ES2284210T3 - Un dispositivo de ensayo y un metodo para detectar la presencia de un analito residual en una muestra. - Google Patents
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Abstract
Un dispositivo de ensayo (50, 101) para detectar la presencia de un analito residual en una muestra, que comprende: a) una composición (34, 110) de fase móvil que tiene un receptor para unirse con el analito, en el que dicha composición de fase móvil se puede portar en la muestra; b) una membrana (36, 107) de fase estacionaria que tiene un primer extremo de membrana, en contacto con la composición de fase móvil, y un segundo extremo de membrana, en el que dicha membrana permite un flujo capilar lateral de la muestra desde el primer extremo de membrana hasta el segundo extremo de membrana; c) una zona de ensayo (38) sobre la membrana (36, 107) de fase estacionaria entre el primer extremo de membrana y el segundo extremo de membrana, y con un primer aglutinante para unirse con un receptor desunido; d) una zona de control (40) sobre la membrana de fase estacionaria entre la zona de ensayo y el segundo extremo de membrana, y con un segundo aglutinante para unirse con un receptor de unión a analitos, caracterizado porque la composición de fase móvil incluye además un anticuerpo o un aglutinante adicional que se une con un analito seleccionado para competir con el receptor, reduciendo por ello la sensibilidad al analito seleccionado.
Description
Un dispositivo de ensayo y un método para
detectar la presencia de un analito residual en una muestra.
Se han desarrollado kits y métodos de ensayo
inmunocromatográfico o de flujo lateral para detectar la presencia
o concentración de residuos químicos o analitos, o clases de los
mismos, a partir de muestras líquidas. Un ejemplo de uno de tales
kits de ensayo incluye un kit de prueba de embarazo. Se describen
ejemplos adicionales en los documentos US 5.451.504, EP 0 279 573 y
WO 96/38720.
Particularmente, hace mucho que se ha reconocido
en el área de salubridad de los alimentos que se debería efectuar
de modo preciso, económico y sencillo la detección de residuos. Los
consumidores y los gobiernos son cada vez más conscientes de la
necesidad de hacer ensayos con los alimentos para detectar la
presencia de residuos no deseables que se presentan naturalmente, o
de otro modo.
Ya que una gran parte de los consumidores son
niños, la salubridad de los alimentos hace mucho que es crítica en
la industria láctea. Los residuos antibióticos usados en una granja
láctea aparecen ocasionalmente en el suministro de leche. Los
peligros asociados con estos residuos no deseables incluyen las
reacciones alérgicas, la ayuda a la propagación de nuevos
microbios, y a veces resistentes a los medicamentos, y otros riesgos
sanitarios a largo plazo.
Los organismos públicos han establecido, en
algunos casos, límites legales para ciertos residuos en los
alimentos, por ejemplo, residuos antibióticos en la leche. Los
residuos por encima del límite legal se consideran inseguros para
el consumo humano. Los niveles de residuos por debajo del límite
legal se consideran "seguros". Es importante, por lo tanto,
que los métodos de detección, además de ser efectuados de modo
económico y sencillo, no proporcionen resultados positivos cuando
los residuos están por debajo de los límites legales, de manera que
la leche u otros alimentos, por otra parte aceptables, no se
descarten o se traten de otro modo como que contienen residuos por
encima de los límites legales.
Según la presente invención, se ha previsto un
dispositivo de ensayo para detectar la presencia de un analito
residual en una muestra, que comprende:
a) una composición de fase móvil que tiene un
receptor para unirse con el analito, en el que dicha composición de
fase móvil se puede portar en la muestra;
b) una membrana de fase estacionaria que tiene
un primer extremo de membrana, en contacto con la composición de
fase móvil, y un segundo extremo de membrana, en el que dicha
membrana permite un flujo capilar lateral de la muestra desde el
primer extremo de membrana hasta el segundo extremo de membrana;
c) una zona de ensayo sobre la membrana de fase
estacionaria entre el primer extremo de membrana y el segundo
extremo de membrana, y con un primer aglutinante para unirse con un
receptor desunido;
d) una zona de control sobre la membrana de fase
estacionaria entre la zona de ensayo y el segundo extremo de
membrana, y con un segundo aglutinante para unirse con un receptor
de unión a analitos, en el que la composición de fase móvil incluye
además un anticuerpo o un aglutinante adicional que se une con un
analito seleccionado para competir con el receptor, reduciendo por
ello la sensibilidad al analito seleccionado.
Habitualmente, un líquido, tal como leche, tiene
una o más impurezas o analitos que están en cantidades mínimas que
se tienen que analizar. A fin de detectar el analito, una
realización de la presente invención emplea un receptor marcado que
reacciona con el analito para formar un complejo
analito-receptor. El receptor marcado está situado
dentro de o próximo a una membrana y, cuando se expone al líquido,
se presenta flujo capilar lateral sobre el mismo. En el flujo, el
líquido porta con él el complejo analito-receptor y
cualquier receptor marcado desunido. Una zona de ensayo está
situada sobre la membrana en la trayectoria de flujo. La zona de
ensayo tiene un analito conjugado representativo fijado a la
membrana, para unir un receptor desunido a fin de formar un primer
complejo analito-conjugado-receptor
que, como consecuencia del marcador, tiene una señal que se puede
ver a simple vista o leer con un instrumento.
El flujo capilar del líquido sigue sobre la
membrana hasta una zona de control. La zona de control incluye un
aglutinante fijado a la membrana, que se une con el receptor
marcado. Una vez unido, la zona de control cambia a una señal que
se puede ver a simple vista, leer con un instrumento o ver bajo
condiciones especiales de luz, tal como con luz ultravioleta. Si la
señal en la zona de ensayo es más intensa que la señal en la zona
de control, el ensayo indica que el analito no está presente en una
cantidad suficiente (un ensayo negativo). Si la señal en la zona de
ensayo es menos intensa que la señal en la zona de control, el
ensayo indica que el analito está presente en una cantidad en
exceso de los niveles permisibles (un ensayo positivo).
El receptor puede unir una familia de analitos
(uno o una pluralidad de analitos) que tengan puntos de unión
estructural similares. Los miembros de una familia de analitos
pueden tener diferentes requisitos de niveles de detección y, por
lo tanto, se pueden emplear aglutinantes adicionales de analitos,
por ejemplo, anticuerpos monoclonales o policlonales, que unen una
porción del analito en competencia con el receptor, en la muestra,
disminuyendo por ello la sensibilidad del ensayo. Los anticuerpos se
mezclan con el receptor marcado en una cantidad a fin de ajustar la
sensibilidad frente a un analito específico o un grupo de analitos.
La sensibilidad del ensayo se ajusta de manera que no se obtenga un
resultado positivo en las pruebas a menos que un cierto umbral de
analito esté presente en la muestra.
La presente invención incluye muchas ventajas,
tales como la combinación de receptores o anticuerpos de amplio
espectro y alta pureza con alta actividad específica por área
superficial, combinados con anticuerpos específicos frente a
residuos contrarrestantes (por ejemplo, monoclonales) para conseguir
la detección de residuos del orden de niveles de partes por mil
millones (ppb) (10^{-9}) o partes por billón (ppt) (10^{-12})
en o próximos a las disposiciones reglamentarias. Al seleccionar
como objetivo el resto activo del residuo químico se permite la
detección de un amplio espectro de fármacos activos (por ejemplo,
medicamentos veterinarios, productos químicos agrícolas (por
ejemplo, plaguicidas) o toxinas microbianas y sus metabolitos
activos). Además, se pueden añadir anticuerpos adicionales para
ajustar la sensibilidad umbral del ensayo.
La presente invención se refiere a un
dispositivo y un método de ensayo para detectar la presencia de un
analito residual en una muestra. El ensayo y el dispositivo usan
análisis de amplio espectro basado en el reconocimiento por color
directo, por fluorescencia o por infrarrojos para detectar
rápidamente la baja presencia en partes por mil millones (ppb) de
un producto químico o de una familia de residuos químicos que
comparten en común puntos de reconocimiento. Los kits están
diseñados para ensayar con antibióticos, toxinas y plaguicidas en
muestras alimenticias o medioambientales en el campo o en el
laboratorio. Los análisis son no competitivos, al usar química de
saturación.
Los anteriores y otros objetos, propiedades y
ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la
descripción siguiente proporcionada sólo a modo de ejemplo, tal como
se ilustra en los dibujos que se acompañan, en los que caracteres
de referencia semejantes hacen referencia a las mismas partes por
todas las vistas diferentes. Los dibujos no están necesariamente a
escala, poniéndose énfasis, en cambio, en ilustrar los principios de
la invención. Todos los porcentajes y las partes son en peso, a
menos que se indique de otro modo.
La figura 1 es una vista en perspectiva y en
despiece ordenado de un dispositivo de ensayo de carcasa
moldeada.
Las figuras 2, 3 y 4 son vistas esquemáticas,
ilustrativas del uso del dispositivo de ensayo de la figura 1.
La figura 5 es una vista en perspectiva de una
estufa de incubación y del dispositivo de ensayo con una muestra
líquida.
La figura 6 es una vista en planta frontal a
escala ampliada de la tira de ensayo de las figuras
1-5, con vistas frontales en sección a escala
ampliada de resultados positivos y negativos en las pruebas.
La figura 7 es una vista en perspectiva y en
despiece ordenado de un dispositivo de ensayo tipo blíster.
Las figuras 8, 9 y 10 son vistas laterales
esquemáticas, ilustrativas del uso del dispositivo de ensayo de la
figura 7.
Las figuras 11 y 12 son vistas en perspectiva de
una estufa de incubación y del dispositivo de ensayo con una
muestra líquida.
La figura 13 es una vista en planta frontal a
escala ampliada de la tira reactiva de las figuras
7-12, con vistas en sección frontales a escala
ampliada de resultados positivos y negativos en las pruebas.
La figura 14 es una vista en perspectiva y en
despiece ordenado de un dispositivo de ensayo tipo blíster con
refuerzo y estrechamiento sobresalientes de blíster para producir
lugares de apriete.
Las figuras 15, 16 y 17 son vistas laterales,
esquemáticas e ilustrativas del uso del dispositivo de ensayo de la
figura 14.
La figura 18 es una vista a escala ampliada de
la zona de restricción de movimiento de la tira de la figura
14.
En los dibujos, las figuras 1-6
muestran un dispositivo de ensayo 10 de analitos que incluye una
carcasa 12 alargada moldeada. La carcasa 12 puede estar formada por
un polímero de estireno transparente en una pieza, moldeado por
inyección. La carcasa 12 define una cavidad 14 alargada de carcasa
con un extremo abierto 16, y con una cavidad de expansión 18 de
aplicación agrandada y rectangular en el extremo abierto 16 de la
carcasa 12. La carcasa 12 incluye una cavidad inferior alargada
formada durante el procedimiento de moldeo por inyección. La
carcasa incluye una tapa protectora 22 opcional amovible ajustada
por rozamiento o con salto elástico, adaptada para ajustar sobre el
extremo abierto 16 de la carcasa 12, y unas aberturas 19 de
expansión de líquido en la cubierta superior de la cavidad de
aplicación de carcasa para aumentar el rendimiento de la expansión
de una matriz de absorción de muestras, tal como una esponja 32, en
el tiempo de ensayo.
La cavidad 14 de carcasa incluye en su interior,
sobre la superficie inferior, una tira reactiva 28 de flujo lateral
adaptada para detectar la presencia de un analito en una muestra
líquida, tal como leche. La tira reactiva 28 incluye una tira de
soporte 30, con la esponja 32 fijada en un extremo. La esponja 32
puede incluir una pluralidad de capas secuenciales, que comprenden
una almohadilla rectangular de material celulósico seco y
comprimido, como un absorbente de líquidos-muestras
asegurado a la superficie frontal de la tira de soporte 30. La
esponja 32 se selecciona para que al expandirse en contacto con el
líquido, tal como leche, llene la cavidad de expansión 18, esponja
32 que se representa en dos dimensiones. Por ejemplo, con la leche,
la esponja 32 tiene unas medidas aproximadamente de
3-4 mm por 12-14 mm, mientras que la
cavidad 18 tiene aproximadamente de 5-6 mm por
15-16 mm, y por 4-6 mm de altura. La
cavidad de expansión 18 puede estar dimensionada aproximadamente
del 60% al 30% menor que la expansión completa del material de
esponja.
La tira de soporte 30 incluye un soporte 33
tratado de fase móvil con una composición 34 de fase móvil, una
membrana 36 de fase estacionaria, que incluye una zona de ensayo 38
y una zona de control 40 para el analito a detectar, y una zona de
eliminación 43 en el segundo extremo de la tira de soporte 30 para
capturar la muestra líquida en exceso. La carcasa 12 incluye una
cubierta superior 42 transparente para la observación visual de la
zona de ensayo (zona de referencia) 38 y la zona de control 40. La
tira reactiva 28 está colocada y situada de modo flojo en la
cavidad 14 alargada, con la esponja 32 situada debajo de la cavidad
de expansión 18, extendiéndose la esponja 32, de modo general,
hasta aproximada o ligeramente más allá del plano del extremo de
aplicación abierto, estando cubierto el extremo antes del uso por la
tapa protectora 22.
En funcionamiento, la tapa protectora 22 se
retira antes del uso y el extremo de aplicación abierto de la
carcasa 12 se inserta brevemente (aproximadamente de uno a diez
segundos) en el líquido a ensayar, tal como leche, empleando la
carcasa 12 alargada como mango. Véase la figura 2. Se retira el
dispositivo de ensayo 10 y se permite que la esponja 32 se expanda
para llenar la cavidad de expansión 18 y para comenzar el flujo
lateral de la muestra de leche a través de la tira reactiva 28 (de 2
a 6 minutos). Véanse las figuras 3 y 4. Preferiblemente, se inserta
la tapa protectora 22 para proteger contra contaminación cruzada, y
se coloca entonces el dispositivo de ensayo 10 en una posición
horizontal, extendiéndose hacia abajo la cavidad de aplicación 18
en una estufa de incubación 46 calentada eléctricamente, estando
conformada una cavidad 47 de estufa de incubación para recibir el
dispositivo de ensayo, y llevándose a cabo la incubación, por
ejemplo, por un tiempo de tres a diez minutos. La temperatura de
incubación se observa a través de una escala 48 indicadora de
temperaturas. Véase la figura 5. Se retira e invierte entonces el
dispositivo de ensayo 10 incubado, y se observa la vista frontal
del dispositivo de ensayo, con la zona de ensayo 38 y la zona de
control 40. Véase la figura 6. Las lecturas de las líneas para los
controles positivos y negativos se ilustran en la figura 6,
adyacentes a la vista frontal del dispositivo de ensayo 10. En la
esponja 32, la expansión está controlada por el volumen y tamaño de
la cavidad de expansión 18, dando como resultado que la esponja 32
llena completamente la cavidad de expansión 18 con un volumen
preseleccionado de líquido, por ejemplo de 0,1 a 1,0 ml, de manera
que la cantidad de muestra líquida tomada para el ensayo se
controla hasta la cantidad correcta. Las dimensiones de la cavidad
de expansión 18 impiden que la almohadilla 32 de esponja se expanda
completamente, de manera que se mantiene la presión en la esponja
expandida, tal como se muestra en la figura 4, para ayudar a forzar
el flujo capilar lateral de la muestra líquida a través de la tira
reactiva 28 en la carcasa 12.
Los dibujos de las figuras 7-13
ilustran otro dispositivo de ensayo 50 en un blíster transparente,
que incluye una tira de sellado 52 de plástico de cinta
transparente, con una etiqueta de desprendimiento 54 en un extremo,
y un blíster 56 transparente asegurado de manera adhesiva a la tira
52, para encerrar en su interior la tira reactiva 28. El blíster 56
incluye una cavidad alargada para contener la tira 28 y una cavidad
de expansión 58 de carcasa en un primer extremo para constituir una
cavidad, generalmente en forma de cepillo de dientes, dentro del
blíster 56 de plástico y la tira 52. La tira reactiva 28
seleccionada está sellada y encerrada dentro del blíster 56.
La figura 8 muestra una vista en sección lateral
del dispositivo 50 de ensayo tipo blíster antes del uso. La figura
9 muestra el dispositivo 50 de ensayo tipo blíster con un extremo
desprendido hacia atrás por la patilla de desprendimiento 54, para
exponer la cavidad de expansión 58 de carcasa y la esponja 32 de la
tira reactiva 28, de manera que se puede añadir una cantidad
definida de una muestra líquida, por ejemplo, con una pipeta, tal
como se muestra. En una realización preferida, la cavidad 18 tiene
forma triangular similar a la esponja 32, tal como se muestra en la
figura 9.
La figura 10 ilustra el dispositivo de ensayo 50
después de la adición de la muestra líquida, con la patilla de
desprendimiento 54 vuelta a sellar y con la esponja 32 completamente
expandida por la muestra líquida dentro de la cavidad 58 de
carcasa, y listo para ser incubado.
La figura 11 ilustra el dispositivo de ensayo 50
al revés y colocado en una de las dos cavidades 47 en la estufa de
incubación 46. La figura 12 ilustra la técnica de añadir la muestra
líquida con una pipeta, mientras se arranca la patilla de
desprendimiento 54 lejos del extremo del dispositivo de ensayo 50 en
la estufa de incubación 46. Se sella e incuba el dispositivo de
ensayo 50. Los resultados en las pruebas del ensayo terminado se
pueden leer entonces a través de una cubierta superior transparente
del blíster 56, tal como se muestra en la figura 13, para
proporcionar resultados positivos o negativos en las pruebas.
La tira reactiva 28 del análisis de inhibición
(figura 7) seleccionada para betalactámicos en leche es para un
ensayo rápido de betalactámicos en la leche mezclada, cruda y
pasteurizada. En funcionamiento, se verifica un calibrador 48 de
temperaturas en la estufa de incubación 46 para asegurar una
temperatura de la estufa de incubación de aproximadamente 55°C. Por
ejemplo, el indicador 48 de temperaturas puede estar coloreado, por
ejemplo, en verde, para su uso. El dispositivo de ensayo 50 se
coloca en una cavidad 47 de la estufa de incubación 46, con el lado
plano mirando hacia arriba y la patilla de desprendimiento 54
suficientemente desprendida hacia atrás para exponer la esponja 32,
por ejemplo, un centímetro. La leche se mezcla a fondo antes del
ensayo, y se añaden aproximadamente de 0,2-0,7 ml,
preferiblemente de 0,3-0,5 ml, con una pipeta a la
esponja 32 expuesta. La patilla 54 con cinta adhesiva se vuelve a
sellar por presión manual y se cierra la cubierta de la estufa de
incubación 46. Se incuba el dispositivo de ensayo 50, por ejemplo,
al menos de 6 a 8 minutos y, luego, se retira de la estufa de
incubación 46, se mantiene verticalmente y se hace una comparación
aproximadamente en una hora entre la zona de ensayo 38 y la zona de
control 40. Si no aparece ninguna zona de control 40, el ensayo no
es válido. Se presenta un ensayo negativo cuando la zona de
referencia 38 es la misma o más oscura que la zona de control 40.
Se indica un ensayo positivo cuando la zona de ensayo 38 está
ausente o evidentemente más clara que la zona de control 40.
Con más detalle, el dispositivo de ensayo 10,
capaz de detectar analitos en fluidos biológicos, incluye los
siguientes componentes:
una esponja 32, un material comprimido, tal como
celulosa, es capaz de absorber un fluido biológico y actuar como un
prefiltro para eliminar impurezas macroscópicas, tales como pelo,
suciedad, etc. La esponja 32 está dimensionada para absorber una
cantidad fija de muestra requerida a fin de completar el análisis.
Este material comprimido, cuando se expande y contacta con la pared
interior de la carcasa 12, ocasiona una presión suficiente para
activar el flujo capilar a lo largo de la esponja 32 de componentes,
el soporte 33 de fase móvil, la membrana 36 de fase estacionaria y
la zona de eliminación 43, y en el tiempo requerido (aproximadamente
de 3 a 8 minutos) para un ensayo comercialmente vendible. La
esponja 32 solapa el soporte de fase móvil (almohadilla de
conjugados) 33 de 1 a 10 mm, de manera que, cuando se añade una
muestra acuosa, tal como leche, a la esponja 32, la muestra circula
sobre el soporte 33 de fase móvil.
El dispositivo de ensayo puede usar un receptor
biológico que esté etiquetado con cantidades abundantes de tintes
de color, infrarrojos, fluorescentes o luminescentes. La muestra
licuada (por ejemplo, leche, maíz, pienso, extracto de cacahuete,
extracto de carne, suero, muestra ambiental, etc.) vuelve a poner en
suspensión el receptor etiquetado, que se estabiliza previamente
con aditivos fácilmente solubles en una composición de fase móvil.
El receptor etiquetado liberado de control temporal reacciona con el
analito en la muestra, al tiempo que entra en una zona de reacción
sobre la membrana 36 de fase estacionaria.
Los anticuerpos monoclonales específicos frente
a residuos se incluyen también en la composición de fase móvil para
unir específicamente el residuo en exceso con alta sensibilidad,
ajustando, así, la sensibilidad para esos residuos específicos
hacia abajo (para hacer el ensayo menos sensible). Como la menor
parte de estos residuos están disponibles para competir con el
receptor de amplio espectro, la sensibilidad se ajusta más próxima
a las disposiciones reglamentarias. Por ejemplo, la sensibilidad
inicial del receptor de betalactámicos a cefapirina es
3-5 ppb. Incluyendo los anticuerpos específicos
frente a cefapirina, la sensibilidad se ajusta a
15-20 ppb. El nivel "seguro" normativo de la
Food and Drug Administration en leche cruda y mezclada es 20
ppb.
Se apreciará que un complejo de anticuerpos
específicos con antibióticos libres en una muestra, hace que los
antibióticos con complejos no estén disponibles para una medición
adicional en cualquier análisis de inhibición de receptores o de
unión.
La carcasa 12 se debería usar para permitir la
adición de muestra biológica, por inmersión, vertido o pipetado. La
carcasa 12 puede estar construida de un material flexible o duro,
tal como poliestireno, polipropileno o polietileno.
El soporte 33 de fase móvil puede estar hecho de
una membrana de vidrio o un polímero, tal como poliéster o
polietileno, que actúa como un filtro secundario para la eliminación
de materiales más microscópicos (células somáticas). El soporte se
pretrata con una disolución química, tal como una de citrato de
sodio de 0,01 a 0,2 M, pH 6-8, capaz de neutralizar
las interferencias encontradas en las muestras biológicas. El
soporte de fase móvil solapa la membrana 36 de fase estacionaria
(tira reactiva) aproximadamente de 1 a 4 mm.
Las microesferas de colores o fluorescentes
revestidas con receptores/anticuerpos están en suspensión en una
disolución que contiene proteínas, por ejemplo, albúmina sérica
bovina (BSA), glicerol, azúcar o equivalentes de los mismos, por
ejemplo, sacarosa (SUC) o trehalosa (TRE), polietilenglicol 8.000 MW
(PEG), mezclas de aminoácidos (AA) o detergentes, como
estabilizadores y agentes de humectación, y se absorben o se rocían
en la membrana usando un instrumento de rociado, tal como el
disponible de la firma Biodot. Además, los anticuerpos específicos
frente a residuos se secan o se inmovilizan por rociado en esta
matriz. La amortiguación de la muestra se optimiza aquí también
usando un tampón con un pH dado, sal o cualquier cofactor requerido
necesitado para optimizar la cinética de unión con
receptores/anticuerpos.
Una fase móvil incluye proteínas de unión
altamente específicas, tales como una enzima o unos anticuerpos
monoclonales, capaces de unirse a un analito y tituladas hasta una
concentración conocida para hacer que no esté disponible para
reacción/detección adicionales de una cantidad conocida de analito.
Esta no disponibilidad para reacción/detección adicionales permite
el ajuste de un nivel de detección de uno o más analitos hasta un
nivel especificado de interés. Por ejemplo, en ceftiofur, a un
betalactámico con un nivel de tolerancia de 50 ppb en la leche, se
le puede cambiar la sensibilidad desde 5 ppb hasta entre
40-50 ppb, por la adición de un anticuerpo
monoclonal específico frente a ceftiofur. El anticuerpo monoclonal
específico compite con el receptor marcado para impedir que un
analito específico se una a un receptor o anticuerpo, que es capaz
de unirse a una familia de compuestos relacionados.
Las proteínas altamente purificadas, tales como
receptores de betalactámicos o IgG antitetánicas, preparadas
mediante purificación de afinidad y/o una combinación de
cromatografía hidrofóbica/de intercambio iónico, están fijadas a
una sonda coloreada, fluorescente o infrarroja que se puede observar
por medios ópticos/de instrumental, o por ambos. La fijación de
proteínas a una sonda se denomina complejo de proteínas de
unión/sonda.
La composición 34 de fase móvil, tal como
esferillas de oro, se realizan con un tamaño de partícula entre 10
y 60 nm. Las esferillas se pueden rociar sobre un soporte 33 de fase
móvil, tal como un polietileno de alta densidad pretratado. La
composición de fase móvil se rocía usando una máquina, tal como la
de las firmas Ivek, Biodot o Camag, o se absorbe en la esponja 32,
en una disolución que contiene del 5 al 20% en azúcar, tal como
sacarosa o trehalosa, del 5 al 20% en proteínas, tal como BSA o
Primatone, de 5 a 100 mM de una disolución tampón (base de fosfatos
o trizma base) con un pH final entre 6-8. La
composición de fase móvil se rocía sobre la porción superior del
soporte de fase móvil, de manera que la esponja 32 no solape la
porción rociada de la composición de fase móvil del soporte de fase
móvil, al colocar la porción más alta de la esponja 32 de 1 a 7 mm
por delante de la porción rociada de la composición de fase
móvil.
Una membrana de fase estacionaria puede
consistir en nitrocelulosa o nailon, que tiene múltiples zonas de
reacción. La zona de control, que contiene el anticuerpo frente al
receptor, se rocía al mismo tiempo y se seca la nitrocelulosa. El
grosor de la zona se ajusta por la BSA añadida a la composición de
fase móvil. La composición de fase móvil se rocía sobre la porción
superior del soporte 33 de fase móvil, de manera que la composición
34 de fase móvil no solape la esponja 32, sino más bien el soporte
33 de fase móvil solape la esponja 32, al colocar la porción más
alta de la esponja 32 aproximadamente de 1 a 7 mm por delante de la
porción rociada de la fase móvil. El soporte de fase móvil se seca y
se ensaya en un sistema de análisis para sensibilidad de todos los
medicamentos. Se ajustan entonces, tal como se necesiten, las
concentraciones de anticuerpos en la disolución de la composición
de fase móvil.
Para que la fase móvil obtenga la mejor
respuesta en color o fluorescencia, se pueden preparar proteínas
altamente purificadas (por ejemplo, receptores de betalactámicos o
IgG antitetánicas) mediante (i) purificación de afinidad y/o (ii)
una combinación de cromatografía hidrofóbica/de intercambio
iónico.
Para sondas de color, infrarrojas o
fluorescentes, el receptor/anticuerpo puede ser un tinte de color,
infrarrojo o fluorescente inmovilizado, por ejemplo, en una
microesfera de 0,02-10 micrómetros o en oro
coloidal. Estos soportes absorben proteínas o presentan grupos
funcionales, tales como NH_{2}, COOH o CHO, para unión covalente
a proteínas. La microesfera está, de modo general, revestida con una
alta concentración de proteínas de unión altamente específicas.
Típicamente, la membrana de fase estacionaria
está formada por nitrocelulosa, nailon, polietileno u otro material
adecuado. En la fase estacionaria, el medicamento representativo de
analitos está fijado con alta relación específica a un portador,
por ejemplo, una proteína, tal como BSA, IgG o proteína A. La
membrana 36 de fase estacionaria presenta múltiples zonas de
reacción e incluye la zona de ensayo 38 rociada en una línea, usando
un instrumento adecuado de rociado. El fin de la zona de ensayo es
capturar un complejo sin reaccionar de proteínas de unión/sonda
para su visión o medición. La zona de ensayo 38 (figura 6) consiste
en un analito de detección; es decir, ceforanida o un miembro de la
familia de analitos, es decir, betalactámicos, acoplado a una
proteína portadora, es decir, BSA, IgG, KLH, en suspensión en una
disolución tampón de 5 a 100 mM (tal como una base de fosfatos o
tampón) en un intervalo de pH de 3-10,
preferiblemente de 6-8. La concentración de
proteínas total de la disolución de anticuerpos varía desde 0,2
hasta 100 mg/ml. El analito-portador, disuelto en
una disolución tampón, por ejemplo, un tampón de fosfatos 10 mM, pH
6,9, que contiene azúcares, tales como trehalosa u otros aditivos,
se rocía como una línea sobre la membrana de fase estacionaria. La
inmovilización de tentáculos del analito conjugado a una portadora
de múltiples puntos de unión, tales como proteínas A o microesferas
de látex, aumenta la estabilidad y la capacidad de unión. Un
tratamiento térmico posterior de la membrana estabiliza además la
adhesión. Sobre el dispositivo de ensayo, se puede añadir una
segunda zona de ensayo a la zona de reacción para ensayar un
segundo analito. Por ejemplo, la primera zona de ensayo puede tener
un primer aglutinante para amoxicilina, ampicilina, ceftiofur,
cefaparina y penicilina G. La segunda zona de ensayo puede tener un
segundo aglutinante para cloxacilina. Alternativamente, la primera
zona de ensayo puede hacer ensayos con betalactámicos y la segunda
zona de ensayo puede hacer ensayos con sulfonamidas. Se pueden
añadir zonas de ensayo adicionales para hacer ensayos con analitos
adicionales.
La zona de reacción incluye también la zona de
control 40, mostrada en la figura 13, rociada en forma de línea,
usando un instrumento adecuado de rociado. Un objetivo de la zona de
control 40 es capturar un complejo de proteínas de unión/sonda que
no se ha unido a la zona de ensayo 38. La zona de control 40 puede
consistir en un anticuerpo específico frente a las proteínas de
unión/sonda en suspensión en una disolución tampón de 5 a 100 mM
(de fosfatos o trizma) en un intervalo de pH de 3 a 10. La
concentración de proteínas total de la disolución de anticuerpos
varía, de modo general, desde 0,2 hasta 100 mg/ml.
En una realización, el material para
ceforanida-SM se añade a la disolución
SMCC-BSA-NEM y la reacción sigue
con agitación durante la noche a 4°C. La
ceforanida-BSA se dializa para eliminar la
ceforanida libre. La zona de control incluye un anticuerpo frente
al receptor etiquetado o un anticuerpo de amplio espectro, que está
inmovilizado como una línea paralela a la zona de ensayo. Así, el
receptor/anticuerpo de la composición de fase móvil se captura en
esta línea, independientemente de la presencia o ausencia de
analitos en la muestra. La zona de control consiste en un
an-
ticuerpo realizado frente al receptor de betalactámicos. El receptor es purificado mediante cromatografía de afinidad.
ticuerpo realizado frente al receptor de betalactámicos. El receptor es purificado mediante cromatografía de afinidad.
Una comparación de la zona de control con la
zona de ensayo produce el resultado en las pruebas. Típicamente, si
la zona de control es más oscura que la zona de ensayo, un analito
está presente al nivel de detección o a un mayor nivel (véase la
figura 6).
La zona de eliminación 43, mostrada en la figura
7, está realizada típicamente de celulosa prensada u otro material
absorbente para mantener consistente el flujo de muestra y para
retener la muestra reaccionada. La zona de eliminación solapa, de
modo general, la membrana 36 de fase estacionaria aproximadamente de
1 a 5 mm.
La movilidad de la muestra (leche, suero
sanguíneo u otros fluidos) se ensaya para optimizar los tiempos y
la uniformidad de reacción. Se usan membranas de poros de gran
tamaño (15 a 140 \mum) para permitir el flujo de muestras
viscosas, como leche o suero.
La zona de eliminación 43 incluye típicamente
una almohadilla absorbente que es una membrana de absorción hecha
de una esponja sintética de celulosa, o de otro material. Esta
almohadilla mantiene la muestra circulando y detiene el flujo en la
saturación, proporcionando así al análisis control temporal y
reduciendo el ruido de fondo.
Se añade una muestra biológica acuosa a la
esponja 32 del dispositivo de ensayo. La esponja 32 sirve como una
almohadilla para muestras que se expande a medida que absorbe la
muestra. La almohadilla 32 de esponja solapa al soporte 33 de fase
móvil, y al flujo de fluido sobre el soporte 33 de fase móvil, en el
que los materiales de fase móvil se disuelven en el fluido
biológico. Los analitos presentes en la muestra empiezan a unirse
con la o las proteínas de unión específicas fijadas a la muestra. Al
mismo tiempo, anticuerpos específicos unidos o desunidos o
proteínas de unión se unen con analitos específicos para ajustar su
sensibilidad al ensayo. El soporte 33 de fase móvil solapa la
membrana 36 de fase estacionaria, y el fluido biológico, junto con
la composición 34 de fase móvil (esferillas coloreadas), siguen
reaccionando, a medida que los materiales fluyen hacia arriba de la
membrana 36 de fase estacionaria. Cuando el complejo de proteínas de
unión/sonda alcanza la zona de ensayo 38, una porción del complejo
de proteínas de unión/sonda se une a la zona de ensayo. En una
muestra positiva, el analito en la misma se une al complejo de
proteínas de unión/sonda, reduciendo la cantidad de complejo de
proteínas de unión/sonda capaz de unirse a la zona de ensayo 38.
Cuando el material alcanza la zona de control 40, una porción del
complejo de proteínas de unión/sonda se une a la zona de control
40. El reactivo en exceso se absorbe entonces en la almohadilla de
elimina-
ción 43.
ción 43.
En una muestra negativa, los reactivos se
titulan de manera que la zona de ensayo 38 tenga la misma cantidad
o, preferiblemente, una mayor cantidad de la sonda uniéndose a ella
que en la zona de control 40. Al contrario a esto, en una muestra
positiva, la zona de control 40 tiene una mayor cantidad de la sonda
uniéndose a ella que la zona de ensayo 38.
En una realización de la invención, se realiza
un ensayo de betalactámicos para analizar los mismos en la leche
con un nivel seguro. Se une un receptor de betalactámicos
parcialmente purificado a partir del BST (Bacillus
stearothermophilus) a una disolución de oro coloidal para
conseguir una sonda de proteínas de unión a
betalactámicos/esferillas de oro. Ésta es rociada sobre el soporte
33 de fase móvil, junto con anticuerpos monoclonales frente a
ceftiofur, cefapirina, ampicilina y amoxicilina, a fin de reducir
la sensibilidad de estos cuatro antibióticos, de manera que el
ensayo proporcione una respuesta deseada a la dosis. Se rocía sobre
la zona de ensayo 38 una ceforanida-BSA conjugada,
y se rocía en la zona de control 40 un anticuerpo frente al receptor
de betalactámicos BST. Se aplica una muestra de leche cruda,
preferiblemente entre 0,1-1,0 ml, a la almohadilla
para muestras con una pipeta y se incuba la tira reactiva a 55°C.
Después de aproximadamente ocho minutos, se retira la tira reactiva
10 de la estufa de incubación, y se analiza. Si la zona de ensayo 38
es más oscura o del mismo color que la línea de la zona de control
40, la muestra es negativa y, si la zona de ensayo 38 es más clara
que la zona de control 40, la muestra es positiva.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Los resultados en las pruebas se muestran en la
siguiente Tabla 1:
El ensayo descrito es un análisis de tipo
inhibición. El analito en la muestra se une con una sonda de
proteínas de unión a betalactámicos/de composición de fase móvil e
impide la unión a un betalactámico estacionario unido a la
superficie de la membrana. La adición de un anticuerpo monoclonal
específico frente a ceftiofur ha alterado su nivel de inhibición
desde aproximadamente cinco ppb hasta entre 40 y 50 ppb. La adición
de un anticuerpo monoclonal específico frente a cefapirina ha
reducido su sensibilidad desde aproximadamente 3-5
ppb hasta entre 15 a 20 ppb.
El dispositivo de ensayo de la invención se
puede usar con tiras reactivas para detectar una variedad de
analitos, tales como toxinas tipo alfatoxinas, plaguicidas, tales
como organofosfatos y carbamatos; así como betalactámicos, tales
como penicilina, ampicilina, amoxicilina, cloxacilina,
dicloxacilina, oxacilina, ceftiofur y cefapirina; tetraciclinas,
tales como clorotetraciclina, oxitetraciclina y tetraciclina;
sulfonamidas, tales como sulfametazina, sulfadimetoxina,
sulfamerazina, sulfatiazol y sulfadiazina; macrolidas, tales como
eritromicina, espiramicina y tilosina; aminoglicosidas, tales como
gentamicina, neomicina y DH/estriptomicina; y otros, tales como
dapsona, cloramfenicol, novobiocina, espectinomicina y
trimetoprima, para detectar los límites de
residuo-analito máximos en la muestra. La mayoría
de los elementos para cada ensayo son los mismos, excepto las
sustancias químicas de la fase móvil, la zona de ensayo y la zona
de control, que están adaptados a la detección de analitos
específicos.
A medida que la muestra entra desde la membrana
36 de fase estacionaria en la zona de eliminación 43 (hasta que se
satura la almohadilla absorbente), el receptor etiquetado sin
reaccionar es capturado en la zona de reacción por un analito
inmovilizado representativo de grupo. El residuo químico en la
muestra reacciona con el receptor etiquetado, haciéndolo que no
reaccione a la línea de ensayo. Así, cuantos más residuos hay en la
muestra, menos señales se detectan en la zona de ensayo.
La membrana de fase estacionaria está construida
a partir de una matriz altamente porosa adecuada para muestras
viscosas, tales como leche o extractos de carne. En cada zona, está
embebida una combinación de polímeros solubles (por ejemplo,
proteínas, polietilenglicol, etc.) para controlar la cinética de
movilidad de la muestra desde la composición de fase móvil hasta la
zona de reacción, y en la propia zona de reacción.
Se generaron datos con un receptor de
betalactámicos microbianos, unos anticuerpos específicos frente a
sulfametazina, tretraciclina y aflatoxina (pt CHII AOAC) para
detectar la presencia de residuos correspondientes en la leche o en
otras matrices, tal como suero. Se detectaron con estos experimentos
unos niveles de 3-5 ppb de penicilina G (PEN G), de
5-20 ppb de cefapirina, de 30-100
ppb de oxitetraciclina (OXT), de 10-100 ppb de
sulfametazina (SMZ) y de 2-40 ppb de aflatoxina
B1.
Se prefiere, de modo general, una estufa de
incubación con temperatura ajustable que varíe hasta 70°C. El
dispositivo de ensayo puede emplear un colorímetro portátil, un
fluorímetro de refracción o un lector de infrarrojos. En una
realización preferida, el dispositivo de ensayo incluye un lector
que se usa para leer una tira reactiva que contiene dos líneas. La
línea de control es una línea de referencia que asegura que el
ensayo ha discurrido correctamente. La línea de control se usa
también como una referencia cuando el lector determina si la muestra
es positiva o negativa. La línea de ensayo indica la concentración
de la sustancia que se está ensayando. Cuanto más oscura es la
línea de ensayo, mayor es la concentración de la sustancia en la
muestra. El lector incluye dos componentes, un controlador y un
medidor.
El medidor lee la tira, cuando ésta se inserta
en el medidor, al que se da la orden de leer la tira. El medidor
selecciona entonces una serie de diodos emisores de luz (LED),
preferiblemente, siete. La luz emitida desde los LED rebota en la
tira que se está leyendo. La luz se refleja entonces en un
optosensor 128 x 1. El sensor envía 128 valores de fecha que
representan la intensidad de la luz en cada uno de los 128 píxeles
para un microcontrolador a bordo. La fecha del píxel se almacena en
la memoria del medidor. Las áreas oscuras de la tira tienen un
valor inferior al de las áreas claras. Esta información se usa más
tarde para calcular la intensidad de las dos líneas que se están
leyendo.
El controlador envía una orden al medidor a fin
de pedir la fecha leída por este último. El controlador realiza
cálculos con la fecha para determinar la intensidad de las dos
líneas. Si la línea de ensayo es más oscura que la línea de
control, entonces, se dice que el ensayo tiene un resultado
negativo. Si la línea de ensayo es más clara que la línea de
control, entonces, se dice que el ensayo tiene un resultado
positivo. El controlador presenta al usuario el resultado, así como
un valor sin procesar que representa la diferencia en la intensidad
de las dos líneas.
La integración de la estufa de incubación con
fibra óptica para leer los resultados puede hacer que el ensayo
esté completamente automatizado.
La unidad de ensayo, con una forma tal como de
blíster, se coloca en una estufa de incubación, que se calienta
hasta aproximadamente 56,5°C \pm 1°C. Se desprende hacia atrás la
cinta y se añade una muestra líquida, de 0,3 ml, al pocillo para
muestras, y se vuelve a sellar la cinta. La unidad de ensayo se
incuba al menos durante cinco minutos.
Una vez que la muestra se añade al pocillo para
muestras, es absorbida por la esponja para muestras, que se expande
en el interior del pocillo. La porción superior del pocillo de
plástico impide que la esponja se expanda completamente. La presión
de la esponja contra el pocillo, en la parte superior, y contra el
soporte de fase móvil, en la parte inferior, proporciona algo de
fuerza añadida para propulsar la muestra líquida hacia arriba de la
tira de ensayo con un régimen mayor que el que se presentaría de
otro modo. La esponja se expande, y la muestra se mueve, a
continuación, sobre el soporte de fase móvil e interactúa con la
composición de fase móvil. La composición de fase móvil comienza a
moverse sobre la nitrocelulosa. Durante este tiempo, los residuos o
analitos producidos en la muestra se unen al receptor o anticuerpo
fijado al conjugado de fase móvil.
Cuando la composición de fase móvil alcanza la
zona de ensayo, el receptor marcado libre se une a la zona de
ensayo, dando como resultado una línea inferior oscura. El receptor
o anticuerpo con analito unido no se une a la línea de ensayo,
dando como resultado una línea de zona de ensayo no coloreada o
ligeramente coloreada. Este es un análisis de tipo inhibición
secuencial, en el que el compuesto de interés no se une a la zona de
ensayo. La composición de fase móvil se mueve hasta más allá de la
zona de control y sobre una almohadilla absorbente, que sirve como
depósito para recoger la composición desunida de fase móvil.
Las figuras 14-17 ilustran una
realización del dispositivo 101 en el blíster 103 transparente, que
incluye una tira de sellado 111 de plástico de cinta transparente
para encerrar en su interior la tira reactiva 105. El blíster 103
incluye una cavidad alargada para contener la tira 105 y una
cavidad-carcasa de expansión 104 para formar una
cavidad, generalmente en forma de cepillo de dientes, dentro del
blíster 103 de plástico y la tira 105. Tal como se muestra, la
cavidad-carcasa de expansión 104 está conformada
triangularmente. El blíster 103 incluye una zona 114 de restricción
de movimiento que rodea la almohadilla de eliminación 106 y otra
zona 115 de restricción de movimiento que rodea el refuerzo adhesivo
113 en el punto en el que éste sobresale por delante de la esponja
109 de absorción de muestras. Las zonas 114, 115 de restricción de
movimiento forman lugares de apriete que aseguran la tira 105
dentro del blíster 103. El dispositivo, por lo tanto, está diseñado
de manera que una posición en la que se presenta estrechamiento está
en la almohadilla de eliminación 106, zona en la que hay situado un
material absorbente que actúa como almohadilla absorbente.
Preferiblemente, el dispositivo está diseñado, y los componentes
están situados, de manera que aproximadamente un cm de refuerzo
adhesivo sobresale por delante de la almohadilla de esponja de
muestra contenida dentro de la zona de aplicación de muestra. Por
lo tanto, la tira está asegurada en su sitio en uno cualquiera o en
ambos extremos, permitiendo por ello un flujo libre de muestra.
La figura 15 muestra una vista en sección
lateral del dispositivo 101 de ensayo tipo blíster antes del uso.
La figura 15 muestra el dispositivo 101 de ensayo tipo blíster, con
un extremo desprendido hacia atrás por una patilla de
desprendimiento 112, para exponer la cavidad-carcasa
de expansión 104 y secar la almohadilla 109 de esponja absorbente
de filtro de la tira reactiva 105, de manera que se puede añadir una
cantidad definida de una muestra líquida, por ejemplo, con una
pipeta, tal como se muestra. La figura 17 ilustra el dispositivo de
ensayo 101 después de la adición de la muestra líquida, con la
patilla de desprendimiento 112 vuelta a sellar y con la almohadilla
109 de esponja completamente expandida por la muestra líquida dentro
de la cavidad-carcasa 104, y listo para ser
incubado.
La figura 18 es una vista a escala ampliada de
la almohadilla absorbente 109 del dispositivo de ensayo. La figura
18 ilustra el estrechamiento de las paredes interiores de la carcasa
en la zona A para formar la zona 114 de restricción de movimiento,
asegurando que el refuerzo adhesivo 113, y, por ello, la tira 105
(no mostrada en la figura 18) se mantiene en su sitio dentro del
blíster 113 de plástico. La figura 18 ilustra también la zona B de
cámara de aire que existe entre la tira 105 y el refuerzo adhesivo
113, lo que permite un flujo consistente de la muestra a lo largo
de la tira.
Claims (5)
1. Un dispositivo de ensayo (50, 101) para
detectar la presencia de un analito residual en una muestra, que
comprende:
a) una composición (34, 110) de fase móvil que
tiene un receptor para unirse con el analito, en el que dicha
composición de fase móvil se puede portar en la muestra;
b) una membrana (36, 107) de fase estacionaria
que tiene un primer extremo de membrana, en contacto con la
composición de fase móvil, y un segundo extremo de membrana, en el
que dicha membrana permite un flujo capilar lateral de la muestra
desde el primer extremo de membrana hasta el segundo extremo de
membrana;
c) una zona de ensayo (38) sobre la membrana
(36, 107) de fase estacionaria entre el primer extremo de membrana
y el segundo extremo de membrana, y con un primer aglutinante para
unirse con un receptor desunido;
d) una zona de control (40) sobre la membrana de
fase estacionaria entre la zona de ensayo y el segundo extremo de
membrana, y con un segundo aglutinante para unirse con un receptor
de unión a analitos,
caracterizado porque
la composición de fase móvil incluye además un
anticuerpo o un aglutinante adicional que se une con un analito
seleccionado para competir con el receptor, reduciendo por ello la
sensibilidad al analito seleccionado.
2. Un dispositivo de ensayo según la
reivindicación 1, en el que dicho aglutinante adicional es un
anticuerpo seleccionado a partir de los anticuerpos frente a
cefapirina, ampicilina, ceftiofur y amoxicilina.
3. Un dispositivo de ensayo según cualquier
reivindicación precedente, en el que dicho receptor es un receptor
marcado que se une con una familia de analitos que tienen puntos de
unión estructural similares.
4. Un dispositivo de ensayo según la
reivindicación 3, en el que los miembros de la familia de analitos
tienen diferentes requisitos de niveles de detección y en el que
dicho anticuerpo o aglutinante adicional es un anticuerpo y está
mezclado con el receptor marcado, en una cantidad que ajuste la
sensibilidad para el analito seleccionado, de manera que no se
obtenga un resultado positivo a menos que un cierto umbral del
analito seleccionado esté presente en la muestra.
5. Un dispositivo de ensayo según cualquier
reivindicación precedente, para detectar residuos antibióticos en
la leche.
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