ES2337379T3 - Proceso para producir sustancias. - Google Patents
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Abstract
Un microorganismo que pertenece al género Escherichia en el que las actividades de adenililtransferasa de glutamina sintetasa (denominada en lo sucesivo en este documento proteína GlnE) y proteína reguladora PII para glutamina sintetasa (denominada en lo sucesivo en este documento proteína GlnB) se reducen mediante mutación y que tiene la capacidad de formar y acumular L-glutamina o una sustancia biosintetizada utilizando nitrógeno suministrado por L-glutamina y en el que las actividades de adenililtransferasa de glutamina sintetasa y proteína reguladora PII para glutamina sintetasa están reducidas en comparación con cepas antes de la mutación.
Description
Proceso para producir sustancias.
La presente invención se refiere a un
microorganismo que pertenece al género Escherichia que tiene
la capacidad de formar y acumular L-glutamina o una
sustancia biosintetizada utilizando nitrógeno suministrado por
L-glutamina y un proceso para producir
L-glutamina o la sustancia usando el
microorganismo.
En los microorganismos que pertenecen al género
Escherichia y similares, la L-glutamina sirve
no sólo como un sustrato para la síntesis de proteínas, sino
también como un sustrato que suministra nitrógeno en la biosíntesis
de los ácidos nucleicos purina y piridimina y de aminoácidos tales
como L-arginina, L-histidina,
L-triptofano y L-asparagina.
Por otra parte, la biosíntesis de
L-glutamina está catalizada por la glutamina
sintesasa (GS) codificada por el gen glnA y se conoce que la
actividad de GS está sometida a una regulación muy estricta y
complicada. Es decir, la GS está controlada negativamente por la
adenililación. Tales adenililación y desadenililación están
catalizadas por la glutamina-sintetasa
adenililtransferasa (denominada en lo sucesivo en este documento
proteína GlnE) codificada por el gen glnE y la dirección de
la catálisis está determinada por la proteína reguladora PII para
la glutamina sintetasa (denominada en lo sucesivo en este documento
proteína GlnB) codificada por el gen glnB. Cuando la
proteína GlnB se uridilila, la misma promueve la desadenililación de
GS mediante la proteína GlnE y, por el contrario, cuando la
proteína GlnB no está uridililada, la misma promueve la
adenililación de GS por la proteína GlnE. La uridililación y
desuridililación de la proteína GlnB están determinadas por una
proteína codificada por el gen glnD. Como la
L-glutamina promueve la desuridililación, GS se
adenilila para provocar una reducción de la actividad de GS,
conduciendo a la regulación suprimiendo la síntesis de
L-glutamina. Por otra parte, el ácido
2-oxoglutárico promueve la uridililación de la
proteína GlnB, por lo que la síntesis de
L-glutamina se promueve de acuerdo con el esquema
opuesto al anterior (publicaciones no de patente Nº 1 y 2).
Se han realizado intentos para producir
L-glutamina por fermentación mediante la
desregulación del mecanismo complicado descrito anteriormente. En
la publicación de patente Nº 1, se describe que se ha obtenido
Escherichia coli que forma y acumula
L-glutamina modificando GS de forma que su sitio de
adenililación no estará adenililado y mediante potenciación de la
expresión del gen glnA, pero la producción de
L-glutamina por el microorganismo es sólo de 1,3
g/l.
Además, se conocen los siguientes
microorganismos: cepas productoras de glutamina tales como
Corynebacterium glutamicum que tiene una supresión del gen
glnE (publicación de patente Nº 2) y Corynebacterium
glutamicum en el que el gen glnA está modificado y la
expresión del gen gdh está potenciada (publicación de patente
Nº 2); cepas productoras de L-arginina tales como
Escherichia coli en la que se ha introducido el gen
argA (publicación de patente Nº 3); cepas productoras de
L-triptofano tales como Escherichia coli en
la que el operón de triptofano, el gen aroG y el gen
serA se han introducido (publicación de patente Nº 4); cepas
productoras de L-histidina tales como
Escherichia coli con resistencia a aminoquinolina conferida
(publicación de patente Nº 5); y cepas productoras de ácido
nucleico tales como Escherichia coli productora de ácido
5'-inosínico en la que los genes purA, deoD,
purR, add, gsk, edd, xapA, ushA y aph están suprimidos y
la expresión de gen purF desensibilizado está potenciada
(publicación de patente Nº 6) y Escherichia coli productora
de ácido 5'-guanílico en la que los genes
purA, dedo, puR, add, gsk, edd, xapA, ushA y
aph se suprimen y la expresión del gen purF
desensibilizado y el gen guaAB está potenciada (publicación
de patente Nº 6). Sin embargo, no ha habido informes sobre un
microorganismo que pertenezca al género Escherichia en el que
las actividades de la proteína GlnE y la proteína GlnB estén
reducidas o se hayan perdido y que tengan la capacidad de formar y
acumular L-glutamina o una sustancia biosintetizada
utilizando nitrógeno suministrado por L-glutamina y
un proceso para producir L-glutamina o la sustancia
que usa el microorganismo.
Publicación no de patente Nº: 1
E. coli y Salmonella, Segunda
Edición (1996)
Publicación no de patente Nº: 2
FEMS Microb. Lett., 201, 91-98
(2001)
Publicación de patente Nº: 1
Solicitud de Patente No Examinada Publicada
Japonesa Nº 164297/03
Publicación de patente Nº: 2
Solicitud de Patente No Examinada Publicada
Japonesa Nº 300887/02
Publicación de patente Nº:3
Solicitud de Patente No Examinada Publicada
Japonesa Nº 5693/82
Publicación de patente Nº 4:
Patente de los Estados Unidos Nº 5.939.295
Publicación de patente Nº: 5
Solicitud de Patente No Examinada Publicada
Japonesa Nº 86998/01
Publicación de patente Nº: 6
Solicitud de Patente No Examinada Publicada
Japonesa Nº 355087/02
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un microorganismo que pertenece al género
Escherichia que tenga la capacidad de formar y acumular
L-glutamina o una sustancia biosintetizada
utilizando nitrógeno suministrado por L-glutamina y
un proceso para producir L-glutamina o la sustancia
usando al microorganismo.
La presente invención se refiere a los
siguientes (1) a (11).
- (1)
- Un microorganismo que pertenece al género Escherichia en el que las actividades de la glutamina-sintetasa adenililtransferasa (denominada en lo sucesivo en este documento proteína GlnE) y la proteína reguladora PII para glutamina sintetasa (denominada en lo sucesivo en este documento proteína GlnB) se reducen mediante mutación y que tiene la capacidad de formar y acumular L-glutamina o una sustancia biosintetizada utilizando nitrógeno suministrado por L-glutamina y en el que las actividades de la glutamina sintetasa adenililtransferasa y la proteína reguladora PII para glutamina sintetasa están reducidas en comparación con cepas antes de la mutación.
- (2)
- Un microorganismo que pertenece al género Escherichia en el que las actividades de la proteína GlnE y la proteína GlnB se han perdido por mutación.
- (3)
- El microorganismo de acuerdo con los puntos anteriores (1) o (2), donde el microorganismo que pertenece al género Escherichia es un microorganismo en el que un nucleótido se ha suprimido, sustituido o añadido en la secuencia de nucleótidos del gen que codifica la proteína GlnE de tipo silvestre (denominado en lo sucesivo en este documento gen GlnE) y en la del gen que codifica la proteína GlnB de tipo silvestre (denominado en lo sucesivo en este documento gen glnB).
- (4)
- El microorganismo de acuerdo con uno cualquiera de los puntos anteriores (1) a (3), donde el microorganismo que pertenece al género Escherichia es Escherichia coli.
- (5)
- El microorganismo de acuerdo con uno cualquiera de los puntos anteriores (1) a (4), en el que la sustancia biosintetizada utilizando nitrógeno suministrado por L-glutamina es un aminoácido o un ácido nucleico.
- (6)
- El microorganismo de acuerdo con el punto anterior (5), en el que el aminoácido es un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en L-arginina, L-triptofano, L-histidina y ácido L-glutámico.
- (7)
- El microorganismo de acuerdo con el punto anterior (5), en el que el ácido nucleico es un ácido nucleico seleccionado entre el grupo que consiste en adenosina, inosina, guanosina, xantosina, citidina, uridina, timidina, ácido 5'-adenílico, ácido 5'-inosínico, ácido 5'-guanílico, ácido 5'-citidílico, ácido 5'-xantílico, ácido 5'-uridílico y ácido 5'-timidílico.
- (8)
- Un proceso para producir L-glutamina o una sustancia biosintetizada utilizando nitrógeno suministrado por L-glutamina, que comprende: cultivar el microorganismo de acuerdo con uno cualquiera de los puntos anteriores (1) a (4) en un medio; permitir que se forme y se acumule en el medio L-glutamina o la sustancia y recuperar la L-glutamina o la sustancia a partir del medio.
- (9)
- El proceso de acuerdo con el punto anterior (8), en el que la sustancia biosintetizada utilizando nitrógeno suministrado por L-glutamina es un aminoácido o un ácido nucleico.
\newpage
- (10)
- El proceso de acuerdo con el punto anterior (9), en el que el aminoácido es un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en L-arginina, L-triptofano, L-histidina y ácido L-glutámico.
- (11)
- El proceso de acuerdo con el punto anterior (9), en el que el ácido nucleico es un ácido nucleico seleccionado entre el grupo que consiste en adenosina, inosina, guanosina, xantosina, citidina, uridina, timidina, ácido 5'-adenílico, ácido 5'-inosínico, ácido 5'-guanílico, ácido 5'-citidílico, ácido 5'-xantílico, ácido 5'-uridílico y ácido 5'-timidílico.
La presente invención proporciona un
microorganismo que pertenece al género Escherichia que tiene
la capacidad de formar y acumular L-glutamina o una
sustancia biosintetizada utilizando nitrógeno suministrado por
L-glutamina y un proceso para producir
L-glutamina o la sustancia usando el
microorganismo.
Los microorganismos que pertenecen al género
Escherichia en los que las actividades de la proteína GlnE y
la proteína GlnB están reducidas o se han perdido como se ha
definido en este documento anteriormente se pueden obtener mediante
los siguientes métodos: un método en el que las mutaciones por
supresión de los genes glnE y glnB presentes en
microorganismos existentes que pertenecen al género
Escherichia se acumulan en un microorganismo que pertenece
al género Escherichia mediante transducción de P1 [J.H.
Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.
(1972)]; un método en el que se realiza tratamiento por mutación tal
como radiación UV y después se seleccionan las cepas en las que las
actividades de la proteína GlnE y la proteína GlnB están reducidas
o se han perdido; un método en el que las supresiones, sustituciones
o adiciones de nucleótidos se introducen en las secuencias de
nucleótidos del gen glnE y el gen glnB en el ADN
cromosómico de un microorganismo que pertenece al género
Escherichia y similares. En este documento, el gen
glnE y el gen glnB respectivamente consisten en una
secuencia de nucleótidos donde una secuencia de nucleótidos que
contiene una región que regula la expresión génica tal como una
secuencia promotora se añade a la secuencia de nucleótidos que
codifica la proteína GlnE o la proteína GlnB.
En la presente invención, los microorganismos
que pertenecen al género Escherichia en los que las
actividades de la proteína GlnE y la proteína GlnB están reducidas
se refieren a microorganismos en los que las actividades de la
proteína GlnE y la proteína GlnB están reducidas en comparación con
cepas antes de la mutación (cepas parentales) mediante la
introducción de la mutación anterior, específicamente, aquellas en
los que las actividades de proteína están reducidas preferiblemente
en el 80% o menos, preferiblemente el 50% o menos, más
preferiblemente el 30% o menos, adicionalmente preferiblemente el
20%, particularmente preferiblemente el 10% o menos y lo más
preferible es que sea el 5% o menos. Las actividades de la proteína
GlnE y la proteína GlnB se pueden medir mediante métodos
conocidos.
Los métodos para introducir una supresión,
sustitución o adición de un nucleótido en un gen en el ADN
cromosómico de un microorganismo incluyen métodos que utilizan
recombinación homóloga. Un ejemplo de un método general que utiliza
recombinación homóloga es un método que usa un plásmido para
recombinación homóloga preparado ligando un gen mutante que tiene
una supresión, sustitución o adición de nucleótido introducida en un
ADN plasmídico sin capacidad de replicación autónoma en una célula
hospedadora en la que se tiene que introducir la supresión del
nucleótido o similar y que porta un gen de resistencia a fármaco. Un
ejemplo de un método preferido que utiliza recombinación homóloga
es un método en el que se introduce una supresión, una sustitución
o una adición de un nucleótido utilizando el sistema de
recombinación homóloga de fago lambda [Proc. Ntl. Acad. Sci. EE.UU.,
97, 6641-6645 (2000)].
El plásmido para recombinación homóloga se
introduce en una célula hospedadora mediante un método ordinario,
seguido por selección de un transformante en el que el plásmido para
la recombinación homóloga se ha integrado en el ADN cromosómico
mediante recombinación homóloga usando la resistencia a fármaco como
un marcador. El transformante obtenido se cultiva usando un medio
que no contiene el fármaco durante varias horas a un día y después
se propaga en un medio de agar que contiene el fármaco y en un medio
de agar sin el fármaco. Mediante la selección de una cepa que no
crece en el primer medio pero que puede crecer en el segundo medio,
se puede obtener la cepa en la que ocurrió la segunda recombinación
homóloga en el ADN cromosómico. La introducción de una supresión,
sustitución o adición de nucleótido en un gen deseado en el ADN
cromosómico se puede confirmar determinando la secuencia de
nucleótidos de una región del ADN cromosómico que contiene el gen en
el que se ha introducido la supresión o similar. Además, una
supresión, sustitución o adición de nucleótido se puede introducir
eficazmente en genes plurales utilizando recombinación homóloga de
acuerdo con un método usando un ADN lineal.
Específicamente, un ADN lineal que contiene un
gen en el que se tiene que introducir una supresión, sustitución o
adición de nucleótido se incorpora en una célula para provocar
recombinación homóloga entre el ADN cromosómico y el ADN lineal
introducido. Este método es aplicable a microorganismos que
pertenecen al género Escherichia que tienen la capacidad de
incorporar un ADN lineal, preferiblemente aquellos que pertenecen a
Escherichia coli, más preferiblemente Escherichia
coli que expresa un grupo de proteínas recombinantes obtenidas
del fago \lambda (sistema de recombinación Roja).
Un ejemplo de Escherichia coli que
expresa un sistema de recombinación roja \lambda es Escherichia
coli JM101 que porta pKD46, que es un ADN plasmídico que
comprende un gen de sistema de recombinación Roja \lambda
(disponible en Escherichia coli Genetic Stock Center,
Universidad de Yale, EE.UU.).
Los ejemplos de los ADN útiles para
recombinación homóloga son los siguientes:
- (a)
- ADN lineal en el que los ADN que tienen homología con los ADN presentes en el exterior de ambos extremos de una región de ADN cromosómico que se tiene que someter a introducción de una supresión, sustitución o adición de nucleótido están presentes en ambos extremos de un gen de resistencia a fármaco;
- (b)
- ADN lineal en el que los ADN que tienen homología con los ADN presentes en el exterior de ambos extremos de una región de ADN cromosómico que se tiene que someter a introducción de una supresión, sustitución o adición de nucleótido están ligados entre sí;
- (c)
- ADN lineal en el que los ADN que tienen homología con ADN presentes en el exterior de ambos extremos de una región de ADN cromosómico que se tiene que someter a introducción de una supresión, sustitución o adición de nucleótido están presentes en ambos extremos de ADN que consiste en un gen de resistencia a fármaco y un gen que se puede usar para selección negativa y
- (d)
- ADN lineal del punto anterior (a) en el que una secuencia de nucleótidos reconocida por recombinasa Flp obtenida de levadura [Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 82, 5875 (1985)] está presente adicionalmente entre el gen de resistencia a fármaco y los ADN que tienen homología con ADN presentes en el exterior de ambos extremos de la región de ADN cromosómico.
Como el gen de resistencia a fármaco, se puede
usar cualquiera de diversos genes de resistencia a fármaco que
impartan resistencia a un fármaco al que el microorganismo
hospedador muestre sensibilidad. Cuando se usa Escherichia
coli como el microorganismo hospedador, los ejemplos de los
genes de resistencia a fármaco incluyen gen de resistencia a
kanamicina, gen de resistencia a cloranfenicol, gen de resistencia a
gentamicina, gen de resistencia a espectinomicina, gen de
resistencia a tetraciclina y gen de resistencia a ampicilina.
El "gen que se puede usar para selección
negativa" se refiere a un gen que es mortal para un
microorganismo hospedador en determinadas condiciones de cultivo
cuando el gen se expresa en el microorganismo hospedador. Los
ejemplos de los genes son el gen sacB obtenido a partir de un
microorganismo que pertenece al género Bacillus [Appl.
Environ. Microbiol., 59, 1361-1366 (1993)] y el gen
rpsL obtenido a partir de un microorganismo que pertenece al
género Escherichia [Genomics, 72, 99-104
(2001)].
Los ADN que tienen homología con los ADN
presentes en el exterior de ambos extremos de una región de ADN
cromosómico que se tiene que someter a introducción de una
sustitución o supresión, que existen en ambos extremos de los ADN
lineales anteriores, se localizan en la misma dirección que los del
ADN cromosómico, y su longitud es preferiblemente de
aproximadamente 10 pb a 100 pb, más preferiblemente de
aproximadamente 20 pb a 50 pb y adicionalmente preferiblemente de
aproximadamente 30 pb a 40 pb.
La secuencia de nucleótidos reconocida por
recombinasa Flp obtenida de levadura no está limitada
específicamente siempre y cuando sea una secuencia de nucleótidos
reconocida por dicha proteína y que cataliza recombinación
homóloga. Los ejemplos preferidos son ADN que tienen la secuencia de
nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 9 y ADN que tienen una
secuencia de nucleótidos en la que de uno a varios nucleótidos se
han suprimido, sustituido o añadido en dicho ADN y que tienen una
secuencia de nucleótidos reconocida por recombinasa Flp obtenida de
levadura y que cataliza recombinación homóloga.
El ADN anterior que tiene homología se refiere a
ADN que tiene un grado tal de homología que permite la aparición de
recombinación homóloga entre la región objeto de ADN cromosómico y
el ADN lineal anterior, específicamente, homología del 80% o más,
preferiblemente homología del 90% o más, más preferiblemente
homología del 95% o más y adicionalmente preferiblemente homología
del 100%.
La homología entre secuencias de nucleótidos se
puede determinar usando el algoritmo BLAST por Karlin y Altschul
[Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 90, 5873 (1993)] y FASTA [Methods
Enzymol., 183, 63 (1990)]. En base al algoritmo BLAST, se han
desarrollado programas tales como BLASTN y BLASTX [J. Mol. Biol.,
215, 403 (1990)]. Cuando una secuencia de nucleótidos se analiza
mediante BLASTN en base a BLAST, los parámetros, por ejemplo, son
los siguientes: puntuación = 100 y longitud de palabra = 12. Cuando
se usan los programas BLAST y Gapped BLAST, se usan los parámetros
por defecto de cada programa. Las técnicas específicas para estos
análisis se conocen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).
El fragmento de ADN lineal anterior se puede
preparar mediante PCR. El ADN lineal deseado también se puede
obtener construyendo ADN que contiene el ADN lineal anterior en
plásmido y después realizando tratamiento con enzimas de
restricción.
Más específicamente, los ejemplos de los métodos
para introducir una supresión, sustitución o adición de nucleótido
en el ADN cromosómico de un microorganismo utilizando recombinación
homóloga incluyen los siguientes Métodos 1 a 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Método
1
Un método que comprende introducir el ADN lineal
de los puntos anteriores (a) o (d) en un microorganismo hospedador y
seleccionar un transformante que porta el ADN lineal insertado en su
ADN cromosómico mediante recombinación homóloga usando la
resistencia a fármaco como un marcador.
\vskip1.000000\baselineskip
Método
2
Un método que comprende introducir el ADN lineal
del punto anterior (b) en el transformante obtenido de acuerdo con
el Método anterior 1 y eliminar el gen de resistencia a fármaco
insertado en su ADN cromosómico mediante el Método 1 para sustituir
o suprimir una región del ADN cromosómico del microorganismo.
\vskip1.000000\baselineskip
Método
3
Un método que comprende:
- [1]
- introducir el ADN lineal del punto anterior (c) en un microorganismo hospedador y seleccionar un transformante que porta el ADN lineal insertado en su ADN cromosómico mediante recombinación homóloga usando la resistencia a fármaco como un marcador;
- [2]
- sintetizar ADN ligando los ADN que tienen homología con los ADN presentes en el exterior de ambos extremos de una región de ADN cromosómico que se tiene que someter a la introducción de una sustitución o supresión en la misma dirección que la del ADN cromosómico e introducir el ADN sintetizado en el transformante obtenido en el punto anterior [1]; y
- [3]
- cultivar el transformante sometido a la operación del punto anterior [2] en condiciones de forma que el gen que se puede usar para selección negativa se expresa y seleccionar una cepa capaz de crecer mediante el cultivo como una cepa en la que el gen de resistencia a fármaco y el gen que se puede usar para la selección negativa se eliminen del ADN cromosómico.
\vskip1.000000\baselineskip
Método
4
Un método que comprende:
- [1]
- introducir el ADN lineal del punto anterior (d) en un microorganismo hospedador y seleccionar un transformante que porta el ADN lineal insertado en su ADN cromosómico mediante recombinación homóloga usando la resistencia a fármaco como un marcador; y
- [2]
- introducir un plásmido de expresión de gen de recombinasa Flp en el transformante obtenido en el punto anterior [1] y después de la expresión del gen, obtener una cepa sensible al fármaco usado en el punto anterior [1].
En los métodos anteriores, la introducción del
ADN lineal en un microorganismo hospedador se puede realizar
mediante cualquiera de los métodos para introducción de ADN en el
microorganismo, por ejemplo, el método que usa ión calcio [Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU., 69, 2110 (1972)], el método de protoplasto
(Solicitud de Patente No Examinada Publicada Japonesa Nº 248394/88)
y electroporación [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)].
Mediante el uso de un ADN lineal en el que se
inserta un gen arbitrario que se tiene que insertar en ADN
cromosómico en la parte central del ADN lineal usado en el Método 2
o Método 3 [2], es posible eliminar el gen de resistencia a fármaco
y similares y al mismo tiempo insertar un gen arbitrario al ADN
cromosómico.
Los Métodos anteriores 2 a 4 son métodos que no
dejan genes extraños tales como un gen de resistencia a fármaco y
un gen que se puede usar para selección negativa en el ADN
cromosómico del transformante que se obtendrá finalmente. Por lo
tanto, es posible producir fácilmente un microorganismo que tenga
supresiones, sustituciones o adiciones de nucleótidos en dos o más
regiones diferentes del ADN cromosómico repitiendo las operaciones
de estos métodos usando el mismo gen de resistencia a fármaco y el
mismo gen que se puede usar para selección negativa.
Es posible confirmar fácilmente que un
microorganismo en el que las actividades de la proteína GlnE y la
proteína GlnB están reducidas o se han perdido obtenido mediante
los métodos anteriores tiene la capacidad de formar y acumular
L-glutamina o una sustancia biosintetizada
utilizando nitrógeno suministrado por L-glutamina
cultivando microorganismo en un medio y después analizando
L-glutamina o la sustancia formada y acumulada en el
medio mediante un método conocido tal como análisis de HPLC o
bioensayo.
Un ejemplo de un microorganismo que pertenece al
género Escherichia en el que las actividades de la proteína
GlnE y la proteína GlnB se han perdido por mutación y que forma y
acumula L-glutamina obtenible por los métodos
anteriores es Escherichia coli JGLBE1 en la que el gen
glnE y el gen GlnB están suprimidos.
El microorganismo anterior que pertenece al
género Escherichia en el que las actividades de la proteína
GlnE y la proteína GlnB están reducidas o se han perdido como se ha
definido en este documento anteriormente tiene la capacidad no sólo
de formar y acumular L-glutamina sino también la
capacidad de formar y acumular una sustancia biosintetizada
utilizando nitrógeno suministrado por
L-glutamina.
Los ejemplos de las sustancias biosintetizadas
utilizando nitrógeno suministrado por L-glutamina
incluyen aminoácidos y ácidos nucleicos. Los ejemplos preferidos de
los aminoácidos incluyen L-arginina,
L-histidina, L-triptofano y ácido
L-glutámico. Los ejemplos preferidos de los ácidos
nucleicos incluyen adenosina, inosina, guanosina, xantosina,
citidina, uridina, timidina, ácido 5'-adenílico,
ácido 5'-inosínico, ácido
5'-guanílico, ácido 5'-citidílico,
ácido 5'-xantílico, ácido
5'-uridílico y ácido
5'-timidílico.
Los microorganismos que pertenecen al género
Escherichia en los que las actividades de la proteína GlnE y
la proteína GlnB están reducidas o se han perdido como se ha
definido en este documento anteriormente y que tienen la capacidad
de formar y acumular una sustancia biosintetizada utilizando
nitrógeno suministrado por L-glutamina incluyen,
además de Escherichia coli JGLBE1, microorganismos obtenidos
tratando los microorganismos obtenidos mediante los métodos
anteriores adicionalmente mediante los siguientes métodos, solos o
en combinación:
- (a)
- un método en que al menos uno de los mecanismos que regula la biosíntesis de la sustancia se relaja o cancela;
- (b)
- un método en el que la expresión de al menos una de las enzimas implicadas en la biosíntesis de la sustancia está potenciada;
- (c)
- un método en el que el número de copias de al menos uno de los genes enzimáticos implicados en la biosíntesis de la sustancia está aumentado;
- (d)
- un método en el que al menos una de las rutas metabólicas que se ramifican a partir de la ruta biosintética de la sustancia en metabolitos diferentes a la sustancia está debilitada o bloqueada; y
- (e)
- un método en el que se selecciona una cepa celular que tiene una resistencia más elevada a un análogo de la sustancia en comparación con una cepa de tipo silvestre.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando la sustancia es un aminoácido, los
métodos de los puntos anteriores (a) a (b) se describen, por
ejemplo, en la siguiente bibliografía: (a), Agric. Biol. Chem., 43,
105-111 (1979), J. Bacteriol., 110,
761-763 (1972), Appl. Microbiol. Biotechnol., 39,
318-323 (1993), etc.; (b), Agric. Biol. Chem., 43,
105- 111 (1979), J. Bacteriol., 110, 761-763
(1972), etc.; (c), Appl. Microbiol. Biotechnol., 39,
318-323 (1993), Agric. Biol. Chem., 39,
371-377 (1987), etc.; (d), Appl. Environ.
Microbiol., 38, 181-190 (1979), Agric. Biol. Chem.,
42, 1773- 1778 (1978), etc.; y (e) Agric. Biol. Chem., 36,
1675-1684 (1972), Agric. Biol. Chem., 41,
109-116 (1977), Agric. Biol. Chem., 37,
2013-2023 (1973), Agric. Biol. Chem., 51,
2089-2094 (1987), etc. Cuando la sustancia es un
ácido nucleico, los métodos de los puntos anteriores (a) a (e) se
describen específicamente en Biotechnology, segunda edición
completamente revisada, ed. H.J. Rehm, G. Reed, A. Puhler y P.
Stadler, vol. 6 "products of primary metabolism" ed. M. Roehr,
VCH verslgsgesellschaft mbH, Weinheim (1996), Solicitud de Patente
No Examinada Publicada Japonesa Nº 355087/02, etc.
Los microorganismos de la presente invención
también incluyen microorganismos obtenidos sometiendo los
microorganismos que pertenecen al género Escherichia que ya
se conoce que tiene la capacidad de producir una sustancia
biosintetizada utilizando nitrógeno suministrado por
L-glutamina al tratamiento para provocar la
reducción o pérdida de las actividades de la proteína GlnE y de la
proteína GlnB mediante mutación de acuerdo con los métodos descritos
anteriormente.
Los ejemplos conocidos de los microorganismos
que pertenecen al género Escherichia que tienen la capacidad
de producir una sustancia biosintetizada utilizando nitrógeno
suministrado por L-glutamina incluyen Escherichia
coli que produce L-arginina (Solicitud de
Patente No Examinada Publicada Japonesa Nº 5693/82), Escherichia
coli que produce L-triptofano (Patente de los
Estados Unidos Nº 5.939.295), Escherichia coli que produce
L-histidina (Solicitud de Patente No Examinada
Publicada Japonesa Nº 86998/01) Escherichia coli que produce
ácido L-glutámico (Solicitud de Patente No
Examinada Publicada Japonesa Nº 244970/93) Escherichia coli
que produce ácido 5'-inosínico (Solicitud de
Patente No Examinada Publicada Japonesa Nº 355087/02) y
Escherichia coli que produce ácido
5'-guanílico (Solicitud de Patente No Examinada
Publicada Japonesa Nº 355087/02).
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede producir L-Glutamina o
una sustancia biosintetizada utilizando nitrógeno suministrado por
L-glutamina cultivando en un medio un
microorganismo que pertenece al género Escherichia que se
puede preparar mediante los métodos descritos en el punto anterior
1, permitiendo que se formen y acumulen en el medio
L-glutamina o la sustancia y recuperando
L-glutamina o la sustancia a partir del medio.
Los ejemplos de las sustancias biosintetizadas
utilizando nitrógeno suministrado por L-glutamina
incluyen las sustancias mencionadas en el punto anterior 1.
El medio usado en el proceso de producción de la
presente invención puede ser cualquiera de medios sintéticos y
medios naturales siempre y cuando contengan nutrientes necesarios
para el crecimiento del microorganismo de la presente invención y
la biosíntesis de L-glutamina o una sustancia
biosintetizada utilizando nitrógeno suministrado por
L-glutamina, por ejemplo, fuentes de carbono,
fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas y vitaminas.
Como las fuentes de carbono, se puede usar
cualquiera de las fuentes de carbono que se puede asimilar por el
microorganismo usado. Los ejemplos de fuentes de carbono adecuadas
incluyen carbohidratos tales como glucosa y fructosa, alcoholes
tales como etanol y glicerol y ácidos orgánicos tales como ácido
acético.
Los ejemplos de las fuentes de nitrógeno
incluyen amoniaco, sales de amonio tales como sulfato de amonio,
compuestos de nitrógeno tales como amina y fuentes de nitrógeno
naturales tales como peptona e hidrolizado de soja.
Los ejemplos de las sales inorgánicas incluyen
fosfato potásico, sulfato de magnesio, cloruro sódico, sulfato
ferroso y carbonato potásico.
Los ejemplos de las vitaminas incluyen biotina y
tiamina. Además, si es necesario, se pueden añadir sustancias
necesarias para el crecimiento de un microorganismo de la presente
invención (por ejemplo, en el caso de un microorganismo que requiere
aminoácidos, el aminoácido requerido).
El cultivo preferiblemente se realiza en
condiciones aeróbicas, por ejemplo, mediante cultivo por agitación
o cultivo con agitación centrífuga en aireación. La temperatura de
cultivo es de 20 a 50ºC, preferiblemente de 20 a 42ºC y más
preferiblemente de 28 a 38ºC. El pH del cultivo es de 5 a 9,
preferiblemente de 6 a 7,5 y el periodo de cultivo es de 5 horas a 5
días, preferiblemente de 16 horas a 3 días.
La L-Glutamina o la sustancia
biosintetizada utilizando nitrógeno suministrado por
L-glutamina acumulada en el medio se puede
recuperar mediante métodos de purificación ordinarios. Por ejemplo,
la L-glutamina se puede recuperar retirando las
células y las materias sólidas por centrifugación o similar después
del cultivo y después realizando tratamiento de intercambio iónico,
concentración o cristalización fraccionada.
Determinadas realizaciones de la presente
invención se ilustran en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos no
deben interpretarse como limitantes del alcance de la presente
invención.
La supresión de genes específicos en ADN
cromosómico de Escherichia coli se realizó de acuerdo con el
método que utiliza el sistema de recombinación homóloga de fago
lambda [Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 97, 6641-6645
(2000)]. Los plásmidos pKD46, pkD3 y pCP20 usados más adelante se
prepararon mediante extracción, de acuerdo con un método conocido,
a partir de cepas de Escherichia coli que los portan que se
obtuvieron de Escherichia coli Genetic Stock Center,
Universidad de Yale, EE.UU.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de nucleótidos del gen
glnE y del gen glnB de Escherichia coli K12 se
han descrito anteriormente [Science, 5331,
1453-1474 (1997)]. En base a las secuencias de
nucleótidos indicadas, los ADN que consisten en las secuencias de
nucleótidos mostradas en SEC ID Nº: 1 y 2 que se usarán como ADN
cebadores para la supresión del gen glnE y los ADN que
consisten que las secuencias de nucleótidos mostradas en SEC ID Nº:
3 y 4 que se usarán como ADN cebadores para la supresión del gen
glnB se sintetizaron usando un sintetizador de ADN (Modelo
8905, PerSeptive Biosystems, Inc). Los ADN cebadores sintetizados se
diseñaron basándose en las secuencias de nucleótidos de 36 pb que
se encuentran cadena arriba y cadena abajo de los genes diana
respectivos que se tienen que suprimir.
Se realizó PCR usando cada conjunto de los ADN
sintéticos anteriores como un conjunto de cebadores y ADN de pKD3
como un molde. Se realizó PCR durante 30 ciclos de 94ºC durante un
minuto, 55ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 3 minutos, usando 40
\mul de una mezcla de reacción que comprende 10 ng del ADN
plasmídico, 0,5 \mumol/l de cada uno de los cebadores, 2,5
unidades de ADN polimerasa de Pfu (Stratagene), 4 \mul de
tampón para ADN polimerasa de Pfu (10 x) (Stratagene) y 200
\mumol/l de cada uno de los desoxiNTP.
Un décimo de cada una de las mezclas de reacción
resultantes se sometió a electroforesis en gel de agarosa para
confirmar que el fragmento deseado se había amplificado. Después, la
mezcla de reacción restante se mezcló con un volumen igual de
fenol/cloroformo (1 vol/I vol) saturado con TE [10 mmol/l de
Tris-HCl (pH 8,0), 1 mmol/l de EDTA].
La mezcla resultante se centrifugó y la capa
superior obtenida se mezcló con un volumen de dos veces de etanol
frío y se dejó que reposara a -80ºC durante 30 minutos, seguido de
centrifugación para precipitar el ADN. Después, el precipitado de
ADN se disolvió en 20 \mul de TE. Mediante este procedimiento, se
obtuvieron fragmentos génicos de resistencia a cloranfenicol para
supresión del gen glnE y el gen glnB.
\vskip1.000000\baselineskip
Escherichia coli JM101 se transformó con
pKD46 y Escherichia coli JM101 que portaba pKD46 (denominada
en lo sucesivo en este documento Escherichia coli
JM101/pKD46) se seleccionó en medio LB agar que contenía 100 mg/l
de ampicilina. La Escherichia coli JM101/pkD46 cultivada en
presencia de 10 mmol/l de L-arabinosa y 50 \mug/ml
de ampicilina se transformó mediante electroporación usando el
fragmento génico de resistencia a cloranfenicol para supresión del
gen glnE y una cepa recombinante en la que el gen de
resistencia a cloranfenicol se había insertado en el gen
glnE en el ADN cromosómico de la cepa JM101 y el gen
estructural de glnE se suprimió, se seleccionó en medio LB
agar que contenía 25 mg/l de cloranfenicol.
Las réplicas de la cepa resistente a
cloranfenicol obtenida se prepararon en medio de LB agar que
contenía 25 mg/l de cloranfenicol, seguido por aislamiento de
colonia única a 42ºC. Después, las réplicas de las colonias
obtenidas se prepararon en medio de LB agar que contenía 25 mg/l de
cloranfenicol y LB agar que contenía 100 mg/l de ampicilina para
seleccionar una colonia que mostraba resistencia a cloranfenicol y
sensibilidad a ampicilina. La cepa con pKD46 eliminado seleccionada
se transformó usando pCP20, se propagó en medio LB agar que contenía
100 mg/l de ampicilina y se cultivó durante una noche a 30ºC.
Las réplicas de la cepa resistente a ampicilina
que crecieron en el medio se prepararon en medio LB agar sin
fármaco, seguido por aislamiento de colonia única a 42ºC. Después,
las réplicas de las colonias obtenidas se prepararon en medio LB
agar sin fármaco, medio LB agar que contenía 25 mg/l de
cloranfenicol y medio LB agar que contenía 100 mg/l de ampicilina
para seleccionar colonias que mostraban sensibilidad a cloranfenicol
y sensibilidad a ampicilina. Los ADN cromosómicos se prepararon a
partir de las cepas respectivas obtenidas de ese modo de acuerdo
con un método ordinario [Seibutsukogaku Jikkensho (Experiments in
Biotechnology), editado por The Society for Biotechnology, Japón,
pág. 97-98, Baifukan (1992)]. Se realizó PCR de
colonia usando ADN cebadores que consisten en las secuencias de
nucleótidos mostradas en SEC ID Nº: 5 y 6 que se diseñaron basándose
en una secuencia de nucleótidos interna del gen glnE.
Se realizó PCR de colonia durante 30 ciclos de
94ºC durante un minuto, 55ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 3
minutos, usando 40 \mul de una mezcla de reacción que comprende
las células en una cantidad obtenida poniendo en contacto una punta
de pipeta de 200 \mul con la colonia, 0,5 \mumol/l de cada uno
de los cebadores, 2,5 unidades de ADN polimerasa de Pfu, 4
\mul de tampón para ADN polimerasa de Pfu (10 x) y 200
\mumol/l de cada uno de los desoxiNTP. De las cepas sometidas a
PCR, se identificó una cepa con la que no se detectó amplificación
génica como una cepa que tenía la supresión del gen glnE y se
denominó Escherichia coli JGLE1.
De la misma manera a la anterior, Escherichia
coli JM101/pKD46 se transformó usando el fragmento génico de
resistencia a cloranfenicol para supresión del gen glnB para
obtener Escherichia coli en la que el gen glnB se
había suprimido y la cepa obtenida se denominó Escherichia
coli JGLB1.
\vskip1.000000\baselineskip
Escherichia coli JGLE1 obtenido en el
punto anterior (2) se transformó con pKD46, se propagó en medio LB
agar que contenía 100 mg/l de ampicilina y se cultivó durante una
noche a 30ºC para obtener Escherichia coli JGLE1 que portaba
pkD46 (denominada en este documento en lo sucesivo Escherichia
coli JGLE1/pKD46). De la misma manera que en el punto anterior
(2) Escherichia coli JGLE1/pKD46 se transformó mediante
electroporación con el fragmento génico de resistencia a
cloranfenicol para la supresión del gen glnB para obtener una
cepa recombinante en la que el gen glnB en el ADN
cromosómico se había suprimido. Se realizó PCR de colonia en las
mismas condiciones que en el punto anterior (2) usando ADN
cebadores que consisten en las secuencias de nucleótidos mostradas
en SEC ID Nº: 7 y 8 que se denominaron basándose en una secuencia de
nucleótidos interna en el gen glnB. Un cepa con la que no se
detectó amplificación génica en la PCR anterior se identificó como
una cepa que tenía la supresión del gen glnB y se denominó
Escherichia coli JGLBE1.
Escherichia coli JM101 y Escherichia
coli JGLB1, Escherichia coli JGLE1 y Escherichia
coli JGLBE1 obtenidas en el Ejemplo 1 se inocularon
respectivamente en 8 ml de medio LB [10 g/l de
Bacto-triptona (Difco), 5 g/l de extracto de
levadura (Difco) y 5 g/l de cloruro de sodio] en un tubo de ensayo y
se cultivaron a 28ºC durante 17 horas. Cada uno de los cultivos
resultantes se inoculó en 8 ml de un medio de producción [16 g/l de
hidrogenofosfato dipotásico, 14 g/l de dihidrogenofosfato potásico,
5 g/l de sulfato de amonio, 1 g/l de ácido cítrico (anhidro), 5 g/l
de ácido Casamino (Difco), 10 g/l de glucosa, 10 mg/l de vitamina
B_{1}, 25 mg/l de heptahidrato de sulfato de magnesio y 50 mg/l
de heptahidrato de sulfato ferroso; pH ajustado a 7,2 con 10 mol/l
de hidróxido sódico; glucosa, vitamina B_{1}, heptahidrato de
sulfato de magnesio y heptahidrato de sulfato ferroso se añadieron
después de esterilización por vapor separada] en un tubo de ensayo
en una cantidad del 1% y se cultivaron a 30ºC durante 24 horas. El
cultivo resultante se centrifugó para obtener un sobrenadante de
cultivo.
El producto en el sobrenadante de cultivo se
derivatizó mediante el método de F-moc y después se
analizó mediante HPLC. El análisis de HPLC se realizó usando
ODS-HG5 (Nomura Kagaku Co., Ltd.) como una columna
de separación y solución A (6 ml/l de ácido acético y acetonitrilo
al 20% (v/v), pH ajustado a 4,8 con trietilamina) y solución B (6
ml/l de ácido acético y acetonitrilo al 70% (v/v), pH ajustado a 4,8
con trietilamina) como eluyentes. La proporción de solución A a
solución B fue de 8:2 durante los primeros 5 minutos de elución y a
partir de entonces se cambió con un gradiente lineal de forma que
la proporción se volvió 1:1 a los 20 minutos después del inicio de
la elución. Los resultados de análisis se muestran en la Tabla
1.
Los resultados en la Tabla 1 revelaron que
Escherichia coli JGLBE1 en la que el gen glnE y el gen
glnB se habían suprimido acumula una cantidad extraordinaria
de L-glutamina en el medio en comparación con
Escherichia coli JGLB1 o JGLE1 que tenían una supresión
génica única en la que el gen glnE o el gen glnB se
había suprimido.
Escherichia coli JGLBE1 obtenida en el
Ejemplo 1 se inoculó en 50 ml de medio LB en un matraz de Erlenmeyer
de 300 ml y se cultivó a 28ºC durante 17 horas.
El cultivo resultante se inoculó en 950 ml de un
medio de producción para fermentación en tarro [7 g/l de
dihidrogenosfosfato potásico, 5 g/l de cloruro de amonio, 1 g/l de
ácido cítrico (anhidro) 5 g/l de extracto de levadura (Kyokuto
Pharmaceutical Ind. Co., Ltd.), 10 mg/l de heptahidrato de sulfato
de manganeso, 20 g/l de glucosa, 10 mg/l de vitamina B_{1}, 2
mg/l de heptahidrato de sulfato de magnesio y 0,2 g/l de
heptahidrato de sulfato ferroso; pH ajustado a 7,2 con 10 mol/l de
hidróxido sódico; glucosa, vitamina B_{1}, heptahidrato de
sulfato de magnesio y heptahidrato de sulfato ferroso se añadieron
después de esterilización por vapor separada] en un fermentador de
tarro 2-1 en una cantidad del 1%. El cultivo se
realizó a 30ºC con agitación (900 rpm) y aireación (aire comprimido
esterilizado con un filtro de esterilización; 1,0 vvm), durante el
cual el pH del medio se mantuvo a 7,0 con hidróxido de amonio al
18%. Después de que la glucosa añadida inicialmente se había
agotado (después de 24 horas), se suministró una solución de glucosa
al 60% esterilizada a una velocidad de 10 a 13 ml por hora.
Después de 50 horas de cultivo, el cultivo
resultante se analizó de la misma manera que en el Ejemplo 2,
mediante lo cual se observó que se habían acumulado 8,0 g/l de
L-glutamina en el cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede producir eficazmente
L-Glutamina o una sustancia biosintetizada
utilizando nitrógeno suministrado por L-glutamina
mediante la presente invención.
| SEC ID Nº: 1 - Descripción de Secuencia Artificial: ADN Sintético |
| SEC ID Nº: 2 - Descripción de Secuencia Artificial: ADN Sintético |
| SEC ID Nº: 3 - Descripción de Secuencia Artificial: ADN Sintético |
| SEC ID Nº: 4 - Descripción de Secuencia Artificial: ADN Sintético |
| SEC ID Nº: 5 - Descripción de Secuencia Artificial: ADN Sintético |
| SEC ID Nº: 6 - Descripción de Secuencia Artificial: ADN Sintético |
| SEC ID Nº: 7 - Descripción de Secuencia Artificial: ADN Sintético |
| SEC ID Nº: 8 - Descripción de Secuencia Artificial: ADN Sintético |
| SEC ID Nº: 9 - Descripción de Secuencia Artificial: ADN Sintético |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proceso para producir sustancias
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 1000P11695W00
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP2004-189012
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
25-06-2004
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 56
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ADN Sintético
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<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttgagcggc tgccagagcc tttagccgag gaatcagtgt aggctggagc tgcttc
\hfill56
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 56
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ADN Sintético
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipctgccagctt gcccgcacca gttcacgctc tgcggtcata tgaatatcct ccttag
\hfill56
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<210> 3
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<211> 56
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ADN Sintético
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<400> 3
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\hfill56
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<210> 4
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ADN Sintético
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\hfill56
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<210> 5
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ADN Sintético
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\hfill27
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ADN Sintético
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ADN Sintético
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\hfill27
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<210> 8
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<211> 27
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ADN Sintético
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<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskipatggaaacat ccggcaaccc ttgacgc
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<211> 34
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ADN Sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskipgaagttccta tactttctag agaataggaa cttc
\hfill34
Claims (11)
1. Un microorganismo que pertenece al género
Escherichia en el que las actividades de adenililtransferasa
de glutamina sintetasa (denominada en lo sucesivo en este documento
proteína GlnE) y proteína reguladora PII para glutamina sintetasa
(denominada en lo sucesivo en este documento proteína GlnB) se
reducen mediante mutación y que tiene la capacidad de formar y
acumular L-glutamina o una sustancia biosintetizada
utilizando nitrógeno suministrado por L-glutamina y
en el que las actividades de adenililtransferasa de glutamina
sintetasa y proteína reguladora PII para glutamina sintetasa están
reducidas en comparación con cepas antes de la mutación.
2. Un microorganismo que pertenece al género
Escherichia en el que las actividades de proteína GlnE y
proteína GlnB se pierden por mutación.
3. El microorganismo de acuerdo la
reivindicación 1 ó 2, en el que el microorganismo que pertenece el
género Escherichia es un microorganismo en el que un
nucleótido se ha suprimido, sustituido o añadido en la secuencia de
nucleótidos del gen que codifica la proteína GlnE de tipo silvestre
y en el del gen que codifica la proteína GlnB de tipo silvestre.
4. El microorganismo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el
microorganismo que pertenece al género Escherichia es
Escherichia coli.
5. El microorganismo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la sustancia
biosintetizada utilizando nitrógeno suministrado por
L-glutamina es un aminoácido o ácido nucleico.
6. El microorganismo de acuerdo con la
reivindicación 5, en el que el aminoácido es un aminoácido
seleccionado entre el grupo que consiste en
L-arginina, L-triptofano,
L-histidina y ácido L-glutámico.
7. El microorganismo de acuerdo con la
reivindicación 5, en el que el ácido nucleico es un ácido nucleico
seleccionado entre el grupo que consiste en adenosina, inosina,
guanosina, xantosina, citidina, uridina, timidina, ácido
5'-adenílico, ácido 5'-inosínico,
ácido 5'-guanílico, ácido
5'-citidílico, ácido 5'-xantílico,
ácido 5'-uridílico y ácido
5'-timidílico.
8. Un proceso para producir
L-glutamina o una sustancia biosintetizada
utilizando nitrógeno suministrado por L-glutamina,
que comprende: cultivar el microorganismo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en un medio; permitir que
L-glutamina o la sustancia se formen y acumulen en
el medio; y recuperar la L-glutamina o la sustancia
a partir del medio.
9. El proceso de acuerdo con la reivindicación
8, en el que la sustancia biosintetizada utilizando nitrógeno
suministrado por L-glutamina es un aminoácido o un
ácido nucleico.
10. El proceso de acuerdo con la reivindicación
9, en el que el aminoácido es un aminoácido seleccionado entre el
grupo que consiste en L-arginina,
L-triptofano, L-histidina y ácido
L-glutámico.
11. El proceso de acuerdo con la reivindicación
9, en el que el ácido nucleico es un ácido nucleico seleccionado
entre el grupo que consiste en adenosina, inosina, guanosina,
xantosina, citidina, uridina, timidina, ácido
5'-adenílico, ácido 5'-inosínico,
ácido 5'-guanílico, ácido
5'-citidílico, ácido 5'-xantílico,
ácido 5'-uridílico y ácido
5'-timidílico.
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