para LAT.
(4) Cromatografía en columna Phenyl-TOYOPERL650S
Se añadió sulfato de amonio 1 M a las fracciones activas para LAT, y la mezcla se vertió en la columna Phenyl-TOYOPERL650S (TOSOH) (DIAMETRO 5,5 x 3,0 cm) previamente equilibrada con tampón fosfato 0,01 M (pH 7,2) que contenía fosfato de piridoxal 0,5 mM y sulfato de amonio 1 M, y se hizo eluir con 1.200 ml de gradiente de sulfato de amonio (0,8 a 0 M) utilizando el mismo tampón, y se recogieron las fracciones activas para LAT.
(5) Ultrafiltración
Se sometieron a ultrafiltración las fracciones activas para LAT (150 ml) con ADVANTEC UP-20 hasta completar un volumen de 15 ml. Este producto concentrado (2,5 ml) se vertió en una columna PD10 (Amersham Pharmacia), y se hizo eluir y se sometió a precipitación por adición de sal con tampón Tris-HCl 0,1 M (pH 7,4).
(6) Cromatografía en columna AKTA MonoQ HR5/5
La solución de enzima sometida a precipitación por adición de sal (3,5 ml) se vertió en la columna MonoQ HR5/5 de AKTAexplorer 10S System (Amersham Pharmacia) previamente equilibrada con tampón Tris-HCl 0,1 M (pH 7,4), se lavó con el mismo tampón, y se hizo eluir con 40 ml de gradiente lineal de cloruro de sodio (0 a 0,4 M) utilizando el mismo tampón, y se recogieron las fracciones activas para LAT. Las fracciones activas para LAT (5 ml) se sometieron a precipitación por adición de sal con una columna PD10, y se sometieron a una columna MonoQ HR5/5 de AKTAexplorer 10S System, y se recogieron las fracciones activas para LAT. Las relaciones entre cada fracción y la actividad LAT relativa se muestran en la Figura 6.
(7) Electroforesis
Se sometieron las fracciones activas para LAT a Multigel 4/20 y 10/20 (Daiichi Kagaku Yakuhin Co., Ltd.) y se llevaron a cabo Native-PAGE y SDS-PAGE, y los resultados se muestran en la Figura 7. En cuanto a las fracciones activas para LAT, se observó una banda a un peso molecular de aproximadamente 100.000 en Native-PAGE y se observo una banda a un peso molecular de aproximadamente 55.000 en SDS-PAGE. Se aplicó la banda de peso molecular de aproximadamente 55.000 en SDS-PAGE a una membrana PVDF utilizando PhastTransfer (Amersham Pharmacia).
4. Análisis de la secuencia de aminoácidos N-terminal
Se llevó a cabo el análisis de la secuencia de aminoácidos N-terminal de la banda sometida a transferencia mediante el método de degradación de Edman utilizando HP G1005A Protein Sequencing System (HEWLETT PACKARD). Como resultado, se reveló que la secuencia de aminoácidos N-terminal era
SLLAPLAPLRAHAGTRLTQG (SEQ ID NO: 9)
Basándose en esto, se diseñaron los cebadores de ADN (N = I)
NmaRout CCYTGNGTNARNCKNGTNCCNGCRTGNGCNCG (SEQ ID NO: 10)
NmaRin CCNGCRTGNGCNCGNARNGGNGCNARNGGNGC (SEQ ID NO: 11)
y se llevó a cabo la PCR en el ADN del genoma de la cepa IFO 3084 de F. lutescens utilizando el KIT de clonación LA PCR in vitro (Takara Company). Las condiciones de la reacción de PCR fueron 30 ciclos de 94ºC, 30 segundos \rightarrow 55ºC, 2 minutos \rightarrow 72ºC, 1 minuto. Como resultado, se obtuvo un fragmento de amplificación por PCR de aproximadamente 400 pb que contenía el extremo anterior y su región aguas arriba. Basándose en esta secuencia, se obtuvo se región vecina utilizando la PCR. Esto es, se digirió el ADN del genoma de la cepa IFO 3084 de F. lutescens con las enzimas de restricción PstI y SalI, respectivamente, y los productos digeridos se sometieron, respectivamente, a reacción de auto-li-
gación utilizando Ligation Kit versión 2 (Takara Company), y se utilizaron los ADN resultantes como ADN molde.
Basándose en estos ADN molde, se diseñaron los cebadores de ADN
NIFout ttgatttgag cagattcgca ctgccattt (SEQ ID NO: 5)
NIRout aaggttttcg acaaagtgac catttccca (SEQ ID NO: 6)
y se llevó a cabo la PCR utilizando LA Taq (Takara Company). Las condiciones de la reacción de PCR fueron 30 ciclos de 98ºC, 20 segundos \rightarrow 68ºC, 6 minutos. Como resultado, se obtuvo un fragmento de amplificación de la PCR de aproximadamente 2 kpb a partir del molde PstI y un fragmento de amplificación de la PCR de aproximadamente 8 kpb a partir del molde SalI. La secuencia de bases se determinó mediante el método del paseo con cebadores utilizando ABIPRISM 377XL DNA Sequencer (Perkin Elmer corporation) en estos fragmentos de amplificación por PCR. Esta secuencia de bases se muestra en el SEQ ID NO: 1.
5. Construcción de los plásmidos pCF301 y pCF335
Se prepararon los siguientes cebadores de ADN en los que los sitios PstI de la base 545 a la base 2658 del SEQ ID NO: 1 se habían convertido en sitios KpnI y SacI, respectivamente:
ctggtaccgc tcgatccggc tctgcaccgt (SEQ ID NO: 7)
ctggagctca ggcaggtgcg ggccacgtgt (SEQ ID NO: 8)
y se llevó a cabo la reacción de PCR utilizando estos cebadores para amplificar la región del gen lat. El fragmento amplificado de aproximadamente 2,1 kpb se digirió con las enzimas de restricción KpnI y SacI, y la solución resultante fue referida como Solución de ADN Inserto. Por otra parte, se digirió pCF704 con las enzimas de restricción KpnI y SacI, y el producto digerido y la solución de ADN Inserto se sometieron a reacción de ligación utilizando Ligation Kit versión 2 (Takara company), y el plásmido resultante fue referido como pCF301. Adicionalmente, se digirió pCF301 con las enzimas de restricción KpnI y SacI, y el fragmento de 2,1 kpb se cortó del gel de agarosa, y éste y el producto digerido de pCF235 con las enzimas de restricción KpnI y SacI se sometieron a reacción de ligación, y el plásmido resultante se denominó pCF335.
6. Complementación de la actividad LAT por el plásmido pCF301
El mutante obtenido transformando el segundo mutante con pCF704 fue denominado 2ª cepa de pCF704, y el mutante obtenido transformando el segundo mutante con pCF301 fue denominado 2ª cepa de pCF301. Estas cepas se cultivaron con sacudimiento a 32ºC durante la noche. Se inocularon (30 \mul) de cada uno de los caldos de cultivo como inóculo en 3 ml de un medio de producción (polipeptona al 1,5%, extracto de levadura al 0,5%, lisina-HCl al 2,0%, pH no ajustado) en un tubo de centrifugación, y se cultivaron con agitación aireada durante 17 horas. El caldo de cultivo resultante (1 ml) se centrifugó (1.000 x g, 10 minutos) para recoger las células, y las células se lavaron con 10 ml de tampón fosfato 0,2 M (pH 7,3) que contenía fosfato de piridoxal 0,5 mM. Las células se suspendieron en 1 ml del mismo tampón y se fracturaron ultrasónicamente. Las células fracturadas se separaron mediante centrifugación (1.000 x g, 10 minutos) para obtener un extracto celular. Se analizó la actividad LAT de este extracto celular. Los resultados se muestran en la Figura 8. pCF301 complementaba la mutación lat en el segundo mutante.
7. Elevación de la capacidad productora de ácido homoglutámico mediante pCF335
Un transformante obtenido transformando la cepa IFO 3084 de F. lutescens de tipo salvaje con pCF704 fue denominada cepa pCF704 de tipo salvaje, y los transformantes obtenidos transformando la cepa IFO 3084 con los plásmidos pCF301 y pCF335 fueron denominados cepa pCF301 de tipo salvaje y cepa pCF335 de tipo salvaje, respectivamente. Estas cepas fueron inoculadas en porciones de 3 ml del medio de escrutinio que contenía 20 \mug/ml de kanamicina, respectivamente, y se cultivaron con sacudimiento a 32ºC durante la noche. Se inocularon porciones de 100 \mul de cada caldo de cultivo como inóculo en porciones de 25 ml de un medio de producción (polipeptona al 1,5%, extracto de levadura al 0,5%, lisina-HCl al 2,0%, pH no ajustado), y se cultivaron con sacudimiento a 32ºC durante 24 horas, 48 horas y 72 horas, respectivamente. La cantidad de ácido homoglutámico del sobrenadante de cada uno de los caldos de cultivo se midió mediante HPLC. Esto es, se diluyó cada uno de los caldos de cultivo con agua destilada de manera que la concentración de aminoácido total pudiera estar en el orden de 1.000 mg/l, y se transfirieron 50 \mul de la dilución a un tubo de ensayo y se concentraron hasta sequedad. Se añadieron al residuo 50 \mul de una solución mixta de isotiocianato de fenilo, trietilamina, etanol y agua destilada (1:1:7:2), y la mezcla se agitó para formar una solución, se dejó a la temperatura ambiente durante 10 minutos y se concentró hasta sequedad a presión reducida. El residuo se disolvió en 500 \mul de Solución A como fase móvil de la HPLC, y se inyectaron 5 \mul de la misma. Las condiciones de la HPLC son las descritas en 5 del Ejemplo 1.
Como resultado, como se muestra en la Figura 9, la cepa pCF335 de tipo salvaje tenía una capacidad productora de ácido homoglutámico aproximadamente dos veces mayor que la de la cepa pCF704 de tipo salvaje.
<110> MERCIAN CORPORATION
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<120> GEN QUE PARTICIPA EN LA PRODUCCIÓN DEL ÁCIDO HOMO-GLUTÁMICO Y LA UTILIZACIÓN DEL MISMO
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<130> 11428
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\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP99935047.3
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<141> 1999-08-04
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP10/232382
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1998-08-05
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP11/182362
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999-06-28
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 2663
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<212> ADN
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<213> Flavobacterium lutescens 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (801).. (2276)
\newpage
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<400> 1
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2
3
4
5 
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<210> 2
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<211> 492
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<212> Proteína
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<213> Flavobacterium lutescens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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6
7 
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<210> 3
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<211> 6357
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<212> ADN
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<213> Flavobacterium lutescens 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (2855)..(4384)
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<400> 3
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8
9
10
11
12
13 
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<210> 4
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<211> 510
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<212> Proteína
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<213> Flavobacterium lutescens 
\newpage
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<400> 4
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14
15
16 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskip
ttgatttgag cagattcgca ctgccattt 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
aaggttttcg acaaagtgac catttccca 
\hfill
29 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 30
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador
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<400> 7
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\hskip-.1em\dddseqskip
ctggtaccgc tcgatccggc tctgcaccgt 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador
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<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskip
ctggagctca ggcaggtgcg ggccacgtgt 
\hfill
30 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 20
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<212> Proteína
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<213> F. lutescens IFO 3084
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\sa{Ser Leu Leu Ala Pro Leu Ala Pro Leu Arg Ala His Ala Gly Thr Arg}
\sac{Leu Thr Gln Gly}
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<210> 10
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<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador; N = I
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskip
ccytgngtna rnckngtncc ngcrtgngcn cg 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
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<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador; N = I
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskip
ccngcrtgng cncgnarngg ngcnarnggn gc 
\hfill
32

Claims (10)

1. Un ADN puro aislado que contiene un gen que participa en la producción de ácido L-homoglutámico, obtenible de una bacteria perteneciente a Flavobacterium lutescens, o un modificador que hibrida con el gen en condiciones restrictivas y tiene una función capaz de recuperar la capacidad productora de ácido L-homoglutámico de un mutante de Flavobacterium lutescens que carece de capacidad productora,
donde el gen que participa en la producción de ácido L-homoglutámico es un ADN que codifica parcial o totalmente al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste en una proteína que tiene actividad L-lisina:ácido 2-oxoglutárico 6-aminotransferasa (a) y una proteína que tiene actividad deshidrogenasa de ácido piperidino-6-carboxílico (b),
donde el último ADN es un ADN que contiene la secuencia de bases continua desde la base 801 a la base 2276 del SEQ ID NO: 1 (a) o un ADN que contiene la secuencia de bases continua desde la base 2855 a la base 4384 del SEQ ID NO: 3 (b).
2. El ADN de acuerdo con la reivindicación 1 que tiene la secuencia de bases del SEQ ID NO: 1 o la secuencia de bases continua desde la base 545 a la base 2658 del SEQ ID NO: 1.
3. El ADN de acuerdo con la reivindicación 1 que tiene la secuencia de bases del SEQ ID NO: 3 o la secuencia de bases continua desde la base 2077 a la base 4578 del SEQ ID NO: 3.
4. Un plásmido recombinante autónomamente replicante o replicativo por integración que porta el ADN de acuerdo con la reivindicación 1.
5. El plásmido recombinante de acuerdo con la reivindicación 4 que tiene la secuencia de bases continua desde la base 545 a la base 2658 del SEQ ID NO: 1 y/o la secuencia de bases continua desde la base 2077 a la base 4578 del SEQ ID NO: 3.
6. El plásmido recombinante de acuerdo con la reivindicación 4 que se puede obtener a partir de Flavobacterium lutescens IFO 3084 (pCF213) (FERM BP-6797).
7. Un transformante obtenido transformando una bacteria perteneciente al género Flavobacterium como anfitrión con el plásmido recombinante de acuerdo con la reivindicación 4.
8. Un procedimiento para producir ácido L-homoglutámico que comprende cultivar en un medio un transformante obtenido mediante transformación con el plásmido recombinante de acuerdo con la reivindicación 4; durante o después del cultivo, poner en contacto el transformante desarrollado con L-lisina o ácido 1-piperidino-6-carboxílico para convertirlo en ácido L-homoglutámico; y recuperar el ácido L-homoglutámico producido de este modo.
9. El procedimiento de producción de ácido L-homoglutámico de acuerdo con la reivindicación 8, donde el transformante es un transformante de acuerdo con la reivindicación 7.
10. El procedimiento para producir ácido L-homoglutámico de acuerdo con la reivindicación 8, donde el transformante es uno obtenido transformando una bacteria perteneciente al género Flavobacterium como anfitrión con un plásmido recombinante que se puede obtener de Flavobacterium lutescens IFO 3084 (pCF213) (FERM BP-6797).
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