ES2277922T3

ES2277922T3 - Proteinas fijadoras de gtp relacionadas con el estres, y metodos de utilizacion en plantas.

Info

Publication number: ES2277922T3
Application number: ES01928388T
Authority: ES
Inventors: Oswaldo Da Costa E Silva; Hans J. Bohnert; Nocha Van Thielen; Ruoying Chen
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2000-04-07
Filing date: 2001-04-06
Publication date: 2007-08-01
Anticipated expiration: 2021-04-06
Also published as: WO2002046442A3; US6867351B2; US6689939B2; EP1795600A2; CA2405750C; ES2272461T3; WO2001077354A2; EP1311693A2; EP1795600A3; US7495151B2; US7189893B2; EP1760146A3; EP1881073A2; US7803987B2; US20090320157A1; CA2405708A1; US7514599B2; US20090031451A1; EP1760145A2; DE60124880T2

Abstract

Una célula de planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificante de Proteína Fijadora de GTP Relacionada con el Estrés (GBSRP), en la cual la GBSRP se selecciona de un grupo constituido por un polipéptido como se define en SEQ ID NO:11 y un polipéptido que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con un polipéptido de SEQ ID NO:11 en toda su longitud, y en donde la expresión del ácido nucleico en la célula de la planta da como resultado una tolerancia incrementada de la célula de la planta al estrés por sequía y/o estrés por helada en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula de la planta.

Description

Proteínas fijadoras de GTP relacionadas con el estrés, y métodos de utilización en plantas.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Esta invención se refiere en general a secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas que están asociadas con respuestas al estrés abiótico y la tolerancia al estrés abiótico en las plantas. En particular, esta invención se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas que confieren a las plantas tolerancia a la sequía y/o la hela-
da.

Antecedentes de la técnica

Los estados de estrés abiótico ambiental, tales como estrés por sequía, estrés por salinidad, estrés por calor, y estrés por frío, son factores fundamentales limitantes del crecimiento y la productividad de las plantas. Las pérdidas de cosechas y pérdidas de rendimiento de cosecha de cosechas importantes tales como arroz, maíz (grano) y trigo causadas por estos estados de estrés constituyen un factor económico y político importante y contribuyen a la escasez de alimentos en muchos países sub-desarrollados.

Las plantas se ven expuestas típicamente durante su ciclo vital a condiciones de contenido reducido de agua en el medio ambiente. La mayoría de las plantas han desarrollado estrategias para protegerse a sí mismas contra estas condiciones de desecación. No obstante, si la severidad y duración de las condiciones de sequía son demasiado grandes, los efectos sobre el desarrollo, el crecimiento y el rendimiento de la mayoría de las plantas de cosecha son profundos. Adicionalmente, la mayoría de las plantas de cosecha son muy sensibles a concentraciones elevadas de sal en el suelo. La exposición continua a sequía y contenido elevado de sal causa alteraciones importantes en el metabolismo de las plantas. Estos grandes cambios en el metabolismo conducen finalmente a la muerte celular y por consiguiente a pérdidas de rendimiento.

El desarrollo de plantas tolerantes al estrés es una estrategia que tiene potencial para resolver o mediar al menos alguno de estos problemas. Sin embargo, las estrategias de tradicionales de reproducción de plantas para desarrollar nuevas líneas de plantas que exhiban resistencia (tolerancia) a estos tipos de estrés son relativamente lentas y requieren líneas específicas resistentes para cruzamiento con la línea deseada. Los recursos limitados de germoplasma para tolerancia al estrés y la incompatibilidad en los cruzamientos entre especies de plantas remotamente afines representan problemas importantes encontrados en la reproducción convencional. Adicionalmente, los procesos celulares que conducen a tolerancia a la sequía, el frío y la sal en plantas modelo, tolerantes a la sequía y/o la sal son de naturaleza compleja e implican mecanismos múltiples de adaptación celular y numerosos caminos metabólicos. Esta naturaleza multi-componente de la tolerancia al estrés no sólo ha hecho en gran parte infructuosa la reproducción para tolerancia, sino que ha limitado también la posibilidad de elaborar por ingeniería genética plantas con tolerancia al estrés utilizando métodos biotecnológicos.

Así pues, es necesaria la identificación de los genes y proteínas implicados en estos procesos multi-componente que conducen a la tolerancia al estrés. La elucidación de la función de los genes expresados en las plantas tolerantes al estrés no sólo hará avanzar la comprensión actual de la adaptación de las plantas y la tolerancia a los estados de estrés ambiental, sino que puede proporcionar también información importante para el diseño de nuevas estrategias para mejora de las cosechas.

Existen al menos cuatro caminos diferentes de transducción de señales que conducen a tolerancia al estrés en la planta modelo Arabidopsis thaliana. Estos caminos se encuentran bajo el control de distintos factores de transcripción, proteína-quinasas, proteína-fosfatasas y otros componentes de los caminos de transducción de señales (Shinozaki et al. 2000 Curr. Op. Pl. Biol. 3: 217-23). Estas proteínas son dianas primarias para modificación por ingeniería genética de la tolerancia al estrés, dado que las mismas podrían funcionar como cambios maestros; las alteraciones en un solo gen podrían conducir a la activación de una cadena entera de transducción de señales conducente a la tolerancia al estrés.

La percepción del estrés osmótico en las bacterias así como en las plantas es realizada por un sistema de dos componentes que comprende una proteína perceptora y una proteína efectora (Wurgler-Murphy SM y Saito S. 1997. Trends in Biochem. Sci. 22: 172-6 y Shinozaki et al. 2000. Curr. Op. Pl. Biol. 3: 217-23). Caminos de transducción de señales dependientes de proteína-quinasas activadas por mitógenos están estrechamente implicados en estos procesos. Otro componente importante de estas cadenas de transducción de señales son las proteínas fijadoras de GTP (proteínas G). Hablando en términos generales, existen al menos tres clases de proteínas G: a) proteínas heterotrímeras (subunidades alfa, beta y gamma), b) proteínas monómeras (pequeñas), y c) Dianinas. Las proteínas fijadoras de GTP reciben este nombre debido a que cada una debe fijar GTP para ser activa. Las funciones de las proteínas fijadoras de GTP son variadas, en el sentido de que se extienden desde la transmisión directa de una señal externa (por estar asociadas con un receptor fijado a la membrana), pasando por la participación en el tráfico de vesículas, hasta la importación de proteínas en compartimientos sub-celulares.

La participación de proteínas G trímeras en la tolerancia al estrés no ha sido demostrada directamente hasta ahora. Sin embargo, dado que las mismas están asociadas con receptores fijados a la membrana, pueden estar implicadas en la transmisión de la señal de estrés detectada que conduce a la tolerancia al estrés. La fijación del ligando a un receptor podría causar supuestamente la activación de la sub-unidad alfa y cambiar con ello la concentración de un segundo mensajero de peso molecular bajo. Los cambios en la concentración de segundos mensajeros, como CAMP en los sistemas animales, activan finalmente otros componentes del camino de transducción de señales, y segundos mensajeros tales como derivados de inositol han sido implicados en la tolerancia al estrés en las plantas (Ishitani et al. 1996 PI Journal 9: 537-48).

Las proteínas G monómeras/pequeñas están involucradas también en muchos procesos celulares diferentes y han sido implicadas en el tráfico/transporte de vesículas, el ciclo celular y la importación de proteínas a orgánulos. Varios grupos de investigadores han identificado proteínas G pequeñas, homólogas a la familia Rab de proteínas G pequeñas, que son inducidas por tratamientos de desecación en las plantas (Bolte et al. 2000 Plant Mol. Biol. 42: 923-36; O'Mahony y Oliver 1999 Plant Mol. Biol. 39: 809-21). Estos investigadores especulan que las proteínas G pequeñas podrían estar involucradas en la preservación de la integridad de la membrana o la re-estructuración después del alivio del estrés. Sin embargo, dichos investigadores no han producido plantas transgénicas con tolerancia incrementada al estrés por sobre-expresión de estas proteínas G pequeñas.

Otra clase de proteínas G es la de las proteínas G de peso molecular alto. Las Dinaminas son un miembro representativo de esta clase. Han sido identificados varios homólogos de proteínas G de peso molecular alto en cierto número de sistemas eucariotas, que incluyen levadura, humanos, ratas y ratones y en sistemas vegetales que incluyen Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum y Glycine max. Aunque la secuencia y las funciones propuestas de los diferentes homólogos son diversas, todos ellos parecen funcionar en el tráfico de proteínas, ayudando probablemente a la formación de vesículas. La Dinamina mejor caracterizada hasta la fecha ha sido aislada de la rata y se ha demostrado que se fija a los microtúbulos y participa en la endocitosis al tiempo que es regulada por fosforilación (Robinson et al. 1993 Nature 365: 163-166.). Adicionalmente, se ha encontrado que la Dinamina vegetal aislada de Glycine max está localizada en toda la anchura de la placa celular recién formada durante la citoquinesis, lo que sugiere un papel para la proteína en la deposición del material de la placa celular por vesículas exocíticas (Gu & Verma 1996. EMBO J. 15: 695-704). Se ha demostrado que la proteína, ADL1, aislada de Arabidopsis, se localiza en las membranas tilacoides en el fraccionamiento sub-organular de los cloroplastos de las hojas. Plantas transgénicas que sobre-expresan una forma mutante de este gen exhiben un número reducido de cloroplastos y los cloroplastos existentes tenían un número reducido de tilacoides y proteínas de membrana tilacoidea. Estos datos sugieren un papel para ADL1 en el transporte de proteína necesario para la biogénesis de las membranas tilacoides (Park et al. 1998 EMBO J. 17: 859-867). Otro homólogo de este tipo, DNM1, encontrado en Saccharomyces cerevisiae participa también en la endocitosis, actuando en un nuevo paso antes de la fusión con el endosoma final (Gammie et al. 1995. J. Cell Biol. 130: 553-566). Sin embargo,
a pesar de estas investigaciones no ha sido demostrada la participación de las Dinaminas en la tolerancia al estrés.

Existe necesidad por tanto, de identificar los genes expresados en las plantas tolerantes al estrés que tengan la capacidad de conferir resistencia al estrés a su planta hospedadora y a otras especies de plantas. Las plantas tolerantes al estrés de nueva generación tendrán muchas ventajas, tales como el aumento de la extensión en que pueden cultivarse las plantas de cosecha, por ejemplo por disminución de los requerimientos de agua en una especie vegetal.

Sumario de la invención

Esta invención satisface en parte la necesidad de identificar proteínas nuevas y singulares fijadoras de GTP capaces de conferir tolerancia al estrés a las plantas por sobre-expresión. La presente invención proporciona una célula de planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificante de una Proteína Fijadora de GTP Relacionada con el Estrés (GBSRP), en donde la GBSRP se selecciona de un grupo constituido por un polipéptido como se define en SEQ ID NO: 11 y un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 95% con un polipéptido de SEQ ID NO: 11 en toda su longitud, y en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la célula de la planta da como resultado una tolerancia incrementada de la célula de la planta al estrés por sequía y/o el estrés por helada en comparación con la variedad de tipo salvaje de la célula de la planta. Concretamente, en esta memoria se describen proteínas-G: 1) Proteína-1 Fijadora de GTP (GBP-1) de Physcomitrella patens.

La invención estipula en algunas realizaciones que la GBSRP y el ácido nucleico codificante son los encontrados en miembros del género Physcomitrella. En otra realización preferida, el ácido nucleico y la proteína son de una Physcomitrella patens. La invención estipula que el estrés ambiental puede ser estrés por sequía y estrés por temperatura, o combinaciones de los mismos. En particular, el estrés ambiental es sequía o temperatura baja.

La invención proporciona adicionalmente una semilla producida por una planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificante de GBSRP como se ha descrito arriba, en donde la semilla es progenie auténtica para tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta. La invención proporciona adicionalmente una semilla producida por una planta transgénica que expresa una GBSRP como se ha descrito arriba en donde la semilla es progenie auténtica para tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.

La invención proporciona adicionalmente el uso de cualquiera de las plantas o semillas transgénicas arriba descritas para la fabricación de un producto agrícola. La invención proporciona adicionalmente una GBSRP aislada como se ha descrito arriba. La invención proporciona adicionalmente un ácido nucleico codificante de GBSRP aislado, en donde el ácido nucleico codificante de GBSRP codifica una GBSRP como se ha descrito arriba.

La invención proporciona adicionalmente un vector de expresión recombinante aislado que comprende un ácido nucleico codificante de GBSRP como se ha descrito arriba, en donde la expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora da como resultado la tolerancia incrementada de la célula hospedadora al estrés por sequía y/o el estrés por helada, en comparación con la variedad de tipo salvaje de la célula hospedadora.

La invención proporciona adicionalmente un método de producción de una planta transgénica con un ácido nucleico codificante de GBSRP como se ha descrito arriba, en el cual la expresión del ácido nucleico en la planta da como resultado la tolerancia incrementada de la célula de la planta al estrés por sequía y/o el estrés por helada en comparación con la variedad de tipo salvaje de la planta, que comprende: (a) transformar una célula de planta con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico codificante de GBSRP como se ha descrito arriba, y (b) generar a partir de la célula de la planta una planta transgénica con una tolerancia incrementada al estrés por sequía y/o el estrés por helada en comparación con la variedad de tipo salvaje de la planta.

La presente invención proporciona también métodos de modificación de la tolerancia al estrés de una planta que comprenden modificar la expresión de una GBSRP en la planta, en donde la GBSRP es como se ha descrito arriba. La invención estipula que este método puede realizarse de tal manera que la tolerancia al estrés se aumenta o se reduce. Preferiblemente, la tolerancia al estrés se aumenta en una planta por aumento de la expresión de una GBSRP.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1 (A-E) muestran las secuencias parciales de cDNA de GBP-1 (SEQ ID NO: 1), GBP-2 (SEQ ID NO: 2), GBP-3 (SEQ ID NO: 3), GBP-4 (SEQ ID NO: 4) y GBP-5 (SEQ ID NO: 5) de Physcomitrella patens.

Las Figuras 2 (A-E) muestran las secuencias de cDNA de longitud total de GBP-1 (SEQ ID NO: 6), GBP-2 (SEQ ID NO: 7), GBP-3 (SEQ ID NO: 8), GBP-4 (SEQ ID NO: 9) y GBP-5 (SEQ ID NO: 10 de Physcomitrella patens.

Las Figuras 3 (A-E) muestran las secuencias de aminoácidos deducidas de GBP-1 (SEQ ID NO: 11), GBP-2 (SEQ ID NO: 12), GBP-3 (SEQ ID NO: 13), GBP-4 (SEQ ID NO: 14) y GBP-5 (SEQ ID NO: 15) de Physcomitrella patens.

La Figura 4 muestra un diagrama del vector de expresión de plantas pBPSSC022 que contiene el super-promotor que dirige la expresión de SEQ ID NOs: 6, 7, 8, 9, y 10 ("Gen Deseado"). Los componentes son: gen de resistencia a la kanamicina NPTII (Hajdukiewicz et al. 1994 Pl. Mol Biol. 25: 989-98), promotor AtAct2-i (An et al. 1996 Plant J. 10: 107-21), terminador OCS3 (Weigel et al. 2000 Pl. Physiol. 122: 1003-13).

La Figura 5 muestra los resultados de una prueba de estrés por sequía con plantas transgénicas que sobre-expresan PpGBP-1 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales.

La Figura 6 muestra los resultados de una prueba de estrés por sequía con plantas transgénicas que sobre-expresan PpGBP-2 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales.

La Figura 7 muestra los resultados de una prueba de estrés por sequía con plantas transgénicas que sobre-expresan PpGBP-3 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales.

La Figura 8 muestra los resultados de una prueba de estrés por sequía con plantas transgénicas que sobre-expresan PpGBP-4 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales.

La Figura 9 muestra los resultados de una prueba de estrés por helada con plantas transgénicas que sobre-expresan PpGBP-1 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales.

La Figura 10 muestra los resultados de una prueba de estrés por helada con plantas transgénicas que sobre-expresan PpGBP-2 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales.

La Figura 11 muestra los resultados de una prueba de estrés por helada con plantas transgénicas que sobre-expresan PpGBP-3 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales.

La Figura 12 muestra los resultados de una prueba de estrés por helada con plantas transgénicas que sobre-expresan PpGBP-4 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales.

La Figura 13 muestra los resultados de una prueba de estrés por helada con plantas transgénicas que sobre-expresan PpGBP-5 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales.

Descripción detallada de la invención

La presente invención puede entenderse más fácilmente por referencia a la descripción detallada siguiente de las realizaciones preferidas de la invención y los ejemplos incluidos en esta memoria. Debe entenderse que la terminología utilizada en esta memoria tiene por objeto únicamente describir realizaciones específicas y no debe interpretarse como limitante. En particular, la designación de las secuencias de aminoácidos como proteína "Proteínas Relacionadas con el Estrés Fijadoras de GTP" (GBSRPs), no limita en modo alguno la funcionalidad de dichas secuencias.

La presente invención proporciona una célula de planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificante de GBSRP, en donde la GBSRP se selecciona de un grupo constituido por un polipéptido como se define en SEQ ID NO: 11 y un polipéptido que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con un polipéptido de SEQ ID NO: 11 en toda su longitud, y en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la célula de la planta da como resultado una tolerancia incrementada de la célula de la planta al estrés por sequía y/o el estrés por helada en comparación con la variedad de tipo salvaje de la célula de la planta. La invención proporciona adicionalmente una planta transgénica que comprende una célula de planta como se ha descrito arriba. Se proporciona también una semilla de planta producida por una planta transgénica que comprende una célula de la planta como se ha descrito arriba, en donde la semilla es progenie auténtica para tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con la variedad de tipo salvaje de la planta. La invención proporciona también el uso de una planta o semilla transgénica como se ha descrito arriba para la fabricación de un producto agrícola.

Como se utiliza en esta memoria, el término "variedad" se refiere a un grupo de plantas dentro de una especie que comparten caracteres constantes que los separan de la forma típica y de otras variedades posibles dentro de dicha especie. Si bien posee al menos un rasgo distintivo, una variedad se caracteriza también por cierta variación entre los individuos dentro de la variedad, basada fundamentalmente en la segregación mendeliana de rasgos entre la progenie de generaciones sucesivas. Una variedad se considera "progenie auténtica" para un rasgo particular si la misma es homocigótica genéticamente para dicho rasgo en tal grado que, cuando la variedad de progenie auténtica se auto-poliniza, no se observa un grado significativo de segregación independiente del rasgo entre la progenie. En la presente invención, el rasgo procede de la expresión transgénica de una o más secuencias de DNA introducidas en una variedad de la planta.

La presente invención describe por primera vez que la GBSRP de Physcomitrella patens, GBP-1, es útil para aumentar la tolerancia de una planta al estrés por sequía y/o el estrés por helada. La proteína predicha codificada por PpGBP-1 es similar a una clase particular de la proteína G pequeña de levadura, la proteína Sar-1 (Davies C. 1994. Plant Mol. Biol. 24: 525-31). Sar-1 está involucrada en el transporte de vesículas de levadura en el retículo endoplasmático. La sobre-expresión de esta clase de proteínas puede aumentar la tolerancia al estrés por preservación de la integridad de la membrana durante el intervalo de estrés y aceleración de la reconstrucción de la membrana después de la cesación del estrés.

De acuerdo con ello, la presente invención proporciona GBSRPs aisladas seleccionadas del grupo constituido por GBP-1. En particular, la GBSRP se selecciona de una Proteína-1 fijadora de GTP (GBP-1) como se define en SEQ ID NO: 11 y secuencias que tienen al menos 95% de identidad con ella en toda su longitud, y homólogos y ortólogos de la misma. Homólogos y ortólogos de las secuencias de aminoácidos se definen más adelante.

Las GBSRPs de la presente invención se producen preferiblemente por técnicas de DNA recombinante. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína se somete a clonación en un vector de expresión (como se ha descrito arriba), se introduce el vector de expresión en una célula hospedadora (como se ha descrito arriba y se expresa la GBSRP en la célula hospedadora. La GBSRP puede aislarse luego de las células por un esquema de purificación apropiado utilizando técnicas estándar de purificación de proteínas. Como alternativa a la expresión recombinante, un polipéptido o péptido GBSRP puede sintetizarse químicamente utilizando técnicas estándar de síntesis de péptidos. Además, la GBSRP nativa puede aislarse de células (v.g., Physcomitrella patens), por ejemplo utilizando un anticuerpo anti-GBSRP, que puede producirse por técnicas estándar utilizando una GBSRP o fragmento de la misma.

La invención proporciona adicionalmente un ácido nucleico codificante de GBSRP aislado como se ha descrito arriba.

En particular, el ácido nucleico codificante de GBSRP se selecciona de un ácido nucleico de la Proteína-1 Fijadora de GTP (GBP-1) como se define en SEQ ID NO: 6 y una secuencia que tiene al menos 80% de identidad con ella en toda la región codificante.

Homólogos y ortólogos de las secuencias de nucleótidos se definen más adelante. En una realización preferida, el ácido nucleico y la proteína se aíslan del género de plantas Physcomitrella. En otra realización preferida, el ácido nucleico y la proteína son de una planta Physcomitrella patens (P. patens).

Como se utiliza en esta memoria, el término "estrés ambiental" se refiere a cualquier condición de crecimiento sub-óptima e incluye condiciones sub-óptimas asociadas con estrés por sequía y temperatura, o combinaciones de los mismos. En particular, el estrés ambiental es sequía o temperatura, o combinaciones de las mismas, y en particular, puede ser contenido bajo de agua o temperatura baja. Debe entenderse también que, tal como se utiliza en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, "un" o "uno(a)" puede significar uno o más, dependiendo del contexto en el que se utilice. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" puede significar que puede utilizarse al menos una célula.

Como se utilizan también en esta memoria, debe entenderse que los términos "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" incluyen moléculas de DNA (v.g., cDNA o DNA genómico) y moléculas de RNA (v.g., mRNA) y análogos del DNA o RNA generados utilizando análogos de nucleótidos. Este término abarca también secuencia no traducida localizada en ambos extremos 3' y 5' de la región codificante del gen: al menos aproximadamente 1000 nucleótidos de secuencia aguas arriba del extremo 5' de la región codificante y al menos aproximadamente 200 nucleótidos de secuencia aguas abajo del extremo 3' de la región codificante del gen. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es DNA bicatenario.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una que está separada sustancialmente de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está exento de algunas de las secuencias que flanquean naturalmente el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el DNA genómico del organismo del que se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la molécula de ácido nucleico de GBSRP aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de las secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el DNA genómico de la célula de la que se deriva el ácido nucleico (v.g., una célula de Physcomitrella patens). Además, una molécula de ácido nucleico "aislada", tal como una molécula cDNA, puede estar exenta de algo del material celular restante con el que está asociada la misma naturalmente, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente.

Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, v.g. una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 6, puede aislarse utilizando técnicas estándar de biología molecular y la información de secuencias proporcionada en esta memoria. Por ejemplo, un cDNA de GBSRP de P. patens puede aislarse a partir de una genoteca de P. patens utilizando la totalidad o una porción de una de las secuencias de SEQ ID NO: 1. Además, una molécula de ácido nucleico que abarca la totalidad o una porción de una de las secuencias de SEQ ID NO: 1 puede aislarse por la reacción en cadena de la polimerasa utilizando iniciadores oligonucleotídicos diseñados basándose en esta secuencia. Por ejemplo, puede aislarse mRNA de células de plantas (v.g., por el procedimiento de extracción con tiocianato de guanidinio de Chirgwin et al. 1979 Biochemistry 18: 5294-5299) y puede prepararse cDNA utilizando transcriptasa inversa (v.g., transcriptasa inversa de MLV de Moloney, disponible de Gibco/BRL, Bethesda, MD; o transcriptasa inversa de AMV, disponible de Seikagaku America Inc., St. Petersburg, FL). Iniciadores oligonucleotídicos sintéticos para amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa pueden diseñarse basándose en las secuencias de nucleótidos que se muestran en SEQ ID NO: 1. Una molécula de ácido nucleico de la invención puede amplificarse utilizando cDNA o, alternativamente, DNA genómico, como molde e iniciadores oligonucleotídicos apropiados de acuerdo con las técnicas estándar de amplificación PCR. La molécula de ácido nucleico así amplificada puede clonarse en un vector apropiado y caracterizarse por análisis de la secuencia de DNA. Adicionalmente, pueden prepararse oligonucleótidos correspondientes a una secuencia de nucleótidos de GBSRP por técnicas de síntesis estándar, v.g., utilizando un sintetizador automático de DNA.

En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 6.

Estos cDNAs comprenden secuencias que codifican las GBSRPs (es decir, la "región codificante", indicada en la Tabla 1), así como secuencias 5' no traducidas y secuencias 3' no traducidas. Debe entenderse que SEQ ID NO: 6 comprenden a la vez regiones codificantes y regiones 5' y 3' no traducidas. Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden comprender solamente la región codificante de la secuencia en SEQ ID NO: 6 o pueden contener fragmentos genómicos enteros aislados de DNA genómico. Una región codificante de estas secuencias se indica como una "posición ORF".

Además, la molécula de ácido nucleico puede comprender solamente una porción de la región codificante de la secuencia en SEQ ID NO: 6, por ejemplo, un fragmento que puede utilizarse como una sonda o iniciador o un fragmento que codifica una porción biológicamente activa de una GBSRP. Las secuencias de nucleótidos determinadas por la clonación de los genes GBSRP de P. patens permiten la generación de sondas e iniciadores diseñados para uso en la identificación y/o clonación de homólogos de GBSRP en otros tipos de células y organismos, así como homólogos de GBSRP de otros musgos y especies afines.

Porciones de proteínas codificadas por las moléculas de ácido nucleico de GBSRP de la invención son preferiblemente porciones biológicamente activas de una de las GBSRPs descritas en esta memoria. Como se utiliza en esta memoria, debe entenderse que la expresión "porción biológicamente activa de" una GBSRP incluye una porción, v.g., un dominio/motivo, de una GBSRP que participa en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta, tiene una actividad como se indica en la Tabla 1, o participa en la transcripción de una proteína involucrada en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta. Para determinar si una GBSRP, o una porción biológicamente activa de la misma, puede participar en la transcripción de una proteína involucrada en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta, o si la represión de una GBSRP da como resultado una tolerancia incrementada al estrés en una planta, puede realizarse un análisis de estrés de una planta que comprende la GBSRP. Tales métodos de análisis son bien conocidos por los expertos en la técnica, como se detalla en el Ejemplo 7. De modo más específico, fragmentos de ácido nucleico que codifican porciones biológicamente activas es de una GBSRP pueden prepararse por aislamiento de una porción de una de las secuencias en SEQ ID NO: 11, que expresa la porción codificada de la GBSRP o el péptido (v.g., por expresión recombinante in vitro) y evaluación de la actividad de la porción codificada de la GBSRP o el
péptido.

Se contemplan porciones biológicamente activas de una GBSRP e incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos derivadas de la secuencia de aminoácidos de una GBSRP, v.g., una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, o la secuencia de aminoácidos de una proteína homóloga a una GBSRP, que incluyen menos aminoácidos que una GBSRP de longitud total o la proteína de longitud total que es homóloga a una GBSRP, y exhiben al menos una actividad de una GBSRP. Por regla general, las porciones biológicamente activas (v.g., péptidos que tienen, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 o más aminoácidos de longitud) comprenden un dominio o motivo que tiene al menos una actividad de una GBSRP. Además, otras porciones biológicamente activas en las cuales están delecionadas otras regiones de la proteína, pueden prepararse por técnicas recombinantes y evaluarse respecto a una o más de las actividades descritas en esta memoria. Con preferencia, las porciones biológicamente activas de una GBSRP incluyen uno o más dominios/motivos seleccionados o porciones de los mismos que tienen actividad biológica.

La invención abarca también proteínas GBSRP quiméricas o de fusión. Como se utiliza en esta memoria, una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" GBSRP comprende un polipéptido de GBSRP enlazado operativamente a un polipéptido que no es de GBSRP. Un polipéptido de GBSRP hace referencia a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a una GBSRP como se ha descrito arriba, en tanto que un polipéptido que no es de GBSRP hace referencia a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a una proteína que no es sustancialmente homóloga a la GBSRP, v.g., una proteína que es diferente de la GBSRP y se deriva del mismo organismo o de un organismo diferente. Dentro de la proteína de fusión, el término "enlazado operativamente" tiene por objeto indicar que el polipéptido de GBSRP y el polipéptido que no es de GBSRP están fusionados uno a otro de tal manera que ambas secuencias cumplen la función propuesta atribuida a la secuencia utilizada. El polipéptido que no es de GBSRP puede fusionarse al término N o el término C del polipéptido de GBSRP. Por ejemplo, en una realización, la proteína de fusión es una proteína de fusión GST-GBSRP en la cual las secuencias de GBSRP están fusionadas al término C de las secuencias de GST. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de GSBRPs recombinantes. En otra realización, la proteína de fusión es una GBSRP que contiene una secuencia de señal heteróloga en su término N. En ciertas células hospedadoras (v.g., células hospedadoras de mamífero), la expresión y/o secreción de una GBSRP puede incrementarse por el uso de una secuencia señal heteróloga.

Preferiblemente, una proteína GBSRP quimérica o de fusión de la invención se produce por técnicas estándar de DNA recombinante. Por ejemplo, fragmentos de DNA que codifican las diferentes secuencias de polipéptidos se ligan unos a otros en marco de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo empleando términos de extremos romos o extremos cohesivos para ligación, digestión con enzimas de restricción para proporcionar los términos apropiados, rellenado de extremos cohesivos en caso apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión indeseable y ligación enzimática. En otra realización, el gen de fusión puede sintetizarse por técnicas convencionales que incluyen sintetizadores automáticos de DNA. Alternativamente, puede llevarse a cabo la amplificación de fragmentos de genes por PCR utilizando iniciadores de anclaje que dan lugar a colgantes complementarios entre dos fragmentos de genes consecutivos que pueden reasociarse y re-amplificarse subsiguientemente para generar una secuencia de gen quimérica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, compiladores Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Además, están disponibles comercialmente muchos vectores de expresión que codifican ya un resto de fusión (v.g., un polipéptido GST). Un ácido nucleico codificante de GBSRP puede clonarse en un vector de expresión de este tipo de tal modo que el resto de fusión está enlazado en marco a la GBSRP.

Además de fragmentos y proteínas de fusión de las GBSRPs descritas en esta memoria, se contemplan homólogos y análogos de GBSRPs y ácidos nucleicos codificantes de GBSRP existentes naturalmente en una planta como se ha descrito arriba. Los "homólogos" se definen en esta memoria como dos ácidos nucleicos o proteínas que tienen secuencias de nucleótidos o aminoácidos similares u "homólogas", respectivamente. Los homólogos incluyen variantes alélicas, ortólogos, parálogos, agonistas y antagonistas de las GBSRPs como se define más adelante. El término "homólogo" abarca adicionalmente moléculas de ácido nucleico que difieren de las secuencias de nucleótidos que se muestran en SEQ ID NO: 6 (y porciones de las mismas) debido a la degeneración del código genético y codifican por tanto la misma GBSRP que la codificada por las secuencias de nucleótidos que se muestran en SEQ ID NO: 6.

Como se utiliza en esta memoria, una GBSRP "existente naturalmente" hace referencia a una secuencia de aminoácidos de GBSRP que existe en la naturaleza. Particularmente, una GBSRP existente naturalmente comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 11.

Un agonista de la GBSRP puede retener sustancialmente las mismas actividades biológicas de la GBSRP, o un subconjunto de ellas. Un antagonista de la GBSRP puede inhibir una o más de las actividades de la forma existente naturalmente de la GBSRP. Por ejemplo, el antagonista de GBSRP puede fijarse competitivamente a un miembro situado aguas abajo o aguas arriba de la cascada metabólica de componentes de la membrana celular que incluye la GBSRP, o fijarse a una GBSRP que media el transporte de compuestos a través de tales membranas, impidiendo con ello que tenga lugar translocación.

Moléculas de ácido nucleico correspondientes a variantes alélicas naturales y análogos, ortólogos y parálogos de un cDNA de GBSRP pueden aislarse basándose en su identidad con los ácidos nucleicos de GBSRP de Physcomitrella patens descritos en esta memoria utilizando cDNAs de GBSRP, o una porción de los mismos, como sonda de hibridación de acuerdo con técnicas estándar de hibridación en condiciones de hibridación severas. En una realización alternativa, los homólogos de la GBSRP pueden identificarse por escrutinio de genotecas combinatorias de mutantes, v.g., mutantes de truncación, de la GBSRP respecto a actividad agonista o antagonista de GBSRP. En una realización, se genera una genoteca diversificada de variantes de GBSRP por mutagénesis combinatoria al nivel del ácido nucleico y se codifica por una genoteca de genes diversificada. Una genoteca diversificada de variantes de GBSRP puede producirse mediante, por ejemplo, ligación enzimática de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias de genes de tal modo que pueda expresarse un conjunto degenerado de secuencias potenciales de GBSRP como polipéptidos individuales, o alternativamente, como una serie de proteínas de fusión mayores (v.g., para presentación de fago) que contienen la serie de secuencias de GBSRP en ellas. Existen una diversidad de métodos que pueden utilizarse para producir genotecas de homólogos potenciales de GBSRP a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerada. La síntesis química de una secuencia de genes degenerada puede realizarse en un sintetizador automático de DNA, y el gen sintético se liga luego a un vector de expresión apropiado. El uso de una serie degenerada de genes permite la provisión, en una mezcla, de todas las secuencias codificantes de la serie deseada de secuencias potenciales de GBSRP. Métodos para la síntesis de oligonucleótidos degenerados se conocen en la técnica (véase, v.g., Narang, S.A., 1983 Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. 1984 Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al. 1984 Science 198: 1056; Ike et al. 1983 Nucleic Acid Res. 11: 477).

Adicionalmente, pueden utilizarse genotecas de fragmentos de las regiones codificantes de GSBRP para generar una población diversificada de fragmentos de GBSRP para escrutinio y selección subsiguiente de homólogos de una GBSRP. En una realización, puede generarse una genoteca de fragmentos de secuencia codificantes por tratamiento de un fragmento PCR bicatenario de una secuencia codificante de GBSRP con una nucleasa en condiciones en las cuales se produce mellado sólo aproximadamente una vez por molécula, desnaturalización del DNA bicatenario, renaturalización del DNA para formar DNA bicatenario, que puede incluir pares sentido/antisentido de productos mellados diferentes, eliminación de porciones monocatenarias de los dúplex reformados por tratamiento con nucleasa S1, y ligación de la genoteca de fragmentos resultante en un vector de expresión. Por este método, puede derivarse una genoteca de expresión que codifica fragmentos N-terminales, C-terminales e internos de diversos tamaños de la GBSRP.

Se conocen en la técnica varios métodos para escrutar productos génicos de genotecas combinatorias producidas por mutaciones puntuales o truncación, y para el escrutinio de genotecas de cDNA para productos génicos que tengan una propiedad seleccionada. Dichas técnicas son adaptables para escrutinio rápido de las genotecas de genes generadas por la mutagénesis combinatoria de homólogos de GBSRP. Las técnicas utilizadas más ampliamente, que son susceptibles de análisis de alta capacidad, para escrutinio de grandes genotecas de genes incluyen típicamente clonación de la genoteca de genes en vectores de expresión replicables, transformación de células apropiadas con la genoteca de vectores resultante, y expresión de los genes combinatorios en condiciones en las cuales la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó. La mutagénesis recursiva de conjunto (REM), una nueva técnica que mejora la frecuencia de mutantes funcionales en las genotecas, puede utilizarse en combinación con los ensayos de escrutinio para identificar homólogos de GBSRP (Arkin y Youvan, 1992 PNAS 89: 7811-7815; Delgrave et al. 1993 Protein Engineering 6 (3): 327-331). En otra realización, pueden aprovecharse ensayos basados en células para analizar una genoteca de GBSRP diversificada, utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Se proporciona un método de identificación de una nueva GBSRP, que comprende (a) generar una respuesta específica de anticuerpos para una GBSRP, o un fragmento de la misma, como se describe en esta memoria; (b) escrutar material supuesto de GBSRP con el anticuerpo, en donde la fijación específica del anticuerpo al material indica la presencia de una GBSRP potencialmente nueva; y (c) analizar el material fijado en comparación con GBSRP conocidas, para determinar su novedad.

A fin de determinar el porcentaje de homología de dos secuencias de aminoácidos (v.g., la secuencia de SEQ ID NO: 11 y una forma mutante de la misma), se alinean las secuencias para propósitos de comparación óptima (v.g., pueden introducirse lagunas en la secuencia de una proteína o ácido nucleico para alineación óptima con la otra proteína o ácido nucleico). Se comparan luego los residuos de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos correspondientes. Cuando una posición en una secuencia (v.g., la secuencia de SEQ ID NO: 11) está ocupada por el mismo residuo de aminoácido que la posición correspondiente en la otra secuencia (v.g., una forma mutante de la secuencia seleccionada del polipéptido de SEQ ID NO: 11) entonces las moléculas son homólogas en dicha posición (es decir, tal como se utiliza en esta memoria, "homología" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a "identidad" de aminoácido o ácido nucleico). El mismo tipo de comparación puede hacerse entre dos secuencias de ácido nucleico.

El porcentaje de homología entre las dos secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % homología = números de posiciones idénticas/números totales de posiciones x 100). Las secuencias de aminoácidos incluidas en la presente invención son homólogas al menos en un 95%, y preferiblemente al menos en 96%, 97%, 98%, 99% o más a una secuencia completa de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 11. En otra realización adicional, al menos 95%, y preferiblemente al menos 96%, 97%, 98%, 99% o más, homólogas a una secuencia entera de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico representada en SEQ ID NO: 6.

En otras realizaciones, la longitud preferible de comparación de secuencias para proteínas es al menos 15 residuos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 25 residuos de aminoácidos, y muy preferiblemente al menos 35 residuos de aminoácidos.

En otra realización, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 95%, y preferiblemente al menos 96%, 97%, 98%, 99% o más homóloga a una secuencia de nucleótidos representada en SEQ ID NO: 6, o una porción de la misma. La longitud preferible de la comparación de secuencias para ácidos nucleicos de la invención es la longitud total de la región codificante.

Asimismo, es preferible que la molécula de ácido nucleico homóloga codifique una proteína o porción de la misma que incluye una secuencia de aminoácidos que es suficientemente homóloga a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, tal que la proteína o porción de la misma mantenga la misma función o una función similar que la secuencia de aminoácidos con la que se compara. Las funciones de las secuencias de aminoácidos de GBSRP de la presente invención incluyen la capacidad para participar en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta, o más particularmente, para participar en la transcripción de una proteína implicada en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta de Physcomitrella patens. Ejemplos de tales actividades se describen en la Tabla 1.

Además de los métodos arriba descritos, puede realizarse una determinación del porcentaje de homología entre dos secuencias utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido y no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877). Un algoritmo de este tipo está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410).

Las búsqueda de los ácidos nucleicos BLAST puede realizarse con el programa NBLAST, registro = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de ácido nucleico homólogas a las moléculas de ácido nucleico GBSRP de la invención. Adicionalmente, pueden realizarse búsquedas de proteínas BLAST con el programa XBLAST, registro = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las GBSRPs de la presente invención. Para obtener alineaciones con lagunas para propósitos de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Cuando se utilizan los programas BLAST Y Gapped BLAST, pueden utilizarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (v.g., XBLAST y NBLAST). Otro ejemplo no limitante preferido de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (CABIOS 1989). Dicho algoritmo está incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) que forma parte del paquete de soporte lógico de alineación de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparación de secuencias de aminoácidos, puede utilizarse una tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad por longitud de laguna de 12 y una penalidad por laguna de 4 a fin de obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las GBSRPs de la presente invención. Para obtener alineaciones con lagunas para propósitos de comparación, puede utilizarse GAPPED BLAST como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden utilizarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (v.g., XBLAST y NBLAST). Otro ejemplo no limitante preferido de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (CABIOS 1989). Dicho algoritmo está incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) que forma parte del paquete de soporte lógico de alineación de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparación de secuencias de aminoácidos, puede utilizarse una tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad por longitud de laguna de 12 y una penalidad por laguna de 4.

Finalmente, la homología entre secuencias de amino-ácidos puede determinarse también utilizando métodos de hibridación conocidos por los expertos en la técnica. De acuerdo con ello, una molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida, v.g., se hibrida en condiciones severas, a una de las secuencias de nucleótidos que se muestran en SEQ ID No.: 6 o una porción de la misma. Más particularmente, una molécula de ácido nucleico aislada tiene al menos 15 nucleótidos de longitud y se hibrida en condiciones severas a la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 6.

En otras realizaciones, el ácido nucleico tiene una longitud de al menos 30, 50, 100, 250, o más nucleótidos.

Como se utiliza en esta memoria, la expresión "se hibrida en condiciones severas" tiene por objeto describir condiciones para hibridación y lavado en las cuales las secuencias de nucleótidos que son al menos homólogas en un 60% una a otra se mantienen típicamente hibridadas una a otra. Preferiblemente, las condiciones son tales que secuencias de al menos aproximadamente 65%, de modo más preferible al menos aproximadamente 70%, y de modo todavía más preferible al menos aproximadamente 75% o más homólogas una a otra, se mantienen por lo general hibridadas mutuamente. Tales condiciones severas son conocidas por los expertos en la técnica y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, 6.3.1-6.3.6, John Wiley & Sons, N.Y. (1989). Un ejemplo preferido, no limitante de condiciones de hibridación severas es la hibridación en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguida por uno o más lavados en 0,2 X SSC, 0,1% SDS a 50-65ºC. Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico aislada que se hibrida en condiciones severas a una secuencia de SEQ ID NO: 6 corresponde a una molécula de ácido nucleico existente naturalmente. Tal como se utiliza en esta memoria, una molécula de ácido nucleico "existente naturalmente" hace referencia a una molécula de RNA o DNA que tiene una secuencia de nucleótidos que existe en la naturaleza (v.g., que codifica una proteína natural). En una realización, el ácido nucleico codifica una GBSRP de Physcomitrella patens existente naturalmente.

Utilizando los métodos arriba descritos, y otros conocidos por los expertos en la técnica, una persona con experiencia ordinaria en la técnica puede aislar homólogos de las GBSRPs que comprenden secuencias de aminoácidos que se muestran en SEQ ID NO: 11.

Un subconjunto de estos homólogos está constituido por variantes alélicas. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "variante alélica" hace referencia a una secuencia de nucleótidos que contiene polimorfismos que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de una GBSRP y que existen en una población natural (v.g., una especie o variedad de planta). Tales variaciones alélicas naturales pueden dar como resultado típicamente una varianza de 1-5% en un ácido nucleico de GBSRP. Las variantes alélicas pueden identificarse por secuenciación de la secuencia de ácido nucleico de interés en cierto número de plantas diferentes, lo cual puede realizarse fácilmente utilizando sondas de hibridación para identificar el mismo locus genético de GBSRP en dichas plantas. Cualquiera y la totalidad de dichas variaciones de ácido nucleico y polimorfismos o variaciones de aminoácidos resultantes en una GBSRP que son el resultado de la variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional de una GBSRP, debe entenderse que están comprendidas dentro del alcance de la invención.

Se contemplan adicionalmente moléculas de ácido nucleico que codifican GBSRPs de la misma u otra especie tales como análogos, ortólogos y parálogos de GBSRP,. Tal como se utiliza en esta memoria, el término "análogos" hace referencia a dos ácidos nucleicos que tienen la misma o similar función, pero que han evolucionado por separado en organismos no afines. Tal como se utiliza en esta memoria, el término "ortólogos" hace referencia a dos ácidos nucleicos de especies diferentes, pero que han evolucionado a partir de un gen ancestral común por especiación. Normalmente, los ortólogos codifican proteínas que tienen la misma o similares funciones. Como se utiliza también en esta memoria, el término "parálogos" hace referencia a dos ácidos nucleicos que están relacionados por duplicación en un mismo genoma. Los parálogos tienen usualmente funciones diferentes, pero estas funciones pueden ser afines (Tatusov, R.L. et al. 1997 Science 278 (5338): 631-637). Análogos, ortólogos y parálogos de una GBSRP existente naturalmente pueden diferir de la GBSRP existente naturalmente por modificaciones posteriores a la traducción, por diferencias en la secuencia de amino-ácidos o por ambas cosas. Modificaciones posteriores a la traducción incluyen derivatización química in vivo e in Vitro de polipéptidos, v.g., acetilación, carboxilación, fosforilación, o glicosilación, y dichas modificaciones pueden ocurrir durante la síntesis o el procesamiento de polipéptidos o después del tratamiento con enzimas modificantes aisladas. En particular, los ortólogos exhibirán por lo general al menos 95%, 96%, 97%, 98% o incluso 99% de identidad u homología con la totalidad o parte de una secuencia de aminoácidos de GBSRP existente naturalmente, y exhibirán una función similar a una GBSRP. Los ortólogos son también preferiblemente capaces de participar en la respuesta al estrés en las plantas. En una realización, los ortólogos de GBSRP mantienen la capacidad para participar en el metabolismo de compuestos necesarios para la construcción de membranas celulares en Physcomitrella patens, o en el transporte de moléculas a través de estas membranas.

Además de variantes existentes naturalmente de una secuencia de GBSRP que pueden existir en la población, el profesional experto apreciará adicionalmente que pueden introducirse cambios por mutación en una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 6, conduciendo con ello a cambios en la secuencia de aminoácidos de la GBSRP codificada, sin alterar la capacidad funcional de la GBSRP. Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos "no esenciales" en una secuencia de SEQ ID NO: 6.

Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede alterarse con respecto a la secuencia de tipo salvaje de una de las GBSRPs sin alterar la actividad de dicha GBSRP, mientras que un residuo de aminoácido "esencial" se requiere para la actividad de la GBSRP. Otros residuos de aminoácidos, sin embargo, (v.g., aquéllos que no están conservados o están sólo semi-conservados en el dominio que tiene actividad de GSBRP) pueden no ser esenciales para la actividad y por consiguiente es probable que sean susceptibles de alteración sin alterar la actividad de la GBSRP.

De acuerdo con ello, otro aspecto se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican GBSRPs que contienen cambios en residuos de aminoácidos que no son esencialmente para la actividad de la GBSRP. Tales GBSRPs difieren en secuencia de aminoácidos de una secuencia contenida en SEQ ID NO: 11, pero retienen al menos una de las actividades de GBSRP descritas en esta memoria. En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína, en donde la proteína comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de homología con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111.

Preferiblemente, la proteína codificada por la molécula de ácido nucleico tiene una homología de al menos 96%, 97%, 98%, o 99% respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 11.

Los homólogos de GBSRP preferidos son preferiblemente capaces de participar en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta, o más particularmente, participar en la transcripción de una proteína implicada en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta de Physcomitrella patens, o tienen una o más actividades expuestas en la Tabla 1.

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un homólogo de GBSRP para una secuencia proteínica de SEQ ID NO: 11 puede crearse por introducción de una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en una secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 6 tal que se introducen una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos en la proteína codificada. Pueden introducirse mutaciones en la secuencia de SEQ ID NO: 6 por técnicas estándar, tales como mutagénesis orientada y mutagénesis mediada por PCR. Preferiblemente, se efectúan sustituciones conservadoras de aminoácidos en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales predichos. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es una en la cual el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar.

Familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (v.g., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (v.g., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares desprovistas de carga (v.g., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (v.g., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas en posición beta (v.g., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (v.g., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Así, un residuo de aminoácido no esencial predicho en una GBSRP se reemplaza preferiblemente con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. Alternativamente, en otra realización, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de una secuencia codificante de GBSRP, por ejemplo por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden escrutarse respecto a una actividad de GBSRP descrita en esta memoria a fin de identificar mutantes que retienen la actividad de GBSRP. Después de la mutagénesis de las secuencias de SEQ ID NO: 6, la proteína codificada puede expresarse recombinantemente y la actividad de la proteína puede determinarse por análisis de la tolerancia al estrés de una planta que expresa la proteína que se describe en el Ejemplo 7.

Además de las moléculas de ácido nucleico que codifican las GBSRPs descritas anteriormente, otro aspecto se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que son antisentido respecto a aquéllas. Un ácido nucleico "antisentido" comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido nucleico "sentido" que codifica una proteína, v.g., complementaria a la cadena codificante de una molécula de cDNA bicatenaria o complementaria a una secuencia de mRNA. De acuerdo con ello, un ácido nucleico antisentido puede estar unido por hidrógeno a un ácido nucleico sentido. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una cadena codificante entera de GBSRP; o sólo a una porción de la misma. En una realización, una molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido respecto a una "región codificante" de la cadena codificante de la cadena codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica una GBSRP. La expresión "región codificante" hace referencia a la región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones que se traducen en residuos de aminoácidos (v.g., la región codificante entera de ,,,,, comprende los nucleótidos 1 a ....). En otra realización, la molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido respecto a una "región no codificante" de la cadena codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica una GBSRP. La expresión "región no codificante" se refiere a secuencias 5' y 3' que flanquean la región codificante que no se traducen en aminoácidos (es decir, a las que se hace referencia también como regiones 5' y 3' no traducidas).

En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada comprende una molécula de ácido nucleico que es un complemento de la secuencia de nucleótidos representada en SEQ ID NO: 6, o una porción de la misma. Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a una de las secuencias de nucleótidos que se muestran en SEQ ID NO: 6 es una que es suficientemente complementaria a la secuencia de nucleótidos representada en SEQ ID NO: 6 tal que la misma puede hibridarse a la secuencia de nucleótidos representada en SEQ ID NO: 6, formando con ello un dúplex estable.

Dadas las secuencias de la cadena codificante que codifican las GBSRPs descritas en esta memoria (v.g., la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 6) pueden diseñarse ácidos nucleicos antisentido de la invención de acuerdo con las reglas de apareamiento de bases de Watson y Crick. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria a la región codificante entera de mRNA de GBSRP, pero más preferiblemente es un oligonucleótido que es antisentido respecto a solamente una porción de la región codificante o no codificante de RNA de GBSRP. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario a la región que circunda el sitio de comienzo de la traducción de mRNA de GBSRP. Un oligonucleótido antisentido puede tener, por ejemplo, una longitud de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nucleótidos.

Un ácido nucleico antisentido puede construirse utilizando reacciones de síntesis química y de ligación enzimática que emplean procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (v.g. un oligonucleótido antisentido) puede sintetizarse químicamente utilizando nucleótidos existentes naturalmente o nucleótidos modificados diversamente, diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y de sentido, v.g., pueden utilizarse derivados fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Ejemplos de nucleótidos modificados que pueden utilizarse para generar el ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)-uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxi-propil)-uracilo, (acp3)w, y 2,6-diaminopurina. Alternativamente, el ácido nucleico antisentido puede producirse biológicamente utilizando un vector de expresión en el cual un ácido nucleico ha sido subclonado en una orientación antisentido (es decir, el RNA transcrito a partir del ácido nucleico insertado tendrá una orientación antisentido respecto a un ácido nucleico diana de interés, descrito ulteriormente en la subsección que sigue).

Las moléculas de ácido nucleico antisentido se administran típicamente a una célula o se generan in situ de tal manera que las mismas se hibridan con o se fijan a mRNA celular y/o DNA genómico que codifica una GBSRP para inhibir con ello la expresión de la proteína, v.g., por inhibición de la transcripción y/o la traducción. La hibridación puede realizarse por complementariedad convencional de nucleótidos para formar un dúplex estable, o, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico antisentido que se fija a dúplex de DNA, por interacciones específicas en la hendidura mayor de la doble hélice. La molécula antisentido puede modificarse de tal manera que la misma se fije específicamente a un receptor o un antígeno expresado en una superficie seleccionada de la célula, v.g., por enlace de la molécula de ácido nucleico antisentido a un péptido o un anticuerpo que se fija a un receptor o antígeno de la superficie celular. La molécula de ácido nucleico antisentido puede suministrarse también a células utilizando los vectores descritos en esta memoria. Para alcanzar concentraciones intracelulares suficientes de las moléculas antisentido, se prefieren constructos de vectores en los cuales la molécula de ácido nucleico antisentido está dispuesta bajo el control de un promotor procariota, viral, o eucariota (con inclusión de plantas)
fuerte.

En otra realización adicional, la molécula de ácido nucleico antisentido es una molécula de ácido nucleico alfa-anomérica. Una molécula de ácido nucleico alfa-anomérica forma híbridos bicatenarios específicos con RNA complementario en los cuales, contrariamente a las unidades \beta usuales, las cadenas avanzar paralelas una a otra (Gaultier et al. 1987 Nucleic Acids. Res. 15: 6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisentido puede comprender también un 2'-o-metilribonucleótido (Inoue et al. 1987 Nucleic Acids Res. 15: 6131-6148) o un análogo quimérico RNA-DNA (Inoue et al. 1987, FEBS Lett. 215: 327-330).

En otra realización adicional, un ácido nucleico antisentido es una ribozima. Las ribozimas son moléculas catalíticas de RNA con actividad de ribonucleasa que son capaces de escindir un ácido nucleico monocatenario, tal como un mRNA, para el cual tienen las mismas una región complementaria. Así, pueden utilizarse ribozimas (v.g., las ribozimas de cabeza de martillo descritas en Haselhoff y Gerlach, 1988 Nature 334: 585-591) para escindir catalíticamente transcritos de mRNA de GBSRP a fin de inhibir con ello la traducción de mRNA de GBSRP. Una ribozima que tiene especificidad para un ácido nucleico codificante de GBSRP puede diseñarse basándose en la secuencia de nucleótidos de un cDNA de GBSRP, como se describe en esta memoria (es decir, SEQ ID NO: 6) o sobre la base de una secuencia heteróloga a aislar de acuerdo con los métodos propuestos en esta invención. Por ejemplo, puede construirse un derivado de un RNA de IVS de Tetrahymena L-19 en el cual la secuencia de nucleótidos del sitio activo es complementaria a la secuencia de nucleótidos a escindir en un mRNA codificante de GBSRP. Véase, v.g., Cech et al. Patente U.S. No. 4.987.071 y Cech et al. Patente U.S. No. 5.116.742. Alternativamente, puede utilizarse mRNA de GBSRP para seleccionar un RNA catalítico que tenga una actividad específica de ribonucleasa a partir de una agrupación de moléculas de RNA. Véase, v.g., Bartel, D. y Szostak, J.W., 1993 Science 261: 1411-1418.

Alternativamente, la expresión de los genes de GBSRP puede inhibirse por direccionamiento de secuencias de nucleótidos complementarias a la región reguladora de una secuencia nucleotídica de GBSRP (v.g., un promotor y/o intensificador de GBSRP) para formar estructura de triple hélice que impiden la transcripción de un gen de GBSRP en las células diana. Véase en líneas generales, Helene, C., 1991 Anticancer Drug Des. 6(6): 569-84; Helene C. et al. 1992 Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 27-36; y Maher, L.J., 1992 Bioassays 14(12): 807-15.

Además de los ácidos nucleicos de GBSRP y proteínas arriba descritos, la presente invención abarca estos ácidos nucleicos y proteínas unidos a un resto. Estos restos incluyen, pero sin carácter limitante, restos de detección, restos de hibridación, restos de purificación, restos de suministro, restos de reacción, restos de fijación, y análogos. Un grupo típico de ácidos nucleicos unidos a un resto incluye sondas e iniciadores. Las sondas y los iniciadores comprenden típicamente una región de secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones severas a al menos 12, con preferencia aproximadamente 25, con más preferencia aproximadamente 40, 50 ó 75 nucleótidos consecutivos de una cadena sentido de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 6, una secuencia anti-sentido de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 6, o mutantes de la misma existentes naturalmente. Iniciadores basados en una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 6 pueden utilizarse en reacciones PCR para clonar homólogos de GBSRP. Las sondas basadas en las secuencias de nucleótidos de GBSRP pueden utilizarse para detectar transcritos o secuencias genómicas que codifican la misma proteína o proteínas homólogas. En realizaciones preferidas, la sonda comprende adicionalmente un grupo marcador unido a ella; el grupo marcador puede ser v.g. un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un co-factor enzimático. Dichas sondas pueden utilizarse como una parte de un kit de ensayo de marcadores genómicos para identificar células que expresan una GBSRP, por ejemplo por medida de un nivel de un ácido nucleico codificante de GBSRP, en una muestra de células, v.g., detección de niveles de mRNA de GBSRP o determinación de si un gen de GBSRP genómico ha sido mutado o delecionado.

En particular, un método útil para averiguar el nivel de transcripción del gen (un indicador de la cantidad de mRNA disponible para la traducción del producto génico) consiste en realizar una transferencia Northern (para referencia véase, por ejemplo, Ausubel et al. 1988 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: Nueva York). Esta información demuestra al menos parcialmente el grado de transcripción del gen transformado. Puede prepararse RNA celular total a partir de células, tejidos u órganos por varios métodos, todos ellos bien conocidos en la técnica, tales como el descrito en Bormann, E.R. et al. 1992 Mol. Microbiol. 6: 317-326. Para evaluar la presencia o la cantidad relativa de proteína traducida a partir de este mRNA, pueden emplearse técnicas estándar, tales como una transferencia Western. Estos métodos son bien conocidos por una persona con experiencia ordinaria en la técnica. (Véase, por ejemplo, Ausubel et al. 1988 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: Nueva York).

La invención proporciona adicionalmente un vector de expresión recombinante aislado que comprende un ácido nucleico de GBSRP, como se ha descrito arriba, en donde la expresión del vector en una célula hospedadora da como resultado la tolerancia incrementada de la célula hospedadora al estrés por sequía y/o el estrés por helada en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula hospedadora. Como se utiliza en esta memoria, el término "vector" hace referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", término que hace referencia a un bucle circular de DNA bicatenario al cual pueden estar ligados segmentos de DNA adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el cual segmentos adicionales de DNA pueden ligarse al genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedadora en la cual se han introducido (v.g., vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (v.g., vectores no episómicos de mamífero) se integran en el genoma de una célula hospedadora después de introducción en la célula hospedadora, y con ello se replican junto con el genoma del hospedador. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están enlazados operativamente. En esta memoria se hace referencia a vectores de este tipo como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de DNA recombinante se encuentran a menudo en la forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse intercambiablemente dado que el plásmido es la forma de vector más corrientemente utilizada. Sin embargo, la invención tiene por objeto incluir otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (v.g., retrovirus deficientes en replicación, adenovirus y virus adeno-asociados), que desempeñan funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas sobre la base de las células hospedadoras a utilizar para la expresión, que está enlazada operativamente a la secuencia de ácido nucleico a expresar. En un vector de expresión recombinante, la expresión "enlazado operativamente" tiene por objeto significar que la secuencia de nucleótidos de interés está enlazada a la o las secuencias reguladoras de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (v.g., en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedadora cuando el vector se introduce en la célula hospedadora). La expresión "secuencia reguladora" tiene por objeto incluir promotores, intensificadores y otros elementos de control de la expresión (v.g., señales de poliadenilación). Secuencias reguladoras de este tipo se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) o véase: Gruber y Crosby, en: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, compiladores Glick y Thompson, capítulo 7, 89-108, CRC Press: Boca Raton, Florida, con inclusión de las referencias que aparecen en dicho lugar. Secuencias reguladoras incluyen aquéllas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospedadoras y aquéllas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solamente en ciertas células hospedadoras o en ciertas condiciones. Será apreciado por los expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a transformar, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en células hospedadoras para producir con ello proteínas o péptidos, con inclusión de proteínas o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describe en esta memoria (v.g., GBSRPs, formas mutantes de GBSRPs, proteínas de fusión, etc.).

Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden diseñarse para expresión de GBSRPs en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, los genes GBSRP pueden expresarse en células bacterianas tales como C. glutamicum, células de insecto (utilizando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura y otras células fúngicas (véase Romanos, M.A. et al. 1992, Foreign gene expression in yeast: a review, Yeast 8: 423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J. et al. 1991 Heterologous gene expression in filamentous fungi, en: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, compiladores, p. 396-428: Academic Press: San Diego; y van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J., 1991, Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, en: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al. compiladores, p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), algas (Falciatore et al. 1999 Marine Biotechnology 1(3): 239-251), ciliados de los tipos: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Pseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella, y Stylonychia, especialmente del género Stylonychia lemnae con vectores siguiendo un método de transformación como el descrito en WO 98/01572 y células de plantas multicelulares (véase Schmidt, R. and Willmitzer, L., 1988 High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants, Plant Cell Rep. 583-586); Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, chapter 6/7, S. 71-119 (1993); F.F. White, B.Jenes et al. Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. Kung und R. Wu, 128-43, Academic Press: 1993; Potrykus, 1991 Annu. Rev. Plant Physiol. Molec. Biol. 42:205-225 y las referencias citadas en dichos lugares) o células de mamífero. Células hospedadoras adecuadas se exponen adicionalmente en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press: San Diego, CA (1990). Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, utilizando por ejemplo secuencias reguladoras del promotor T7 y la polimerasa T7.

La expresión de proteínas en procariotas se realiza en muchos casos con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas sean de fusión o no lo sean. Los vectores de fusión añaden cierto número de aminoácidos a una proteína codificada en ellos, usualmente al término amino de la proteína recombinante, pero también al término C, o se fusionan dentro de regiones adecuadas en las proteínas. Tales vectores de fusión desempeñan típicamente tres finalidades: 1) aumentar la expresión de una proteína recombinante; 2) aumentar la solubilidad de una proteína recombinante; y 3) ayudar a la purificación de una proteína recombinante por actuar como un ligando en la purificación por afinidad. A menudo, en los vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítico en la unión del resto de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante del resto de fusión subsiguientemente a la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento cognadas, incluyen Factor Xa, trombina y enteroquinasa.

Vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. y Johnson, K.S., 1988 Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan glutation-S-transferasa (GST), proteína E de fijación de maltosa, o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante diana. En una realización, la secuencia codificante de la GBSRP se somete a clonación en un vector de expresión pGEX para crear un vector que codifica una proteína de fusión que comprende, desde el término N al término C GST-sitio de escisión de trombina-proteína X. La proteína de fusión puede purificarse por cromatografía de afinidad utilizando resina glutatión-agarosa. La GBSRP recombinante no fusionada a GST puede recuperarse por escisión de la proteína de fusión con trombina.

Ejemplos de vectores de expresión de E. coli inducibles y adecuados que no son de fusión incluyen pTrc (Amann et al. 1988 Gene 69:301-315) y pET 11b (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). La expresión de genes diana por el vector pTrc está basada en la transcripción por la RNA-polimerasa del hospedador a partir de un promotor de fusión trp-lac híbrido. La expresión de genes diana por el vector pET 11d está basada en la transcripción a partir de un promotor de fusión gn10-lac T7 mediado por una RNA-polimerasa viral co-expresada (T7 gn1). Esta polimerasa viral es suministrada por cepas hospedadoras BL21(DE3) o HMS174(DE3) a partir de un profago \lambda residente que aloja un gen T7 gn1 bajo el control de transcripción del promotor lacUV 5.

Una estrategia para maximizar la expresión de proteínas recombinantes consiste en expresar la proteína en una bacteria hospedadora que tiene una capacidad deteriorada para escindir proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128). Otra estrategia consiste en alterar la secuencia del ácido nucleico a insertar en un vector de expresión de tal manera que los codones individuales para cada aminoácido sean los utilizados preferentemente en la bacteria seleccionada para expresión, tal como C. glutamicum (Wada et al. 1992 Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Dicha alteración de secuencias de ácido nucleico de la invención puede realizarse por técnicas estándar de síntesis de DNA.

En otra realización, el vector de expresión de GBSRP es un vector de expresión de levadura. Ejemplos de vectores para expresión en la levadura S. cerevisiae incluyen pYepSec1 (Baldari, et al. 1987 Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, 1982 Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. 1987 Gene 54:113-123), y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vectores y métodos para la construcción de vectores apropiados para uso en otros hongos, tales como los hongos filamentosos, incluyen los detallados en: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi", en: Applied Molecular Genetics of fungi, J.F. Peberdy, et al. compiladores, p. 1-28 Cambridge University Press: Cambridge.

Alternativamente, las GBSRPs de la invención pueden expresarse en células de insecto utilizando vectores de expresión de baculovirus. Vectores de expresión de baculovirus disponibles para expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (v.g., células Sf9) incluyen la serie pAc (Smith et al. 1983 Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers, 1989 Virology 170:31-39).

En otra realización adicional, un ácido nucleico de GBSRP de la invención se expresa en células de mamífero utilizando un vector de expresión de mamífero. Ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed, B, 1987 Nature 329-840) y pMT2PC (Kaufman et al. 1987 EMBO J. 6:187-195). Cuando se utilizan en células de mamífero, las funciones de control del vector están proporcionadas a menudo por elementos reguladores virales. Por ejemplo, promotores utilizados comúnmente se derivan de polioma, Adenovirus 2, Citomegalovirus y el Virus 40 de los Simios. Para otros sistemas de expresión adecuados para células tanto procariotas como eucariotas, véanse los capítulos 16 y 17 de Sambrook, J. Fritsch, E.F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

En otra realización, el vector de expresión recombinante de mamífero es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo de célula particular (v.g., se utilizan elementos reguladores específicos de tejidos para expresar el ácido nucleico). Elementos reguladores específicos de tejidos se conocen la técnica. Ejemplos no limitantes de promotores específicos de tejidos adecuados incluyen el promotor albúmina (específico de hígado; Pinkert et al. 1987 Genes Dev. 1:268-277), promotores específicos linfoides (Calame y Eaton, 1988 Adv. Immunol. 43:235-275), en particular promotores de receptores de las células T (Winoto y Baltimore, 1989 EMBO J. 8:729-733) e inmunoglobulinas (Banerji et al. 1983 Cell 33:729-740; Queen y Baltimore, 1983 Cell 33:741-748), promotores específicos de neuronas (v.g., el promotor de neurofilamentos; Byrne y Ruddle, 1989 PNAS 86:5473-5477), promotores específicos de páncreas (Edlund et al. 1985 Science 230:912-916), y promotores específicos de glándula mamaria (v.g., el promotor de lactosuero; patente U.S. No. 4.873.316 y la Publicación de Solicitud de Patente Europea No. 264.166). Están comprendidos también promotores regulados por desarrollo, por ejemplo, los promotores hox murinos (Kessel y Gruss, 1990 Science, 249:374-379) y el promotor de fetoproteína (Campes y Tilghman, 1989 Genes Dev. 3:537-546).

En otra realización, las GBSRPs de la invención pueden expresarse en células de plantas unicelulares (tales como algas) (véase Falciatore et al. 1999 Marine Biotechnology 1 (3):239-251 y las referencias citadas en dicho lugar) y células de plantas procedentes de plantas superiores (v.g., las espermatofitas, tales como plantas de cosecha). Ejemplos de vectores de expresión de plantas incluyen los detallados en; Becker, D., Kemper, E., Schell, J. y Masterson, R., 1992 New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; y Bevan, M.W., 1984 Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en: Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, compiladores: Kung y R. Wu, Academic Press, 1993; p. 15-38.

Una casete de expresión de plantas contiene preferiblemente secuencias reguladoras capaces de impulsar la expresión génica en células de plantas y enlazadas operativamente de tal manera que cada secuencia puede desempeñar su función, por ejemplo, la terminación de la transcripción por señales de poliadenilación. Señales de poliadenilación preferidas son las originarias de t-DNA de Agrobacterium tumefaciens tales como el gen 3 conocidos como octopina-sintasa del plásmido Ti pTiACH5 (Gielen et al. 1984 EMBO J. 3:835) o equivalentes funcionales de los mismos, pero también son adecuados cualesquiera otros terminadores funcionalmente activos en plantas.

Dado que la expresión de genes de plantas no está limitada en muchos casos a niveles de transcripción, una casete de expresión de plantas contiene preferiblemente otras secuencias enlazadas operativamente tales como intensificadores de la traducción, tales como la secuencia superestimulante que contiene la secuencia conductora no traducida 5' del virus del mosaico del tabaco, que mejora la relación de proteína por RNA (Gallie et al. 1987 Nucl. Acids Research 15:8693-8711).

La expresión de genes de plantas debe enlazarse operativamente a un promotor apropiado que confiere la expresión de los genes de una manera oportuna, específica de la célula o del tejido. Se prefieren promotores que impulsan expresión constitutiva (Benfey et al. 1989 EMBO J. 8:2195-2202) como los derivados de virus de plantas tales como el CAMV 35S (Franck et al. 1980 Cell 21:285-294), el CaMV 19S (véase también la patente U.S. No. 5352605 y la solicitud PCT No. WO 8402913) o promotores de plantas como los de la subunidad pequeña Rubisco descrita en la patente U.S. No. 4.962.018.

Otras secuencias preferidas para uso en casetes de expresión de genes de plantas son secuencias de direccionamiento necesarias para dirigir el producto génico a su compartimiento celular apropiado (para revisión, véase Kermode, 1996 Crit. Rev. Plant Sci. 15(4):285-423 y las referencias citadas en dicho lugar) tales como la vacuola, el núcleo, todos los tipos de plástidos tales como amiloplastos, cloroplastos, cromoplastos, el espacio extracelular, la mitocondria, el retículo endoplasmático, los cuerpos de aceite, peroxisomas y otros compartimientos de las células de las plantas.

La expresión de genes de plantas puede ser facilitada también por un promotor inducible (véase Gatz, 1997 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Biol. 48:89-108). Promotores químicamente inducibles son especialmente adecuados si se desea que ocurra la expresión génica de una manera específica en el tiempo. Ejemplos de tales promotores son un promotor inducible por ácido salicílico (Solicitud PCT No. WO 95/19443), un promotor inducible por tetraciclina (Gatz et al. 1992 Plant J. 2:397-404) y un promotor inducible por etanol (Solicitud PCT No. WO 93/21334).

Asimismo, promotores adecuados que responden a condiciones de estrés biótico o abiótico son aquéllos tales como el promotor del gen PRP1 inducible por patógenos (Ward et al. 1993 Plant Mol. Biol. 22:371-366), el promotor hsp80 del tomate inducible por calor (Patente U.S. No. 5187267), el promotor alfa-amilasa de la patata inducible por frío (Solicitud PCT No. WO 96/12814) o el promotor pinII inducible por lesiones (Patente Europea No. 375091). Para otros ejemplos de promotores inducibles por sequía, frío y sal, tales como el promotor RD29A, véase Yamaguchi-Shinozalei et al. (1993 Mol. Gen. Genet. 236:331-340).

Se prefieren especialmente aquellos promotores que confieren expresión génica en tejidos y órganos específicos, tales como células de guarda y las células de los pelos radicales. Promotores adecuados incluyen el promotor del gen napin de la colza (Patente U.S. No. 5.608.152), el promotor USP de Vicia Faba (Baeumlein et al. 1991 Mol. Gen Genet. 225(3):459-67), el promotor oleosina de Arabidopsis (Solicitud PCT No. WO 98/45461), el promotor faseolina de Phaseolus vulgaris (Patente U.S. No. 5504200), el promotor Bce4 de Brassica (Solicitud PCT No. WO 91/13980) o el promotor B4 de legumina (LeB4; Baeumlein et al. 1992 Plant Journal, 2(2):233-9) así como promotores que confieren expresión específica de semillas en plantas monocotiledóneas tales como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz, etc. Promotores adecuados que deben indicarse son el promotor del gen 1pt2 o 1pt1 de la cebada (Solicitud PCT No. WO 95/15389 y la Solicitud PCT No. WO 95/23230) o los descritos en la Solicitud PCT No. WO 99/16890 (promotores del gen hordeína de la cebada, el gen glutelina del arroz, el gen oricina del arroz, el gen prolamina del arroz, el gen gliadina del trigo, el gen glutelina del trigo, el gen zeína del maíz, el gen glutelina de la avena, el gen kasirina del sorgo y el gen secalina del centeno).

Son también especialmente adecuados promotores que confieren expresión de genes específicos de plástidos, dado que los plástidos son el compartimiento en el que tiene lugar la biosíntesis de los lípidos. Promotores adecuados son el promotor de RNA-polimerasa viral descrito en la Solicitud PCT No. WO 95/16783 y la Solicitud PCT No. WO 97/06250 y el promotor clpP de Arabidopsis descrito en la Solicitud PCT No. WO 99/43394.

Puede proporcionarse un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de DNA de GBSRP de la invención clonado en el vector de expresión en una orientación antisentido. Es decir, la molécula de DNA se enlaza operativamente a una secuencia reguladora de una manera que permita la expresión (por transcripción de la molécula de DNA) de una molécula de RNA que es antisentido para un mRNA de GBSRP. Pueden seleccionarse secuencias reguladoras enlazadas operativamente a una molécula de ácido nucleico clonada en la orientación antisentido que dirigen la expresión continua de la molécula de RNA antisentido en una diversidad de tipos de células. Por ejemplo, pueden seleccionarse promotores y/o intensificadores virales, o secuencias reguladoras que dirigen la expresión constitutiva, específica de tejido o específica del tipo de células de RNA antisentido. El vector de expresión antisentido puede encontrarse en la forma de un plásmido, fagémido recombinante o virus atenuado en el cual los ácidos nucleicos antisentido se producen bajo el control de una región reguladora de alta eficiencia. La actividad de la región reguladora puede estar determinada por el tipo de célula en el que se introduce el vector. Para una discusión de la regulación de la expresión génica utilizando genes antisentido véase Weintraub, H. et al. Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986 y Mol et al. 1990 FEBS Letters 268:427-
430).

Otro aspecto de la invención se refiere a células hospedadoras en las cuales se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Las expresiones "célula hospedadora" y "célula hospedadora recombinante" se utilizan intercambiablemente en esta memoria. Debe entenderse que dichas expresiones se refieren no sólo a la célula objeto particular sino que se aplican también a la progenie o progenie potencial de dicha célula. Dado que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutación o a influencias ambientales, dicha progenie puede de hecho no ser idéntica a la célula originaria, pero se incluyen todavía dentro del alcance de la expresión tal como se utiliza en esta memoria.

Una célula hospedadora puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, una GBSRP puede expresarse en células bacterianas tales como C. glutamicum, células de insecto, células fúngicas o células de mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS), algas, ciliados, células de plantas, hongos u otros microorganismos como C. glutamicum. Otras células hospedadoras adecuadas son conocidas por los expertos en la técnica.

Puede introducirse DNA vector en células procariotas o eucariotas por técnicas convencionales de transformación o transfección. Tal como se utilizan en esta memoria, los términos "transformación", "transfección", "conjugación" y "transducción" tienen por objeto hacer referencia a una diversidad de métodos reconocidos en la técnica para la introducción de ácido nucleico extraño (v.g., DNA) en una célula hospedadora, con inclusión de co-precipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, competencia natural, transferencia mediada por productos químicos y electroporación. Métodos adecuados para transformación o transfección de células hospedadoras, con inclusión de células de plantas pueden encontrarse en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) y otros manuales de laboratorio tales como Methods in Molecular Biology, 1995, vol. 44, Agrobacterium protocols, compiladores: Gartland y Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey. Dado que la tolerancia al estrés biótico o abiótico es un rasgo general que se desea conferir por herencia a una diversidad de plantas tales como maíz, trigo, centeno, avena, trigo híbrido, arroz, cebada, soja, cacahuete, algodón, colza y canola, mandioca, pimiento, girasol y tagetes, plantas solanáceas tales como patata, tabaco, berenjena y tomate, especies de Vicia, guisante, alfalfa, plantas arbustivas (café, cacao, té), especies de Sálix, árboles (palma de aceite, cocotero), céspedes perennes y cosechas forrajeras, estas plantas de cosecha son también plantas diana preferidas para la ingeniería genética como una realización adicional de la presente invención.

En particular, la invención proporciona un método de producción de una planta transgénica con un ácido nucleico codificante de GBSRP como se ha descrito arriba, en donde la expresión del o de los ácidos nucleicos en la planta da como resultado una tolerancia incrementada al estrés por sequía y/o helada en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta, que comprende: (a) transformar una célula de planta con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de GBSRP como se ha descrito arriba, y (b) generar a partir de la célula de la planta una planta transgénica con una tolerancia incrementada al estrés por sequía y/o estrés por helada en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta. La invención abarca también un método de aumentar la expresión de un gen de interés en una célula hospedadora en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula hospedadora, en donde el gen de interés se transcribe en respuesta a una GBSRP, que comprende: (a) transformar la célula hospedadora con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico codificante de GBSRP como se ha descrito arriba, y (b) expresar la GBSRP en la célula hospedadora, incrementando con ello la expresión del gen transcrito en respuesta a la GBSRP, en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula hospedadora.

Para dicha transformación de plantas, pueden utilizarse vectores binarios tales como pBinAR (Höfgen y Willmitzer, 1990 Plant Science 66:221-230). La construcción de los vectores binarios puede realizarse por ligación del cDNA en orientación de sentido o antisentido en el T-DNA. En la posición 5-prima respecto al cDNA un promotor de planta activa la transcripción del cDNA. Una secuencia de poliadenilación está localizada en posición 3-prima respecto al cDNA. La expresión específica de tejido puede lograrse utilizando un promotor específico de tejido. Por ejemplo, la expresión específica de semilla puede conseguirse por clonación del promotor napin o LeB4 o USP en posición 5-prima respecto al cDNA. Asimismo, puede utilizarse cualquier otro elemento promotor específico de semilla. Para expresión constitutiva en la planta entera, puede utilizarse el promotor 35S de CaMV. La proteína expresada puede estar direccionada a un compartimiento celular utilizando péptido señal, por ejemplo para plástidos, mitocondria o retículo endoplasmático (Kermode, 1996 (Crit. Rev. Plant Sci. 4(15):285-423). El péptido señal se somete a clonación en posición 5-prima en marco respecto al cDNA para conseguir la localización subcelular de la proteína de fusión. Adicionalmente, pueden utilizarse promotores que son sensibles a estados de estrés abiótico, tales como el promotor RD29A de Arabidopsis, con las secuencias de ácido nucleico descritas en esta memoria. Un experto en la técnica reconocerá que el promotor utilizado debería estar enlazado operativamente al ácido nucleico de tal modo que el promotor cause la transcripción del ácido nucleico, que da como resultado la síntesis de un mRNA que codifica un polipéptido. Alternativamente, el RNA puede ser un RNA antisentido para uso en producir la expresión subsiguiente del mismo u otro gen o genes.

Métodos alternativos de transfección incluyen la transferencia directa de DNA en flores en desarrollo por electroporación o transferencia génica mediada por Agrobacterium. La transformación de plantas mediadas por Agrobacterium puede realizarse utilizando por ejemplo la cepa GV3101 (pMP90) (Koncz y Schell, 1996 Mol. Gen. Genet. 204:383-396) o LBA4404 (Clontech) de Agrobacterium tumefaciens. La transformación puede realizarse por técnicas estándar de transformación y regeneración (Deblaere et al. 1994 Nucl. Acids. Res. 13:4777-4788; Gelvin, Stanton B. y Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2ª Edición - Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. - in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11- P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R.; Thompson John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993. - 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Por ejemplo, la colza puede transformarse por transformación del cotiledón o el hipocótilo (Moloney et al. 1989 Plant Cell Report 8:238-242; De Block et al. 1989 Plant Physiol. 91:694-701). El uso de antibióticos para la selección de Agrobacterium y plantas depende del vector binario y de la cepa de Agrobacterium utilizada para la transformación. La selección de colza se realiza normalmente utilizando kanamicina como marcador de plantas seleccionable. La transferencia de genes mediada por Agrobacterium al lino puede realizarse utilizando, por ejemplo, una técnica descrita por Mlynarova et al. 1994 Plant Cell Report 13:282-285. Adicionalmente, la transformación de la soja puede realizarse utilizando por ejemplo una técnica descrita en la Patente Europea No. 0424 047, la Patente U.S. No. 5.322.783, la Patente Europea No. 0397 687, la Patente U.S. No. 5.376.543 o la Patente U.S. No. 5.169.770. La transformación del maíz puede realizarse por bombardeo con partículas, absorción del DNA mediada por polietilen-glicol o por la técnica de las fibras de carburo de silicio. (Véase, por ejemplo, Freeling y Walbot "The maize handbook", Springer Verlag: Nueva York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Un ejemplo específico de transformación del maíz se encuentra en la Patente U.S. No. 5.990.387 y un ejemplo específico de transformación del trigo puede encontrarse en la Solicitud PCT No. WO 93/07256.

Para la transfección estable de células de mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y de la técnica de transfección utilizada, solamente una pequeña fracción de células puede integrar el DNA extraño en su genoma. A fin de identificar y seleccionar estos integrantes, se introduce generalmente un gen que codifica un marcador seleccionable (v.g., resistencia a antibióticos) en las células hospedadoras junto con el gen de interés. Marcadores seleccionables preferidos incluyen aquéllos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato o en plantas que confieren resistencia hacia un herbicida tal como glifosato o glufosinato. Las moléculas de ácido nucleico que codifican un marcador seleccionable pueden introducirse en una célula hospedadora en el mismo vector que el que codifica una GBSRP o pueden introducirse en un vector separado. Las células transfectadas de manera estable con la molécula de ácido nucleico introducida pueden identificarse, por ejemplo, mediante selección de fármacos (v.g., las células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán).

Para crear un microorganismo recombinante homólogo, se prepara un vector que contiene al menos una porción de un gen de GBSRP en el cual se ha introducido una deleción, adición o sustitución para alterar con ello, v.g., desorganizar funcionalmente, el gen de GBSRP. Preferiblemente, el gen de GBSRP es un gen GBSRP de Physcomitrella patens, pero puede ser un homólogo de una planta afín o incluso de una fuente de mamífero, levadura, o insecto. En una realización preferida, el vector está diseñado de tal manera que, por recombinación homóloga, el gen de GBSRP endógeno se rompe funcionalmente (es decir, ya no codifica una proteína funcional; a esto se hace referencia también como un vector puesto fuera de combate ("knock-out")). Alternativamente, el vector puede diseñarse de tal manera que, después de la recombinación homóloga, el gen GBSRP endógeno resulta mutado o alterado de cualquier otro modo pero codifica todavía una proteína funcional (v.g., la región reguladora de aguas arriba puede estar alterada alterando con ello la expresión de la GBSRP endógena). Para crear una mutación puntual por recombinación homóloga, pueden utilizarse híbridos DNA-RNA en una técnica conocida como quimeraplastia (Cole-Strauss et al. 1999 Nucleic Acids Research 27(5): 1323-1330 y Kmiec, 1999 Gene therapy american Scientist 87(3):240-247). Los procedimientos de recombinación homóloga en Physcomitrella patens son también bien conocidos en la técnica y se contemplan para uso en esta invención.

Por lo que respecta al vector de recombinación homóloga, la porción alterada del gen GBSRP está flanqueada en los extremos 5' y 3' por una molécula de ácido nucleico adicional del gen GBSRP que permite que ocurra la recombinación homóloga entre el gen GBSRP exógeno transportado por el vector y un gen de GBSRP endógeno, en un microorganismo o planta. La molécula de ácido nucleico de GBSRP flanqueante adicional tiene una longitud suficiente para la recombinación homóloga exitosa con el gen endógeno. Típicamente, se incluyen en el vector varios centenares de pares de bases hasta kilobases de DNA flanqueante (en ambos extremos 5' y 3') (véase, v.g., Thomas, K. R., y Capecchi, M.R., 1987 Cell 51:503 para una descripción de vectores de recombinación homóloga o Strepp et al. 1998 PNAS, 95(8):4368-4373 para recombinación basada en cDNA en Physcomitrella patens). El vector se introduce en un microorganismo o célula de planta (v.g., por DNA mediado por polietilen-glicol), y las células en las cuales el gen de GBSRP introducido se ha recombinado homólogamente con el gen GBSRP endógeno se seleccionan utilizando métodos conocidos en la técnica.

En otra realización, puede producirse microorganismos recombinantes que contienen sistemas seleccionados que permiten la expresión regulada del gen introducido. Por ejemplo, la inclusión de un gen de GBSRP en un vector poniéndolo bajo control del operón lac permite la expresión del gen GBSRP únicamente en presencia de IPTG. Tales sistemas reguladores son bien conocidos en la técnica.

Una célula hospedadora de la invención, tal como una célula hospedadora procariota o eucariota en cultivo, puede utilizarse para producir (es decir, expresar) una GBSRP. De acuerdo con ello, la invención proporciona adicionalmente métodos para producir GBSRPs utilizando las células hospedadoras de la invención. En una realización, el método comprende cultivar la célula hospedadora de la invención (en la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica una GBSRP, o en cuyo genoma se ha introducido un gen que codifica una GBSRP de tipo salvaje o alterada) en un medio adecuado hasta que se produce la GBSRP. En otra realización, el método comprende adicionalmente aislar GBSRPs del medio o la célula hospedadora.

Otro aspecto de la invención se refiere a GBSRPs aisladas como se ha descrito arriba y porciones biológicamente activas de las mismas. Una proteína "aislada" o "purificada" o porción biológicamente activa de la misma está exenta de algo del material celular cuando se produce por técnicas de DNA recombinante, o precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. La expresión "sustancialmente exenta de material celular" incluye preparaciones de GBSRP en las cuales la proteína está separada de algunos de los componentes celulares de las células en las que se produce la misma natural o recombinantemente. En una realización, la expresión "sustancialmente exenta de material celular" incluye preparaciones de una GBSRP que tienen menos de aproximadamente 30% (expresado en peso seco) de material distinto de GBSRP (a lo que se hace referencia también en esta memoria como "proteína contaminante"), de modo más preferible menos de aproximadamente 20% de material distinto de GBSRP, de modo todavía más preferible menos de aproximadamente 10% de material distinto de GBSRP, y de modo muy preferible menos de aproximadamente 5% de material distinto de GBSRP.

Cuando la GBSRP o la porción biológicamente activa de la misma se produce recombinantemente, la misma está también de modo preferible sustancialmente exenta de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, de modo más preferible menos de aproximadamente 10%, y de modo muy preferible menos de aproximadamente 5% del volumen de la preparación de proteína. La expresión "sustancialmente exenta de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones de GBSRP en las cuales la proteína está separada de precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. En una realización, la expresión "sustancialmente exenta de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones de una GBSRP que tienen menos de aproximadamente 30% (expresado en peso seco) de precursores químicos o productos químicos distintos de GBSRP, de modo más preferible menos de aproximadamente 20% de precursores químicos o productos químicos distintos de GBSRP, de modo todavía más preferible menos de aproximadamente 10% de precursores químicos o productos químicos distintos de GBSRP, y de modo muy preferible menos de aproximadamente 5% de precursores químicos o productos químicos distintos de GBSRP. En realizaciones preferidas, proteínas aisladas, o porciones biológicamente activas de las mismas, carecen de proteínas contaminantes del mismo organismo del que se deriva la GBSRP. Típicamente, tales proteínas se producen por expresión recombinante de, por ejemplo, una GBSRP de Physcomitrella patens en plantas distintas de Physcomitrella patens o microorganismos tales como C. glutamicum, ciliados, algas u hongos.

Las moléculas de ácido nucleico, proteínas, homólogos de proteínas, proteínas de fusión, iniciadores, vectores, y células hospedadoras descritas en esta memoria pueden utilizarse en uno o más de los métodos siguientes: identificación de Physcomitrella patens y organismos afines; mapeado de genomas de organismos afines a Physcomitrella patens; identificación y localización de secuencias de interés de Physcomitrella patens; estudios de evolución; determinación de regiones de GBSRP requeridas para función; modulación de una actividad de GBSRP; modulación del metabolismo de una o más funciones celulares; modulación del transporte transmembranal de uno o más compuestos; y modulación de la resistencia al estrés.

El musgo Physcomitrella patens representa un miembro de los musgos. El mismo es afín a otros musgos tales como Ceratodon purpureus que es capaz de crecer en ausencia de luz. Musgos tales como Ceratodon y Physcomitrella comparten un alto grado de homología en la secuencia de DNA y el nivel de polipéptidos permitiendo el uso de escrutinio heterólogo de moléculas de DNA con sondas procedentes de otros musgos u organismos, permitiendo así la derivación de una secuencia de consenso adecuada para escrutinio heterólogo o anotación funcional y predicción de funciones de genes en terceras especies. La posibilidad de identificar tales funciones puede tener por tanto importancia significativa, v.g. la predicción de especificidad de sustrato de enzimas. Adicionalmente, estas moléculas de ácido nucleico
puede servir como puntos de referencia para el mapeado de genomas de musgos, o de genomas de organismos afines.

Las moléculas de ácido nucleico de GBSRP de la invención tienen una diversidad de usos. Es muy importante que el ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos de la presente invención pueden utilizarse para transformar plantas, induciendo con ello tolerancia a estados de estrés tales como sequía y frío. La presente invención proporciona por tanto una planta transgénica transformada por un ácido nucleico de GBSRP como se ha descrito arriba, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la planta da como resultado una tolerancia incrementada al estrés por sequía y/o estrés por helada en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta. La planta transgénica puede ser una monocotiledónea o una dicotiledónea. La invención estipula adicionalmente que la planta transgénica puede seleccionarse de maíz, trigo, centeno, avena, trigo híbrido, arroz, cebada, soja, cacahuete, algodón, colza, canola, mandioca, pimiento, girasol, tagetes, plantas solanáceas, patata, tabaco, berenjena, tomate, especies de Vicia, guisante, alfalfa, café, cacao, té, especies de Sálix, palma de aceite, cocotero, céspedes perennes y cosechas forrajeras, por ejemplo.

En particular, la presente invención describe la utilización de la expresión de GBP-1 de Physcomitrella patens para producir por ingeniería genética plantas tolerantes a la sequía y/o tolerantes al frío. Esta estrategia ha sido demostrada en esta memoria para Arabidopsis thaliana, colza/canola, habas de soja, maíz y trigo, pero su aplicación no está restringida a estas plantas. De acuerdo con ello, la invención proporciona una planta transgénica que contiene una GBSRP seleccionada de GBP-1 (SEQ ID NO: 11), en donde el estrés ambiental es sequía o temperatura incrementada.

La presente invención proporciona también métodos de modificación de la tolerancia al estrés, es decir tolerancia a la sequía y/o al frío de una planta, que comprende modificar la expresión de una GBSRP como se describe arriba en la planta.

La invención estipula que este método puede realizarse de tal manera que la tolerancia al estrés se aumenta o se reduce. En particular, la presente invención proporciona métodos de producción de una planta transgénica que tiene una tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta que comprende aumentar la expresión de una GBSRP en una planta.

Pueden utilizarse métodos de aumento de la expresión de GBSRPs en los cuales la planta es transgénica o no transgénica. En los casos en que la planta es transgénica, la planta puede transformarse con un vector que contiene cualquiera de los ácidos nucleicos codificantes de GBSRP arriba descritos, o la planta puede transformarse con un promotor que dirige la expresión de GBSRP nativa en la planta, por ejemplo. La invención estipula que dicho promotor puede ser específico de tejido. Adicionalmente, un promotor de este tipo puede estar regulado por desarrollo. En una alternativa, plantas no transgénicas pueden tener expresión de GBSRP nativa modificada por inducción de un promotor nativo.

La expresión de GBP-1 (SEQ ID NO: 6) en plantas diana puede realizarse por uno de los ejemplos siguientes, aunque sin carácter limitante,: (a) promotor constitutivo, (b) promotor inducible por estrés, (c) promotor inducido por productos químicos, y (d) sobre-expresión de un promotor modificado por ingeniería genética con, por ejemplo, factores de transcripción derivados de dedos de cinc (Greisman y Pabo, 1997 Science 275:657). El último caso implica la identificación de los homólogos de GBP-1 (SEQ ID NO: 11) en la planta diana así como de su promotor. Los factores de transcripción recombinantes que contienen dedos de cinc se modifican por ingeniería genética para interaccionar específicamente con la GBP-1 (SEQ ID NO: 11) homóloga y se activa la transcripción del gen correspon-
diente.

Además de introducir las secuencias de ácido nucleico de GBSRP en plantas transgénicas, estas secuencias pueden utilizarse también para identificar un organismo como Physcomitrella patens o un pariente próximo del mismo. Asimismo, aquéllas pueden utilizarse para identificar la presencia de Physcomitrella patens o un pariente del mismo en una población mixta de microorganismos. La invención proporciona las secuencias de ácido nucleico de varios genes de Physcomitrella patens; por sonda del DNA genómico extraído de un cultivo de una población singular o mixta de microorganismos en condiciones severas con una sonda que abarca una región de un gen de Physcomitrella patens que es exclusivo de este organismo, puede determinarse si está presente este organismo.

Adicionalmente, las moléculas de ácido nucleico y proteína de la invención pueden servir como marcadores para regiones específicas del genoma. Esto tiene utilidad no sólo en el mapeado del genoma, sino también en estudios funcionales de proteínas de Physcomitrella patens. Por ejemplo, para identificar la región del genoma a la que se fija una proteína particular de fijación de DNA de Physcomitrella patens, el genoma de Physcomitrella patens podía digerirse, e incubarse los fragmentos con la proteína de fijación de DNA. Aquellos fragmentos que fijan la proteína pueden sondarse adicionalmente con las moléculas de ácido nucleico de la invención, preferiblemente con marcadores fácilmente detectables. La fijación de una molécula de ácido nucleico de este tipo al fragmento del genoma permite la localización del fragmento al mapa genómico de Physcomitrella patens, y, cuando se realiza múltiples veces con enzimas diferentes, facilita una determinación rápida de la secuencia de ácido nucleico a la que se fija la proteína. Adicionalmente, las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser suficientemente homólogas a las secuencias de especies afines de tal modo que estas moléculas de ácido nucleico pueden servir como marcadores para la construcción de un mapa genómico en musgos afines.

Las moléculas de ácido nucleico de GBSRP de la invención son también útiles para estudios evolutivos y estructurales de proteínas. Los procesos metabólicos y de transporte en los cuales participan las moléculas de la invención son utilizados por una diversidad de células procariotas y eucariotas; por comparación de las secuencias de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención con aquéllas que codifican enzimas similares de otros organismos, puede evaluarse la afinidad evolutiva de los organismos. Análogamente, una comparación de este tipo permite una evaluación de cuáles son las regiones de la secuencia que se conservan y cuáles no, lo que puede ayudar a determinar aquellas regiones de la proteína que son esenciales para el funcionamiento de la enzima. Este tipo de determinación es valioso para estudios de ingeniería de proteínas y puede proporcionar una indicación de lo que puede tolerar la proteína en términos de mutagénesis sin pérdida de función.

La manipulación de las moléculas de ácido nucleico de GBSRP de la invención puede dar como resultado la producción de GBSRPs que tengan diferencias funcionales de las GBSRPs de tipo salvaje. Estas proteínas pueden mejorarse en eficiencia o actividad, pueden estar presentes en mayores números en la célula de lo que es usual, y pueden tener eficiencia o actividad reducidas.

Existen varios mecanismos por los cuales la alteración de una GBSRP de la invención puede afectar directamente a la respuesta al estrés y/o la tolerancia al estrés. En el caso de plantas que expresan GBSRPs, el transporte incrementado puede conducir a un reparto mejorado de sal y/o solutos en el tejido y los órganos de las plantas. Por aumento del número o la actividad de las moléculas transportadoras que exportan moléculas iónicas de la célula, puede ser posible afectar a la tolerancia de la célula a la sal.

El efecto de la modificación genética en plantas, C. glutamicum, hongos, algas, o ciliados sobre la tolerancia al estrés puede evaluarse dejando crecer el microorganismo o la planta modificado(a) en condiciones inferiores a las adecuadas y analizando posteriormente las características de crecimiento y/o metabolismo de la planta. Dichos métodos de análisis son bien conocidos por un experto en la técnica, e incluyen peso seco, peso húmedo, síntesis de proteínas, síntesis de carbohidratos, síntesis de lípidos, tasas de evapotranspiración, rendimiento de la planta en general y/o la cosecha, floración, reproducción, producción de semillas, crecimiento de raíces, tasas de respiración, tasas de fotosíntesis, etc. (Aplicaciones de HPLC en Bioquímica en: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17; Rehm et al. 1993 Biotechnology, vol. 3, capítulo III: Recuperación y purificación de productos, páginas 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. et al. 1988 Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. y Cabral, J.M.S., 1992 Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A. y Henry, J.D., 1988 Biochemical Separations, en: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. B3, capítulo 11, páginas 1-27, VCH: Weinheim; y Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).

Por ejemplo, vectores de expresión de levadura que comprenden los ácidos nucleicos descritos en esta memoria, o fragmentos de los mismos, pueden construirse y transformarse en Saccharomyces cerevisiae utilizando protocolos estándar. Las células transgénicas resultantes pueden ensayarse luego en cuanto a fallo o alteración de su tolerancia al estrés por sequía y temperatura. Análogamente, vectores de expresión de plantas que comprenden los ácidos nucleicos descritos en esta memoria, o fragmentos de los mismos, pueden construirse y transformarse en una célula de planta apropiada tal como Arabidopsis, soja, colza, maíz, trigo, Medicago truncatula, etc., utilizando protocolos estándar. Las células transgénicas y/o plantas resultantes derivadas de ello pueden ensayarse luego en cuanto a fallo o alteración de su tolerancia al estrés por sequía y temperatura.

La modificación por ingeniería genética de uno o más genes de GBSRP de la invención puede dar también como resultado GBSRPs que tienen actividades alteradas que afectan indirectamente a la respuesta al estrés y/o la tolerancia al estrés de algas, plantas, ciliados u hongos u otros microorganismos tales como C. glutamicum. Por ejemplo, los procesos bioquímicos normales del metabolismo dan como resultado la producción de una diversidad de productos (v.g., peróxido de hidrógeno y otras especies oxigenadas reactivas) que pueden interferir activamente con estos mismos procesos metabólicos (por ejemplo, se sabe que el peroxinitrito nitra las cadenas laterales de la tirosina, desactivando con ello algunas enzimas que tienen tirosina en el sitio activo (Groves, J.T., 1999 Curr. Opin. Chem. Biol. 3(2):226-235). Si bien estos productos son excretados típicamente, las células pueden alterarse genéticamente para transportar más productos de lo que es típico para una célula de tipo salvaje. Por optimización de la actividad de una o más GBSRPs de la invención que están involucradas en la exportación de moléculas específicas, tales como moléculas de sal, puede ser posible mejorar la tolerancia de la célula al estrés.

Adicionalmente, las secuencias descritas en esta memoria, o fragmentos de las mismas, pueden utilizarse para generar mutaciones del tipo "knockout" (es decir mutaciones que desactivan un gen determinado) en los genomas de diversos organismos, tales como bacterias, células de mamífero, células de levadura, y células de plantas (Girke, T., 1998 The Plant Journal 15:39-48). Las células "knockout" resultantes pueden evaluarse luego respecto a su aptitud o capacidad para tolerar diversas condiciones de estrés, su respuesta a diversas condiciones de estrés, y el efecto sobre el fenotipo y/o el genotipo de la mutación. Para otros métodos de desactivación de genes véase la Patente U.S. No. 6.004.804 "Non-Chimeric Mutational Vectors" y Puttaraju et al. 1999 Spliceosome-mediated RNA trans-splicing as a tool for gene therapy, Nature Biotechnology 17:246-252.

Las estrategias de mutagénesis mencionadas anteriormente para GBSRPs que dan como resultado resistencia incrementada al estrés no deben considerarse limitantes; variaciones en estas estrategias serán fácilmente evidentes para un experto en la técnica. Utilizando tales estrategias, e incorporando los mecanismos descritos en esta memoria, las moléculas de ácido nucleico y proteínas de la invención pueden utilizarse para generar algas, ciliados, plantas, hongos u otros microorganismos tales como C. glutamicum que expresan moléculas de ácido nucleico y proteínas GBSRP mutadas tales que la tolerancia al estrés se mejora.

Las GBSRPs descritas en esta memoria pueden utilizarse también para generar anticuerpos que se fijan específicamente a una GBSRP, o una porción de la misma, tal como es codificada por un ácido nucleico descrito en esta memoria. Los anticuerpos pueden producirse por muchos métodos bien conocidos (véase, v.g Harlow and Lane, "Antibodies; A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, (1988)). Resumidamente, puede inyectarse antígeno purificado en un animal en una cantidad y en intervalos suficientes para provocar una respuesta inmunitaria. Los anticuerpos pueden purificarse directamente, o pueden obtenerse células del bazo a partir del animal. Las células pueden fusionarse luego con una línea de células inmortales y escrutarse respecto a la secreción de anticuerpos. Los anticuerpos pueden utilizarse para escrutar genotecas de clones de ácido nucleico en cuanto a células secretoras del antígeno. Los clones positivos pueden secuenciarse posteriormente. (Véase, por ejemplo, Kelly et al. 1992 Bio/Technology 10:163-167; Bebbington et al. 1992 Bio/Technology 10:169-175).

Las expresiones "se fija selectivamente" y "se fija específicamente" con el polipéptido hacen referencia a una reacción de fijación que es determinante de la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y otros compuestos biológicos. Así, en condiciones de inmunoensayo diseñadas, los anticuerpos específicos fijados a una proteína particular no se fijan en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. La fijación selectiva de un anticuerpo en tales condiciones puede requerir un anticuerpo que se seleccione por su especificidad para una proteína particular. Pueden utilizarse una diversidad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos que se fijan selectivamente a una proteína particular. Por ejemplo, se utilizan rutinariamente inmunoensayos ELISA en fase sólida para seleccionar anticuerpos que son selectivamente inmunorreactivos con una proteína. Véase Harlow and Lane, "Antibodies; A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, (1988)), para una descripción de formatos y condiciones de inmunoensayo que podrían utilizarse para determinar fijación
selectiva.

En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales a partir de diversos hospedadores. Una descripción de técnicas para preparar tales anticuerpos monoclonales puede encontrarse en Stites et al. compiladores, "Basic and Clinical Immunology" (Lange Medical Publications, Los Altos, Calif., 4ª edición) y las referencias citadas en dicho lugar, y en Harlow and Lane, ("Antibodies; A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, (1988)).

A lo largo de esta solicitud se han citado diversas publicaciones.

Debe entenderse también que lo que antecede hace referencia a realizaciones preferidas de la presente invención. La invención se ilustra adicionalmente por los ejemplos que siguen, que no deben interpretarse en modo alguno como imposición de limitaciones en cuanto al alcance de la misma.

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Ejemplos Ejemplo 1 Crecimiento de cultivos de Physcomitrella patens

Para este estudio se utilizaron plantas de la especie Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. de la colección de la sección de estudios genéticos de la Universidad de Hamburgo. Dichas plantas proceden de la cepa 16/14 recogida por H.L.K. Whitehouse en Gransden Wood, Huntingdonshire (Inglaterra), que fue subcultivada a partir de una espora por Engel (1968, Am. J. Bot. 55, 438-446). La proliferación de las plantas se llevó a cabo por medio de esporas y por medio de regeneración de los gametofitos. El protonema se desarrolló a partir de la espora haploide como un cloronema rico en cloroplastos y caulonema pobre en cloroplastos, sobre el cual se formaron yemas al cabo de aproximadamente 12 días. Éstas crecieron para dar gametóforos que llevaban anteridios y arquegonios. Después de la fertilización, se obtuvo el esporofito diploide con una pequeña seta y la cápsula de esporas, en la cual maduraron las
meiosporas.

El cultivo se llevó a cabo en una cámara climatizada a una temperatura del aire de 25ºC y con una intensidad de luz de 55 micromoles^{-1m2} (luz blanca; tubo fluorescente Philips TL 65W/25) y un cambio luz/oscuridad de 16/8 horas. El musgo se modificó en cultivo líquido utilizando medio de Knop de acuerdo con Reski y Abel (1985, Planta 165: 354-358) o se cultivó en medio sólido de Knop utilizando agar oxoide al 1% (Unipath, Basingstoke, Inglaterra). Los protonemas utilizados para el aislamiento de RNA y DNA se cultivaron en cultivos líquidos aireados. Los protonemas se trituraron cada nueve días y se transfirieron a medio de cultivo fresco.

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Ejemplo 2 Aislamiento de DNA total a partir de las plantas

Los detalles para el aislamiento de DNA total se refieren al tratamiento de un gramo de peso fresco de material de la planta. Los materiales utilizados incluyen los tampones siguientes: tampón CTAB: 2% (p/v) de bromuro de N-cetil-N,N,N-trimetilamonio (CTAB); Tris HCl 100 mM de pH 8,0; NaCl 1,4 M; EDTA 20 mM; tampón de N-laurilsarcosina: 10% (p/v) de N-laurilsarcosina; Tris HCl 100 mM de pH 8,0; EDTA 20 mM.

El material de planta se trituró bajo nitrógeno liquido en un mortero para dar un polvo fino y se transfirió a matraces Eppendorf de 2 ml. El material de planta congelado se cubrió luego con una capa de 1 ml de tampón de descomposición (1 ml de tampón CTAB, 100 \mul de tampón de N-laurilsarcosina, 20 \mul de \beta-mercaptoetanol y 10 \mul de solución de proteinasa K, 10 mg/ml) y se incubó a 60ºC durante una hora con agitación continua mediante sacudidas. El homogeneizado obtenido se distribuyó en dos matraces Eppendorf (de 2 ml) y se extrajo dos veces mediante sacudidas con el mismo volumen de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Para la separación de fases, se llevó a cabo una centrifugación a 8000 x g y a la temperatura ambiente durante 15 minutos en cada caso. El DNA se precipitó luego a -70ºC durante 30 minutos utilizando isopropanol enfriado en hielo. El DNA precipitado se sedimentó a 4ºC y 10.000 g durante 30 minutos y se resuspendió en 180 \mul de tampón TE (Sambrook et al. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6). Para purificación ulterior, el DNA se trató con NaCl (concentración final 1,2 M) y se precipitó de nuevo a -70ºC durante 30 minutos utilizando dos veces el volumen de etanol absoluto. Después de un paso de lavado con etanol al 70%, el DNA se secó y se recogió subsiguientemente en 50 \mul de H_{2}O + RNAsa (concentración final 50 mg/ml). El DNA se disolvió durante una noche a 4ºC y la digestión con RNAsa se llevó a cabo subsiguientemente a 37ºC durante una hora. El almacenamiento del DNA tuvo lugar
a 4ºC.

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Ejemplo 3 Aislamiento de RNA total y RNA poli(A)^{+} y construcción de una genoteca de cDNA de Physcomitrella patens

Para la investigación de los transcritos, se aislaron tanto RNA total como RNA poli(A)^{+}. El RNA total se obtuvo de protonemas de tipo salvaje de 9 días siguiendo el método GTC (Reski et al. 1994, Mol. Gen. Genet., 244:352-359). El RNA poli(A)^{+} se aisló utilizando Dyna Beads® (Dynal, Oslo, Noruega) siguiendo las instrucciones del protocolo de los fabricantes. Después de la determinación de la concentración del RNA o del RNA poli(A)^{+}, se precipitó el RNA por adición de 1/10 volúmenes de acetato de sodio 3 M de pH 4,6 y 2 volúmenes de etanol y se guardó a
-70ºC.

Para la construcción de la genoteca de cDNA, se realizó la síntesis de la primera cadena utilizando transcriptasa inversa del Virus de la Leucemia de los Murinos (Roche, Mannheim, Alemania) e iniciadores oligo-d(T), y la síntesis de la segunda cadena por incubación con DNA-polimerasa I, enzima Klenow y digestión con RNAsaH a 12ºC (2 horas), 16ºC (1 hora) y 22ºC (1 hora). La reacción se paró por incubación a 65ºC (10 minutos) y se transfirió subsiguientemente a hielo. Las moléculas de DNA bicatenario se hicieron romas con DNA-polimerasa T4 (Roche, Mannheim) a 37ºC (30 minutos). Los nucleótidos se separaron por extracción con fenol/cloroformo y columnas centrífugas Sephadex G50. Se ligaron adaptadores EcoRI (Pharmacia, Freiburg, Alemania) a los extremos del cDNA con DNA-ligasa T4 (Roche, 12ºC, durante una noche) y se fosforilaron por incubación con polinucleótido-quinasa (Roche, 37ºC, 30 minutos). Esta mezcla se sometió a separación en un gel de agarosa de punto de fusión bajo. Las moléculas DNA mayores que 300 pares de bases se eluyeron del gel, se extrajeron con fenol, se concentraron en columnas Elutip-D (Schleicher y Schuell, Dassel, Alemania), se ligaron a ramas vectoras y se empaquetaron en fagos lamda ZAPII o fagos lambda ZAP-Express utilizando el kit Gigapack Gold (Stratagene, Ámsterdam, Países Bajos) utilizando material y siguiendo las instrucciones del fabricante.

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Ejemplo 4 Secuenciación y anotación de la función de ESTs de Physcomitrella patens

Se utilizaron genotecas de cDNA como se describe en el Ejemplo 3 para secuenciación de DNA de acuerdo con métodos estándar, y en particular, por el método de terminación de cadenas utilizando el equipo ABI PRISM Big Bye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer, Weiterstadt, Alemania). Se realizó una secuenciación aleatoria subsiguientemente a la recuperación preparativa del plásmido a partir de genotecas de cDNA por escisión en masa in vivo, retransformación, y extensión subsiguiente de DH10B en placas de agar (detalles de material y protocolo de Stratagene, Ámsterdam, Países Bajos). Se preparó DNA plasmídico a partir de cultivos de E. coli desarrollados durante una noche que crecían en medio Caldo Luria que contenía ampicilina (véase Sambrook et al. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) en un robot de preparación de DNA Qiagene (Qiagen, Hilden), de acuerdo con los protocolos del fabricante. Se utilizaron iniciadores de secuenciación con las secuencias de nucleótidos siguientes:

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100

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Las secuencias se procesaron y anotaron utilizando el paquete de soporte lógico EST-MAX proporcionado comercialmente por Bio-Max (Munich, Alemania). El programa incorpora prácticamente todos los métodos bioinformáticos importantes para la caracterización funcional y estructural de secuencias de proteínas. Para referencia, puede consultarse el sitio de la web pedant.mips.biochem.mpg.de. Los algoritmos más importantes incorporados en EST-MAX son: FASTA: Búsquedas de bases de datos de secuencias muy sensibles con estimaciones de significación estadística; Pearson W.R. (1990) Comparación de secuencias rápida y sensible con FASTP y FASTA. Methods Enzymol. 183:63-98; BLAST: Búsquedas de bases de datos de secuencias muy sensibles con estimaciones de significación estadística. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., and Lipman D.J. Herramienta de búsqueda de alineación local básica. Journal of Molecular Biology 215:403-10; PREDATOR: Predicción de la estructura secundaria de alta exactitud de secuencias simples y múltiples. Frishman, D. and Argos, P. (1997) 75% de exactitud en la predicción de la estructura secundaria de proteínas. Proteins, 27:329-335; CLUSTALW: Alineación de secuencias múltiples. Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994) CLUSTAL W: Mejora de la sensibilidad de la alineación de secuencias progresivas múltiples por ponderación de secuencia, penalidades por laguna específicas de las posiciones y elección de la matriz de peso. Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680; TMAP: Predicción de la región transmembranal a partir de secuencias múltiplemente alineadas. Persson, B. and Argos, P. (1994) Predicción de segmentos transmembranales en proteínas utilizando alineaciones de secuencias múltiples. J. Mol. Biol. 237:182-192; ALOM2: Predicción de la región transmembranal de secuencias simples. Klein, P., Kanehisa, M.,and DeLisi, C. Predicción de la función de proteínas a partir de las propiedades de las secuencias: Un análisis discriminado de una base de datos. Biochim. Biophys. Acta 787:221-226 (1984). Versión 2 por Dr. K-Nakai; PROSEARCH: Detección de patrones de secuencia de proteínas PROSITE. Kolakowski L.F. Jr, Leunissen J.A.M., Smith J.E. (1992) ProSearch: búsqueda rápida de secuencias de proteínas con patrones de expresión regular relacionados con la estructura y función de las proteínas. Biotechniques 13, 919-921; BLIMPS: Búsquedas de semejanza contra una base de datos de bloques sin lagunas. J.C. Wallace and Henikoff S., (1992); PATMAT: Un programa de búsqueda y extracción para consultas y bases de datos de secuencia, patrón y bloque, CABIOS 8:249-254. Escrito por Bill Alford.

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Ejemplo 5 Identificación de ORFs de Physcomitrella patens correspondientes a GBP-1 y otras proteínas no abarcadas por la presente invención, a saber GBP-2, GBP-3, GBP-4 y GBP-5

Los cDNAs parciales de Physcomitrella patens (ESTs) que se muestran en la Tabla 1 siguiente se identificaron en el programa de secuenciación de Physcomitrella patens EST utilizando el programa EST-MAX por análisis BLAST. Los Números de Identificación de Secuencia correspondientes a estos ESTs son como sigue: GBP-1 (SEQ ID NO: 1) (abarcada por la presente invención), GBP-2 (SEQ ID NO: 2) (no abarcada por la presente invención), GBP-3 (SEQ ID NO: 3) (no abarcada por la presente invención), GBP-4 (SEQ ID NO: 4) (no abarcada por la presente invención) y GBP-5 (SEQ ID NO: 55) (no abarcada por la presente invención).

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TABLA 1

1

TABLA 2 Grado de identidad y semejanza de aminoácidos de PpGBP-1 y otras proteínas homólogas (se utilizó el programa de comparación Pairwise: penalidad por laguna: 10; penalidad por extensión de laguna: 0,1; matriz de registro: blosum62)

2

Ejemplo 6 Clonación del cDNA de longitud total de Physcomitrella patens codificante de GBP-1 y otras proteínas no abarcadas por la presente invención, a saber GBP-2, GBP-3, GBP-4 y GBP-5

Para aislar PpGBP-2 de longitud total (SEQ ID NO: 7) se realizó una PCR como se describe más adelante bajo Amplificación de Longitud Total utilizando los ESTs originales descritos en el Ejemplo 5 como molde dado que los mismos eran de longitud total (véase la Tabla 3 para los iniciadores). Para aislar los clones codificantes de PpGBP-1 (SEQ ID NO: 6), PpGBP-3 (SEQ ID NO: 8), PpGBP-4 (SEQ ID NO: 9) y PpGBP-5 (SEQ ID NO: 10) de Physcomitrella patens, se crearon genotecas de cDNA con el kit SMART RACE cDNA Amplification (Clontech Laboratories) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizó como molde RNA total aislado como se describe en el Ejemplo 3. Los cultivos se trataron antes del aislamiento del RNA como sigue: Estrés por Sal: 2, 6, 12, 24, 48 h con medio complementado con NaCl 1-M; Estrés por Frío: 4ºC durante los mismos tiempos que para la sal; Estrés por Sequía: los cultivos se incubaron sobre papel de filtro seco durante los mismos tiempos anteriores. El RNA se retiró luego y se utilizó para aislamiento.

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Protocolo 5' RACE

Se utilizaron las secuencias EST PpGBP-1 (SEQ ID NO: 1), PpGBP-3 (SEQ ID NO: 3), PpGBP-4 (SEQ ID NO: 4), PpGBP-5 (SEQ ID NO: 5) identificadas por la búsqueda de bases de datos como se describe en el Ejemplo 5, para diseñar oligos para RACE (véase la Tabla 3). Las secuencias extendidas para estos genes se obtuvieron por realización de la reacción en cadena de la polimerasa Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE PCR) utilizando el kit Adbantage2 PCR (Clontech Laboratories) y el kit de amplificación de cDNA SMART RACE (Clontech Laboratories) empleando un termociclador Biometra T3 siguiendo las instrucciones del fabricante.

Las secuencias obtenidas por las reacciones RACE contenían el extremo 5' de las regiones codificantes de longitud total para PpGBP-1, PpGBP-3, PpGBP-4 y PpGBP-5 y se utilizaron para diseñar oligos para clonación de longitud total de los genes respectivos (véase a continuación bajo "Amplificación de Longitud total").

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Amplificación de Longitud total

Se obtuvieron clones de longitud total correspondientes a PpGBP-2 (SEQ ID NO: 7) realizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con iniciadores específicos de genes (véase la Tabla 3) y el EST original como molde. Las condiciones para la reacción eran condiciones estándar con DNA-polimerasa PWO (Roche). La PCR se realizó de acuerdo con condiciones estándar y con los protocolos del fabricante (Sambrook et al. 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2ª Edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY, termociclador Biometra T3). Los parámetros para la reacción eran: cinco minutos a 94ºC seguidos por cinco ciclos de un minuto a 94ºC, un minuto a 50ºC y 1,5 minutos a 72ºC. Esto fue seguido por 25 ciclos de un minuto a 94ºC, un minuto a 65ºC y 1,5 minutos a 72ºC. Los clones de longitud total para PpGBP-1 (SEQ ID NO: 6), PpGBP-3 (SEQ ID NO: 8), PpGBP-4 (SEQ ID NO: 9), PpGBP-5 (SEQ ID NO: 10) se aislaron por repetición del método RACE pero utilizando los iniciadores específicos de genes que se dan en la Tabla 3.

Los fragmentos amplificados se extrajeron luego del gel de agarosa con un Kit de Extracción de Gel QIAquick (Qiagen) y se ligaron en el vector TOPO pCR 2.1 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los vectores recombinantes se transformaron en células Top10 (Invitrogen) utilizando condiciones estándar (Sambrook et al. 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2ª Edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY). Las células transformadas se seleccionaron en agar LB que contenía 100 \mug/ml de carbenicilina, 0,8 mg de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosido) y 0,8 mg de IPTG (isopropiltio-\beta-D-galactosido) que se había dejado crecer durante una noche a 37ºC. Se seleccionaron las colonias blancas y se utilizaron para inocular 3 ml de LB líquido que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. Se extrajo el DNA plasmídico utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los análisis de los clones subsiguientes y el mapeado de restricción se llevaron a cabo de acuerdo con técnicas estándar de biología molecular (Sambrook et al. 1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2ª Edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY).

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TABLA 3 Esquema e iniciadores utilizados para clonación de clones de longitud total

3

4

Ejemplo 7 Modificación por ingeniería genética de plantas de Arabidopsis tolerantes al estrés por sobrepresión del gen GBP-1 y otros genes no abarcadas por la presente invención, a saber GBP-2, GBP-3, GBP-4 y GBP-5 Construcción del Vector Binario: pBPSSC022

Se digirió el constructo plasmídico pACGH101 con PstI (Roche) y FseI (NEB) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. El fragmento se purificó en gel de agarosa y se extrajo por medio del Kit de Extracción de DNA Qiaex II (Qiagen). Esto dio como resultado un fragmento vector con el promotor Actina 2 de Arabidopsis con intrón interno y el terminador OCS3. Los iniciadores para la amplificación por PCR del gen NPTII se designaron como sigue:

101

El gen NPTII de 0,9 kilobases se amplificó por PCR a partir de DNA del plásmido pCambia 2301 [94ºC 60 s, {94ºC 60 s, 61ºC (-0,1ºC por ciclo) 60 s, 62ºC 2 min} x 25 ciclos, 72ºC 10 min en máquina de Gradiente T Biometra], y se purificó por medio del Kit de Extracción PCR Qiaquick (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El DNA de la PCR se subclonó luego en el vector pCR-BluntII TOPO (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante (constructo NPT-Topo). Estas ligaciones se transformaron en células Top10 (Invitrogen) y se dejaron crecer sobre placas LB con 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina durante una noche a 37ºC. Se utilizaron luego las colonias para inocular 2 ml de medio LB con 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. El DNA plasmídico se recuperó utilizando el kit Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen) y se secuenció en ambas direcciones 5' y 3' utilizando condiciones estándar. El análisis subsiguiente de los datos de secuencia utilizando el soporte lógico VectorNTI reveló la ausencia de errores de la PCR en la secuencia del gen NPTII.

El constructo NPT-Topo se digirió luego con PstI (Roche) y FseI (NEB) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. El fragmento de 0,9 kilobases se purificó en gel de agarosa y se extrajo por medio del Kit de Extracción de DNA Qiaex II (Qiagen). El fragmento de inserción Pst/Fse de NPT-Topo y el fragmento vector Pst/Fse de pACGH101 se ligaron luego uno a otro utilizando DNA-ligasa T4 (Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante. La ligación se transformó luego en células Top10 (Invitrogen) en condiciones estándar, creando el constructo pBPSsc019. Se seleccionaron colonias sobre placas LB con 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. Se utilizaron luego estas colonias para inocular 2 ml de medio LB con 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. Se recuperó el DNA plasmídico utilizando el kit Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

El constructo pBPSSC019 se digirió con KpnI y BsaI (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento se purificó en gel de agarosa y se extrajo luego por medio del Kit de Extracción de DNA Qiaex II (Qiagen) de acuerdo con sus instrucciones, dando como resultado una casete Act-NPT de 3 kilobases, que incluía el promotor Actin2 de Arabidopsis con intrón interno, el gen NPTII y el terminador OCS3.

El vector pBPSJH001 se digirió con SpeI y ApaI (Roche) y se rellenó en los extremos romos con enzima Klenow y dNTPs 0,1 mM (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Esto produjo un fragmento vector de 10,1 kilobases menos la casete de Gentamicina, que se recircularizó por autoligación con DNA-ligasa T4 (Roche), y se transformó en células Top10 (Invitrogen) empleando condiciones estándar. Las células transformadas se seleccionaron en agar LB que contenía 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. Se utilizaron luego colonias para inocular 2 ml de LB líquido que contenía 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. Se extrajo el DNA plasmídico utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El plásmido recircularizado se digirió luego con KpnI (Roche) y se extrajo del gel de agarosa empleando el Kit de Extracción de DNA Qiaex II (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.

La inserción Act-NPT cortada con Kpn y el vector pBPSJH001 recircularizado cortado con Kpn se ligaron luego uno a otro utilizando DNA-ligasa T4 (Roche) y se transformaron en células Top10 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. El constructo resultante, pBPSsc022, contenía ahora el Super Promotor, el gen CUS, el terminador NOS, y la casete Act-NPT. Las células transformadas se seleccionaron en agar LB que contenía 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. Se utilizaron luego colonias para inocular 2 ml de LB líquido que contenía 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron crecer a 37ºC. Se extrajo el DNA plasmídico utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de confirmación del éxito de la ligación por digestiones de restricción, se propagó ulteriormente el DNA del plásmido pBPSsc022 y se recuperó utilizando el kit Plasmid Midiprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Subclonación de GBP-1 y otras proteínas no abarcadas por la presente invención, a saber GBP-2, GBP-3, GBP-4 y GBP-5 en el vector binario

Los fragmentos que contenían los diferentes factores de transcripción de Physcomitrella patens se subclonaron a partir de los vectores PCR2.1 TOPO por doble digestión con enzimas de rescisión (véase la Tabla 4) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento de la subsecuencia se escindió del gel de agarosa con un Kit de Extracción de Gel QIAquick (QIAgen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se ligó a los vectores binarios pBPSsc022, se escindió con las enzimas apropiadas (véase Tabla 4) y se desfosforiló antes de la ligación. El pBPSsc022 recombinante resultante contenía el ácido nucleico de la proteína fijadora de GTP correspondiente en la orientación de sentido bajo el super-promotor constitutivo.

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TABLA 4 Se indican los nombres de los diversos constructos de los factores de transcripción de Physcomitrella patens utilizados para la transformación de plantas

6

* = no abarcada por la presente invención

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Transformación en Agrobacterium

Los vectores recombinantes se transformaron en Agrobacterium tumefaciens C58C1 y PMP90 de acuerdo con condiciones estándar (Hoefgen y Willmitzer, 1990).

Transformación de plantas

Se cultivaron y transformaron Arabidopsis thaliana ecotipo C24 de acuerdo con condiciones estándar (Bechtold 1993, Acad. Sci. París. 316:1194-1199; Bent et al. 1994, Science 265:1856-1860).

Escrutinio de las Plantas Transformadas

Se utilizaron semillas T1 de acuerdo con protocolos estándar (Xiong et al. 1999, Plant Molecular Biology Reporter 17:159-170). Se extendieron las semillas sobre medio ½ Murashige y Skoog (MS) (Sigma-Aldrich) de pH 5,7 con KOH, 0,6% de agar y se complementaron con 1% de sacarosa, 0,5 g/l de ácido 2-[N-morfolino]etanosulfónico (MES) (Sigma-Aldrich), 50 \mug/ml de kanamicina (Sigma-Aldrich), 500 \mug/ml de carbenicilina (Sigma-Aldrich) y 2 \mug/ml de benomil (Sigma-Aldrich). Las semillas en las placas se vernalizaron durante 4 días a 4ºC. Las semillas se dejaron germinar en una cámara climatizada a una temperatura del aire de 22ºC y con intensidad luminosa de 40 micromoles^{-1m2} (luz blanca); tubo fluorescente Philips TL 65W/25) con 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad como ciclo de longitud diurna. Las plantas de semillero transformadas se seleccionaron al cabo de 14 días y se transfirieron a medio ½ MS de pH 5,7 con placas de agar KOH al 0,6% complementadas con 0,6% de agar, 1% de sacarosa, 0,5 g/l de MES (Sigma-Aldrich), y 2 \mug/ml de benomil (Sigma-Aldrich) y se dejaron recuperar durante 5-7 días.

Escrutinio de Tolerancia a la Sequía

Se transfirieron plantas de semillero T1 a papel de filtro estéril seco en una cápsula Petri y se dejaron desecar durante 2 horas a 80% RH (humedad relativa) en un equipo Percival Growth CU3615, micromoles^{-1m2} (luz blanca; tubo fluorescente Philips TL 65W/25). Se redujo luego la RH a 60% y se desecaron ulteriormente las plantas de semillero durante 8 horas. Las plantas de semillero se retiraron luego y se pusieron sobre placas de agar ½ MS 0,6% complementadas con 2 \mug/ml de benomil (Sigma-Aldrich) y 0,5 g/l de MES (Sigma-Aldrich) y se evaluaron después de 5 días.

En condiciones de estrés por sequía, las plantas de Arabidopsis thaliana que sobreexpresaban PpGBP-1 exhibían una tasa de supervivencia de 45% (9 supervivientes de 20 plantas estresadas) al escrutinio de estrés; PpGBP-2, 84% (76 supervivientes de 90 plantas estresadas); PpGBP-3, 44% (4 supervivientes de 9 plantas estresadas); PpGBP-4, 82% (97 supervivientes de 116 plantas estresadas); en tanto que el control no transformado tenía una tasa de supervivencia de 28% (16 supervivientes de 57 plantas estresadas) (véase Tabla 5). Es digno de mención que los análisis de estas líneas transgénicas se realizaron con plantas T1, y por consiguiente los resultados serán mejores cuando se encuentre un expresante homocigótico fuerte.

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TABLA 5 Sumario de los ensayos de estrés por sequía

7

* = no abarcado por la presente invención

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Escrutinio de Tolerancia a la Helada

Se transportaron plantas de semillero a cápsulas Petri que contenían 1/2 MS 0,6% agar complementado con 2% de sacarosa y 2 \mug/ml de benomil. Después de 4 días, las plantas de semillero se incubaron a 4ºC durante una hora y se cubrieron luego con hielo machacado. Las plantas de semillero se pusieron luego en una Cámara Ambiental Environmental Specialist ES2000 y se incubaron durante 3,5 horas comenzando a -1,0ºC y descendiendo -1ºC/hora. Las plantas de semillero se incubaron luego a -5,0ºC durante 24 horas y se dejaron descongelar luego a 5ºC durante 12 horas. El agua se retiró por vertido y las plantas de semillero se registraron al cabo de 5 días.

En condiciones de estrés por helada, las plantas de Arabidopsis thaliana que sobreexpresaban PpGBP-1 exhibían una tasa de supervivencia de 60% (15 supervivientes de 25 plantas estresadas) al escrutinio de estrés; PpGBP-2, 75% (44 supervivientes de 59 plantas estresadas); PpGBP-3, 80% (8 supervivientes de 10 plantas estresadas); PpGBP-4 87% (34 supervivientes de 39 plantas estresadas); PpGBP-5 75% (6 supervivientes de 8 plantas estresadas); mientras que el control no transformado exhibía una tasa de supervivencia de 28% (16 supervivientes de 57 plantas estresadas) (véase la Tabla 6). Es digno de mención que los análisis de estas líneas transgénicas se realizaron con plantas T1, y por consiguiente, los resultados serán mejores cuando se encuentre un expresante homocigótico
fuerte.

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TABLA 6 Sumario de los ensayos de estrés por helada

8

9

* = no abarcado por la presente invención

Ensayo de Tolerancia a la Sal

Se transfirieron plantas de semillero a papel de filtro impregnado en 1/2 MS y se pusieron sobre agar al 0,6% 1/2 MS complementado con 2 \mug/ml de benomil la noche anterior al escrutinio de tolerancia a la sal. Para el escrutinio de tolerancia a la sal, el papel de filtro con las plantas de semillero se desplazó a pilas de papel de filtro estéril, impregnado en NaCl 50 mM, en una cápsula Petri. Después de 2 horas, el papel de filtro con las plantas de semillero se movió a pilas de papel de filtro estéril, impregnado con NaCl 200 mM, en una cápsula Petri. Después de 2 horas, el papel de filtro con las plantas de semillero se movió a pilas de papel de filtro estéril, impregnadas en NaCl 600 mM, en una cápsula Petri. Después de 10 horas, las plantas de semillero se movieron a cápsulas Petri que contenían 0,6% de agar 1/2 MS complementado con 2 \mug/ml de benomil. Las plantas de semillero se evaluaron después de 5 días.

Las plantas transgénicas se escrutan respecto a su tolerancia mejorada a la sal, demostrando que la expresión del transgén confiere tolerancia a la sal.

Ejemplo 8 Detección del transgén GBP-1 y de los transgenes GBP-2, GBP-3, GBP-4, GBP-5 (no abarcados por la presente invención) en las líneas transgénicas de Arabidopsis

Una hoja de una planta de tipo salvaje y una planta transgénica de Arabidopsis se homogeneizó en 250 \mul de tampón de bromuro de hexadeciltrimetil-amonio (CTAB) (2% CTAB, NaCl 1,4 M, EDTA 8 mM y Tris 20 mM de pH 8,0) y 1 \mul de \beta-mercaptoetanol. Las muestras se incubaron a 60-65ºC durante 30 minutos y se añadieron luego 250 \mul de cloroformo a cada muestra. Las muestras se agitaron enérgicamente durante 3 minutos y se centrifugaron durante 5 minutos durante 18.000 x g. Se retiró el sobrenadante de cada muestra y se añadieron 150 \mul de isopropanol. Las muestras se incubaron a la temperatura ambiente durante 15 minutos, y se centrifugaron durante 10 minutos a 18.000 x g. Cada pelet se lavó con etanol a 70%, se secó, y se resuspendió en 20 \mul de TE. Se utilizaron 4 \mul de la suspensión anterior en una reacción PCR de 20 \mul utilizando DNA-polimerasa Taq (Roche Molecular Biochemicals) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El plásmido del vector binario con cada gen clonado en el mismo se utilizó como control positivo, y como control negativo se utilizó DNA genómico C24 de tipo salvaje en las reacciones PCR. La reacción PCR de 10 \mul se analizó en gel de agarosa/bromuro de etidio al 0,8%. El programa PCR utilizado fue como sigue: 30 ciclos de un minuto a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 4 minutos a 70ºC, seguido por 10 minutos a 72ºC.

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El iniciador 5' era como sigue:

: 5'GCTGACACGCCAAGCCTCGCTAGTC3' (SEQ ID NO: 35). Los iniciadores específicos del gen y el tamaño de las bandas amplificadas (Tamaño del Producto Génico) se indican a continuación:

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PpGBP-1:

: Iniciador: RC587: GCGTTAACTCGTCGCTCTTAAACACCGAGCTAAG

: Producto génico: 700 pb (SEQ ID NO: 36).

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PpGBP-2: (no abarcado por la presente invención)

: Iniciador: RC404: GCGAGCTCGAGGCACTAATCAGAGAACGCCGTA

: Producto Génico: 1000 pb (SEQ ID N0:37)

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PpGBP-3: (no abarcado por la presente invención)

: Iniciador: RC498: GCGAGCTCGACCCTGGCATTTCCCATCGCAGCAA

: Producto Génico: 700 pb (SEO ID N0:38)

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PpGBP-4: (no abarcado por la presente invención)

: Iniciador: RC569: GCGAGCTCCTGGGAGTTGAGGGCTTGGATGTAA

: Producto Génico: 2100 pb (SEQ ID N0:39)

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PpGBP-5: (no abarcado por la presente invención)

: Iniciador RC647:GCGAGCTCGCAACTGGCGTACTTATTAACACTA

: Producto Génico: 900 pb (SEQ ID N0:40)

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Los transgenes se amplificaron con éxito a partir de las líneas transgénicas T1, pero no del tipo salvaje C24. Este resultado indica que las plantas transgénicas T1 contienen al menos una copia de los transgenes. No había indicación alguna de existencia de genes idénticos o muy similares en el control de Arabidopsis thaliana sin transformar que pudo amplificarse por este método.

Ejemplo 9 Detección del mRNA del transgén GBP-1 y los mRNAs de los transgenes GBP-2, GBP-3, GBP-4, GBP-5 (no abarcados por la presente invención) en líneas transgénicas de Arabidopsis

La expresión del transgén se detectó utilizando RT-PCR. Se aisló el RNA total a partir de plantas tratadas por estrés utilizando un procedimiento adaptado (de Verwoerd et al. 1989 NAR 17:2362). Se recogieron muestras de hojas (50-100 mg) y se trituraron a un polvo fino en nitrógeno líquido. Se resuspendió el tejido triturado en 500 \mul de una mezcla 1:1 a 80ºC de fenol a tampón de extracción (LiCl 100 mM, Tris 100 mM de pH 8, EDTA 10 mM, SDS al 1%), seguido por agitación enérgica breve para mezclar. Después de la adición de 250 \mul de cloroformo, se agitó brevemente cada muestra con intensidad. Se centrifugaron luego las muestras durante 5 minutos a 12.000 x g. La fase acuosa superior se llevó a un tubo Eppendorf nuevo. Se precipitó el RNA por adición de una décima parte de su volumen de acetato de sodio 3 M y dos volúmenes de etanol de 95%. Se mezclaron las muestras por inversión y se dejaron en hielo durante 30 minutos. El RNA se redujo a un sedimento por centrifugación a 12.000 x g durante 10 minutos. Se retiró el sobrenadante y los pelets se secaron brevemente al aire. Los pelets de las muestras de RNA se resuspendieron en 10 \mul de agua tratada con DEPC. Para eliminar el DNA contaminante de las muestras, se trató cada una con DNasa exenta de RNasa (Roche) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se sintetizó cDNA a partir del RNA total utilizando el estuche de síntesis de cDNA de la primera Cadena (Boehringer Mannheim) siguiendo las recomendaciones del fabricante.

La amplificación por PCR de un fragmento específico de gen del cDNA sintetizado se realizó utilizando DNA polimerasa Taq (Roche) y los iniciadores específicos del gen en la reacción siguiente: tampón PCR 1X, MgCl_{2} 1,5 mM, 0,2 \muM de cada iniciador, 0,2 \muM dNTPs, 1 unidad de polimerasa, y 5 \mul de cDNA de la reacción de síntesis. La amplificación se realizó en las condiciones siguientes: desnaturalización, 95ºC, 1 minuto; reasociación, 62ºC, 30 segundos; extensión, 72ºC, 1 minuto, 35 ciclos; extensión, 72ºC, 5 minutos; mantenimiento, 4ºC, en todos los casos. Los productos PCR se corrieron en un gel de agarosa al 1%, se tiñeron con bromuro de etidio, y se visualizaron bajo luz UV utilizando el sistema de documentación de gel Quantity-One (Bio-Rad). La expresión de los transgenes se detectó en la línea transgénica T1. Estos resultados indicaban que los transgenes se expresan en las líneas transgénicas y sugerían fuertemente que su producto génico mejoraba la tolerancia de la planta al estrés en las líneas transgénicas. De acuerdo con la exposición anterior, no pudo detectarse por este método expresión alguna de genes endógenos idénticos o muy similares. Estos resultados están de acuerdo con los datos del Ejemplo 7.

TABLA 7 Iniciadores utilizados para la amplificación del mRNA del transgén respectivo en PCR utilizando RNA aislado de plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana como molde

10

* = no abarcado por la presente invención

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Ejemplo 10 Elaboración por ingeniería genética de plantas de soja tolerantes al estrés por sobre-expresión del gen GBP-1 y los genes GBP-2, GBP-3, GBP-4 y GBP-5 (no abarcados por la presente invención)

Se utilizaron los constructos pBPSLVM162, pBPSJYW004, pBPSJYW001, pBPSLVM180 y pBPSJYW006 para transformar soja como se describe a continuación.

Se esterilizaron en superficie semillas de soja con etanol al 70% durante 4 minutos a la temperatura ambiente con agitación continua mediante sacudidas, seguido por 20% (v/v) de Clorox complementado con 0,05% (v/v) de Twin durante 20 minutos con agitación continua mediante sacudidas. Después de ello, se lavaron las semillas 4 veces con agua destilada y se pusieron sobre papel de filtro estéril humedecido en una cápsula Petri a la temperatura ambiente durante 6 a 39 horas. Se desprendieron las cubiertas de las semillas, y se desprendieron los cotiledones del eje del embrión. El eje del embrión se examinó para asegurarse de que no se había deteriorado la región meristemática. Los ejes cortados del embrión se recogieron en una cápsula Petri estéril semi-abierta y se secaron al aire hasta un contenido de humedad menor que 20% (peso fresco) en una cápsula Petri sellada hasta su uso ulterior.

Se preparó un cultivo de Agrobacterium tumefaciens a partir de una sola colonia en medio LB sólido más los antibióticos apropiados (v.g. 100 mg/l de estreptomicina, 50 mg/l de kanamicina) seguido por crecimiento de la colonia simple en medio LB líquido hasta una densidad óptica a 600 nm de 0,8. A continuación, el cultivo de bacterias se redujo a un sedimento a 7000 rpm durante 7 minutos a la temperatura ambiente, y se resuspendió en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) complementado con acetosiringona 100 \muM. Los cultivos bacterianos se incubaron en este medio de pre-inducción durante 2 horas a la temperatura ambiente antes de su utilización. Los ejes de los embriones de las semillas cigóticas de soja a aproximadamente 15% de contenido de humedad se embebieron durante 2 horas a la temperatura ambiente con el cultivo de suspensión de Agrobacterium pre-inducido. Los embriones se retiraron del cultivo de imbibición y se transfirieron a cápsulas Petri que contenían medio MS sólido complementado con 2% de sacarosa y se incubaron durante 2 días en la oscuridad, a la temperatura ambiente. Alternativamente, los embriones se pusieron sobre papel de filtro estéril húmedo (medio MS líquido) en una cápsula Petri y se incubaron en las mismas condiciones arriba descritas. Después de este periodo, los embriones se transfirieron a medio MS sólido o líquido complementado con 50 mg/l de carbenicilina o 300 mg/l de cefotaximo para destruir las agrobacterias. Se utilizó el medio líquido para humedecer el papel de filtro estéril. Los embriones se incubaron durante 4 semanas a 25ºC, bajo 150 \mumol^{-2}s^{-1} y fotoperiodo de 12 horas. Una vez que las plantas de semillero produjeron raíces, se transfirieron a suelo Metromix estéril. El medio de las plantas in vitro se eliminó por lavado antes de transferir las plantas al suelo. Las plantas se mantuvieron bajo una cubierta de plástico durante 1 semana para favorecer el proceso de aclimatación. Se transfirieron luego las plantas a una sala de crecimiento en la cual se incubaron a 25ºC, bajo 150 \mumol m^{-2}s^{-1} de intensidad luminosa y fotoperiodo de 12 horas durante aproximadamente 80 días.

Las plantas transgénicas se escrutaron luego en cuanto a su tolerancia mejorada a la sequía, la sal y/o el frío, de acuerdo con el método de escrutinio descrito en el Ejemplo 7, demostrando que la expresión de los transgenes confiere tolerancia al estrés.

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Ejemplo 11 Producción por ingeniería genética de plantas de colza/canola tolerantes al estrés por sobre-expresión del gen GBP-1 y los genes GBP-3, GBP-4 y GBP-5 (no abarcados por la presente invención)

Se utilizaron los constructos pBPSLVM162, pBPSJYW004, pBPSJYW001, pBPSLVM180 y pBPSJYW006 para transformar colza/canola como se describe a continuación.

El método de transformación de plantas descrito en esta memoria es también aplicable a Brassica y otras cosechas. Semillas de canola se esterilizan superficialmente con etanol al 70% durante 4 minutos a la temperatura ambiente con agitación continua mediante sacudidas, seguido por 20% (v/v) de Clorox complementado con 0,05% (v/v) de Twin durante 20 minutos, a la temperatura ambiente con agitación continua mediante sacudidas. A continuación, se lavan 4 veces las semillas con agua destilada y se dejan sobre papel de filtro estéril húmedo en una cápsula Petri a la temperatura ambiente durante 18 horas. Se separan luego las cubiertas de las semillas y las semillas se secan al aire durante una noche en una cápsula Petri estéril semiabierta. Durante este periodo, las semillas pierden aproximadamente un 85% de su contenido de agua. Las semillas se guardan a la temperatura ambiente en una cápsula Petri herméticamente cerrada hasta su uso ulterior. Los constructos de DNA y la imbibición de los embriones son como se describe en el Ejemplo 10. Se analizan muestras de las plantas transgénicas primarias (T0) por PCR para confirmar la presencia de T-DNA. Estos resultados se confirman por hibridación Southern en la cual el DNA se somete a electroforesis en un gel de agarosa al 1% y se transfiere a una membrana de nailon cargada positivamente (Roche Diagnostics). Se utiliza el Kit de Síntesis de Sonda PCR DIG (Roche Diagnostics) para preparar una sonda marcada con digoxigenina por PCR, y se utiliza de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Las plantas transgénicas se escrutan luego respecto a su tolerancia mejorada al estrés de acuerdo con el método de escrutinio descrito en el Ejemplo 7, demostrando que la expresión del transgén confiere tolerancia a la sequía.

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Ejemplo 12 Producción por ingeniería genética de plantas de maíz tolerantes al estrés por sobre-expresión del gen GBP-1 y los genes GBP-2, GBP-3, GBP-4 y GBP-5 (no abarcados por la presente invención)

Se utilizaron los constructos pBPSLVM162, pBPSJYW004, pBPSJYW001, pBPSLVM180 y pBPSJYW006 para transformar maíz como se describe a continuación.

La transformación de maíz (Zea Mays L.) se realiza con el método descrito por Ishida et al. 1996 Nature Biotech. 14645-50. Los embriones inmaduros se co-cultivan con Agrobacterium tumefaciens que llevan vectores "super-binarios", y las plantas transgénicas se recuperan por organogénesis. Este procedimiento proporciona una eficiencia de transformación comprendida entre 2,5% y 20%. Las plantas transgénicas se escrutan luego respecto a su tolerancia mejorada a la sequía, la sal y/o el frío de acuerdo con el método de escrutinio descrito en el Ejemplo 7, demostrando que la expresión del transgén confiere tolerancia al estrés.

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Ejemplo 13 Producción por ingeniería genética de plantas de trigo tolerantes al estrés por sobre-expresión del gen GBP-1 y los genes GBP-2, GBP-3, GBP-4 y GBP-5 (no abarcados por la presente invención)

Se utilizaron los constructos pBPSLVM162, pBPSJYW004, pBPSJYW001, pBPSLVM180 y pBPSJYW006 para transformar trigo como se describe a continuación.

La transformación del trigo se realiza con el método descrito por Ishida et al. 1996 Nature Biotech. 14745-50. Se co-cultivan embriones inmaduros con Agrobacterium tumefaciens que llevan vectores "super-binarios", y se recuperan plantas transgénicas por organogénesis. Este procedimiento proporciona una eficiencia de transformación entre 2,5% y 20%. Las plantas transgénicas se escrutan luego respecto a su tolerancia mejorada al estrés de acuerdo con el método de escrutinio descrito en el Ejemplo 7, demostrando que la expresión de los transgenes confiere tolerancia a la sequía.

Ejemplo 14 Identificación de Genes Homólogos y Heterólogos

Pueden utilizarse secuencias génicas para identificar genes homólogos o heterólogos a partir de cDNA o genotecas genómicas. Los genes homólogos (v.g. clones de cDNA de longitud total) pueden aislarse por hibridación de ácido nucleico utilizando por ejemplo genotecas de cDNA. Dependiendo de la abundancia del gen de interés, se extienden en placas 100.000 hasta 1.000.000 de bacteriófagos recombinantes y se transfieren a membranas de nailon. Después de desnaturalización con álcali, se inmoviliza el DNA en la membrana mediante, v.g., reticulación por UV. La hibridación se lleva a cabo en condiciones de severidad alta. En solución acuosa, la hibridación y el lavado se realizan con una fuerza iónica de NaCl 1 M y una temperatura de 68ºC. Se generan sondas de hibridación mediante v.g. marcación radiactiva (^{32}P) por transcripción de la mella (High Prime, Roche, Mannheim, Alemania). Las señales se detectan por autorradiografía.

Los genes parcialmente homólogos o heterólogos que son afines pero no idénticos pueden identificarse de una manera análoga al procedimiento arriba descrito utilizando condiciones de hibridación y lavado de baja severidad. Para la hibridación acuosa, la fuerza iónica se mantiene normalmente a NaCl 1 M mientras que la temperatura se reduce progresivamente desde 68 a 42ºC.

El aislamiento de las secuencias génicas con homologías (o identidad/semejanza de secuencia) solamente en un dominio diferenciado de (por ejemplo 10-20 aminoácidos) puede llevarse a cabo por utilización de sondas de oligonucleótidos sintéticos radio-marcadas. Los oligonucleótidos radio-marcados se preparan por fosforilación del extremo 5-prima de dos oligonucleótidos complementarios con polinucleótido-quinasa T4. Los oligonucleótidos complementarios se reasocian y se ligan para formar concatémeros. Los concatémeros bicatenarios se someten luego a radiomarcación mediante, por ejemplo, transcripción de la mella. La hibridación se lleva a cabo normalmente en condiciones de severidad baja utilizando concentraciones altas de oligonucleótidos.

Solución de hibridación de oligonucleótidos:

: 6 x SSC

: fosfato de sodio 0,01 M

: EDTA 1 mM (pH 8)

: 0,5% SDS

: 100 \mug/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado

: 0,1% de leche desnatada seca

Durante la hibridación, la temperatura se reduce gradualmente hasta 5ºC por debajo del valor Tm estimado de los oligonucleótidos o hasta la temperatura ambiente seguido por pasos de lavado y autorradiografía. El lavado se realiza con severidad baja tal como tres pasos de lavado utilizando 4 x SSC. Detalles adicionales han sido descritos por Sambrook, J. et al. (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press o Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons.

Ejemplo 15 Identificación de genes homólogos por escrutinio de genotecas de expresión con anticuerpos

Pueden utilizarse clones de cDNA para producir proteínas recombinantes, por ejemplo en E. coli (v.g. sistema QIAexpress pQE de Qiagen). Las proteínas recombinantes se purifican luego normalmente por afinidad mediante cromatografía de afinidad Ni-NTA (Qiagen). Las proteínas recombinantes se utilizan luego para producir anticuerpos específicos, por ejemplo utilizando técnicas estándar para inmunización de conejos. Los anticuerpos se purifican por afinidad utilizando una columna Ni-NTA saturada con el antígeno recombinante como ha sido descrito por Gu et al. 1994 BioTechniques 17:257-262. El anticuerpo puede utilizarse luego para escrutar genotecas de expresión de cDNA a fin de identificar genes homólogos o heterólogos por escrutinio inmunológico (Sambrook, J. et al. (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press o Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons.

Ejemplo 16 Mutagénesis in vivo

La mutagénesis in vivo de microorganismos puede realizarse mediante pasadas de DNA plasmídico (u otro vector) a través de E. coli u otros microorganismos (v.g. Bacillus spp o levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae) que están deteriorados en sus capacidades para mantener la integridad de su información genética. Las cepas mutantes típicas tienen mutaciones en los genes para el sistema de reparación de DNA (v.g., mutHLS, mutD, mutT, etc.; para referencia, véase Rupp W.D. (1996) DNA repair mechanisms, en: Escherichia coli and Salmonella, p. 2277-2294, ASM: Washington). Tales cepas son bien conocidas por los expertos en la técnica. El uso de dichas cepas se ilustra, por ejemplo, en Greener, A. y Callahan, M. (1994) Strategies 7:32-34. La transferencia de moléculas de DNA mutadas en plantas se realiza preferiblemente después de selección y ensayo en microorganismos. Las plantas transgénicas se generan de acuerdo con diversos ejemplos dentro de la sección de ejemplos de este docu-
mento.

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Ejemplo 17 Análisis in vitro de la Función de los Genes de Physcomitrella en Organismos Transgénicos

La determinación de las actividades y los parámetros cinéticos de las enzimas está bien establecida en la técnica. Los experimentos para determinar la actividad de cualquier enzima alterada dada tienen que adaptarse a la actividad específica de la enzima de tipo salvaje, lo cual está perfectamente dentro de la capacidad de un experto en la técnica. Revisiones acerca de enzimas en general, así como detalles específicos concernientes a estructura, cinética, principios, métodos, aplicaciones y ejemplos para la determinación de muchas actividades de enzimas pueden encontrarse, por ejemplo, en las referencias siguientes: Dixon, M., and Webb, E.C., (1979) Enzymes. Longmans: Londres; Fersht, (1985) Enzyme Structure and Mechanism. Freeman: Nueva York; Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman: San Francisco; Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P.D., ed. (1983) The Enzymes, 3rd ed. Academic Press: Nueva York; Bisswanger, H, (1994) Enzymkinetik, 2nd ed. VCH: Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., GraBl, M., eds. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3rd ed., vol. I-XII, Verlag Chemie: Weinheim; and Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) vol. A9, Enzymes. VCH: Weinheim, p. 352-363.

La actividad de las proteínas que se fijan a DNA puede medirse por varios métodos bien establecidos, tales como ensayos de desplazamiento de bandas de DNA (denominados también ensayos de retardación en gel). El efecto de dichas proteínas sobre la expresión de otras moléculas puede medirse utilizando ensayos de genes informadores (tales como el descrito Kolmar, H. et al. (1995) EMBO J. 14: 3895-3904 y las referencias citadas en dicho lugar). Los sistemas de ensayo de genes informadores son bien conocidos y están bien establecidos para aplicaciones en células tanto pro- como eucariotas, utilizando enzimas tales como \beta-galactosidasa, proteína fluorescente verde, y varias
otras.

La determinación de la actividad de las proteínas de transporte de membrana puede realizarse de acuerdo con técnicas tales como las descritas en Gennis, R.B. Pores, Channels and Transporters, en Biomembranes, Molecular Structure and Function, pp. 85-137, 199-234 y 270-322, Springer, Heidelberg (1989).

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Ejemplo 18 Purificación del Producto Deseado a Partir de Organismos Transformados

La recuperación del producto deseado a partir de material de plantas (a saber, Physcomitrella patens o Arabidopsis thaliana), hongos, algas, ciliados, células de C. glutamicum, u otras células bacterianas transformadas con las secuencias de ácido nucleico descritas en esta memoria, o el sobrenadante de los cultivos arriba descritos puede realizarse por diversos métodos bien conocidos en la técnica. Si el producto deseado no es secretado por las células, puede recogerse a partir del cultivo por centrifugación a baja velocidad, después de lo cual pueden lisarse las células por técnicas estándar, tales como fuerza mecánica o sonificación. Los órganos de las plantas pueden separarse mecánicamente de otros tejidos u órganos. Después de la homogeneización, los residuos celulares se separan por centrifugación, y la fracción sobrenadante que contiene las proteínas solubles se retiene para purificación ulterior del compuesto deseado. Si el producto es secretado por las células deseadas, entonces se separan las células del cultivo por centrifugación a baja velocidad, y se retiene la fracción sobrenadante para purificación ulterior.

La fracción sobrenadante de cualquier método de purificación se somete a cromatografía con una resina adecuada, en la cual la molécula deseada o es retenida sobre una resina cromatográfica en tanto que muchas de las impurezas de la muestra no se retienen, o, por el contrario, las impurezas son retenidas por la resina mientras que la muestra no lo es. Tales pasos de cromatografía pueden repetirse en caso necesario, utilizando la misma o diferentes resinas cromatográficas. Un experto en la técnica estaría plenamente versado en la selección de resinas cromatográficas apropiadas y en su aplicación más eficaz para una molécula particular a purificar. El producto purificado puede concentrarse por filtración o ultrafiltración, y guardarse a una temperatura a la que se maximiza la estabilidad del
producto.

Existe una amplia serie de métodos de purificación conocidas en la técnica y el método de purificación que antecede no tiene por objeto ser limitante. Dichas técnicas de purificación se describen, por ejemplo, en Bailei J.E. & Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: Nueva York (1986). Adicionalmente, la identidad y pureza de los compuestos aislados puede evaluarse por métodos estándar de la técnica. Éstos incluyen cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), métodos espectroscópicos, métodos de tinción, cromatografía en capa delgada, NIRS, ensayo enzimático, o microbiológicamente. Tales métodos de análisis se revisan en: Patek et al. 1994 Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova et al., 1996 Biotekhnologiya 11:27-32; y Schmidt et al., 1998 Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, (1996) vol. A27, VCH: Weinheim, p. 89-90, p. 521-540, p. 540-547, p. 559-566, 575-581 and p. 581-587; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17.

<110> BASF PLANT SCIENCE GMBH

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<120> PROTEÍNAS FIJADORAS DE GTP RELACIONADAS CON EL ESTRÉS, Y MÉTODOS DE UTILIZACIÓN EN PLANTAS

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<130> 16313-0040

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<140> PCT/US01/11291

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2001-04-06

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/196,001

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-04-07

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 805

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 671

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 749

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 815

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (782)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 490

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 667

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1045

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 698

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2119

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 883

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

23

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 192

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 316

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 206

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 609

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

30

31

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 216

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

33

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caggaaacag ctatgacc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctaaagggaa caaaagctg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtaaaacga cggccagt

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgccagcatt gtcgagaccc agaaa

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcccgggtc cgtagatacc aaggctggt

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgttaactc gtcgctctta aacaccgagc taag

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcccgggcc tctcttgctc atccccaatg gctg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgagctcga ggcactaatc agagaacgcc gta

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacaactgcc ctggctccaa aatca

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcccgggca ggagattgga gaatcagtct gc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgagctcga ccctggcatt tcccatcgca gcaa

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tactgcatcc actactgcct ccgct

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcccgggca cgcctccacc ctcttgggtc aca

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgagctcct gggagttgag ggcttggatg taa

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtcctcctc ctcgccagcc ttggt

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcccgggcg tccaccctca accagattgg tgc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgagctcgc aactggcgta cttattaaca cta

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgctgcaga tttcatttgg agaggacacg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggccggc ctcagaagaa ctcgtcaaga aggcg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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<400> 35

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\hskip-.1em\dddseqskip

gctgacacgc caagcctcgc tagtc

\hfill

25

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<210> 36

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<211> 34

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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<400> 36

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gcgttaactc gtcgctctta aacaccgagc taag

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34

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<210> 37

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<211> 33

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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<400> 37

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcgagctcga ggcactaatc agagaacgcc gta

\hfill

33

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<210> 38

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<211> 34

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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<400> 38

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcgagctcga ccctggcatt tcccatcgca gcaa

\hfill

34

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<210> 39

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<211> 33

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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gcgagctcct gggagttgag ggcttggatg taa

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33

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<210> 40

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<211> 33

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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gcgagctcgc aactggcgta cttattaaca cta

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33

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<210> 41

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<211> 29

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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atcccgggtc cgtagatacc aaggctggt

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29

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<210> 42

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<211> 34

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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gcgttaactc gtcgctctta aacaccgagc taag

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34

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<210> 43

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<211> 34

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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atcccgggcc tctcttgctc atccccaatg gctg

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34

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<210> 44

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<211> 33

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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gcgagctcga ggcactaatc agagaacgcc gta

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33

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<210> 45

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<211> 32

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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atcccgggca ggagattgga gaatcagtct gc

\hfill

32

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<210> 46

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<211> 34

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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gcgagctcga ccctggcatt tcccatcgca gcaa

\hfill

34

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<210> 47

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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ggcacacagg agtacgcaga gtttc

\hfill

25

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<210> 48

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<211> 27

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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<400> 48

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cgctctctgc gtcttgctgc tatcatg

\hfill

27

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<210> 49

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<211> 33

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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<400> 49

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atcccgggcg tccaccctca accagattgg tgc

\hfill

33

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<210> 50

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<211> 33

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

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<400> 50

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gcgagctcgc aactggcgta cttattaaca cta

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33

Claims

1. Una célula de planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificante de Proteína Fijadora de GTP Relacionada con el Estrés (GBSRP), en la cual la GBSRP se selecciona de un grupo constituido por un polipéptido como se define en SEQ ID NO: 11 y un polipéptido que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con un polipéptido de SEQ ID NO: 11 en toda su longitud, y en donde la expresión del ácido nucleico en la célula de la planta da como resultado una tolerancia incrementada de la célula de la planta al estrés por sequía y/o estrés por helada en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula de la planta.

2. La célula de planta transgénica de la reivindicación 1, en la cual la GBSRP es como se define en SEQ ID NO: 11.

3. La célula de planta transgénica de la reivindicación 1, en la cual el ácido nucleico codificante de GBSRP es como se define en SEQ ID NO: 6.

4. La célula de planta transgénica de la reivindicación 1, en la cual el ácido nucleico codificante de GBSRP tiene al menos 80-90% de identidad de secuencia con la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 6. en toda su región codificante.

5. La célula de planta transgénica de la reivindicación 1, en la cual la planta es una monocotiledónea.

6. La célula de planta transgénica de la reivindicación 1, en la cual la planta es una dicotiledónea.

7. La célula de planta transgénica de la reivindicación 1, en la cual la planta se selecciona del grupo constituido por maíz, trigo, centeno, avena, trigo híbrido, arroz, cebada, soja, cacahuete, algodón, colza, canola, mandioca, pimiento, girasol, tagetes, plantas solanáceas, patata, tabaco, berenjena, tomate, especies de Vicia, guisante, alfalfa, café, cacao, té, especies de Sálix, palma de aceite, cocotero, hierbas perennes y cosechas forrajeras.

8. La célula de planta transgénica de la reivindicación 1, en la cual la expresión del ácido nucleico en la célula de la planta da como resultado una eficiencia incrementada del uso de agua por la planta en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula de la planta.

9. La célula de planta transgénica de la reivindicación 1, en la cual la expresión del ácido nucleico en la célula de la planta da como resultado un peso seco incrementado de la planta en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula de la planta.

10. Una planta transgénica que comprende una célula de planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

11. Una semilla producida por una planta transgénica que comprende una célula de planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la cual la semilla es progenie auténtica para una tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula de la planta.

12. Uso de una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 10 o una semilla de acuerdo con la reivindicación 11 para la fabricación de un producto agrícola.

13. Una Proteína Relacionada con el Estrés Fijadora de GTP (GBSRP) aislada, en la cual la GBSRP se selecciona del grupo constituido por Proteína-1 Relacionada con el Estrés Fijadora de GTP (GBP-1) como se define en SEQ ID NO: 11 y un polipéptido que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 11 en toda su longitud, y en donde la expresión del ácido nucleico en una planta da como resultado una tolerancia incrementada de la planta al estrés por sequía y/o estrés por helada en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.

14. La GBSRP aislada de la reivindicación 13, en la cual la GBSRP es GBP-1 como se define en SEQ ID NO: 11.

15. Un ácido nucleico codificante de Proteína Relacionada con el Estrés Fijadora de GTP (GBSRP) aislado, en el cual la GBSRP se selecciona del grupo constituido por GBP-1 como se define en SEQ ID NO: 11 y una secuencia de polipéptidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 11 en toda su longitud.

16. El ácido nucleico codificante de GBSRP aislado de la reivindicación 15, en donde el ácido nucleico codificante de GBSRP es como se define en SEQ ID NO: 6.

17. El ácido nucleico codificante de GBSRP aislado de la reivindicación 15, en donde el ácido nucleico codificante de GBSRP tiene al menos 80-90% de identidad de secuencia con la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 6 en toda su región codificante.

18. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 15, en donde la expresión del ácido nucleico en una planta da como resultado una eficiencia incrementada de uso del agua por la planta en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.

19. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 15, en donde la expresión del ácido nucleico en una célula de la planta da como resultado un peso seco incrementado de la planta en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.

20. Un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico de las reivindicaciones 15, 16, 17, 18 ó 19, en donde la expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora da como resultado la tolerancia incrementada de la célula hospedadora al estrés por sequía y/o estrés por helada en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula hospedadora.

21. El vector de expresión recombinante de la reivindicación 20, en el cual la expresión del ácido nucleico en una planta da como resultado una eficiencia incrementada de uso del agua por la planta en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.

22. El vector de expresión recombinante de la reivindicación 20, en el cual la expresión del ácido nucleico en una planta da como resultado un peso seco incrementado de la planta en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.

23. Un método de producción de una planta transgénica que contiene un ácido nucleico codificante de una Proteína Relacionada con el Estrés Fijadora de GTP (GBSRP), en el cual la expresión del ácido nucleico en la planta da como resultado una tolerancia incrementada de la planta al estrés por sequía y/o estrés por helada en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta, que comprende

a.: transformar una célula de la planta con un vector de expresión que comprende el ácido nucleico, y

b.: generar a partir de la célula de la planta una planta transgénica con una tolerancia incrementada al estrés por sequía y/o estrés por helada en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta,

en donde la GBSRP se selecciona de un grupo constituido por GBP-1 como se define en SEQ ID NO: 11 y un polipéptido que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 11 en toda su longitud.

24. El método de la reivindicación 23, en el cual la GBSRP es como se define en SEQ ID NO: 11.

25. El método de la reivindicación 23, en el cual el ácido nucleico codificante de GBSRP es como se define en SEQ ID NO: 6.

26. El método de la reivindicación 23, en el cual el ácido nucleico codificante de GBSRP tiene al menos 80-90% de identidad de secuencia con la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 6 en toda su región codificante.

27. El método de la reivindicación 23, en el cual la expresión del ácido nucleico en la planta da como resultado una eficiencia incrementada del uso de agua por la planta en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.

28. El método de la reivindicación 23, en el cual la expresión del ácido nucleico en la planta da como resultado un peso seco incrementado de la planta en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.

29. Un método de modificación de la tolerancia al estrés de una planta, que comprende modificar la expresión de una Proteína Relacionada con el Estrés Fijadora de GTP (GBSRP) en la planta, en el cual la GBSRP se selecciona de un grupo constituido por GBP-1 como se define en SEQ ID NO: 11 y un polipéptido que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 11 en toda su longitud, y en el cual la modificación de la expresión de la GBSRP en la planta da como resultado una tolerancia modificada al estrés por sequía y/o estrés por helada de la planta en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.

30. El método de la reivindicación 29, en el cual la GBSRP es como se define en SEQ ID NO: 11.

31. El método de la reivindicación 29, en el cual el ácido nucleico codificante de GBSRP es como se define en SEQ ID NO: 6.

32. El método de la reivindicación 29, en el cual el ácido nucleico codificante de GBSRP tiene al menos 8-90% de identidad de secuencia con la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 6 en toda su región codificante.

33. El método de la reivindicación 29, en el cual la tolerancia al estrés se incrementa.

34. El método de la reivindicación 29, en el cual la planta no es transgénica.

35. El método de la reivindicación 29, en el cual la planta es transgénica.

36. El método de la reivindicación 35, en el cual la planta se transforma con un promotor que dirige la expresión de la GBSRP.

37. El método de la reivindicación 36, en el cual el promotor es específico de tejido.

38. El método de la reivindicación 36, en el cual el promotor está regulado por desarrollo.

39. El método de la reivindicación 29, en el cual el aumento de la expresión del polipéptido en la planta da como resultado una eficiencia incrementada de uso del agua por la planta en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.

40. El método de la reivindicación 29, en el cual el aumento de la expresión del polipéptido en la planta da como resultado un peso seco incrementado de la planta en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.