ES2380422T3 - Genes de la remolacha azucarera involucrados en la tolerancia al estrés - Google Patents

Abstract

El uso de un ácido nucleico de Beta vulgaris para mejorar la tolerancia al estrés osmótico en una planta que comprende la expresión de dicho ácido nucleico de Beta vulgaris, caracterizado porque confiere tolerancia al estrés osmótico a las células de levadura, y en donde dicho ácido nucleico de Beta vulgaris se escoge entre: (a) un ácido nucleico que contiene una secuencia de ADN como la indicada en la SEQ ID NO 3 o el complemento de la misma, (b) un ácido nucleico que contiene la secuencia de ARN correspondiente a la SEQ ID NO 3 o el complemento de la misma, (c) un ácido nucleico que hibrida específicamente con el ácido nucleico de (a) o (b) bajo condiciones rigurosas, (d) un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que es al menos 89% idéntico a la secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 8, (e) un ácido nucleico que codifica una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 8, (f) un ácido nucleico que se degenera hasta un ácido nucleico como el indicado en la SEQ ID NO 3, o que se degenera hasta un ácido nucleico como el definido en uno cualquiera de los numerales (a) hasta (e) como resultado del código genético, (g) un ácido nucleico que difiere de un ácido nucleico que codifica una proteína como la indicada en la SEQ ID NO 8, o que difiere de un ácido nucleico como el definido en cualquiera de los numerales (a) hasta (e) como resultado de diferencias en el uso del codón entre los organismos, (h) un ácido nucleico que difiere de un ácido nucleico que codifica una proteína como la indicada en la SEQ ID NO 8, o que se diferencia de un ácido nucleico como se define en cualquiera de los numerales (a) hasta (e) como resultado de diferencias entre los alelos, y (i) un ácido nucleico como el definido en cualquiera de los numerales (a) hasta (h) caracterizado porque dicho ácido nucleico es ADN, ADNc, AND genómico o AND sintético.

Description

Genes de la remolacha azucarera involucrados en la tolerancia al estrés

Campo de la invención

La presente descripción se relaciona con el campo de la biología molecular en plantas, más particularmente con el uso de genes y proteínas de la remolacha azucarera, capaces de conferir un fenotipo en células eucariotas u organismos de tolerancia a situaciones de estrés, por ejemplo, toxicidad por sales minerales provocada por iones tales como Na+ o Li+.

Antecedentes

La salinidad del suelo es uno de los estreses abióticos más significativos para la agricultura de plantas y por lo tanto, sería útil para identificar y aislar genes de tolerancia al estrés para el objetivo práctico de mejorar genéticamente la tolerancia a la salinidad de los cultivos.

Otros dos estreses abióticos importantes, la sequía y el frío, están íntimamente relacionados con el estrés por salinidad. Muchos de los genes que son regulados por el estrés por salinidad son también sensibles al estrés por sequía o por frío (Zhu, 1997), por lo tanto, estos genes son particularmente interesantes para el mejoramiento genético de la tolerancia al estrés.

Los mecanismos moleculares por medio de los cuales las plantas responden al estés por salinidad están empezando a ser dilucidados (Hasegawa et al. 2000a). Los transportadores de sodio en la membrana de la vacuola y del plasma, identificados como los productos de los genes NHX1 y SOS1 de Arabidopsis (Gaxiola et al. 1992,�?bside et al. 1999) y SOS1 (Shi et al. 2000), respectivamente, han sido descritos como importantes determinantes de la tolerancia a la sal.

Para lograr el objetivo de mejorar genéticamente la tolerancia al estrés en las plantas es importante utilizar genes de tolerancia al estrés que cuando se introducen pueden conferir inmediatamente tolerancia al estrés. La acción de estos genes puede no ser dependiente de otros eventos relacionados con la ruta u otros componentes que sean necesarios para el mecanismo molecular de la tolerancia al estrés. Se puede identificar los factores importantes causantes del estrés en el organismo estresado, pero la pregunta sigue siendo si estos genes también contribuirán a mejorar la tolerancia al estrés en un huésped heterólogo cuando se los aisla y transfecta dentro del mismo.

La remolacha azucarera (genes) y estrés

Se sabe que Beta vulgaris L. (Chenopodaceae, remolacha azucarera), es más bien una planta resistente al estrés cuando se la compara con otras plantas, por ejemplo, Arabidopsis thaliana. Las remolachas azucareras son relativamente hablando bastante resistentes a la sal y a la sequía. Los genes que son los responsables de la capacidad de la remolacha azucarera para crecer en condiciones más difíciles comienzan a ser dilucidados. Una primera indicación de que un gen bajo investigación podría estar implicado en la inducción de resistencia, es el aumento de su expresión bajo condiciones de estrés. Como ejemplo, Matías et al. (1996) mostraron que el estrés por salinidad induce la mayor expresión de la H+ATPasa tipo V en las hojas maduras de la remolacha azucarera. También la betaína, un osmoprotector, es acumulada por muchas plantas de remolacha en respuesta a la salinidad y a la sequía. Además, en la remolacha azucarera, la expresión de Colina monooxigenasa, que cataliza la etapa comprometedora en la síntesis de la betaína derivada de la glicina de la remolacha azucarera, también es inducida por estrés osmótico en Chenopodaceae. Los niveles de ARNm en las hojas se incrementan de 3 a 7 veces con una concentración de sal de 400 mM y retorna a niveles no inducidos (Russel, 1998). Como se mencionó anteriormente, existen diferentes rutas alternativas para responder a situaciones de estrés y por lo tanto, muchos genes diferentes están probablemente implicados en las respuestas al estrés.

Resumen de la invención

La presente invención provee un objetivo como el expuesto en todos y cada uno de los numerales (i) hasta (xxxiii) a continuación:

(i)

El uso de un ácido nucleico de Beta vulgaris para mejorar la tolerancia al estrés osmótico en una planta que comprende la expresión de dicho ácido nucleico de Beta vulgaris, caracterizado porque confiere tolerancia al estrés osmótico a las células de levadura, y en donde dicho ácido nucleico de Beta vulgaris se escoge entre:

(a)

un ácido nucleico que contiene una secuencia de ADN como la indicada en la SEQ ID NO 3 o el complemento de la misma,

(b)

un ácido nucleico que contiene la secuencia de ARN correspondiente a la SEQ ID NO 3 o el complemento de la

misma,

(c)

un ácido nucleico que hibrida específicamente con el ácido nucleico de (a) o (b) bajo condiciones rigurosas,

(d)

un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que es al menos 89% idéntico a la secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 8,

(e)

un ácido nucleico que codifica una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 8,

(f)

un ácido nucleico que se degenera hasta un ácido nucleico como el indicado en la SEQ ID NO 3, o que se degenera hasta un ácido nucleico como el definido en uno cualquiera de los numerales (a) hasta (e) como resultado del código genético,

(g)

un ácido nucleico que difiere de un ácido nucleico que codifica una proteína como la indicada en la SEQ ID NO 8,

o que difiere de un ácido nucleico como el definido en cualquiera de los numerales (a) hasta (e) como resultado de diferencias en el uso del codón entre los organismos,

(h)

un ácido nucleico que difiere de un ácido nucleico que codifica una proteína como la indicada en la SEQ ID NO 8,

o que se diferencia de un ácido nucleico como se define en cualquiera de los numerales (a) hasta (e) como resultado de diferencias entre los alelos, y

(i)

un ácido nucleico como el definido en cualquiera de los numerales (a) hasta (h) caracterizado porque dicho ácido nucleico es ADN, ADNc, AND genómico o AND sintético.

(ii)

El uso de un ácido nucleico de Beta vulgaris como el expuesto en el numeral (i) más arriba en donde dichas células de levadura se derivan de la cepa JM26 de levadura sensible al Na+.

(iii) Un método para mejorar la tolerancia al estrés osmótico en una planta que comprende la expresión o alteración de la expresión de cualquier ácido nucleico como el expuesto en el numeral (i) más arriba en células, tejidos o partes de dicha planta.

(iv)

Un método como el expuesto en el numeral (iii) más arriba en donde dicha expresión de dicho ácido nucleico ocurre bajo el control de un promotor.

(v)

Un método como el expuesto en uno cualquiera de los numerales (iii) o (iv) más arriba en donde dicho estrés osmótico es provocado por salinidad.

(vi)

Un método como el expuesto en uno cualquiera de los numerales (iii) o (iv) más arriba en donde dicho estrés osmótico es provocado por sequía.

(vii) Un método como el expuesto en uno cualquiera de los numerales (iii) o (iv) más arriba en donde dicho estrés osmótico es provocado por una helada.

(viii) Un método como el expuesto en uno cualquiera de los numerales (iii) o (iv) más arriba en donde dicho estrés osmótico es provocado por frío.

(ix)

Un método como el expuesto en uno cualquiera de los numerales de (iii) hasta (viii) más arriba en donde dicho método conduce a un aumento en el rendimiento.

(x)

Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína para mejorar la tolerancia al estrés osmótico en una planta seleccionada entre una de las siguientes:

(a)

un ácido nucleico que contiene una secuencia de ADN como la indicada en la SEQ ID NO 3 o el complemento de la misma,

(b)

un ácido nucleico que contiene la secuencia de ARN correspondiente a la SEQ ID NO 3 o el complemento de la misma,

(c)

un ácido nucleico que hibrida especialmente con el ácido nucleico del numeral (a) o (b) bajo condiciones muy rigurosas,

(d)

un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que es al menos 89% idéntical a una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 8,

(e)

un ácido nucleico que codifica una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 8,

(f)

un ácido nucleico que se degenera hasta un ácido nucleico como el indicado en la SEQ ID NO 3, o que se degenera hasta un ácido nucleico como el definido en cualquiera de los numerales (a) hasta (e) como resultado del código genético,

(g)

un ácido nucleico que se diferencia de un ácido nucleico que codifica una proteína como la indicada en la SEQ ID NO 8, o que se diferencia de un ácido nucleico como el definido en cualquiera de los numerales (a) hasta (e) como resultado de diferencias en el uso del codón entre organismos,

(h)

un ácido nucleico que se diferencia de un ácido nucleico que codifica una proteína como la indicada en la SEQ ID NO 8, o que se diferencia de un ácido nucleico como el definido en cualquiera de los numerales (a) hasta (e) como resultado de diferencias entre los aleles, y

(i)

un ácido nucleico como el definido en cualquiera de los numerales (a) hasta (h) caracterizado porque dicho ácido nucleico es ADN, ADNc, ADN genómico o ADN sintético.

(xi)

Una molécula de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos contiguos de longitud que hibridan específicamente con un ácido nucleico como el expuesto en (x) más arriba.

(xii) Una molécula de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos contiguos de longitud que amplifica específicamente un ácido nucleico como el expuesto en (x) más arriba.

(xiii) Un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico como el expuesto en (x) más arriba.

(xiv) Un vector como el expuesto en (xiii) más arriba que es un vector de expresión en donde dicha secuencia de ácido nucleico está operativamente enlazada a una o más secuencias de control que permiten la expresión de dicha secuencia en células huésped procariotas y/o eucariotas.

(xv) Una célula huésped que contiene una molécula de ácido nucleico como la expuesta en (x) más arriba o un vector como el expuesto en cualquiera de los numerales (xiii) o (xiv) más arriba.

(xvi) Una célula huésped como la expuesta en (xv) más arriba, en donde la célula huésped es una célula bacteriana, de insecto, de hongo, de levadura, vegetal o de animal.

(xvii) Un polipéptido aislado que puede ser codificado por un ácido nucleico como el expuesto en (x) más arriba.

(xviii) Un polipéptido como el expuesto en (xvii) más arriba que tiene una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 8 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 89% idéntica a una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 8.

(xix) Un método para producir un polipéptido como el expuesto en cualquiera de los numerales (xvii) o (xviii) más arriba que comprende el cultivo de una célula huésped como la expuesta en cualquiera de los numerales (xv) o (xvi) más arriba bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido y la recuperación del polipéptido producido del cultivo.

(xx) Un anticuerpo que reconoce específicamente un polipéptido como el expuesto en cualquiera de los numerales

(xvii) o (xviii) más arriba o un epítopo específico de dicho polipéptido.

(xxi) Un método para la producción de células vegetales alteradas, tejidos vegetales o plantas que comprende la introducción de un polipéptido como el expuesto en cualquiera de los numerales (xvii) o (xviii) más arriba directamente dentro de dicha célula o tejido vegetal o en un órgano de dicha planta.

(xxii) Un método para efectuar la expresión de un polipéptido como el expuesto en cualquiera de los numerales (xvii)

o (xviii) más arriba que comprende la introducción de una molécula de ácido nucleico como la expuesta en (x) más arriba operativamente enlazada a una o más secuencias de control o un vector como el expuesto en cualquiera de los numerales (xiii) o (xiv) más arriba en forma estable dentro del genoma de una célula vegetal.

(xxiii) Un método para la producción de células vegetales transgénicas, tejidos vegetales o plantas que comprende la introducción de un ácido nucleico como el expuesto en (x) más arriba en un formato expresable o un vector como el expuesto en cualquiera de los numerales (xiii) o (xiv) más arriba en dicha célula vegetal, tejido vegetal o planta.

(xxiv) Un método para mejorar la tolerancia al estrés osmótico en una célula vegetal, tejido o planta que comprende la introducción de cualquier ácido nucleico como el expuesto en (x) más arriba dentro de dicha célula vegetal, tejido u órgano de dicha planta.

(xxv) Un método como el expuesto en uno cualquiera de los numerales de (xxii) hasta (xxiv) más arriba que comprende además la regeneración de una planta a partir de dicha célula vegetal.

(xxvi) Una célula vegetal transgénica que contiene un ácido nucleico como el expuesto en (x) más arriba que está operativamente enlazado a elementos reguladores que permiten la transcripción y/o la expresión de dicho ácido nucleico en células vegetales o en una célula vegetal transgénica que puede ser obtenida por medio de un método como el expuesto en (xxiii) más arriba.

(xxvii) Una célula vegetal transgénica como la expuesta en (xxvi) más arriba en donde dicho ácido nucleico como el expuesto en (x) más arriba está integrado en forma estable dentro del genoma de dicha célula vegetal.

(xxviii) Una planta o un tejido vegetal transgénico que contiene células vegetales como el expuesto en cualquiera de los numerales (xxvi) o (xxvii) más arriba.

(xxix) Una planta transgénica como la expuesta en (xxviii) más arriba que muestra una mayor tolerancia al estrés osmótico, comparada con la correspondiente planta de tipo silvestre.

(xxx) Una parte cosechable de una planta como la expuesta en cualquiera de los numerales (xxviii) o (xxix) más arriba, dicha parte cosechable conteniendo células vegetales transgénicas como las expuestas en cualquiera de los numerales (xxvi) o (xxvii) más arriba.

(xxxi) La parte cosechable de una planta como la expuesta en (xxx) más arriba que se selecciona de entre el grupo que consiste de semillas, hojas, frutos, cultivos de tallos, rizomas y bulbos.

(xxxii) La progenie derivada de cualquiera de las plantas o partes de la planta como las expuestas en cualquiera de los numerales (xxviii) hasta (xxxi) más arriba, y que contiene células vegetales transgénicas como las expuestas en cualquiera de los numerales (xxvi) o (xxvii) más arriba.

El asunto tratado por la invención pertenece específicamente por lo tanto a la divulgación, descripción y enseñanzas de la presente descripción detallada.

Como se divulga aquí cinco nuevos genes fueron aislados de Beta vulgaris y transferidos a células de levadura. Estos genes indujeron todos tolerancia al estrés en las células de levadura, y codifican para una subunidad a de caseína quinasa, denominada como BvCK2A, una dihidroorotasa, denominada como BvDHO, un factor 1A de iniciación de la traducción, denominado como BvelF-1A, y para otras dos proteínas desconocidas, denominadas así mismo como Bv120 y Bv20Li.

Inesperadamente, los inventores demostraron que estos genes de remolacha azucarera cuando se transfieren a levadura podrían volver a este organismo heterólogo tolerante al estrés, al estrés por Na+ en particular. El fenotipo sorprendentemente fuerte de algunos de estos clones de levadura y el hecho de que estos genes en forma aislada y en un ambiente heterólogo actúan como reforzadores de la tolerancia al estrés, convierten a estos genes en herramientas muy atractivas para inducir tolerancia al estrés en cualquier organismo de interés, sin necesidad de otros compuestos. La capacidad de estos genes para mejorar la tolerancia al estrés osmótico en células de levadura cuando se aíslan y transfectan en ellas, claramente los distinguen de otros genes de remolacha azucarera que se sabe que juegan un papel en (otras) respuestas al estrés, pero que no fueron utilizados en forma aislada. Uno de estos genes nuevos de remolacha azucarera de la presente invención codifica una subunidad de caseína quinasa. Fue sorprendente divulgar por primera vez una subunidad de caseína quinasa vegetal y más sorprendentemente un subdominio catalítico a de caseína quinasa ejerciendo una función en respuesta al estrés por salinidad. Aquí se describe un clon de ADNc (BvCKA2) que codifica una de las subunidades catalíticas a de proteína quinasa CK2 de remolacha azucarera (anteriormente caseína quinasa II). BvCKA2 aumenta la tolerancia al NaCl de levadura. Además, se demuestra aquí que la expresión de BvCKA2 en remolacha azucarera es inducida por estrés por salinidad.

También fue muy sorprendentemente la identificación de otros dos genes como una dihidroorotasa de remolacha azucarera y un factor 1A de iniciación de la traducción, respectivamente, ya que en el presente estado de la técnica del relacionado con el estrés de una planta, no existe evidencia de la función de tales proteínas como inductoras de tolerancia al estrés.

Además fue sorprendente que dos de los genes aislados codificaran polipéptidos para los que no se podían encontrar homólogos. Por lo tanto estos genes pueden ser considerados como un nuevo tipo de genes que codifican un nuevo tipo de proteína que confiere a un organismo heterólogo tolerancia al estrés.

Todos estos genes divulgados aquí son clonados en un formato de un vector expresable y son capaces de aportar características agronómicamente interesantes a una planta transgénica cuando se los transfecta aquí.

Para identificar nuevos genes de plantas que intervienen en el estrés por NaCl, los inventores adoptaron una estrategia previamente utilizada con la levadura Saccharomyces cerevisiae (Serrano, 1996). Los inventores construyeron una biblioteca de ADNc de remolacha azucarera estresada por salinidad y la detectaron en una cepa de levadura sensible a la salinidad. La justificación para esta detección de genes de plantas expresado en células de levadura es que se cree algunos de los mecanismos moleculares de tolerancia de la levadura a la sal son similares a los de las células vegetales (Serrano, 1996, Hasegawa et al. 2000b). La remolacha azucarera es una planta de cultivo relativamente halófila (Marschner, 1995), que podría ser una mejor fuente de genes halotolerantes que la planta modelo Arabidopsis.

En consecuencia, la descripción detallada describe cinco nuevos genes de Beta vulgaris con secuencias de nucleótidos como se indica en las SEQ ID Nos: 1 a 5 , que codifican cinco polipéptidos diferentes con secuencias de aminoácidos como las mostradas en las SEQ ID Nos 6 a 10.

La presente descripción detallada describe vectores, o células huésped u organismos que contienen al menos parte de las secuencias como las respuestas en las SEQ ID Nos. 1 a 5.

Además, se describe un método para conferir tolerancia al estrés a un organismo de interés, preferiblemente plantas, levaduras o bacterias, que comprende la introducción de al menos uno de los cinco genes de remolacha azucarera en ese organismo.

Descripción detallada de la invención

Uno de los problemas subyacentes de la presente invención es proporcionar genes que pueden ser utilizados para mejorar la tolerancia al estrés de organismos que sufren de condiciones de estrés tales como estrés osmótico, causado por salinidad o sequía y/o por condiciones de estrés tales como estrés por frío, heladas y congelación o estrés oxidativo.

Esta invención ofrece soluciones al problema anteriormente descrito y se divulga en las siguientes realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

La descripción detallada divulga un conjunto de genes que son originarios de Beta vulgaris, una planta de cultivo tolerante al estrés, que fueron aislados y que le confieren tolerancia a la Saccharomyces cerevisiae a condiciones de estrés, por ejemplo, genes que confieren tolerancia al estrés a la cepa JM26 de levadura sensible a Na+. Adicional al hecho de que estos genes son todos de la misma planta, todos ellos mostraron un fenotipo de resistencia a la sal cuando separadamente transformaron a un mutante de levadura sensible a la sal. Al hacerlo así todos ellos actuaron como un único reforzador de la tolerancia al estrés.

Inesperadamente, estos genes codifican proteínas con funciones putativas muy diferentes como la subunidad a de la caseína quinasa, la dihidroorotasa, el factor 1A de iniciación de la traducción y algunos de ellos son incluso de un tipo desconocido. Otras características tales como el fenotipo muy fuerte de resistencia a la sal que algunos de estos genes mostraron en levadura y el hecho de que algunos de estos genes son frecuentemente aislados en el procedimiento de detección selectiva en levadura, contribuyen a la efectividad y la eficiencia de estos genes como reforzadores de la tolerancia al estrés. Este conjunto de genes permiten a la persona experta en la técnica alterar genéticamente el organismo de interés con el fin de hacerlo resistente a las situaciones de estrés. Para el cultivo por ejemplo plantas de cultivo, muchas de las cuales son sensibles a condiciones de estrés tales como salinidad, sequía

o frío, los genes divulgados ofrecen la posibilidad de resolver el problema de menor productividad y menor beneficio económico. Cada gen de este conjunto de genes le permite a la persona experta en la técnica modificar el destino de la célula y/o el desarrollo de la planta y/o la morfología de la planta y/o la bioquímica y/o la fisiología mediante la introducción de al menos uno de estos genes en la célula.

La caseína quinasa, CK2 (anteriormente CKII), es una serina-treonina proteína quinasa, omnipresente y altamente conservada entre los organismos eucariotas (Glover, 1998). Se compone de dos subunidades catalíticas (a o a') y de dos subunidades reguladoras (�), que se tetramerizan para adoptar una estructura a2�2. La proteína quinasa CK2 se localiza tanto en el núcleo como en el compartimiento citoplasmático donde fosforila una variedad de sustratos que participan en diferentes funciones celulares. En levadura, CK2 es esencial y requiere por lo menos de cuatro procesos biológicos: floculación, el progreso del ciclo celular, la polaridad de la célula y de la homeostasis iónica. En las plantas, se ha propuesto que CK2 participa en la regulación del ciclo celular (Espunya et al. 1999), en la regulación de la luz del desarrollo de la planta (Lee et al. 1999) y en el funcionamiento del reloj circadiano (Sugano et al. 1998, Suggano et al., 1999). No se ha demostrado anteriormente una relación entre la expresión ectópica de la subunidad a de la caseína quinasa de la planta y el estrés en general. En consecuencia, se divulga aquí un nuevo ácido nucleico de la remolacha azucarera como el expuesto en la SEQ ID NO. 1, más conocido como el clon 154, que codifica una subunidad catalítica a de caseína quinasa, también denominada como BvCKA2 y capaz de mejorar la tolerancia a la sal en células de levadura sensibles a la sal. El marco de lectura abierto, que comienza en la posición del nucleótido 202 y termina en la posición 1203 codifica las secuencias de aminoácidos para BvCKA2 expuestas en la SEQ ID NO. 6.

También la identificación de uno de los genes como una dihidroorotasa de remolacha azucarera fue muy sorprendente ya que, en el estado actual de la técnica en el campo del estrés de las plantas, no hay evidencia para la función de una enzima así tal como una inductora de la tolerancia al estrés. En consecuencia, se divulga aquí un ácido nucleico novedoso de la remolacha azucarera tal como el expuesto en la SEQ ID NO. 2, también conocido como el clon 35, que codifica una dihidroorotasa, también denominada como BvDHO y capaz de mejorar la tolerancia a la sal en células de levadura sensibles a la sal. El marco de lectura abierto, que comienza en la posición del nucleótido 199 y termina en la posición 1236 codifica las secuencias de aminoácidos para BvDHO expuestas en la SEQ ID NO. 7.

Además, el aislamiento de un factor 1A de iniciación de la traducción de la remolacha azucarera, que actúa como un reforzador único de la tolerancia al estrés, fue muy sorprendente. Aunque se sabe que las células responden al estrés mediante la alteración de la fosforilación de los factores de transcripción con el fin de alterar la capacidad de traducción, esta es la primera vez que se podría demostrar que un factor de traducción por sí mismo podría contribuir en el mejoramiento de la tolerancia al estrés en un organismo cuando se lo transfecta aquí.

En consecuencia, la invención se relaciona con un ácido nucleico novedoso de la remolacha azucarera como se expone en la SEQ ID NO. 3, también conocido como el clon 76, que codifica un factor 1A de iniciación de la traducción, también conocido como BvelF-1A capaz de mejorar la tolerancia a la sal en células de levadura sensibles a la sal. El marco de lectura abierto, que comienza en la posición del nucleótido 88 y termina en la posición 521 codifica las secuencias de aminoácidos para BvelF-1A expuestas en la SEQ ID NO. 8.

Se encontró que otros dos polipéptidos codificados por ácidos nucleicos con función desconocida confieren tolerancia al estrés en la levadura.

En consecuencia, se divulga aquí un ácido nucleico novedoso de la remolacha azucarera como el expuesto en la SEQ ID NO. 4, también conocido como el clon 120, que codifica una proteína desconocida, también denominado como Bv120, capaz de mejorar la tolerancia a la sal en células de levadura sensibles a la sal. El marco de lectura abierto, que comienza en la posición del nucleótido 29 y que termina en la posición 499 codifica las secuencias de aminoácidos para Bv120 expuestos en la SEQ ID NO. 9.

Adicionalmente, se divulga aquí un ácido nucleico novedoso de la remolacha azucarera como el expuesto en la SEQ ID NO. 5, también conocido como el clon 20Li, que codifica una proteína desconocida, también denominado como Bv20Li, capaz de mejorar la tolerancia a la sal en células de levadura sensibles a la sal. El marco de lectura abierto, que comienza en la posición del nucleótido 1 y que termina en la posición 879 codifica las secuencias de aminoácidos para Bv20Li expuestas en la SEQ ID NO. 10.

También se divulga aquí el procedimiento de detección de una biblioteca de ADNc de hojas de remolacha azucarera inducidas por NaCl y el aislamiento posterior de los cinco genes de la remolacha azucarera como se mencionó anteriormente. Se siguió un enfoque funcional para la identificación de las proteínas de la remolacha azucarera que están involucradas en la respuesta de las plantas al estrés por salinidad. Para este propósito se construyó una biblioteca de expresión de ADNc inducida por NaCl a partir de hojas de remolacha azucarera como se describe en el ejemplo 1 y en el ejemplo 3 y se utilizó la cepa mutante de levadura JM26 sensible a Na+ (véase el ejemplo 2) para detectar los ADNc de la remolacha azucarera que aumentaron la tolerancia a la sal de la levadura por sobreexpresión. El crecimiento de este mutante de levadura está normalmente inhibido con concentraciones de NaCl (150 mM) similares a aquellas que afectarían el crecimiento de la mayoría de especies de cultivo. Este procedimiento de detección se describe en el ejemplo 4. Después de la transformación de 100.000 células individuales con los plásmidos pYPGE15 que contienen los insertos de ADNc, se reunieron las colonias y se seleccionan por su capacidad para crecer en presencia de NaCl 150 mM (véase el ejemplo 4). Cuatro de los clones positivos, fueron llamados el clon 154, el clon 35, el clon 76 y el clon 120.

Los clones de levadura 154, el clon 35, el clon 76 y el 120 tenían un claro fenotipo de tolerancia a la sal y el fenotipo era muy reproducible: bajo NaCl 150 mM las células de levadura de control no crecieron en absoluto, y las células de levadura que sobreexpresan al inserto 154, 35, 76 o 120 crecieron. Los clones 35 y 76 fueron seleccionados dos veces y tres veces, respectivamente, durante la selección de los clones de levadura tolerantes a la sal, lo que sugiere la presencia abundante de aquellos clones en las hojas de remolacha azucarera estresadas con sal.

El mismo procedimiento de detección selectiva se realizó también para seleccionar las células de levadura tolerantes al Li+. Después de la transformación de la biblioteca de ADNc de remolacha azucarera, se reunieron las colonias y se seleccionaron por su capacidad para crecer en presencia de LiCI 20 mM sin metionina como se describe en el ejemplo 4. Uno de los clones positivos fue denominado 20Li. El clon 20Li mostró un fuerte fenotipo de tolerancia al Li+.

La definición de un fenotipo fuerte se basa en experimentos de ensayo de caída. Se elaboraron diferentes diluciones de cultivos saturados (1:10, 1:100, 1:1000) y estos fueron cultivados sobre medios selectivos (NaCl 150 mM más metionina o LiCl 20 mM sin metionina). Fenotipos fuertes son aquellos clones que crecieron bien en todas las diluciones ensayadas (por ejemplo, el clon 35, 76, 120 para NaCl y el clon 20Li para LiCI). El clon 154 no tenía un fenotipo muy fuerte en levadura, ya que únicamente la primera dilución (1:10) fue capaz de crecer en medios selectivos. Las células de control que expresan el plásmido vacío no crecieron en absoluto en los medios selectivos.

En consecuencia, la descripción de tallada de la invención describe un método para la inducción de tolerancia al estrés en un organismo que comprende la expresión de al menos un gen de Beta vulgaris que confiere tolerancia al estrés a las células de levadura.

En otra realización, la memoria descriptiva se refiere al uso de un ácido nucleico para Beta vulgaris para mejorar la tolerancia al estrés en una plantas que comprende la expresión de dicho ácido nucleico para Beta vulgaris caracteriza porque confiere tolerancia al estrés a las células de levadura, por ejemplo a las células de levadura derivadas de la cepa de levadura JM26 sensibles al Na+.

En una realización adicional, la presente memoria descriptiva describe un método para la inducción de tolerancia al estrés osmótico en un organismo que comprende la expresión de al menos un gen para Beta vulgaris que confiere tolerancia al estrés osmótico u oxidativo, tal como al estrés por sal o al estrés por sequía o tolerancia al estrés por congelación, a células de levadura.

La expresión "inducción de tolerancia al estrés" como se usa aquí tiene el mismo significado que "mejoramiento de la tolerancia al estrés" y por lo tanto se puede utilizar en forma intercambiable.

Todos los clones seleccionados se describen aquí a continuación con más detalle. Para encontrar homólogos posibles, se sometieron la secuencia de aminoácidos de los ORF (putativos) a una búsqueda de homología, realizado con el programa BlastP 2.0.10 (Altschul et al. 1997).

El inserto de ADNc de la presente plásmido en el clon 154 contiene un ADNc de 1527 pares de bases (SEQ ID NO. 1) con un marco de lectura abierto de 999 pares de bases que codifican un polipéptido de 333 aminoácidos (SEQ ID NO. 6) con un peso molecular predicho de 39,4 kD. Este polipéptido, llamado BvCKA2, tiene 91,6% de identidad con una de las subunidades catalíticas (cadena alfa 2) de la proteína quinasa CK2 de Zea mays (ZMCKA2). BvCKA2 contiene los 11 subdominios típicos de las proteínas quinasas eucariotas (Hanks et al. 1995) y todos los residuos de aminoácidos conservados característicos de las subunidades catalíticas CK2 (Figura 1). La 170-DWG-172 presente en el sitio catalítico es un patrón de huella invariable para subunidades alfa CK2 (Niefind et al., 1998). También están presentes en BvCKA2 la lisina catalítica esencial 63-K y la región altamente básica 69-KKKKIKR-75. El inserto de ADNc del plásmido presente en el clon 35 contiene un ADNc de 1743 pares de bases (SEQ ID NO. 2) con un marco de lectura abierto de 1035 pares de bases que codifica un polipéptido de 345 aminoácidos (SEQ ID NO. 7) con un peso molecular predicho de 40,8 kD. Este polipéptido, llamado BvDHO, tiene 79% de identidad con el precursor de la proteína dihidroorotasa de Arabidopsis thaliana y tiene 81% de identidad con la dihidroorotasa de la patata (WO0118190, WO0114569). El inserto de ADNc del plásmido presente en el clon 76 contiene un ADNc de 643 pares de bases (SEQ ID NO. 3) con un marco de lectura abierto de 432 pares de bases que codifica un polipéptido de 144 aminoácidos (SEQ ID NO. 8) con un peso molecular predicho de 17 kD. Este polipéptido, llamado BvelF-1 A, tiene 88% de identidad con el precursor del factor 1A de iniciación de la traducción eucariota (elf-1A o anteriormente conocido como eiF-4C) de Onobrychis viciifolia (esparceta común). El inserto de ADNc del plásmido presente en el clon 120 contiene un ADNc de 845 pares de bases (SEQ ID NO. 4) con un marco de lectura abierto de 468 pares de bases que codifica un polipéptido de 156 aminoácidos (SEQ ID NO. 9), denominado Bv120, con un peso molecular predicho de 18,5 kD. El inserto de ADNc del plásmido presente en el clon 20Li contiene un ADNc de 879 pares de bases (SEQ ID NO. 5) con un marco de lectura abierto putativo de 876 pares de bases que codifica un polipéptido de 292 aminoácidos (SEQ ID NO. 10) con un peso molecular predicho de 34,5 kD. Este polipéptido, llamado Bv20Li, tiene 59% de identidad con una proteína predicha de un clon genómico de Arabidopsis thaliana, para la cual no se ha descrito ninguna función.

La memoria descriptiva divulga el uso de un ácido nucleico para Beta vulgaris para mejorar la tolerancia al estrés osmótico u oxidativo en una planta en la que dicho ácido nucleico para Beta vulgaris se selecciona entre uno de los siguientes:

(a)

un ácido nucleico que contiene una secuencia de ADN como se indica en cualquiera de las SEQ ID Nos. 1 a 5 o el complemento de las mismas,

(b)

un ácido nucleico que contiene la secuencia de ARN correspondiente a cualquiera de las SEQ ID NOs. 1 a 5 o el complemento de las mismas,

(c)

un ácido nucleico que hibrida específicamente con el ácido nucleico de (a) o (b) bajo condiciones de alta rigurosidad,

(d)

un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que es al menos 93%, preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 6,

(e)

un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80%, preferiblemente al menos 82%, 85% ó 90%, más preferiblemente al menos 95%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 7,

(f)

un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que es al menos 89%, preferiblemente 90%, 92%, 95% ó 96%, más preferiblemente 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 8,

(g)

un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que es al menos 75%, preferiblemente 80%, 85% ó 90%, más preferiblemente 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 9,

(h)

un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que es al menos 65%, preferiblemente 70%, 75%, 80%, 85% ó 90%, más preferiblemente 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una

secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 10,

(I)

un ácido nucleico que codifica una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos como la indicada en cualquiera de las SEQ ID Nos. 6 a 10,

(j)

un ácido nucleico que codifica un fragmento inmunológicamente activo y/o funcional de una proteína codificada por una secuencia de ADN como la indicada en cualquiera de las SEQ ID Nos. 1 a 5,

(k)

un ácido nucleico que es degenerado hasta un ácido nucleico como el indicado en cualquiera de las SEQ ID Nos. 1 a 5, o que es degenerado hasta un ácido nucleico como se define en cualquiera de los numerales (a) hasta (j) como resultado del código genético,

(I)

un ácido nucleico que es diferente de un ácido nucleico que codifica una proteína como la indicada en cualquiera de las SEQ ID NOs. 6 a 10, o que es diferente de un ácido nucleico como se define en cualquiera de los numerales

(a)

hasta (j) como resultado de las diferencias en el uso de codones entre organismos,

(m)

un ácido nucleico que es diferente de un ácido nucleico que codifica una proteína como la indicada en cualquiera de las SEQ ID NOs. 6 a 10, o que es diferente de un ácido nucleico como el definido en cualquiera de los numerales

(a)

hasta (j) como resultado de las diferencias entre los alelos, y

(n)

un ácido nucleico como se define en cualquiera de los numerales (a) hasta (m), caracterizado porque dicho ácido nucleico es ADN, ADNc, ADN genómico o ADN sintético.

Además, la memoria descriptiva divulga un método para mejorar la tolerancia al estrés en una planta o en las plantas que comprende la expresión de al menos uno de los ácidos nucleicos como se describió anteriormente en células, tejidos o partes de dicha planta o plantas. También para las plantas que ya expresan un ácido nucleico de la invención, se divulga un método para alterar la tolerancia al estrés en dichas plantas que comprende la alteración de la expresión de un ácido nucleico de la invención en células, tejidos o partes de dichas plantas.

La presente divulgación detallada de la invención también describe un método para la inducción de tolerancia al estrés en un organismo, por ejemplo una planta, que comprende la expresión o la alteración de la expresión de un de un ácido nucleico que codifica una subunidad alfa de caseína quinasa, por ejemplo una subunidad alfa de caseína quinasa de una planta en células, tejidos o partes de dicho organismo; un método para la inducción de tolerancia al estrés osmótico, por salinidad, por Na+ o Li+ en un organismo, por ejemplo, una planta, levadura o bacterias, que comprende la expresión de una subunidad a de caseína quinasa de la planta, tal como una subunidad a de caseína quinasa de remolacha azucarera o un homólogo o un ortólogo de la misma; así como un método para la inducción de tolerancia al Na+ en una planta, tal como arroz, que comprende la expresión de una subunidad a de caseína quinasa de la remolacha azucarera.

Dicha subunidad a de caseína quinasa puede estar representada por las SEQ ID Nos. 1 y 6.

La presente divulgación detallada de la invención también describe el uso de una caseína quinasa para controlar el proceso de floración de las plantas. Los presentes inventores encontraron sorprendentemente que la sobreexpresión de una subunidad a de caseína quinasa, tal como la subunidad a de caseína quinasa de la remolacha azucarera identificada en la presente invención tiene un efecto sobre el proceso de floración, independiente de la luz.

La presente divulgación detallada de la invención también describe un método para controlar el proceso de floración de una planta que comprende la expresión o la alteración de la expresión de un ácido nucleico que codifica una subunidad alfa de caseína quinasa, tal como la representada por la SEQ ID NO 6 en células, tejidos o partes de dicha planta.

La presente divulgación detallada de la invención también describe el uso de un ácido nucleico que codifica una subunidad alfa caseína quinasa, tal como la representada por la SEQ ID NO 6 para controlar el proceso de floración de una planta.

La presente divulgación detallada de la invención describe un método para mejorar la tolerancia al estrés en un organismo, por ejemplo en una planta, que comprende la expresión o la alteración de la expresión de un ácido nucleico que codifica una dihidroorotasa en células, tejidos o partes de dicho organismo o dicha planta. Un método para la inducción de tolerancia al estrés osmótico, por sal, por Na+ o Li+ en un organismo, por ejemplo, una planta, levadura o bacterias, que comprende la expresión de una dihidroorotasa de una planta, tal como dihidroorotasa de remolacha azucarera o un homólogo o un ortólogo o un parálogo de la misma; así como un método para la inducción de tolerancia de Na+ a una planta, tal como arroz, que comprende la expresión de la dihidroorotasa de remolacha azucarera. Dicha dihidroorotasa puede estar representado por las SEQ ID Nos. 2 y 7. La presente memoria descriptiva también describe un método para la inducción de tolerancia al estrés en un organismo, por ejemplo en una planta, que comprende la expresión o la alteración de la expresión de un ácido nucleico que codifica un factor 1A de iniciación de la traducción en células, tejidos o partes de dicho organismo; un método para la inducción de tolerancia al estrés osmótico, por sal, por Na+ o Li+ en un organismo, por ejemplo, una planta, levadura o bacterias, que comprende la expresión de un factor 1A de iniciación de la traducción en una planta, tal como un factor 1A de iniciación de la traducción de la remolacha azucarera o de un homólogo, ortólogo o un parálogo del mismo; así como un método para la inducción de tolerancia al Na+ en una planta, tal como arroz, que comprende la expresión de un factor 1A de iniciación de la traducción de la remolacha azucarera. En una realización interesante de la invención, dicho factor 1A de iniciación de la traducción está representado por las SEQ ID NOs 3 y 8.

La presente memoria descriptiva también describe un método para mejorar la tolerancia al estrés en una planta que comprende la expresión o la alteración de la expresión de un ácido nucleico como el representado por la SEQ ID NO 4 ó 5, o un homólogo, un ortólogo o un parálogo del mismo.

La presente memoria descriptiva también describe un ácido nucleico aislado que codifica una proteína o un fragmento funcional y/o inmunológicamente activo de dicha proteína seleccionado del grupo que consiste de:

(a)

un ácido nucleico que contiene una secuencia de ADN como se indica en cualquiera de las SEQ ID NOs 1 a 5 o el complemento de las mismas,

(b)

un ácido nucleico que contiene la secuencia de ARN correspondiente a cualquiera de las SEQ ID NOs. 1 a 5 o el complemento de las mismas,

(c)

un ácido nucleico que hibrida específicamente con la secuencia de nucleótidos como se define (a) o (b) bajo condiciones de alta rigurosidad,

(d)

un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que es al menos 93%, preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 6,

(e)

un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80%, preferiblemente al menos 82%, 85%, 86%, 87%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 7,

(f)

un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que es al menos 89%, preferiblemente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 8,

(g)

un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que es al menos 75%, preferiblemente al menos 78%, 80%, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 9,

(h)

un ácido nucleico que codifica al menos parte de una proteína con una secuencia de aminoácidos que es al menos 65%, preferiblemente al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 10,

(I)

un ácido nucleico que codifica una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos como la indicada en cualquiera de las SEQ ID NOs 6 a 10,

(j)

un ácido nucleico que codifica un fragmento inmunológicamente activo y/o funcional de una proteína codificada por una secuencia de ADN como la indicada en cualquiera de las SEQ ID NOs 1 a 5,

(k)

un ácido nucleico que es degenerado hasta un ácido nucleico como el indicado en cualquiera de las SEQ ID NOs 1 a 5, o que es degenerado hasta un ácido nucleico como se define en cualquiera de los numerales (a) hasta (j) como resultado del código genético,

(I)

un ácido nucleico que es diferente de un ácido nucleico que codifica una proteína como la indicada en cualquiera de las SEQ ID NOs. 6 a 10, o que es diferente de un ácido nucleico como se define en cualquiera de los numerales

(a)

hasta (j) como resultado de las diferencias en el uso de codones entre organismos,

(m)

un ácido nucleico que es diferente de un ácido nucleico que codifica una proteína como la indicada en cualquiera de las SEQ ID NOs. 6 a 10, o que es diferente de un ácido nucleico como el definido en cualquiera de los numerales

(a)

hasta (j) como resultado de las diferencias entre los alelos, y

(n)

un ácido nucleico como se define en cualquiera de los numerales (a) hasta (m), caracterizado porque dicho ácido nucleico es ADN, ADNc, ADN genómico o ADN sintético

El clon 154 (SEQ ID NO 1) fue escogido para una caracterización adicional debido a que tiene homólogos en la levadura. Muchos información está disponible sobre CK2 en levadura y en otros organismos, por ejemplo mutantes de las subunidades CK2 de levadura.

Con el fin de confirmar la presencia de BvCKA2 en el genoma de la remolacha azucarera y para estimar el número de genes que codifican las subunidades catalíticas CK2 en esta especie vegetal, los inventores realizaron un análisis de transferencias tipo Southern. Como se describe en el ejemplo 8, primero se hibridó el ADN genómico de la remolacha azucarera utilizando un fragmento que incluye el ORF de BvCKA2 (Figura 2A). La presencia de diferentes fragmentos de hibridación en todos los carriles independientes de las endonucleasas de restricción utilizadas para digerir el ADN genómico, sugiere que CKA2 es un miembro de una familia de genes multicopia en la remolacha azucarera. Se utilizó la sonda de hibridación que puede reconocer todos los miembros de la familia de CK2, incluyendo los genes que codifican para diferentes isoformas de la subunidad catalítica. Cuando se utilizó una sonda más específica para la hibridación, únicamente se pudieron detectar dos bandas en la digestión con Bam HI y Hind III, y una banda en la digestión con Eco RI (Figura 2B). Esto puede indicar la presencia de dos genes estrechamente relacionados que codifican para subunidades catalíticas CK2 en la remolacha azucarera.

Para confirmar la funcionalidad del gen BvCKA2 para conferir tolerancia al estrés a la levadura, se demostró la complementación de la mutación CK2 de la levadura (ejemplo 6).

En la levadura Saccharomyces cerevisiae, CK2 es esencial para el crecimiento y existen dos genes redundantes, CKA1 y CKA2, que codifican dos subunidades catalíticas relacionadas (Padmanabha et al. 1990). YDH8 es una cepa de levadura mutante doble cka1/cka2 que porta un plásmido con una subunidad cka2 termosensible (pDH8). Para determinar si BvCKA2 podría suprimir el fenotipo termosensible de la cepa YDH8, se transformaron células YDH8 con el plásmido pYPGE15 + BvCKA2. Mientras que la cepa YDH8 sólo podía crecer a la temperatura permisiva de 25° C, YDH8 que sobreexpresa BvCKA2 fue capaz de crecer a 25° y a 37° C (Figura 3). BvCKA2 también podría complementar otras características fenotípicas de la cepa mutante cka1,2 tal como floculación (datos no presentados). Finalmente, cuando se removió el plásmido pDH8 y las células únicamente expresaron BvCKA2, la enzima de la planta podía soportar el crecimiento de levadura a 25° y 37° C (datos no presentados). Estos resultados sugieren claramente que BvCKA2 puede reemplazar funcionalmente la subunidad catalítica de levadura de CK2 y esto puede sugerir que CK2 es un proceso de regulación relacionado en ambos organismos.

De acuerdo con esta memoria descriptiva, que ilustra la clonación del gen BvCKA2, se describe una molécula de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos de longitud que hibrida específicamente con un ácido nucleico como se divulga en esta memoria descriptiva. Se describe también una molécula de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos de longitud que amplifica específicamente un ácido nucleico como se divulga en esta memoria descriptiva.

La presente memoria descriptiva divulga adicionalmente un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico como se definió anteriormente, tal como un vector de expresión en donde la secuencia de ácido nucleico está operativamente enlazada a una o más secuencias de control que permiten la expresión de dicha secuencia en células huésped procariotas y / o eucariotas.

La presente memoria descriptiva divulga una célula huésped que contiene una molécula de ácido nucleico como se definió anteriormente o un vector como se describió anteriormente, siendo dicha célula huésped por ejemplo una célula bacteriana, de insecto, de hongo, vegetal o animal.

La funcionalidad del gen BvCKA2 fue también confirmada por medio de la demostración del crecimiento de una cepa dura JM26 sensible al Na+ (ejemplo 2) en medios con NaCl como se describe en el ejemplo 7.

Este mutante de levadura, defectuoso en la subunidad reguladora no esencial de CK2, muestra un fenotipo de hipersensibilidad al Na+ y al Li+ (Bidwai et al. de 1995, Nadal et al. 1999b). La sobreexpresión tanto de la subunidad catalítica alfa 2 de la remolacha azucarera (BvCKA2), así como una de las subunidades catalíticas de levadura (ScCKA2), que fue clonada como se describe en el ejemplo 5, aumentó la tolerancia al Na+ de las células de levadura JM26 (Figura 4). Esto indica un efecto específico de CK2 sobre la tolerancia al Na+. La mayor tolerancia al Na+ de células de levadura que sobreexpresan BvCKA2 también se pudo demostrar en cultivos líquidos.

Los efectos funcionales anteriormente mencionados de la sobreexpresión de los genes de remolacha azucarera, posiblemente, posiblemente también pueden ser obtenidos por medio de la aplicación de los polipéptidos aislados producidos por estos genes o producidos en una forma sintética.

Por lo tanto, la presente invención también se relaciona con un polipéptido aislado que puede ser codificado por un ácido nucleico como se describió anteriormente, o un homólogo o un derivado del mismo, o un fragmento inmunológicamente activo y / o funcional del mismo, teniendo preferiblemente este polipéptido una secuencia de aminoácidos como se indica en cualquiera de las SEQ ID NOs 6-10, o un homólogo o un derivado del mismo, o un fragmento inmunológicamente activo y / o funcional del mismo.

También se divulga un método para producir un polipéptido como se mencionó anteriormente, que comprende el cultivo de una célula huésped como se mencionó anteriormente, bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido y la recuperación del polipéptido producido a partir del cultivo.

También, los efectos funcionales que fueron observados después de la expresión de los genes de la remolacha azucarera pueden ser influenciados por proteínas que se enlazan a los polipéptidos producidos por estos genes. Por lo tanto, la presente memoria descriptiva se relaciona con un anticuerpo que reconoce específicamente un polipéptido como se mencionó anteriormente o un epítopo específico de dicho polipéptido.

Con el propósito de investigar si el mecanismo de tolerancia a la sal conferido por BvCKA2 era debido a la regulación de la homeostasis iónica, se determinaron los niveles intracelulares de Na+ y K+ en las células que crecen en presencia de estos iones (Tabla 1) como se describe en el ejemplo 7. Se determinó que la expresión de BvCKA2 no cambió significativamente el contenido de Na+ y K+ en células de levadura.

Tabla 1: Contenido de sodio y potasio (mM) de células JM26 que sobreexpresan CKA2. Las células fueron cultivadas durante la noche en presencia de NaCl 75 mM. Los resultados son la media de tres experimentos independientes ± SD.

[K]

[Na]

PYPGE15

57 ± 11 136 ± 9

PYPGE15 + BVCKA2

56 ± 3 146 ± 9

En levadura, se ha demostrado que los mutantes en la subunidad reguladora � de la CK2 (CKB1) son muy sensibles al Na+ y Li+ (Bidwai et al. 1995, Nadal et al. 1999a). Se divulga aquí es que la sobreexpresión no solamente de la levadura, sino también de la subunidad catalítica a CK2 aumenta la tolerancia de la levadura al Na+. Dado que no solamente la reducción de la actividad de CK2 aumenta la sensibilidad al NaCl (mutantes de levadura ckb1), sino que también un aumento en la actividad de CK2 mejora la tolerancia a la sal, es posible que CK2 sea un determinante importante de la tolerancia a la sal en levadura. Sin embargo, no se conoce el mecanismo por medio del cual CK2 puede regular la tolerancia a la sal en levadura. Los datos publicados recientemente sugieren que CK2 regula la transcripción de la ATPasa ENA1 (Teney y Glover, 1999), el principal determinante para el flujo de Na+ en levadura. Uno de los aspectos de la invención enseña además de esto, que ya se demostró que la tolerancia a la sal conferida por BvCKA2 no está relacionada con la regulación de la homeostasis de Na+ dentro de las células. Además, se ha demostrado que la sobreexpresión de BvCKA2 mejoró la tolerancia a la sal del mutante de levadura JM26 que carece de los dos principales sistemas de transporte involucrados en el flujo de Na+ (la ATPasa ENA1-4 y el transportador bidireccional NHA1 de Na+/H+). Además, las mediciones de Na+ y K+ intracelulares no mostraron ninguna diferencia significativa entre los controles y las células que sobreexpresan CKA2 (Tabla 1). Las células de levadura que carecen del transportador bidireccional NHX de Na+/H+ vacuolar también mostraron mejoría en el crecimiento en medios con NaCl cuando ellas sobreexpresan CKA2 (datos no mostrados) descartando la posibilidad de que CK2 altere los niveles citoplasmáticos de Na+ a través del secuestro vacuolar. De acuerdo con esto, Nadal et al. (1999b) demostraron que la sensibilidad a la sal del mutante de levadura ckb1 no era debida a los defectos en los flujos de sodio. Estos autores postularon que CK2 podría reducir, por fosforilación, la sensibilidad al Na+ de un componente importante de la maquinaria celular que es sensible a la sal. Es difícil encontrar tales objetivos putativos de toxicidad por sal ya que se ha encontrado que muchos sustratos, incluidos factores de transcripción, proteínas quinasas y topoisomerasas poseen sitios de fosforilación putativos de CK2 (Grein et al. 1999).

A fin de confirmar que BvCKA2 participa en la respuesta de plantas de remolacha azucarera al estés por salinidad, se analizó la acumulación de ARNm de BvCKA2 en respuesta a diferentes tiempos de exposición al NaCl. La transferencia en gel de ARN utilizando una sonda específica de CKA2 mostró sólo una banda que correspondía al tamaño del ADNc de BvCKA2 (1,5 Kb). Como se muestra en la figura 5 se acumuló el ARNm de BvCKA2 con el tiempo tras el tratamiento con NaCl, y alcanzó un máximo a las 24 horas. El aumento fue de aproximadamente de 3 veces en comparación con las plantas de control. Es interesante observar que la biblioteca de ADNc de la remolacha azucarera utilizada para la búsqueda de genes que están implicados en la tolerancia al estrés, también fue obtenida a partir de las plantas tratadas durante 24 horas con NaCl.

Con el fin de confirmar que BvelF-1A participa en la respuesta de las células de levadura al estés por salinidad, se midió la incorporación de fenilalanina en proteínas. Los inventores observaron que bajo condiciones de estrés por salinidad, la incorporación de fenilalanina en células de levadura transformadas con el ADNc que codifica BvelF-1A fue mucho mayor que en las células transformadas con el vector vacío (ejemplo 12). Estos resultados demuestran que elF-1a está directamente implicado en la respuesta a la tolerancia al estrés. Además, estos resultados muestran que la sobreexpresión de este ADNc (según la SEQ ID NO. 3) puede mejorar la traducción bajo condición de estrés por salinidad.

Estos nuevos hallazgos son muy interesantes ya que esta es la primera evidencia que demuestra que un factor de iniciación de la traducción mejora la tolerancia al estrés.

Se demostró que los genes de remolacha azucarera de la presente invención confieren tolerancia al estrés a una levadura heteróloga cuando se transfectan en ella.

Además, se demostró que los genes de remolacha azucarera divulgados aquí, confieren tolerancia al estrés a una planta cuando se transfectan allí (véase el ejemplo 10).

Una aplicación agronómicamente interesante y adicional de estos genes, es para transfectarlos en una planta de cultivo con el fin de hacer que este cultivo sea más tolerante a condiciones de crecimiento inapropiadas. Las plantas de arroz pueden ser transfectadas con al menos uno de los genes de remolacha azucarera de la presente invención (ejemplo 9), que puede conferir tolerancia a la salinidad a las plantas de arroz. Esta aplicación ofrece una solución para el rendimiento reducido de arroz en tierras fuertemente irrigadas, causado por la deposición y acumulación de sales provenientes del agua de riego en el suelo.

De acuerdo con la divulgación anterior, la documentación del efecto del gen de la remolacha azucarera en una respuesta fisiológica a una situación de estrés in planta, la presente memoria descriptiva también se relaciona con un método para la producción de plantas transgénicas, células de plantas o tejidos de las plantas que comprende la introducción de una molécula de ácido nucleico como se definió anteriormente en un formato expresable o en un vector como se definido anteriormente en dicha planta, célula de planta o tejido de la planta. También se describe aquí un método para la producción de plantas alteradas, células de plantas o tejidos de las plantas que comprende la introducción de un polipéptido como se divulga aquí directamente en una célula, un tejido o un órgano de dicha planta.

La presente memoria descriptiva también se relaciona con un método para mejorar la tolerancia al estrés en una célula de una planta, tejido o planta que comprende la introducción de cualquier ácido nucleico como se mencionó anteriormente en dicha célula de planta, tejido u órgano de dicha planta.

Además, la presente memoria descriptiva describe un método para efectuar la expresión de un polipéptido como se mencionó anteriormente, que comprende la introducción de una molécula de ácido nucleico de la invención, opcionalmente operativamente enlazada a una o más secuencias de control o a un vector como se definió anteriormente de forma estable en el genoma de una célula de una planta. La memoria descriptiva describe un método como se describió aquí anteriormente, que comprende además la regeneración de una planta a partir de dicha célula de la planta.

Además, la memoria descriptiva, se relaciona a una célula de una planta transgénica que contiene una secuencia de ácido nucleico de la invención que está operativamente enlazada a elementos reguladores que permiten la transcripción y / o la expresión de dicho ácido nucleico en las células de la planta o una célula de una planta transgénica que puede ser obtenida por medio de un método como se describió anteriormente. Además, esta célula de una planta transgénica puede tener dicho ácido nucleico de la invención integrado en forma estable en su genoma. También se divulga una planta o un tejido de una planta transgénica que contiene células vegetales como se describió anteriormente, y además esta planta transgénica puede mostrar una mayor tolerancia al estrés, preferiblemente a un estrés osmótico tal como estrés por salinidad, Na+, Li+, sequía, frío o congelación o estrés oxidativo, en comparación con la planta de tipo silvestre correspondiente. También se divulga adicionalmente una parte cosechable de dicha planta que puede se puede seleccionar de entre el grupo que consiste de semillas, hojas, frutos, cultivos de tallo, rizomas y bulbos o la progenie derivada de cualquiera de las plantas o partes de plantas como se describió anteriormente.

Debido a que se demostró que los genes de la remolacha azucarera de la invención no están restringidos funcionalmente a su homología de fondo, la presente memoria descriptiva también se refiere a un método para alterar la tolerancia al estrés en un(os) microorganismo(s) que comprende la expresión o alteración de la expresión de un ácido nucleico de la invención en células, tejidos o partes de dicho organismo(s).

Como es conocido por la persona capacitada en la técnica, muchos genes implicados en el estrés por salinidad también están implicados en las respuestas a otras situaciones de estrés. En consecuencia, la presente memoria descriptiva se refiere también a los métodos anteriormente mencionados para la producción de células, plantas u otros organismos transgénicos, en donde dicho estrés puede ser estrés osmótico, estrés por salinidad, estrés por sequía, estrés por congelación o estrés por frío o estrés oxidativo.

En la mayoría de las aplicaciones prácticas de la presente invención, se utilizará la nueva tecnología para crear un efecto benéfico para el organismo transformado. Por lo tanto, la presente memoria descriptiva se refiere a un método de acuerdo con cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, dicho método conduciendo a un aumento en el rendimiento e incluso a un método en el que dicha expresión de dicho ácido nucleico se produce bajo el control de un promotor. Dicho promotor puede ser un promotor constitutivo o inducible. En los casos en que se prevé una expresión de los genes específica de las células, específica del tejido o específica de un órgano, se utiliza un promotor específico de las células, específico del tejido o específico de un órgano. Una lista exhaustiva pero no limitante de ejemplos de promotores que pueden ser utilizados en los métodos de la invención se proporciona en la Tabla 4.

En cuanto a la levadura, muchos compañeros que interactúan para los CK2 de plantas han sido postulados, incluyendo factores de transcripción, tales como CCA1 implicado en la regulación del reloj circadiano (Sugano et al. 1999), o GBF1 que regula la expresión de genes inducidos por la luz (Donald y Cashmore 1990). Curiosamente, dos proteínas quinasas inducidas por estrés por salinidad, ATPK19 y ATPK6, también contienen sitios de fosforilación putativos de CK2 (Mizoguchi et al. 1995).

Por consiguiente, la presente memoria descriptiva describe un método para la identificación y obtención de proteínas que interactúan con un polipéptido de la invención que comprende un ensayo de cribado en el que se utiliza dicho polipéptido de la presente invención. Este método podría comprender, por ejemplo, un ensayo de cribado de doble híbrido en donde se utilizan un polipéptido de la invención como carnada y una biblioteca de ADNc como presa.

También se describe un método para la modulación de la interacción entre un polipéptido de la invención y asociados de la proteína que interactúan que pueden ser obtenidos por medio de un método como el descrito anteriormente. Además, se describe un método para la identificación y la obtención de compuestos que interactúan con un polipéptido de la invención que comprende las etapas de:

(a)

proporcionar un sistema de doble híbrido en donde se expresan un polipéptido de la invención y un asociado de la proteínas que interactúa que puede ser obtenido por medio de un método como se describió anteriormente,

(b)

interactuación de dicho compuesto con el complejo formado por los polipéptidos expresados como se define en a), y,

(c)

realización de la medición de interacción de dicho compuesto con dicho polipéptido o el complejo formado por los polipéptidos expresados como se define en (a).

Aún así, la memoria descriptiva describe un método para identificar compuestos o mezclas de compuestos que se enlazan específicamente con un polipéptido de la invención, que comprende:

(a)

combinar un polipéptido de la invención con dicho compuesto o mezclas de compuestos bajo condiciones adecuadas para permitir la formación del complejo, y,

(b)

detectar la formación del complejo, en donde la presencia de un complejo identifica un compuesto o mezcla de compuestos que específicamente se enlazan con dicho polipéptido.

Debido a que estos compañeros de interacción del polipéptido de la invención pueden cooperar en la funcionalidad de estos polipéptidos, la presente memoria descriptiva también describe el uso de un compuesto o mezcla de compuestos identificados por medio de un método como se describió anteriormente como un factor que mejora la tolerancia al estrés en un(os) organismo(s).

En consecuencia, la presente memoria descriptiva describe el uso de una molécula de ácido nucleico como se definió anteriormente, un vector de la invención, un polipéptido de la invención para aumentar el rendimiento o para estimular el crecimiento de la planta. En particular, se divulga la oportunidad de aumentar el rendimiento de cualquier parte cosechable de una planta, tal como raíz, hoja, semillas, etc.

Es importante para el éxito agronómico de un cultivo que pueda hacer frente a situaciones de estrés. Por lo tanto, podría ser útil utilizar los genes o los polipéptidos de la invención para detectar en los cultivos importantes la presencia de genes de tolerancia al estrés. En consecuencia, la presente memoria descriptiva se refiere a una composición de diagnóstico que comprende al menos un ácido nucleico de la invención, un vector de la invención, un polipéptido de la invención o un anticuerpo de la invención.

Se describe que en condiciones normales de crecimiento de la planta existe una concentración típicamente baja de menos de 1 mM de Na+. Por lo tanto se divulga la posibilidad de utilizar una planta que puede ser obtenida por medio del método como se definió anteriormente o la planta de la invención para el cultivo en el suelo con un contenido de sal de más de 1 mM de iones. En la mayoría de los experimentos, se demostró que las plantas tolerantes a la sal eran capaces de crecer en condiciones con aproximadamente 40 mM hasta aproximadamente 400 mM de Na+.

Definiciones y elaboraciones para las realizaciones

A lo largo de esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera otra cosa el palabra "comprende" y variaciones tales como "que comprende" y "que contiene", se entenderá que implican la inclusión de un número entero establecido o etapa o grupo de números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas.

Tal como se usa aquí, el término "derivado de" se usará para indicar que un número entero o un grupo de números enteros se ha originado a partir de la especies especificada, pero no necesariamente ha sido obtenido directamente de la fuente especificada.

Los términos "proteína(s)", "péptido(s)" u "oligopéptidos(s)", cuando se utilizan aquí se refieren a aminoácidos en una forma polimérica de cualquier longitud. Dichos términos incluyen también modificaciones conocidas de aminoácidos tales como la formación de enlaces disulfuro, cisteinilación, oxidación, glutationilación, metilación, acetilación, farnesilación, biotinilación, estearoilación, formilación, adición de ácido lipoico, fosforilación, sulfatación, ubiquitinación, miristoilación, palmitoilación, geranilgeranilación, ciclación (por ejemplo, formación de ácido

piroglutámico), oxidación, desamidación, deshidratación, glicosilación (por ejemplo, pentosas, hexosaminas, Nacetilhexosamines, desoxihexoses, hexosas, ácido siálico, etc.), acilación y radiomarcadores (por ejemplo 125l, 131l,35S, 14C, 32P, 33P, 3H), así como residuos de aminoácidos de origen no natural, residuos de L-aminoácidos y residuos de D-aminoácido.

"Homólogos" de una proteína como se divulga aquí son aquellos péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que contienen sustituciones, supresiones y / o adiciones de aminoácidos en relación con dicha proteína con respecto a cual de ellas son un homólogo sin alterar una o más de sus propiedades funcionales, en particular, sin reducir la actividad del producto resultante. Por ejemplo, un homólogo de dicha proteína consistirá en una secuencia de aminoácidos bioactiva variante de dicha proteína. Para producir tales homólogos, los aminoácidos presentes en dicha proteína puede ser reemplazados por otros aminoácidos que tienen propiedades similares, por ejemplo hidrofobicidad, hidrofilicidad, momento hidrófobo, antigenicidad, propensión a formar o a romper estructuras ahelicoidales o estructuras de lámina �, y así sucesivamente. En la Tabla 2 se da una visión general de las propiedades físicas y químicas de los aminoácidos.

Tabla 2: Propiedades de los aminoácidos de origen natural.

Propiedades de carga/hidrofobicidad

Grupo lateral Aminoácido

no polar hidrófobo

alifático alifático, que contiene S aromático imino ala, ile, leu, val met phe, trp pro

no cargado polar

alifático amida aromático hidroxilo sulfhidrilo gly asn, gln tyr ser, thr cys

cargado positivamente

básico arg, his, lys

cargado negativamente

ácido asp, gly

Dos formas especiales de homología, ortólogos y parálogos, son conceptos evolutivos utilizados para describir las relaciones ancestrales de los genes. El término "parálogos" se refiere a las duplicaciones de genes dentro del genoma de una especie que conduce a genes parálogos. El término "ortólogos" se refiere a los genes homólogos en los distintos organismos debido a la relación ancestral. La presente memoria descriptiva se refiere también a homólogos, parálogos y ortólogos de los genes y proteínas de la invención. Los parálogos u ortólogos de los genes y proteínas de la invención puede tener un menor porcentaje de identidad de secuencia con las secuencias o proteínas de la invención que los estrictamente interpretados como "homólogos" tal como se definió anteriormente.

Las variantes por sustitución de una proteína de la invención son aquellas en las cuales al menos un residuo en dicha secuencia de aminoácidos de la proteína ha sido removido y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos individuales, pero pueden agruparse dependiendo de las limitaciones funcionales colocadas sobre el polipéptido; las inserciones usualmente serán del orden de aproximadamente 1 - 10 residuos de aminoácidos y las supresiones estarán en el intervalo de aproximadamente 1 20 residuos. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos comprenderán sustituciones conservadoras de aminoácidos, tales como aquellas descritas más arriba.

Variantes de inserción de secuencias de aminoácidos de una proteína de la invención son aquellos en los que se introducen uno o más residuos de aminoácidos en un sitio predeterminado en dicha proteína. Las inserciones puede comprender fusiones en el terminal amino y / o en el terminal carboxilo, así como inserciones dentro de la secuencia de múltiples aminoácidos o de aminoácidos individuales. En general, las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos serán más pequeñas que las fusiones en el terminal amino o en el terminal carboxilo, del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos. Los ejemplos de proteínas o péptidos de fusión en el terminal amino o en el terminal carboxilo incluyen al dominio de enlazamiento o al dominio de activación de un activador transcripcional como se utiliza en el sistema de doble híbrido en levadura, proteínas de recubrimiento de fago, etiqueta de (histidina)6, glutationa S-transferasa, proteína A, proteína de enlazamiento de maltosa, dihidrofolato reductasa, epítopo de Tag·100 (EETARFQPGYRS), epítopo de c-myc (EQKLISEEDL), epítopo de FLAG® (DYKDDDK), lacZ, CMP (péptido de enlazamiento de calmodulina), epítopo de HA (YPYDVPDYA), epítopo de proteína C (EDQVDPRLIDGK) y epítopo de VSV (YTDIEMNRLGK).

Las variantes de supresión de una proteína de la invención se caracterizan por la remoción de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de dicha proteína.

Las variantes de aminoácidos de una proteína de la invención puede ser fácilmente elaboradas utilizando técnicas sintéticas de péptidos bien conocidas en la técnica, tales como la síntesis de péptidos en fase sólida y similares, o por medio de manipulaciones de ADN recombinante. La manipulación de las secuencias de ADN para producir variantes de proteínas, que se manifiestan como variantes de sustitución, de inserción o de supresión son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las técnicas para realizar mutaciones por sustitución en sitios predeterminados en el ADN que tienen una secuencia conocida son bien conocidos por aquellos capacitados en la técnica, tales como por medio de mutagénesis M13, kit de mutagénesis in vitro T7-Gen (USB, Cleveland, OH), kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagénesis dirigida al sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis dirigida al sitio. Otra alternativa para manipular secuencias de ADN para producir variantes de proteínas, que se manifiestan como variantes por sustitución, por inserción o por supresión comprende la modificación dirigida del gen in vivo que se pueden lograr por medio de oligonucleótidos quiméricos de ARN / ADN como lo describen por ejemplo (Palmgren 1997; Yoon et al 1996).

Los "derivados" de una proteína de la invención son aquellos péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que pueden incluir residuos aminoácidos adicionales de origen natural, glucosilados alterados, acilados o de origen no natural en comparación con la secuencia de aminoácidos de una forma de origen natural de dicho polipéptido. Alternativamente o adicionalmente, un derivado puede incluir uno o más sustituyentes que no son de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de la forma de origen natural de dicho polipéptido, por ejemplo una molécula reportera u otro ligando, enlazada en forma covalente o no covalente a la secuencia de aminoácidos tal como, por ejemplo, una molécula reportera que está enlazada a la misma para facilitar su detección. Un derivado de una proteína retiene la actividad biológica o la actividad enzimática de la proteína de la que se deriva.

Con "inmunológicamente activo" se entiende que una molécula o fragmentos específicos de la misma tales como epítopos o haptenos son reconocidos por, es decir enlazados, a anticuerpos.

En el contexto de la presente invención también se incluyen homólogos, derivados y/o fragmentos inmunológicamente activos de cualquiera de los polipéptidos de remolacha azucarera de la invención o un homólogo, derivado o fragmento de los mismos como se define más arriba.

"Anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales, policlonales, sintéticos o anticuerpos de camallo de cadena pesada así como fragmentos de anticuerpos tales como fragmentos Fab, Fv o scFv. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar por medio de técnicas como las descritas anteriormente, por ejemplo (Liddle & Cryer, 1991), que comprenden la fusión de células de mieloma de ratón a las células de bazo procedentes de animales inmunizados. Además, los anticuerpos o fragmentos de los mismos con una molécula o fragmentos de los mismo pueden ser obtenidos mediante el uso de métodos como se describe, por ejemplo en (Harlow & Lane, 1988). En el caso de anticuerpos dirigidos contra péptidos pequeños tales como fragmentos de una proteína de la invención, dichos péptidos se acoplan generalmente a una proteína portadora antes de la inmunización de los animales. Tales portadores de proteína incluyen hemocianina de lapa (KLH), albúmina de suero bovino (BSA), ovoalbúmina y el toxoide del tétanos. La proteína transportadora mejora la respuesta inmune del animal y proporciona epítopos para los sitios de enlazamiento del receptor de células T. El término "anticuerpos" incluye, además, derivados de los mismos tales como anticuerpos marcados. Las etiquetas de anticuerpo incluyen fosfatasa alcalina, PKH2, PKH26, PKH67, fluoresceína (FITC), Hoechst 33258, R-ficoeritrina (PE), rodamina (TRITC), Quantum Rojo, Rojo Texas, Cy3,

125I, 131l, 35S,

biotina, agarosa, peroxidasa, esferas de oro y radiomarcadores (por ejemplo, 14C, 32P, 33P, 3H). Herramientas de biología molecular que dependen de anticuerpos contra una proteína incluyen el análisis de transferencias en gel de proteína, la selección de bibliotecas de expresión que permiten la identificación de genes, métodos cuantitativos de proteínas, que incluyen ELISA y RIA, la purificación por inmunoafinidad de proteínas, por ejemplo inmunoprecipitación de las proteínas (Magyar et al. 1997) e inmunolocalización. Otros usos de anticuerpos y especialmente de anticuerpos peptídicos incluyen el estudio de procesamiento proteolítico (Loffler et al. 1994; Woulfe et al. 1994), la determinación de sitios activos de la proteína (Lerner, 1982), el estudio de los precursores y de procesamiento post-traduccional (Baron y Baltimore, 1982; Lerner et al. 1981;. Semler et al. 1982), la identificación de los dominios de la proteína implicados en las interacciones proteína-proteína (Murakami et al. 1992) y el estudio del uso del exón en expresión génica (Tamura et al 1991).

También se describen anticuerpos que reconocen los polipéptidos de la remolacha azucarera de la invención, derivados o fragmentos de la misma tal como se define más arriba.

Los términos "gen(es)", "polinucleótido(s)", "secuencia(s) de ácido nucleico", "secuencia(s) de nucleótidos(s)", "secuencia(s) de ADN" o "molécula(s) de ácido nucleico", cuando se utilizan aquí se referen a nucleótidos, ya sea ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una combinación de ambos, en una forma polimérica de cualquier longitud. Dichos términos incluyen además ADN y ARN monocatenarios y bicatenarios. Dichos términos incluyen también modificaciones conocidas de nucleótidos tales como metilación, ciclización y 'cubiertas' y la sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo tal como inosina. Las modificaciones de nucleótidos incluyen la adición de acridina, amina, biotina, azul cascada, colesterol, Cy3®, Cy5®, Cy5.5® Dabcilo, digoxigenina, dinitrofenilo, Edans, 6-FAM, fluoresceína, 3'-glicerilo, HEX, IRD-700, IRD-800, JOE, fosfato de psoraleno, rodamina, ROX, tiol (SH), espaciadores, TAMRA, TET, AMCA-S® , SE, BODIPY® , Azul Marina®, Azul Pacífico®, Verde Oregon®, Verde Rodamina®, Rojo Rodamina®, Verde Rhodol® y Rojo Texas®. Las modificaciones de una columna vertebral de polinucleótidos incluyen metilfosfonato, ARN 2'-OMe-metilfosfonato, fosforotiorato, ARN, 2'-OMeARN. Las modificaciones de bases incluyen 2-amino-dA, 2-aminopurina, 3'-(ddA), 3'dA(cordicepina), 7-desaza-dA, 8-BrdA, 8-oxo-dA, N6-Me-dA, sitio abásico (dSpacer), biotina dT, 2'-OMe-5ME-C, 2'-OMe-propinil-C, 3'-(5-Me-dC), 3'(ddC), 5-Br-dC, 5-l-dC, 5-Me-dC, 5-F-dC, carboxi-dT, dA convertible, dC convertible, dG convertible, dT convertible, dU convertible, 7-desaza-dG, 8-Br-dG, 8-oxo-dG, O6-Me-dG, S6-DNP-dG, 4-metil-indol, 5-nitroindol, 2'-OMe-inosina, 2'-dl, O6-fenil-dl, 4-metil-indol, 2'-desoxinebularina, 5-nitroindol, 2-aminopurina, dP (análogo de purina), DK (análogo de pirimidina), 3-nitropirrol, 2-tio-dT, 4-tio-dT, biotina-dT, carboxi-dT, O4-Me-dT, O4-triazol dT, 2'-OMe-propinil-U, 5Br-dU, 2'-dU, 5-F-dU, 5-l-dU, O4-triazol dU y radiomarcadores (por ejemplo 125l, 131l, 35S, 14C, 32P, 33P, 3H). Dichos términos también incluyen ácidos nucleicos peptídicos (PNA), un análogo de ADN en el que la columna vertebral es un pseudopéptido que consiste de unidades de N-(2-aminoetil)-glicina en lugar de un azúcar. Las PNA imitan el comportamiento del ADN y se enlazan con cadenas complementarias de ácido nucleico. La columna vertebral neutra de ANP da como resultado un enlazamiento más fuerte y una mayor especificidad que la normalmente lograda. Además, las propiedades químicas, físicas y biológicas únicas de PNA han sido explotadas para producir potentes herramientas biomoleculares, y agentes antisentido y antigénicos, sondas moleculares y biosensores. Por "molécula de ADN recombinante" o "gen quimérico" se entiende un ADN híbrido producido por la unión de fragmentos de ADN de diferentes fuentes. Por "secuencia heteróloga de nucleótidos" se pretende una secuencia que no es de origen natural con la secuencia promotora. Aunque esta secuencia de nucleótidos es heteróloga a la secuencia del promotor, puede ser homóloga, o nativa, o heteróloga, o foránea, a la planta huésped. "Cadena sentido" se refiere a la cadena de una molécula de ADN bicatenario que es homóloga a una transcripción de ARNm de la misma. La "cadena antisentido" contiene una secuencia invertida, que es complementaria a aquella de la "cadena sentido".

Una "secuencia de codificación" o un "marco de lectura abierto" u "ORF" se definen como una secuencia de nucleótidos que pueden ser transcritos en ARNm y/o traducido en un polipéptido cuando se pone bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas, es decir, cuando dicha secuencia de codificación u ORF está presente en un formato expresable. Dicha secuencia de codificación del ORF está delimitada por un codón de iniciación de traducción 5’ y un codón de detención de la traducción 3’. Una secuencia de codificación o ORF pueden incluir, pero no se limita a ARN, ARNm, ADNc, secuencias de nucleótidos recombinantes, secuencias de nucleótidos fabricadas sintéticamente o ADN genómico. Dicha secuencia de codificación de u ORF puede ser interrumpida por secuencias de ácido nucleico intervinientes. Los genes y las secuencias de codificación que esencialmente codifican la misma proteína pero aislada de diferentes fuentes pueden consistir de secuencias de ácido nucleico sustancialmente divergentes. Recíprocamente, las secuencias de ácidos nucleicos sustancialmente divergentes pueden ser diseñadas para efectuar la expresión de esencialmente la misma proteína. Dichas secuencias de ácido nucleico son el resultado de, por ejemplo, la existencia de diferentes alelos de un gen dado, o de la degeneración del código genético o de las diferencias en el uso de codones. Así, como se indica en la Tabla 3, aminoácidos tales como metionina y triptófano son codificados por un solo codón mientras que otros aminoácidos tales como arginina, leucina y serina pueden ser cada uno traducidos a partir hasta de seis codones diferentes. Las diferencias en el uso de un codón preferido se ilustran a continuación para Agrobacterium tumefaciens (una bacteria), Arabidopsis thaliana, M. sativa (dos plantas dicotiledóneas) y Oryza sativa (una planta monocotiledónea). Estos ejemplos se extrajeron de (Http://www.kazusa.or.jp/codon). Para dar un ejemplo, el codón GGC (para glicina) es el codón más frecuentemente utilizado en Agrobacterium tumefaciens (36,2‰), es el segundo codón más frecuentemente utilizado en Oryza sativa, pero se utiliza mucho menos frecuentemente en Arabidopsis thaliana y M. sativa (9‰ y 8,4‰, respectivamente). De los cuatro posibles codones que codifican glicina (véase la Tabla 3), dicho codón GGC se utiliza más preferiblemente en Agrobacterium tumefaciens y Oryza sativa. Sin embargo, en Arabidopsis thaliana este es el codón GGA (y GGU) mientras que en M. sativa este es el codón GGU (y GGA). Las variantes alélicas se definen además por incluir polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP), así como polimorfismos pequeños de inserción / supresión (los INDEL; el tamaño de los INDEL suele ser inferior a 100 pb). Los SNP y los INDEL forman el mayor conjunto de variantes de secuencia en cadenas polimórficas de origen natural de la mayoría de los organismos. Son útiles en el mapeo de genes y en el descubrimiento de genes y las funciones de los genes. Además, son útiles en la identificación de los loci genéticos, por ejemplo, genes de plantas, que intervienen en los procesos determinantes tales como la tasa de crecimiento, el tamaño de la planta y el rendimiento de la planta, el vigor de la planta, la resistencia a enfermedades, la tolerancia al estrés, etc.

Tabla 3. La degeneración del código genético.

Aminoácido

Código de tres letras Código de una letra Codones posibles

Alanina

Ala A GCA GCC GCG GCU

Arginina

Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU

Asparagina

Asn N AAC AAU

�?cido Aspártico

Asp D GAC GAU

Cisteína

Cys C UGC UGU

�?cido Glutámico

Glu E GAA GAG

Glutamina

Gln Q CAA CAG

Glicina

Gly G GGA GGC GGG GGU

Histidina

His H CAC CAU

Isoleucina

Ile I AUA AUC AUU

Leucina

Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU

Lisina

Lys K AAA AAG

Metionina

Met M AUG

Fenilalanina

Phe F UUC UUU

Prolina

Pro P CCA CCC CCG CCU

Serina

Ser S AGC AGU UCA UCC UC G UCU

Treonina

Thr T ACA ACC ACG ACU

Triptófano

Trp W UGG

Tirosina

Tyr Y UAC UAU

Valina

Val V GUA GUC GUG GUU

Posibles codones de “DETENCIÓN”

UAA

UAG UGA

5 Muchas técnicas están disponibles en la actualidad para identificar los SNP y / o los INDEL incluyendo (i) PCR seguida por cromatografía líquida de alto rendimiento desnaturalizante (DHPLC; por ejemplo, Cho et al. 1999), (ii) electroforesis capilar desnaturalizante constante (CDCE), combinada con PCR de alta fidelidad (por ejemplo, Li-Sucholeiki et al. 1999.), (iii) electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (por ejemplo, Fischer y Lerman, 1983), (iv) espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorción / ionización láser asistido por matriz (MALDI

10 TOF MS; por ejemplo, Ross et al. 2000);. (v) ensayos de PCR con monitoreo de fluorescencia en tiempo real (por ejemplo, Tapp et al. 2000);. (vi) tecnología en gel AcryditeTM (por ejemplo, Kenney et al. 1998);. (vii) técnica de huellas con el ciclo del didesoxi (CddF; por ejemplo Langemeier et al. 1994), (viii) análisis de polimorfismo de conformación monocatenaria (SSCP) (por ejemplo, Vidal-Puig y Moller, 1994) y (ix) reacción de extensión del cebador por minisecuenciación (por ejemplo, Syvanen 1999). La técnica de "detección de lesiones locales inducidas en los genomas" (TILLING;. McCallum et al. 2000a,b), que es una variante de (i) ver más arriba, también se puede aplicar para identificar rápidamente un gen alterado, por ejemplo en plantas químicamente mutadas que muestran fenotipos interesantes.

"Hibridación" es el proceso en el que secuencias de nucleótidos complementarias sustancialmente homólogas hibridan entre sí. El proceso de hibridación puede producirse totalmente en solución, es decir, ambos ácidos nucleicos complementarios están en solución. Las herramientas en la biología molecular que dependen de tal proceso incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; y todos los métodos basados en la misma), la hibridación sustractiva, la extensión aleatoria del cebador, el mapeo con nucleasa S1, la extensión del cebador, la transcripción inversa, la síntesis de ADNc, despliegue diferencial de los ARN, y determinación de la secuencia de ADN. El proceso de hibridación también puede presentarse con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados en una matriz tal como perlas magnéticas, perlas de Sefarosa o cualquier otra resina. Las herramientas en la biología molecular que dependen de tal proceso incluyen el aislamiento del ARNm con cola de poli (A+). El proceso de hibridación puede presentarse además con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizado a un soporte sólido tal como una membrana de nylon o de nitrocelulosa o inmovilizado por ejemplo por medio de fotolitografía, por ejemplo a un soporte de vidrio silíceo (este último se conoce como arreglos o microarreglos de ácido nucleico o como chips de ácido nucleico). Las herramientas de biología molecular que dependen de este proceso incluyen análisis de transferencias en gel de ARN y ADN, hibridación de colonias, hibridación en placa, hibridación in situ e hibridación de microarreglos. A fin de permitir que se produzca la hibridación, generalmente se desnaturalizan térmica o químicamente las moléculas de ácido nucleico para fundir una cadena doble en dos cadenas simples y / o para remover horquillas u otras estructuras secundarias de ácidos nucleicos monocatenarios. La rigurosidad de la hibridación está influenciada por condiciones tales como la temperatura, la concentración salina y la composición del amortiguador de hibridación. Las condiciones de alta rigurosidad para hibridación incluyen alta temperatura y / o baja concentración salina (las sales incluyen NaCl y citrato de Na3) y / o la inclusión de formamida en el amortiguador de hibridación y / o la disminución de la concentración de compuestos tales como SDS (detergente) en el amortiguador de hibridación y / o la exclusión de compuestos tales como sulfato de dextrano o polietilén glicol (que promueven la aglomeración molecular) del amortiguador de hibridación. Las condiciones convencionales de hibridación son descritas, por ejemplo por (Sambrook et al. 1989), pero una persona capacitada se dará cuenta que se pueden diseñar numerosas condiciones de hibridación diferentes en función de la homología conocida o esperada y / o de la longitud de la secuencia de ácido nucleico. Con la expresión, que hibrida específicamente, se entiende que hibrida bajo condiciones estrictas. Se prefieren particularmente condiciones de hibridación de rigurosidad suficientemente baja para aislar ácidos nucleicos heterólogos a las secuencias de ADN de la invención definidas más arriba. Los elementos que contribuyen a dicha heterología incluyen alelismo, degeneración del código genético y diferencias en el uso del codón preferido como se discute más arriba.

En consecuencia, la presente invención también está relacionada con el uso de las secuencias de ADN de la invención que codifican los polipéptidos de azúcar de remolacha de la invención, homólogos, derivados y / o fragmentos inmunológicamente activos de los mismos tal como se define más arriba en cualquiera de los método de hibridación. La presente memoria descriptiva se refiere también además a secuencias de ADN que hibridan con dichas secuencias de ADN de la invención.

Las secuencias de ADN de la invención pueden ser interrumpidas por secuencias intervinientes. Por "secuencias intervinientes" se entiende cualquier secuencia de ácido nucleico que interrumpe una secuencia de codificación que contiene dicha secuencia de ADN de la invención o que interrumpe el formato expresable de una secuencia de ADN que contiene dicha secuencia de ADN de la invención. La remoción de la secuencia interviniente restaura dicha secuencia de codificación o dicho formato expresable. Los ejemplos de secuencias intervinientes incluyen intrones, secuencias de ADN que pueden ser movilizadas tales como transposones y etiquetas de ADN tales como por ejemplo un ADN-T. Por "secuencia de ADN que puede ser movilizada" se entiende cualquier secuencia de ADN que pueden ser movilizada como resultado de un evento de recombinación.

Para efectuar la expresión de una proteína en una célula, tejido u órgano, preferentemente de origen vegetal, o bien la proteína puede ser introducida directamente en dicha célula, por ejemplo mediante microinyección o un medio balístico o, alternativamente, una molécula aislada de ácido nucleico que codifica dicha proteína puede ser introducida en dicha célula, tejido u órgano en un formato expresable.

Preferiblemente, la secuencia de ADN de la invención comprende una secuencia de codificación o un marco de lectura abierto (ORF) que codifica los polipéptidos de la remolacha azucarera de la invención o un homólogo o derivado de los mismos o un fragmento inmunológicamente activo de los mismos tal como se define más arriba.

Por "vector" o "secuencia del vector" se entiende una secuencia de ADN, que puede ser introducida en un organismo por medio de transformación y puede ser mantenida en forma estable en dicho organismo. El mantenimiento del vector es posible por ejemplo, en cultivos de E. coli, Agrobacterium tumefaciens, Saccharomyces cerevisiae o Schizosaccharomyces pombe. Otros vectores tales como fagémidos y vectores cósmidos pueden ser mantenidos y multiplicados en bacterias y / o en virus. Las secuencias del vector comprenden generalmente un conjunto de sitios únicos reconocidos por las enzimas de restricción, el sitio de clonación múltiple (MCS), en donde una o más secuencia que no son del vector puede ser insertadas.

Por "secuencia que no es de vector" se entiende en consecuencia una secuencia de DNA que está integrada en uno

o más de los sitios del MCS incluido dentro de un vector.

Los "vectores de expresión" forman un subconjunto de vectores que, por el hecho de contener las secuencias reguladoras apropiadas que permiten la creación de un formato expresable para la(s) secuencia(s) que no es(son) de vector, permiten así la expresión de la proteína codificada por dicha(s) secuencia(s) que no es(son) de vector. Se conocen vectores de expresión en el arte que permiten la expresión de un gen, proteína, en organismos incluidos bacterias (por ejemplo, Escherichia coli), hongos (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris), células de insecto (por ejemplo, vectores de expresión de baculovirus), células animales ( por ejemplo, células COS o CHO) y células vegetales (por ejemplo, vectores de expresión con base en el virus X de la patata, véase, por ejemplo Vance et al. 1998 - WO9844097). La presente invención incluye claramente cualquier vector o vector de expresión que contenga una secuencia de ADN que no sea de vector que codifique los polipéptidos, homólogo, derivados y / o fragmentos inmunológicamente activo de los mismos de la remolacha azucarera tal como se define más arriba.

Como una alternativa para la producción de proteína mediada por un vector (de expresión) en los sistemas biológicos, se puede aplicar la síntesis química de proteínas. Los péptidos sintéticos se pueden fabricar en fase de solución o en fase sólida. La síntesis de péptidos en fase sólida (Merrifield, 1963) es, sin embargo, la forma más común y consiste en la adición secuencial de aminoácidos para crear una cadena de péptido lineal. La síntesis de péptidos en fase sólida incluye ciclos que consisten de tres etapas: (i) la inmovilización del aminoácido del terminal carboxilo de la cadena peptídica en crecimiento a un soporte sólido o resina; (ii) el ensamblado de la cadena, un proceso que consiste en la activación, el acoplamiento y la desprotección del aminoácido que va a ser añadido a la cadena peptídica en crecimiento; y (iii) escisión que incluye la remoción de escisión de la cadena peptídica completa de la resina y la remoción de los grupos protectores de las cadenas laterales de aminoácidos. Los métodos comunes en la síntesis de péptidos en fase sólida incluyen Fmoc/tBu (9-fluorenilmetiloxicarbonilo/t-butilo) y Boc (tbutiloxicarbonilo) como los grupos de aminoácidos protectores del terminal amino. Los grupos protectores de la cadena lateral de aminoácidos incluyen metilo (Me), formilo (CHO), etilo (Et), acetilo (Ac), t-butilo (t-Bu), anisilo, bencilo (Bzl), trifluroacetilo (Tfa), N-hidroxisuccinimida (ONSu, OSu), benzoílo (Bz), 4-metilbencilo (Meb), tioanizilo, tiocresilo, benciloximetilo (Bom), 4-nitrofenilo (ONp), benciloxicarbonilo (Z), 2-nitrobenzoilo (NBz), 2-nitrofenilsulfenilo (Nps), 4-toluenosulfonilo (Tosilo, Tos), pentafluorofenilo (Pfp), difenilmetilo (Dpm), 2-clorobenciloxicarbonilo (Cl-Z), 2,4,5-triclorofenilo, 2-bromobenciloxicarbonilo (Br-Z), trifenilmetilo (tritilo, Trt), y 2,5,7,8-pentametil-cromo-6-sulfonilo (Pmc). Durante el ensamblado de la cadena, se remueven Fmoc o Boc lo que resulta en un terminal amino activado del residuo de aminoácido enlazado a la cadena en crecimiento. El terminal carboxilo del aminoácido entrante se activa por conversión en un éster altamente reactivo, por ejemplo, por HBTU. Con las tecnologías actuales (por ejemplo, el sintetizador Biosystems 9050 de PerSeptive, el sintetizador de péptidos Modelo 431 de Applied Biosystems), se pueden fabricar péptidos lineales de hasta 50 residuos. Una serie de directrices está disponible para producir péptidos que son adecuadas para uso en sistemas biológicos incluyendo (i) la limitación del uso de aminoácidos difíciles tales como Cys, Met, Trp (fácilmente oxidados y/o degradados durante la síntesis de péptidos)

o Arg; (ii) minimizar los aminoácidos hidrófobos (que pueden perjudicar la solubilidad del péptido), y (iii) evitar un ácido glutámico en el terminal amino (puede formar un ciclo de Piroglutamato).

Por "formato expresable" se entiende que la molécula aislada de ácido nucleico está en una forma adecuada para ser transcrita en ARNm y/o traducida para producir una proteína, ya sea constitutivamente o después de inducción por medio de una señal intracelular o extracelular, tales como un estímulo ambiental o estrés (mitógenos, anoxia, hipoxia, temperatura, salinidad, luz, deshidratación, etc.) o un compuesto químico tal como IPTG (isopropil--Dtiogalactopiranósido) o como un antibiótico (tetraciclina, ampicilina, rifampicina, kanamicina), una hormona (por ejemplo, giberelina, auxina, citoquinina, glucocorticoides, brasinoesteroides, etileno, ácido abscísico, etc.), análogos de hormona (ácido yodoacético (IAA), 2,4-D, etc), un metal (zinc, cobre, hierro, etc.), o dexametasona , entre otros. Como lo saben aquellos capacitados en la técnica, la expresión de una proteína funcional también puede requerir de una o más modificaciones post-traduccionales, tales como glicosilación, fosforilación, desfosforilación, o una o más interacciones proteína-proteína, entre otros. Todos estos procesos se encuentran incluidos dentro del alcance del término "formato expresable".

Preferiblemente, la expresión de una proteína en una célula, tejido u órgano específico, preferentemente de origen vegetal, se efectúa mediante la introducción y expresión de una molécula aislada de ácido nucleico que codifica dicha proteína, tal como una molécula de ADNc, un gen genómico, una molécula sintética de oligonucleótido, una molécula de ARNm o un marco de lectura abierto, a dicha célula, tejido u órgano, en donde dicha molécula de ácido nucleico se coloca operativamente en conexión con secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo un promotor, preferiblemente un promotor expresable en plantas, y una secuencia de terminación.

"Secuencia Reguladora" se refiere a secuencias de ADN de control, que son necesarias para afectar la expresión de secuencias de codificación a las cuales están ligadas. La naturaleza de tales secuencias de control es diferente dependiendo del organismo huésped. En procariotas, las secuencias de control incluyen generalmente promotores, sitios de enlazamiento ribosomal y terminadores. En eucariotas en general, las secuencias de control incluyen promotores, terminadores y reforzadores o silenciadores. El término "secuencia de control" se pretende que incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también pueden incluir componentes adicionales convenientes que determinan cuándo, cuánto y donde se expresa un gen específico.

La referencia que se hace aquí a un "promotor" debe ser tomada en su contexto más amplio e incluye las secuencias reguladoras de la transcripción derivadas de un gen genómico eucariota clásico, incluyendo la caja TATA que se requiere para la iniciación exacta de la transcripción, con o sin una secuencia de caja CCAAT y elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias activadoras secuencia arriba, reforzadores y silenciadores) que alteran la expresión génica en respuesta a los estímulos externos y/o de desarrollo, o en una forma específica del tejido.

Las secuencias reguladoras en este documento también se refieren a cualquier del grupo que contiene un promotor, reforzador, silenciador, secuencia del intrón, región 3'UTR y / o 5'UTR, proteína y / o elementos estabilizadores del ARN.

El término "promotor" incluye también las secuencias reguladoras de la transcripción de un gen procariota clásico, en cuyo caso pueden incluir una secuencia de caja -35 y / o secuencias reguladoras transcripcionales de caja -10.

El término "promotor" también se utiliza para describir una molécula sintética o de fusión o un derivado, que confiere, activa o mejora la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano.

Promotores pueden contener copias adicionales de uno o más elementos reguladores específicos, para mejorar aún más la expresión y / o para alterar la expresión espacial y / o la expresión temporal de una molécula de ácido nucleico a la que está conectado operativamente. Tales elementos reguladores pueden colocarse en forma adyacente a una secuencia de un promotor heterólogo para conducir la expresión de una molécula de ácido nucleico en respuesta por ejemplo al cobre, a glucocorticoides, a la dexametasona, a la tetraciclina, a la giberelina, a AMPc, al ácido abscísico, a auxinas, a lesiones, al etileno, al jasmonato o al ácido salicílico o para conferir expresión de una molécula de ácido nucleico a células, tejidos u órganos específicos, tales como meristemos, hojas, raíces, embriones, flores, semillas o frutos. En el contexto de la presente invención, el promotor es preferiblemente una secuencia del promotor expresable en plantas. Los promotores, sin embargo, que también funcionan o únicamente funcionan en las células no vegetales tales como bacterias, células de levadura, células de insecto y células animales no están excluidos de la invención. Por "expresable en plantas" se entiende que la secuencia del promotor, incluyendo cualquiera de los elementos reguladores adicionales añadidos o contenidos en el mismo, es al menos capaz de inducir, de conferir, de activar o de mejorar la expresión en una célula vegetal, tejido u órgano, preferiblemente en una células, tejido u órgano de una planta monocotiledónea o dicotiledónea.

Los términos "operable de una planta" y "operable en una planta" cuando se usan aquí, respecto de una secuencia promotora, se entenderá que son equivalentes a una secuencia del promotor expresable en una planta.

En el presente contexto, un "promotor regulado" o una "secuencia regulable del promotor" es un promotor que es capaz de conferir expresión sobre un gen estructural en una célula, tejido u órgano particular o grupo de células, tejidos u órganos de una planta, opcionalmente bajo condiciones específicas, sin embargo generalmente no confieren expresión en toda la planta bajo todas las condiciones. En consecuencia, una secuencia regulable del promotor puede ser una secuencia del promotor que confiere expresión sobre un gen al que está conectado operativamente en un lugar particular dentro de la planta o, alternativamente, en toda la planta bajo un conjunto específico de condiciones, tales como después de la inducción de la expresión génica por parte de un compuesto químico u otro suscitador. Preferiblemente, el promotor regulable utilizado en la realización de la presente invención confiere expresión en un lugar específico dentro de la planta, ya sea constitutivamente o después de la inducción, no obstante, no en toda la planta bajo ninguna circunstancia. Se incluyen dentro del ámbito de tales promotores secuencias promotoras específicas de la célula, secuencias promotoras específicas del tejido, secuencias promotoras específicos del órgano, secuencias promotoras de un gen específico del ciclo celular, secuencias promotoras inducibles y secuencias promotoras constitutivas que han sido modificadas para conferir expresión en una parte determinada de la planta en cualquier momento, tal como mediante la integración de dicho promotor constitutivo dentro de un elemento genético transponible (Ac, Ds, Spm, En, u otro transposón). Aquellos capacitados en el arte serán conscientes de que un "promotor inducible" es un promotor cuya actividad transcripcional se incrementa o induce en respuesta a un estímulo de desarrollo, químico, ambiental o físico. De manera similar, la persona capacitada comprenderá que un "promotor constitutivo" es un promotor que es transcripcionalmente activo en la mayor parte, pero no necesariamente en todas las partes de un organismo, preferiblemente una planta, durante la mayor parte, pero no necesariamente durante todas las fases de su crecimiento y desarrollo.

Generalmente por "promotor débil" se entiende un promotor que dirige la expresión de una secuencia de codificación en un nivel bajo. Por un "nivel bajo" se entiende en niveles de aproximadamente de 1/10.000 de transcripciones hasta aproximadamente 1/100.000 de transcripciones, hasta aproximadamente 1/500.0000 de transcripciones. Por el contrario, un "promotor fuerte" dirige la expresión de una secuencia de codificación a un nivel alto, o aproximadamente desde 1/10 de transcripciones hasta aproximadamente 1/100 de transcripciones, hasta aproximadamente 1/1.000 de transcripciones.

El término "específico de la célula" se entenderá que indica que la expresión es predominantemente en una célula particular o tipo de célula, preferiblemente de origen vegetal, aunque no necesariamente exclusivamente en dicha célula o tipo de célula.

Asimismo, el término "específico del tejido" se entenderá que indica que la expresión es predominantemente en un tejido particular o tipo de tejido, preferentemente de origen vegetal, aunque no necesariamente exclusivamente en dicho tejido o tipo de tejido.

Asimismo, el término "específico del órgano" se entenderá que indica que la expresión es predominantemente en un órgano particular, de preferencia de origen vegetal, aunque no necesariamente de forma exclusiva en dicho órgano. "Específico de la raíz" significa que el promotor se expresa en la raíz únicamente y no en otros tejidos de la planta.

Por "preferido de la raíz" se pretende que la expresión de la secuencia heteróloga de nucleótidos es más abundante en la raíz, pero también podría tener bajos niveles de expresión en otros lugares de la planta. Aunque un cierto nivel de expresión de la secuencia heteróloga de nucleótidos se produce en otros tipos de tejidos vegetales, la expresión se produce más abundantemente en la raíz incluyendo raíces primarias, laterales y adventicias.

Por "raíz" se entiende cualquier parte de la estructura de la raíz, que comprende la cima de la raíz, el meristemo apical, el protodermo, el meristemo del suelo, el procambium, la endodermis, la corteza, la corteza vascular, la epidermis, y similares.

El término "específico del ciclo celular" se entenderá que indica que la expresión es predominantemente cíclica y que se producen en una o más, no necesariamente fases consecutivas del ciclo celular aunque no necesariamente de forma exclusiva en el ciclo de las células, preferiblemente de origen vegetal.

Colocando una molécula de ácido nucleico bajo el control regulador de una secuencia promotora, o en relación operativa con una secuencia promotora significa el posicionamiento dicha molécula de ácido nucleico de tal manera que la expresión está controlada por la secuencia promotora. Un promotor está generalmente, pero no necesariamente, situado secuencia arriba, o en el extremo 5', y dentro de 2 kb del sitio de inicio de la transcripción, de la molécula de ácido nucleico que regula. En la construcción de combinaciones de un promotor heterólogo / un gen estructural se prefiere generalmente posicionar al promotor a una distancia del sitio de comienzo de la transcripción del gen que sea aproximadamente la misma que la distancia entre ese promotor y el gen que controla en su entorno natural (es decir, el gen del cual se deriva el promotor). Como es conocido en la técnica, se puede hacer alguna variación en esta distancia sin pérdida de la función del promotor. Del mismo modo, el posicionamiento preferido de un elemento de la secuencia reguladora con respecto a un gen heterólogo que va a ser colocado bajo su control, se define por medio del posicionamiento del elemento en su entorno natural (es decir, el gen del que se deriva). De nuevo, como se conoce en la técnica, se puede presentar también alguna variación en esta distancia.

"Expresión" significa la producción de una proteína o una secuencia de nucleótidos en la misma célula o en un sistema libre de células. Incluye la transcripción en un producto de ARN, la modificación post-transcripcional y / o la traducción en un producto de proteína o polipéptido a partir de un ADN que codifica ese producto, así como posibles modificaciones post-traduccionales.

"Operativamente enlazado" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Una secuencia de control "operativamente enlazada" a una secuencia de codificación está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia de codificación se logra bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. En caso de que la secuencia de control sea un promotor, es obvio para una persona experta que se utiliza preferentemente ácido nucleico bicatenario.

Los ejemplos de promotores adecuados para su uso en construcciones génicas de la presente invención incluyen a aquellos enlistados en la Tabla 4, entre otros. Los promotores enlistados en la Tabla 4 se proporcionan para que sirvan únicamente como ejemplo y la presente invención no está limitada por la lista proporcionada allí.

En el caso de promotores constitutivos o de promotores que inducen la expresión a través de toda la planta, se prefiere que tales secuencias sean modificadas por medio de la adición de secuencias de nucleótidos derivadas de uno o más de los promotores específicos del tejido enlistados en la Tabla 4, o, alternativamente, las secuencias de nucleótidos derivadas de uno o más de los promotores inducibles específicos de tejido mencionados anteriormente, 5 para conferirles la especificidad del tejido. Por ejemplo, el promotor 35S del CaMV puede ser modificado por medio de la adición de la secuencia promotora del maíz ADH1, para conferirle expresión específica de la raíz regulada anaeróbicamente, como se ha descrito previamente (Ellis et al. 1987). Otro ejemplo describe cómo conferir abundante expresión génica de raíz o específica de la raíz por fusión del promotor 35S del CaMV con el gen GRP3 de proteína rica en glicina de maíz (Feix y Wulff 2000 - WO0015662). Tales modificaciones se puede lograr

10 mediante experimentación rutinaria por parte de los expertos en la técnica.

El término "terminador" se refiere a una secuencia de ADN en el extremo de una unidad transcripcional que señala la terminación de la transcripción. Los terminadores son secuencias de ADN 3’ no traducidas que contienen una señal de poliadenilación, que facilita la adición de secuencias de poliadenilato al extremo 3' de un transcrito primario. Los terminadores activos en células derivadas de virus, levaduras, mohos, bacterias, insectos, aves, mamíferos y plantas

15 son conocidos y están descritos en la literatura. Ellos pueden ser aislados a partir de bacterias, hongos, virus, animales y / o plantas.

Los ejemplos de terminadores particularmente adecuados para su uso en las construcciones génicas de la presente invención incluyen al terminador del gen para la nopalina sintasa (NOS) de Agrobacterium tumefaciens, la secuencia terminadora del gen para la octopina sintasa (OCS) de Agrobacterium tumefaciens, la secuencia terminadora del

20 gen para 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), la secuencia terminadora para ADP-glucosa pirofosforilasa de Oryza sativa (t3'Bt2), la secuencia terminadora del gen para zeína de Zea mays, el terminador del gen rbcs-1A, y las secuencias terminadoras del gen rbcs-3A, entre otras.

Las personas capacitadas en el arte estarán fácilmente en posición para proporcionar promotores y terminadores adicionales que son útiles en la realización de la presente invención.

25 Tabla 4. Ejemplos de promotores expresables en plantas para uso en la realización de la presente invención

I: PROMOTORES ESPEC�?FICOS DE LA CÉLULA, ESPEC�?FICOS DE TEJIDO, Y ESPEC�?FICOS DE ÓRGANOS

FUENTE DEL GEN

PATRON DE EXPRESIÓN REFERENCIA

a-amilasa (Amy32b)

aleurona Lanahan et al, Plant Cell 4: 203 - 211, 1992; Skriver et al, Proc Natl Acad Sci USA 88: 7266 - 7270,

Gen tipo catepsina �

aleurona Cejudo et al, Plant Mol Biol 20: 849 856, 1992

rolB de Agrobacterium rhizogenes

cambium Nilsson at al, Physiol Plant 100: 456 462, 1997

AtPRP4

flores http://salus.medium.edu/mmg/tierney/ht ml

chalcona sintasa (chsA)

flores Van der Meer et al, Plant Mol Biol 15: 95 - 109, 1990

LAT52

antera Twell et al, Mol Gen Genet 217: 240 245, 1989

apetala-3

flores

quitinasa

fruta (bayas, uvas, etc.) Thomas et al. CSIRO Plant Industry, Urrbrae, South Australia, Australia; http://winetitles.com.au/ gwrdc/csh95-1.html

rbcs-3A

Tejido verde (por ejemplo hoja) Lamat al, Plant Cell 2: 857 - 866, 1990; Tucker et al., Plant Physiol 113: 1303 1308, 1992

Genes específicos de la hoja

hoja Baszczynski et al, Nucl Acid Res 16: 4732, 1988

AtPRP4

hoja http://salus.medium.edu/mmg/tierney/ht ml

promotor del gen para adenina metil transferasa del virus de chlorella

hoja Mitra and Higgins, Plant Mol Biol 26: 85 - 93, 1994

promotor del gen del arroz aldP

hoja Kagaya et al, Mol Gen Genet 248: 668 674, 1995

(continuación) (continuación) (continuación) (continuación)

I: PROMOTORES ESPEC�?FICOS DE LA CÉLULA, ESPEC�?FICOS DE TEJIDO, Y ESPEC�?FICOS DE ÓRGANOS

FUENTE DEL GEN

PATRON DE EXPRESIÓN REFERENCIA

promotor rbcs de arroz o tomate

hoja Kyozuka et al, Plant Physiol 102: 9911000, 1993

cab-6 de pino

hoja Yamamotoet al, Plant Cell Physiol 35: 773 - 778, 1994

promotor del rubisco

hoja

cab (proteína enlazante/clorofila a/b)

hoja

gen Blec4 del guisante

Tejidos epidérmicos florales y vegetativos Mandaci and Dobres, Plant Mol Biol 34: 961 - 965

SAM22

hoja senescente Crowell et al, Plant Mol Biol 18: 459 466, 1992

gen ltp (gen de transferencia de lípidos)

Fleming et al, Plant J 2: 855 - 862, 1992

gen nif de R. japonicum

nódulo United States Patent No 4 803165

gen nifH de B. japonicum

nódulo United States Patent No 5008194

GmENOD40

nódulo Yang et al, Plant J 3: 573 - 585, 1993

PEP carboxilasa (PEPC)

nódulo Pathirana et al, Plant Mol Biol 20: 437 - 450, 1992

leghemoglobina (Lb)

nódulo Gordon et al, J Exp Bot 44: 1453 - 1465, 1993

gen del virus Tungro baciliforme

floema Bhattacharyya-Pakrasi et al, Plant J 4: 71 - 79,1992

genes específicos del polen

polen; microesporas Albani et al, Plant Mol Biol 15: 605, 1990; Albani et al, Plant Mol Biol 16: 501, 1991

Zm13

polen Guerrero et al, Mol Gen Genet 224: 161 - 168,1993

gen apg

microesporas Twell et al, Sex Plant Reprod 6: 217 - 224, 1993

gen específico del polen de maíz

polen Hamilton et al, Plant Mol Biol 18: 211 - 218, 1992

gen expresado en polen de girasol

polen Baltz et al, Plant J 2: 713 - 721, 1992

gen específico de polen de B. napus

polen; antera; tapetum Amoldoet al,JCellBiochem,Abstract No. Y101, 204, 1992

genes expresables en la raíz

raíces Tingey et al, EMBO J 6: 1, 1987

gen inducible de auxina de tabaco

punta de la raíz Van der Zaal et al, Plant Mol Biol 16: 983, 1991

�-tubulina

raíz Oppenheimer et al, Gene 63:87, 1988

genes específicos de la raíz del tabaco

raíz Conkling et al, Plant Physiol 93: 1203, 1990

gen G1-3b de B. napus

raíz United States Patent No 5401836

SbPRP1

raíces Suzuki et al, Plant Mol Biol 21: 109 - 119, 1993

AtPRP1; AtPRP3

raíces; pelos radiculares http://salus.medium.edu/mmg/tierney/ht ml

gen RD2

corteza de la raíz http://www2.cnsu.edu/ncsu/research

gen TobRB7

vasculatura de la raíz http://www2.cnsu.edu/ncsu/research

AtPRP4

hojas; flores; primordios de raíces laterales http://salus.medium.edu/mmg/tierney/ht ml

genes específicos de semillas

semilla Simon et al, Plant Mol Biol 5: 191, 1985; Scofield et al, J Biol Chem 262: 12202, 1987; Baszczynski et al, Plant Mol Biol 14: 633, 1990

Albumina nueces del Brasil

semilla Pearson et al, Plant Mol Biol 18: 235 - 245, 1992

Leguminosas

semilla Ellis et al, Plant Mol Biol 10: 203 - 214, 1988

I: PROMOTORES ESPEC�?FICOS DE LA CÉLULA, ESPEC�?FICOS DE TEJIDO, Y ESPEC�?FICOS DE ÓRGANOS

FUENTE DEL GEN

PATRON DE EXPRESIÓN REFERENCIA

glutelina (arroz)

semilla Takaiwa et al, Mol Gen Genet 208: 15 - 22, 1986; Takaiwa et al, EBSLett 221: 43 - 47, 1987

zeina

semilla Matzke et al, Plant Mol Biol 14: 323 - 32 1990

napA

semilla Stalberg et al, Planta 199: 515 - 519, 1996

gluteína-1 de LMW y HMW del trigo

endospermo MolGenGenet216: 81 - 90,1989; Nucl Acids Res 17: 461 - 462, 1989

SPA de trigo

semilla Albani et al, Plant Cell 9: 171 - 184, 1997

cZ19B1, zeina de 19 kDa de maíz

semilla WO0011177

mi1ps, mioinositol-1-Pi sintasa de maíz

semilla WO0011177

a, �, y-gliadinas de trigo

endospermo EMBO J 3: 1409 - 1415, 1984

promotor ltr1 de cebada

endospermo

hordelina B1, C, D de cebada

endospermo Theor Appl Gen 98: 1253 - 1262, 1999; Plant J 4: 343 - 355, 1993; Mol Gen Genet 250: 750 - 60, 1996

DOF de cebada

endospermo Mena et al, Plant J 116: 53 - 62, 1998

blz2

endospermo EP99106056.7

promotor sintético

endospermo Vicente-Carbajosa et al, Plant J 13: 629 - 640, 1998

prolamina NRP33 de arroz

endospermo Wu et al, Plant Cell Physiol 39: 885 - 889, 1998

a-globulina Glb-1 de arroz

endospermo Wu et al, Plant Cell Physiol 39: 885 - 889, 1998

genes END de maíz

endospermo WO0012733

END1 de cebada

endospermo WO9808961

NUC1 de cebada

nucela WO9808961

OSH1 de arroz

embrión Sato et al, Proc Natl Acad Sci USA 93: 8117 - 8122, 1996

REB/OHP-1 a-globulina del arroz

endospermo Nakase et al, Plant Mol Biol 33: 513 - 522, 1997

PP glucosa ADP de arroz

endospermo Trans Res 6: 157 - 168, 1997

Familia del gen ESR de maíz

endospermo Plant J 12: 235 - 246, 1997

y-kafirina de sorgo

endospermo Plant Mol Biol 32: 1029 - 1035, 1996

KNOX

embrión Postma-Haarsma et al, Plant Mol Biol 39: 257 - 271, 1999

oleosina de arroz

embrión y aleurona Wu et al, J Biochem 123: 386, 1998

oleosina de girasol

semilla (embrión y semilla seca) Cummins et al, Plant Mol Biol 19: 873 - 876, 1992

LEAFY

meristemo de brote Weigel et al, Cell 69: 843 - 859, 1992

Knat1 de Arabidopsis thaliana

meristemo de brote Número de acceso AJ131822

meristemo de brote

Número de acceso Z71981

CLAVATA1

meristemo de brote Número de acceso AF049870

genes específicos del estigma

estigma Nasrallah et al, Proc Natl Acad Sci USA 85: 5551, 1988; Trick et al, Plant Mol Biol 15: 203, 1990

gen de la patatina clase l

tubérculo Liu et al, Plant Mol Biol 153: 386 - 395, 1991

arroz PCNA

meristemo Kosugi et al, Nucl Acids Res 19: 1571 - 1576, 1991; Kosugi and Ohashi, Plant Cell 9: 1607 - 1619, 1997

tubulina TubA1 de guisante

células en división Stotz and Long, Plant Mol Biol 41: 601 - 614, 1999

I: PROMOTORES ESPEC�?FICOS DE LA CÉLULA, ESPEC�?FICOS DE TEJIDO, Y ESPEC�?FICOS DE ÓRGANOS

FUENTE DEL GEN

PATRON DE EXPRESIÓN REFERENCIA

cdc2A de Arabidopsis

células del ciclo Chung y Parish, FEBS Lett 362: 215 - 219, 1995

Rop1A de Arabidopsis

Anteras; polen maduro + tubos de polen Li et al, Plant Physiol 118: 407 - 417, 1998

AtDMC1 de Arabidopsis

Asociado a la meiosis Klimyuk y Jones, Plant J 11: 1 - 14, 1997

PS-IAA4/5 y PS-IAA6 de guisantes

inducible por auxina Wong et al, Plant J 9: 587 - 599, 1996

farnesiltransferasa de guisante

Tejidos de meristemo; tejidos que crecen cerca del floema; represados por luz y azúcar Zhou et al, Plant J 12: 921 - 930,1997

Ciclina B1;1 de Tabaco (N. sylvestris)

Células en división/tejido meristemático Trehin et al, Plant Mol.Biol. 35: 667 672, 1997

Ciclinas mitóticas CYS (tipo A) y CYM (tipo B) de Catharanthus roseus

Células en división/tejido meristemático Ito et al, Plant J 11: 983 - 992, 1997

cyc 1At (= cyc B1;1) y cyc3aAt (tipo A) de Arabidopsis

Células en división/tejido meristemático Shaul et al, Proc Natl Acad Sci USA 93: 4868 - 4872, 1996

caja del promotor tef1 de Arabidopsis

Células en división/tejido meristemático Regad et al, Mol Gen Genet 248: 703 - 711, 1995

cyc07 de Catharanthus roseus

Células en división/tejido meristemático Ito et al, Plant Mol Biol 24: 863 - 878, 1994

II: EJEMPLOS DE PROMOTORES CONSTITUTIVOS

FUENTE DEL GEN

PATRON DE EXPRESIÓN REFERENCIA

Actina

constitutivo McElroy et al, Plant Cell 2: 163 - 171, 1990

35S de CAMV

constitutivo Odell et al, Nature 313: 810 - 812, 1985

19S de CAMV

constitutivo Nilsson et al, Physiol Plant 100: 456 462, 1997

GOS2

constitutivo de Pater et al, Plant J 2: 837 - 844, 1992

ubiquitina

constitutivo Christensen et al, Plant Mol Biol 18: 675 - 689, 1992

ciclofilina de arroz

constitutivo Buchholz et al, Plant Mol Biol 25: 837 843, 1994

histona H3 de maíz

constitutivo Lepetit et al, Mol Gen Genet 231: 276 285, 1992

histona H3 de alfalfa

constitutivo Wu et al, Nucleic Acids Res 17: 3057 3063, 1989; Wu et al, Plant Mol Biol 11: 641 - 649,1988

actina 2

constitutivo An et al, Plant J 10: 107 - 121, 1996

III: EJEMPLOS DE PROMOTORES INDUCIBLES DE ESTRES

NOMBRE

ESTRÉS REFERFENCIA

P5CS (delta(1)-pirrolina-5-caroxilato sintasa)

sal, agua Zhang et al, Plant Sci 129: 81 - 89,1997

cor15a

frio Hajela et al, Plant Physiol 93: 1246 - 1252, 1990

cor15b

frío Wlihelm et al, Plant Mol Biol 23: 1073 1077, 1993

cor15b (-305 a +78 nt)

frío, sequía Baker et al, Plant Mol Biol 24: 01 - 713, 1994

rd29

sal, sequía, frío Kasuga et al, Nature Biotechnol 18: 287 - 291, 1999

III: EJEMPLOS DE PROMOTORES INDUCIBLES DE ESTRES

NOMBRE

ESTRÉS REFERFENCIA

Proteínas de choque térmico, incluidos promotores artificiales que contienen el elemento de choque térmico (HSE)

calor Barros et al, Plant Mol Biol 19 665 - 75, 1992. Marrs et al, Dev Genet 14: 27 - 41, 1993. Schoffl et al, Mol Gen Genet 217: 246 - 53, 1989

smHSP (proteínas de choque térmico pequeño)

calor Waters et al, J Exp Bot 47: 325 - 338, 1996

wcs120

frio Ouellete et al, FEBS Lett 423: 324 - 328, 1998

ci7

frío Kirch et al, Plant Mol Biol 33: 897 - 909, 1997

Adh

frío, sequía, hipoxia Dolferus et al, Plant Physiol 105: 1075 87, 1994

pwsi18

sal y sequía Joshee et al, Plant Cell Physiol 39: 64 72, 1998

ci21A

frio Schneider et al, Plant Physiol 113: 335 - 45, 1997

Trg-31

sequía Chaudhary et al, Plant Mol Biol 30: 1247 - 57, 1996

osmotina

osmótico Raghothama et al, Plant Mol Biol 23: 1117 - 28, 1993

lapA

lesiones, ambiental WO99/03977 University of California / INRA

IV: EJEMPLOS DE PROMOTORES INDUCIBLES DE PATÓGENOS

NOMBRE

PATOGENO REFERENCIA

RB7

Nematodos del nódulo de la raíz (Meloidogyne spp) US5760386 - North Carolina State University; Opperman et al, Science 263: 221 - 23, 1994

PR-1, 2, 3, 4, 5, 8, 11

hongos, virus, bacterias Ward et al, Plant Cell 3: 1085 - 1094, 1991; Reiss et al 1996; Lebel et al, Plant J 16: 223 - 233, 1998; Melchers et al, Plant J 5: 469 - 480, 1994; Lawton et al, Plant Mol Biol, 19: 735 - 743, 1992

HMG2

nematodos WO9503690 - Virginia Tech Intellectual Properties Inc.

Abi3

Nematodos de quistes (Heterodera spp) No publicado

ARM1

nematodos Barthels et al, Plant Cell 9: 2119 - 2134, 1997 WO 98/31822 - Plant Genetic Systems

Att0728

nematodos Barthels et al, Plant Cell 9: 2119 - 2134, 1997 PCT/EP98/07761

Att1712

nematodos Barthels et al, Plant Cell 9, 2119 - 2134, 1997 PCT/EP98/07761

Gst1

Diferentes tipos de patógenos Strittmatter et al, Mol Plant-Microbe Interact 9: 68 - 73, 1996

LEMMI

nematodos WO 92/21757 -Plant Genetic Systems

CLE

geminivirus PCT/EP99/03445 - CINESTAV

PDF1.2

Hongos incluyendo Alternaria brassicicola y Botrytis cinerea Manners et al, Plant Mol Biol, 38: 1071 - 1080, 1998

Thi2.1

Hongos-Fusarium oxysporum f spp matthiolae vignutelli et al, Plant J 14285 - 295, 1998

DB#226

Nematodos Bird y Wilson, Mol Plant-Microbe Interact 7: 419 - 442, 1994 WO 95.322888

DB#280

Nematodos Bird y Wilson, Mol Plant-Microbe Interact 7: 419 - 442, 1994 WO 95.322888

(continuación)

IV: EJEMPLOS DE PROMOTORES INDUCIBLES DE PATÓGENOS

NOMBRE

PATOGENO REFERENCIA

Cat2

Nematodos Niebel et al, Mol Plant-Microbe Interact 8: 371. 378, 1995

oTub

Nematodos Aristizabal et al (1996), 8th International Congress on Plant-Microbe Interaction, Knoxville US B-29

sHSP

Nematodos Fenoll et al (1997) In: Cellular and molecular aspects of plant-nematode Interactions. Kluwer Academic, C. Fenoll, F. M. W. Grundler and S.A. Ohl (Eds.),

Tsw12

Nematodos Fenoll et al (1997) En: Cellular and molecular aspects of plant-nematode Interactions. Kluwer Academic, C. Fenoll, F.M.W. Grundler and S.A Ohl (Eds.)

Hs1(pro1)

Nematodos WO 98/122335 - Jung

nsLTP

Virus, hongos, bacterias Molina and Garcia-Olmedo FEBS Lett, 318: 119 - 122,1993

RIP

Virus, hongos Turner et al, Proc Natl Acad Sci USA 94: 3866 - 3871, 1997

En el contexto de la presente memoria descriptiva, "expresión ectópica" o "sobreexpresión ectópica" de un gen o una proteína están confiriendo a los patrones de expresión y / o a los niveles de expresión de dicho gen o proteína valores que normalmente no se producen en condiciones naturales. La expresión ectópica se puede lograr de diferentes maneras, incluyendo el enlazamiento operativo de una secuencia de codificación que codifica dicha proteína con un promotor homólogo o heterólogo aislado con el fin de crear un gen quimérico y / o enlazar operativamente dicha secuencia de codificación a su propio promotor aislado (es decir, el promotor no aislado dirige naturalmente la expresión de dicha proteína) con el fin de crear una duplicación de genes recombinantes o un efecto de multiplicación de genes.

La "expresión ectópica" no sólo puede resultar en la sobreexpresión de un gen, sino también puede resultar en "reducción de la expresión", por ejemplo del gen homólogo en la planta donde se efectúa la expresión.

Por "co-expresión ectópica" se entiende la expresión ectópica o sobreexpresión ectópica de dos o más genes o proteínas. Se utilizan los mismos o, más preferentemente, diferentes promotores para conferir expresión de dichos genes o proteínas.

Preferiblemente, la secuencia del promotor utilizada en el contexto de la presente memoria descriptiva está operativamente enlazada a una secuencia de codificación o un marco de lectura abierto (ORF) que codifica uno de los polipéptidos de la remolacha azucarera de la invención o un homólogo, derivado y/o un fragmento inmunológicamente activo del mismo tal como se definió más arriba.

La "reducción de la expresión" como se usa aquí significa la disminución de los niveles de expresión génica y/o de los niveles de producto génico activo y / o de los niveles de actividad del producto génico. La disminución en la expresión puede lograrse por ejemplo, por medio de la adición de secuencias de codificación o de partes de las mismas en una orientación sentido (si resulta en co-supresión) o en una orientación antisentido con respecto a una secuencia promotora y, además, por ejemplo, por medio de mutagénesis de inserción (por ejemplo, inserción de ADN-T o inserción de un transposón) o por medio de estrategias de silenciamiento de genes como describen por ejemplo Angell y Baulcombe 1998 (WO9836083), Lowe et al. 1989 (WO9853083), Lederer et al. 1999 (WO9915682)

o Wang et al. 1999 (WO9953050). Las construcciones genéticas destinadas a silenciar la expresión génica pueden tener la secuencia de nucleótidos de dicho gen (o una o más partes del mismo) contenida allí en una orientación sentido y / o antisentido con respecto a la secuencia promotora. Otro método para reducir la expresión del gen comprende el uso de ribozimas, por ejemplo como se describe en Atkins et al. 1994 (WO9400012), Lenee et al. 1995 (WO9503404), Lutziger et al. 2000 (WO0000619), Prinsen et al. 1997 (WO9713865) y Scott et al. 1997 (WO9738116).

La modulación, incluida la disminución, del nivel de productos génicos activos o de la actividad del producto génico se puede lograr mediante la administración o exposición de las células, tejidos, órganos u organismos a dicho producto génico, un homólogo, análogo, derivado y / o un fragmento inmunológicamente activo del mismo. La inmunomodulación es otro ejemplo de una técnica capaz de reducir los niveles de producto génico activo y / o de actividad del producto génico y comprende la administración de o la exposición a o la expresión de anticuerpos a dicho producto génico a o en las células, tejidos, órganos u organismos en donde los niveles de dicho producto génico y / o actividad del producto génico van a ser modulados. Tales anticuerpos comprenden "planticuerpos", anticuerpos monocatenarios, anticuerpos IgG y anticuerpos de camello de cadena pesada, así como fragmentos de los mismos.

La modulación, incluida la disminución, del nivel de productos génicos activos o de la actividad del producto génico se puede lograr además mediante la administración o exposición de las células, tejidos, órganos u organismos a un inhibidor o activador de dicho producto génico o a la actividad de los mismos. Tales inhibidores o activadores incluyen proteínas (que contienen por ejemplo, proteinasas y quinasas) y compuestos químicos identificados de acuerdo con la presente invención como se describió más arriba.

El término "agonista" se refiere a una sustancia que puede ser o bien una protagonista o una antagonista, es decir, puede tener efectos positivos o negativos, puede ser un reforzador o un inhibidor o un modulador también.

También se describe aquí la reducción de la expresión de los genes de la remolacha azucarera de la invención tal como se definen más arriba; además la reducción de la expresión de los niveles de actividad de los polipéptidos de la remolacha azucarera de la invención mediante los polipéptidos de la remolacha azucarera de la invención ha sido definida más arriba.

Por "destino celular y / o desarrollo de la planta y / o morfología de la planta y / o bioquímica y / o fisiología" se entiende que una o más de las características de desarrollo y / o morfológicas y / o bioquímicas y / o fisiológicas de una planta se ven alteradas por la ejecución de uno o más de las etapas correspondientes a la presente memoria descriptiva. "Destino celular" se refiere al tipo de célula o a las características celulares de una célula particular que se producen durante el desarrollo de la planta o por consiguiente a un proceso celular, en particular durante el ciclo celular o como consecuencia de un proceso del ciclo celular.

El "desarrollo de la planta" o el término "característica del desarrollo e la planta" o términos similares, cuando se los utiliza, debe entenderse que significan cualquier proceso celular de una planta que está involucrado en la determinación del destino de desarrollo de una célula vegetal, en particular del tejido específico o tipo de órgano dentro del cual se desarrollará una célula progenitora. Los procesos celulares relevantes para el desarrollo de la planta serán conocidos por aquellos capacitados en el arte. Tales procesos incluyen, por ejemplo, morfogénesis, fotomorfogénesis, desarrollo de los brotes, desarrollo de las raíces, desarrollo vegetativo, desarrollo reproductivo, elongación del tallo, floración, y los mecanismos reguladores que intervienen en la determinación del destino celular, en particular, un proceso o un proceso de regulación que involucre al ciclo celular.

"Morfología de la planta" o el término "característica morfológica de la planta" u otro término similar, cuando se los utiliza aquí, se entenderá por parte de aquellos capacitados en la técnica que se refieren a la apariencia externa de una planta, incluyendo una cualquiera o más de las características estructurales o una combinación de características estructurales de las mismas. Tales características estructurales incluyen la forma, el tamaño, el número, la posición, el color, la textura, la disposición y patronamiento de cualquier células, tejido u órgano o grupos de células, tejidos u órganos de una planta, incluyendo la raíz, el tallo, la hoja, los brotes, el pecíolo, el tricoma, la flor, el pétalo, el estigma, el estilo, el estambre, el polen, el óvulo, la semilla, el embrión, el endospermo, la cubierta de la semilla, la aleurona, la fibra, el fruto, el cambium, la madera, la pulpa, el parénquima, el aerénquima, el elemento de criba, el floema o el tejido vascular , entre otros.

La "bioquímica de la planta" o el término "característica bioquímica de la planta" o un término similar, cuando se usan aquí, se entenderá por parte de aquellos capacitados en la técnica que se refieren a los procesos metabólicos y catalíticos de una planta, incluyendo el metabolismo primario y secundario y los productos de los mismos, incluyendo cualquier de las moléculas pequeñas, macromoléculas o compuestos químicos, tales como, pero sin limitarse a los almidones, azúcares, proteínas, péptidos, enzimas, hormonas, factores de crecimiento, moléculas de ácido nucleico, celulosas, hemicelulosas, callos, lectinas, fibras, pigmentos tales como las antocianinas, vitaminas, minerales, micronutrientes o macronutrientes, que son producidos por las plantas.

"Fisiología vegetal" o el término "características fisiológico de una planta" o un término similar, cuando se usan aquí, se entenderá que se refieren a los procesos funcionales de una planta, incluyendo los procesos de desarrollo tales como el crecimiento, la expansión y diferenciación, el desarrollo sexual, la reproducción sexual, la producción de semillas, el desarrollo de las semillas, el llenado del grano, la reproducción asexual, la división celular, la latencia, la germinación, la adaptación a la luz, la fotosíntesis, la expansión de la hoja, la producción de fibra, el crecimiento secundario o la producción de madera, entre otros; las respuestas de una planta a los factores aplicados desde afuera tales como metales, productos químicos, hormonas, factores de crecimiento, ambiente y factores de estrés ambiental (por ejemplo, anoxia, hipoxia, alta temperatura, baja temperatura, deshidratación, luz , la duración del día, inundaciones, salinidad, metales pesados, entre otros), incluyendo las respuestas adaptativas de las plantas a dichos factores aplicados desde afuera. El "estrés" o el "estrés ambiental" es una circunstancia causada por los elementos presentes en el medio ambiente que puede incluir pero no están limitados a sequía, salinidad, deshidratación, calor, frío, congelación, anegamiento, lesiones, estrés mecánico, estrés oxidativo, ozono, luz alta, metales pesados, privación de nutrientes, sustancias químicas tóxicas, patógenos (incluyendo virus, bacterias, hongos, insectos y nematodos) y combinaciones de éstos.

El "estrés osmótico" es cualquier tipo de estrés que altera el potencial osmótico de la célula. Por ejemplo el estrés osmótico puede ser causado por sequía o por salinidad o por congelación.

Un "estrés no ambiental" es una circunstancia causada por elementos o factores del organismo (por ejemplo, un defecto de un gen).

Como se usa aquí, "tolerancia al estrés" se refiere a la capacidad para crecer y para producir biomasa durante el estrés, la capacidad de reiniciar el crecimiento y la producción de biomasa después del estrés, y la capacidad para sobrevivir al estrés. El término "tolerancia al estrés" cubre también la capacidad de la planta para someter su programa de desarrollo durante el estrés de manera similar que bajo condiciones no estresadas, por ejemplo, para cambiar de latencia a germinación y de estado vegetativo a reproductivo bajo condiciones de estrés similares que bajo condiciones no estresadas. Además, está demostrado que los genes que protegen contra el estrés osmótico (como la trehalosa) también protegen contra el estrés oxidativo (Benaroudj et al. 2001). Por lo tanto una persona capacitada en la técnica puede asumir que cuando un gen aislado confiere tolerancia a la salinidad a un organismo huésped cuando es transfectado allí, también podría conferir tolerancia al estrés oxidativo. El estrés oxidativo se produce en situaciones de estrés por frío en combinación con luz alta o en situaciones de estrés por ozono, en el caso de la necrosis, como resultado de una infección por patógenos o lesiones, en el caso de senectud o por aplicación de ciertos herbicidas (como la atrazina o el paraquat). Dado que la función de muchos osmoprotectores es realmente desconocida y que el manitol por ejemplo, también se ha demostrado que funcionan como un eliminador de radicales de oxígeno, se puede suponer que el estrés oxidativo se produce también en caso de estrés osmótico.

Los medios para introducir ADN recombinante en tejidos vegetales o en células incluyen, pero no se limitan a, la transformación utilizando CaCl2 y variantes del mismo, en particular, el método descrito previamente (Hanahan, 1983), la absorción directa de ADN en protoplastos (Krens et al 1982; Paszkowski et al. 1984), captación mediada por PEG a los protoplastos (Armstrong et al. 1990), bombardeo con micropartículas, electroporación (Fromm et al. 1985), microinyección de ADN (Crossway et al. 1986; Fromm et al. 1985), bombardeo de micropartículas de explantes de tejidos o células (Christou et al. 1988), infiltración al vacío de tejido con ácido nucleico, o en el caso de las plantas, transferencia mediada por ADN-T de Agrobacterium al tejido de la planta como lo describen esencialmente (An et al. 1985; Dodds 1985; Herrera-Estrella et al. col 1983a; Herrera-Estrella et al. 1983b). Los métodos para la transformación de plantas monocotiledóneas son bien conocidos en la técnica e incluyen transformación mediada por Agrobacterium (Cheng et al. 1997 - WO9748814;. Hansen 1998 - WO9854961, Hiei et al. 1994 - WO9400977;. Hiei et al. 1998 - WO9817813; Rikiishi et al. 1999 - WO9904618; Saito et al. 1995 -WO9506722), bombardeo de microproyectiles (Adams et al. 1999 - US5969213; Bowen et al. 1998 - US5736369, Chang et al. 1994 - WO9413822; Lundquist et al. 1999 - US5874265/US5990390; Vasil y Vasil 1995 - US5405765; Walker et al. 1999 - US5955362), captación de ADN (Eyal et al. 1993 - WO9318168), microinyección de células de Agrobacterium (von Holt 1994 - DE4309203) y sonicación (Finer et al. 1997 - US5693512).

Para el bombardeo de células con micropartículas, una micropartícula es propulsada dentro de una célula para producir una célula transformada. Cualquier metodología adecuada balística para transformación celular y el aparato pueden ser utilizados en la realización de la presente invención. Un ejemplo de un aparato y de los procedimientos han sido divulgado por Stomp et al. (Patente de EE.UU. No. 5.122.466) y Sanford y Wolf (Patente de EE.UU. No. 4.945.050). Cuando se utilizan procedimientos balísticos de transformación, la construcción génica puede incorporar un plásmido capaz de replicarse en la célula que va a ser transformada.

Los ejemplos de micropartículas adecuadas para uso en tales sistemas incluyen esferas de oro de 1 a 5 μm. La construcción de ADN puede ser depositada sobre la micropartícula mediante cualquier técnica adecuada, tal como por medio de precipitación.

Una planta entera puede ser regenerada a partir de la célula transformada o transfectada, de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. El tejido de la planta capaz de propagación clonal posterior, ya sea por medio de organogénesis o de embriogénesis, puede ser transformado con una construcción génica de la presente invención y una planta entera regenerada a partir del mismo. El tejido particular elegido variará dependiendo de los sistemas de propagación clonal disponibles para, y más adecuados para, las especies particulares que están siendo transformadas. Los ejemplos de tejidos objetivo incluyen discos de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotiledones, megagametofitos, tejido de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristemo apical, yemas axilares, y meristemos de raíz), y tejido de meristemo inducido (por ejemplo, meristemo de cotiledón y meristemo de hipocotiledón).

El término "organogénesis", como se usa aquí, significa un proceso por medio del cual los brotes y las raíces se desarrollan de forma secuencial a partir de los centros meristemáticos.

El término "embriogénesis", como se usa aquí, significa un proceso por medio del cual los brotes y las raíces se desarrollan juntos de forma concertada (no secuencialmente), ya sea a partir de células somáticas o de gametos.

Preferiblemente, la planta es producida de acuerdo con el método divulgado aquí, es transfectada o transformada con una secuencia genética, o es susceptible a la introducción de una proteína, por cualquier medio reconocido en el arte, tales como bombardeo de microproyectiles, microinyección, transformación mediada por Agrobacterium (incluido el método de transformación de 'inmersión de flores'; (Bechtold & Pelletier, 1998; Trieu et al. 2000)), fusión de protoplastos, o electroporación, entre otros. Lo más preferible, dicha planta es producida por medio de transformación mediada por Agrobacterium.

La "plántula" es la planta juvenil que surge del embrión maduro después de la germinación de la semilla.

Por "diferenciación de una célula" se entiende que la célula desarrolla características únicas que se ocupan de una función específica. En general, la diferenciación es irreversible. La transformación mediada por Agrobacterium o la transformación agrolística de plantas, levaduras, mohos u hongos filamentosos se basa en la transferencia de una parte de las secuencias del vector de transformación, llamado el ADN-T, al núcleo y en la integración de dicho ADN-T en el genoma de dicha eucariota.

Por "Agrobacterium" se entiende un miembro de la Agrobacteriaceae, más preferiblemente Agrobacterium o Rhizobacterium y lo más preferible Agrobacterium tumefaciens.

Por "ADN-T", o el ADN transferido, se entiende que parte del vector de transformación flanqueado por bordes de ADN-T que es, después de la activación de los genes vir de Agrobacterium, amellado en los bordes del ADN-T y transferido como un ADN monocatenario al núcleo de una célula eucariota.

Cuando se utiliza aquí, con "bordes de ADN-T", "región del borde del ADN-T", o "región del borde" se entiende tanto el borde derecho del ADN-T (RB) como el borde izquierdo del ADN-T (LB). Tal borde comprende una secuencia central flanqueada por una región del borde interior como parte del ADN-T que flanquea al borde y / o una región del borde exterior como parte de la columna vertebral del vector que flanquea al borde. Las secuencias centrales contienen 22 pb en caso de vectores del tipo octopina y 25 pb en caso de vectores del tipo nopalina. Las secuencias centrales en la región del borde derecho y en la región del borde izquierdo forman repeticiones imperfectas. Las secuencias del centro del borde son indispensables para el reconocimiento y el procesamiento por parte del complejo que amella al Agrobacterium que consiste de al menos virD1 y VirD2. Las secuencias centrales que flanquean un ADN-T son suficientes para promover la transferencia de dicho ADN-T. Sin embargo, la eficiencia de la transformación utilizando vectores de transformación que portan dicho ADN-T flanqueado únicamente por dichas secuencias centrales es baja. El borde interior y las regiones exteriores se sabe que modulan la eficiencia de la transferencia del ADN-T (Wang et al. 1987). Uno elemento que mejora la transferencia del ADN-T ha sido caracterizado y reside en la región exterior del borde derecho y es llamado secuencia multiplicadora (Peralta et al, 1986;.. Van Haaren et al 1987).

Por "vector de transformación del ADN-T" o "vector del ADN-T" se entiende cualquier vector que comprende una secuencia de ADN-T flanqueada por un borde de ADN-T derecho e izquierdo que consta de al menos las secuencias centrales del borde derecho y del borde izquierdo, respectivamente, y utilizadas para la transformación de cualquier célula eucariota.

Por "secuencia de la columna vertebral del ADN-T" o "secuencias de la columna vertebral del ADN-T" se entiende todo el ADN de un vector que contiene ADN-T que se encuentra fuera de los bordes del ADN-T y, más específicamente, fuera de los sitios de mellado de las repeticiones imperfectas centrales del borde.

La presente memoria descriptiva incluye vectores optimizados de ADN-T para que la integración de la columna vertebral del vector en el genoma de una célula eucariota se minimice o esté ausente. Por "vector optimizado del ADN-T" se entiende un vector de T-ADN diseñado ya sea para disminuir o eliminar la transferencia de secuencias de la columna vertebral del vector al genoma de una célula eucariota. Tales vectores de ADN-T son conocidos por alguien familiarizado con la técnica e incluyen aquellos descritos anteriormente (Hanson et al. 1999, Stuiver et al. 1999 - WO9901563).

La presente memoria descriptiva considera claramente la inclusión de una secuencia de ADN de la presente invención que codifica un factor DBF1 de enlazamiento de DRE, un homólogo, o un derivado o un fragmento inmunológicamente activo del mismo tal como se define más arriba, en cualquier vector de ADN-T que comprende vectores binarios de transformación, vectores superbinarios de transformación, vectores de transformación integrados en forma conjunta, vectores de transformación derivados de Ri, así como en vectores que transportan al ADN-T utilizados en transformación agrolística.

Por "vector de transformación binario" se entiende un vector de transformación de ADN-T que comprende: una región de ADN-T que comprende al menos un gen de interés y / o al menos un marcador seleccionable activo en la célula eucariota para ser transformada; y una región de la columna vertebral del vector que comprende al menos orígenes de replicación activos en Escherichia coli y Agrobacterium y marcadores de selección en E. coli y Agrobacterium. Alternativamente, la replicación del vector de transformación binario en Agrobacterium depende de la presencia de un plásmido auxiliar separado. El vector binario pGreen y el plásmido auxiliar pSoup forman un ejemplo de tal sistema como se describe, por ejemplo en (Hellens et al. 2000) o como se encuentra disponible en el sitio de Internet http://www.pgreen.ac.uk.

Los bordes del ADN-T de un vector de transformación binario pueden derivarse de plásmidos Ti de tipo octopina o de tipo nopalina o de ambos. El ADN-T de un vector binario sólo se transfiere a una célula eucariota junto con un plásmido auxiliar. También se conocen en la técnica múltiples cepas de Agrobacterium como vector binario para una transformación conjunta eficiente de plantas (Bidney y Scelonge 2000 - WO0018939).

Por "plásmido auxiliar" se entiende un plásmido que se mantienen en forma estable en Agrobacterium y trasporta al menos el conjunto de genes vir necesarios para permitir la transferencia del ADN-T. Dicho conjunto de genes vir se puede derivar de cualquiera de los plásmidos Ti del tipo octopina o del tipo nopalina o de ambos.

Por "vector de transformación superbinario" se entiende un vector de transformación binario que transporta adicionalmente en la región de la columna vertebral del vector una región vir del plásmido Ti, pTiBo542, de la cepa súper virulenta A281 de Agrobacterium tumefaciens (Hiei ef al 1994 - EP0604662, Hiei et al 1995 - EP0687730). Los vectores de transformación súper binarios se utilizan junto con un plásmido auxiliar.

Por "vector de transformación integrado en forma conjunta" se entiende un vector de ADN-T que comprende al menos:

una región de ADN-T que comprende al menos un gen de interés y / o al menos un marcador seleccionable activo en plantas; y una región de la columna vertebral del vector que comprende al menos los orígenes de replicación activos en Escherichia coli y Agrobacterium, y marcadores para selección en Escherichia coli y Agrobacterium, y un conjunto de genes vir necesarios para permitir la transferencia del ADN-T.

Los bordes del ADN-T y dicho conjunto de genes vir de dicho vector de ADN-T se pueden derivar cualquiera de los plásmidos Ti del tipo octopina o del tipo nopalina o de ambos.

Por "vector de transformación de la planta derivado de Ri" se entiende un vector de transformación binario en el cual los bordes del ADN-T se derivan de un plásmido Ti y dicho vector de transformación binario que se utiliza junto con un plásmido Ri ‘auxiliar’ que transporta el conjunto necesario de genes vir.

Como se usa aquí, el término "gen marcador seleccionable" o "marcador seleccionable" o "marcador para selección" incluye cualquier gen que confiera un fenotipo en una célula en la que se expresa para facilitar la identificación y / o la selección de las células que son transfectadas o transformadas con una construcción génica de la invención o un derivado de la misma. Los genes marcadores seleccionables adecuados contemplados aquí incluyen al gen de resistencia a la ampicilina (Amp’), al gen de resistencia a la tetraciclina (Tc’), al gen bacteriano de resistencia a la kanamicina (Kan’), al gen de resistencia a la fosfinotricina, al gen de la neomicina fosfotransferasa (npfll), al gen de resistencia a la higromicina, al gen de la �-glucuronidasa (GUS), al gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), al gen de la proteína fluorescente verde (gfp) (Haseloff et al. 1997), y al gen de la luciferasa, entre otros. Por "agrolísticos", "transformación agrolística" o "transferencia agrolística" se entiende aquí un método de transformación que combina características de transformación mediadas por Agrobacterium, y de suministro de ADN biolístico. Como tal, un plásmido objetivo que contiene ADN-T es suministrado en forma conjunta con el ADN / ARN que permite la producción in planta de VirD1 y VirD2 con o sin VirE2 (Hansen & Chilton, 1996; Hansen et al. 1997, Hansen y Chilton 1997 - WO9712046).

Por "ADN foráneo" se entiende cualquier secuencia de ADN que se introduce en el genoma del huésped mediante técnicas recombinantes. Dicho ADN foráneo incluye por ejemplo una secuencia de ADN-T o una parte del mismo tal como la secuencia de ADN-T que comprende al marcador seleccionable en un formato expresable. El ADN foráneo incluye, además, secuencias de ADN intervinientes como se define más arriba.

"Célula vegetal (o de una planta)" comprende cualquier célula derivada de cualquier planta y que existe en cultivo como una célula individual, un grupo de células o un callo. Una célula vegetal puede ser también cualquier célula en una planta madura o en desarrollo en cultivo o en crecimiento en la naturaleza.

"Planta" o "plantas" incluye todas las especies de plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae. La presente invención es aplicable a cualquier planta, en particular plantas monocotiledóneas y plantas dicotiledóneas,

incluyendo un pienso o legumbre forrajera, una planta ornamental, cultivo alimenticio, árbol, arbusto seleccionado del listado que comprende Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp., Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chaenomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Diheteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehrartia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalyptus spp., Euclea schimperi, Eulalia villosa, Fagopyrum spp., Feijoa sellowiana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksii, Geranium thunbergii, Ginkgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp., Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemarthia altissima, Heteropogon contortus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hyperthelia dissoluta, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesii, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago sativa, Metasequoia glyptostroboides,Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Omithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativum, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonarthria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys verticillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea Mays, amaranto, alcachofa, espárrago, brócoli, coles de Bruselas, repollo, canola, zanahoria, coliflor, apio, col verde, lino, col rizada, lenteja, colza, okra, cebolla, patata, arroz, soja, paja, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, tomate, calabaza, y té, entre otras, o las semillas de cualquier planta específicamente mencionado arriba o un cultivo de tejido, célula u órgano de cualquiera de las especies anteriores.

"Cereal" comprende plantas de cultivo con grano comestible, por ejemplo, plantas que pertenecen a la familia de las gramíneas que se cultiva por sus granos nutritivos como la avena, la cebada, el centeno, el trigo, el arroz y el maíz, etc.

Por "ensayo del doble híbrido en levadura" se entiende un ensayo que se basa en la observación de que muchos factores de transcripción eucariotas contienen dos dominios, un dominio de enlazamiento de ADN (DB) y un dominio de activación (AD) que, cuando están físicamente separados (es decir, ruptura del enlace covalente) no efectúan la expresión del gen objetivo. Dos proteínas capaces de interactuar físicamente con una de dichas proteínas fusionadas a DB y la otra de dichas proteínas fusionada a AD volverán a unir los dominios de DB y de AD del factor de transcripción lo que resulta en la expresión del gen objetivo. El gen objetivo en el ensayo del doble híbrido en levadura es usualmente un gen reportero tal como el gen para la �-galactosidasa. La interacción entre compañeros de la proteína en el ensayo de doble híbrido en levadura puede por lo tanto ser cuantificada midiendo la actividad del producto del gen reportero (Bartel & Fields 1997). Alternativamente, se puede utilizar un sistema de doble híbrido en mamífero que incluye por ejemplo un gen reportero que codifica una proteína fluorescente verde quimérica (Shioda et al. 2000). Aún otra alternativa consiste de un sistema de doble híbrido en bacterias, que utiliza por ejemplo HIS como gen reportero (Joung et al. 2000).

El término "fragmento de una secuencia" o "parte de una secuencia", significa una secuencia truncada de la secuencia original a la cual se hace referencia. La secuencia truncada (secuencia de ácido nucleico o de proteína) puede variar ampliamente en longitud; el tamaño mínimo es el de una secuencia de tamaño suficiente para proporcionar una secuencia con al menos una actividad y/o función comparable a la de la secuencia original a la cual se hace referencia, mientras que el tamaño máximo no es crítico. En algunas aplicaciones, el tamaño máximo usualmente no es sustancialmente mayor que aquel requerido para proporcionar la actividad y / o la(s) función(es) deseada(s) de la secuencia original. Típicamente, el ácido amino truncado estará en el rango desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 333 aminoácidos o más de longitud. Más típicamente, sin embargo, la secuencia tendrá una longitud máxima de alrededor de 333 aminoácidos de longitud, preferiblemente un máximo de alrededor de 330 aminoácidos. Es usualmente deseable seleccionar secuencias de al menos aproximadamente 10, 12 ó 15 aminoácidos, ó 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 hasta un máximo de alrededor de 300 ó 325 aminoácidos. Por ejemplo, el ácido nucleico truncado corresponderá en longitud con el fragmento de aminoácidos que codifica.

Dicho compuesto o pluralidad de compuestos pueden estar contenidos, por ejemplo, en las muestras, por ejemplo, extractos de células procedentes de, por ejemplo, plantas, animales o microorganismos. Además, dicho(s) compuesto(s) puede(n) ser conocido(s) en la técnica, pero hasta ahora no sabe que sea(n) capaz(ces) de suprimir o activar proteínas que interactúan en el ciclo celular. La mezcla de reacción puede ser un extracto libre de células o puede consistir de un cultivo de células o de tejidos. Las configuraciones adecuadas para el método de la invención son conocidas por la persona capacitada en la técnica y fueron, por ejemplo, descritas en general más arriba (Alberts et al. 1994), en particular en el capítulo 17. La pluralidad de compuestos puede ser, por ejemplo, añadida a la mezcla de reacción, medio de cultivo o inyectados en la célula.

Si en el método de la invención se identifica una muestra que contiene un compuesto o una pluralidad de compuestos, entonces es posible o bien aislar el compuesto de la muestra original identificada por contener el compuesto capaz de actuar como un agonista, o se puede subdividir aún más la muestra original, por ejemplo, si se trata de una pluralidad de diferentes compuestos, para reducir el número de sustancias diferentes por muestra y repetir el método con las subdivisiones de la muestra original. Dependiendo de la complejidad de las muestras, las etapas descritas anteriormente se puede realizar varias veces, preferiblemente hasta que la muestra identificada de acuerdo con el método de la invención solamente contenga un número limitado de, o únicamente una(s) sustancia(s). Preferiblemente dicha muestra se compone de sustancias o de propiedades físicas y / o químicas similares, y lo más preferible dichas sustancias son idénticas. Preferiblemente, el compuesto identificado de acuerdo con el método descrito anteriormente o su derivado se formula adicionalmente en una forma adecuada para la aplicación en fitomejoramiento de plantas o a células de plantas y a cultivo de tejidos.

Leyendas de las figuras

Figura 1

Alineaciones de aminoácidos de BvCKA2 con la subunidad catalítica de otro CK2. El número de acceso y las fuentes de cada uno de los CK2 son las siguientes: AtCKA2 (Arabidopsis thaliana, número de acceso Q08466), ZmCKA2 (Zea mays, número de acceso P28523), RnCKA (Rattus norvergicus, número de acceso P19139), XICKA2 (Xenopus laevis, número de acceso P28020) y ScCKA2 (Saccharomyces cerevisiae, número de acceso P19454). Los aminoácidos idénticos están sombreados. Las regiones entre cajones indican importantes residuos conservados en CKII. Estos incluyen al motivo 71-DWG-73 que forma el sitio catalítico, el dominio esencial 63K y el dominio altamente básico 69-KKKKIKR-75.

Figura 2

Análisis de transferencias tipo Southern del gen BvCKA2. Se digirió el ADN genómico con Bam HI (B), Hind III (H) y Eco RI (E) y separó en un gel de agarosa al 0,8%. Se transfirió luego el ADN a una membrana de nylon y se hizo entrecruzamiento con UV. Se efectuó la hibridación bajo condiciones de alta rigurosidad (véase el ejemplo 8) utilizando dos sondas marcadas en forma radioactiva: un fragmento de 887 pb incluido en la región de codificación del ADNc de BvCKA2 (panel izquierdo), y un fragmento de 323 pb que corresponde a la región no traducida 3 del ADNc de BvCKA2 (panel derecho).

Figura 3

BvCKA2 complementa al mutante doble de levadura cka1 cka2. Se transformó la cepa de levadura YDH8 termosensible a la caseína quinasa (cka1 cka2) ya sea con el plásmido pYPGEIS-BvCKA2 (4,5,6,7) o el plásmido vacío (1,2,3) y creció a la temperatura permisiva de 25° C (izquierda) o a la temperatura termosensible de 37° C (derecha).

Figura 4

Aumento de la tolerancia al estrés por NaCl en levadura por la sobreexpresión de ScCKA2 y BvCKA2. Se transformó la cepa mutante de levadura JM26 ya sea con el plásmido vacío (pYPGE15) o los insertos que contienen al plásmido que contienen que codifican para ScCKA2 o BvCKA2. Se analizaron las células transformadas para determinar la tolerancia a la sal como se describe en el ejemplo 7. Las placas contenían medio SD con leucina, adenina y NaCl 150 mM cuando se indicó.

Figura 5

Se favoreció la expresión del gen BvCKA2 por el estrés provocado por NaCl. Se realizó un análisis tipo Northern como se describe en el ejemplo 8. Se aisló el ARN de hojas de remolacha azucarera de 3 semanas a las 0, 3, 6, 8 y 24 horas después del cultivo con (+) o sin (-) NaCl 250 mM. Se hibridó la misma transferencia del ARN con un fragmento 3' UTR de BvCKA2 y con una sonda de tubulina a 3 (AtTUBA, número de acceso M17189) de Arabidopsis usada como control de transferencia del filtro. El control de la carga de gel se realizó con colorante de bromuro de etidio y se muestra por medio de la banda de 3,5 Kb de ARNr.

Figura 6

SEQ ID NO 1 a 5: secuencias de ADN de los ácidos nucleicos de la invención; los codones de inicio y de detención están subrayados. SEC ID NO 6 a 10: secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de la invención.

Figura 7

Evaluación in vitro de la tolerancia al NaCl de Arabidopsis transgénica que expresa el ADNc del clon 154 (BcCKA2) Medio de cultivo: MS, concentraciones de NaCI: NaCl 0, 100 y 125 mM, Variables estudiadas: % de plantas con hojas verdaderas (A) y % de plantas con cotiledones (B), Número de repeticiones del experimento: 6 - 8, Número de plantas por concentración: 150 - 200, Análisis estadístico: ANOVA, Nivel de confianza: 99%.

Figura 8

Imagen de plántulas de Arabidopsis cultivadas sobre medio MS complementado con NaCl 100 mM. Las plántulas no fueron transformadas o fueron transformadas con el vector vacío pBI121 o transformadas con el ADNc del clon 145 que codifica BvCKA2.

Figura 9

Cuantificación de la incorporación de fenilalanina radiactiva en las proteínas de plantas transfectadas con BvelF-1A.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Material vegetal

Se sembraron semillas de remolacha azucarera (Beta vulgaris var. DITA) en macetas que contenían una mezcla de arena y vermiculita (1:1 p/p). Las plantas fueron cultivadas bajo condiciones de invernadero (8 horas a 20°C, 16 horas a 25° C con iluminación adicional para estimular un fotoperíodo mínimo de 12 horas). Se las irrigó periódicamente con una solución nutriente que contenía 2,4 g/l de Ca(NO3)2.4H2O, 1 g/l de KNO3 , 1 g/l de MgSO4.7 H2O, 0,3 g/l de KH2PO4, 5,6 mg/l de quelato de Fe (Kelantren, Bayer), 1,1 mg/l de ZnSO4.7H2O, 3,3 mg/l de MnO4.H2O, 0,3 mg/l de CuSO4.5H2O, 3,8 mg/l de H3BO3, 0,18 mg/l de (NH4)6Mo7.4H2O. Para la construcción de la biblioteca de ADNc, se irrigaron plantas de tres semanas de edad con NaCl 200 mM durante 24 horas antes de la cosecha. Para el análisis de transferencias tipo Northern se irrigaron las plantas con NaCl 250 mM y se recolectaron las hojas en momentos diferentes, como se indica en la leyenda para la Figura 5. Se trataron los controles de la misma manera pero se suministró H2O a los cultivos en vez de la solución de NaCl.

Ejemplo 2: Las cepas de levadura y condiciones de cultivo

Se utilizó la cepa JM26 de Saccharomyces cerevisiae (MATa leu 2-3, 3-1 trp1 112 ura-1, ade 2-1 his3-11, 15 can 1100, ENA 1-4::HIS3, nha1::TRP1) suministrada por J. M. Mulet (Universidad Politécnica de Valencia, Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas) para la selección de la biblioteca de ADNc de la remolacha azucarera y la caracterización del clon de ADNc CKA2. La cepa JM26 es un derivado de W303.1A (Wallis et al. 1989), con mutaciones nulas de los genes ENA1-4 y NHA1, que codifica una ATPasa que bombea Na+ y un transportador bidireccional de Na+/H+, respectivamente, responsables de la extrusión de la mayor parte del sodio de la levadura (Garciadeblas et al. de 1993, Bañuelos et al. 1998). La cepa mutante YDH8 sensible a la temperatura para CK2 (MA Ta cka1-!1::HIS 3 cka2-!1::TRP1 ade2-101ocre his3-!200 leu2-!1 lys2-801ámbar trp1-!1 ura 3-52 [pDH8: LEU2 cka2-8]) fue un generoso obsequio del Dr. C. V. C. Glover, de la Universidad de Georgia (Hanna et al., 1995).

Las levaduras se cultivaron ya sea en un medio de glucosa sintética mínima (SD) o en medio rico (YPD). El medio SD contenía 2% de glucosa, 0,7% de base nitrogenada de levadura sin aminoácidos y ácido succínico 50 mM, ajustado a pH 5 con Tris, además de los aminoácidos requeridos [100 μg/ml de leucina, 30 μg/ml de adenina, 100 mg/ml de metionina] como se indicó. El medio YPD contenía 1% de extracto de levadura, 2% de peptona Bacto y 2% de glucosa. Los medios se suplementaron con NaCl como se indicó. Los medios sólidos contenía 2% de agar grado bacteriológico.

Ejemplo 3: Construcción de una biblioteca de ADNc de la remolacha azucarera inducida por estrés por salinidad

Se sintetizaron los ADNc direccionales (kit de síntesis de ADNc, Stratagene) utilizando ARN con cola poli (A)+ preparado a partir de hojas de plantas de remolacha azucarera tratadas con sal. Se ligaron los ADNc en el vector fago APG15 y empacó utilizando un extracto de empacado Gigapack III dorado (Stratagene). Este fago tiene insertado el plásmido de expresión extirpable pYPGE15 (URA3 como un marcador de selección) que puede ser utilizado directamente tanto para Escherichia coli como para complementación de la levadura (Brunelli y Pall, 1993).

Se recuperó una biblioteca de ADNc de plásmido de APG15 por medio del sistema de la recombinasa cre-lox (Brunelli y Pall, 1993).

Ejemplo 4: selección y aislamiento de clones de ADNc que confieren tolerancia a la sal a la levadura

Para seleccionar los ADNc de la remolacha azucarera que aumentan la tolerancia a la sal en levadura, se utilizó la biblioteca de ADNc construida en pYPGE15 para transformar la cepa mutante de levadura JM26 por medio del método de LiCI (Gietz et al. 1992). Se reunieron los transformantes seleccionados sobre placas de SD con leucina y adenina por medio de prototrofía de uracilo y se los sembró nuevamente en placa sobre medio de selección (SD con leucina, adenina y metionina suplementada con NaCl 0,15 M) con una densidad de 2 x 105 células por placa (12 x 12 cm). Se añadió metionina al medio selectivo para evitar la selección de los homólogos tipo HAL2 que ya se encuentran en Arabidopsis (Quintero et al. 1996; Gil-Mascarell et al. 1999). Alternativamente, para la selección de células de levadura resistentes al Li+, se sembraron nuevamente en placa los transformantes sobre medio de selección (SD con leucina y adenina suplementada con LiCl 20 mM). Se seleccionaron nuevamente los clones putativos positivos sobre el mismo medio con NaCI o LiCl.

Uno de los clones confirmados tolerantes al NaCI, el clon 154, fue seleccionado para caracterización adicional. Se aisló el ADN del plásmido de las células de levadura 154 (pYPGE15+154) y se lo reintrodujo en JM26 para confirmar que confería tolerancia a la sal. La selección contra el plásmido marcado con L/R/43 utilizando ácido fluorótico restableció la sensibilidad a la sal de las células de levadura. Se secuenció directamente el inserto de pYPGE15+154 por medio del método de secuenciación del ciclo colorante - iniciador utilizando un secuenciador de ADN (Modelo ABI 377, PE Biosystems). Después de identificar el inserto como la subunidad alfa de CK2 (véase más adelante) fue renombrado como pYPGE15+BvCKA2.

Ejemplo 5: Clonación del gen CKA2 de levadura

El gen CKA2 de Saccharomyces cerevisiae fue aislado por medio de PCR a partir de ADN genómico. Se llevó a cabo la amplificación con ADN polimerasa Pwo (Roche Molecular Biochemicals) y se diseñaron los iniciadores de acuerdo con la secuencia del clon genómico (GenBank, número de acceso: M33759). La secuencia de los iniciadores (sitios de Eco RI -Xho I subrayados) es la siguiente:

Iniciador hacia adelante 5'-ATGGATTAGAATTCTCATAGAGTTGTAAGGTCTCAGGG-3' (SEQ ID NO 11) y el iniciador inverso 5 ’-CCTCAGTTCTCGAGTTTATAAATGGAAATCAGTGGTGG- 3' (SEQ ID NO 12).

El producto amplificado por PCR de 1,1 kb fue digerido con Eco RI - Xho I y clonado direccionalmente dentro del vector de expresión de lavadura pYPGE15. Este constructo, llamado pYPGE15+ScCKA2, fue utilizado para transformar la cepa de levadura JM26 (Gietz et al. 1992). El análisis de la secuencia confirmó que el inserto contenido en el plásmido pYPGE15 era el gen de levadura CKA2.

Ejemplo 6: Estudios de complementación del mutante de levadura CKA2

Como los genes de la subunidad catalítica 2 de caseína quinasa (CKA1 y CKA2) son esenciales para la viabilidad de la levadura, la cepa mutante YDH8 para ck2 (cka1 cka2) transporta al plásmido centromérico pDH8 (marcador LEU2) que codifica para un alelo sensible a la temperatura de la subunidad catalítica (cka2-8). Este constructo permite que las células crezcan a 25ºC pero no a una temperatura restrictiva de 37ºC (Hanna et al. 1995). El plásmido pYPGE15+BvCKA2 fue introducido en la cepa YDH8 por medio de transformación. Después de eso, se removió el plásmido pDH8 de YDH8 por medio del crecimiento de las células en un medio enriquecido para permitir la pérdida del plásmido y la selección por auxotrofía de leucina. Se investigó el crecimiento de las células de levadura a 25 y 37ºC.

Ejemplo 7: Ensayos de tolerancia a la salinidad y mediciones de concentraciones intracelulares de iones

Los cultivos de levadura se desarrollaron previamente en medio SD líquido con leucina y adenina. Se diluyeron alícuotas de cultivos saturados (1:10) y salpicó con un replicador en placa de 8 x 6 de acero inoxidable (SIGMA St. Louis, Mo.) sobre placas que contienen las concentraciones indicadas de sales. Para las mediciones de concentraciones intracelulares de iones, se centrifugaron 10 ml de cultivo de levadura que se desarrolló hasta fase exponencial en SD más leucina, adenina, metionina y NaCl 75 mM (absorbancia de 0,7 a 660 nm medida con Spectronic 20D: Milton Roy, Rochester N.Y.), se lavó tres veces por medio de resuspensión en MgCI2 10 mM enfriado sobre hielo y finalmente se resuspendió en 1 ml de MgCI2 10 mM. Se determinó la concentración de células por medio de la absorbancia a 660 nm, y se extrajeron los iones intracelulares por medio de la adición de HCl concentrado hasta una concentración final de 0,1 M. Después de la remoción de los restos celulares por medio de centrifugación, se determinaron las concentraciones de K+ y Na+ en el sobrenadante por medio de un espectrómetro de absorción atómica (Varian) en modo de emisión de llama. Se estimó el agua intracelular como se describió previamente (Gaxiola et al. 1992).

Ejemplo 8: Análisis de transferencias tipo Southern y Northern

Se preparó ADN genómico a partir de hojas de remolacha azucarera de 3 semanas de edad de acuerdo con Rogers y Bendich (1994). Se digirieron 5 Ig de ADN con enzimas de restricción apropiadas, se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % y se transfirió sobre un filtro de membrana de nylon (Hybond N+, Amersham Life Science). Se hibridó el filtro de membrana con dos sondas diferentes de ADN marcadas con 32P. Una de ellas correspondía a un fragmento amplificado por PCR de 887 pb (iniciador hacia adelante, 5'-CGAAGCTCTCACTGTTCAATGG-3' (SEQ ID NO 13) y un iniciador inverso, 5'-GGATGTGCCATTG CTTCTTTTGC-3' (SEQ ID NO 14)) incluido en la región de codificación de ADNc de BvCKA2. Un segundo fragmento más específico de 323 pb (iniciador hacia adelante, 5'-CTCTCAAGTTAGAGCTGCAGA-3' (SEQ ID NO 15) e iniciador inverso, 5'-GCTATTAGCAAACTATATTAAGTG-3' (SEQ ID NO 16)) incluye la región no codificadora 3' del ADNc de BvCKA2. La hibridación y los lavados se llevaron a cabo bajo condiciones de alta rigurosidad (65º C) de acuerdo con Church y Gilbert (1984).

Para el análisis de transferencias tipo Northern se aisló ARN total de hojas de remolacha azucarera de control o tratadas con Na+ como lo describen Davis et al. (1998). Se separaron 30 Ig de ARN total sobre un gel de agarosa al 1% que contiene 2,2% de formaldehído y transfirieron sobre un filtro de membrana de nylon (Hybond N, Amersham Life Science). La hibridación se llevó a cabo con la sonda específica 3'UTR de 323 pb descrita más arriba para la transferencia tipo Southern. Se lavó el filtro dos veces con SSC 4X, SDS al 0,1% durante 5 min y dos veces con SSC 0.4X, SDS al 0,1% durante 5 min a 65ºC. Se hibridó nuevamente el mismo filtro con un fragmento Eco RI de 1,9 que contenía al gen de la tubulina a3 de Arabidopsis (Ludwig et al. 1987). Se redujeron las temperaturas de hibridación y de lavado hasta 55ºC para esta sonda heteróloga.

Ejemplo 9: Transformación de arroz con los genes de la remolacha azucarera

Expresión de genes de la remolacha azucarera involucrados en la tolerancia a la salinidad en levadura en arroz que media la tolerancia al estrés en arroz. Para investigar la activación de la tolerancia al estrés de los genes para tolerancia al estrés de la remolacha azucarera en monocotiledóneas, los genes anteriormente mencionados (SEQ ID NO. 1 - 5 ), operativamente enlazados a un promotor, son transformados cada uno para arroz utilizando procedimientos estándar de transformación bien conocidos por las personas capacitadas en el arte y expuestos en el siguiente párrafo. Después de diferentes periodos de tiempo que van desde 1 día hasta 1 o más semanas, se revisa la plántula por la expresión del gen transformado. Esto se hace cultivándolas plántulas en medio de organogénesis, y revisando la presencia del ADN o del ARNm por medio de PCR o de PCR inversa. Después de la confirmación de la expresión génica, se revisan las plantas de arroz transformadas con relación a la tolerancia mejorada a situaciones de estrés que incluyen salinidad, sequía y frío (véase W097/13843). Esto se hace cultivando las plantas de arroz cultivadas en medio que contiene mayores cantidades de NaCI o LiCI. También se analiza la mayor resistencia al frío o a la sequía cultivando las plantas transformadas en temperaturas de crecimiento por debajo del óptimo y niveles por debajo del óptimo de humedad, respectivamente (W097/13843).

Transformación de arroz mediada por Agrobacterium

Los genes de la remolacha azucarera de la presente invención pueden ser operativamente enlazados a un promotor y clonados dentro de un vector. Estos vectores pueden ser transformados para la cepa LBA4404 o C58 de Agrobacterium tumefaciens por medio de electroporación y posteriormente las células bacterianas transformadas se pueden seleccionar sobre un medio de agar sólido que contiene los antibióticos apropiados.

Para la demostración de la expresión de los genes de la presente invención en arroz, se quita la cascarilla a 309 semillas secas maduras de las variedades de arroz cultivadas japonesas Nipponbare o Taipéi, se esterilizan y germinan sobre un medio que contiene ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). Después de incubación en la oscuridad durante cuatro semanas se cortan y propagan los callos embriogénicos derivados del escutelo sobre el mismo medio. El callo embriogénico seleccionado es luego co-cultivado con Agrobacterium. El callo co-cultivado es cultivado sobre un medio que contiene 2,4-D durante 4 a 5 semanas en la oscuridad en presencia de una concentración adecuada del agente selectivo apropiado. Durante este periodo, se desarrollan rápidamente islas de callos resistentes. Después de la transferencia de este material a un medio con una concentración reducida de 2,4-D e incubación a la luz, se libera el potencial embriogénico y se desarrollan brotes en las siguientes cuatro a cinco semanas. Se cortan los brotes del callo y se incuban durante una semana sobre un medio que contiene auxina a partir del cual pueden ser transferidos al suelo. Los brotes endurecidos se cultivan bajo una humedad alta y días cortos en un fitotrón. Se pueden cosechar las semillas tres a cinco meses después del trasplante. El método produce transformantes de un solo locus a una tasa superior al 50% (Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).

Ejemplo 10: Transformación de Arabidopsis con el gen CKA2 de Beta vulgaris

Se estudió la tolerancia al NaCI de plantas transgénicas que expresan ADNc de 154 (BvCKA2). Se transformaron plantas de Arabidopsis thaliana (Ecotipo Columbia) ya sea con el plásmido vacío pBI121 (CLONTECH) o pBI121

BvCKA42 que expresa el subdominio alístico de la proteína quinasa CK2 de la remolacha azucarera (SEQ ID NO. 6). Se insertó el ADNc de BvCKA2 entre los sitios Bam HI y Sac I de pBI121. Se introdujeron los constructos dentro de la cepa Rif C58RifR de Agrobacterium tumefaciens (Van Larebeke et al. 1974). Se utilizó esta cepa para transformar plantas de Arabidopsis por medio del método de inmersión floral.

Se determinó el efecto del NaCI sobre la supervivencia de las plantas in vitro y en experimentos de invernadero.

Experimentos in vitro.

Se cultivaron semillas en placas con medio MS más NaCl 100 ó 125 mM. Se determinó la supervivencia como el número de semillas que desarrollaron cotiledones y/o hojas verdaderas. Los resultados se muestran en las Figuras 7 y 8. Estos resultados muestran claramente que las plantas de Arabidopsis transfectadas con el ADNc que tienen una secuencia de ácido nucleico como la representada en la SEQ ID NO. 1, que codifican una subunidad a de caseína quinasa de Beta vulgaris que tienen una secuencia de aminoácidos como la representada en la SEQ ID NO. 6 de la presente invención, claramente tienen una tasa de supervivencia mejorada en condiciones de estrés por salinidad, cuando se comparan con las plantas de tipo silvestre

Experimentos en invernadero

Se cultivaron las platas sobre macetas que contenían una mezcla de suelo y vermiculita (2:1). Las plantas se desarrollaron como se describió previamente (Kanhonou et al. 2001). Se determinó la tolerancia al NaCl 50 mM de las plantas de control (plantas de tipo silvestre y pantas transformadas con el plásmido vacío) y plantas que sobreexpresan BvCKA2 como el porcentaje de plantas adultas por plantas cultivadas (Tabla 5). Se determinó también el peso seco (Tabla 5). Los datos son la media ± SD.

Tabla 5.

Medio de control

NaCl 50 mM

Planta

% de plantas adultas/plantas cultivadas Peso seco de los brotes (mg/planta) % de plantas adultas/plantas cultivadas Peso seco de los brotes (mg/planta)

WT de control

93 ± 3 103 ± 8 46 ± 5 32 ± 7

Control transgénico

89 ± 6 84 ± 27 48 ± 4 33 ± 10

TBvCKA2,1

90 ± 3 96 ± 11 52 ± 1,5 33 ± 10

TBvCKA2,2

93 ± 11 115 ± 11 58 ± 2 47 ± 3

TBvCKA2,3

90 ± 6 110 ± 10 62 ± 4 45 ± 3

Ejemplo 11: El uso del gen BvCKA2 para controlar la floración independientemente del fotoperíodo.

Recientemente se ha descrito a CK2 como un loci de características cuantitativas (QTL) involucrado en el control del período de floración (Takahashi et al. 2001 ). Específicamente CK2 parece estar involucrado en el control de la sensibilidad al fotoperíodo.

Los inventores observaron que las plantas transgénicas de Arabidopsis como las descritas en el Ejemplo 10 tienen un retraso en el período e floración. Este fenotipo tiene un uso práctico, ya que los cultivadores están interesados en controlar el proceso de floración independientemente del fotoperíodo. Los retrasos o los avances del período de floración se regulan por medio del control del nivel de expresión de CK2, o por medio de la modulación de la actividad de la proteína CK2 en una célula de una planta o por medio del uso de mutantes de esta proteína.

Ejemplo 12: Caracterización funcional de BvelF-1A

La cepa de levadura JM26 de Saccharomyces cerevisiae (Kanhonou et al. 2001) fue transformada ya sea con el plásmido vacío pYPGE15 (Brunelli y Pall, 1993) o con 76pYPGE15. El plásmido 76pYPGE15 porta un ADNc de Beta vulgaris que codifica para el factor e-IF1A de iniciación de la traducción. La incorporación de fenilalanina radioactiva en proteínas de levadura se determinó en cultivo líquido como lo describen (Pascual Ahuir et al. 2001). El experimento fue hecho en presencia (pYPGE15 - NaCl 300mM, 76pYPGE15 - NaCl 300mM) o en ausencia (pYPGE15, 76pYPGE15) de NaCl 300 mM. Los resultados se muestran en la Figura 9. Estos resultados muestran claramente en ausencia de NaCI que la levadura transgénica que porta al BvelF-1A incorpora menos fenilalanina

5 comparado con las células transformadas con el vector vacío. Por el contrario, cuando se ponen las células de levadura bajo condiciones severas de estrés por salinidad, es claro que la síntesis de proteína ocurre mucho mejor en células de levadura transformadas con el BvelF-1 A.

Listado de secuencias

<110> CropDesign N.V. 10 <120> Genes de remolacha roja involucrados en tolerancia al estrés

<130> CROP-017-PCT

<150> EP 00870319.1

<151> 2000-12-22

<150> US 60/271.656 15 <151> 2001-02-26

<160> 16

<170> PatentIn versión 3.1

<210> 1

<211> 1527 20 <212> ADN

<213> Beta vulgaris

<400> 1

<210> 2

<211> 1743

<212> ADN

<213> Beta vulgaris

<400> 2 <210> 3

<211> 634 <212> ADN

<213> Beta vulgaris

<400> 3

<210> 4

<211> 845

<212> ADN

<213> Beta vulgaris

<400> 4

<210> 5

<211> 879

<212> ADN

<213> Beta vulgaris

<400> 5

<210> 6

<211> 333

<212> PRT

<213> Beta vulgaris

<400> 6

<210> 7

<211> 345

<212> PRT

<213> Beta vulgaris

<400> 7

<210> 8

<211> 144 <212> PRT

<213> Beta vulgaris

<400> 8

<210> 9

<211> 156

<212> PRT

<213> Beta vulgaris

10 <400> 9

<210> 10

<211> 292

<212> PRT

<213> Beta vulgaris

<400>

10

<400>

12 cctcagttct cgagtttata aatggaaatc agtggtgg 38

<210> 11

<211> 36

<212> ADN

5

<213> iniciador

<400> 11

atggattaga attctcatag agttgtaagg tctcag

36

<210> 12

<211> 38

10

<212> ADN

<213> iniciador

<210> 13

<211> 22

<212> ADN

<213> iniciador

<400> 13 cgaagctctc actgttcaat gg 22

<210> 14

<211> 23

<212> ADN

<213> iniciador

<400> 14 ggatgtgcca ttgcttcttt tgc 23

<210> 15

<211> 21

<212> ADN

<213> iniciador

<400> 15 ctctcaagtt agagctgcag a 21

<210> 16

<211> 24

<212> ADN

<213> iniciador

<400> 16 gctattagca aactatatta agtg 24 Referencias Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., & Watson J. D. (1994) Molecular Biology of the Cell. Garland

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Claims (31)

1. REIVINDICACIONES

   1. El uso de un ácido nucleico de Beta vulgaris para mejorar la tolerancia al estrés osmótico en una planta que comprende la expresión de dicho ácido nucleico de Beta vulgaris, caracterizado porque confiere tolerancia al estrés osmótico a las células de levadura, y en donde dicho ácido nucleico de Beta vulgaris se escoge entre:

   (a)

   un ácido nucleico que contiene una secuencia de ADN como la indicada en la SEQ ID NO 3 o el complemento de la misma,

   (b)

   un ácido nucleico que contiene la secuencia de ARN correspondiente a la SEQ ID NO 3 o el complemento de la misma,

   (c)

   un ácido nucleico que hibrida específicamente con el ácido nucleico de (a) o (b) bajo condiciones rigurosas,

   (d)

   un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que es al menos 89% idéntico a la secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 8,

   (e)

   un ácido nucleico que codifica una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 8,

   (f)

   un ácido nucleico que se degenera hasta un ácido nucleico como el indicado en la SEQ ID NO 3, o que se degenera hasta un ácido nucleico como el definido en uno cualquiera de los numerales (a) hasta (e) como resultado del código genético,

   (g)

   un ácido nucleico que difiere de un ácido nucleico que codifica una proteína como la indicada en la SEQ ID NO 8,

   o que difiere de un ácido nucleico como el definido en cualquiera de los numerales (a) hasta (e) como resultado de diferencias en el uso del codón entre los organismos,

   (h)

   un ácido nucleico que difiere de un ácido nucleico que codifica una proteína como la indicada en la SEQ ID NO 8,

   o que se diferencia de un ácido nucleico como se define en cualquiera de los numerales (a) hasta (e) como resultado de diferencias entre los alelos, y

   (i)

   un ácido nucleico como el definido en cualquiera de los numerales (a) hasta (h) caracterizado porque dicho ácido nucleico es ADN, ADNc, AND genómico o AND sintético.

2. 2.

   El uso de un ácido nucleico de Beta vulgaris de acuerdo con la reivindicación 1 en donde dichas células de levadura se derivan de la cepa de levadura JM26 sensible al Na+.

3. 3.

   Un método para mejorar la tolerancia al estrés osmótico en una planta que comprende la expresión o alteración de la expresión de cualquier ácido nucleico como se define en la reivindicación 1 en células, tejidos o partes de dicha planta.

4. 4.

   Un método de acuerdo con la reivindicación 3 en donde dicha expresión de dicho ácido nucleico ocurre bajo el control de un promotor.

5. 5.

   Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4 en donde dicho estrés osmótico es provocado por salinidad.

6. 6.

   Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4 en donde dicho estrés osmótico es provocado por sequía.

7. 7.

   Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4 en donde dicho estrés osmótico es provocado por congelación.

8. 8.

   Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4 en donde dicho estrés osmótico es provocado por frío.

9. 9.

   Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 en donde dicho método conduce a un incremento en rendimiento.

10. 10.

    Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína para mejorar la tolerancia al estrés osmótico en una planta seleccionada de uno de los siguientes:

    (a)

    un ácido nucleico que contiene una secuencia de ADN como la indicada en la SEQ ID NO 3 o el complemento de la misma,

    (b)

    un ácido nucleico que contiene la secuencia de ARN correspondiente a la SEQ ID NO 3 o el complemento de la misma,

    (c)

    un ácido nucleico que hibrida específicamente con el ácido nucleico de (a) o (b) bajo condiciones de alta rigurosidad,

    (d)

    un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que es al menos 89% idéntica a una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 8,

    (e)

    un ácido nucleico que codifica una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos como la indicada en SEQ ID NO 8,

    (f)

    un ácido nucleico que se degenera hasta un ácido nucleico como el indicado en la SEQ ID NO 3, o que se degenera hasta un ácido nucleico como el definido en cualquiera de los numerales (a) hasta (e) como resultado del código genético,

    (g)

    un ácido nucleico que difiere de un ácido nucleico que codifica una proteína como la indicada en la SEQ ID NO 8,

    o que difiere de un ácido nucleico como el definido en cualquiera de los numerales (a) hasta (e) como resultado de diferencias en el uso del codón entre organismos,

    (h)

    un ácido nucleico que difiere de un ácido nucleico que codifica una proteína como la indicada en la SEQ ID NO 8,

    o que difiere de un ácido nucleico como el definido en cualquiera de los numerales (a) hasta (e) como resultado de diferencias entre los alelos, y

    (i)

    un ácido nucleico como el definido en cualquiera de los numerales (a) hasta (h) caracterizado porque dicho ácido nucleico es ADN, ADNc, ADN genómico o ADN sintético.

11. 11.

    Una molécula de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos contiguos de longitud que hibridan específicamente con un ácido nucleico de la reivindicación 10.

12. 12.

    Una molécula de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos contiguos de longitud que amplifica específicamente un ácido nucleico de la reivindicación 10.

13. 13.

    Un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10.

14. 14.

    Un vector de acuerdo con la reivindicación 13 que es un vector de expresión en donde dicha secuencia de ácido nucleico está operativamente enlazada con una o más secuencias de control que permiten la expresión de dicha secuencia en células huésped procariotas y/o eucariotas.

15. 15.

    Una célula huésped que contiene una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10 o un vector de acuerdo con la reivindicación 13 ó 14.

16. 16.

    Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la célula huésped es una célula bacteriana, de insecto, de hongo, de levadura, vegetal o animal.

17. 17.

    Un polipéptido aislado que puede ser codificado por un ácido nucleico de la reivindicación 10.

18. 18.

    Un polipéptido de la reivindicación 17 que tiene una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 8 o una secuencia de aminoácidos que s al menos 89% idéntica a una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 8.

19. 19.

    Un método para producir un polipéptido de la reivindicación 17 ó 18 que comprende el cultivo de una célula huésped de la reivindicación 15 ó 16 bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido y la recuperación del polipéptido producido a partir del cultivo.

20. 20.

    Un anticuerpo que reconoce específicamente un polipéptido de la reivindicación 17 ó 18 o un epítopo específico de dicho polipéptido.

21. 21.

    Un método para la producción de células vegetales, tejidos vegetales o plantas alteradas que comprende la introducción de un polipéptido de la reivindicación 17 ó 18 directamente dentro de dicha célula vegetal o tejido o en un órgano de dicha planta.

22. 22.

    Un método para efectuar la expresión de un polipéptido de la reivindicación 17 ó 18 que comprende la introducción de una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 10 operativamente enlazada con una o más secuencias de control o un vector de la reivindicación 13 ó 14 en forma estable dentro del genoma de una célula vegetal.

23. 23.

    Un método para la producción de células vegetales, tejidos vegetales o plantas transgénicas que comprende la introducción de un ácido nucleico de la reivindicación 10 en un formato expresable o un vector de la reivindicación 13 ó 14 en dicha célula vegetal, tejido vegetal o planta.

24. 24.

    Un método para mejorar la tolerancia al estrés osmótico en una célula vegetal, tejido o planta que comprende la introducción de cualquier ácido nucleico como el identificado en la reivindicación 10 dentro de dicha célula vegetal, tejido u órgano de dicha planta.

25. 25.

    Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24 que comprende además la regeneración de una planta a partir de dicha célula vegetal.

26. 26.

    Una célula vegetal transgénica que contiene un ácido nucleico de la reivindicación 10 que está operativamente enlazado con elementos reguladores que permiten la transcripción y/o la expresión de dicho ácido nucleico en

    células vegetales o en una célula vegetal transgénica que puede ser obtenida por medio de un método de la reivindicación 23.
27. 27. Una célula vegetal transgénica de la reivindicación 26 en donde dicho ácido nucleico de la reivindicación 10 es 5 integrado en forma estable dentro del genoma de dicha célula vegetal.
28. 28. Una planta o tejido vegetal transgénicos que contienen células vegetales de la reivindicación 26 ó 27.
29. 29. Una planta transgénica de la reivindicación 28 que muestra mayor tolerancia al estrés osmótico, comparada con 10 la correspondiente planta de tipo silvestre.
30. 30. Una parte cosechable de una planta de la reivindicación 28 ó 29, conteniendo dicha parte cosechable células vegetales transgénicas de la reivindicación 26 ó 27.

    15 31. La parte cosechable de una planta de la reivindicación 30 que se selecciona de entre el grupo que consiste de semillas, hojas, frutos, cultivos de tallo, rizomas y bulbos.
31. 32. La progenie derivada de cualquiera de las plantas o partes de la planta de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, y que contiene células vegetales transgénicas de la reivindicación 26 ó 27.

    Figura 6

    SEQ ID NO 1: Secuencia de AND del clon 154 BvCK2 del gen de la remolacha roja (subunidad catalítica a de la caseína quinasa)

    SEQ ID NO 2: Secuencia de ADN del clon 35 BvDHO del gen de la remolacha roja (dihidroorotasa)

    SEQ ID NO 3: Secuencia de ADN del clon 76 BvelF-1A del gen de la remolacha roja (Factor 1A de iniciación de la traducción)

    10 SEQ ID NO 4: Secuencia de ADN del clon 120 Bv120 del gen de la remolacha roja (proteína putativa)

    SEQ ID NO 5: Secuencia de ADN del clon 20Li Bv20Li del gen de la remolacha roja (proteína desconocida)

    SEQ ID NO 6: Secuencia de aminoácidos del clon 154 BvCK2 del gen de la remolacha roja (subunidad catalítica a de la caseína quinasa)

    SEQ ID NO 7: Secuencia de aminoácidos del clon 35 BvDHO del gen de la remolacha roja (dihidroorotasa)

    SEQ ID NO 8: Secuencia de aminoácidos del clon 76 BvelF-1A del gen de la remolacha roja (Factor 1A de iniciación de la traducción)

    SEQ ID NO 9: Secuencia de aminoácidos del clon 120 Bv120 del gen de la remolacha roja (proteína putativa)

    SEQ ID NO 10: Secuencia de aminoácidos del clon 20Li Bv20Li del gen de la remolacha roja (proteína desconocida)