DE69938427T2

DE69938427T2 - An der herstellung von homo-glutaminsäure beteiligtes gen und dessen verwendung

Info

Publication number: DE69938427T2
Application number: DE69938427T
Authority: DE
Inventors: Tadashi Fujisawa-shi FUJII; Takao Zama-shi NARITA; Kuniho Fujisawa-shi NAKATA; Hitosi Agematu; Hiroshi Fujisawa-shi TSUNEKAWA; Kunio Zama-shi ISSHIKI; Takeo Ayase-shi YOSHIOKA
Original assignee: Mercian Corp
Current assignee: Mercian Corp
Priority date: 1998-08-05
Filing date: 1999-08-04
Publication date: 2009-04-09
Anticipated expiration: 2019-08-05
Also published as: WO2000008170A1; ATE390484T1; EP1103612B1; CN1229497C; EP1103612A1; CN1311821A; ES2300150T3; CA2337981A1; AU5064299A; JP4162383B2; US7235388B2; CA2337981C; DE69938427D1; US6890746B1; US20040214295A1; EP1103612A4

Description

Technisches Gebiet
Diese Erfindung betrifft Genmanipulation und spezieller betrifft sie eine DNA, enthaltend ein Gen, das an der Produktion von L-Homoglutaminsäure (auch bezeichnet als L-2-Aminoadipinsäure oder L-α-Aminoadipinsäure) beteiligt ist, und ein Produktionssystem von L-Homoglutaminsäure (hierin nachstehend lediglich als Homoglutaminsäure bezeichnet), das dieses verwendet.
Stand der Technik
Homoglutaminsäure wird weit verbreitet in Organismen, wie Pflanzen, einschließlich Cholera vibrio als ein Bakterium und Mais (Zea mays), den Embryonen von Fröschen, gefunden. Homoglutaminsäure dient als Intermediat der Lysinbiosynthese bei Pilzen etc. und als ein Vorläufer bzw. Precursor bei der Biosynthese von β-Lactamantibiotika. Weiterhin ist Homoglutaminsäure auch zweckmäßig als synthetisches Intermediat verschiedener Medikamente, einschließlich Methotrexat-Derivaten ( WO 92/09436 ).
Da die Herstellung von Homoglutaminsäure mittels chemischer Synthese eine Racemattrennung („optical resolution") und eine mehrstufige Reaktion erfordert, ist sie vom Kostenaspekt her kein zweckmäßiges Mittel. Andererseits ist ein Verfahren zum Herstellen von Homoglutaminsäure aus L-Lysin unter Verwendung eines Mikroorganismus, der zum Genus Agrobacterium, Klebsiella, Alcaligenes, Brevibacterium oder Bacillus gehört, bekannt ( japanische offengelegte Patentveröffentlichung Nr. 6-181787 ). Ein Teil der Erfinder der vorliegenden Erfindung schlug auch ein Verfahren zum Herstellen von Homoglutaminsäure aus L-Lysin unter Verwendung eines Mikroorganismus, der zum Genus Flavobacterium gehört, vor ( WO 96/31616 ). Jedoch sogar bei dem Verfahren unter Verwendung eines Mikroorganismus wird ernsthaft ein Verfahren gewünscht, das dazu befähigt ist, Homoglutaminsäure effizienter herzustellen.
Somit zielten die Erfinder der vorliegenden Erfindung darauf ab, zum Beispiel durch Genmanipulation das Produktionssystem von Homoglutaminsäure in einem beliebigen der obigen Mikroorganismen zu verstärken. Als eine Übersicht hilfreicher Information über die Manipulation erstellt wurde, zum Beispiel als Teil der Forschungen über den Biosyntheseweg von Cephamycin C, wurde das Vorhandensein von Lysin-6-Aminotransferase und L-Δ¹-Piperidin-carboxylat-Dehydrogenase, die an der Umwandlung von L-Lysin zu α-Aminoadipinsäure (oder Homoglutaminsäure) von Streptomyces clavuligerus als ein Cephamycin C-produzierender Actinomycet beteilt sind, bestätigt und was Erstere angeht, die Position des Gens, das das Enzym codiert etc. (Fuente et al., Biochem. J. (1997) 327, 59–64).
Darüber hinaus berichten Madduri et al. (Journal of Bacteriology (1991) 173(3), 985–988) über die Klonierung und Lokalisierung eines Gens, das die Lysin-ε-Aminotransferase steuert, ein Enzym, das die β-Lactam-Biosynthese in Streptomyces spp. steuert. Sie legten auch dar, dass bei Actinomyceten, die β-Lactamantibiotika des Cephem-Typs produzieren, Lysin-ε-Aminotransferase das initiale Enzym bei der Umwandlung von Lysin zu α-Aminoadipinsäure ist. Die Autoren verwenden ein zweistufiges Verfahren („Chromosomen-Walking"), um eine lambda-Bibliothek von genomischer DNA von Streptomyces clavuligerus auf Fragmente, die L-Lysin-ε-Aminotransferase-Aktivität in S. lividans exprimierten, zu durchmustern. Die Restriktionsanalyse der klonierten DNA bestätigte die Lokalisierung des vermutlichen lat-Gens innerhalb des Clusters der β-Lactam-Biosynthesegene, grob etwa in der Mitte zwischen pcbC, dem Strukturgen für die Isopenicillin-N-Synthetase, und dem vermutlichen cefE-Gen, das die Deacetoxy-cephalosporin-C-Synthetase codiert.
Hinsichlich Flavobacterium lutescens (welches ausgehend von Flavobacterium fuscum re-identifiziert bzw. neu bezeichnet wurde) IFO 3084, verwendet in einem L-Lysin-Bioassay, ist es bekannt, dass 2-Oxoglutarat-6-Aminotransferase [oder Lysin-6-Aminotransferase (hierin nachstehend als LAT bezeichnet)], das den folgenden Weg katalysiert, vorhanden ist (Soda et al., Biochemistry 7 (1968), 4102–4109, ibid. 4110–4119)
In dem obigen Bioassay wird die Absorption des Produktes, das durch Umsetzung von Piperidin-6-carbonsäure (hierin nachstehend auch als P6C bezeichnet) mit o-Aminobenzaldehyd erhalten wird, gemessen. In einem anderen L-Lysin-Bioassay wird die L-Lysin-6-Dehydrogenase-Aktivität von Agrobacterium tumefaciens benutzt (Misono et al., J. Biochem. (Tokio) 105 (1989), 1002–1008).
Der obige IFO 3084-Stamm wird gewöhnlich in dem L-Lysin-Bioassay, wie oben erwähnt, verwendet und sein Anwendungsverfahren ist ebenfalls etabliert. Wenn der IFO 3084-Stamm ein Gen, das ein Protein mit P6C (oder 2-Aminoadipinsäuresemialdehyd, von welchem angegeben wird, dass er sich in einem lebenden Körper in einem quantitativen Gleichgewichtszustand mit P6C befindet)-Dehydrogenase (hierin nachstehend nur als Dehydrogenase bezeichnet)-Aktivität codiert, zusätzlich zu LAT aufweist, wäre der Stamm daher ein Kandidatenbakterium für eine Genklonierung, welche die Aufgabe der vorliegenden Erfindung erfüllt, nämlich die Aufgabe, ein Gen bereitzustellen, das an der Produktion von Homoglutaminsäure beteiligt ist.
Darüber hinaus beschreiben Yagi et al. (Biochimica et Biophysica Acta (1980) 614(1), 63–70) ein neues Aufreinigungsverfahren für die L-Lysin-6-Aminotransferase aus Flavobacterium lutescens mit einem Molekulargewicht von etwa 116.000, wobei die Hitzebehandlung durch Affinitätschromatographie mit L-Lysylacetamidododecyl-Sepharose 6B ersetzt wurde.
Coque et al. (Journal of Bacteriology (1991) 173(19), 6258–6264) entdeckten ein Gen, das Lysin-6-Aminotransferase codiert, und stellten fest, dass dieses Gen stromaufwärts der pcbAB (codiert eine α-Aminoadipyl-Cysteinyl-Valin-Synthetase)- und pcbC (codiert Isopenicillin-N-Synthase)-Gene in dem Cluster der frühen Cephamycin-Biosynthesegene in Nocardia lac-tamdurans lokalisliert war. Dieses Gen enthält ein offenes Leseraster von 1353 Nukleotiden (71,4% G + C), die ein Protein mit 450 Aminosäuren mit einer abgeleiteten Molekülmasse von 48.811 Da codieren. Die Expression von DNA-Fragmenten, die das lat-Gen tragen, in Streptomyces lividans, führte zu einer hohen L-Lysin-6-Aminotransferase-Aktivität, welche bei nicht-transformiertem S. lividans nicht vorhanden war. Das Enzym wurde aus S. lividans (pULBS8) teilweise aufgereinigt und zeigte eine Molekülmasse von 52.800 Da, wie mittels Sephadex-Gelfiltration und Polyacrylamidgelelektrophorese berechnet. DNA-Sequenzen, die stark mit dem lat-Gen von N. lactamdurans hybridisierten, wurden bei vier Cephamycin-produzierenden Streptomyces-Spezies gefunden, aber nicht bei vier anderen Actinomyceten, von denen nicht bekannt ist, dass sie β-Lactame produzieren, was nahe legt, dass das Gen für die β-Lactam-Biosynthese spezifisch ist und nicht an dem allgemeinen Lysinkatabolismus beteiligt ist. Das Protein, das durch das lat-Gen codiert wird, zeigte Ähnlichkeit mit Ornithin-5-Aminotransferasen und N-Acetylornithin-5-Aminotransferasen und enthielt eine Pyridoxalphosphatbindungs-Konsensus-Aminosäuresequenz um Lys-300 des Proteins. Die evolutionären Folgen des lat-Gens als ein wahres β-Lactam-Biosynthesegen werden diskutiert.
Offenbarung der Erfindung
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung versuchten die Klonierung des Lysin-6-Aminotransferase (LAT)-Gens (lat) von Flavobacterium lutescens und gemäß den Umständen eines Gens des Bakteriums, das ein Protein mit Dehydrogenase-Aktivität gegen P6C codiert. Jedoch versagten als Klonierungsverfahren, die in einem solchen Fall regelmäßig angewendet werden, ein Verfahren zum Erhalten eines Gens, auf das abgezielt wird, aus den DNA-Konsensus-Sequenzen zwischen Aminotransferasen anderer Bakterien und ein Verfahren zum Nutzen der Information, die aus dem Ergebnis der Aminosäuresequenzierung eines gereinigten Proteins erhalten wurde, und dergleichen alle bei ihren frühen Untersuchungen.
Unerwarteterweise stellten sie jedoch fest, dass, wenn das schließlich durch den Erfinder gewählte Wirt-Vektor-System verwendet wird, ein Gen, das zumindest befähigt ist, an der Produktion von Homoglutaminsäure beteiligt zu sein, spezieller ein Gen, das ein Protein mit Dehydrogenase-Aktivität gegen P6C codiert, mittels Shotgun-Klonierung kloniert werden kann. Sie stellten auch fest, dass ein Modifikator mit einer bestimmten Homologie (oder Identität) zu den Genen in ähnlicher Weise funktioniert.
Andererseits offenbaren die oben (zitierten) Soda et al., Biochemistry 7 (1968), 4110–4119, ein Verfahren zum Erhalten von kristallinem LAT mit einem Molekulargewicht von 116.000 aus Achromobactor liquidum (= Flavobacterium lutescence) und Yagi et al., J. Biochem. 87 (1980), 1395–1402, offenbaren, dass LAT aus Flavobacterium lutescens aus vier nichtidentischen Untereinheiten, A, B1, B2 und C, aufgebaut ist. Basierend auf diesen Beschreibungen schlugen ihre frühen Untersuchungen des Klonieren eines Gens, das ein Protein mit LAT-Aktivität codiert, wobei die Information genutzt wird, die aus der Aminosäuresequenzierung des gereinigten LAT-Proteins erhalten wurde, fehl. Unter Verwendung eines Verfahrens jedoch, das sich vollständig von den Verfahren, die in diesen Literaturverweisen aus dem Stand der Technik beschrieben sind, unterscheidet, reinigten die Erfinder der vorliegenden Erfindung Proteine mit LAT-Aktivität aus Flavobacterium lutescens auf, sie bestimmten die Aminosäuresequenzen der erhaltenen Proteine und klonierten die Zielgene („objective genes") unter Verwendung dieser Sequenzinformationen und als ein Ergebnis hatten sie Erfolg beim Klonieren eines Gens, das LAT (lat) codiert. Die Erfindung basiert auf den obigen Befunden.
Somit wird gemäß der Erfindung eine isolierte reine DNA, enthaltend ein Gen, das an der Produktion von Homoglutaminsäure beteiligt ist, wobei dieses Gen von einem Bakterium, das zum Genus Flavobacterium lutescens gehört, erhalten werden kann, oder ein Modifikator, welcher unter einer stringenten Bedingung mit dem Gen hybridisiert und eine Funktion aufweist, zur Erlangung bzw. Wiedererlangung der Fähigkeit zur Produktion von Homoglutaminsäure einer Mutante, welcher die Fähigkeit zur Produktion fehlt, befähigt zu sein, bereit.
Spezieller ist das Gen, das an der Produktion von Homoglutaminsäure beteiligt ist, eine DNA, die teilweise oder vollständig mindestens ein Protein, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Protein mit LAT-Aktivität und einem Protein mit Dehydrogenase-Aktivität, codiert, oder ein Modifikator davon.
Insbesondere stellt die Erfindung Folgendes bereit: eine isolierte reine DNA, enthaltend ein Gen, das an der Produktion von L-Homoglutaminsäure beteiligt ist, erhältlich aus einem Bakterium, das zu Flavobacterium lutescens gehört, oder einen Modifikator, welcher mit dem Gen unter einer stringenten Bedingung hybridisiert und eine Funktion aufweist, zur Erlangung bzw. Wiedererlangung der Fähigkeit zur L-Homoglutaminsäure-Produktion einer Mutante von Flavobacterium lutescens, welcher die Fähigkeit zur Produktion fehlt, befähigt zu sein, wobei das Gen, das an der Produktion von L-Homoglutaminsäure beteiligt ist, eine DNA ist, die teilweise oder vollständig mindestens ein Protein codiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Protein mit L-Lysin : 2-Oxoglutarsäure-6-Aminotransferase-Aktivität und einem Protein mit Piperidin-6-carbonsäure-Dehydrogenase-Aktivität, wobei die letztere DNA eine DNA, die die fortlaufende bzw. ununterbrochene Basensequenz von Base 801 bis Base 2276 von SEQ ID NO: 1 enthält, oder eine DNA ist, die die fortlaufende Basensequenz von Base 2855 bis Base 4384 von SEQ ID NO: 3 enthält.
Die Erfindung betrifft auch ein autonom replikatives oder Integrations-replikatives („integration replicative") rekombinantes Plasmid, das die DNA trägt, und eine Transformante, erhalten durch Transformation mit dem rekombinanten Plasmid und ein Verfahren zum Herstellen von Homoglutaminsäure unter Verwendung der Transformante.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Zeichnung, die die Dünnschichtchromatographie-Analyseergebnisse der Homoglutaminsäureproduktion durch Mutanten von F. lutescens zeigt. St ist der Standard Homoglutaminsäure (HG), Spuren 1 bis 4, Spuren 5 bis 7, Spuren 8 bis 10, Spur 11 und Spuren 12 und 13 zeigen die Analyseergebnisse der ersten Mutanten, der zweiten Mutanten, der dritten Mutanten, des Wildtyp-Stamms bzw. der ersten Mutanten mit dem Plasmid pCF704.
2 ist ein Graph, der die L-Lysin-6-Aminotransferase (LAT)-Aktivität von Mutanten von F. lutescens zeigt. Wild, 1st, 2nd und 3rd zeigen die LAT-Aktivitäten des Wildtyp-Stammes, der ersten Mutante, der zweiten Mutante bzw. der dritten Mutante.
3 zeigt die Dünnschichtchromatographie-Analyseergebnisse, die die Komplementarität der Homoglutaminsäureproduktivität von Mutanten mit fehlender Homoglutaminsäureproduktivität durch Plasmid pCF213 zeigen.
HG und Lys zeigen die Wanderungsposition von Homoglutaminsäure und die Wanderungsposition von L-Lysin, und St; 1st pCF213, 2nd pCF213 und 3rd pCF213; Wild pCF213 und Wild pCF704; 1st pCF704 und 2nd pCF704; und 1st pCF111 sind die Ergebnisse der DC-Analysen der Homoglutaminsäure-Standardsubstanz; der Kulturbrühen der ersten, der zweiten bzw. der dritten Mutanten mit pCF313; der Kulturbrühen der Wildtyp-Stämme mit pCF313 bzw. pCF704; der Kulturbrühen der ersten bzw. zweiten Mutanten mit pCF704; und der Kulturbrühen der ersten Mutante mit pCF111 entsprechend.
4 ist ein Graph, der die Homoglutaminsäure-Produktivität mit verstreichender Zeit für F. lutescens IFO 3084 (pCF213) (in der Zeichnung dargestellt durch pCF213) und F. lutescens IFO 3084 (pCF704) (in der Zeichnung dargestellt durch pCF704) zeigt.
5 ist ein Graph, der die Position des ORF, die basierend auf der Basensequenz der pCF213-Insert-Region gefunden wurde, zeigt.
6 ist ein Graph, der die Beziehungen zwischen den Elutionsfraktionen der MonoQ HR5/5-Säulenbehandlung in 3(6) von Beispiel 2 und den relativen LAT-Aktivitäten zeigt.
7 ist eine Photographie anstelle einer Zeichnung, die die Ergebnisse der nativen PAGE (A) und der SDS-PAGE (B) der LAT-aktiven Fraktionen unter Verwendung von Multigel 4/20 und 10/20 in 3(7) von Beispiel 2 zeigt. In der Zeichnung ist M ein Molekulargewichtsmarker, C stellt das in 3 (5) von Beispiel 2 erhaltene Ultrafiltrat dar und die Ziffern stellen die entsprechenden Fraktionsnummern dar.
8 ist ein Graph, der die relativen LAT-Aktivitäten bei Mutanten, denen die Homoglutaminsäure-Produktivität fehlt, und Wildtyp-Stämme durch verschiedene Plasmide zeigt.
9 ist ein Graph, der die Homoglutaminsäure-Produktivität mit Verstreichen der Zeit von F. lutescens IFO 3084, transformiert mit verschiedenen Plasmiden, zeigt.
Spezielle Ausführungsformen der Erfindung
Hinsichtlich der Ursprünge der Gene gemäß der Erfindung (können) beliebige Stämme von Flavobacterium lutescens (hierin nachstehend auch als F. lutescens bezeichnet), einschließlich spontaner Mutanten, solange sie ein Gen bereitstellen können, das an der Produktion von Homoglutaminsäure beteiligt ist, wobei dieses Gen z. B. in F. lutescens als ein Wirt exprimiert werden kann (verwendet werden). Jedoch wird als bevorzugt genannt der IFO 3084-Stamm, welcher leicht zu erhalten ist und dessen geeignete Handhabungsbedingungen, wie Kultur, etabliert sind.
Das Gen, das an der Produktion von Homoglutaminsäure beteiligt ist, bedeutet in der Erfindung jedes Gen, das befähigt ist, an dem zweistufigen Umwandlungssystem von L-Lysin zu Homoglutaminsäure über P6C oder 2-Aminoadipinsäure-6-semialdehyd, welches sich chemisch in einer Gleichgewichtsbeziehung mit P6C befindet, beteiligt zu sein (die erstere Stufe: LAT-Aktivität, die letztere Stufe: Dehydrogenase-Aktivität). Zuerst können als spezifische Beispiele von Genen, die ein Protein mit Dehydrogenase-Aktivität codieren, welches das letztere Umwandlungssystem ist, Gene genannt werden, welche unter Verwendung des Wirt-Vektor-Systems, das durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung etabliert wurde, basierend auf der folgenden Strategie, erhalten werden können.
Die Etablierung eines geeigneten Wirt-Vektor-Systems von F. lutescens ist erforderlich zum Durchführen der Genmanipulation von F. lutescens, aber dafür muss es die folgenden drei Probleme lösen.

(1) Erhalten eines Replikons, welches sich autonom in F. lutescens replizieren kann.
(2) Erhalten eines Wirkstoffresistenzmarkers, welcher in F. lutescens exprimiert werden kann und funktionieren kann.
(3) Etablieren eines Verfahrens zum Einführen einer DNA in F. lutescens.

Glücklicherweise konnten die obigen Probleme (1) und (2) durch die Entdeckung gelöst werden, dass pBBR122, kürzlich durch die Mo Bi Tee Corporation auf den Markt gebracht, welches sich in einer langen Reihe von Gram-negativen Bakterien autonom repliziert und eine Kanamycin- und eine Chloramphenicol-Resistenz aufweist, verwendet werden kann. Zur Lösung des obigen Problems (3) wird zuerst zu einer Vorbedingung, dass ein Verfahren zum Einführen des Plasmids pBBR122 in F. lutescens etabliert wird. Jedoch wurde zuerst eine Untersuchung, basierend auf dem Verfahren der DNA-Einführung in E. coli durch das Elektroporationsverfahren durchgeführt; als ein Ergebnis wuchs eine Kolonie von F. lutescens auf einer L-Platte, enthaltend 20 μg/ml Kanamycin, und durch Kultivieren in Flüssigkeit dieser und Extrahieren der Plasmide mittels des alkalischen SDS-Verfahrens wurde bestätigt, dass pBBR122 stabil in F. lutescens gehalten wurde. Somit wurde das Problem (3) ebenfalls gelöst. Was dieses Wirt-Vektor-System betrifft, so ist es selbst dafür bekannt, dass bei Verwendung anderer Bakterien als Wirt (a) die Transformationseffizienz sehr hoch ist und (b) ein DNA-Fragment einer geeigneten Größe in pBBR122 inseriert werden kann (J. Bac. 178 (1996), 1053–1060), aber es wurde gezeigt, dass die obigen (a) und (b) auch bei F. lutescens möglich sind und es wurde weiterhin ermöglicht, das erhaltene Gen in F. lutescens zu amplifizieren, und darüber hinaus wurde es ermöglicht, ein Gen, das ein Protein mit Dehydrogenase-Aktivität gegen P6C codiert, durch Shotgun-Klonierung zu erhalten. Zur Erleichterung bzw. Ermöglichung des Vorgangs wurde pCF704, bei welchem die multiple Klonierungsstelle von pUC19 anstelle des Chloramphenicolresistenzgens von pBBR122 eingeführt wurde, hergestellt und dies wurde dann als Vektor verwendet.
Anschließend wurde, um ein System zum Evaluieren eines erhaltenen und amplifizierten Gens zu etablieren, eine Mutation in F. lutescens IFO 3084 mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidin (NTG) eingeführt und ein Screening wurde unter Verwendung einer MEM-Platte (pH 7,0), enthaltend Eosin Y, durchgeführt.
Somit wurden die erste Mutante, die überhaupt keine Homoglutaminsäure produzierte, und die zweite und die dritte Mutante, die nur in geringem Ausmaß Homoglutaminsäure produzierten, erhalten. Bei der ersten Mutante, die überhaupt keine Homoglutaminsäure produzierte, wurde bestätigt, dass die lat-Aktivität gleich derjenigen des Wildtyp-Stamms war, und bei der zweiten und bei der dritten Mutante, die nur in geringem Ausmaß Homoglutaminsäure produzierten, wurde nur eine schwache lat-Aktivität bestätigt. Namentlich besteht eine Möglichkeit, dass die erste Mutante an Schädigungen an einem Gen/Genen außer lat, das/die an der Produktion von Homoglutaminsäure beteiligt ist/sind, leidet und dass andererseits die zweite und die dritte Mutante an einigen Schädigungen mindestens an lat leiden.
Anschließend wurde die genomische DNA des Wildtyp-Stamms teilweise mit SauIIIAl verdaut und die 6–8 kbp-Fragmente wurden entsprechend in die BamHI-Stelle von pCF704 inseriert, um eine DNA-Bibliothek herzustellen. Diese Plasmide wurden in die erste, zweite bzw. dritte Mutante eingeführt und die Stämme, welche die Fähigkeit zur Produktion von Homoglutaminsäure erlangten bzw. wiedererlangten, wurden einem Screening unterzogen. Bei dieser Gelegenheit wurde ein Verfahren verwendet, welches das Sammeln von Kolonien, die sich auf einer MEM-Platte (pH 7,0), enthaltend Eosin Y, die zum Screening der Mutanten verwendet wurde, schwarz färbten, und Bestätigen der Fähigkeit zur Homoglutaminsäure-Produktion davon mittels DC umfasst. Als Repräsentanten dieser Mutanten wurde die zweite Mutante (Flavobacterium lutescens, 2. Mutante) am 6. Juli 1998 bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, hinterlegt und ihr wurde die Eingangsnummer bzw. Zugangsnummer FERM P-16874 zugeordnet, und wurde die erste Mutante (Flavobacterium lutescens, 1. Mutante) am 10. Juni 1999 bei diesem Institut hinterlegt und ihr wurde die Eingangsnummer FERM P-17419 zugeordnet, und diese Stämme wurden dort gehalten. Dieser FERM P-16874-Stamm und dieser FERM P-17419-Stamm wurden am 26. Juli 1999 zu ihrer Hinterlegung bei der Internationalen Hinterlegungsbehörde im Rahmen des Budapester Vertrags in dem Institut überführt und es wurden ihnen die Zugangsnummern FERM BP-6798 bzw. FERM BP-6799 zugeordnet.
Als ein Ergebnis wurden ein Stamm mit einem Plasmid, das die Homoglutaminsäure-Produktivität der ersten Mutante komplementiert („complementing"), und ein Stamm mit einem Plasmid, das die Homoglutaminsäure-Produktivität der zweiten Mutante teilweise komplementiert, erhalten. Jedoch neigten die Plasmide dieser Stämme, insbesondere das Plasmid des Stamms, das die zweite Mutante komplementiert, dazu, deletiert zu werden, und ein weiteres Screening zum Erhalten eines stabilen Plasmids war erforderlich. Als ein Ergebnis der DNA-Fragmentanalyse mit Restriktionsenzymbehandlung wurde offenbart, dass das so erhaltene Plasmid mit der Bezeichnung pCF111, welches die erste Mutante komplementiert und die zweite Mutante teilweise komplementiert, und das Plasmid mit der Bezeichnung pCF213 offenbar nahezu das gleiche Plasmid waren.
Andererseits wurden pCF111 und pCF213 in die erste, zweite bzw. dritte Mutante retransformiert und es wurde bezüglich der Fähigkeit zur Homoglutaminsäure-Produktion geprüft. Als ein Ergebnis komplementierten beide Plasmide die erste Mutante, aber sie komplementierten die zweite und die dritte Mutante nur teilweise.
Basierend auf dem Komplementationstest wurde offenbart, dass bei einem Plasmid, das in ausreichender Weise die Fähigkeit zur Homoglutaminsäure-Produktion bei einer Mutante mit fehlender Homoglutaminsäure-Produktivität wiederherstellt, ein Gen, das zumindest an der Produktion von Homoglutaminsäure beteiligt ist, spezieller ein bestimmtes Gen außer lat, vorhanden ist.
Somit kann ohne Einschränkung darauf, aber als eines der „Gene, die an der Produktion von Homoglutaminsäure beteiligt sind" ein Gen genannt werden, welches in dem Insert-Teil des Plasmids pCF213 enthalten ist und ein Protein mit Dehydrogenase-Aktivität codiert. Zum Beispiel ist dieses Gen in der in SEQ ID NO: 3 gezeigten Sequenz vorhanden.
Andererseits kann ein Gen, das an ersterer bzw. der früheren Umwandlung beteiligt ist, das nämlich ein Protein mit LAT-Aktivität gemäß der Erfindung codiert, wie folgt kloniert werden.
F. lutescens wird unter einer bestimmten Kulturbedingung kultiviert, der erhaltene Stamm wird aufgebrochen, die Dispersion mit den aufgebrochenen (Zellen) wird zentrifugiert, um die aufgebrochenen Zellen zu entfernen, und aus dem so erhaltenen Zellextrakt wird das gewünschte Protein isoliert und mittels Ultrazentrifugationsbehandlung, Ammoniumsulfatfällung, Entsalzen, Ionenaustauscher-Säulenchromatographie, Affinitäts-Säulenchromatographie, Ultrafiltration, Elektrophorese etc. gereinigt.
Aus den Ergebnissen der Analyse der Aminosäuresequenz des N-Terminus des gereinigten Proteins werden DNA-Primer konstruiert und eine PCR wird mit der genomischen DNA des F. lutescens (IFO 3084)-Stamms durchgeführt. Basierend auf dem DNA-Fragment, das mittels PCR amplifiziert wurde, wird eine weitere PCR durchgeführt und dadurch wird die Nachbar schaftsregion der beiden äußeren Seiten des DNA-Fragments erhalten. Somit wird eine DNA, die das gewünschte Protein der Erfindung codiert, erhalten.
Es wird somit möglich, eine DNA, die ein Protein mit LAT-Aktivität codiert, als ein anderes Gen, das an der Produktion von L-Homoglutaminsäure beteiligt ist, bereitzustellen. Namentlich kann als anderes Gen der Erfindung z. B. eines genannt werden, das eine Sequenz hat, die die codierende Region der Basensequenz von SEQ ID NO: 1 bildet. Der N-Terminus des entsprechenden gereinigten Proteins ist Ser, wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, aber es wird in Betracht gezogen, dass das N-terminale Met nach der Translation prozessiert wird.
Weiterhin schließt die DNA, enthaltend ein Gen, das an der Produktion von Homoglutaminsäure beteiligt ist, gemäß der vorliegenden Erfindung eine DNA ein, enthaltend mindestens eines von jeweils dem Gen, das ein Protein mit Dehydrogenase-Aktivität codiert, und dem Gen, das ein Protein mit LAT-Aktivität codiert.
Zusätzlich schließt das Gen, auf das in der Erfindung Bezug genommen wird, auch einen Modifikator beider der obigen Gene ein, welcher eine Basensequenz hat, die mit einem der beiden Gene unter einer bestimmten Hybridisierungsbedingung, z. B. unter einer stringenten Bedingung bei 60°C in 2XSSC (in Standard-Citronensäure-Salzlösung), vorzugsweise bei 60°C in 0,5XSSC, insbesondere bevorzugt bei 60°C in 0,2XSSC, hybridisiert und eine Funktion aufweist, zur Erlangung bzw. Wiedererlangung der Fähigkeit zur Homoglutaminsäure-Produktion einer Mutante von F. lutescens, welcher die Fähigkeit zur Produktion fehlt, befähigt zu sein.
Spezieller ist ein Modifikator eines Gens, das ein Protein mit Dehydrogenase-Aktivität codiert, einer der mindestens 70% Identität mit der Basensequenz von Base 2855 bis Base 4387 in SEQ ID NO: 3 zeigt, und ein Modifikator eines Gens, das ein Protein mit LAT-Aktivität codiert, ist einer, der mindestens 50%, vorzugsweise 70%, stärker bevorzugt 95%, Identität mit der Basensequenz von Base 545 bis Base 2658 (codierende Region) in SEQ ID NO: 1 zeigt.
Derartige Modifikatoren schließen einen solchen ein, in welchem eine Base/n entfernt oder hinzugefügt wurde/n oder ein Teil der Basen durch eine andere Base/n ersetzt wurde und zwar am 5'-Terminus, am 3'-Terminus oder in der Mitte einer der beiden obigen Sequenzen. Der Modifikator, in dem ein Teil der Basen durch eine andere Base/n ersetzt ist, schließt einen Modifikator ein, welcher das gleiche Protein codiert, aber eine andere Basensequenz hat, die sich von denjenigen beider der obigen Gene aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet.
Es wird empfohlen, die Basensubstitution außer einer Substitution, die aus der Degeneration des genetischen Codes folgt, unter Berücksichtigung der berechneten bzw. abgeschätzten Aminosäuresequenzen, die durch die beiden obigen Gene codiert werden, so durchzuführen, dass eine ähnliche bzw. gleiche Gestalt als Ganzes des Proteins, basierend auf Ähnlichkeit der Seitenkette jeder Aminosäure, z. B. Hydrophobie, Hydrophilie, Ladung, Größe etc., erhalten wird. Somit wird ein Modifikator, der eine Funktion, die der Funktion eines der beiden der obigen Gene gleich ist, nämlich eine Funktion aufweist, zur Erlangung bzw. Wiedererlangung der Fähigkeit zur Homoglutaminsäure-Produktion einer Mutante von F. lutescens, welcher die Fähigkeit zur Produktion fehlt, befähigt zu sein, mit bemerkenswert hoher Wahrscheinlichkeit erhalten werden.
Der erfindungsgemäße Modifikator kann unter Verwendung einer Nucleinsäure-Synthesevorrichtung („nucleic acid synthesizer") synthetisiert werden oder mittels per se bekannter Punktmutagenese oder ortsspezifischer Mutagenese unter Berücksichtigung der Basensequenzen beider der obigen Gene oder der berechneten bzw. abgeschätzten Aminosäuresequenzen, die durch jene codiert werden, hergestellt werden.
Gemäß der Erfindung kann auch ein rekombinantes Plasmid, das das obige Gen oder den Modifikator trägt, bereitgestellt werden. Ein derartiges Plasmid kann ein autonom replikatives sein, das neben dem obigen Gen oder Modifikator eine autonom replikative bzw. replizierende Sequenz, eine Promotorsequenz, eine Terminatorsequenz, ein Wirkstoffresistenzgen etc. enthält. Weiterhin kann das Plasmid ein Plasmid vom Integrationstyp sein, das eine Sequenz enthält, die zu einer bestimmten Region des Wirtsgenoms, die verwendet werden soll, homolog ist. Als ein Beispiel des autonom replikativen rekombinanten Plasmids, das eine DNA, enthaltend ein Gen, das ein Protein mit Dehydrogenase-Aktivität codiert, trägt, kann ein Plasmid, pBBR122, genannt werden oder eines, welches das Plasmid pBBR122 umfasst, das an einer bestimmten Stelle davon eine Insertion einer multiplen Klonierungsstelle aufweist oder bei dem die bestimmte Stelle oder Region durch eine multiple Klonierungsstelle substituiert ist und bei dem das obige Gen oder der Modifikator unter Verwendung der multiplen Klonierungsstelle inseriert ist. Als spezifische Beispiele derartiger Plasmide können diejenigen genannt werden, die in der Beschreibung als Plasmide pCF111 und pCF213 bezeichnet werden. pCF213 kann durch ein per se bekanntes Plasmidisolierungsverfahren auf Flavobacterium lutescens IFO 3084 (pCF213), welches am 11. März 1998 beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt wurde und welchem die Eingangsnummer FERM P-16699 zugeordnet wurde und welches anschließend zur internationalen Hinterlegung (im Rahmen des) Budapester Vertrages überführt wurde und welchem die Eingangsnummer FERM BP-6797 zugeordnet wurde. Ein rekombinantes Plasmid, das eine DNA, enthaltend ein Gen, das ein Protein mit LAT-Aktivität codiert, trägt und ein rekombinantes Plasmid, das eine DNA, enthaltend beide Gene, trägt, können ebenso in der gleichen Weise wie bei pCF213 konstruiert werden.
Gemäß der Erfindung kann weiterhin auch eine Transformante, erhalten durch Transformieren eines Bakteriums, das zum Genus Flavobacterium gehört, als ein Wirt mit dem obigen rekombinanten Plasmid, bereitgestellt werden. Als das Wirtsbakterium, das zum Genus Flavobacterium gehört, kann jeder beliebige Stamm jeder beliebigen Spezies verwendet werden, solange er die Aufgabe der Erfindung erfüllt, jedoch können als bevorzugte F. lutescens IFO 3084 und F. lutescens SP.7-1 (FERM BP-5457) genannt werden.
Somit kann als ein spezielles Beispiel der obigen Transformante eine genannt werden, die durch Transformieren von F. lutescens IFO 3084 oder F. lutescens SP.7-1 mit pCF213 erhal ten wurde, und F. lutescens IFO 3084 (pCF213) ist als FERM BP-6797 bei der internationalen Hinterlegungsbehörde des National Institute of Bioscience and Human Technology hinterlegt.
Gemäß der Erfindung wird auch ein Verfahren zum Produzieren von Homoglutaminsäure unter Verwendung der Transformante bereitgestellt. In dem Verfahren wird die Transformante in einem Medium, gewachsen durch Kultur, mit L-Lysin oder in einigen Fällen P6C (oder 2-Aminoadipinsäure-6-semialdehyd) als Ausgangsmaterial in Kontakt gebracht oder das Ausgangsmaterial wird mit einer gewachsenen Transformante oder behandelten Zellen davon (z. B. Zellen, die mit einem organischen Lösungsmittel behandelt wurden, ein Zellextrakt, immobilisierte behandelte Zellen) in Kontakt gebracht, um das Ausgangsmaterial in Homoglutaminsäure umzuwandeln.
Als Kohlenstoffquellen des Mediums können jegliche Kohlenstoffquellen verwendet werden, solange sie durch die Transformante verwendbar sind, und wenn F. lutescens als ein Wirt verwendet wird, können zum Beispiel Saccharide, wie Glucose, Fructose, Saccharose und Dextrin, Zuckeralkohole, wie Glycerin und Sorbit, und organische Säuren, wie Fumarsäure und Citronensäure, verwendet werden und es ist wünschenswert, dass die Zugabemenge dieser Kohlenstoffquellen gewöhnlich in der Größenordnung von 0,1 bis 10 Gew.-% (hierin nachstehend als % abgekürzt) liegt.
Als Stickstoffquellen des Mediums können zum Beispiel Ammoniumsalze von anorganischen Säuren, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat und Ammoniumphosphat, Ammoniumsalze von organischen Säuren, wie Ammoniumfumarat und Ammoniumcitrat, und weitere natürliche Stickstoffquellen, wie Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser („corn steep liquor”) und Caseinhydrolysat, verwendet werden und es ist wünschenswert, dass die Zugabemenge dieser Stickstoffquellen gewöhnlich in der Größenordnung von 0,1 bis 10% liegt.
Als anorganische Salze können zum Beispiel Alkalimetallsalze von Phosphorsäure, wie Kaliumphosphat und Natriumphosphat, Alkalimetallchloride, wie Kaliumchlorid und Natriumchlorid, und Metallsalze von Schwefelsäure, wie Magnesiumsulfat und Eisen(II)-sulfat, verwendet werden und es ist wünschenswert, dass die Zugabemenge dieser anorganischen Salze gewöhnlich in der Größenordnung von 0,001 bis 1% liegt.
Unter diesen ist die Flüssigkultur unter Verwendung eines gewöhnlichen Wachstumsmediums für Bakterien bevorzugt und Glucose, Maltose, Stärke etc. als Kohlenstoffquellen und Ammoniumsulfat, Pepton, Hefeextrakt, Sojabohnenmehl etc. als Stickstoffquellen sind besonders effektiv. Zusätzlich werden Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Tafelsalz etc. gewöhnlich als anorganische Salze verwendet.
Es wird empfohlen, dass die Kultur der Mikroorganismen in einem derartigen Medium bei 20 bis 40°C, vorzugsweise 28 bis 37°C, und bei einem pH von 5 bis 9, vorzugsweise 6 bis 8, unter einer aeroben Bedingung durchgeführt wird.
Der Kontakt während der Kultur der gewachsenen Transformante mit dem Ausgangsmaterial wird durchgeführt, indem zuvor das Ausgangsmaterial in das Medium zugegeben wird oder das Ausgangsmaterial während der Kultur in geeigneter Weise zugegeben wird. Der Kontakt kann auch nach Beendigung der Kultur durch Rühren oder Schütteln der gewonnenen bzw. abgenommenen Zellen oder behandelter Zellen und des Ausgangsmaterials in einem Medium oder einem geeigneten Puffer, falls erforderlich mit Zugabe geeigneter Coenzyme etc., in einem Reaktor oder durch Fließenlassen eines Ausgangsmaterials-enthaltenden Materials auf immobilisierte Zellen durchgeführt werden.
Der Fall, in die Transformante und L-Lysin während der Kultur in Kontakt gebracht werden, wird als ein Beispiel genommen und wird unten stehend spezifischer beschrieben. Ein Medium wird mit der Transformante inokuliert und es wird zum Beispiel bei 20 bis 40°C 12 bis 120 Stunden kultiviert, um eine Kulturbrühe des Stamms zu erhalten, die 10⁶ bis 10¹⁰ Mikroorganismen als die Transformante pro ml enthält. Das Ausgangsmaterial L-Lysin als eine Lösung in Wasser oder einem Hilfs-Lösungsmittel oder L-Lysin als solches, ohne dass es gelöst wird, wird zugegeben, so dass die Endkonzentration gewöhnlich 0,5 bis 30 mg/ml sein kann, und die Reaktion wird gewöhnlich bei 20 bis 40°C 18 Stunden bis 7 Tage, vorzugsweise 18 Stunden bis 5 Tage, durchgeführt. Anschließend kann Homoglutaminsäure durch gewöhnliche Reinigungsverfahren, zum Beispiel verschiedene Ionenaustauscherchromatographien unter Verwendung von Kationenaustauscherharzen, Anionenaustauscherharzen etc., Adsorptionschromatographie unter Verwendung von HP20 etc., Präzipitation oder Kristallisation unter Verwendung von Lösungsmitteln und Temperatur und dergleichen, erhalten werden.
Die Beschaffenheit („shape") und die Zugabezeit des zuzugebenden L-Lysins unterliegt keinen besonderen Beschränkungen, aber L-Lysin wird im Hinblick auf die Löslichkeit vorzugsweise als Monohydrochlorid verwendet, und es kann zu Beginn der Kultur oder während der Kultur, z. B. am 1. bis zum 5. Tag, zugegeben werden.
Gemäß der Erfindung wird eine DNA, enthaltend ein Gen, das an der Produktion von Homoglutaminsäure beteiligt ist, bereitgestellt, wobei das Gen L-Lysin zu Homoglutaminsäure umwandelt. Diese DNA ist zweckmäßig in einem mikrobiologischen Produktionsverfahren für Homoglutaminsäure. Gemäß der Erfindung werden auch ein Verfahren zum Produzieren von Homoglutaminsäure durch eine Transformante, die zum effizienten Produzieren von Homoglutaminsäure befähigt ist, und seine Verwendung bereitgestellt.
Hierin nachstehend wird die Erfindung durch spezifische Beispiele weiter detailliert beschrieben. Diese spezifischen Beispiele werden zur Erleichterung bzw. zum Ermöglichen des Verständnisses der Erfindung bereitgestellt und es ist nicht beabsichtigt, die Erfindung auf diese zu beschränken.
Beispiel 1
Klonierung eines Gens, codierend ein Protein mit Dehydrogenase-Aktivität etc.
1. Erhalten eines Stammes, der keine Homoglutaminsäure produziert
3 ml L-Medium (1,0% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, 0,1% Glucose, pH 7,2) wurden mit dem Stamm F. lutescens IFO 3084 inokuliert und bei 32°C unter Schütteln über Nacht inkubiert. 100 μl Kulturbrühe wurden als ein Inokulum in 50 ml L-Medium überimpft und bei 32°C für 4,5 Stunden unter Schütteln kultiviert. Die Zellen wurden aus dieser Kulturbrühe durch Zentrifugation bei 5000 × g für 10 Minuten abgenommen bzw. gesammelt, einmal mit 0,2 M Phosphatpuffer (pH 6,0), gewaschen und in 6 ml 0,2 M Phoshatpuffer (pH 6,0) suspendiert. 50 μl 80 mg/ml NTG wurden zu dieser Zellsuspension zugegeben und eine Schüttelkultur wurde bei 32°C 20 Minuten lang durchgeführt. Die Zellen, die aus dieser Kulturbrühe gesammelt wurden, wurden einmal mit 0,2 M Phosphatpuffer (pH 6,0) gewaschen und die gesamte Menge wurde in 50 ml L-Medium überimpft und es wurde unter Schütteln bei 32°C über Nacht kultiviert. 500 μl-Portionen dieser Kulturbrühe wurden dekantiert bzw. abpipettiert („poured”) und es wurden entsprechend 500 μl-Portionen 60%ige Glycerinlösung zugegeben und die Mischungen wurden entsprechend gut gemischt und anschließend bei –70°C gefroren gelagert. Die gefroren gelagerten Gemische werden als Mutantenlagerungssuspensionen bezeichnet.
Diese Mutantenlagerungssuspension wurde 10⁶fach mit 0,85%iger NaCl(-Lösung) verdünnt und 100 μl-Portionen der Verdünnung wurden auf MEM-Agarmedien (0,5% Polypepton, 0,2% Hefeextrakt, 1,0% Lysin-HCl, 0,006% Methylenblau, 0,04% Eosin Y und 1,5% Agar, pH 7,2) in 8 cm-Petrischalen ausgestrichen und die Kultur wurde bei 32°C 3 Tage lang durchgeführt. Weiße Kolonien unter den gewachsenen Kolonien wurden in 1 ml-Portionen eines Screening-Mediums (1,0% Polypepton, 0,2% Hefeextrakt, 1,0% Lysin-HCl, pH 7,2) überimpft und 2 Tage lang bei 32°C unter Schütteln kultiviert. 3 μl jeder Kultur wurden auf eine Silicagel-DC-Platte übertragen und getrocknet. Diese Platte wurde mit einem Lösungsmittelsystem, bestehend aus Butanol, Essigsäure und Wasser (3:1:1), entwickelt und einer Ninhydrinfärbung unterzogen und dabei wurde jede Spur auf Vorhandensein oder Nicht-Vorhandensein von Homoglutaminsäure geprüft. Somit wurden von den Mutanten die erste Mutante (FERM BP-6799), die überhaupt keine Homoglutaminsäure produzierte, und die zweite Mutante (FERM BP-6798) und die dritte Mutante, die nur eine geringe Menge Homoglutaminsäure produzierten, abgetrennt. Die Ergebnisse, die mittels Prüfen dieser Mutanten auf die Fähigkeit zur Umwandlung von L-Lysin in Homoglutaminsäure (oder der Produktivität bezüglich Homoglutaminsäure) durch DC-Analyse erhalten wurden, sind in 1 gezeigt. In 1 wird Homoglutaminsäure durch HG dargestellt (dies ist auch bei den anderen Zeichnungen der Fall). Die Ergebnisse des Assays der LAT-Aktivität bei diesen Mutanten sind in 2 gezeigt.
2. Konstruktion eines Wirt-Vektor-Systems und eines Transformationssystems
3 ml L-Medium wurden mit dem Stamm F. lutescens IFO 3084 inokuliert und bei 32°C unter Schütteln über Nacht kultiviert. 100 μl der Kulturbrühe wurden als Inokulum in 50 ml L-Medium überimpft und bei 32°C 4,5 Stunden lang unter Schütteln kultiviert. Die Zellen wurden aus dieser Kulturbrühe mittels Zentrifugation bei 5000 × g für 10 Minuten gesammelt, einmal mit 10%iger Glycerinlösung gewaschen und in 3 ml 10%iger Glycerinlösung suspendiert. 200 μl-Portionen dieser Suspension wurden dekantiert bzw. abpipettiert und bei –70°C gefroren gelagert. Die gefroren gelagerten Suspensionen werden als Electrocell-Lagerungssuspensionen bezeichnet. Diese Lagerungssuspension wurde auf Eis aufgetaut und 1 μl einer Lösung von 200 μg/ml eines Vektors mit breitem Wirtsspektrum („Broad Host Range Vector"), pBBR122 (Mo Bi Tec Incorporation), in TE wurde zugegeben. Das Gemisch wurde in eine 0,2 cm-Elektroporationsküvette („Electrocuvette") (BIORAD Incorporation) gegeben, ein elektrischer Impuls wurde unter einer Bedingung von 2,4 kV, 200 Ω und 25 μF unter Verwendung eines Gene Pulser II (BIORAD Incorporation) aufgegeben. Anschließend wurden die Zellen in ein Falcon-Röhrchen gegeben, 1 ml eisgekühltes L-Medium wurde zugegeben und es wurde eine Schüttelkultur bei 32°C 2 Stunden lang durchgeführt. Die Kulturbrühe wurde auf L-Agarmedium (1,0% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, 0,1% Glucose, 1,5% Agar, pH 7,2), enthaltend 20 μg/ml Kanamycin, ausgestrichen und bei 32°C 3 Tage lang kultiviert. Eine Transformante in einer Zahl von 2,4 × 10⁵ wurde erhalten.
3. Konstruktion eines Plasmids pCF704
Ein Primer mit einer EcoRI-Stelle und ein Primer mit einer NcoI-Stelle wurden synthetisiert (Pharmacia Incorporation) und die multiple Klonierungsstelle und 95 bp ihrer Nachbarregion von pUC 18 wurden unter Verwendung von Taq-Polymerase (Pharmacia Incorporation) und dem Thermocycler PCR Thermal Cycler PERSONAL (Takara Company) amplifiziert. Dieses DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und NcoI verdaut und das verdaute Produkt wurde in die EcoRI- und NcoI-Stellen von pBBR122 unter Verwendung des Ligationskits Ligation Kit Version 2 (Takara Company) ligiert. Kompetente Zellen von E. coli JM 109 (Takara Company) wurden mit diesem Reaktionsgemisch transformiert und aus der resultierenden Transformante wurde ein Plasmid pCF704 unter Verwendung des QIAGEN Plasmid Midi-Kits präpariert.
4. Konstruktion eines Plasmids pCF213
Die genomische DNA des Stammes F. lutescens IFO 3084 wurde extrahiert und gemäß dem QIAGEN Blood and Cell Culture DNA-Kits aufgereinigt. Diese genomische DNA wurde mit einem Restriktionsenzym, SauIIIAI, teilweise abgebaut und die resultierenden 6- bis 8-kbp-Fragmente wurden aus Agarosegel ausgeschnitten und DNA wurde gewonnen und unter Verwendung einer Ultrafree C3-Einheit, 0,45 μm, (Millipore Corporation) gereinigt und in TE-Lösung gelöst. Die resultierende Lösung wird als Insert-DNA-Lösung bezeichnet. Andererseits wurde pCF704 mit einem Restriktionsenzym BamHI verdaut und der Verdau wurde mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Der resultierende Verdau und die Insert-DNA-Lösung wurden einer Ligationsreaktion unter Verwendung des Ligation Kit Version 2 (Takara Company) unterzogen und das Reaktionsgemisch wurde als DNA-Bibliothek verwendet.
Diese DNA-Bibliothek wurde zu der Electrocell-Lagerungssuspension der zweiten Mutante zugegeben und ein elektrischer Impuls wurde aufgegeben. Die resultierenden Zellen wurden in ein Falcon-Röhrchen gegeben und 1 ml eisgekühltes L-Medium wurde zugegeben und eine Schüttelkultur wurde bei 32°C 2 Stunden lang durchgeführt. Die gesamte Menge dieser Kulturbrühe wurde in 50 ml L-Medium, enthaltend 20 μg/ml Kanamycin, überimpft und eine Schüttel kultur wurde 2 Tage lang bei 32°C durchgeführt. 500 μl-Portionen der Kulturbrühe wurden dekantiert bzw. abpipettiert und entsprechend wurden 500 μl-Portionen einer 60%igen Glycerinlösung zugegeben und entsprechend gut gemischt und die Gemische wurden bei –70°C gefroren gelagert. Die gefroren gelagerten Gemische werden als Komplementärstamm-Lagerungssuspensionen bezeichnet.
Diese Komplementärstamm-Lagerungssuspension wurde 10³fach mit 0,85%iger NaCl(-Lösung) verdünnt und 100 μl-Portionen der Verdünnung wurden auf MEM-Agarmedien, pH 7,0, (0,5% Polypepton, 0,2% Hefeextrakt, 1,0% Lysin-HCl, 0,006% Methylenblau, 0,04% Eosin Y und 1,5% Agar, pH 7,0) in 8 cm-Petrischalen ausgestrichen und die Kultur wurde 3 Tage lang bei 32°C durchgeführt. Die schwarzen Teile der Zellen, die auf den gesamten Oberflächen gewachsen waren, werden als Komplementärstammgemischzellen bezeichnet. Die entsprechenden Komplementärstammgemischzellen wurden in 3 ml-Portionen des Screening-Mediums überimpft und 2 Tage lang bei 32°C unter Schütteln kultiviert. 3 μl-Portionen jeder der Kulturbrühen wurden tropfenweise auf jede Spur einer Silicagel-DC-Platte aufgegeben und getrocknet. Diese Platte wurde mit einem Lösungsmittelsystem, bestehend aus Butanol, Essigsäure und Wasser (3:1:1) entwickelt und einer Ninhydrinfärbung unterzogen und dabei wurde jede Spur auf das Vorhandensein oder Nicht-Vorhandensein von Homoglutaminsäure hin geprüft. Somit wurden Komplementärstammgemischzellen, die die Fähigkeit zur Homoglutaminsäure-Produktion wiedererlangten, ausgewählt und in Einzelkolonien getrennt und Stämme, die die Fähigkeit zur Homoglutaminsäure-Produktion wiedererlangten, wurden ausgewählt und sie wurden als Komplementärstämme bezeichnet. Eines der Plasmide, das aus diesen Komplementärstämmen unter Verwendung des QIAGEN Plasmid Midi-Kits präpariert wurde, wurde pCF213 genannt. Etwa 6,5 kbp einer Insert-DNA wurden in pCF213 inseriert. Zusammen mit der Komplementarität eines separat erhaltenen Plasmids pCE111 bei jeder Mutante wurde die Komplementarität des obigen pCF213 untersucht und die Ergebnisse sind in 3 gezeigt.
5. Verbesserung der Fähigkeit zur Homoglutaminsäure-Produktion durch pCF213
Ein Stamm, der durch Transformieren eines Wildtyp-Stamms von F. lutescens IFO 3084 mit pCF704 erhalten wurde, wurde als Wild pCF 704-Stamm bezeichnet und ein Stamm, der durch Transformieren eines Wildtyp-Stammes von F. lutescens IFO 3084 mit pCF213 erhalten wurde, wurde als Wild pCF 213-Stamm bezeichnet. Jeder der beiden Stämme wurde durch Inokulieren von 3 ml Screening-Medium, enthaltend 20 μg/ml Kanamycin, verwendet und über Nacht unter Schütteln bei 32°C kultiviert. 100 μl-Portionen jeder dieser Kulturbrühen wurden als Innkuli in 25 ml-Portionen eines Produktionsmediums (1,5% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt, 2,0% Lysin-HCl, pH nicht eingestellt) überimpft und es wurde unter Schütteln bei 32°C 24 Stunden, 48 Stunden bzw. 72 Stunden lang kultiviert. Der Überstand jeder der Kulturbrühen wurde hinsichtlich der Homoglutaminsäuremenge mittels HPLC untersucht. Und zwar wurde die Kulturbrühe mit destilliertem Wasser so verdünnt, dass die Gesamt-Aminosäurekonzentration im Bereich von 1000 mg/l liegen musste, und 50 μl dieser Verdünnung wurden in ein Test röhrchen überführt und unter vermindertem Druck zur Trockene aufkonzentriert. 50 μl einer Lösung, die durch Mischen von Phenylisothiocyanat, Triethylamin, Ethanol und destilliertem Wasser im (Verhältnis) 1:1:7:2 erhalten worden war, wurde dazu gegeben und das Gemisch wurde gerührt, um den Rückstand zu lösen, und 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und unter vermindertem Druck zur Trockene aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in 500 μl Lösung A als der mobilen Phase der HPLC gelöst und 5 μl der Lösung wurden injiziert. Die HPLC-Bedingungen sind unten gezeigt.
Säule: TSK-GEL super-ODS, 4,6ID × 50 mm
Mobile Phase:
Lösung A: Gemisch aus einer Lösung, erhalten durch Einstellen von 140 mM Natriumacetat/0,05% Triethylamin auf pH 6,2 mit Eisessig: Acetonitril im (Verhältnis) 1000:40
Lösung B: 70%iges Acetonitril
Flussrate: 2,0 ml/min
Elutionsbedingung: Gradient einer festgelegten Flussrate, linearer Gradient von 2% bis 40% Lösung B in von 0 bis 7 Minuten, 100% Lösung B bei mehr als 7 Minuten
Detektion: UV 254 nm
Temperatur: 40°C
Unter diesen Bedingungen betrug die Retentionszeit von Homoglutaminsäure 1,3 Minuten und diejenige von Lysin betrug 7,7 Minuten.
Wie aus den in 4 gezeigten Ergebnissen ersichtlich ist, weist der Wildtyp-pCF213-Stamm eine Fähigkeit zur Homoglutaminsäure-Produktion auf, die 1,5-mal höher ist als jene des Wildtyp-pCF704-Stamms.
6. Bestimmung der Genbasensequenz der pCF213-Insert-Region
Die Basensequenz der pCF213-Insert-Region wurde gemäß dem Primer-Walking-Verfahren unter Verwendung der Sequenziervorrichtung ABIPRISM 377XL DNA-Sequencer (Perkin Elmer Corporation) bestimmt. Diese Basensequenz ist in SEQ ID NO: 3 gezeigt.
Das offene Leseraster (ORF) auf der bestimmten Basensequenz wurde unter Verwendung des Verfahrens von Bibb et al. (Gene 30, 157 (1984)) bestimmt. Als ein Ergebnis wurde das in 5 gezeigte ORF gefunden.
7. Analyse der NotI-Stelle von etwa 2,5 kbp in der pCF213-Insert-Region
Es wurde eine Analyse der NotI-Stelle von etwa 2,5 kbp (die Basensequenz von 2077 bis 4578 in SEQ ID NO: 3) in der pCF213-Insert-Region durchgeführt. Diese NotI-Stelle von etwa 2,5 kbp wurde aus dem Agarosegel ausgeschnitten und die DNA wurde gewonnen und unter Verwendung einer Ultrafree C3-Einheit, 0,45 μm (Millipore Corporation) gereinigt und in TE-Lösung gelöst und die Enden wurden gemäß dem DNA-Blunting-Kit (Takara Company) stumpf gemacht („blunted") und die resultierende Lösung wurde als Insert-DNA-Lösung bezeichnet.
Andererseits wurde pCF704 mit einem Restriktionsenzym, HincII, verdaut und anschließend mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Dies und die Insert-DNA-Lösung wurden einer Ligationsreaktion unter Verwendung des Ligationskits Ligation Kit Version 1 (Takara Company) unterzogen. Der Stamm F. lutescens IFO 3084 wurde mit diesem Reaktionsgemisch transformiert und ein Plasmid pCF235 wurde aus der Transformante unter Verwendung des QUIAGEN Plasmid Midi-Kits präpariert.
Die erste Mutante, transformiert mit pCF235, wurde als Inokulum in 3 ml des Screening-Mediums verwendet und 2 Tage lang bei 32°C unter Schütteln kultiviert. 3 μl-Portionen dieser Kulturbrühe wurden tropfenweise auf jeweils eine Spur einer DC-Silicagel-Platte aufgegeben und getrocknet. Diese Platte wurde mit einem Lösungsmittelsystem, bestehend aus Butanol, Essigsäure und Wasser (3:1:1) entwickelt und einer Ninhydrinfärbung unterzogen und jede Spur wurde auf das Vorhandensein oder Nicht-Vorhandensein von Homoglutaminsäure hin geprüft. Als ein Ergebnis wurde aufgezeigt, dass die erste Mutante, die mit pCF235 transformiert ist, die Fähigkeit zur Homoglutaminsäure-Produktion wiedererlangt hatte.
In der DNA-Sequenz von etwa 2,5 kbp, integriert in pCF235, war ein ORF vorhanden, codierend für 510 Aminosäuren mit Beginn bei ATG der 2855. der Basensequenz von SEQ ID NO: 3 und Ende bei TAA der 4387. Diese Aminosäuresequenz wurde einer Homologiesuche mittels BLAST unterzogen und als ein Ergebnis zeigt sich eine hohe Homologie mit verschiedenen Aldehyddehydrogenasen und weiterhin zeigte sich eine hohe Homologie mit der Aminosäuresequenz von Piperidin-6-carbonsäure-Dehydrogenase von Streptomyces clavuligerus, welche kürzlich in der Datenbank registriert wurde (J. Bac., Bd. 180, Nr. 17, 4753–4756 (1998)), und zwar über die gesamte Aminosäuresequenz. Unter Berücksichtigung, dass die erste Mutante, die mit pCF235 transformiert ist, die Fähigkeit zur Homoglutaminsäure-Produktion wiedererlangte und dass die Fähigkeit zur Homoglutaminsäure-Produktion des Wildtyp-pCF213-Stamms erhöht wurde, kann das Protein, das durch dieses ORF codiert wird, als eines mit Piperidin-6-carbonsäure-Dehydrogenase angesehen werden.
Beispiel 2
Klonierung eines Gens, codierend ein Protein mit LAT-Aktivität etc.
1. Assay der LAT-Aktivität
Lysin-HCl (73 mg) und 59 mg 2-Ketoglutarsäure wurden in 1 ml 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,3), enthaltend 0,5 mM Pyridoxalphosphat, gelöst und die Lösung wurde als Reaktionslösung bezeichnet. Die Reaktionslösung (28,75 μl) wurde zu 260 μl der Enzymlösung zugegeben und das Gemisch wurde bei 32°C 1 Stunde lang stehengelassen. 151,8 μl einer Lösung von 5% Trichloressigsäure in Ethanol wurden zugegeben, um die Reaktion zu unterbrechen, das Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert, 90 μl 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,3), enthaltend 4 mM o-Aminobenzaldehyd, wurden zu 60 μl des Überstandes zugegeben und das Gemisch wurde bei 37°C 1 Stunde lang stehengelassen. Das Gemisch wurde bezüglich A465 untersucht und die Fraktionen mit relativ hoher A465 wurden als LAT-aktive Fraktionen bezeichnet.
2. Kultivierung bzw. Kultur des Stamms
Der Stamm F. lutescens IFO 3084 wurde bei 32°C über Nacht unter Schütteln kultiviert. Die Kulturbrühe (50 ml) wurde als Inokulum in 10 l Flavo M9-Medium (0,6% Na₂HPO₄, 0,3% KH₂PO₄, 0,1% NH₄Cl, 0,2% NaCl, 1,0% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Lysin-HCl, 0,005% Silikon KM75, 0,025% MgSO₄, 0,0015% CaCl₂, pH 7,2) in einem 30 l-Fermentationsgefäß überimpft und es wurde unter Rühren mit Belüftung 17 Stunden lang kultiviert. Die resultierende Kulturbrühe (5 1) wurde zentrifugiert (1000 × g, 10 Minuten) um die Zellen zu sammeln, und die Zellen wurden zweimal mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2) gewaschen. Die Zellen wurden in dem gleichen Puffer suspendiert und einem Aufbrechen mittels Ultraschall unterzogen. Die aufgebrochenen Zellen wurden mittels Zentrifugation entfernt (1000 × g, 10 Minuten), um einen Zellextrakt zu erhalten. Der Zellextrakt wurde ultrazentrifugiert (16.000 × g, 90 Minuten) und die Überstandsfraktion wurde den folgenden Aufreinigungsvorgängen unterzogen.
3. Aufreinigung des Enzyms
Alle folgenden Aufreinigungsvorgänge wurden bei 4°C durchgeführt, soweit nichts anderes angegeben ist.
(1) Ammoniumsulfat-Fraktionierung
Die Überstandsfraktion (600 ml), die in Beispiel 1 erhalten worden war, wurde mittels Ammoniumsulfat-Präzipitation gereinigt. Die in den Fraktionen von 30% Sättigung bis 80% Sättigung gebildeten Präzipitate wurden mittels Zentrifugation (1000 × g, 30 Minuten) gesammelt und in 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2) gelöst und die Lösung wurde gegen den gleichen Puffer dialysiert.
(2) Entsalzen
Die dialysierte Enzymlösung (10 ml) wurde auf 4 PD10-Säulen (Amersham Pharmacia) gegossen und eluiert und entsalzt mit 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), enthaltend 0,5 mM Pyridoxalphosphat.
(3) QAE-TOYOPEAL550C-Säulenchromatographie
Die entsalzte Enzymlösung wurde auf eine QAE-TOYOPEAL550C (TOSOH)-Säule (4) 5,5 × 6,0 cm), die zuvor mit 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), enthaltend 0,5 mM Pyridoxalphosphat, äquilibriert worden war, gegossen, mit dem gleichen Puffer gewaschen und durch 2 1 eines linearen Natriumchlorid-Gradienten (0 bis 1,0 M) unter Verwendung des gleichen Puffers eluiert, und die LAT-aktiven Fraktionen wurden gesammelt.
(4) Phenyl-TOYOPERL650S-Säulenchromatographie
1 M Ammoniumsulfat wurde zu den LAT-aktiven Fraktionen zugegeben und das Gemisch wurde auf eine Phenyl-TOYOPERL650S (TOSOH)-Säule (4) 5,5 × 3,0 cm), die zuvor mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2), enthaltend 0,5 mM Pyridoxalphosphat und 1 M Ammoniumsulfat, äquilibriert worden war, gegossen und mit 1200 ml eines Ammoniumsulfatgradienten (0,8 bis 0 M) unter Verwendung des gleichen Puffers eluiert und die LAT-aktiven Fraktionen wurden gesammelt.
(5) Ultrafiltration
Die LAT-aktiven Fraktionen (150 ml) wurden mit ADVANTEC UP-20 ultrafiltriert, um das Volumen auf 15 ml einzustellen. Dieses Konzentrat (2,5 ml) wurde auf PD10-Säulen (Amersham Pharmacia) gegossen und eluiert und entsalzt mit 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,4).
(6) AKTA MonoQ HR5/5-Säulenchromatographie
Die entsalzte Enzymlösung (3,5 ml) wurde auf eine MonoQ HR5/5-Säule eines AK-TAexplorer 10S-Systems (Amersham Pharmacia), die zuvor mit 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) äquilibriert worden war, gegossen, mit dem gleichen Puffer gewaschen und mit 40 ml eines linearen Natriumchlorid-Gradienten (0 bis 0,4 M) unter Verwendung des gleichen Puffers eluiert und die LAT-aktiven Fraktionen wurden gesammelt. Die LAT-aktiven Fraktionen (5 ml) wurden mittels einer PD10-Säule entsalzt und (einer Chromatographie mittels) MonoQ HR5/5-Säule eines AKTAexplorer 10S-Systems unterzogen und die LAT-aktiven Fraktionen wurden gesammelt. Die Beziehungen zwischen jeder Fraktion und der relativen LAT-Aktivität sind in 6 gezeigt.
(7) Elektrophorese
Die LAT-aktiven Fraktionen wurden (einer Elektrophorese mittels) Multigel 4/20 und 10/20 (Daiichi Kagaku Yakuhin Co., Ltd.) unterzogen und Native-PAGE und SDS-PAGE wurden durchgeführt und die Ergebnisse sind in 7 gezeigt. Was die LAT-aktiven Fraktionen betrifft, so wurde eine Bande bei einem Molekulargewicht von etwa 100.000 bei der Native-PAGE beobachtet und es wurde eine Bande bei einem Molekulargewicht von etwa 55.000 bei SDS-PAGE beobachtet. Eine PVDF-Membran wurde mit der Bande mit dem Molekulargewicht von etwa 55.000 bei der SDS-PAGE unter Verwendung von PhastTransfer (Amersham Pharmacia) geblottet.
4. Analyse des N-Terminus der Aminosäuresequenz
Die Analyse des N-Terminus der Aminosäuresequenz der Bande, die dem Blotting unterzogen worden war, wurde mittels des Verfahrens des Edman-Abbaus unter Verwendung eines HP G1005A Protein Sequencing System (HEWLETT PACKARD) durchgeführt. Als ein Ergebnis wurde aufgezeigt, dass der N-Terminus der Aminosäuresequenz wie folgt lautete:
Basierend darauf wurden die DNA-Primer (N = I)
konstruiert und es wurde eine PCR bei der genomischen DNA des Stammes F. lutescens IFO 3084 unter Verwendung des LA PCR in vitro Cloning KIT (Takara Company) durchgeführt. Die PCR-Reaktionsbedingungen lauteten wie folgt: 30 Zyklen bei 94°C, 30 Sekunden → 55°C, 2 Minuten → 72°C, 1 Minute. Als ein Ergebnis wurde ein PCR-Amplifikationsfragment von etwa 400 bp, das den obigen Terminus und seine stromaufwärts gelegene Region enthielt, erhalten. Basierend auf dieser Sequenz wurde eine Nachbarregion unter Verwendung von PCR erhalten.
Und zwar wurde die genomische DNA des Stammes F. lutescens IFO 3084 mit den Restriktionsenzymen PstI bzw. SalI verdaut und die Verdau(produkte) wurden entsprechend einer Selbst-Ligationsreaktion unter Verwendung des Ligation Kit Version 2 (Takara Company) unterzogen und die resultierenden DNAs wurden als Matrizen-DNAs verwendet.
Basierend auf diesen Matrizen-DNAs wurden die DNA-Primer
konstruiert und es wurde eine PCR unter Verwendung von LA Taq (Takara Company) durchgeführt. Die PCR-Reaktionsbedingungen lauteten wie folgt: 30 Zyklen bei 98°C, 20 Sekunden → 68°C, 6 Minuten. Als ein Ergebnis wurde ein PCR-Amplifikationsfragment von etwa 2 kbp von der PstI-Matrize erhalten und es wurde ein PCR-Amplifikationsfragment von etwa 8 kbp von der SalI-Matrize erhalten. Die Basensequenz wurde durch das Primer-Walking-Verfahren unter Verwendung des ABIPRISM 377XL DNA Sequencer (Perkin Elmer Corporation) bei diesen PCR-Amplifikationsfragmenten bestimmt. Diese Basensequenz ist in SEQ ID NO: 1 gezeigt.
5. Konstruktion der Plasmide pCF301 und pCF335
Die folgenden DNA-Primer, worin die PstI-Stellen von Base 545 und Base 2658 von SEQ ID NO: 1 zu KpnI- und SacI-Stellen umgewandelt wurden
wurden hergestellt und eine PCR-Reaktion wurde unter Verwendung dieser Primer durchgeführt, um die lat-Genregion zu amplifizieren. Das amplifizierte Fragment von etwa 2,1 kbp wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und SacI verdaut und die resultierende Lösung wurde als Insert-DNA-Lösung bezeichnet. Andererseits wurde pCF704 mit den Restriktionsenzymen KpnI und SacI verdaut und der Verdau und die Insert-DNA-Lösung wurden einer Ligationsreaktion unter Verwendung des Ligation Kit Version 2 (Takara Company) unterzogen und das resultierende Plasmid wurde als pCF301 bezeichnet. Weiterhin wurde pCF301 mit den Restriktionsenzymen KpnI und SacI verdaut und das 2,1 kbp-Fragment wurde aus dem Agarosegel ausgeschnitten und dies und der Verdau von pCF235 mit den Restriktionsenzymen KpnI und SacI wurden einer Ligationsreaktion unterzogen und das resultierende Plasmid wurde als pCF335 bezeichnet.
6. Komplementation der LAT-Aktivität durch Plasmid pCF301
Eine Mutante, erhalten durch Transformieren der zweiten Mutante mit pCF704, wurde als 2nd pCF704-Stamm bezeichnet und eine Mutante, erhalten durch Transformieren der zweiten Mutante mit pCF301, wurde als 2nd pCF301-Stamm bezeichnet. Diese Stämme wurden bei 32°C über Nacht unter Schütteln kultiviert. Jede der Kulturbrühen (30 μl) wurde als Inokulum in 3 ml eines Produktionsmediums (1,5% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt, 2,0% Lysin-HCl, pH nicht eingestellt) in einem Zentrifugationsröhrchen überimpft und es wurde 17 Stunden lang unter Rühren mit Belüftung kultiviert. Die resultierende Kulturbrühe (1 ml) wurde zentrifugiert (1000 × g, 10 Minuten), um die Zellen zu sammeln, und die Zellen wurden mit 10 ml 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,4), enthaltend 0,5 mM Pyridoxalphosphat, gewaschen. Die Zellen wurden in 1 ml des gleichen Puffers suspendiert und mittels Ultraschall aufgebrochen. Die aufgebrochenen Zellen wurden mittels Zentrifugation (1000 × g, 10 Minuten) entfernt, um einen Zellextrakt zu erhalten. Dieser Zellextrakt wurde auf LAT-Aktivität hin untersucht. Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt. pCF301 komplementierte die LAT-Mutation in der zweiten Mutante.
7. Erhöhung der Fähigkeit zur Homoglutaminsäure-Produktion durch pCF335
Eine Transformante, erhalten durch Transformieren des Wildtyp-Stammes von F. lutescens IFO 3084 mit pCF704, wurde als Wildtyp pCF 704-Stamm bezeichnet und Transformanten, erhalten durch Transformieren des IFO 3084-Stammes mit den Plasmiden pCF301 und pCF335, wurden als Wildtyp-pCF301-Stamm bzw. Wildtyp-pCF335-Stamm bezeichnet. Diese Stämme wurden in 3 ml-Portionen des Screening-Mediums, enthaltend 20 μg/ml Kanamycin, entsprechend überimpft und über Nacht bei 32°C unter Schütteln kultiviert. 100 μl-Portionen jeder der Kulturbrühen wurden als Inokulum in 25 ml-Portionen eines Produktionsmediums (1,5% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt, 2,0% Lysin-HCl, pH nicht eingestellt) überimpft und bei 32°C 24 Stunden, 48 Stunden bzw. 72 Stunden lang unter Schütteln kultiviert. Die Homoglutaminsäuremenge im Überstand jeder dieser Kulturbrühen wurde mittels HPLC gemessen. Und zwar wurde jede dieser Kulturbrühen mit destilliertem Wasser so verdünnt, dass die Gesamt-Aminosäurekonzentration im Bereich von 1000 mg/l liegen konnte, und 50 μl der Verdünnung wurden in ein Teströhrchen überfuhrt und zur Trockene aufkonzentriert. Zu diesem Rückstand wurden 50 μl einer gemischten Lösung von Phenylisothiocyanat, Triethylamin, Ethanol und destilliertem Wasser (1:1:7:2) zugegeben und das Gemisch wurde zur Herstellung einer Lösung gerührt, bei Raumtemperatur 10 Minuten stehengelassen und unter vermindertem Druck zur Trockene aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in 500 μl Lösung A als einer mobilen Phase der HPLC gelöst und 5 μl davon wurden injiziert. Die HPLC-Bedingungen sind wie unter 5 in Beispiel 1 beschrieben.
Als ein Ergebnis, wie in 9 gezeigt, wies der Wildtyp-pCF335-Stamm eine Fähigkeit zur Homoglutaminsäure-Produktion auf, die etwa zweimal höher war als diejenige des Wildtyp-pCF704-Stammes.

Claims

Isolierte reine DNA, enthaltend ein Gen, das an der Produktion von L-Homoglutaminsäure beteiligt ist, erhältlich aus einem Bakterium, das zu Flavobacterium lutescens gehört, oder ein Modifikator, welcher mit dem Gen unter einer stringenten Bedingung hybridisiert und eine Funktion aufweist, zur Erlangung bzw. Wiedererlangung der Fähigkeit zur L-Homoglutaminsäure-Produktion einer Mutante von Flavobacterium lutescens, welcher die Fähigkeit zur Produktion fehlt, befähigt zu sein, wobei das Gen, das an der Produktion von L-Homoglutaminsäure beteiligt ist, eine DNA ist, die teilweise oder vollständig mindestens ein Protein codiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Protein mit L-Lysin:2-Oxoglutarsäure-6-Aminotransferase-Aktivität (a) und einem Protein mit Piperidin-6-carbonsäure-Dehydrogenase-Aktivität (b), wobei die letztere DNA eine DNA, die die fortlaufende bzw. ununterbrochene Basensequenz von Base 801 bis Base 2276 von SEQ ID NO: 1 (a) enthält, oder eine DNA ist, die die fortlaufende Basensequenz von Base 2855 bis Base 4384 von SEQ ID NO: 3 (b) enthält.
DNA gemäß Anspruch 1 mit der Basensequenz von SEQ ID NO: 1 oder der fortlaufenden Basensequenz von Base 545 bis Base 2658 von SEQ ID NO: 1.
DNA gemäß Anspruch 1 mit der Basensequenz von SEQ ID NO: 3 oder der fortlaufenden Basensequenz von Base 2077 bis Base 4578 von SEQ ID NO: 3.
Autonom replikatives oder Integrations-replikatives ("integration replicative") rekombinantes Plasmid, das die DNA gemäß Anspruch 1 trägt.
Rekombinantes Plasmid gemäß Anspruch 4 mit der fortlaufenden Basensequenz von Base 545 bis Base 2658 von SEQ ID NO: 1 und/oder der fortlaufenden Basensequenz von Base 2077 bis Base 4578 von SEQ ID NO: 3.
Rekombinantes Plasmid gemäß Anspruch 4, welches von Flavobacterium lutescens IFO 3084 (pCF213) (FERM 52-6797) erhalten werden kann.
Transformante, erhalten durch Transformieren eines Bakteriums, das zum Genus Flavobacterium gehört, als ein Wirt mit dem rekombinanten Plasmid gemäß Anspruch 4.
Verfahren zum Herstellen von L-Homoglutaminsäure, welches das Kultivieren einer Transformante, erhalten durch Transformation mit dem rekombinanten Plasmid gemäß Anspruch 4, in einem Medium; das Inkontaktbringen der gewachsenen Transformante mit L-Lysin oder 1-Piperidin-6-carbonsäure zur Umwandlung davon in L-Homoglutaminsäure während oder nach der Kultur; und das Gewinnen der so produzierten L-Homoglutaminsäure umfasst.
Verfahren zum Produzieren von L-Homoglutaminsäure gemäß Anspruch 8, wobei die Transformante eine Transformante gemäß Anspruch 7 ist.
Verfahren zum Produzieren von L-Homoglutaminsäure gemäß Anspruch 8, wobei die Transformante eine solche ist, die durch Transformieren eines Bakteriums, das zum Genus Flavobacterium gehört, als ein Wirt mit einem rekombinanten Plas mid, das von Flavobacterium lutescens IFO 3084 (pCF213) (FERM BP-6797) erhalten werden kann, erhalten wird.