PT1075276E

PT1075276E - Composição adjuvante e métodos para sua utilização

Info

Publication number: PT1075276E
Application number: PT99922832T
Authority: PT
Inventors: Glen D Leesman
Original assignee: Corixa Corp
Priority date: 1998-05-07
Filing date: 1999-05-07
Publication date: 2008-01-22
Also published as: NO20005596D0; HUP0101804A3; EP1075276A2; CN101219217A; US6630161B1; WO1999056776A3; HUP0101804A2; HK1039072A1; KR100682154B1; KR20010043404A; DE69937343D1; DK1075276T3; NZ508013A; CY1107265T1; CA2330610A1; AU3973799A; AU755445B2; US20030215497A1; WO1999056776A2; ES2296390T3

Description

DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÃO ADJUVANTE E MÉTODOS PARA SUA UTILIZAÇÃO"

Antecedentes da Invenção

As vacinas compreendem antigénios ou combinações de antigénios que, quando administrados num animal de sangue quente, previnem, melhoram ou tratam a doença. As vacinas para doenças infecciosas compreendiam, originalmente, micróbios inteiros, mortos ou atenuados. No entanto, verificou-se rapidamente que apenas algumas proteínas ou fragmentos proteicos de um micróbio ou célula estimulavam uma resposta imunitária protectora e, na realidade, a inclusão de materiais estranhos à célula toda pode impedir a resposta imunitária. Deste modo, o desenvolvimento de vacinas focou-se na identificação da proteina, fragmento proteico, epitopo e segmento de ADN codificando esse epitopo em particular que induz a resposta imunitária protectora. No entanto, à medida que a identificação de antigénio se tornou mais exacta a eficácia da vacina diminuiu. Os antigénios identificados foram muitas vezes pequenas moléculas incapazes de serem reconhecidas pelas células de processamento de antigénio. Foi, deste modo, necessário combinar estes antigénios com substâncias que aumentem a antigenicidade do antigénio e proporcionem uma resposta imunitária superior. Estas substâncias são os adjuvantes.

Os adjuvantes funcionam de vários modos. Alguns auxiliam na apresentação do antigénio às células apresentadoras de antigénio 1 (APC). As emulsões óleo em água, emulsões água em óleo, lipossomas e microesferas auxiliam na apresentação de antigénio a APC. Pequenos antigénios ou haptenos estão, muitas vezes, ligados a proteínas ou polissacáridos imunogénicos maiores para facilitar o reconhecimento pela APC. Certos adjuvantes apresentam um efeito de depósito que mantêm o antigénio no lugar apropriado até o corpo ter uma oportunidade para estabelecer uma resposta imunitária. Outros adjuvantes estimulam o sistema imunitário, geralmente, aumentando a resposta específica estabelecida para o antigénio.

Os derivados de lípido A atenuado (ALD), monofosforil-lípido A (MLA) e monofosforil-lípido A 3-desacilado (3D-MLA) são potentes adjuvantes imunológicos utilizados em vacinas profilácticas para a doença infecciosa e vacinas terapêuticas para o tratamento de tumores cancerígenos e infecções crónicas. O MLA e 3D-MLA são formas modificadas (LPS) da endotoxina bacteriana lipopolissacárida e são conhecidas e descritas nas Patentes U.S. N° 4436727 e 4912094, respectivamente. O MLA e 3D-MLD induzem um resposta humoral por anticorpo e uma resposta imunitária mediada por células em doentes quando administrados os compostos com um antigénio. O documento WO 96/14871 descreve uma composição imunogénica compreendendo um óleo metabolizável, e. g., esqualeno e um tensioactivo, e. g., fosfatidilcolina ou esfingomielina. O documento JP-A-57206625 descreve uma preparação de imunoglobulina contendo Pluronic® F68 (Poloxâmero 188). O documento WO 95/17210 descreve uma composição adjuvante compreendendo QS21, 3D-MPL e uma emulsão óleo em água 2 compreendendo um óleo metabolizável, tal como o esqualeno, α-tocoferol e tween 80 dissolvidos em PBS.

Uma vacina eficaz apresenta antigénios a um animal de sangue quente, de modo que o animal consiga estabelecer uma resposta imunitária protectora a esses antigénios. Muitas vezes, a composição da vacina deve incluir um adjuvante para alcançar este efeito. Os adjuvantes que estimulam uma resposta imunitária humoral e celular e são seguros e não tóxicos poderão promover a eficácia de qualquer vacina.

Sumário da Invenção A presente invenção é uma nova composição adjuvante, como definido nas reivindicações em anexo. São também reivindicadas as composições de vacina da nova emulsão estável.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção é uma composição adjuvante que é uma emulsão óleo em água estável, compreendendo um óleo metabolizável, um ou mais tensioactivos, um antioxidante e um componente para tornar a emulsão isotónica. A emulsão resultante pode ser tamponada e apresentar um tamanho de partícula inferior a 3 yg. O equilíbrio hidrofílico-lipofílico da emulsão estável é de cerca de 7,5 a cerca de 13,0, e. g., 10,5.

Num aspecto, o equilíbrio hidrofílico-lipofílico é de cerca de 8,0. 3

Noutro aspecto, o equilíbrio hidrofílico-lipofílico é de cerca de 7,5 a cerca de 13,0 e a emulsão compreende 10% volume/volume de esqualeno, 0,09% peso/volume de poloxâmero 188, 1,9% peso/volume de fosfatidilcolina de ovo, 1,75% em volume/volume de glicerol e 0,05% peso/volume de poloxâmero 188, 1,9% peso/volume de fosfatidilcolina de ovo, 1,75% volume/volume de glicerol e 0,05% peso/volume de α-tocoferol.

Numa forma de realização preferida, a emulsão estável compreende desde cerca de 2% a cerca de 15% e, de um modo preferido, 10% volume/volume do óleo metabolizável esqualeno. Os tensioactivos estão presentes na emulsão estável em cerca de 2%. À emulsão estável da presente invenção podem ser adicionadas, aproximadamente, 50 yg de um antioxidante e, aproximadamente, 1,75% de um agente para tornar a emulsão isotónica.

Os óleos metabolizáveis úteis, de acordo com a presente invenção, incluem esqualeno, óleo de soja, óleo de sésamo e óleo MIGLYOL® 810. O esqualeno é preferido.

Os tensioactivos úteis, de acordo com a presente invenção, são monooleato de polioxietileno sorbitano (Tween® 80, CAPMUL® POE-O tensioactivo de baixo PV (ABITEC Corp. Janesville, WI)), 12-hidroxiestearato de polietilenoglicol 660 (tensioactivo SOLUTOL® HS 15) (BASF Corp., Chicago, IL) e co-polímero de blocos polioxietileno-polioxipropileno (co-polímero de blocos PLURONIC® F68) (poloxâmero 188 de BASF Corp., Chicago, IL) , colato de sódio, glicerodesoxicolato, fosfatidilcolina, sendo preferido o co-polímero de blocos PLURONIC® F68. Verificou-se que o Tween 80 e tensioactivo CAPMUL POE-O® de baixo PV produziram um resposta do tipo histamina quando administrados intravenosamente em cães. Outros tensioactivos adequados incluem esfingolípidos, 4 tais como esfingomielina e esfingosina, e fosfolípidos, tais como fosfatidilcolina de ovo, 1,2-Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, L-a-fosfatidiletanolamina e 1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) ou suas misturas. 0 DPPC é aceitável para utilização em humanos.

Oa antioxidantes úteis na emulsão estável da presente invenção incluem α-tocoferol e ácido ascórbico, sendo preferido o a-tocoferol.

Os agentes que podem ser adicionados à emulsão da presente invenção, para tornar o adjuvante isotónico, incluem dextrose, glicerol, manitol, sorbitol, PEG 300, PEG 400 e polietilenoglicol, sendo preferido o glicerol.

Numa forma de realização particularmente preferida, é incorporado um derivado de lípido A atenuado (ALD) nas composições da presente invenção. Os ALD são moléculas do tipo lipido A que foram alteradas ou construídas de modo a que a molécula apresente menos ou diferentes efeitos secundários que o lipido A. Estes efeitos secundários incluem pirogenicidade, reactividade de Shwarzman local e toxicidade, como avaliado no ensaio da dose letal a 50% em embrião de galinha (CELD50) . Os ALD úteis, de acordo com a presente invenção, incluem monofosforil-lipido A (MLA) e monofosforil-lipido A 3-desacilado (3D-MLA) . O MLA e 3D-MLA são conhecidos e não necessitam de ser aqui descritos em detalhe. Ver, por exemplo, Patente U.S. N° 4436727 publicada a 13 de Março de 1984, atribuída a Ribi ImmunoChem Research, Inc., que divulga monofosforil-lipido A e a sua produção. A Patente U.S. N° 4912094 e certificado de reavaliação BI 4912094 de Myers, et al., também atribuída a Ribi 5

ImmunoChem Research, Inc., inclui o monofosforil-lípido A 3-desacilado e um método para a sua produção.

Sem entrar em detalhes das patentes anteriores, o monofosforil-lipido A (MLA), como aqui utilizado, é derivado de lipido A, um componente de lipopolissacáridos (LPS) enterobacterianos, um modulador potente mas altamente tóxico do sistema imunitário. Edgar Ribi e seus colaboradores alcançaram a produção de monofosforil-lipido A (MLA), referido, originalmente, como endotoxina destoxifiçada refinada (RDE). 0 MLA é produzido por refluxo de um extracto de endotoxina (LPS ou lipido A) obtido de mutantes sem heptose de bactérias gram-negativas em soluções de ácido mineral de força moderada (HC1 0,1 N) durante um periodo de, aproximadamente, 30 minutos. Este tratamento resulta na perda da porção fosfato na posição 1 da extremidade redutora da glucosamina.

Simultaneamente, durante este tratamento, o núcleo de hidrato de carbono é removido da posição 6 da glucosamina não redutora. O produto resultante (MLA) exibe níveis consideravelmente atenuados das actividades endotóxicas normalmente associados com a endotoxina de material de partida, tais como pirogenicidade, reactividade de Shwarzman local e toxicidade, como avaliado no ensaio da dose letal em 50% em embrião de galinha (CELD50) . No entanto, retém, de um modo inesperado, a funcionalidade de lipido A e LPS como um imunomodulador.

Outra endotoxina destoxifiçada que pode ser utilizada na prática da presente invenção é referida como monofosforil-lípido A 3-desacilado (3D-MLA). O 3D-MLA é conhecido como apresentado na patente U.S. N° 4912094, certificado de reavaliação BI 6 4912094 e difere do MLA no facto de o resíduo de acilo B-hidroximirístico, que está ligado por éster à extremidade redutora glucosamina na posição 3, ser removido selectivamente da molécula de MLA sob condições que não afectam adversamente os outros grupos. O monofosforil-lípido A 3-desacilado está disponível de Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Montana 59840.

As moléculas de MLA e 3D-MLA são um compósito ou mistura de vários padrões de substituição de ácido gordo, i. e., hepta-acilo, hexa-acilo, penta-acilo etc., com variados comprimentos de cadeia de ácido gordo. Assim, estão englobadas por esta invenção várias formas de MLA e 3D-MLA, incluindo as suas misturas. A estrutura principal do lípido A, que é ilustrada na patente -094, corresponde ao produto que é obtido por 3-desacilação de lípido A hepta-acilo de S. minnesota R595. Outros padrões de substituição de ácido gordo estão englobados por esta divulgação; a característica essencial é que o material seja 3-desacilado. O 3D-MLA modificado utilizado na presente invenção é preparado ao submeter o MLA a hidrólise alcalina, sob condições que resultam na perda de apenas um único ácido gordo da posição 3 da estrutura principal do lípido A. O ácido gordo β-hidroximirístico na posição 3 é anormalmente lábil em meio alcalino. Apenas necessita de tratamento alcalino muito moderado para 3-deacilar completamente o lípido A. As outras ligações éster no lípido A necessitam de condições um pouco mais fortes antes que a hidrólise ocorra para que seja possível deacilar selectivamente estes materiais na posição 3, sem afectar significativamente o resto da molécula. Actualmente não é 7 conhecida a razão para a sensibilidade anormal a meio alcalino do ácido gordo β-hidroximiristico ligado por éster na posição 3.

Embora sejam conhecidos processos de hidrólise alcalina, é importante escolher condições que não causem hidrólise adicional para além da ligação éster do β-hidroximiristico na posição 3.

Em geral, a hidrólise pode ser efectuada em meio aquoso ou orgânico. No último caso, os solventes incluem metanol (álcoois), dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), clorofórmio, diclorometano, bem como as suas misturas. Podem também ser empregues combinações de água e um ou mais dos solventes orgânicos mencionados. A base alcalina pode ser escolhida entre vários hidróxidos, carbonatos, fosfatos e amina. As bases ilustrativas incluem as bases inorgânicas, tais como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, carbonato de sódio, carbonato de potássio, bicarbonato de sódio, bicarbonato de potássio e bases orgânicas, tal como alquilaminas e incluem, mas não estão limitadas a dietilamina e trietilamina.

Em meio aquoso, o pH está tipicamente entre, aproximadamente, 10 e 14, sendo a gama preferida um pH de cerca de 12 a cerca de 13,5. A reacção de hidrólise é tipicamente efectuada a uma temperatura de cerca de 20 °C a cerca de 80 °C, de um modo preferido, cerca de 50 °C a 60 °C, durante um periodo de cerca de 10 a cerca de 30 minutos. Por exemplo, a hidrólise pode ser efectuada em trietilamina a 3% em água, à temperatura ambiente (22-25 °C) durante um periodo de 48 horas. Os únicos requisitos na escolha da temperatura e tempo de hidrólise são que a deacilação ocorra apenas para remover o β-hidroximirístico na posição 3.

Na prática, verificou-se que um método de hidrólise particularmente desejável envolve dissolver o lipido A ou monofosforil-lipido A em clorofórmio:metanol 2:1 (v/v), saturar esta solução com um tampão aquoso consistindo em Na2C03 0,5 M a pH 10,5, e, depois, evaporação flash do solvente a 45-50 °C, sob vácuo com um aspirador (aproximadamente 100 mm de Hg). O material resultante é desacilado selectivamente na posição 3. Este processo também pode ser efectuado com qualquer uma das bases inorgânicas indicadas acima. Nalguns casos, pode ser desejável a adição de um catalisador de transferência de fase, tal como brometo de tetrabutilamónio, à solução orgânica antes da saturação com o tampão aquoso. Para além do MLA e 3D-MLA produzidos como descrito acima, pode ser utilizado ALD produzido através de processos sintéticos ou semi-sintéticos. A composição da presente invenção é um adjuvante. Quando uma quantidade eficaz da composição é administrada a um hospedeiro com um antigénio proteico, é potenciada a resposta imunitária do hospedeiro a esse antigénio. Uma quantidade eficaz da composição adjuvante reivindicada é uma quantidade que estimula ou potência uma resposta imunitária. Um especialista na técnica saberá a quantidade de antigénio que é necessária para estimular uma resposta imunitária a esse antigénio. Por exemplo, 2,5 yg de antigénio de superfície da hepatite B (HBsAg) administradas com uma forma de realização preferida da presente invenção induziram uma resposta humoral no murganho.

De um modo inesperado, verificou-se que a emulsão estável da presente invenção quando combinada com um ALD reduz, 9 significativamente, a pirogenicidade do ALD. A pirogenicidade é a produção de um estado febril por um composto. 0 ALD e o 3D-MLA produzem uma resposta febril superior quando formulado em polietilenoglicol a 40% com etanol a 10% à quando formulados na emulsão estável da presente invenção. A pirogenicidade de uma composição pode ser avaliada num teste convencional de pirogénio da USP em três coelhos. Resumidamente, os compostos são administrados a três coelhos a doses variadas. A temperatura corporal de cada animal é monitorizada ao longo de 4 horas. Qualquer diminuição da temperatura é registada como um aumento de zero. Um aumento individual na temperatura inferior a 0,5 °F foi considerado não pirogénico. Se a composição provoca um aumento individual na temperatura de 0,5 ° F ou mais, a composição é novamente testada utilizando cinco coelhos diferentes. Se não mais que três dos oito coelhos no total exibiram um aumento na temperatura de 0,5 °F ou mais e se a soma do aumento na temperatura para cada um dos oito coelhos não excedeu 3,3 °F, a composição é considerada não pirogénica.

De seguida, estão exemplos que ilustram processos para a prática da invenção. Todas as percentagens estão em peso e todas as proporções de mistura de solventes estão em volume, excepto indicado em contrário.

Exemplo 1- Preparação de 3D-MLA/SE.

Numa forma de realização particularmente preferida, a emulsão estável da presente invenção compreende o seguinte: 10

Material

3D-MLA

Quantidade 1,200-0,005% p/v 10,000% v/v 0,091% p/v 1,909% p/v 1,800% v/v 0,050% p/v 78,200% v/v 10,000% v/v esqualeno co-polímero de blocos PLURONIC-F68® Fosfatidilcolina de ovo glicerol a-tocoferol Água para Injecção Tampão de fosfato de amónio

Será evidente para um especialista na técnica como preparar a emulsão reivindicada. No entanto, verificou-se que a emulsão reivindicada é preparada muito facilmente ao fixar três soluções stock: stock de MLA/PC de ovo, solução stock de óleo e solução stock aquosa.

Para preparar o stock de MLA/PC de ovo, foram dissolvidos em clorofórmio:metanol (C:M) 4:1, monofosforil-lipido A 3-desacilado (3D-MLA) (Ribi ImmunoChem Research, Inc. Hamilton, MT) e fosf atidilcolina de ovo (PC de ovo) . As soluções são, depois, combinadas e a C:M é deixada a evaporar. A restante C:M é removida ao colocar a mistura num liofilizador e mantendo-a durante, aproximadamente, 1-2 horas a uma pressão reduzida. É preparada uma solução stock de fase oleosa ao combinar α-tocoferol e esqualeno e agitando-a num banho de água aquecido até dissolução. É preparada uma solução stock de fase aquosa por pesar co-polimero de blocos PLURONIC F-68 NF e glicerol num recipiente de tampa roscada. É adicionada Água para Injecção ao recipiente 11 que é aquecido e misturado gentilmente até à dissolução dos ingredientes. É adicionado tampão de fosfato de amónio 0,25 M, pH 5,1 ± 0,005 ao co-polimero de blocos PLURONIC F-68 NF/glicerol/água. É adicionada mais água para alcançar o volume desej ado.

Para preparar a emulsão estável, o stock de fase oleosa é combinado com a mistura MLA/PC de ovo. A mistura é sonicada até o MLA se dissolver. A fase oleosa é depois aquecida para 75 °C enquanto a fase aquosa é aquecida para 75 °C. A mistura MLA/PC de ovo de fase oleosa é emulsionada com um Emulsionador Silverson, enquanto a fase aquosa é adicionada lentamente. A emulsão SE resultante tem um HLB de 8,0 e é arrefecida até à temperatura ambiente num banho de gelo. A emulsão pode ser depois homogeneizada utilizando um homogeneizador Avestin C-50 a uma pressão de 22000-25000 psi na válvula, até o tamanho de partícula ser < 0,2 ym. O produto adjuvante final é filtrado utilizando um filtro de membrana hidrofílico de 0,2 ym. Os passos de homogeneização posterior e esterilização terminal por filtro não afectam a quantidade de 3D-MLA presente na composição ou a capacidade adjuvante da preparação.

Exemplo 2- Produção de uma resposta de anticorpo utilizando 3D-MLA/SE.

Foi administrada em murganhos uma imunização primária (Ia) de 2,5 yg de antigénio de superfície de hepatite B (HBsAg) formulado no adjuvante, como preparado no Exemplo 1 no dia 0. As injecções foram dadas subcutaneamente (200 yL por injecção). No dia 21, foi administrada aos murganhos uma imunização secundária (2a) (200 yL por injecção). No dia 19 após a imunização primária 12 (dia 19 após Ia) e dia 27 após a imunização secundária (dia 27 após 2a), foi recolhido sangue dos murganhos. O soro foi recolhido e testado por ELISA convencional para o anticorpo anti-HBsAg. A Tabela 1 mostra que a composição adjuvante da presente invenção induziu a produção de anticorpos anti-HBsAg num animal quando administrada ao animal com esse antigénio.

Tabela 1

Titulos de anticorpo anti-HBsAg produzidos utilizando 3D-MLA/SE

Titulo Anti-HBsAg

Especifico para Especifico para

IgGi IgG2„

Adjuvante 3D-MLA dia 19 dia 27 dia 19 dia 27 M após 1a após 2a após 1a após 2a 3D-MLA/SE 50 16K* 256K 64K 1000K 3D-MLA/SE 25 32K 512K 64K 1000K Pré-diluído 3D-MLA/SE 5 16K 256K 16K 512K 1/10 dia 7 3D-MLA/SE 1 8K 256K 16K 256K SE 0 4K 128K 2K 64K (Veículo) PBS 0 2K 32K 2K 64K 3D-MLA/SE 50 16K 256K 64K 1000K diluído 3D-MLA/SE 25 16K 256K 64K 1000K 1/10 dia 0 3D-NLA/SE 5 8K 128K 32K 512K 3D-MLA/SE 1 4K 128K 16K 256K 13 (continuação)

Titulo Anti-HBsAg" Específico para Específico para

IgGi lgG2„

Adiuvante 3D-MLA dia 19 dia 27 dia 19 dia 27 H2 após Ia após 2a após Ia após 2a SE 0 2K 128K 1K 64K (Veículo) PBS 0 1K 128K 2K 32K Soro — <0,5K <0,5K <0,5K <0,5K Normal *K= 103

Exemplo 3- Estimulação de uma resposta de linfócitos-T Citotóxicos. A) A indução de uma resposta de linfócitos T citotóxicos (CTL) após administração da composição adjuvante da presente invenção e um antigénio proteico foi detectada por um ensaio de citotoxicidade. A grupos de murganhos C57/BL/6 foi administrada subcutaneamente uma imunização primária (região inguinal) com 1,0 pg de antigénio de superfície de hepatite B (HbsAg) formulado no veículo da emulsão estável da presente invenção (SE) e 3D-MLA/SE. O adjuvante MLA/SE foi preparado como no Exemplo 1. Para testar a estabilidade da emulsão estável reivindicada, a emulsão foi diluída 1/10 sete dias antes da sua mistura com o antigénio ou no dia da imunização. O volume injectado foi de 200 pL. Catorze dias depois, três murganhos por grupo experimental foram sacrificados e os baços removidos e reunidos como suspensões celulares individuais e contados. Aos restantes murganhos de cada grupo foi administrada 14 subcutaneamente uma imunização secundária (região inguinal) com 1,0 yg de HbsAg formulado em veiculo SE e adjuvante 3D-MLA/SE. Catorze dias depois, todos os murganhos em cada grupo experimental foram sacrificados e os baços removidos e reunidos como suspensões celulares individuais e contados.

As células de baço (75 X 106 células em 3-4 mL de meio) dos grupos experimentais foram colocadas num frasco em T de 25 cm2. De seguida, ao frasco foi adicionado 1,0 mL de células E.G7 (OVA) irradiadas (20000 rads) a 5 X 106/mL. O volume foi preenchido para 10 mL. As culturas foram mantidas ao colocar os frascos em T na vertical numa incubadora a 37 °C, CO2 a 5% durante quatro dias. No dia 4, as células sobreviventes foram recuperadas dos frascos, lavadas IX, ressuspensas em 5,0 mL e contadas.

As células efectoras recuperadas foram ajustadas para 5 X 106 células viáveis/mL e volumes de 100 yL foram diluídos em serie, em triplicado, nos poços de placas de 96 poços de fundo redondo (Corning 25850) utilizando 100 yL/poço de meio como um diluente. De seguida, foram adicionados aos poços volume de 100 yL de alvos marcados com 51Cr (ver abaixo) [E.G7 (OVA) - uma linha celular EL-4 transfectada com o gene da ovalbumina] a 1 X 105 células/mL. Os poços de libertação espontânea (SR) continham 100 yL de alvos e 100 yL de meio. Os poços de libertação máxima (MR) continham 100 yL de alvos e 100 yL de detergente (Tween 20 a 2%) . As proporções Efector/alvo (E/T) foram de 50:1, 25:1, 12,5:1, 6,25:1. As placas foram centrifugadas a 400 X g e incubadas a 37 °C, CO2 a 5% durante 4 h. Após a incubação, os sobrenadantes de poço foram recolhidos utilizando um Sistema de Recolha de Sobrenadante Skatron. 15

Percentagem de lise especifica

100 X (Libertação Exp.-SR){MR - SR)

As células alvo, E.G7 (OVA), foram marcadas com 51Cr (cromato de sódio) como se segue. Num volume total de 1,0 mL foram misturadas 5 X 106 células alvo e 250 yCi de 51Cr em tubo cónico de 15 mL. A suspensão celular foi incubada num banho de água a 37 °C durante 90 min., com agitação suave a cada 15 min.

Após incubação, as células marcadas foram lavadas 3X por centrifugação e decantação com volumes de 15 mL de meio. Após a terceira centrifugação, as células foram resuspensas em 10 mL de meio fresco e deixadas á temperatura ambiente durante 30 min e, depois, centrifugadas. As células foram finalmente resuspensas em meio para 1 X 105 células/mL. Os resultados do ensaio de citotoxicidade são apresentados nas Tabelas 2 e 3. 16

Tabela 2

Resposta Citotóxica 14 d após Ia % de Citotoxicidade

Adjuvante MLA E/T pg 50:1 25:1 12.5:1 6.25:1 3D-MLA/SE 50 44 30 18 7 3D-MLA/SE 25 36 17 11 6 Pre-diluído 3D-MLA/SE 5 29 13 9 4 dia 7 3D-MLA/SE 1 27 13 7 3 SE(Veículo) 0 25 13 7 4 PBS 0 7 5 2 0 3D-MLA/SE 50 21 12 5 3 3D-MLA/SE 25 48 36 24 13 Diluído 3D-MLA/SE 5 22 14 9 4 dia 0 3D-MLA/SE 1 25 14 7 3 SE(Veículo) 0 24 11 6 3 PBS 0 8 3 1 0 Normal 6 3 2 0 17

Tabela 3

Resposta Citotóxica dia 14 após 2a % de Citotoxicidade

Adjuvante MLA E/T pg 50:1 25:1 12.5:1 6.25:1 3D-MLA/SE 50 89 65 41 25 3D-MLA/SE 25 79 64 40 23 Pré-diluído 3D-MLA/SE 5 64 45 27 16 dia 7 3D-MLA/SE 1 44 30 18 8 SE (Veículo) 0 65 39 31 18 PBS 0 28 18 10 6 3D-MLA/SE 50 80 56 39 26 3D-MLA/SE 25 77 48 31 18 Diluído 3D-MLA/SE 5 86 68 43 28 dia 0 3D-MLA/SE 1 63 36 23 11 SE (Veículo) 0 63 42 28 14 PBS 0 17 12 7 4 Normal -- 7 2 0 0 A administração de 3D-MLA/SE e um antigénio proteico induziu uma resposta de linfócitos citotóxicos e produção de antigénio em murganhos tratados. Os ; murganhos BALB/c foram imunizados subcutaneamente com 2,0 yg de HbsAg + 25 yg de 3D-MLA/SE no dia 0 (Ia) e dia 21 (2 a) . Os ensaios CTL foram efectuados como acima. 0 adjuvante 3D-MLA/SE foi preparado 18 como no Exemplo 1. A Tabela 4 ilustra que foi induzida uma resposta de linfócitos T citotóxicos.

Tabela 4

Resposta Citotóxica % de Citotoxicidade E/T Adjuvante Dia 50:1 25:1 12.5:1 6.25:1 3D-MLA/SE dl7 após Ia 55 27 14 10 Veículo SE 32 16 9 6 3D-MLA/SE dl6 após 2a 81 62 47 24 Veículo SE 38 23 14 8

Os resultados do título de anticorpo para HbsAg são apresentados na Tabela 5. 0 soro da recolha de sangue no dia 28 após 2a foi titulado em placas ELISA revestidas com HbsAg ou um péptido com 28 aminoácidos (p72) que contem epitopos de célula B encontrados na região S, resíduos 110-137, do HbsAg. 19

Tabela 5 Título de anticorpo anti-hepatite em murganhos tratados.

Titulo Anti-HBsAg-1 HBsAg Péptido p72

Adjuvante igGi igG2a igGi igG2a 3D-MLA/SE 1024K 2048K 64K 256K Veículo SE 1024K 64K 64K 4K Soro de Murganho Normal <0,5K <0,5K <0,5K LO O V

Os murganhos tratados com 3D-MLA/SE apresentaram resposta humoral e linfócitos T citotóxicos ao antigénio de superfície da hepatite B.

Exemplo 4- Avaliação da pirogenicidade de 3D-MLA/SE. 0 adjuvante 3D-MLA/SE foi avaliado no teste convencional de pirogénio da USP em três coelhos (NAMSA, Northwood OH). 0 adjuvante 3D-MLA/SE da presente invenção foi comparado com o 3D-MLA formulado em propilenoglicol (PG) a 40% e etanol (EtOH) a 10%, que foi avaliado a níveis de dose de 5, 8, 11, 14, 15, 17, 20, 25, 30, 35 yg/kg ao longo de duas experiências. A formulação de 3D-MLA/SE foi avaliada no mesmo teste de pirogénio de coelho a níveis de dose de 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350 yg/kg ao longo de duas experiências. As doses pirogénicas e doses pirogénicas limite foram definidas por definições USP estabelecidas. Uma dose pirogénica limite foi uma dose onde, pelo menos, um de três coelhos apresentou um aumento de 20 temperatura máximo h0,5 °C acima da linha de base durante três horas após dosagem.

Tabela 6A.

Pirogenicidade de 3D- -MLA em PG a 40 %/EtOH a 10% AUMENTO DE TEMPERATURA MÁXIMO Dose Coelho Coelho Coelho Total ^g/Rg 1 2 3 l£ 35 1,1 0,6 0,9 2, 6 35 1,1 0,9 2,4 4,3 30 0,9 0,6 0,7 2,2 25 0,7 1,1 0,9 2,7 20 0,5 0,6 0,6 1,7 17 0,4 0,3 0,3 1,0 15 0,4 0,3 0,4 1,1 14 0,4 0,3 0,3 1,0 11 0,1 0,2 0,1 0,4 8 0,0 0,1 0,1 0,2 5 0,1 0,0 0,0 0,1 21

Tabela 6B.

Pirogenicidade de 3D-MLA/SE

AUMENTO DE TEMPERATURA MÁXIMO

Dose Coelho Coelho Coelho Total ^g/Rg 1 2 3 l£ 350 0,7 0,6 00 o 2,1 350 0,3 0,6 0,6 1,5 300 00 o 0,7 0,6 2,1 250 0,4 0,5 0,3 1,2 200 1,0 1,0 1,1 3,1 200 0,2 0,1 0,1 0,4 150 0,3 0,2 0,2 0,7 150 0,1 0,3 0,2 0, 6 125 0,1 0,1 0,1 0,1 100 0,1 0,2 0,1 0,4 75 0,0 0,1 0,1 0,2 0 adjuvante 3D-MLA/SE pirogenicidade e comparado com o foi, depois, avaliado 3D-MLA formulado em EtOH a para10%. 22

Tabela 7

Pirogenicidade de 3D-MLA/SE vs. 3D-MLA em EtOH a 10% AUMENTO DE TEMPERATURA MÁXIMO

Material Dose Coelho Coelho Coelho Total pg/Rg 1 2 3 l£ 3D-MLA/EtOH 10 1,5 1,5 1,5 4,5 3D-MLA/EtOH 5 0,7 0,9 0,4 2,0 3D-MLA/EtOH 2,5 0,3 0,4 0,1 0,8 3D-MLA/EtOH 2,5 0,1 0,2 0,1 0,4 3D-MLA/EtOH 1,25 0,0 0,0 0,0 0,0 3D-MLA/SE 200 0,6 0,6 I-» o 2,2 3D-MLA/SE 150 0,5 0,2 0,4 1,1 3D-MLA/SE 100 0,2 0,3 0,1 0, 6 3D-MLA/SE 50 0,0 0,0 0,0 0,0 3D-MLA/SE 75 0,1 0,1 0,3 0,5 3D-MLA/SE 50 O o 0,2 0,0 0,2 3D-MLA/SE 35 00 o 0,1 0,1 0,5 3D-MLA/SE 20 o o O o O o O o 3D-MLA/SE 10 0,0 0,0 0,1 0,1 3D-MLA/SE 0 0,4 0,0 0,0 0,4 Existe um diferencial de dez vezes na pirogenicidade com uma dose de 2 0 yg/kg de 3D-MLA em PG a 40% /EtOH a 10%, sendo pirogénica limite e uma dose de 200 yg/kg para 3D-MLA/SE definida como uma dose pirogénica limiar. 0 adj uvante 3D-MLA/SE foi consideravelmente menos pirogénico que outras formulações do composto (Tabelas 6 e 7) . Do mesmo modo, a composição adjuvante 23 da presente invenção é segura, produzindo lesões relacionadas como o fármaco que são minimas a nenhuma nos locais de injecção, nódulos linfáticos que escoam os locais de injecção e baços.

Deverá ser evidente que os exemplos e formas de realização aqui descritas são apenas para fins ilustrativos e com base nestas serão sugeridas várias modificações ou alterações aos especialistas na técnica e que se pretende que sejam incluídas no âmbito das reivindicações em anexo.

Lisboa, 10 de Janeiro de 2008 24

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composição adjuvante consistindo em 25 yg de 3D-MLA e uma emulsão óleo em água compreendendo óleo metabolizável, um ou mais tensioactivos, um antioxidante e um componente para tornar a emulsão isotónica.
2. Composição adjuvante da reivindicação 1, em que o referido óleo metabolizável é o esqualeno.
3. Composição adjuvante da reivindicação 1, em que o referido um ou mais tensioactivo são seleccionados do grupo consistindo em monoleato polioxietileno de sorbitano (Tween® 80, CAPMUL® POE-O), 12-hidroxiestearato de polietilenoglicol 660 (tensioactivo SOLUTOL® HS 15), co-polimero de blocos polioxietileno-polioxipropileno (co-polimero de blocos PLURONIC® F68), colato de sódio, glicerodesoxicolato, esfingomielina, esfingosina, 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, L-a-fosfatidiletanolamina e 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina e fosfatidilcolina de ovo ou uma mistura destes.
4. Composição adjuvante de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido antioxidante é seleccionado do grupo consistindo de α-tocoferol e ácido ascórbico.
5. Composição adjuvante da reivindicação 4, em que o antioxidante é o a-tocoferol. 1
6. Composição de vacina compreendendo um antigénio proteico e nas uma composição adjuvante como reivindicado reivindicações 1-5. Lisboa, 10 de Janeiro de 2008 2