ES2267263T3

ES2267263T3 - Coadministracion de un inhibidor de la angiogenesis para reforzar la respuesta inmunologica por medio de la mediacion de una proteina de fusion de una citoquina con un anticuerpo.

Info

Publication number: ES2267263T3
Application number: ES99917558T
Authority: ES
Inventors: Stephen D. Gillies
Original assignee: EMD Serono Research Center Inc
Current assignee: EMD Serono Research Center Inc
Priority date: 1998-04-15
Filing date: 1999-04-15
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2019-04-15
Also published as: NO20005155L; CA2328076A1; CA2328076C; HUP0101352A2; AU758860B2; EP1071468B1; ZA200005475B; CZ20003767A3; HUP0101352A3; NO20005155D0; RU2229305C2; US20040180035A1; DE69931908T2; WO1999052562A2; ATE329622T1; PL343462A1; WO1999052562A3; JP2002511432A; MXPA00010070A; AU3565099A

Abstract

Una composición que comprende en combinación: (i) una proteína de fusión de (a) una molécula de inmunoglobulina que contiene en dirección amino terminal hacia carboxi terminal un dominio variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina (VH) capaz de enlazar al antígeno, un dominio constante de una cadena pesada 1 de una inmunoglobulina (CH1) y un dominio constante de una cadena pesada 2 de una inmunoglobulina (CH2), y (b) una citoquina fusionada al carboxi terminal del dominio de la inmunoglobulina capaz de inducir una respuesta inmunológica contra dicho antígeno en dicho mamífero, en donde la proteína de fusión induce una respuesta inmunológica contra un antígeno de un tipo preseleccionado de célula en un mamífero, y (ii)un inhibidor de angiogénesis seleccionado del grupo que consiste de (a) endostatina, (b) angiostatina, (c) un péptido que tiene afinidad de enlazamiento por la integrina ávâ3, y (d) un anticuerpo que tiene afinidad de enlazamiento por la integrina ávâ3, en una cantidad, en donde el inhibidor de angiogénesis refuerza dicha respuesta inmunológica inducida por medio de la proteína de fusión con relación a la proteína de fusión sola.

Description

Coadministración de un inhibidor de la angiogénesis para reforzar la respuesta inmunológica por medio de la mediación de una proteína de fusión de una citoquina con un anticuerpo.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona generalmente con inmunoconjugados, en particular, proteínas de fusión de una citoquina con un anticuerpo útil para inmunoterapia dirigida y estimulación inmunológica en general. Más específicamente, la presente invención se relaciona con e uso de inhibidores de angiogénesis para reforzar una respuesta inmunológica por medio de la mediación de una proteína de fusión de una citoquina con un anticuerpo, contra un tipo preseleccionado de célula, por ejemplo, células en un tumor sólido.

Antecedentes de la invención

Se han utilizado anticuerpos para el tratamiento de enfermedades humanas durante muchos años, principalmente para proporcional inmunidad pasiva hacia una infección viral o bacterial. Más recientemente, sin embargo, se han utilizado conjugados de anticuerpo y de anticuerpos como agentes antitumorales. La actividad antitumoral ha sido difícil de demostrar en la mayoría de los tipos de tumores a menos que el arraigo clínico sea el de una enfermedad residual mínima (Reithmuller y colaboradores, LANCET 94: 1177-1183), o cuando el tumor es asequible a anticuerpos en la circulación, por ejemplo, en el caso de linfoma B (Maloney y colaboradores, (1994) BLOOD 84: 2457-2466). Los tumores sólidos son mucho más refractarios a la intervención terapéutica mediada por anticuerpos de lo que lo son los focos micrometastáticos encontrados en el arraigo de enfermedades residuales mínimas.

Los primeros estudios muestran que el tratamiento de tumores con anticuerpos in vivo puede reforzarse grandemente por medio de la fusión de citoquinas estimuladoras inmunológicas a una molécula de anticuerpo. Sin embargo, las proteínas de fusión de una citoquina con un anticuerpo fueron mucho menos efectivas en la destrucción de tumores sólidos más grandes, de lo que lo fueron para focos metastáticos diseminados (Xiang y colaboradores, (1997) CANCER RESEARCH 57: 4948-4955, y Lode y colaboradores, (1998) BLOOD 91: 1706-1715).

Por lo tanto, persiste aún la necesidad en el estado de la técnica por composiciones y métodos que empleen tales composiciones para reforzar las respuestas inmunológicas mediadas por una proteína de fusión de citoquina con anticuerpo, contra tipos de células preseleccionadas, por ejemplo, los tipos de células presentes en los tumores sólidos.

Resumen de la invención

Esta invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que cuando se administra un inmunoconjugado a un mamífero, es posible crear una respuesta inmune más potente contra un tipo preseleccionado de célula, si el inmunoconjugado se administra junto con un inhibidor de angiogénesis. En particular, se ha encontrado que tales combinaciones son particularmente útiles en la mediación de la destrucción inmunológica del tipo preseleccionado de célula, tal como los tipos de células encontrados en los tumores sólidos y en células infectadas en forma viral.

En un aspecto, la invención provee una composición para inducir una respuesta inmunológica citócida contra un tipo preseleccionado de célula en un mamífero. La composición contiene en combinación: (i) un inmunoconjugado que contiene un sitio para el enlazamiento de un anticuerpo capaz de enlazarse al tipo preseleccionado de célula, y una citoquina capaz de inducir tal respuesta inmunológica contra el tipo preseleccionado de célula en el mamífero, y (ii) un inhibidor de angiogénesis en una cantidad suficiente para reforzar la respuesta inmunológica inducida por el inmunoconjugado de la combinación relativa a la respuesta inmunológica estimulada solamente por el inmunoconjugado.

El sitio de enlazamiento del anticuerpo del inmunoconjugado contiene preferiblemente, una cadena pesada de inmunoglobulina o un fragmento de la misma para enlazamiento del antígeno. La cadena pesada de inmunoglobulina contiene preferiblemente, en una dirección amino-terminal hacia carboxi-terminal, un dominio en la región variable en la inmunoglobulina (V_{H}) capaz de enlazarse a un antígeno preseleccionado, a un dominio pesado constante 1 en la inmunoglobulina (CH1), a un dominio pesado constante 2 en la inmunoglobulina (CH2), y opcionalmente puede incluir además un dominio pesado constante 3 en la inmunoglobulina (CH3). En una modalidad más preferida, el inmunoconjugado es una proteína de fusión que contiene una cadena pesada de inmunoglobulina o un fragmento de la misma para el enlazamiento al antígeno a través de un enlace polipéptido a la citoquina. Por lo tanto, una proteína de fusión preferida de una citoquina con un anticuerpo contiene, en una dirección amino-terminal hacia carboxi-terminal, (i) el sitio para el enlazamiento de un anticuerpo que contiene una región variable en la inmunoglobulina capaz de enlazar a un antígeno sobre la superficie de la célula en el tipo preseleccionado de célula, un dominio CH1 en la inmunoglobulina, un dominio CH2 en la inmunoglobulina (opcionalmente un dominio CH3), y (ii) la citoquina. Los métodos para elaborar y utilizar tales proteínas de fusión son descritos en detalle en Gillies y colaboradores (1992) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 89:1428-1432; Gillies y colaboradores (1998) J. IMMUNOL. 160:6195-6203; y en la patente estadounidense No. 5.650.150.

Los dominios en la región constante de la inmunoglobulina (esto es, los dominios CH1, CH2 y/o CH3) pueden ser los dominios de la región constante normalmente asociados con el dominio de la región variable en un anticuerpo de ocurrencia natural. Alternativamente, uno o más de los dominios de la región constante de la inmunoglobulina pueden derivarse de anticuerpos diferentes de los anticuerpos utilizados como fuente del dominio de la región variable. En otras palabras, los dominios de la región constante y variable de la inmunoglobulina pueden derivarse de anticuerpos diferentes, por ejemplo, anticuerpos derivados de diferentes especies. Ver, por ejemplo, la patente estadounidense No. 4.816.567. Además, las regiones variables de la inmunoglobulina pueden contener secuencias de la región del armazón (FR) derivadas de una especie, por ejemplo, una humana, y secuencias de la región determinante complementaria (CDR) interpuestas entre las FR, derivadas de una segunda especie diferente, por ejemplo, un ratón. Los métodos para elaborar y utilizar tales regiones quiméricas variables de la inmunoglobulina, se revelan, por ejemplo, en las patentes estadounidenses Nos. 5.225.539 y 5.585.089.

Los inmunoconjugados con base en anticuerpos contienen preferiblemente además una cadena ligera de inmunoglobulina que preferiblemente está covalentemente unida a la cadena pesada de inmunoglobulina por medio de, por ejemplo, un enlace disulfuro. Las regiones variables de las cadenas liviana y pesada enlazadas a la inmunoglobulina definen ambas un sitio de enlazamiento sencillo y completo para el enlazamiento del antígeno preseleccionado. En otras modalidades, los inmunoconjugados contienen dos cadenas quiméricas, cada una al menos con una porción de una cadena pesada de inmunoglobulina fusionada a una citoquina. Las dos cadenas quiméricas están preferiblemente enlazadas en forma covalente por medio, por ejemplo, de uno o más enlaces de disulfuro entre las cadenas.

La invención provee así proteínas de fusión en las cuales la actividad y la especificidad del enlazamiento con el antígeno de un anticuerpo se combinan con la potente actividad biológica de una citoquina. Una proteína de fusión de la presente invención puede utilizarse para liberar selectivamente a la citoquina hacia una célula objetivo in vivo para que la citoquina pueda ejercer un efecto biológico localizado en la vecindad de la célula objetivo. En una modalidad preferida, el anticuerpo componente de la proteína de fusión se enlaza específicamente a un antígeno o a una célula de cáncer y, como resultado, la proteína de fusión ejerce una actividad anticancerosa localizada. En una modalidad alternativa preferida, el anticuerpo componente de la proteína de fusión se enlaza específicamente a una célula infectada con virus, tal como una célula infectada con VIH, y, como resultado, la proteína de fusión ejerce una actividad antiviral localizada.

Las citoquinas que pueden incorporarse dentro de los inmunoconjugados de la invención incluyen, por ejemplo, factores de necrosis tumoral, interleuquinas, factores de estimulación de colonias, y linfoquinas. Los factores preferidos de necrosis tumoral incluyen, por ejemplo, al factor \alpha de necrosis tumoral (TNF\alpha). Las interleuquinas incluyen, por ejemplo, interleuquina-2 (IL-2), interleuquina-4 (IL-4), interleuquina-5 (IL-5), interleuquina-7 (IL-7), interleuquina-12 (IL-12), interleuquina-15 (IL-15) y interleuquina-18 (IL-18). Las interleuquinas preferidas son IL-4, IL-7, IL-2, y IL-12. Los factores para estimulación de colonias incluyen, por ejemplo, al factor para estimulación de colonias granulocito-macrófago (GM-CSF) y al factor para estimulación de colonias de macrófago (M-CSF). Las linfoquinas preferidas incluyen, por ejemplo, linfotoxinas (LT). Otras citoquinas útiles incluyen interferones, incluidos IFN-a, IFN-b y IFN-g, todos los cuales tienen efectos inmunológicos, así como efectos antiangiogénicos, que son independientes de su actividad antiviral.

Los inhibidores preferidos de angiogénesis útiles en la práctica de la invención incluyen, por ejemplo, endostatina, angiostatina, péptidos que tienen afinidad de enlazamiento por integrina \alpha_{v}\beta_{3} y anticuerpos o fragmentos de los mismos que tienen afinidad de enlazamiento por la integrina \alpha_{v}\beta_{3}.

En un aspecto adicional, la invención se relaciona con el uso de dichas composiciones para la inducción de una respuesta inmunológica citócida contra un tipo preseleccionado de célula en un mamífero. El uso incluye la administración al mamífero (i) de un inmunoconjugado que contiene un sitio de enlazamiento para un anticuerpo capaz del enlazamiento al tipo preseleccionado de célula y una citoquina capaz de inducir tal respuesta inmunológica contra el tipo preseleccionado de célula, y (ii) un inhibidor de angiogénesis en una cantidad suficiente para reforzar la respuesta inmunológica relativa a la respuesta inmunológica estimulada por el inmunoconjugado solamente.

En una modalidad preferida, el tipo preseleccionado de célula puede ser una célula cancerosa presente, por ejemplo, en un tumor sólido, más preferiblemente en un tumor sólido mayor (esto es, aproximadamente mayor a 100 mm^{3}). Alternativamente, el tipo preseleccionado de célula puede ser una célula infectada con un virus, por ejemplo, una célula infectada con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH).

En otra modalidad preferida, el inhibidor de angiogénesis puede ser administrado simultáneamente con el inmunoconjugado. Alternativamente, el inhibidor de angiogénesis puede ser administrado antes de la administración del inmunoconjugado. Además, se contempla que el inmunoconjugado pueda ser administrado junto con una pluralidad de diferentes inhibidores de angiogénesis. Alternativamente, se contempla que el inhibidor de angiogénesis pueda ser administrado junto con una pluralidad de inmunoconjugados diferentes.

También se proveen las dosificaciones preferidas y los regímenes de administración para administrar los inmunoconjugados en combinación con los inhibidores de angiogénesis.

Breve descripción de los dibujos

Lo anterior y otros objetivos, rasgos, y ventajas de la presente invención, así como la invención en si misma, pueden ser entendidos más completamente a partir de la siguiente descripción de las modalidades preferidas, cuando se leen junto con los dibujos acompañantes, en los cuales:

La Figura 1 es una representación esquemática de un ejemplo de inmunoconjugado útil en la práctica de la invención.

La Figura 2A y la 2B son gráficas que describen la expresión de EpCAM humana en células transfectadas de carcinoma de pulmón de ratón de Lewis (LLC) tal como se analizaron por medio de la selección de células activadas por fluorescencia (FACS). Se colorearon igual número de células transfectadas ya sea solamente con un anticuerpo específico antihumano Fc marcado con un isotiocianato secundario de fluoresceína (FITC) (Panel A), o con coloreadas primero con la proteína de fusión con el anticuerpo huKS-hulL2 seguido por el anticuerpo específico antihumano Fc marcado con FITC (Panel B);

La Figura 3 es una gráfica lineal que describe los efectos sobre los tumores subcutáneos de una proteína de fusión de una citoquina con un anticuerpo administrada ya sea sola o en combinación con una segunda proteína de fusión de una citoquina con un anticuerpo en la cual la citoquina tiene actividad antiangiogénica. Se inició un tratamiento por 5 días, 13 días después de la implantación de células LLC. Los ratones fueron tratados con solución fisiológica amortiguada con fosfato (diamantes no rellenos); 15 \mug/día de la proteína de fusión huKS-mu\gamma2a-mulL sola (cuadrados rellenos); 10 \mug/día de la proteína de fusión huKS-mu\gamma2a-mulL12 (triángulos rellenos); y una combinación de 7,5 \mug/día de la proteína de fusión huKS-mu\gamma2a-mulL2 y 5 \mug/día de la proteína de fusión huKS-mu\gamma2a-mulL12
(cruces);

La Figura 4 es una gráfica lineal que describe los efectos sobre los tumores subcutáneos de una proteína de fusión de una citoquina con un anticuerpo administrada ya sea sola o en combinación con una proteína de fusión de endostatina. Se hizo seguimiento al tamaño de los tumores subcutáneos CT26/EpCAM en ratones tratados con suero fisiológico amortiguado con fosfato (diamantes rellenos), una proteína de fusión muFc-muEndo (cuadrados rellenos), una proteína de fusión huKS-hu\gamma4-hulL2 (diamantes rellenos), y una combinación de la proteína de fusión muFc-muEndo y de la proteína de fusión huKS-hu\gamma4-hulL2 (cruces); y

La Figura 5 es una gráfica lineal que describe los efectos sobre los tumores subcutáneos de una proteína de fusión de una citoquina con un anticuerpo administrada ya sea sola o en combinación con indometacina. Se hizo seguimiento al tamaño de los tumores subcutáneos LLC-EpCAM en ratones tratados con solución salina amortiguada con fosfato (diamantes rellenos), una proteína de fusión huKS-hu\gamma1-hulL2 (cuadrados rellenos), indometocina (triángulos rellenos), y una combinación de la proteína de fusión huKS-hu\gamma1-hulL2 e indometocina (cruces).

Descripción detallada de la invención

Se ha descubierto ahora que las respuestas inmunológicas citócidas iniciadas por medio de un inmunoconjugado contra un tipo preseleccionado de célula puede ser significativamente reforzado por medio de la administración del inmunoconjugado junto con un inhibidor de angiogénesis. La terapia combinada es particularmente efectiva en la mediación de la destrucción inmunológica de un tejido enfermo, tal como, un tumor establecido o células infectadas en forma viral. La presente invención describe métodos para elaborar y utilizar inmunoconjugados útiles, así como ensayos útiles para probar su actividad farmacocinética en modelos de animales preclínicos in vivo, cuando ellos se combinan con inhibidores adecuados de angiogénesis.

Como se lo utiliza aquí, el término "respuesta inmunológica citócida" se entiende que significa cualquier respuesta inmunológica en un mamífero, ya sea de naturaleza humoral o celular, que es estimulada por el inmunoconjugado de la invención, y ya sea que mata o bien reduce la viabilidad de un tipo preseleccionado de célula en el mamífero. La respuesta inmunológica puede incluir uno o más tipos de células, incluidas las células T, células asesinas naturales (NK) y macrófagos.

Como se lo utiliza aquí, el término "inmunoconjugado" se entiende que significa un conjugado de (i) un sitio de enlazamiento de un anticuerpo que tiene especificidad de enlazamiento por, y es capaz de enlazarse a la superficie del antígeno sobre una célula cancerosa o una célula infectada con un virus, y (ii) una citoquina que es capaz de inducir o estimular una respuesta inmunológica citócida contra el cáncer o la célula infectada con un virus. Por lo tanto, el inmunoconjugado es capaz de liberar en forma selectiva a la citoquina hacia una célula objetivo in vivo para que la citoquina pueda mediar una respuesta inmunológica localizada contra la célula objetivo. Por ejemplo, si el componente del anticuerpo del inmunoconjugado enlaza selectivamente a un antígeno o a una célula cancerosa, por ejemplo, una célula cancerosa en un tumor sólido, en particular, un tumor sólido más grande, superior aproximadamente 100 mm^{3}, el inmunoconjugado ejerce una actividad anticancerosa localizada. Alternativamente, si el componente del anticuerpo del inmunoconjugado enlaza selectivamente a un antígeno o a una célula infectada con un virus, tal como una célula infectada con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), el inmunoconjugado ejerce una actividad antiviral localizada.

Como se lo utiliza aquí, el término "sitio de enlazamiento del anticuerpo" se entiende que significa al menos una porción de una cadena pesada de inmunoglobulina, por ejemplo, una región variable de una inmunoglobulina capaz del enlazamiento al tipo preseleccionado de célula. El sitio de enlazamiento del anticuerpo contiene preferiblemente también al menos una porción de una región constante en la inmunoglobulina que incluye, por ejemplo, un dominio CH1, un dominio CH2, y opcionalmente, un dominio CH3. Además, la cadena pesada de la inmunoglobulina puede estar asociada, ya sea en forma covalente o no covalente, a una inmunoglobulina liviana que contiene, por ejemplo, una región variable en la cadena liviana de la inmunoglobulina, y opcionalmente una región constante en la cadena liviana. Por lo tanto, se contempla que el sitio de enlazamiento del anticuerpo puede contener un anticuerpo intacto o un fragmento del mismo capaz de enlazarse al tipo preseleccionado de célula.

Con relación al inmunoconjugado, se contempla que el fragmento de anticuerpo puede estar enlazado a la citoquina por medio de una variedad de formas bien conocidas por aquellos ordinariamente capacitados en la técnica. Por ejemplo, el sitio de enlazamiento del anticuerpo se enlaza preferiblemente a través de un enlace polipéptido a la citoquina en una construcción de una proteína de fusión. Alternativamente, el sitio de enlazamiento del anticuerpo puede acoplarse químicamente a la citoquina a través de grupos reactivos, por ejemplo, grupos sulfhidrilo, dentro de cadenas laterales de aminoácidos presentes dentro del sitio de enlazamiento del anticuerpo y la citoquina.

Como se lo utiliza aquí, el término "citoquina" se entiende que significa cualquier proteína o péptido, análogo o un fragmento funcional del mismo, que es capaz de estimular o inducir una respuesta inmunológica citócida contra un tipo preseleccionado de célula, por ejemplo, una célula cancerosa o una célula infectada con un virus, en un mamífero. Por lo tanto, se contempla que pueden incorporarse una variedad de citoquinas dentro de los inmunoconjugados de la invención. Las citoquinas útiles incluyen, por ejemplo, factores de necrosis tumoral, interleuquinas, linfoquinas, factores de estimulación de colonias, interferones que incluyen variantes de especies, análogos truncados de los mismos que son capaces de estimular o de inducir tales respuestas inmunológicas citócidas. Los factores útiles de necrosis tumoral incluyen, por ejemplo, TNF \alpha. Las linfoquinas útiles incluyen, por ejemplo, LT. Los factores útiles de estimulación de colonias incluyen, por ejemplo, GM-CSF y M-CSF. Las interleuquinas útiles incluyen, por ejemplo, IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-12, IL-15 y IL-18. Los interferones útiles, incluyen, por ejemplo, IFN-\alpha, IFN-\beta y IFN-\gamma.

El gen que codifica a una citoquina particular de interés puede clonarse de nuevo, obteniéndolo a partir de una fuente disponible, o sintetizándolo por medio de la síntesis estándar de ADN a partir de secuencias conocidas de nucleótidos. Por ejemplo, la secuencia de ADN de LT es conocida (ver, por ejemplo, Nedwin y colaboradores (1985) NUCLEIC ACIDS RES. 13:6361), como lo son las secuencias para IL-2 (ver, por ejemplo, Taniguchi y colaboradores (1983) NATURE 302:305-318), GM-CSF (ver, por ejemplo, Gasson y colaboradores (1984) SCIENCE 266:1339-1342), y TNF \alpha (ver, por ejemplo, Nedwin y colaboradores (1985) NUCLEIC ACIDS RES. 13:6361).

En una modalidad preferida, los inmunoconjugados son proteínas de fusión recombinantes producidas por medio de metodologías convencionales de ADN recombinante, esto es, por medio de la formación de una construcción de ácido nucleico que codifica al inmunoconjugado quimérico. La construcción de las proteínas recombinantes de fusión de una citoquina con un anticuerpo ha sido descrita en el arte previo. Ver, por ejemplo, Gillies y colaboradores (1992) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 89: 1428-1432; Gillies y colaboradores (1998) J. IMMUNOL. 160:6195-6203; y la patente estadounidense No. 5.650.150. Preferiblemente, una construcción de un gen que codifica al inmunoconjugado de la invención incluye, en la orientación 5' a 3', un segmento de ADN que codifica a un dominio de una región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina, un segmento de ADN que codifica a una región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina, y un ADN que codifica a la citoquina. El gen fusionado se une en o se inserta dentro de un vector de expresión para la transfección dentro de una célula receptora adecuada en donde se expresa el gen fusionado. La cadena híbrida de polipéptido se combina preferiblemente con una cadena liviana de inmunoglobulina de tal manera que la región variable de la inmunoglobulina de la cadena pesada (V_{H}) y la región variable de la inmunoglobulina de la cadena liviana (V_{L}) se combinan para producir un sitio único y completo para el enlazamiento de un antígeno preseleccionado. En una modalidad preferida, las cadenas liviana y pesada de la inmunoglobulina se acoplan en forma covalente, por ejemplo, por medio de un enlace disulfuro entre las cadenas. Además, dos cadenas pesadas de inmunoglobulina, ya sea una o ambas, se fusionan a una citoquina, pueden acoplarse covalentemente, por ejemplo, por medio de uno o más enlaces disulfuro entre las cadenas.

La Figura 1 muestra una representación esquemática de un ejemplo de un inmunoconjugado 10. En esta modalidad, las moléculas de citoquina 2 y 4 son péptidos enlazados a los terminales carboxilo 6 y 8 de las regiones 10 y 12 de CH3 de las cadenas pesadas 14 y16 del anticuerpo. Las regiones 26 y 28 de V_{L} se muestran apareadas con las regiones 18 y 20 de V_{H} en una configuración IgG típica, proveyendo así, dos sitios de enlazamiento 30 y 32 para el antígeno en los extremos amino terminales del inmunoconjugado 10 y dos sitios de enlazamiento 40 y 42 al receptor de la citoquina en los extremos carboxilo del inmunoconjugado 10. Desde luego, en sus aspectos más amplios, los inmunoconjugados no necesitan aparearse como se ilustra, o solamente una de las dos cadenas pesadas de inmunoglobulina necesitan fusionarse a una molécula de citoquina.

Los inmunoconjugados de la invención pueden considerarse quiméricos en virtud de dos aspectos de su estructura. Primero, el inmunoconjugado es quimérico ya que incluye una cadena pesada de inmunoglobulina que tiene una especificidad de enlazamiento al antígeno enlazada a una citoquina dada. Segundo, un inmunoconjugado de la invención puede ser quimérico en el sentido de que incluye una región variable en la inmunoglobulina (V) y una región constante en la inmunoglobulina (C), ambas derivadas a partir de anticuerpos diferentes de tal manera que la proteína resultante sea una quimera V/C. Por ejemplo, las regiones variable y constante pueden derivarse a partir de moléculas de anticuerpo de ocurrencia natural aislables a partir de especies diferentes. Ver, por ejemplo, la patente estadounidense No. 4.816.567. También están incluidas las construcciones en las cuales una cualquiera o ambas regiones variables de la inmunoglobulina contienen secuencias de la región del armazón (FR) y secuencias determinantes de complementariedad (CDR) derivadas a partir de especies diferentes. Tales construcciones se revelan, por ejemplo, en Jones y colaboradores (1986) NATURE 321:522-525, Verhoyen y colaboradores (1988) SCIENCE 239:1534-1535, y las patentes estadounidenses Nos. 5.225.539 y 5.585.089. Además, se contempla que las secuencias de la región variable pueden derivarse por medio de bibliotecas de selección, por ejemplo, bibliotecas para visualizar fagos, para las secuencias de la región variable que enlazan a un antígeno preseleccionado con la afinidad deseada. Los métodos para elaborar y seleccionar las bibliotecas para visualizar al fago se revelan por ejemplo, en Huse y colaboradores (1989) SCIENCE 246:1275-1281 y en Kang y colaboradores (1991) PROC. NAIL ACAD. SCI. USA 88: 11120-11123.

Los dominios de la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina de los inmunoconjugados pueden seleccionarse a partir de cualquiera de las cinco clases de inmunoglobulinas denominadas como IgA (Ig\alpha), IgD (Ig\delta), IgE (Ig\varepsilon), IgG (Ig\gamma), y IgM (Ig\mu). Sin embargo, se prefieren las regiones constantes de la cadena pesada de la inmunoglobulina de la clase IgG. Además, se contempla que las cadenas pesadas de la inmunoglobulina se pueden derivar de cualquiera de las subclases de anticuerpo IgG denominadas en el estado del arte como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Como se sabe, cada región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina contiene cuatro o cinco dominios. Los dominios son denominados secuencialmente como sigue: CH1-bisagra-CH2-CH3-(-CH4). CH4 está presente en IgM, la cual no tiene región de bisagra. Las secuencias de AND de los dominios de la cadena pesada tienen homología cruzada entre las clases de inmunoglobulinas, por ejemplo, el dominio CH2 de IgG es homólogo al dominio CH2 de IgA e IgD, y al dominio CH3 de IgM e IgE. Las cadenas livianas de la inmunoglobulina pueden tener o bien una cadena constante kapa (\kappa) o lambda (\lambda). Las alineaciones de la secuencia y de las secuencias de estas regiones de la inmunoglobulina son bien conocidas en el estado del arte (ver, por ejemplo, Kabat y colaboradores, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U.S. Department of Health y Human Services, tercera edición 1983, cuarta edición 1987, Huck y colaboradores (1986) Nuc. ACIDS RES. 14: 1779-1789).

En las modalidades preferidas, la región variable se deriva de un anticuerpo específico para un antígeno de la superficie de la célula preseleccionada (un antígeno asociado con una célula enferma tal como una célula cancerosa o una célula infectada con un virus), y la región constante incluye a los dominios CH1, y CH2 (y opcionalmente CH3) a partir de un anticuerpo que es el mismo o diferente del anticuerpo que es la fuente de la región variable. En la práctica de esta invención, la porción de anticuerpo del inmunoconjugado es preferiblemente no inmunogénico o es débilmente inmunogénico en el receptor deseado. Por lo tanto, la porción de anticuerpo, se deriva preferiblemente, tanto como sea posible, de la misma especie que el receptor deseado. Por ejemplo si el inmunoconjugado se administra en humanos, los dominios de la región constante son preferiblemente de origen humano. Ver, por ejemplo, la patente estadounidense No. 4.816.567. Además, cuando la región variable de la inmunoglobulina se deriva de una especie diferente a la del receptor deseado, por ejemplo, cuando las secuencias de la región variable son de origen murino y el receptor deseado es un humano, entonces la región variable contiene preferiblemente secuencias de la FR humana con secuencias de la CDR murina interpuestas entre las secuencias de la FR para producir una región quimérica variable que tiene especificidad de enlazamiento por un antígeno preseleccionado pero al mismo tiempo sin embargo, minimizando la inmunoreactividad en el huésped deseado. El diseño y la síntesis de tales regiones quiméricas variables se revelan en Jones y colaboradores (1986) NATURE 321: 522-525, Verhoyen y colaboradores (1988) SCIENCE 239: 1534-1535, y en las patentes estadounidenses Nos. 5.225.539 y 5.585.089. La clonación y la expresión de una proteína de fusion de una citoquina con un anticuerpo, la proteína de fusión IL-12 con el anticuerpo KS-1/4 anti-EpCAM, así como su habilidad para erradicar la metástasis establecida del carcinoma de colon, ha sido descrita en Gillies y colaboradores (1998) J. IMMUNOL. 160: 6195-6203.

El gen que codifica a la citoquina se une, ya sea directamente o por medio de un enlazador, por ejemplo, por medio del AND que codifica a un enlazador (Gly_{4}-Ser)_{3} en el marco del extremo 3' del gen que codifica a la región constante de la inmunoglobulina (por ejemplo, un exón CH2 o CH3). En ciertas modalidades, el enlazador puede contener una secuencia de nucleótidos que codifican a un sitio de escisión proteolítica. Este sitio, cuando se interpone entre la región constante de la inmunoglobulina y la citoquina, puede ser diseñado para proveer la liberación proteolítica de la citoquina en el sitio objetivo. Por ejemplo, se conoce bien que la plasmina y la tripsina rompen después de los residuos de lisina y arginina en los sitios que son accesibles a las proteasas. Muchas otras endoproteasas específicas para el sitio, y las secuencias de aminoácidos que ellas rompen son bien conocidas en el estado del arte. Los sitios preferidos de escisión proteolítica y las enzimas proteolíticas que son reactivas con tales sitios de escisión se revelan en las patentes estadounidenses Nos. 5.541.087 y 5.726.044.

La construcción de ácido nucleico puede incluir opcionalmente al promotor endógeno y al reforzador para que el gen que codifica a la región variable, regule la expresión de la cadena quimérica de inmunoglobulina. Por ejemplo, los genes que codifican a la región variable pueden obtenerse como fragmentos de ADN que contienen al péptido líder, al gen VJ (regiones variables reordenadas funcionalmente (V) con un segmento de unión (J)) para la cadena liviana, o al gen VDJ para la cadena pesada, y al promotor endógeno y al reforzador para estos genes. Alternativamente, el gen que codifica a la región variable puede obtenerse a parte de los elementos reguladores endógenos y utilizarse en un vector de expresión que provee a estos elementos.

Los genes de la región variable pueden obtenerse por medio de procedimientos estándar de clonación de ADN a partir de las células que producen al anticuerpo deseado. La selección de la biblioteca genómica para una región variable específica reordenada funcionalmente puede lograrse por medio del uso de sondas apropiadas de ADN tales como segmentos de ADN que contienen a la secuencia de ADN de la región J, y a las secuencias corriente abajo. La identificación y la confirmación de los clones correctos se logra por medio de la secuenciación de los genes clonados y la comparación de la secuencia con la secuencia correspondiente del ARNm adecuadamente empalmado de longitud completa.

El antígeno objetivo puede ser un antígeno de una superficie celular de un tumor o de una célula cancerosa, de una célula infectada con un virus o de otra célula enferma. Los genes que codifican a las regiones variables apropiadas pueden obtenerse generalmente a partir de líneas celulares linfoides que producen inmunoglobulina, por ejemplo, líneas celulares de hibridoma que producen inmunoglobulina específica para antígenos asociados con tumores, o pueden producirse antígenos virales por medio de técnicas estándar de hibridación de células somáticas bien conocidas en el estado de la técnica (ver, por ejemplo, la patente estadounidense No. 4.196.265). Estas líneas celulares que producen inmunoglobulina proporcionan la fuente de genes de la región variable en forma reordenada funcionalmente. Los genes de la región variable serán típicamente de origen murino debido a que este sistema murino se presta por sí mismo a la producción de una amplia variedad de inmunoglobulinas de especificidad deseada. Además, las secuencias de la región variable se pueden derivar por medio de las bibliotecas de selección, por ejemplo, las bibliotecas para visualizar al fago, para las secuencias de la región variable que enlazan a un antígeno preseleccionado con una afinidad deseada. Los métodos para elaborar y seleccionar a las bibliotecas para la visualización de fagos se revelan, por ejemplo, en Huse y colaboradores (1989) SCIENCE 246: 1275-1281 y Kang y colaboradores (1991) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 88: 11120-11123.

El fragmento de ADN de codificación que contiene al gen de la región variable funcionalmente activa se enlaza a un fragmento de ADN que contiene al gen que codifica a la región constante deseada (o a una porción de la misma). Las regiones constantes de la inmunoglobulina (la cadena pesada y la liviana) se pueden obtener a partir de las células que producen anticuerpos por medio de técnicas estándar de clonación génica. Los genes para las dos clases de cadenas livianas humanas (\kappa y \lambda) y las cinco clases de cadenas pesadas humanas (\alpha, \delta, \varepsilon, \gamma y \mu) han sido clonadas, y por lo tanto, las regiones constantes de origen humano se encuentran fácilmente disponibles a partir de estos clones.

El gen fusionado que codifica a la cadena híbrida pesada de la inmunoglobulina se une o se inserta dentro de un vector de expresión para la incorporación dentro de una célula receptora. La introducción de la construcción del gen dentro de los vectores plásmidos puede lograrse por medio de procedimientos estándar de acoplamiento génico. La cadena pesada de la inmunoglobulina quimérica y que se coexpresa en la misma célula con la correspondiente cadena liviana de la inmunoglobulina para que una inmunoglobulina completa se pueda expresar y unir simultáneamente. Para este propósito, las construcciones de la cadena liviana y la cadena pesada se pueden colocar en los mismos vectores o en vectores separados.

Las líneas celulares receptoras son generalmente células linfoides. La célula receptora preferida es un mieloma (o hibridoma). Los mielomas pueden sintetizar, unir, y secretar inmunoglobulinas codificadas por medio de genes transfectados y pueden glicosilar proteínas. El receptor o las células huésped particularmente preferidas incluyen al mieloma Sp2/0 que normalmente no produce inmunoglobulina endógena, y células NS/0 de mieloma de ratón. Cuando se transfecta, la célula produce únicamente inmunoglobulina codificada por medio de las construcciones del gen transfectado. Los mielomas transfectados pueden cultivarse y medios de cultivo o en peritoneo de ratones en donde el inmunoconjugado secretado puede recuperarse a partir del fluido ascitis. Pueden utilizarse otras células linfoides tales como los linfocitos B como células receptoras.

Existen varios métodos para la transfección de células linfoides con vectores que contienen las construcciones de ácido nucleico que codifican a la cadena quimérica de inmunoglobulina. Por ejemplo, los vectores pueden introducirse dentro de células linfoides por medio de fusión de esferoblasto (ver, por ejemplo, Gillies y colaboradores (1989) BIOTECHNOL. 7:798-804). Otros métodos útiles incluyen electroporación o precipitación en fosfato de calcio (ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores editores (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press).

Otros métodos útiles para producir al inmunoconjugado incluyen la preparación de una secuencia de ARN que codifican a la construcción y su traducción en un sistema apropiado de expresión in vivo o in vitro. Se contempla que las metodologías de ADN recombinante para la síntesis de los genes que codifican a las proteínas de fusión de una citoquina con un anticuerpo, por introducción de los genes en células huésped, para la expresión de los genes en el huésped, y para cosechar la proteína de fusión resultante son bien conocidos y enteramente documentados en el estado del arte. Los protocolos específicos se describen, por ejemplo, en Sambrook y colaboradores editores (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press.

Se entiende que los inmunoconjugados químicamente acoplados puede producirse utilizando una variedad de métodos bien conocidos por aquellos capacitados en el arte. Por ejemplo, el anticuerpo o un fragmento de anticuerpo puede ser acoplado químicamente a la citoquina utilizando cadenas laterales de aminoácidos químicamente reactivos en el anticuerpo o en el fragmento de anticuerpo y la citoquina. Las cadenas laterales de aminoácidos pueden enlazarse covalentemente, por ejemplo, a través de enlaces disulfuro, o por medio de reactivos de entrelazamiento homo o heterobifuncionales que incluyen, por ejemplo, N-succinimidil 3(-2-piridilditio)proprionato, éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinato, éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida, y 1,4-di-[3'(2'-piridiltio)propionamido]butano, todos los cuales se encuentran comercialmente disponibles con Pierce, Rockford, IL.

Se entiende que el término "inhibidor de angiogénesis" como se lo utiliza aquí, se refiere a cualquier molécula que reduce o inhibe la formación de nuevos vasos sanguíneos en un mamífero. Con relación a la terapia contra el cáncer, el inhibidor de angiogénesis reduce o inhibe la formación de nuevos vasos sanguíneos en o sobre un tumor, preferiblemente en o sobre tumo sólido. Se contempla que los inhibidores útiles de angiogénesis pueden identificarse utilizando una variedad de ensayos bien conocidos y utilizados en el estado del arte. Tales ensayos incluyen, por ejemplo, el ensayo de proliferación de células endoteliales capilares de bovino, el ensayo en la membrana corioalantoica de pollo (CAM) o el ensayo en cornea de ratón. Sin embargo, se prefiere el ensayo CAM (ver, por ejemplo, O'Reilly y colaboradores (1994) CELL 79: 315-328 y O'Reilly y colaboradores (1997) CELL 88: 277-285). En resumen, los embriones con yemas intactas se remueven de los huevos blancos fertilizados de tres días de edad y se colocan en una caja de petri. Después de incubación a 37ºC, 3% de CO_{2} durante tres días, se aplica un disco que contiene metilcelulosa al inhibidor putativo de angiogénesis a la membrana corioalantoica de un embrión individual. Después de incubación aproximadamente durante 48 horas, se observaron las membranas corioalantoicas bajo el microscopio para encontrar evidencia de zonas de inhibición.

Se conocen bien numerosos inhibidores de angiogénesis y enteramente documentados en el estado del arte. Los ejemplos de inhibidores útiles de angiogénesis en la práctica de la invención incluyen, por ejemplo, inhibidores proteicos/peptídicos de angiogénesis tales como: angiostatina, un fragmento proteolítico de plasminógeno (O'Reilly y colaboradores (1994) CELL 79:315-328, y las patentes estadounidenses Nos. 5.733.876; 5.837.682; y 5.885.795); endostatina, un fragmento proteolítico de colágeno XVIII (O'Reilly y colaboradores (1997) CELL 88: 277-285 y la patente estadounidense No. 5.854.205); péptidos que contienen la secuencia tripéptida RGD y capaces de enlazar a la integrina \alpha_{v}\beta_{3} (Brooks y colaboradores (1994) CELL 79: 1157-1164); y ciertos anticuerpos y fragmentos del mismo de enlazamiento al antígeno y péptidos que interactúan con la integrina \alpha_{v}\beta_{3} encontrada sobre células epiteliales vasculares de tumor (Brooks y colaboradores, supra). Sin embargo, actualmente se prefieren a la endostatina y a la angiostatina.

Como se lo utiliza aquí, se entiende que una porción de anticuerpo del inmunoconjugado se enlaza específicamente a un antígeno preseleccionado, una citoquina se enlaza específicamente a un receptor para la citoquina, o un inhibidor de angiogénesis se enlaza específicamente a un receptor para el inhibidor, si la afinidad de enlazamiento por el antígeno o por el receptor es mayor a 10^{5}M^{-1}, y más preferiblemente mayor a 10^{7}M^{-1}. Como se lo utiliza aquí, los términos angiostatina, endostatina, TNF, IL, GM-CSF, M-CSF, LT, e IFN no solamente se refieren a proteínas intactas sino también a fragmentos bioactivos y/o análogos de los mismos. Los fragmentos bioactivos se refieren a porciones de la proteína intacta que tienen al menos 30%, más preferiblemente al menos 70%, y lo más preferible al menos 90% de la activad biológica de las proteínas intactas. Análogos se refiere a especies y variantes alélicas de la proteína intacta, o a reemplazos de aminoácidos, inserciones o supresiones de los mismos que tienen al menos 30%, más preferiblemente al menos 70%, y lo más preferible al menos 90% de la actividad biológica de la proteína intacta.

Los inhibidores de angiogénesis pueden coadministrarse simultáneamente con el inmunoconjugado, o administrados separadamente por medio de diferentes rutas de administración. Las composiciones de la presente invención pueden administrarse por medio de cualquier ruta que sea compatible con las moléculas particulares. Por lo tanto, una administración apropiada puede ser oral o parenteral, incluidas las rutas de administración intravenosa e intraperitoneal.

Las composiciones de la presente invención pueden ser suministradas a un animal por medio de cualquier medio adecuado, directamente (por ejemplo, localmente, por medio de una inyección, implantación o administración tópica a un locus de tejido) o sistémicamente (por ejemplo, parenteral u oralmente). Cuando la composición vaya a ser suministrada parenteralmente, tal como por medio intravenoso, subcutáneo, oftálmico, intraperitoneal, intramuscular, bucal, rectal, vaginal, intraorbital, intracerebral, intracraneal, intraespinal, intraventricular, intratecal, intracisternal, intracapsular, intranasal o por medio de administración en aerosol, la composición contiene preferiblemente parte de una solución o suspensión acuosa fluida o fisiológicamente compatible. Así, el portador o vehículo es fisiológicamente aceptable de tal manera que además de la entrega de la composición deseada al paciente, este no afecta adversamente de otra manera el balance de electrolitos y/o el volumen del paciente. El medio fluido para el agente puede contener por lo tanto solución fisiológica normal (por ejemplo, NaCl acuoso al 9,85%, 0.15M, pH 7-7,4).

Las dosis preferidas del inmunoconjugado por administración se encuentran dentro del rango de 0,1 mg/m^{2}-100 mg/m_{2}, más preferiblemente, 1 mg/m^{2}-20 mg/m^{2}, y lo más preferible 2 mg/m^{2}-6 mg/m^{2}. Las dosis preferidas del inhibidor de angiogénesis generalmente dependerán del tipo de inhibidor de angiogénesis utilizado, sin embargo, las dosis óptimas pueden determinarse utilizando experimentación de rutina. La administración del inmunoconjugado y/o del inhibidor de angiogénesis pueden inyecciones periódicas de bolos, o por medio de una administración intravenosa o intraperitoneal continua a partir de un depósito externo (por ejemplo, a partir de una bolsa intravenosa) o interno (por ejemplo, a partir de un implante bioerosionable). Además, se contempla que el inmunoconjugado de la invención pueda ser administrado también al receptor deseado junto con una pluralidad de diferentes inhibidores de angiogénesis. Se contempla, sin embargo, que la combinación óptima de inmunoconjugados y de inhibidores de angiogénesis, las formas de administración y las dosis, se puedan determinar por medio de experimentación de rutina se haga pues dentro del nivel de la técnica en el estado del arte.

Pueden emplearse una variedad de métodos para evaluar la eficiencia de una terapia combinada utilizando proteínas de fusión de una citoquina con un anticuerpo e inhibidores de angiogénesis sobre respuestas inmunológicas. Por ejemplo, el modelo animal descrito en el Ejemplo 1, u otro modelo animal adecuado, puede ser utilizado por alguien entrenado para evaluar que inhibidores de angiogénesis, o combinaciones de inhibidores de angiogénesis, son más efectivos para actuar sinergísticamente con un inmunoconjugado, por ejemplo, una proteína de fusión de una citoquina con un anticuerpo (por ejemplo, la proteína de fusión anticuerpo-IL2) para reforzar la destrucción inmunológica de tumores establecidos. El inhibidor de angiogénesis, o la combinación de inhibidores de angiogénesis, puede administrarse antes de, o simultáneamente con, el curso de la terapia con el inmunoconjugado y el efecto sobre el tumor puede ser convenientemente observado por medio de mediciones volumétricas. Además, en la medida en que los nuevos inhibidores de angiogénesis se identifican, una persona capacitada será capaz de utilizar los métodos descritos aquí para evaluar el potencial de estos nuevos inhibidores para reforzar la actividad anticancerosa de las proteínas de fusión de una citoquina con un anticuerpo.

Alternativamente, después de la terapia, los tumores pueden ser cortados, seccionados y coloreados por medio de métodos histológicos estándar, o a través de reactivos inmunohistológicos específicos con el propósito de evaluar el efecto de la terapia combinada sobre la respuesta inmunológica. Por ejemplo, la coloración simple con hematoxilina y eosina puede revelar diferencias en la infiltración lipolítica dentro de los tumores sólidos lo cual es indicativo de una respuesta celular inmunológica. Además, la inmunocoloración de secciones con anticuerpos para clases específicas de inmunocitos, puede revelar la naturaleza de una respuesta inducida. Por ejemplo, los anticuerpos que se enlazan a CD45 (un marcador general de leucocitos), CD4 y CD8 (para la identificación de subclases de células T), y NK1.1 (un marcador sobre células NK), pueden utilizarse para evaluar el tipo de respuesta inmune que ha sido mediada por los inmunoconjugados de la invención.

Alternativamente, el tipo de respuesta inmune mediada por los inmunoconjugados puede evaluarse por medio de estudios convencionales de agotamiento de un subconjunto de células, por ejemplo en Lode y colaboradores (1998) BLOOD 91:1706-1715. Ejemplos de anticuerpos debilitantes incluyen a aquellos que reaccionan con los marcadores de células T CD4 y CD8, así como aquellos que se unen a los marcadores NK como el NK1.1 y asialo GM. En resumen, estos anticuerpos se inyectan al mamífero antes de iniciar el tratamiento de citoquina con anticuerpo en dosis bastante altas (por ejemplo, en dosis aproximadamente de 0,5 mg/ratón), y se suministran después de eso en intervalos semanales hasta completar el experimento. Esta técnica puede identificar los tipos necesarios de células necesarios para provocar la respuesta inmunológica observada en el mamífero.

En otra aproximación, la actividad citotóxica de los esplenocitos aislados de animales que han sido tratados con la terapia de combinación puede compararse con aquellas de otros grupos de tratamiento. Los cultivos de esplenocitos se preparan por medio de un picado mecánico de bazos estériles recuperados por medio de técnicas estándar encontradas en la mayoría de los manuales de laboratorio de inmunología. Ver, por ejemplo, Coligan y colaboradores (eds) (1988) "Current Protocols in Immunology", John Wiley & Sons, Inc. Las células resultantes son cultivadas entonces en un medio adecuado para cultivo celular (por ejemplo, DMEM de GIBCO) que contiene suero, antibióticos y una baja concentración de IL-2 (\sim10 U/mL). Por ejemplo, con el propósito de comparar la actividad de NK, normalmente 3 días de cultivo son óptimos, mientras que, con el propósito de comparar la actividad citotóxica de las células T, normalmente 5 días de cultivo son óptimos. La actividad citotóxica puede ser medida por medio de marcación radioactiva de células tumorales objetivo (por ejemplo, células LLC) con ^{51}Cr durante 30 minutos. Después de remover el exceso de radiomarcador, las células marcadas se mezclan con concentraciones variables de células cultivadas de bazo durante 4 horas. Al final de la incubación, el ^{51}Cr liberado de las células se mide por medio de un contador gama que es luego utilizado para cuantificar el grado de lisis de las células inducido por los inmunocitos. La actividad del linfocito T citotóxico tradicional (o CTL) se mide en esta forma.

La invención se ilustra además por medio de los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1 Modelo Animal

Se desarrolló un modelo murino contra el cáncer para estudiar el efecto de la combinación de proteínas de fusión de una citoquina con un anticuerpo y los inhibidores de angiogénesis en la mediación de respuestas inmunológicas efectivas contra un tumor. Las proteínas de fusión de una citoquina con un anticuerpo utilizadas en los siguientes ejemplos se unen a EpCAM, un antígeno tumoral humano encontrado en la mayoría de los tumores derivados del epitelio (ver, Perez y Walter (1989) J. IMMUNOL. 142:3662-3667). Con el propósito de analizar la eficacia en un modelo murino inmunocompetente, fue necesario expresar el antígeno humano sobre la superficie de una célula tumoral de ratón que es singénica con el huésped ratón. Las células de carcinoma de pulmón de Lewis (LLC), una línea celular bien conocida de cáncer de pulmón en ratón, fue seleccionada para este propósito. Como resultado, el antígeno tumoral humano, EpCAM, se expresó sobre la superficie de las células LLC.

Las células LLC fueron transfectadas con un plásmido de expresión que contiene un ADNc que codifica a un antígeno EpCAM humano (reconocido por medio del anticuerpo KS-1/4 como se describe en Vurki y colaboradores (1984) CANCER RES. 44:681), y conducido por el promotor temprano del citomegalovirus (CMV) (Immunogen, Carlsbad, CA). El antígeno KS (KSA o EpCAM) fue clonado por PCR a partir de ADNc preparado por medio de células de carcinoma de próstata humana, LnCAP. El iniciador hacia delante tenía la secuencia de oligonucleótidos 5' TCTAGAGCAGCATGGCGCCCCCGC (SEQ ID NO: 1), en la cual el ATG es el codón de iniciación de traducción, el iniciador inverso tenía la secuencia de oligonucleótidos 5' CTCGAGTTATGCATTGAGTTCCCT (SEQ ID NO: 2), en donde TTA es el anticodón de la terminación de la traducción. El ADNc de Ep-CAM fue clonado dentro de un vector retroviral pLNCS (Clontech, Palo Alto, CA) y la transfección fue realizada de acuerdo con protocolos establecidos (Ausubel y colaboradores, (eds) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons). En resumen, la línea celular de empaquetamiento PA317 (ATCC CRL 9078) fue transfectada con pLNCX-EpCAM por medio de coprecipitación en fosfato de calcio, y el medio acondicionado que contenía el virus usado para transfectar a las células LLC. Se añadió G418 (Sigma Chemical Co.) a las células transfectadas de a 1 mg/mL para seleccionar los clones estables. Se identificaron los clones que expresan al antígeno EpCAM humano (LLC-Ep) por medio de inmunocoloración y análisis por medio de la selección de células activadas por fluorescencia (FACS).

Como se describe en la Figura 1, los clones LLP-Ep coloreados primero con una proteína de fusión para el anticuerpo hu-KS-IL2 (ver el Ejemplo 2 más adelante) seguido por un anticuerpo específico Fc antihumano marcado con isocianato de fluoresceína (FITC) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA), exhibieron un nivel bastante uniforme de expresión de EpCAM humana. El nivel de expresión en estos clones estuvo bien por encima del nivel observado con clones coloreados solamente con el anticuerpo específico Fc antihumano marcado con FITC.

Con el propósito de mostrar que la expresión de una proteína humana de superficie celular no incrementó la inmunogenicidad de las células LLC-Ep, se inyectaron ratones C57B1/6 en forma subcutánea con diferentes números de células. Se encontró que todos los ratones desarrollaron rápidamente tumores progresivos después de la inyección con 5 x 10^{5} células, aproximadamente con la misma cinética de crecimiento observada con la línea celular parental LLC. Todos los animales llegaron a moribundos y fueron sacrificados para evitar sufrimiento innecesario.

Ejemplo 2 Preparación de Proteínas de Fusión del Inhibidor de Angiogénesis con un Anticuerpo o de Citoquina con un Anticuerpo

En los siguientes ejemplos se discuten una variedad de proteínas de fusión de una citoquina con un anticuerpo. En particular, el Ejemplo 3 revela el uso de las proteínas de fusión KS-murino\gamma2a-murino IL2 (huKS-mu\gamma2a-muIL2) humanizada y KS-murino\gamma2a-murino IL12 (huKS-mu\gamma2a-muIL12) humanizada. El Ejemplo 4 revela el uso de la proteína de fusión huKS-mu\gamma2a-muIL2 junto con angiostatina de murino-Fc de murino (muFc-muAngio) y las proteínas de fusión de endostatina de murino-Fc de murino (muFc-muEndo). El Ejemplo 5 revela el uso de las proteínas de fusión KS-humana \gamma4-humana IL2 (huKS-huy4-huIL2) humanizada y muFc-muEndo. Finalmente, el Ejemplo 6 revela el uso de la proteína de fusión KS-humana hu\gamma1-human IL2 (huKS-hu\gamma1-huIL2) humanizada con indometacina. La construcción de estas proteínas de fusión se discute más adelante.

huKS-hu\gamma1-huIL2

Se preparó un gen que codifica a la proteína de fusion huKS-hu\gamma1-huIL2 y se lo expresó esencialmente como se describe en Gillies y colaboradores (1998) J. IMMUNOL. 160:6195-6203 y en la patente estadounidense No. 5.650.150. En resumen, las regiones variables humanizadas del anticuerpo KS-1/4 de ratón (Varki y colaboradores, (1984) CANCER RES. 44:681-687) fueron modelados utilizando los métodos revelados en Jones y colaboradores (1986) NATURE 321: 522-525, que involucran la inserción de las CDR de cada región variable KS 1/4 dentro de las secuencias de la estructura de consenso de las regiones variables humanas con el más alto grado de homología. El modelamiento molecular con una estación de trabajo Silicon Graphics Indigo que implementa el programa BioSym conformó que se mantuvieron las formas de las CDR. Las secuencias de la proteína se tradujeron entonces en forma inversa, y los genes se construyeron por medio de la unión de oligonucleótidos superpuestos.

Las regiones variables resultantes se insertaron dentro de un vector de expresión que contenía las regiones constantes de la cadena liviana \kappa humana y la cadena pesada C\gammal humana esencialmente como se describe en Gillies y colaboradores (1992) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 89:1428-1432, excepto porque los promotores de metalotioneina y los reforzadores de la cadena pesada de la inmunoglobulina fueron reemplazados por el promotor CMV/reforzador para la expresión de ambas cadenas. Las fusiones de las secuencias maduras de IL-2 a los terminales carboxilo de las cadenas pesadas humanas se prepararon como se describe en Gillies y colaboradores (1992) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 89:1428-1432, excepto porque las regiones no traducidas 3' del gen IL-2 se derivaron de la región poli(A) SV40.

La proteína de fusión IL-2 se expresó por medio de la transfección del plásmido resultante dentro de la línea celular de mieloma NS/0 con medio de selección que contiene metrotexato 0,1 \muM. En resumen, con el propósito de obtener clones transfectados en forma estable, se introdujo ADN al plásmido dentro de las células NS/0 de mieloma de ratón por medio de electroporación. Las células NS/0 fueron cultivadas en medio de Eagle modificado de Dulbecco, suplementado con 10% de suero bovino fetal. Aproximadamente 5 x 10^{6} células fueron lavadas una vez con PBS y resuspendidas en 0,5 mL de PBS. Diez \mug de ADN linealizado de plásmido fueron incubados luego con las células en una Gene Pulser Cuvette (0,4 cm de separación de la puntas del electrodo, BioRad) sobre hielo durante 10 minutos. La electroporación se llevó a acabo utilizando una Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) programada a 0,25 V y 500 \muF. A las células se les permitió recuperarse durante 10 minutos sobre hielo, después de lo cual fueron resuspendidas en medio de crecimiento y luego sembradas sobre dos placas de 96 pozos. Los clones transfectados en forma estable fueron seleccionados para crecimiento en presencia de metrotexato 100 nM (MTX), los cuales fueron introducidos dos días después de la transfección. Las células fueron alimentadas cada 3 días por tres veces más, y aparecieron los clones resistentes al MTX en 2 a 3 semanas.

Los clones que se expresaron fueron identificados por medio de Fc o ELISA para citoquinas utilizando los anticuerpos apropiados (ver, por ejemplo, Gillies y colaboradores (1989) BIOTECHNOL. 7:798-804). La proteína de fusión resultante fue purificada por medio de enlazamiento y elución a partir de proteína A Sefarosa (Pharmacia), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

huKS-hu\gamma4-hulL2

Se construyó un gen que codifica a la proteína de fusión huKS.hu\gamma4.hulL2 y se expresó esencialmente como se describe en U.S.S.N. 09/256.156 presentada el 24 de febrero de 1999, que reivindica la prioridad con U.S.S.N. 60/075.887, presentada el 25 de febrero de 1998.

En resumen, una versión Ig\gamma4 de la proteína de fusión huKS-hu\gamma1-hulL2, descrita anteriormente, fue preparada por medio de la remoción del fragmento de gen C\gamma1 de la región constante de la inmunoglobulina del vector de expresión huKS-hu\gamma1-hulL2 y reemplazada con la secuencia correspondiente del gen C\gamma4 humano. Las secuencias y los alineamientos de la secuencia de las regiones constantes de la cadena pesada humana C\gamma1, C\gamma2, C\gamma3 y C\gamma4 se revelan en Huck y colaboradores (1986) Nuc. ACIDS RES. 14:1779-1789.

El intercambio de los fragmentos C\gamma1 y C\gamma4 se logró por medio de la digestión del ADN del plásmido que contenía al C\gamma1 original con Hind III y Xho I y la purificación de un gran fragmento de 7,8 kb por medio de electroforesis sobre gel de agarosa. Un segundo ADN de plásmido que contenía al gen C\gamma4 se digirió con Hind III y Nsi I y se purificó un fragmento de 1,75 kb. Un tercer plásmido que contenía al ADNc de IL-2 y al sitio poli A de SV40, fusionado al terminal carboxilo del gen C\gamma1 humano, se digirió con Xho I y Nsi I y se purificó el fragmento más pequeño de 470 pb. Los tres fragmentos se ligaron entre sí en cantidades molares aproximadamente iguales y se utilizó el producto de ligación para transformar al E. coli competente. El producto de ligación se utilizó para transformar al E. coli competente y las colonias se seleccionaron por medio del crecimiento sobre placas que contenían ampicilina. Los plásmidos recombinantes correctamente ensamblados se identificaron por medio de análisis de restricción de las preparaciones de ADN del plásmido a partir de los transformantes aislados y se utilizó la digestión con Fsp I para discriminar entre los insertos génicos C\gamma1(sin Fsp I) y C\gamma4 (un sitio).

El vector final, que contiene al reemplazo de la cadena pesada C\gamma4-IL2, fue introducido en células NS/0 de mieloma de ratón por medio de electroporación (0,25 V y 500 \muF) y se seleccionaron los transfectantes por medio del crecimiento en un medio que contenía metotrexato (0,1 \muM). Se identificaron los clones celulares que expresan altos niveles de la proteína de fusión huKS-hu\gamma1-hulL2, se expandieron, y se purificó a la proteína de fusión a partir de los sobrenadantes del cultivo utilizando cromatografía en proteína A Sefarosa. La pureza y la integridad de la proteína de fusión C\gamma4 fue determinada por medio de electroforesis sobre gel de poliacrilamida-SDS. La actividad de IL-2 se midió en un análisis de proliferación de células T (Gillis y colaboradores (1978) J. IMMUNOL. 120:2027-2032) y se encontró que era idéntica a aquella de la construcción \gammal.

huKS-mu\gamma2a-muIL2

Se construyó un gen que codifica a la proteína de fusión huKS-mu\gamma2a-muIL2 por medio del reemplazo de las regiones constantes del anticuerpo humano y de IL-2 humano de la proteína de fusión huKS-hu\gamma1-huIL2, como se describió anteriormente, con las correspondientes secuencias de murino. Específicamente, el ADN de C\gamma1-IL2 humano fue reemplazado con un fragmento de ADNc de C\gamma2a de murino fusionado a un ADN que codifica a IL-2 de murino. En resumen, la región VH de la huKS se unió en marco al ADNc de \gamma2a de murino, llevando a cabo una superposición por PCR utilizando iniciadores oligonucleótidos de superposición:

(sentido)	5' CC GTC TCC TCA GCCAAA ACA ACA GCC CCA TCG GTC	(SEQ ID NO: 3);
(antisentido)	5' GG GGC TGT TGT TTT GGC TGA GGA GAC GGT GAC TGA CG	(SEQ ID NO: 4);
(sentido)	5' C TTA AGC CAG ATC CAG TTG GTG CAG	(SEQ ID NO: 5); y
(antisentido)	5' CC CGG GGT CCG GGA GAA GCT CTT AGT C	(SEQ ID NO: 6).

Los oligonucleótidos de las SEQ ID NOS: 3 y 4 fueron diseñados para hibridar a la unión del dominio V_{H} de huKS y la región constante del ADNc \gamma2a de murino (en itálicas). En la primera vuelta de PCR, hubo dos reacciones separadas. En una reacción, el V_{H} del ADN de huKS fue utilizado como el molde con los oligonucleótidos de las SEQ ID NOS: 4 y 5. El iniciador de la SEQ ID NO: 5 introdujo un sitio de restricción AfIII (CTTAAG) secuencia arriba de la secuencia que codifica al amino terminal maduro de huKS V_{H} (en negrilla). En otra reacción, el ADNc de \gamma2a de murino fue utilizado como el molde con los oligonucleótidos de las SEQ ID NOS: 3 y 6. El iniciador de la SEQ ID NO: 6 hibridó al ADNc que codifica a la región alrededor del C-terminal de \gamma2a e introdujo un sitio de restricción Xmal (CCCGGG) por ligación posterior al ADNc de muIL2. Los productos PCR de las dos reacciones se mezclaron y se los sometió a una segunda vuelta por PCR, utilizando los oligonucleótidos de las SEQ ID NOS: 5 y 6. El producto PCR resultante se clonó, y después de la verificación de la secuencia, el fragmento AfIII-Xmal que codifica al V_{H} de huKS y a la región constante \gamma2a de murino, fue utilizado para ligación al ADN que codifica al péptido señal en el sitio AfIII el ADNc de muIL2 en el sitio Xmal.

El ADNc de IL2 de murino fue clonado a partir del ARNm de las células mononucleares de la sangre periférica de murino utilizando los oligonucleótidos expuestos en la SEQ ID NOS: 7 y 8, especialmente:

(sentido)	5' GGC CCG GGT AAA GCA CCC ACT TCA AGC TCC	(SEQ ID NO. 7); y
(antisentido)	5' CCCTCGAGTTATTGAGGGCTTGTTG	(SEQ ID NO. 8).

El iniciador de la SEQ ID NO: 7 adaptó al muIL2 (secuencia en negrilla) para unirse a \gamma2a de mu en el sitio de restricción de Xmal (CCCGGG). El iniciador de la SEQ ID NO: 8 introdujo un sitio de restricción Xhol (CTCGAG) inmediatamente después del codón de terminación de la traducción (antisentido en negrillas).

En forma similar, el dominio liviano variable (V_{L}) de huKS se unió a la secuencia de ADNc de mu \kappa por medio de superposición por PCR. Los oligonucleótidos de superposición utilizados incluyeron:

(sentido)	5' G GAA ATA AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT G	(SEQ ID NO. 9);
(antisentido)	5' GC AGC ATC AGC CCGTT TTA TTT CCA GCT TGG TCC	(SEQ ID NO. 10);
(sentido)	5' C TTA AGC GAG ATC GTG CTG ACC CAG	(SEQ ID NO. 11); y
(antisentido)	5' CTC GAG CTA ACA CTC ATT CCT GTT GAA GC	(SEQ ID NO. 12).

Los oligonucleótidos fueron diseñados para hibridar a la unión de la V_{L} de huKS y la región constante del ADNc de \kappa de murino (en itálicas). En la primera vuelta por PCR, hubo dos reacciones separadas. En una reacción la V_{L} del ADN de huKS fue utilizada como molde, con los oligonucleótidos expuestos en las SEQ ID NOS: 10 y 11, que introdujo un sitio de restricción AfIII (CTTAAG) secuencia arriba de la secuencia que codifica al amino terminal maduro de huKS V_{L} (en negrilla). En la otra reacción, el ADNc de \kappa de murino fue utilizado como molde, con los oligonucleótidos expuestos en las SEQ ID NOS: 9 y 12, que introdujo un sitio de restricción Xhol (CTCGAG) después del codón de terminación de la traducción (antisentido en negrillas).

Los productos PCR de las dos reacciones se mezclaron y se los sometió a una segunda vuelta por PCR, utilizando los oligonucleótidos expuestos en las SEQ ID NOS: 11 y 12. El producto PCR resultante se clonó, y después de la verificación de la secuencia, el fragmento AfIII-Xhol que codifica al V_{L} de huKS y la mezcla de la región constante \kappa de murino, fue ligada al ADN que codifica al péptido señal en el sitio AfIII.

Ambas secuencias de la cadena liviana y de la cadena pesada de murino fueron utilizadas para reemplazar las secuencias humanas en pdHL7. El vector de expresión del anticuerpo resultante, que contiene un gen marcador seleccionable dhfr, fue electroporado (0,25 V, 500 \muF), dentro de células NS/0 de mieloma de murino y los clones fueron seleccionados por medio de cultivo en un medio que contiene metotrexato 0,1 \muM. Los clones transfectados, resistentes al metrotexato fueron analizados por secreción de los determinantes del anticuerpo por medio de métodos estándar de ELISA. Las proteínas de fusión se purificaron a través de cromatografía en proteína A Sefarosa de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

huKS-mu\gamma2a-muIL12

Se construyó un gen que codifica a la proteína de fusión huKS mu\gamma2a-mulL12 y se expresó esencialmente como se describe en U.S.S.N. 08/986.997 presentada el 8 de diciembre de 1997, y Gillies y colaboradores (1998) J. IMMNUNOL. 160:6195-6203. En resumen, esto se logró por medio de la fusión del ADNc de la subunidad IL-12 de p35 de murino a la región de codificación de la cadena pesada huKS-mu\gamma2a preparada previamente. El vector resultante fue transfectado entonces dentro de una línea celular NS/0 de mieloma transfectada previamente con, y capaz de expresar a la subunidad IL-12 de p40. En otras palabras, una línea celular fue transfectada con p40 solo y se selecciono una célula estable de alta expresión, que fue utilizada entonces como receptora para la transfección por medio de la proteína de fusión que contiene a p35 (esto es, transfección secuencial).

Las subunidades IL-12 de p40 y p35 de murino fueron aisladas por medio de PCR a partir del ARNm preparado de las células de bazo activadas con Concanavalina A (5 \mug/mL en medio de cultivo durante 3 días). Los iniciadores PCR utilizados para aislar la secuencia de ácido nucleico que codifica a p35 que también adaptaron al ADNc de p35 como un fragmento de restricción Xmal-Xhol incluyeron:

: 5' CCCCGGGTAGGGTCATTCCAGTCTCTGG (SEQ ID NO: 13); y

: 5' CTCGAGTCAGGCGGAGCTCAGATAGC (SEQ ID NO: 14).

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El iniciador PCR utilizado para aislar la secuencia de ácido nucleico que codifica a p40 incluye:

: 5' TCTAGACCATGTGTCCTCAGAAGCTAAC (SEQ ID NO: 15); y

: 5' CTCGAGCTAGGATCGGACCCTGCAG (SEQ ID NO: 16).

Un vector plásmido (pdHL7-huKS-mu\gamma2a-p35) fue construido como se describe (Gillies y colaboradores, J. IMMUNOL. METHODS 125:191) que contiene a un gen marcador seleccionable dhfr, a una unidad de transcripción que codifica a una cadena liviana del anticuerpo humanizado KS, y a una unidad de transcripción que codifica a una cadena pesada de murino fusionada a la subunidad p35 de IL-12 de ratón. La fusión se logró por medio de la ligación del fragmento Xmal al fragmento Xhol del ADNc adaptado de la subunidad p35, a un único sitio Xmal en el extremo del exón CH3 del gen \gamma2a de murino preparado previamente. Ambas unidades de transcripción de la cadena H y de la cadena L incluyeron un promotor de citomegalovirus (CMV) (en lugar del promotor de metalotioneina en la referencia original) en el extremo 5' y, un sitio de poliadenilación en el extremo 3'.

Se construyó un vector similar (pNC-p40) para la expresión de la subunidad libre p40 que incluye a un gen marcador seleccionable (gen resistente a la neomicina) pero utilizando aún al promotor CMV para la transcripción. La región de codificación en este caso incluyó a la secuencia líder natural de la subunidad p40 para el tráfico adecuado al retículo endoplasmático y la unión con la proteína de fusión. El plásmido pNC-p40 fue electroporado dentro de las células y estas fueron sembradas sobre placas y seleccionadas en un medio que contenía G418. En este caso, los sobrenadantes del cultivo a partir de los clones resistentes a la droga, fueron analizados por medio de ELISA para la producción de la subunidad p40.

El vector de expresión pdHL7-huKS-mu\gamma2a-p35 fue electroporado dentro de la línea celular NS/0 que ya expresa p40 de murino, como se describe en Gillies y colaboradores (1998) J. IMMUNOL. 160:6195-6203. Los clones transfectados resistentes al metotrexato fueron analizados por la secreción de determinantes de anticuerpo e IL-12 de ratón por medio de métodos estándar ELISA. La proteína resultante fue purificada por medio del enlazamiento a, y elución a partir de una columna de proteína A Sefarosa de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.

muFc-muEndo

Un gen que codifica a la proteína de fusión muFc-muEndo fue construido y expresado esencialmente como se describe en U.S.S.N. 60/097.883, presentada el 25 agosto de 1998.

En resumen, la endostatina de murino y la Fc de murino fueron expresadas como una proteína de fusión muFc-muEndostatina. Se utilizó PCR para adaptar al gen de la endostatina para la expresión en el vector pdCs-muFc(D_{4}K) (Lo y colaboradores (1998) PROTEIN ENGINEERING 11:495-500) que contiene un sitio de reconocimiento para enteroquinasa Asp4-Lys (LaVallie y colaboradores (1993) J. BIOL. CHEM. 268: 23311-23317). El iniciador hacia adelante 5'-C CCC AAG CTT CAT ACT CAT CAG GAC TTT C (SEQ ID NO: 17), donde el AAGCTT (sitio HindIII) fue seguido por la secuencia (en negrilla) que codifica al N-terminal de la endostatina. El iniciador inverso fue 5'-CCC CTC GAG CTA TTT GGA GAA AGA GGT C (SEQ ID NO: 18), que fue diseñado para colocar un codón de DETENCIÓN de la traducción (anticodón, CTA) inmediatamente después del C-terminal de la endostatina, y esto fue seguido por un sitio Xhol (CTCGAG).

El producto PCR fue clonado y secuenciado, y el fragmento HindIII-Xhol que codifica a la endostatina se ligó dentro del vector pdCs-muFc(D_{4}K). Los clones estables NS/0 que expresan muFc(D_{4}K)-muEndo se seleccionaron y se ensayaron utilizando un ELISA anti-muFc. La proteína de fusión resultante fue expresada y purificada a través de cromatografía en Proteína A Sefarosa.

muFc-muAngio

Un gen que codifica a la proteína de fusión muFc-muAngio fue construido y expresado esencialmente como se describe en U.S.S.N. 60/097.883, presentada el 25 agosto de 1998.

En resumen, la angiostatina de murino y la Fc de murino fueron expresadas como una proteína de fusión muFc-muAngiostatina. Se utilizó PCR para adaptar la secuencia NA de la angiostatina, gentilmente suministrada por el laboratorio del Dr. Judah Folkman, Childrens Hospital, Boston, MA, para la expresión en el vector pdCs-Fc(D_{4}K) (Lo y colaboradores (1998) PROTEIN ENGINEERING 11:495-500). El iniciador hacia adelante fue 5'-C CCC AAG CTT GTG TAT CTG TCA GAA TGT AAG CCC TCC TGT CTC TGA GCA (SEQ ID NO: 19), donde el AAGCTT (sitio HindIII) fue seguido por la secuencia (en negrilla) que codifica al N-terminal de la angiostatina. El iniciador inverso fue 5'-CCC CTC GAG CTA CCC TCC TGT CTC TGA GCA (SEQ ID NO: 20), que se diseñó para colocar un codón de DETENCIÓN de la traducción (anticodón, CTA) inmediatamente después del C-terminal de la angiostatina, y esto fue seguido por un sitio XhoI (CTCGAG).

El producto PCR fue clonado y secuenciado, y el fragmento HindIII-Xhol que codifica a la angiostatina se ligó dentro del vector pdCs-muFc(D_{4}K). Los clones estables NS/0 que expresan muFc(D_{4}K)-muAngio se seleccionaron y se ensayaron utilizando un ELISA anti-muFc. La proteína de fusión resultante fue expresada y purificada a través de cromatografía en Proteína A Sefarosa.

Ejemplo 3 Terapia de Combinación utilizando a las proteínas de fusión KS-IL2 y KS-IL12 para el Tratamiento de Tumores LLC-Ep

Los ratones hembra C57B1/6 fueron inyectados en forma subcutánea en medio de la espalda con células LLC-Ep (5 x 10^{5} por ratón) que crecieron en cultivo celular. Aproximadamente después de dos semanas, los animales con tumores palpables en el rango de 150-400 mm^{3} fueron divididos en cuatro grupos, con una distribución igual de los tamaños de los tumores entre los grupos. Los animales fueron tratados como sigue: en el grupo 1, los animales recibieron únicamente PBS (grupo de control); en el grupo 2, los animales recibieron únicamente a la proteína de fusión huKS-mu\gamma2a-muIL2; en el grupo 3, los animales recibieron únicamente la proteína de fusión huKS-mu\gamma2a-muIL12; y en el grupo 4, los animales recibieron ambas proteínas de fusión, la huKS-mu\gamma2a-muIL2 y la huKS-mu\gamma2a-muIL12. El crecimiento del tumor fue observado por medio de mediciones volumétricas hasta que los animales en el grupo de control se tornaron moribundos y se les aplicó la eutanasia. Se midieron los volúmenes de los tumores con calibradores y se calcularon como V = 4 \pi/3 (0.5L x 0.5W x 0.5H), donde L es el largo, W es el ancho, y H es la altura del tumor.

Los resultados se resumen en la Fig. 3. Los ratones tratados con PBS se representan por medio de diamantes sin relleno, los ratones tratados con 15 \mug/día de la proteína de fusión huKS-mu\gamma2a-muIL2 se representan por medio de cuadrados rellenos, los ratones tratados con 10 \mug/día de una proteína de fusión huKS-mu\gamma2a-muIL12 se representan por medio de triángulos rellenos, y los ratones tratados con una combinación de 7.5 \mug/día de la proteína de fusión huKS-mu\gamma2a-muIL2 y 5 \mug/día de la proteína de fusión huKS-mu\gamma2a-muIL12 se representan por medio de cruces.

Como se ilustra en la Fig. 3, el tratamiento con la proteína de fusión huKS-mu\gamma2a-muIL2 (15 \mug durante 5 días consecutivos) no retrasó o redujo el crecimiento de los tumores LLC-Ep (cuadrados rellenos). Solamente se observó un ligero efecto antitumoral en los ratones tratados con la proteína de fusión huKS-mu\gamma2a-muIL12 sola de a 10 \mug por dosis durante cinco días consecutivos (triángulos rellenos). Sin embargo, cuando se combinaron las dos proteínas de fusion utilizando la mitad de las cantidades originales para cada una (7.5 \mug de huKS-mu\gamma2a-muIL2 y 5 \mug de huKS-mu\gamma2a-muIL12, respectivamente), se observó un sorprendente retraso en el crecimiento (cruces) sugiriendo un efecto sinergístico entre las dos proteínas de fusión.

Ejemplo 4 Terapia utilizando una Proteína de Fusión de una Citoquina con un Anticuerpo y una Combinación de Angiostatina y Endostatina

Los ratones hembra C57B1/6 fueron inyectados en forma subcutánea en medio de la espalda con células LLC-Ep (5 x 10^{5} por ratón) que crecieron en cultivo celular. Aproximadamente después de dos semanas, los animales con tumores palpables en el rango de 150-400 mm^{3} fueron divididos en cuatro grupos y fueron tratados como sigue: (1) los animales recibieron únicamente PBS; (2) los animales recibieron una mezcla de muFc-Angio y muFc-Endo; (3) los animales recibieron una proteína de fusión huKS-mu\gamma2a-muIL2; y (4) los animales recibieron tanto a la proteína de fusión huKS-mu\gamma2a-muIL2 como a la mezcla de muFc-Angio y muFc-Endo. Los animales fueron inyectados con sus respectivos tratamientos durante cinco días consecutivos.

muFc-Angio y muFc-Endo son administrados a ratones que padecen de tumores en una dosis de 5 mg/kg. Los animales que reciben a la proteína de fusion huKS-mu\gamma2a-muIL2 son tratados con dosis diarias de 10 \mug de huKS-mu\gamma2a-muIL2 durante un total de 5 días. El crecimiento de los tumores se observa por medio de mediciones volumétricas.

Se contempla que el tratamiento con la mezcla de muFc-Angio y muFc-Endo solamente será efectiva con tumores LLC que se contraen durante un período de tratamiento de dos semanas. Se contempla, sin embargo, que este tratamiento no será tan efectivo durante un corto período de, por ejemplo, cinco días. También se contempla que los animales tratados solamente con la proteína de fusión muKS-muIL2 exhibirán una mínima actividad antitumoral. Se contempla, sin embargo, que el grupo que recibe tanto a la proteína de fusión huKS-mu\gamma2a-muIL2 como la mezcla de muFc-Angio y muFc-Endo mostrarán una significativa reducción en el crecimiento del tumor en comparación con cualquiera de las dos del grupo, muFc-Angio o muFc-Endo, o el grupo de la proteína de fusión huKS-mu\gamma2a-muIL2.

Ejemplo 5 Terapia de Combinación de una Proteína de Fusión de una Citoquina con un Anticuerpo y Endostatina

Las células de carcinoma CT26 de ratón que expresan EpCAM humana fueron inyectadas en forma subcutánea en las espaldas rasuradas de ratones BALB/c (2 x 10^{6} células por inyección). Cuando los tumores alcanzaron un tamaño de 100-200 mm^{3} (aproximadamente de 7 a 14 días), los ratones fueron divididos en forma aleatoria en cuatro grupos, 4 ratones por grupo. El grupo 1 recibió inyecciones intravenosas de 0,2 mL de PBS, diariamente. El grupo 2 recibió inyecciones intravenosas de muFc-muEndostatina (320 \mug/ratón) en PBS, diariamente. El grupo 3 recibió inyecciones intravenosas de la proteína de fusión huKS-hu\gamma4-huIL2 (10 \mug/ratón) en PBS, diariamente durante 5 días únicamente. El grupo 4 recibió inyecciones intravenosas de una combinación de huKS-hu\gamma4-huIL2 (10 \mug/ratón) y muFc-muEndo (320 \mug/ratón) en PBS, diariamente durante 5 días, y después de eso inyecciones diarias de muFc-muEndo (320 \mug/ratón) en PBS. Se midieron los volúmenes de los tumores como se describió en el Ejemplo 3.

Los resultados se resumen en la Fig. 4. Los ratones tratados con PBS se representan por medio de diamantes rellenos, los ratones tratados con la proteína de fusión muFc-muEndo se representan por medio de cuadrados rellenos, los ratones tratados con una proteína de fusión huKS-hu\gamma4-huIL2 se representan por medio de diamantes rellenos y los ratones tratados con una combinación de la proteína de fusión muFc-muEndo y la proteína de fusión huKS-hu\gamma4-huIL2 se representan por medio de cruces.

La Fig. 4 muestra que la combinación de la proteína de fusión de una citoquina con un anticuerpo y la proteína antiangiogénica muFc-muEndo fue superior a cualquiera de los agentes por sí mismos. Después de un tratamiento durante 19 días, la relación T/C (tamaño promedio de los tumores en el grupo de tratamiento/tamaño promedio de los tumores en el grupo de control) para la terapia de combinación de huKS-hu\gamma4-huIL2 y muFc-muEndo fue de 0,25, que fue una mejora significativa sobre el T/C de 0,31 para huKS-hu\gamma4-huIL2 y 0,42 para muFc-muEndo.

Ejemplo 6 Terapia de Combinación de una Proteína de Fusión de una Citoquina con un Anticuerpo e Indometacina

Los ratones hembra C57B1/6 fueron inyectados en forma subcutánea en medio de la espalda con células LLC-Ep (2 x 10^{6} células por inyección). Cuando los tumores alcanzaron 600-1200 mm^{3}, los ratones fueron sacrificados. La piel sobre el tumor fue limpiada con betadina y etanol, los tumores fueron cortados y se descartó el tejido necrótico. Se preparó una suspensión de células tumorales en solución fisiológica amortiguada con fosfato, por medio del paso viable del tejido tumoral a través de un tamiz y luego a través de una serie de agujas hipotérmicas secuencialmente cada vez más pequeñas con un calibre de 22 hasta 30. Las células se ajustaron hasta una concentración de 1 x 10^{7} células/mL y se colocaron sobre hielo. Los ratones C57BL/6 fueron inyectados entonces con 0,1 mL de las células resuspendidas en forma fresca (1 x 10^{6} células/ratón) en la línea media proximal del dorso subcutáneo.

Cuando los tumores alcanzaron un tamaño de 100-200 mm^{3} (aproximadamente de 7 a 14 días), los ratones fueron divididos en forma aleatoria en cuatro grupos, 5 ratones por grupo. El grupo 1 recibió inyecciones intravenosas de 0,2 mL de PBS, diariamente. El grupo 2 recibió 5 inyecciones intravenosas diariamente de huKS-hu\gamma1-huIL2 (25 \mug/ratón) en PBS. El grupo 3 recibió indometacina en forma oral en agua para beber (20 \mug/mL, o aproximadamente 50-70 \mug de indometacina consumidos diariamente por ratón) durante todo el período de tratamiento. El grupo 4 recibió 5 inyecciones intravenosas diarias de huKS-hu\gamma1-huIL2 (25 \mug/ratón), e indometacina en forma oral en agua para beber (20 \mug/mL) durante todo el período del tratamiento. Se midieron los volúmenes de los tumores como se describió en el Ejemplo 3.

Los resultados se presentan en la Fig. 5. Los ratones tratados con PBS se representan por medio de diamantes sin relleno, los ratones tratados con la proteína de fusión huKS-hu\gamma1-huIL2 se representan por medio de cuadrados rellenos, los ratones tratados con indometacina se representan por medio de triángulos rellenos, y los ratones tratados con una combinación de la proteína de fusión huKS-hu\gamma1-huIL2 e indometacina se representan por medio de cruces.

La Fig. 5 muestra que la combinación de la proteína de fusión de una citoquina con un anticuerpo y el compuesto químico antiangiogénico indometacina fue superior a cualquiera de los agentes por sí mismos. Después de un tratamiento durante 22 días, la relación T/C para la terapia de combinación de huKS-hu\gamma4-huIL2 e indometacina fue de 0,40, lo cual fue una mejora significativa sobre el T/C de 0,61 para huKS-hu\gamma4-huIL2 y 0,60 para indometacina.

<110> Gillies, Stephen D

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<120> Coadministración de un Inhibidor de la Angiogénesis para Reforzar la Respuesta Inmunológica por medio de la Mediación de una Proteína de Fusión de una Citoquina con un Anticuerpo

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<130> LEX-004PC

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<140>

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<141>

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<150> 60/081.863

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<151> 1998-04-14

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<160> 20

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador PCR

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<220>

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<221> características_misc

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<222> (12)..(14)

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<223> Codón de terminación de la traducción

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

tctagagcag catggcgccc ccgc

\hfill

24

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<210> 2

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador PCR

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<220>

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<221> características_misc

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<222> (7).. (9)

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<223> Anticodón de terminación de la traducción

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctcgagttat gcattgagtt ccct

\hfill

24

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<210> 3

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<211> 35

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador PCR

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<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgtctcctc agccaaaaca acagccccat cggtc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador PCR

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggctgttg ttttggctga ggagacggtg actgacg

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador PCR

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttaagccag atccagttgg tgcag

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador PCR

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccggggtcc gggagaagct cttagtc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador PCR

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcccgggta aagcacccac ttcaagctcc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador PCR

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccctcgagtt attgagggct tgttg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador PCR

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaaataaaa cgggctgatg ctgcaccaac tg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador PCR

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcagcatcag cccgttttat ttccagcttg gtcc

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador PCR

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttaagcgag atcgtgctga cccag

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador PCR

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcgagctaa cactcattcc tgttgaagc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador PCR

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccccgggtag ggtcattcca gtctctgg

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador PCR

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcgagtcag gcggagctca gatagc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador PCR

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctagaccat gtgtcctcag aagctaac

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador PCR

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcgagctag gatcggaccc tgcag

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador PCR

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccccaagctt catactcatc aggactttc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador PCR

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccctcgagc tatttggaga aagaggtc

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador PCR

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccccaagctt gtgtatctgt cagaatgtaa gccctcctgt ctctgagca

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador PCR

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccctcgagc taccctcctg tctctgagca

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

Claims

1. Una composición que comprende en combinación:

(i): una proteína de fusión de (a) una molécula de inmunoglobulina que contiene en dirección amino terminal hacia carboxi terminal un dominio variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina (VH) capaz de enlazar al antígeno, un dominio constante de una cadena pesada 1 de una inmunoglobulina (CH1) y un dominio constante de una cadena pesada 2 de una inmunoglobulina (CH2), y (b) una citoquina fusionada al carboxi terminal del dominio de la inmunoglobulina capaz de inducir una respuesta inmunológica contra dicho antígeno en dicho mamífero, en donde la proteína de fusión induce una respuesta inmunológica contra un antígeno de un tipo preseleccionado de célula en un mamífero, y

(ii): un inhibidor de angiogénesis seleccionado del grupo que consiste de

(a): endostatina,

(b): angiostatina,

(c): un péptido que tiene afinidad de enlazamiento por la integrina \alpha_{v}\beta_{3}, y

(d): un anticuerpo que tiene afinidad de enlazamiento por la integrina \alpha_{v}\beta_{3},

: en una cantidad, en donde el inhibidor de angiogénesis refuerza dicha respuesta inmunológica inducida por medio de la proteína de fusión con relación a la proteína de fusión sola.

2. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el dominio de la inmunoglobulina comprende además a un dominio constante de la cadena pesada 3 de una inmunoglobulina (CH3), interpuesta entre el dominio CH2 y la citoquina.

3. Una composición de la reivindicación 1 ó 2, en donde la molécula de inmunoglobulina comprende además una cadena liviana de inmunoglobulina (VL) combinada con el dominio VH para producir un sitio único y completo para enlazamiento del antígeno.

4. Una composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la citoquina de la proteína de fusión se selecciona del grupo que consiste de un factor de necrosis tumoral, una interleuquina, un factor de estimulación de una colonia, y una linfoquina.

5. Una composición de la reivindicación 4, en donde la interleuquina se selecciona del grupo IL-2, IL-4, IL-7 e IL-12.

6. Una composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el tipo preseleccionado de célula es una célula cancerosa.

7. El uso de una composición como la definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la elaboración de un medicamento que refuerza en un mamífero la respuesta inmunológica citócida contra un tipo preseleccionado de célula.

8. El uso de la reivindicación 7, en donde el medicamento es adecuado para el tratamiento de cáncer.