ES2267136T3 - Anticuerpo monocional antirreceptor fit-1 del vegf humano. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE UN ANTICUERPO MONOCLONAL QUE REACCIONA INMUNOLOGICAMENTE CON UN RECEPTOR FLT - 1 DE VEGF HUMANO, Y CELULAS EN LAS CUALES EL RECEPTOR FLT - 1 DE VEGF HUMANO SE EXPRESA SOBRE LA SUPERFICIE DE LA CELULA, Y UN ANTICUERPO MONOCLONAL QUE INHIBE LA UNION DE VEGF HUMANO AL RECEPTOR FLT - 1 DE VEGF HUMANO. TAMBIEN DESCRIBE UN MEDIO PARA EL DIAGNOSTICO O EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES EN LAS CUALES SUS ESTADOS MORBIDOS SE DESARROLLAN MEDIANTE ANGIOGENESIS ANORMAL, TAL COMO LA PROLIFERACION O LA METASTASIS DE TUMORES SOLIDOS, LA ARTRITIS EN LA ARTRITIS REUMATOIDE, LA RETINOPATIA DIABETICA, LA RETINOPATIA DE PREMATURIDAD, LA PSORIASIS Y SIMILARES.
Description
Anticuerpo monoclonal antirreceptor
Flt-1 del VEGF humano.
La presente invención se refiere a un anticuerpo
monoclonal capaz de unirse específicamente al receptor
Flt-1 del VEGF humano que es útil para el
diagnóstico o el tratamiento de enfermedades en las que sus estados
patológicos evolucionan mediante angiogénesis anormal, como por
ejemplo proliferación o metástasis de tumores sólidos, artritis en
artritis reumatoide, retinopatía diabética, retinopatía del
prematuro y psoriasis; a un hibridoma capaz de producir el
anticuerpo; a un método para detectar inmunológicamente el receptor
Flt-1 del VEGF humano utilizando el anticuerpo
monoclonal; a la utilización del anticuerpo monoclonal para el
diagnóstico y a la terapia de enfermedades tales como el tumor
sólido, la artritis reumatoide, la retinopatía diabética, la
retinopatía del prematuro, la psoriasis y similares.
La angiogénesis desempeña una función importante
en el desarrollo individual y en la construcción de tejidos en los
vertebrados, está directamente implicada en la formación del cuerpo
lúteo durante el ciclo sexual, en la proliferación transitoria del
endometrio uterino y en la formación de la placenta en individuos
maduros (hembras). Con respecto a los estados patológicos, la
angiogénesis está implicada en la proliferación o metástasis de
tumores sólidos y en la formación o aceleración de la patología en
la retinopatía diabética y en la artritis reumatoide (J. Biol.
Chem., 267, 10931 (1992)). La angiogénesis se produce por
la secreción de un factor de angiogénesis e implica el proceso de la
formación de un tubo y la producción de un nuevo vaso sanguíneo.
Durante este proceso, la membrana basal y el intersticio son
destruidos por una proteasa segregada por las células endoteliales
de un vaso sanguíneo existente alrededor del factor de angiogénesis
segregado, seguido del errabundeo y proliferación posterior de las
células endoteliales vasculares (J. Biol. Chem., 267,
10931 (1992)). Los factores que provocan angiogénesis incluyen el
factor de permeabilidad vascular (en adelante "VPF") y el
factor de crecimiento endotelial vascular (en adelante "VPF")
(en adelante "VPF/VEGF"). Estos factores se consideran los
factores más importantes en la angiogénesis patológica y no
patológica (Advances in Cancer Research, 67, 281
(1995). VPF/VEGF es una proteína con un peso molecular de
aproximadamente 40.000 constituida por homodímeros, que había sido
descrita al ser moléculas independientes como factor de
permeabilidad vascular (VPF) en 1983 (Science, 219,
983 (1983)) y como un factor de crecimiento endotelial vascular
(VEGF) en 1989 (Biochem. Biophys. Res. Comm., 161, 851
(1989)), pero se ha puesto de manifiesto como resultado de la
clonación del ADNc que son la misma sustancia (Science,
246, 1306 (1989); Science 246, 1309 (1989)) (en
adelante, el término "VPF/VEGF" se denomina "VEGF").
Además de la actividad de VEGF en las células endoteliales
vasculares descritas anteriormente, se ha demostrado que VEGF
presenta además una actividad que potencia el crecimiento
(Biochem. Biophys. Res. Comm., 161, 851 (1989)), una
actividad potenciadora de la migración (J. Immunology,
152, 4149 (1994)), una actividad potenciadora de la secreción
de la metaloproteasa (J. Cell Physiol., 153, 557
(1992)) y una actividad potenciadora de secreción de urocinasa y tPA
(Biochem. Biophys. Res. Comm., 161, 902 (1991)).
Además, se ha demostrado que VEGF presenta una actividad
potenciadora de angiogénesis (Circulation, 92 supl.
II, 365 (1995)) y una actividad potenciadora de la permeabilidad
vascular (Science, 219, 983 (1983)), como sus
actividades in vivo. Se ha indicado que VEGF es un factor de
crecimiento con especificidad sumamente elevada para las células
endoteliales vasculares (Biochem. Biophys. Res. Comm.,
161, 851 (1989)) y que cuatro proteínas que tienen diferentes
pesos moleculares están presentes debido al corte y empalme
alternativo del ARNm (J. Biol. Chem., 267, 26031
(1991)).
Entre las enfermedades acompañadas de
angiogénesis, se ha descrito que VEGF desempeña una función
importante en la proliferación o en la metástasis de tumores sólidos
y en la formación de estados patológicos de la retinopatía diabética
y de la artritis reumatoide. Con respecto a los tumores sólidos, se
ha descrito la producción de VEGF en numerosos tejidos tumorales
humanos, tal como en el carcinoma renal (Cancer Research,
54, 4233 (1994)), cáncer de mama (Human Pathology,
26, 86 (1995)), tumor cerebral (J. Clinical
Investigation, 91, 153 (1993)), cáncer gastrointestinal
(Cancer Research, 53, 4727 (1993)) y cáncer de ovario
(Cancer Research, 54, 276 (1994)). Asimismo, los
resultados de un estudio sobre la correlación entre la cantidad de
expresión de VEGF en tumores y la proporción superviviente de
pacientes en pacientes con cáncer de mama ha puesto de manifiesto
que la angiogénesis tumoral es más activa en los tumores que
expresan elevadas concentraciones de VEGF que en tumores con baja
expresión de VEGF y que la proporción de supervivencia es menor en
los pacientes con cáncer de mama que presentan tumores con expresión
elevada de VEGF que los pacientes con cáncer de mama que presentan
tumores con expresión baja de VEGF (Japanese J. Cancer
Research, 85, 1045 (1994)). Se ha publicado también que
un anticuerpo monoclonal anti-VEGF inhibió el
crecimiento del tumor en un sistema de prueba del modelo de
xenotrasplante en el que se transfectó un tumor humano en ratones
lampiños por trasplante subcutáneo (Nature, 362, 841
(1993)). Asimismo, se ha publicado que, en un modelo de cáncer
metastásico de un tumor humano en ratones lampiños, un anticuerpo
monoclonal anti-VEGF inhibió la metástasis del tumor
(Cancer Research, 56, 921 (1996)). Además, dado que se
detectó una concentración elevada de VEGF en perfusiones de la
pleura carcinomatosa humana y ascitis, se ha sugerido la posibilidad
de que VEGF sea un factor principal implicado en la retención de
perfusiones de pleura y artritis (Biochimica et Biophysica
Acta, 1221, 211 (1994)).
En la retinopatía diabética, la angiogénesis
anormal produce desprendimiento de retina y hemorragia del cuerpo
vítreo, produciendo la ceguera y se ha publicado que la angiogénesis
en la retinopatía diabética y el nivel de obstrucción de VEGF en
los globos oculares están interrelacionados positivamente (New
England J. Medicine, 331, 1480 (1994)). Además, se ha
publicado que la angiogénesis en un modelo de retinopatía de mono se
inhibe cuando la actividad de VEGF está inhibida por la
administración intraocular de un anticuerpo monoclonal neutralizante
anti-VEGF (Arch. Ophthalmol., 114,
(1996)).
La evolución en los estados patológicos de la
artritis reumatoide (destrucción del hueso y cartílago) está
acompañada de angiogénesis, y se ha publicado que una concentración
elevada de VEGF está contenida en el fluido sinovial de los
pacientes con artritis reumatoide y que los macrófagos en las
articulaciones de los pacientes con artritis reumatoide produce
artritis reumatoide de VEGF (Journal of Immunology,
152, 4149 (1994); J. Experimental Medicine,
180, 341 (1994)).
Se han descrito los receptores de VEGF. Éstos
comprenden la tirosina cinasa tipo fms (denominada en adelante
"Flt-1") (Oncogene, 5, 519 (1990);
Science, 255, 989 (1992)) y el receptor que contiene
el dominio de inserción de la cinasa (denominado en adelante
"KDR") (documento WO 92/14748; Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 88, 9026 (1991); Biochem. Biophys. Res.
Comm., 187, 1579 (1992); documento WO 94/11499), que
pertenece a la familia de tirosina cinasa de tipo receptor. Cada
Flt-1 y KDR es una proteína de membrana de 180 a 200
kilodaltons de peso molecular que presenta un dominio extracelular
constituido por 7 zonas de tipo inmunoglobulina y un dominio
intracelular constituido por una zona de tirosina cinasa. Se ha
descrito que VEGF se une específicamente a Flt-1 y
KDR a los valores KD de 20 pM y 75 pM y que Flt-1 y
KDR se expresan en las células endoteliales vasculares de una
manera específica (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90,
7533 (1993); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8915
(1993)). Con respecto a Flt-1 en varias
enfermedades, se ha descrito que, en comparación con las células
endoteliales vasculares en tejidos normales, la expresión de ARNm
de Flt-1 aumenta en las células endoteliales del
tumor de tejidos de glioblastoma humano (Nature, 359,
845 (1992)) y en las células endoteliales vasculares tumorales de
los tejidos del cáncer orgánico digestivo humano (Cancer
Research, 53, 4727 (1993)). Además, se ha descrito que
la expresión de ARNm de Flt-1 es observada por
hibridación in situ en las células endoteliales vasculares
de las articulaciones de pacientes con artritis reumatoide (J.
Experimental Medicine, 180, 341 (1994)). Estos
resultados sugieren poderosamente que un sistema VEGF/receptor
Flt-1 del VEGF desempeña una función importante en
la angiogénesis del tumor. Aunque se ha descrito que VEGF se une a
Flt-1 y el dominio intracelular está
autofosforilado (Science, 255, 989 (1992)), la función
detallada del mecanismo receptor no está todavía aclarada. Sin
embargo, se ha descubierto que ratones modificados genéticamente en
los que se destruyó el gen Flt-1 mueren después de
un periodo fetal de 8,5 a 9,5 días debido a la construcción anormal
del vaso sanguíneo causada por la morfología anormal de las células
endoteliales vasculares durante la formación de islotes sanguíneos
en la etapa inicial del desarrollo y en la angiogénesis posterior.
Esto había conducido a una suposición de que Flt-1
presenta una función esencial para la formación tubular de las
células endoteliales vasculares en la angiogénesis (Nature,
376, 66 (1995)).
En vista de lo anterior, es de esperar que un
anticuerpo que pueda inhibir las actividades biológicas de VEGF
mediante su enlace al receptor Flt-1 de VEGF será
útil en el diagnóstico o el tratamiento de enfermedades en las que
sus estados patológicos evolucionen por angiogénesis anormal, tales
como la proliferación o metástasis de tumores sólidos, artritis en
artritis reumatoide, retinopatía diabética, retinopatía del
prematuro y psoriasis. Sin embargo, un anticuerpo monoclonal del
receptor Flt-1 anti-VEGF que puede
detectar las células en las que se expresa el receptor
Flt-1 de VEGF y el anticuerpo monoclonal del
receptor Flt-1 anti-VEGF que puede
inhibir las actividades biológicas de VEGF no ha sido descrito en
la técnica.
El documento WO-A 95/21868
describe un anticuerpo monoclonal producido por la línea celular
DC101 de hibridoma (IgG1k) depositado con el nº de registro del
ATCC, ATCC HB 11534. Se dice que dicho anticuerpo reacciona
específicamente con flk-1 murino.
Flk-1 es un receptor de VEGF más, que es distinto de
flt-1 y de KDR.
Davis-Smyth y colaboradores
describen que el segundo dominio de tipo inmunoglobulina de
flt-1 determina el enlace del ligando (The EMBO
Journal, 15, 4919-4927 (1996)).
Se ha dirigido la atención hacia el desarrollo
de un método que es útil para el diagnóstico o el tratamiento de
enfermedades en las que sus estados patológicos evolucionan mediante
angiogénesis anormal, tales como la proliferación o metástasis de
tumores sólidos, artritis en artritis reumatoide, retinopatía
diabética, retinopatía del prematuro y psoriasis. Aunque no se ha
publicado nada sobre el anticuerpo monoclonal antirreceptor
Flt-1 del VEGF humano, se considera que la
detección de las zonas de angiogénesis y la inhibición de la
angiogénesis mediante la utilización de un anticuerpo monoclonal
del receptor Flt-1 de VEGF
anti-humano será útil para el diagnóstico y el
tratamiento de estas enfermedades. Por consiguiente, se ha esperado
el desarrollo de un anticuerpo monoclonal antirreceptor
Flt-1 del VEGF humano.
Flt-1 del VEGF humano.
La presente invención se refiere a un anticuerpo
monoclonal que reacciona específicamente con el receptor
Flt-1 del VEGF humano; reconoce un epítopo que está
presente en una zona de las posiciones 1ª a la 338ª del aminoácido
N-terminal (incluyendo una secuencia señal) del
receptor Flt-1 del VEGF humano, inhibe el enlace
del VEGF humano al receptor Flt-1 del VEGF humano y
por esta razón también inhibe las actividades biológicas del VEGF
humano. El anticuerpo monoclonal de la presente invención reacciona
específicamente con el receptor Flt-1 del VEGF
humano por tinción de inmunocitos. Ejemplos de anticuerpos
monoclonales de la invención comprenden el anticuerpo monoclonal
KM1732 que pertenece a la subclase IgG1 de ratón, el anticuerpo
monoclonal KM1748 que pertenece a la subclase IgG2b de ratón y el
anticuerpo monoclonal KM1750 que pertenece a la subclase IgG2b de
ratón. Estos anticuerpos monoclonales inhiben la unión del VEGF
humano al receptor Flt-1 del VEGF humano e inhiben
además las actividades biológicas de un VEGF humano. La presente
invención se refiere también al hibridoma KM1732 (FERM
BP-5698) que produce el anticuerpo monoclonal
KM1732, al hibridoma KM1748 (FERM BP-5699) que
produce el anticuerpo monoclonal KM1748 y al hibridoma KM1750 (FERM
BP-5700) que produce el anticuerpo monoclonal
KM1750.
Además, la presente invención se refiere a, la
utilización del anticuerpo monoclonal de la presente invención
in vitro, a un método para detectar inmunológicamente el
receptor Flt-1 del VEGF humano, a un método para
detectar inmunológicamente las células en las que el receptor
Flt-1 del VEGF humano se expresan en la superficie
de éste y a un método para detectar inmunológicamente y determinar
el receptor Flt-1 del VEGF humano. Además, la
presente invención se refiere a, la utilización del anticuerpo
monoclonal de la presente invención in vitro, a un método
para inhibir el enlace del VEGF humano al receptor
Flt-1 del VEGF humano y a un método para inhibir
las actividades biológicas del VEGF humano.
La presente invención se refiere a un agente
para el diagnóstico de enfermedades en las que sus estados
patológicos evolucionan mediante angiogénesis anormal, como por
ejemplo proliferación o metástasis de tumores sólidos, artritis en
artritis reumatoide, retinopatía diabética, retinopatía del
prematuro, psoriasis y similares.
Los inventores de la presente invención han
descubierto que el anticuerpo monoclonal antirreceptor
Flt-1 del VEGF humano capaz de reconocer un epítopo
presente en una zona de las posiciones 1ª a 338ª del aminoácido
N-terminal del receptor Flt-1 del
VEGF humano por tinción de inmunocitos y que las actividades
biológicas del VEGF humano pueden inhibirse mediante la inhibición
del enlace de VEGF al antirreceptor Flt-1 de VEGF.
El diagnóstico y tratamiento de las enfermedades descritas
anteriormente en las que sus estados patológicos evolucionan
mediante angiogénesis anormal, como por ejemplo proliferación o
metástasis de tumores sólidos, artritis en artritis reumatoide,
retinopatía diabética, retinopatía del prematuro y psoriasis pueden
llevarse a cabo utilizando estos anticuerpos monoclonales.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona anticuerpos que reaccionan específicamente con el
receptor Flt-1 del VEGF humano. Con respecto al
anticuerpo monoclonal de la presente invención, se proporciona un
anticuerpo monoclonal que reconoce un epítopo que está presente en
una zona de las posiciones 1ª a 338ª del aminoácido
N-terminal (incluyendo una secuencia señal) del
receptor Flt-1 del VEGF humano y asimismo reacciona
específicamente con el receptor Flt-1 de VEGF
humano mediante tinción con inmunocitos. Asimismo, la presente
invención proporciona un anticuerpo monoclonal que inhibe el enlace
del VEGF humano al receptor Flt-1 del VEGF humano y
también inhibe las actividades biológicas del VEGF humano. Ejemplos
de anticuerpo monoclonal que reconoce el epítopo y además reacciona
específicamente con el receptor Flt-1 del VEGF
humano por tinción de inmunocitos comprende el anticuerpo
monoclonal KM1732 producido por el hibridoma KM1732 (FERM
BP-5698), el anticuerpo monoclonal KM1748 producido
por el hibridoma KM1748 (FERM BP-5699) y el
anticuerpo monoclonal KM1750 producido por el hibridoma KM1750
(FERM BP-5700). Estos anticuerpos monoclonales
inhiben el enlace del VEGF humano al receptor Flt-1
del VEGF humano y también inhiben las actividades biológicas del
VEGF humano.
El anticuerpo monoclonal de la presente
invención puede ser cualquier anticuerpo, con tal que presente las
propiedades reivindicadas, pero los anticuerpos que son creados por
el método de producción siguiente pueden citarse como ejemplos
preferidos. Es decir, el anticuerpo monoclonal antirreceptor
Flt-1 del VEGF humano puede obtenerse preparando la
proteína del receptor Flt-1 del VEGF humano como
antígeno, inmunizando a un animal capaz de proporcionar un
hibridoma con el antígeno, tal como un ratón, rata, hámster, conejo
o similares, produciendo por esta razón las células del plasma que
presentan la especificidad del antígeno, preparando un hibridoma
capaz de producir el antígeno monoclonal mediante la fusión de las
células con una línea celular de mieloma y cultivando
posteriormente el hibridoma.
Ejemplos de anticuerpos monoclonales adicionales
que reaccionan específicamente con el receptor Flt-1
de VEGF humano mediante tinción de inmunocitos comprenden el
anticuerpo monoclonal KM1730 que pertenece la subclase IgG1 de ratón
y el anticuerpo monoclonal KM1731 que pertenece a la subclase IgG2a
de ratón. KM1730 es producido por el hibridoma KM1730 (FERM
BP-5697) y KM 1731 es producido por el hibridoma
KM1731 (FERM BP-5718).
El método de producción del anticuerpo
antirreceptor Flt-1 del VEGF humano de la presente
invención se describe a continuación.
Los ejemplos de la sustancia útil como antígeno
para la preparación del anticuerpo monoclonal antirreceptor
Flt-1 del VEGF humano comprenden las células en las
que el receptor Flt-1 del VEGF humano se expresan en
la superficie celular o en una fracción de la membrana celular de la
misma, la proteína del receptor Flt-1 del VEGF
humano soluble con una zona extracelular de diferente longitud y una
proteína de fusión de la proteína con la zona Fc del anticuerpo.
Como células capaces de expresar el receptor Flt-1
del VEGF humano en la superficie celular, pueden ser a modo de
ejemplo las células NIH3T3-Flt-1
(Oncogene, 10, 135 (1995)). En un método para expresar
el anticuerpo como proteína del receptor Flt-1 del
VEGF humano soluble con una zona extracelular de diferente longitud
o una proteína de fusión de la proteína con la zona Fc del
anticuerpo, la longitud total o el fragmento parcial del ADNc que
codifica el receptor Flt-1 del VEGF humano
(Oncogene, 5, 519 (1990); Abstract of Papers, the
18th Annual meeting of Japan Molecular Biology Society,
2P-227 (diciembre de 1995)) se inserta en un punto
corriente abajo del activador de un vector apropiado, el vector
recombinante construido de este modo se inserta en las células
huésped y las células con expresión del receptor
Flt-1 del VEGF humano obtenidas de este modo se
cultivan en un medio apropiado, produciendo de ese modo la longitud
total de un fragmento parcial del receptor Flt-1 del
VEGF humano en las células o el sobrenadante del cultivo como tal o
como proteína de fusión.
Como células huésped, pueden utilizarse
cualquiera de las bacterias, levaduras, células de animal, células
de insecto y similares con tal que puedan expresar el gen de
interés. Ejemplos de las bacterias comprenden el género
Escherichia, el género Bacillus y similares, tales
como Escherichia coli, Bacillus subtilis y similares.
Ejemplos de levaduras comprenden Saccharomyces cerevisiae,
Schizosaccharomyces pompe y similares. Ejemplos de células de
animal comprenden las células de Namalwa que son células humanas,
células COS que son células de mono y células CHO que son células de
hámster chino. Ejemplos de células de insecto comprenden Sf9 y Sf21
(producidas por Pharmingen), High Five (producida por Invitrogen) y
similares.
Cuando se utiliza como huésped una bacteria tal
como Escherichia coli, el vector de expresión puede
construirse preferentemente con un activador, una secuencia de
enlace al ribosoma, el ADN de la presente invención, una secuencia
de terminación de la transcripción y, según se necesite, una
secuencia controladora del activador. Los ejemplos comprenden pGEX
disponible en el mercado (producido por Pharmacia), sistema pET
(producido por Novagen) y similares.
Con respecto al método para la introducción del
vector recombinante en una bacteria, puede utilizarse cualquiera de
los métodos conocidos para introducir el ADN en la bacteria, tal
como un método en el que se utiliza ión calcio (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 69, 2110-2114 (1972)), un
método de protoplastos (solicitud de patente japonesa no examinada
publicada nº 2483942/91) y similares.
Cuando se utiliza levadura como huésped, como
vector de expresión se utiliza YEp13 (ATCC 37115), YEp24 (ATCC
37051), YCp50 (ATCC 37419) o similares.
Con respecto al método para la introducción del
vector recombinante en levadura, pueden utilizarse cualquiera de los
métodos conocidos para la introducción del ADN en la levadura, tal
como en un método de electroporación (Methods. Enzymol.,
194, 182-187 (1990)), un método de
esferoplastos (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84,
1929-1933 (1978)), un método de acetato de litio
(J. Bacteriol., 153, 163-168 (1983)) y
similares.
Cuando se utilizan células de animales como
huésped, pueden ser a título de ejemplo pAGE107 (solicitud de
patente japonesa no examinada publicada nº 22.979/88;
Cytotechnology, 3, 133 (1990)), pAGE103 (J.
Biochem., 101, 1307 (1987)) y similares como vector de
expresión útil.
Puede utilizarse cualquier activador capaz de
efectuar la expresión en células animales. Los ejemplos comprenden
el activador del gen IE (precoz inmediato) de citomegalovirus (CMV),
el activador del SV40, el activador de metalotioneína y similares.
Además, puede utilizarse el potenciador del gen IE del CMV humano
junto con el activa-
dor.
dor.
Con respecto al método para la introducción del
vector recombinante en células de animal, puede utilizarse
cualquiera de los métodos conocidos para introducir el ADN en las
células del animal, tal como un método de electroporación
(Cytotechnology, 3, 133 (1990)), un método con fosfato
de calcio (solicitud de patente japonesa no examinada publicada nº
227.075/90), un método de lipofección (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 84, 7413 (1987)) y similares.
Cuando se utilizan células de insecto como
huésped, la proteína puede expresarse por el método conocido
descrito, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular
Biology, suplemento 1-34 y Baculovirus
expression vectors, A laboratory manual. Es decir, el vector que
introduce el gen recombinante y el baculovirus descrito a
continuación se introducen simultáneamente en las células de insecto
para obtener un virus recombinante en el sobrenadante del cultivo de
células de insecto y a continuación las células de insecto se
infectan con el virus recombinante obtenido de esta manera para
obtener las células de insecto que expresan la proteína.
Ejemplos del vector que introduce el gen
comprenden pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII (fabricados todos por
Invitrogen) y similares.
Ejemplos de baculovirus incluyen el virus de la
polihedrosis nuclear californiana autógrafo con el que se infectan
los insectos de la familia Barathra.
Con respecto al método para la introducción
simultánea del vector que introduce el gen recombinante descrito
anteriormente y del baculovirus descrito anteriormente en las
células de insecto para la preparación del virus recombinante,
pueden ponerse a título de ejemplo el método del fosfato de calcio
(solicitud de patente japonesa no examinada publicada nº
227.075/90), el método de lipofección (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 84, 7413 (1987)) y similares.
Alternativamente, puede producirse la proteína
de interés preparando un baculovirus recombinante que utiliza, por
ejemplo, un kit BaculoGold Starter fabricado por Pharmingen y a
continuación infectando las células de insecto descritas
anteriormente, tales como Sf9, Sf21, High Five, o similares, con el
virus recombinante (Bio/Technology, 6, 47 (1988)).
Con respecto al método de expresión génica, se
han desarrollado técnicas, tales como la producción de secreción, la
expresión de la proteína de fusión y similares, y pueden utilizarse
cada uno de estos métodos. Por ejemplo, la expresión génica puede
producirse según el método descrito en Molecular Cloning 2ª
edición, Cold Spring Harbor Lab. Press, Nueva York (1989) o por
expresión directa.
La longitud total o un fragmento parcial de un
receptor Flt-1 del VEGF humano puede producirse como
tal o como una proteína de fusión del mismo cultivando un
transformante obtenido de la manera descrita anteriormente en un
medio de cultivo, efectuando de este modo la formación y acumulación
de la proteína de la presente invención en el medio de cultivo
resultante y a continuación recogiendo la proteína de la mezcla de
cultivo. El cultivo del transformante de la presente invención en
un medio de cultivo se realiza según un método habitual que se
utiliza en el cultivo de las células huésped respectivas.
Con respecto al medio para la utilización en el
cultivo del transformante obtenido utilizando un microorganismo tal
como Escherichia coli, levadura o similares, como huésped,
puede utilizarse un medio natural o un medio sintético, con tal que
contenga materiales que puedan ser asimilados por el microorganismo,
tales como fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales
inorgánicas y similares, y pueda realizarse el cultivo de
transformante de manera eficaz (Molecular Cloning, 2ª
edición, Cold Spring Harbor Lab. Press, Nueva York (1989)). El
cultivo se realiza generalmente en condiciones aeróbicas, tal como
un cultivo en agitación, un cultivo con aireación en agitación
sumergida, o similares, entre 15 y 40ºC durante 16 a 96 horas.
Durante el cultivo, el pH se controla entre 3,0 y 9,0. El ajuste del
pH se realiza utilizando un ácido inorgánico u orgánico, una
solución alcalina, urea, carbonato de calcio, amoniaco y similares.
Según se necesite, pueden añadirse antibióticos, tales como
ampicilina, tetraciclina y similares al medio durante el
cultivo.
Con respecto al medio para su utilización en el
cultivo de un transformante obtenido utilizando células de animal
como huésped, puede utilizarse el medio RPMI 1640, el medio MEM de
Eagle o algunos de estos medios enriquecidos además con suero de
ternero fetal. El cultivo se realiza generalmente entre 35 y 37ºC
durante 3 a 7 días en presencia de CO_{2} al 5%. Según se
necesite, pueden añadirse antibióticos, tales como kanamicina,
penicilina y similares al medio durante el cultivo.
Con respecto al medio para su utilización en el
cultivo de un transformante utilizando células de insecto como
huésped, puede utilizarse el medio TNM-FH (producido
por Pharmingen), Sf900IISFM (producido por Life Technologies),
ExCell400 o ExCell405 (ambos producidos por JRH Biosciences) o
similares. El cultivo se realiza generalmente entre 25 y 30ºC
durante 1 a 4 días, y puede añadirse gentamicina y antibióticos
similares al medio durante el cultivo según se necesite.
Aunque el medio para el cultivo de células de
animales y células de insecto contiene suero, es deseable utilizar
un medio exento de suero a fin de purificar de manera eficaz la
longitud total o el fragmento parcial del receptor
Flt-1 del VEGF humano como tal o como proteína de
fusión.
Cuando la longitud total o el fragmento parcial
del receptor Flt-1 del VEGF humano se acumula en el
interior de las células huésped como tal o como proteína de fusión,
se recogen las células una vez acabado el cultivo por
centrifugación, se ponen en suspensión en un tampón acuoso y a
continuación se descomponen utilizando oscilador ultrasónico, prensa
francesa, o similares, y recogiendo posteriormente la proteína de un
fluido sobrenadante preparado centrifugando las células destruidas
de este modo.
Además, cuando se forma un cuerpo insoluble en
el interior de las células el cuerpo insoluble se insolubiliza
utilizando un agente desnaturalizador de proteínas y a continuación
se forma la estructura de orden superior de la proteína diluyendo o
dializando la proteína solubilizada obtenida de este modo en o
frente a una solución que no contiene el agente desnaturalizante de
proteínas o que contiene el agente pero en una concentración tan
baja que la proteína no se desnaturaliza.
Cuando la longitud total o el fragmento parcial
del receptor Flt-1 del VEGF humano se segrega fuera
de las células como tal o como proteína de fusión, la proteína
expresada puede recogerse en el sobrenadante del cultivo. El
aislamiento y la purificación pueden realizarse empleando medios de
separación, tales como la extracción en disolvente, la
precipitación fraccionada con disolventes orgánicos, salado,
diálisis, centrifugación, ultracentrifugación, cromatografía de
intercambio iónico, cromatografía por filtración en gel,
cromatografía hidrófoba, cromatografía por afinidad, cromatografía
en fase inversa, cristalización, electroforesis y similares, solos o
en combinación.
Si bien en la inmunización pueden utilizarse
cualquiera de los animales, tales como ratones, ratas, hámsters,
conejos y similares, con tal que pueda prepararse un hibridoma, en
la presente invención se describe un ejemplo en el que se utilizan
ratones y ratas. Se inmuniza un ratón o rata de 3 a 20 semanas con
la proteína obtenida en la etapa anterior 1-(1) como antígeno, y las
células productoras de anticuerpo se extraen del bazo, ganglio
linfático o sangre periférica del animal. La inmunización se realiza
administrando el antígeno varias veces por inyección subcutánea,
intravenosa o intraperitoneal junto con un adyuvante apropiado. Como
adyuvante, puede ponerse como ejemplo, adyuvante completo de Freund
o una combinación de gel de hidróxido de aluminio con vacuna contra
la tos ferina. Se extrae una muestra de sangre del fondo del ojo o
de la vena caudal del animal 3 a 7 días después de cada
administración, se analiza la muestra, por ejemplo, por
inmunoanálisis enzimático (ensayo inmunosorbente con enzima ligada
(ELISA), publicado por Igaku Shoin, (1976)) como si fuese reactivo
con el antígeno utilizado, a saber el receptor Flt-1
del VEGF humano soluble o células NIH3T3 en las que el receptor
Flt-1 del VEGF humano se expresa en la superficie
celular y a continuación un ratón o rata que presenta un título de
anticuerpo suficiente en su suero se somete a la utilización como
fuente de suministro de células productoras de anticuerpos. Del
3^{er} al 7º día después de la administración final del antígeno,
se escinde el bazo del ratón inmunizado para realizar la fusión de
las células del bazo con las células del mieloma según el método
conocido (Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, (1988); conocido como "Antibodies - A
Laboratory Manual" en adelante).
Como células de mieloma, puede utilizarse
cualquier célula de mieloma capaz de desarrollarse in vitro,
que comprenda las células creadas obtenidas del ratón, tal como la
línea celular P3-X63Ag8-U1
(P3-U1) de mieloma de ratón (BALB/c) resistente a
8-azaguanina (G. Kohler et al., Europ. J.
Immunol., 6, 511 (1976)), SP2/O-Ag14
(SP-2) (M. Shulman et al., Nature,
276, 269 (1978)),
P3-X63-Ag8653 (653) (J. F. Kearney
et al., J. Immunol., 123, 1548 (1979)),
P3-X63-Ag8 (X63) (G. Kohler et
al., Nature, 256, 495 (1975)) y similares. Estas
líneas celulares se cultivan y subcultivan según el método conocido
(Antibodies - A Laboratory Manual) y 2\times10^{7} o más
de las células se aseguran hasta la fusión celular.
Las células productoras de anticuerpo obtenidas
en la etapa (2) anterior y las células de mieloma obtenidas en la
etapa (3) anterior se lavan, se mezclan con medio aglomerador de
células, polietilenglicol-1000
(PEG-1000) o similares, para efectuar la fusión
celular y a continuación se ponen en suspensión en un medio de
cultivo. Para el lavado de las células, se utiliza medio MEM o PBS
(1,83 g de fosfato ácido disódico, 0,21 g de fosfato dibásico de
potasio, 7,65 g de cloruro sódico, 1 litro de agua destilada, pH
7,2). Para obtener selectivamente las células fusionadas de
interés, como medio para poner en suspensión las células fusionadas
se utiliza medio HAT {medio normal (medio preparado añadiendo
glutamina (1,5 mM), 2-mercaptoetanol
(5\times10^{-5} M), gentamicina (10 \mug/ml) y suero de
ternero fetal (FCS) (10%, producido por CSL) al medio
RPMI-1640) enriquecido además con hipoxantina
(10^{-4} M), timidina (1,5\times10^{-5} M) y aminopterina
(4\times10^{-7} M)}.
Después del cultivo, se toma una muestra de una
parte del sobrenadante del cultivo, y se analiza, por ejemplo, por
un método de inmunoanálisis enzimático que se describirá en la etapa
(5) para seleccionar los pocillos que pueden reaccionar
específicamente con el receptor Flt-1 del VEGF
humano o con una proteína recombinante tal como una proteína de
fusión con el receptor Flt-1 del VEGF humano
descrita en la etapa (1) anterior. A continuación, se realiza la
clonación dos veces limitando el análisis por dilución (utilizando
medio HT (medio preparado eliminando la aminopterina del medio HAT)
para el primer análisis y el medio normal para el segundo análisis)
y un hibridoma que presenta un título de anticuerpo estable y
elevado se selecciona como hibridoma capaz de producir el
anticuerpo monoclonal antirreceptor Flt-1 del VEGF
humano.
La selección de un hibridoma capaz de producir
el anticuerpo monoclonal antirreceptor Flt-1 del
VEGF humano se realiza por el método de inmunoanálisis enzimático
descrito a continuación.
El receptor Flt-1 del VEGF
humano o una proteína recombinante tal como una proteína de fusión
con el receptor Flt-1 del VEGF humano descrito en la
etapa 1-(1) anterior se cubre en una placa apropiada y se deja
reaccionar con un primer anticuerpo, es decir un sobrenadante del
cultivo de hibridoma o un anticuerpo purificado obtenido en la etapa
1-(6) siguiente, y a continuación con un segundo anticuerpo, es
decir un anticuerpo de inmunoglobulina de ratón o un anticuerpo de
inmunoglobulina antirrata marcado con biotina, una enzima, una
sustancia quimioluminiscente, un compuesto radioactivo o similares,
y a continuación se realiza una reacción adecuada para el marcador
utilizado a fin de seleccionar una muestra que reaccione
específicamente con el receptor Flt-1 del VEGF
humano como un hibridoma capaz de producir anticuerpo monoclonal
antirreceptor Flt-1 del VEGF humano. Ejemplos de
hibridoma incluyen los hibridomas KM1730, KM1731, KM1732, KM1748 y
KM1750. Los hibridomas KM1730, KM1732, KM1748 y KM1750, se
depositaron en el National Institute of Bioscience and Human
Technology, Agency of Industrial Science and Technology (Higashi
1-1-3, Tsukuba-shi,
Ibaraki, Japón) el 8 de octubre de 1996 y el hibridoma KM1731 el 22
de octubre de 1996, y se les asignaron las denominaciones FERM
BP-5697, FERM BP-5698, FERM
BP-5699, FERM BP-5700 y FERM
BP-5718, respectivamente.
Las células de hibridoma productoras del
anticuerpo monoclonal antirreceptor Flt-1 del VEGF
humano obtenidas en la etapa 1-(3) descrita anteriormente se
administran por inyección intraperitoneal a ratones de 8 a 10
semanas o a ratones lampiños tratados con pristano (por
administración intraperitoneal de 0,5 ml de
2,6,10,14-tetrametilpentadecano (pristano) seguida
de 2 semanas de alimentación) a una dosis de 2\times10^{7} a
5\times10^{6} células/animal. El hibridoma produce tumor
ascítico en 10 a 21 días. Se extrae el fluido ascítico de los
ratones o de los ratones lampiños, se centrifuga, se somete a salado
con sulfato amónico saturado al 40 al 50% o a precipitación con
ácido caprílico y a continuación se pasa a través de una columna de
DEAE-Sepharosa, columna de proteína A o Cellulofine
GSL 2000 (producido por Seikagaku Kogyo) para extraer una fracción
de IgG o IgM para dar un anticuerpo monoclonal purificado.
La subclase del anticuerpo monoclonal purificado
puede determinarse utilizando un kit de tipado del anticuerpo
monoclonal de ratón o un kit de tipado del anticuerpo monoclonal de
rata. La cantidad de proteína puede determinarse por el método de
Lowry o mediante cálculo basado en la densidad óptica a 280 nm.
Además, la presente invención se refiere a la
utilización in vitro del anticuerpo monoclonal de la presente
invención, a un método para detectar inmunológicamente el receptor
Flt-1 del VEGF humano o células en las que el
receptor Flt-1 del VEGF humano se expresa sobre la
superficie del mismo, a un método para detectar inmunológicamente y
determinar el receptor Flt-1 del VEGF humano soluble
y a un método para inhibir el enlace de un VEGF humano a un receptor
Flt-1 del VEGF humano o a las actividades biológicas
del VEGF humano.
Además, la presente invención se refiere a un
agente para el diagnóstico para enfermedades en las que sus estados
patológicos evolucionan mediante angiogénesis anormal, como por
ejemplo proliferación o metástasis de tumores sólidos, artritis en
artritis reumatoide, retinopatía diabética, retinopatía del
prematuro, psoriasis y similares.
Los métodos para detectar y determinar el
receptor Flt-1 del VEGF humano se describen a
continuación.
Ejemplos de los métodos, que utilizan el
anticuerpo monoclonal de la presente invención, para detectar
inmunológicamente el receptor Flt-1 del VEGF humano
o una célula en la que el receptor Flt-1 del VEGF
humano se expresa en la superficie del mismo y para detectar
inmunológicamente y determinar el receptor Flt-1 del
VEGF humano soluble comprenden la tinción de inmunocitos, la
transferencia Western, sandwich ELISA, y similares. Estos métodos se
describen a continuación.
En primer lugar, se preparan las células en las
que el receptor Flt-1 del VEGF humano se expresa en
la superficie celular. Se ponen en suspensión células en suspensión
como tales o células adherentes después del desprendimiento de las
células utilizando tripsina-EDTA, por ejemplo, en
una solución de tampón para la utilización de la tinción de
inmunocitos (PBS que contiene BSA al 1%, EDTA al 0,02% y azida
sódica al 0,05%) y se administran en fracciones de 1\times10^{5}
a 2\times10^{6}. Un sobrenadante del cultivo del hibridoma
productor del anticuerpo monoclonal antirreceptor
Flt-1 del VEGF humano obtenido en la etapa 1-(4)
descrita anteriormente, el anticuerpo monoclonal purificado obtenido
en la etapa 1-(6) descrita anteriormente o el anticuerpo monoclonal
marcado con biotina mediante un método conocido (Enzyme Antibody
Method: publicado por Gakusai Kikaku 1985) se diluye con la
solución del tampón para utilización en la tinción de inmunocitos o
la solución tampón para utilización en la tinción de inmunocitos
enriquecida además con suero animal al 10% a una concentración de
0,1 a 50 \mug/ml y administrado en porciones de 20 a 500 \mul
para realizar la reacción bajo enfriamiento durante 30 minutos.
Cuando se utiliza en la reacción el sobrenadante del cultivo del
hibridoma productor del anticuerpo monoclonal antirreceptor
Flt-1 del VEGF humano obtenido en la etapa 1-(4)
descrita anteriormente o el anticuerpo monoclonal purificado
obtenido en la etapa 1-(6) descrito anteriormente, las células se
lavan con la solución tampón para la utilización en la tinción de
inmunocitos a continuación un anticuerpo de inmunoglobulina
antirratón o inmunoglobulina antirrata marcada con colorante
fluorescente, tal como FITC, ficoeritrina o similares, que se
disuelve en la solución tampón para su utilización en la tinción de
inmunocitos hasta una concentración de aproximadamente 0,1 a 50
\mug/ml, se administra en porciones de 50 a 500 \mul para
realizar la reacción bajo enfriamiento durante 30 minutos. Cuando se
utiliza en la reacción el anticuerpo monoclonal marcado con biotina,
la estreptavidina se administra en porciones de 50 a 500 \mul y a
continuación la reacción se realiza bajo enfriamiento a la oscuridad
durante 30 minutos. Una vez terminada la reacción, las células se
lavan intensamente con la solución tampón para su utilización en
tinción de inmunocitos y se analizan mediante un clasificador de
células.
Los componentes de la membrana celular se
preparan a partir de las células en las que se expresa el receptor
Flt-1 del VEGF humano, tales como las células NIH3T3
que expresan el receptor Flt-1 del VEGF humano
(denominadas en los sucesivo
"NIH3T3-Flt-1") y a partir de
las células de referencia tales como las células NIH3T3 (denominadas
en adelante "NIH3T3-Neo") (Oncogene,
10, 135 (1995)), y los componentes de la membrana se someten
a electroforesis por el método SDS-PAGE en
condiciones reductoras en una cantidad comprendida entre 0,1 y 30
\mul de proteína por banda. Las proteínas tratadas de este modo
se transfieren a una membrana de PVDF y se dejan reaccionar con PBS
que contiene BSA al 1% a temperatura ambiente durante 30 minutos
para efectuar el bloqueo. Se deja reaccionar con el sobrenadante
del cultivo del hibridoma productor de anticuerpo monoclonal
antirreceptor Flt-1 del VEGF humano obtenido en la
etapa 1-(4) descrita anteriormente o con el anticuerpo monoclonal
purificado obtenido en la etapa 1-(6) descrita anteriormente, se
lava con PBS que contiene Tween al 0,05% y a continuación se deja
reaccionar con IgG antirratón de cabra marcado con peroxidasa a
temperatura ambiente durante 2 horas. Después del lavado con PBS
que contiene Tween al 0,05%, se detectan las bandas a las que se une
el anticuerpo monoclonal antirreceptor Flt-1 del
VEGF humano utilizando los reactivos de detección de transferencia
Western ECL^{TM} (producidos por Amersham) o similares.
Como primer anticuerpo, el anticuerpo monoclonal
purificado obtenido en la etapa 1-(6) descrita anteriormente se
recubre en una placa apropiada y se deja reaccionar con 0,056 a
10.000 ng/ml del hibridoma productor de anticuerpo monoclonal
antirreceptor Flt-1 del VEGF humano soluble
purificado obtenido en la etapa 1-(1) descrita anteriormente, o con
una muestra, tal como suero humano o similares. Después de un lavado
meticuloso de la placa, éste se deja reaccionar con un segundo
anticuerpo, es decir, un anticuerpo monoclonal marcado con biotina,
una enzima, una sustancia quimioluminiscente, un compuesto
radioactivo o similares, que es uno de los anticuerpos monoclonales
purificados obtenidos en la etapa 1-(6) descrita anteriormente pero
reconoce diferentes epítopos de los del anticuerpo monoclonal
utilizado como primer anticuerpo, y a continuación se realiza la
reacción adecuada para el marcador utilizado. Se prepara una curva
de calibración basada en la reactividad para el receptor
Flt-1 del VEGF soluble purificado y se calcula la
concentración del receptor Flt-1 del VEGF soluble
en las muestras.
Se ejemplifican los métodos de inhibición del
enlace del VEGF humano para el receptor Flt-1 del
VEGF humano y de las actividades biológicas del VEGF humano.
Se distribuye metanol en fracciones de 100
\mul en los pocillos de una placa MultiScreen-IP
de 96 pocillos (producida por Millipore) para dar un producto
hidrófilo natural para la membrana de PVDF en el fondo de la placa.
Tras el lavado con agua, el receptor Flt-1 del VEGF
humano o una proteína recombinante tal como una proteína de fusión
con el receptor Flt-1 del VEGF humano se diluye
hasta una concentración de 0,1 a 10 \mug/ml, se distribuye en
fracciones de 50 \mul/pocillo y a continuación se deja reposar
durante la noche a 4ºC para efectuar su adsorción. Después del
lavado, el PBS que contiene albúmina de suero bovino al 1% (BSA) se
distribuye en fracciones de 100 \mul/pocillo y la reacción se
realiza a temperatura ambiente durante 1 hora para efectuar el
bloqueo de algunos grupos activos restantes. Tras el lavado con PBS,
el sobrenadante del cultivo del hibridoma productor de anticuerpo
monoclonal antirreceptor Flt-1 del VEGF humano
obtenido en la etapa 1-(4) descrita anteriormente o el anticuerpo
monoclonal purificado obtenido en la etapa 1-(6) descrita
anteriormente se distribuye en fracciones de 50 \mul/pocillo y a
continuación se distribuye 0,1 a 10 ng/ml de VEGF marcado con
^{125}I (producido por Amersham) en fracciones de 50
\mul/pocillo, realizando posteriormente la reacción a temperatura
ambiente durante 1,5 horas. Tras el lavado con Tween al 0,05%-PBS,
los pocillos se secan a 50ºC, y se distribuye un producto
centelleante en fracciones de 20 a 100 \mul/pocillo para medir la
radioactividad del VEGF marcado con ^{125}I ligado a cada pocillo
utilizando Top Count (producido por Packard) o similares.
Se distribuye PBS que contiene albúmina de suero
bovino (BSA) al 1% en fracciones de 100 \mul en los pocillos de
una placa MultiScreen-IP de 96 pocillos (producida
por Millipore), la reacción se realiza a temperatura ambiente
durante 1 hora para efectuar el bloqueo de algunos grupos activos en
los pocillos y a continuación se ponen en suspensión células
NIH3T3-Flt-1 en
BSA-PBS al 1% que contiene NaN_{3} al 0,05% se
distribuye en fracciones de 1 x 10^{4} a 1 x 10^{5}/pocillo.
Tras el lavado con BSA-PBS al 1%, el sobrenadante
del cultivo del hibridoma productor de anticuerpo monoclonal
antirreceptor Flt-1 del VEGF humano obtenido en la
etapa 1-(4) descrita anteriormente o el anticuerpo monoclonal
purificado obtenido en la etapa 1-(6) descrita anteriormente se
distribuye en fracciones de 50 \mul/pocillo y a continuación se
distribuye 0,1 a 10 ng/ml de VEGF marcado con ^{125}I (producido
por Amersham) en fracciones de 50 \mul/pocillo, realizando
posteriormente la reacción a temperatura ambiente durante 1,5 horas.
Tras el lavado con PBS, los pocillos se secan a 50ºC, y se
distribuye un producto centelleante en fracciones de 20 a 100
\mul/pocillo para medir la radioactividad del VEGF marcado con
^{125}I ligado a cada pocillo utilizando Top Count (producido por
Packard) o similares.
La Fig. 1 es un gráfico que presenta las etapas
de construcción del plásmido pVL1393/Flt 3N.
La Fig. 2 es un gráfico que presenta las etapas
de construcción del plásmido pVL1393/Flt 7N.
La Fig. 3 es un gráfico que presenta patrones de
electroforesis en SDS poliacrilamida (se utilizó un gel con
gradiente del 5 al 20%) de Flt-1 7N y
Flt-1 3N purificados. Partiendo del lado izquierdo,
se presentan los modelos de electroforesis de los marcadores de peso
molecular, Flt-1 3N y Flt-1 7N
respectivamente. La electroforesis se realizó en condiciones
reductoras.
La Fig. 4 es un gráfico que presenta resultados
del análisis del efecto de los receptores Flt-1 7N y
Flt-1 3N del VEGF humano soluble para inhibir el
enlace de un VEGF humano con ^{125}I a una placa recubierta con
receptor Flt-1 7N del VEGF humano soluble.
La Fig. 5 es un gráfico que presenta los
resultados del examen de la reactividad de enlace del anticuerpo
monoclonal antirreceptor Flt-1 del VEGF humano por
inmunoanálisis enzimático.
La Fig. 6 es un gráfico que presenta los
resultados del examen de la actividad del anticuerpo monoclonal
antirreceptor Flt-1 del VEGF humano para inhibir el
enlace de VEGF al receptor Flt-1 del VEGF
humano.
La Fig. 7 es un gráfico que presenta los
resultados del examen de la actividad de los anticuerpos
monoclonales KM1732, KM1748 y KM1750 antirreceptor
Flt-1 del VEGF humano para inhibir el enlace del
VEGF humano al receptor Flt-1 del VEGF humano.
La Fig. 8 es un gráfico que presenta los
resultados del examen de la actividad de los anticuerpos
monoclonales KM1732, KM1748 y KM1750 antirreceptor
Flt-1 del VEGF humano para inhibir el enlace del
VEGF humano a las células que expresan al receptor
Flt-1 del VEGF humano.
La Fig. 9 es un gráfico que presenta los
resultados del análisis por citometría de flujo de la reactividad de
los anticuerpos monoclonales KM1730, KM1731, KM1732, KM1748 y KM1750
antirreceptor Flt-1 del VEGF humano con las células
NIH3T3-Flt-1 que expresan el
receptor Flt-1 del VEGF humano y las células
NIH3T3-Neo de referencia.
La Fig. 10 es un gráfico que presenta los
resultados del examen de la reactividad del anticuerpo KM1737
monoclonal antirreceptor Flt-1 del VEGF humano con
el receptor Flt-1 del VEGF humano por transferencia
Western. La banda 1 presenta el patrón por transferencia Western de
las células NIH3T3-Flt-1 y la banda
2 presenta el patrón de las células NIH3T3-Neo.
La Fig. 11 es un gráfico que presenta los
resultados del examen del sistema de determinación de los receptores
Flt-1 3N y Flt-1 7N del VEGF humano
soluble, realizado utilizando anticuerpos KM1732 y KM1730
biotinilado monoclonales antirreceptor Flt-1 del
VEGF humano.
La Fig. 12 es un gráfico que presenta los
resultados del análisis por citometría de flujo de la reactividad
del anticuerpo monoclonal antirreceptor Flt-1 del
VEGF humano con las células HUVEC endoteliales vasculares
humanas.
La Fig. 13 es un gráfico que presenta los
resultados del análisis por citometría de flujo de la reactividad
del anticuerpo monoclonal antirreceptor Flt-1 del
VEGF humano con las células HUVEC endoteliales vasculares humanas en
condiciones sin estimulación o con estimulación del VEGF.
La Fig. 14 es un gráfico que presenta los
resultados del análisis sobre los cambios en la cantidad de
expresión del receptor Flt-1 del VEGF humano en
células HUVEC endoteliales vasculares humanas en condiciones sin
estimulación o con estimulación del VEGF. La cantidad de expresión
de Flt-1 se presenta como valor de reacción relativo
del anticuerpo monoclonal KM1730 antirreceptor Flt-1
del VEGF humano cuando la reactividad de un anticuerpo de referencia
se define como 1.
Ejemplo
1
Se preparó un vector de la siguiente manera,
para su utilización en la expresión de un fragmento del receptor
Flt-1 del VEGF humano soluble (denominado en
adelante "receptor Flt-1 3N del VEGF humano
soluble") que corresponde a una zona de las posiciones 1ª a la
338ª (incluyendo una secuencia señal) a partir del aminoácido
N-terminal del receptor Flt-1 del
VEGF humano. El receptor Flt-1 3N del VEGF humano
soluble corresponde a las tres zonas de tipo inmunoglobulina de las
caras N-terminales del dominio extracelular del
receptor Flt-1 del VEGF humano soluble.
Un clon flt nº 3-7 de ADNc (M.
Shibuya et al., Oncogene, 5, 519, 1990) que
contiene el ADNc completo que codifica el receptor
Flt-1 del VEGF humano se digirió parcialmente con
las enzimas de restricción EcoRI y TaqI para recoger
un fragmento de ADN EcoRI-TaqI de 1.263 bp del extremo
5' y el fragmento recogido de este modo se insertó en la secuencia
EcoRI del lado 5' y la secuencia NotI del lado 3'
corriente abajo del punto de iniciación de la transcripción del gen
de polihedrina de un plásmido pVL1393 del vector recombinante del
gen de baculovirus (producido por Invitrogen) utilizando un
adaptador TaqI-NotI en el que se había introducido
artificialmente un codón de terminación (fragmento de ADN sintético
con las secuencias nucleotídicas presentadas en la SEC. ID nº: 1 y
nº: 2) obteniéndose de este modo el vector de expresión pVL1393/Flt
3N del receptor Flt-1 3N del VEGF humano soluble
(Fig. 1).
Se preparó un vector de la siguiente manera,
para su utilización en la expresión de un fragmento del receptor
Flt-1 del VEGF humano soluble (denominado en
adelante "receptor Flt-1 7N del VEGF humano
soluble") que corresponde a una zona de las posiciones 1ª a la
750ª (incluyendo una secuencia señal) a partir del aminoácido
N-terminal del receptor Flt-1 del
VEGF humano. El receptor Flt-1 3N del VEGF humano
soluble corresponde a las siete zonas de tipo inmunoglobulina del
dominio extracelular del receptor Flt-1 del VEGF
humano soluble.
Se añadió una fracción de 2,5 unidades de Taq
polimerasa a 100 \mul de solución de gelatina al 0,001% (p/v) de
MgCl_{2} 10 mM que contenía 10 pmoles de cebadores con las
secuencias de nucleótidos mostradas en SEC. ID nº: 3 y nº: 4, 10 ng
del clon flt nº 3-7 (Oncogene, 5, 519,
(1990)) ADN y trifosfatos de desoxinucleótido 10 mM. Se repitió 30
veces la reacción en cadena de polimerasa (PCR) en la que una
reacción consistió, tras el pretratamiento a 95ºC durante 5 minutos,
en el tratamiento a 95ºC durante 90 segundos, a 50ºC durante 90
segundos y por último a 72ºC durante 90 segundos, recogiendo
posteriormente un fragmento de ADN. El fragmento de ADN se digirió
con HindIII (la posición de 1893 bp en el clon flt nº
3-7) y NotI para obtener un fragmento de ADN
HindIII-NotI de 610 bp, es decir un fragmento de ADN
que contiene un fragmento de 1894 a 2499 bp del clon flt nº
3-7, el codón de terminación y la secuencia de
reconocimiento NotI. A continuación, el clon flt nº
3-7 se digirió con enzimas de restricción
EcoRI y HindIII para recoger un fragmento
EcoRI-HindIII de 1893 bp del extremo 5'. El fragmento
de ADN HindIII-NotI de 610 bp y los fragmentos
EcoRI-HindIII de 1893 bp se insertaron a continuación
en la secuencia EcoRI del lado 5' y la secuencia NotI
del lado 3' corriente abajo del punto de iniciación de la
transcripción del gen polihedrina de un plásmido pVL1393 del vector
recombinante del gen baculovirus, preparando de este modo el vector
de expresión pVL1393/Flt 7N del receptor Flt-1 7N
del VEGF humano soluble (Fig. 2).
Para la producción de proteína por células de
insecto, es necesario preparar un virus recombinante en el que se
integra un gen de interés, y el procedimiento de preparación consta
de una etapa en la que una molécula de ADNc que codifica una
proteína de interés se inserta en un plásmido especial, que se
denomina vector de transferencia, y una etapa posterior en la que
un virus natural y el vector de transferencia se transfectan
conjuntamente en células de insecto para obtener un virus
recombinante mediante recombinación homóloga. Estas etapas se
realizaron de la siguiente manera utilizando el kit BaculoGold
Starter fabricado por Pharmigen (producto nº
PM-21001K) según el manual.
Se preparó un baculovirus recombinante de la
siguiente manera introduciendo un ADN filamentoso de baculovirus
(ADN BaculoGold de baculovirus, producido por Pharmigen) y el ADN
del vector de transferencia preparado de este modo en células Sf9 de
insecto (producidas por Pharmigen) que se habían cultivado
utilizando medio de insecto TMF-FH (producido por
Pharmigen) utilizando un método de lipofectina (Protein, Nucleic
Acid, Enzyme, 37, 2701 (1992).
Una fracción de 1 \mug de pVL1393/Flt7N
preparada en la etapa (2) anterior o de pVL1393/Flt3N preparado en
la etapa (1) anterior y 20 ng de ADN filamentoso de baculovirus se
disolvieron en 12 \mul de agua destilada, la solución se mezcló
con una mezcla de 6 \mul de lipofectina y 6 \mul de agua
destilada y a continuación la mezcla resultante de dejó reposar a
temperatura ambiente durante 15 minutos. Independientemente de esto,
se pusieron en suspensión 1\times10^{6} células Sf9 en 2 ml de
medio Sf900-II (producido por Gibco) y se colocaron
en una placa de Petri de plástico para cultivo celular de 35 mm de
diámetro. A esto se añadió el volumen completo de la solución recién
descrita de la mezcla de ADN del plásmido, ADN filamentoso de
baculovirus y lipofectina, seguida de 3 días de cultivo a 27ºC para
recoger 1 ml del sobrenadante del cultivo que contiene el virus
recombinante. Una fracción de 1 ml de medio Sf900-II
se añadió a la placa de Petri resultante y se llevaron a cabo 3 días
de cultivo a 27ºC para obtener 1,5 ml del sobrenadante del cultivo
que contiene el virus recombinante.
A continuación, el virus recombinante obtenido
de este modo para su utilización en la expresión de la proteína se
cultivó de la siguiente manera.
Una fracción de 2\times10^{7} de células Sf9
se pusieron en suspensión en 10 ml de medio
Sf900-II, se colocaron en un matraz de 175 cm^{2}
(producido por Greiner) y se dejaron en reposo a temperatura
ambiente durante 1 hora para efectuar la adherencia de las células
al matraz. Se descartó posteriormente el fluido sobrenadante y 15 ml
de medio de insecto TMN-FH reciente y una fracción
de 1 ml del sobrenadante del cultivo que contiene el virus
recombinante descrito anteriormente se añadió y se cultivó durante 3
días a 27ºC. Después del cultivo, se centrifugó el fluido
sobrenadante a 1.500 \times g durante 10 minutos para separar las
células, obteniendo de este modo una solución del virus recombinante
para su utilización en la expresión proteica.
Se calculó el título del virus en la solución de
virus recombinante obtenida de este modo por el método descrito en
el manual del kit BaculoGold Starter (Pharmigen).
Una fracción de 6\times10^{6} células Sf9 se
puso en suspensión en 4 ml de medio Sf900-II, se
colocó en placas de Petri de plástico de 60 mm de diámetro para
cultivo celular y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 1
hora para efectuar la adherencia de las células a la placa. A
continuación, se descartó el fluido sobrenadante, se añadieron a la
placa 400 \mul de medio Sf900-II recientes y la
solución del virus recombinante descrito anteriormente se diluyó
10.000 veces con medio Sf900-II y se dejó en reposo
a temperatura ambiente durante 1 hora, se eliminó el medio y a
continuación se vertieron en la placa 5 ml de un medio que contiene
agarosa al 1% de punto de fusión bajo (Agarplaque Agarosa, producido
por Pharmigen) (preparada mezclando 1 ml de Agarplaque al 5%
esterilizada más solución acuosa de agarosa con 4 ml de medio de
insecto TMN-FH y se almacenó a 42ºC). Tras reposar a
temperatura ambiente durante 15 minutos, se lió la placa con una
cinta de vinilo para evitar el secado, se colocó en un recipiente
sellable de plástico y a continuación se sometió a 6 días de cultivo
a 27ºC. Una fracción de 1 ml de PBS que contiene 0,01% de rojo
neutro se añadió a la placa para realizar el cultivo adicional
durante 1 día y a continuación se hizo el recuento del número de
placas formadas de este modo. Mediante el procedimiento anterior, se
observó que cada una de las soluciones de virus recombinante
contenía partículas de virus de aproximadamente 1\times10^{7}
unidades formadoras de placa (denominadas en adelante "PFU")
por ml.
Los receptores Flt-1 7N y
Flt-1 3N del VEGF humano soluble se obtuvieron de la
siguiente manera. Una porción de 4\times10^{7} células High Five
se pusieron en suspensión en 30 ml de medio
EX-CELL^{TM} 400 (producido por JRH Biosciences)
contenido en un matraz de 175 cm^{2} (producido por Greiner) y se
dejó en reposo a temperatura ambiente durante 1 hora para efectuar
la adherencia de las células al matraz. Una fracción de 1 ml de una
solución que contiene aproximadamente 1 a 3\times10^{8} PFU/ml
de partículas de virus recombinante obtenidas en la etapa (3)
anterior procedente de los vectores de transferencia pVL1393/Flt 7N
y pVL1393/Flt 3N se añadió al matraz para realizar la infección a
temperatura ambiente durante 2 horas. Se eliminó el sobrenadante del
cultivo y se añadieron 30 ml de medio EX-CELL^{TM}
400 para llevar a cabo 3 a 4 días de cultivo a 27ºC. Una vez
finalizado el cultivo, se recogió el sobrenadante del cultivo y se
centrifugó a 1.500 \times g durante 10 minutos para obtener un
fluido del sobrenadante.
Se rellenó una columna con aproximadamente 60 ml
de gel de heparina-Sepharose CL-6B
(producido por Pharmacia Biotech AB) y se lavó con 600 ml de tampón
Tris-HCl 20 mM (pH 7,5) a un caudal de 0,5
ml/minuto. Tras el lavado, 1.000 ml del medio de cultivo que
contiene los receptores Flt-1 7N y
Flt-1 3N del VEGF humano soluble, que se habían
preparado de la forma descrita anteriormente, se pasaron a través de
una columna CL-6B con
heparina-Sepharose a un caudal de 0,5 ml/minuto.
Tras el lavado con 600 ml de tampón Tris-HCl 20 mM
(pH 7,5) a un caudal de 0,5 ml/minuto, 600 ml de tampón
Tris-HCl 20 mM (pH 7,5) con un gradiente de densidad
de NaCl 0 M a 1,1 M se pasaron a través de la columna para llevar a
cabo la elución de las proteínas adsorbidas en
heparina-Sepharose, y se fraccionó el eluido en
porciones de 8 ml. Las proteínas contenidas en cada fracción se
analizaron por electroforesis en gel de SDS poliacrilamida
(SDS-PAGE) y se recogieron 60 a 80 ml de las
fracciones que contienen los receptores Flt-1 7N y
Flt-1 3N del VEGF humano soluble y se concentraron
utilizando CentriPrep 10 (producido por Amicon). Tras la
concentración, se obtuvieron Flt-1 7N y
Flt-1 3N humanos solubles como soluciones de 5 ml y
13 ml, respectivamente (las concentraciones de proteína fueron de
331 \mug/ml y 204 \mug/ml).
La pureza de los receptores
Flt-1 7N y Flt-1 3N del VEGF humano
soluble purificado se confirmó por SDS-PAGE. Se
realizó la SDS-PAGE según un método conocido
(Anticancer Research, 12, 1121, 1992). Se realizó la
electroforesis de Flt-1 7N y de
Flt-1 3N, utilizando un gel con gradiente del 5 al
20% (producido por Atto) como gel, cada uno de 2 \mug de proteína
por banda, en condiciones reductoras y el gel resultante se tiñó con
azul brillante de Coomassie. Los resultados se presentan en la Fig.
3. La pureza de Flt-1 7N y Flt-1 3N
se observó que era del 95% o más.
La proteína del antígeno de referencia (proteína
de referencia negativa) de los receptores Flt-1 7N y
Flt-1 3N del VEGF humano soluble se obtuvo de la
manera siguiente. Una fracción de 4\times10^{7} de células High
Five se puso en suspensión en 30 ml de medio
EX-CELL^{TM} 400 (producido por JRH Biosciences)
contenida en un matraz de 175 cm^{2} (producido por Greiner), se
dejó en reposo a temperatura ambiente durante 1 hora para efectuar
la adherencia de las células al matraz y a continuación se cultivó a
27ºC durante 3 a 4 días. Una vez finalizado el cultivo, se recogió
el sobrenadante del cultivo y se centrifugó a 1.500 \times g
durante 10 minutos para obtener un fluido sobrenadante.
Se rellenó una columna con aproximadamente 20 ml
de gel de heparina-Sepharose CL-6B
(producido por Pharmacia Biotech AB) y se lavó con 200 ml de tampón
Tris-HCl 20 mM (pH 7,5) a un caudal de 0,5
ml/minuto. Tras el lavado, 500 ml del medio de cultivo de células
High Five, se pasaron a través de una columna CL-6B
con heparina-Sepharose a un caudal de 0,5 ml/minuto.
Tras el lavado con 200 ml de tampón Tris-HCl 20 mM
(pH 7,5) a un caudal de 0,5 ml/minuto, se pasaron a través de la
columna 200 ml de tampón Tris-HCl 20 mM (pH 7,5) que
contenía NaCl 1 M para llevar a cabo la elución de las proteínas
adsorbidas en heparina-Sepharose. Se concentró la
fracción de la elución de NaCl 1 M utilizando CentriPrep 10
(producido por Amicon) para obtener 7 ml de la proteína del antígeno
de referencia (867 \mug/ml como concentración de proteína).
La actividad para el enlace de VEGF humano de
los receptores Flt-1 7N y Flt-1 3N
del VEGF humano soluble se confirmó de la siguiente manera.
Se distribuyó metanol en fracciones de 100
\mul en pocillos de una placa de filtración
Immobilon^{TM}-P de 96 pocillos (producida por
Millipore) para dar un hidrófilo natural para la membrana de PVDF en
el fondo de la placa. Tras el lavado con agua, el
Flt-1 7N humano soluble diluido con PBS hasta una
concentración de 2 \mug/ml, se distribuyó en fracciones de 50
\mul/pocillo y se dejó reposar durante la noche a 4ºC para
efectuar su adsorción. Tras el lavado, el PBS que contenía albúmina
de suero bovino al 1% (BSA) se distribuyó en fracciones de 100
\mul/pocillo y se llevó a cabo 1 hora de la reacción a temperatura
ambiente para efectuar el bloqueo de los grupos activos restantes.
Después del lavado con PBS, cada uno de los receptores
Flt-1 7N y Flt-1 3N del VEGF humano
soluble purificado obtenido en la etapa (4) descrita anteriormente
se distribuyó en fracciones de 50 \mul/pocillo (concentración
final 1 a 1.000 ng/ml) y a continuación se distribuyó VEGF humano
marcado con ^{125}I (concentración final, 3 ng/ml: producido por
Amersham) en fracciones de 50 \mul/pocillo, realizando
posteriormente la reacción a temperatura ambiente durante 1,5 horas.
Después del lavado con Tween al 0,05%-PBS, se secaron los pocillos a
50ºC y se distribuyó Microscinti-0 (producido por
Packard) en fracciones de 20 \mul/pocillo para medir la
radioactividad del VEGF humano marcado con ^{125}I ligado a cada
pocillo utilizando Top Count (producido por Packard).
Los resultados se presentan en la Fig. 4. Se
demostró que los receptores Flt-1 7N y
Flt-1 3N del VEGF humano soluble inhiben el enlace
del VEGF humano marcado con ^{125}I al receptor
Flt-1 7N del VEGF humano soluble en función de la
concentración. Dado que los receptores Flt-1 7N y
Flt-1 3N del VEGF humano soluble presentaban un
grado similar de actividad de enlace del VEGF humano, se puso de
manifiesto que el VEGF humano se une al grupo Flt-1
3N (posiciones 1ª a 338ª del aminoácido N-terminal
que comprende la secuencia señal).
Se obtuvo el VEGF humano de la siguiente manera.
Una fracción de 4\times10^{7} de células High Five se puso en
suspensión en 30 ml de medio EX-CELL^{TM} 400
(producido por JRH Biosciences) contenida en un matraz de 175
cm^{2} (producido por Greiner) y se dejó en reposo a temperatura
ambiente durante 1 hora para efectuar la adherencia de las células
al matraz. Una fracción de 1 ml de la solución que contiene
aproximadamente 1 a 3\times10^{8} PFU/ml de las partículas de
baculovirus recombinante del VEGF humano obtenidas según el método
conocido (Cell Growth & Differentiation, 7, 213
(1996)) se añadió al matraz para realizar la infección a temperatura
ambiente durante 2 horas. Se eliminó el sobrenadante del cultivo y
se añadieron 30 ml de medio EX-CELL^{TM} 400
reciente para realizar 3 a 4 días de cultivo a 27ºC. Tras la
finalización del cultivo, se recogió el sobrenadante del cultivo y
se centrifugó a 1.500 \times g durante 10 minutos para obtener un
fluido sobrenadante.
Se rellenó una columna con aproximadamente 40 ml
de gel de heparina-Sepharose CL-6B
(producido por Pharmacia Biotech AB) y se lavó con 400 ml de tampón
Tris-HCl 20 mM (pH 7,5) a un caudal de 0,5
ml/minuto. Tras el lavado, 1.500 ml del medio de cultivo que
contiene VEGF humano preparado de la manera descrita anteriormente,
se pasaron a través de una columna CL-6B con
heparina-Sepharose a un caudal de 0,5 ml/minuto.
Tras el lavado con 400 ml de tampón Tris-HCl 20 mM
(pH 7,5) a un caudal de 0,5 ml/minuto, se pasaron a través de la
columna 120 ml de cada uno de los tampones de
Tris-HCl 20 mM (pH 7,5) que contenían NaCl 0,2 M,
0,5 M y 1 M en este orden para llevar a cabo la elución paso a paso
de las proteínas adsorbidas a la heparina-Sepharose
y se fraccionó el eluido en fracciones de 8 ml. Se analizaron las
proteínas contenidas en cada fracción por electroforesis en gel de
SDS poliacrilamida y se recogieron 120 ml de las fracciones
(fracciones de NaCl 0,5 a 1 M) que contenían VEGF humano. Tras la
concentración que utiliza CentriPrep-10 (producido
por Amicon), se obtuvo VEGF humano en 4 ml de solución
(concentración de proteínas, 1,2 mg/ml).
Se administró una fracción de 50 \mug de cada
uno de los antígenos obtenidos en la etapa 1-(4) descrita
anteriormente, junto con 2 mg de gel de hidróxido de aluminio y
1\times10^{9} células de vacuna contra la tos ferina (producida
por Chiba Serum Institute), en ratones BALB/c hembra de 5 semanas
(SLC Japón), ratones B6C3F1 (Charles River Japón) o ratas SD hembra
(SLC Japón) y, a partir de las 2 semanas siguientes, se
administraron 10 a 50 \mug de la proteína una vez a la semana
durante un total de cuatro veces. Asimismo, se administraron
1\times10^{7} de células
NIH3T3-Flt-1 6 veces en tres ratones
BALB/c hembra de 5 semanas (SLC Japón). Se extrajeron muestras de
sangre del fondo del ojo o de la vena caudal, se examinaron sus
títulos de anticuerpo en el suero mediante inmunoanálisis enzimático
descrito a continuación, y se escindieron los bazos de los ratones o
las ratas que presentan un título de anticuerpo suficiente 3 días
después de la inmunización final. En relación con esto, no se
produjo inmunización en los ratones BALB/c hembra de 5 semanas a los
que se administraron células
NIH3T3-Flt-1, de modo que no aumentó
el título de anticuerpo en Flt-1 7N soluble.
El bazo escindido de este modo se cortó en
piezas en medio MEM (producido por Nissui Pharmaceutical), no ligado
utilizando un par de pinzas y a continuación se centrifugó (1.200
rpm durante 5 minutos). Se descartó el sobrenadante resultante y el
sedimento obtenido de este modo se trató con tampón de
Tris-cloruro amónico (pH 7,65) durante 1 a 2
minutos para eliminar los eritrocitos, se lavó tres veces con medio
MEM y se utilizó en la fusión celular.
Con respecto a la medición del antisuero
procedente de ratones o ratas inmunizados con el
Flt-1 7N y Flt-1 3N humanos solubles
obtenidos en la etapa 1-(4) descrita anteriormente y los
sobrenadantes del cultivo de hibridomas, se utilizaron como
antígenos los receptores Flt-1 7N y
Flt-1 3N del VEGF humano soluble obtenidos en el
sobrenadante del cultivo de células de insecto de 1-(4). Una
solución diluida en PBS de 1 a 10 \mug/ml de cada uno de los
receptores Flt-1 7N y Flt-1 3N del
VEGF humano soluble y la fracción de la adsorción de la columna de
heparina del sobrenadante del cultivo celular High Five y obtenido
en la etapa 1-(6) descrita anteriormente como antígeno de referencia
se distribuyó en fracciones de 50 \mul/pocillo en una placa de 96
pocillos para EIA (producido por Greiner) y se dejó en reposo
durante la noche a 4ºC para recubrimiento. Tras el lavado, el PBS
que contiene albúmina de suero bovino al 1% (BSA) se distribuyó en
fracciones de 100 \mul/pocillo y se llevó a cabo 1 hora de
reacción a temperatura ambiente para efectuar el bloqueo de los
grupos activos restantes. Después de descartar el
BSA-PBS al 1%, se distribuyó antisuero de ratón
inmunizado o de rata inmunizada y sobrenadante del cultivo de un
hibridoma en fracciones de 50 \mul/pocillo para realizar la
reacción durante 2 horas. Tras el lavado con Tween al 0,05%-PBS, se
distribuyó inmunoglobulina antirratón de conejo marcada con
peroxidasa o inmunoglobulina antirrata de conejo marcada con
peroxidasa (ambas producidas por DAKO) se distribuyeron en
fracciones de 50 \mul/pocillo y se llevó a cabo 1 hora de reacción
a temperatura ambiente, se lavó la placa con Tween al 0,05%-PBS y a
continuación se produjo el desarrollo del color utilizando solución
de sustrato ABTS (sal amónica de (2,2-azinobis(ácido
3-etilbenzotiazol-6-sulfónico))
para medir la absorbancia máxima a una DO415 nm utilizando E max
(producido por Molecular Devices).
Se cultivó la línea celular P3U1 de mieloma de
ratón resistente a 8-azaguanina utilizando medio
normal para asegurar 2\times10^{7} o más de las células para su
utilización en la fusión celular como línea celular precursora.
Las células de bazo de ratón o las células de
bazo de rata obtenidas en el apartado 2 descrito anteriormente y las
células de mieloma obtenidas en el apartado 4 anterior se mezclaron
en una proporción de 10:1 y se centrifugaron (1.200 rpm durante 5
minutos), se descartó el sobrenadante, las células precipitadas se
liberaron minuciosamente para lo cual, mientras se agitaba a 37ºC,
se añadieron posteriormente una solución mixta de 2 g de
polietilenglicol-1000 (PEG-1000), 2
ml de medio MEM y 0,7 ml de DMSO en una cantidad de 0,2 a 1
ml/10^{8} células de mieloma de ratón y a continuación 1 a 2 ml de
medio MEM varias veces a intervalos de 1 a 2 minutos, y a
continuación se ajustó el volumen total a 50 ml añadiendo medio MEM.
Tras la centrifugación (900 rpm durante 5 minutos), se descartó el
sobrenadante y las células obtenidas de este modo se liberaron
suavemente y a continuación se pusieron en suspensión suavemente en
100 ml de medio HAT mediante suspensión repetida hacia dentro de una
pipeta graduada y descargándolo desde la misma.
La suspensión se distribuyó en fracciones de 100
\mul en los pocillos de una placa de cultivo de 96 pocillos y se
cultivó a 37ºC durante 10 a 14 días en una atmósfera de CO_{2} al
5% en una incubadora de CO_{2} al 5%. El sobrenadante del cultivo
resultante se examinó por el método de inmunoanálisis enzimático
descrito en el Ejemplo 1-3 para seleccionar los
pocillos que reaccionaron específicamente con el receptor
Flt-1 7N o Flt-1 3N del VEGF humano
soluble obtenido en la etapa 1-(4) descrita anteriormente, pero no
reaccionaron con el antígeno de referencia obtenido en la etapa
1-(6), y a continuación se repitió la clonación dos veces cambiando
el medio por medio HT y medio normal para crear hibridomas capaces
de producir anticuerpos monoclonales de receptor
Flt-1 del VEGF anti-humano. Los
resultados se presentan en la tabla siguiente.
| Animal | Cabezal | Inmunógeno | Fuente de | Pocillos | Número de hibridomas |
| cribado | cribados | creados | |||
| Ratones Balb/c | 3 | NIH3T3-Flt-1 | Flt 7N | - | - |
| Rata SD | 1 | Flt 7N | Flt 7N | 1.008 | 3 (KM1733, 1735, 1736) |
| Ratones BALB/c | 1 | Flt 7N | Flt 7N | 672 | 5 (KM1737, 1739, 1740, |
| 1742, 1743) | |||||
| Rata SD | 1 | Flt 7N | Flt 7N | 1.176 | 3 (KM1745, 1746, 1747) |
| Ratones H3C3F1 | 1 | Flt 7N | Flt 3N | 672 | 3 (KM1748, 1749, 1750) |
| Ratones Balb/c | 1 | Flt 7N | Flt 3N | 420 | 3 (KM1730, 1731, 1732) |
Cuando los hibridomas obtenidos de un ratón
Balb/c y de dos ratas SD inmunizadas con el receptor
Flt-1 7N del VEGF humano soluble preparadas en la
etapa 1-(4) descrita anteriormente se cribaron en aproximadamente
672 pocillos y aproximadamente 2.184 pocillos, respectivamente,
utilizando el receptor Flt-1 7N del VEGF humano
soluble, se obtuvieron 5 clones y 6 clones respectivos de
anticuerpos monoclonales antirreceptor Flt-1 del
VEGF humano, y se denominaron KM1737, KM1739, KM1740, KM1742 y
KM1743 y KM1733, KM1735, KM1736, KM1745, KM1746 y KM1747,
respectivamente. Ninguno de estos clones presentaba la acción para
inhibir el enlace de VEGF humano al Flt-1 como se
demuestra en el apartado 8 siguiente. Además, KM1735, KM1736,
KM1742, KM1743 y KM1745 reaccionaron con las células con expresión
del receptor Flt-1 del VEGF humano mediante el
método de tinción de inmunocitos descrito en el apartado 10
siguiente, pero la reacción fue sumamente débil en comparación con
KM1730, KM1731 y KM1732.
Por otra parte, cuando los hibridomas obtenidos
de un ratón B3C3F1 y de un ratón Balb/c inmunizados con el receptor
Flt-1 7N del VEGF humano soluble preparado en la
etapa 1-(4) descrita anteriormente se cribaron para aproximadamente
672 pocillos y aproximadamente 420 pocillos, respectivamente,
utilizando el receptor Flt-1 3N del VEGF humano
soluble, se obtuvieron 3 clones para cada uno de los anticuerpos
monoclonales antirreceptor Flt-1 del VEGF humano, y
se denominaron KM1748, KM1749 y KM1750 y KM1730, KM1731 y KM1732,
respectivamente. De estos clones, tres clones KM1732, KM1748 y
KM1750 presentaron la acción de inhibir el enlace de VEGF humano a
Flt-1 como se muestra en el apartado 8 siguiente.
Además, tres clones KM1730, KM1731 y KM1732 reaccionaron de manera
muy acusada con las células con expresión del receptor
Flt-1 del VEGF humano mediante el método de tinción
de inmunocitos descrito en el apartado 10 siguiente.
La clase de anticuerpo de estos anticuerpos
monoclonales se determinó por inmunonanálisis enzimático utilizando
el kit Subclass Typing (producido por Zymed). Los resultados se
presentan en la tabla siguiente.
| Anticuerpo monoclonal | Subclase de anticuerpo |
| KM1733 | IgG2a de ratón |
| KM1735 | IgG1 de rata |
| KM1736 | IgG2a de rata |
| KM1737 | IgG1 de ratón |
| KM1739 | IgG1 de ratón |
| KM1740 | IgG1 de ratón |
| KM1742 | IgG1 de ratón |
| KM1743 | IgG1 de ratón |
| KM1745 | IgG2a de rata |
| KM1746 | IgG1 de rata |
| KM1747 | IgG1 de rata |
| KM1748 | IgG2b de ratón |
| KM1748 | IgG1 de ratón |
| KM1750 | IgG2b de ratón |
| KM1730 | IgG1 de ratón |
| KM1731 | IgG2a de ratón |
| KM1732 | IgG1 de ratón |
Todos los anticuerpos monoclonales creados en la
presente invención eran de la clase IgG.
Los hibridomas obtenidos en el apartado 5
anterior se administraron respectivamente a ratones (Balb/c)
lampiños hembra de 8 semanas tratados con pristano por inyección
intraperitoneal a una dosis de 5 a 20\times10^{6} células por
animal. Los hibridomas produjeron la formación de tumor ascítico en
10 a 21 días. Se extrajo fluido ascítico de cada ratón con fluido
ascítico (1 a 8 ml por animal), se centrifugaron (3.000 rpm durante
5 minutos) para eliminar la materia sólida y a continuación se
purificaron por un método de precipitación con ácido caprílico
(Antibodies - A Laboratory Manual).
Se confirmó la especificidad de los anticuerpos
monoclonales antirreceptor Flt-1 del VEGF humano
descrito en el apartado 5 anteriormente utilizando el método del
inmunoanálisis enzimático descrito en el apartado 3
anteriormente.
Los resultados se presentan en la Fig. 5. Entre
los anticuerpos monoclonales obtenidos preparando hibridomas
procedentes de ratones y ratas inmunizados con Flt-1
7N y seleccionados utilizando Flt-1 7N (KM173,
KM1735, KM1736, KM1737, KM1739, KM1740, KM1742, KM1743, KM1745,
KM1746 y KM1747), solamente KM1740 reaccionó con
Flt-1 7N y Flt-1 3N, poniendo de
manifiesto que reconoce un epítopo que está presente en una zona de
las posiciones 1ª a 338ª del aminoácido terminal de
Flt-1 (incluyendo la secuencia señal). Como los 10
clones restantes reaccionaron con Flt-1 7N pero no
con Flt-1 3N, se puso de manifiesto que reconocen un
epítopo que está presente en una zona de las posiciones 339ª a 750ª
del aminoácido N-terminal de Flt-1
(incluyendo la secuencia señal). Por otra parte, ya que todos los
anticuerpos monoclonales obtenidos preparando hibridomas de ratones
inmunizados con Flt-1 7N y que se seleccionan
utilizando Flt-1 3N (KM1748, KM1749, KM1750, KM1730,
KM1731 y KM1732) reaccionaron con Flt-1 7N y
Flt-1 3N, se puso de manifiesto que reconocen un
epítopo que está presente en una zona de las posiciones 1ª a 338ª
del aminoácido N-terminal de Flt-1
(incluyendo la secuencia señal).
Se confirmó de la siguiente manera la actividad
de los anticuerpos monoclonales antirreceptor Flt-1
del VEGF humano descrito anteriormente en el apartado 5 para inhibir
el enlace de un VEGF humano a un receptor Fl-1 del
VEGF humano.
Se distribuyó metanol en fracciones de 100
\mul en pocillos de una placa de filtración
MultiScreen-IP de 96 pocillos (producida por
Millipore) para dar un hidrófilo natural para la membrana de PVDF en
el fondo de la placa. Tras el lavado con agua, el receptor
Flt-1 7N del VEGF humano soluble diluido con PBS
hasta una concentración de 1,6 \mug/ml se distribuyó en fracciones
de 50 \mul/pocillo y se dejó reposar durante la noche a 4ºC para
efectuar su adsorción. Tras el lavado, el PBS que contenía albúmina
de suero bovino al 1% (BSA) se distribuyó en fracciones de 50
\mul/pocillo y se llevó a cabo 1 hora de reacción a temperatura
ambiente para efectuar el bloqueo de los grupos activos restantes.
Después del lavado con PBS, cada sobrenadante del cultivo de
hibridomas o un anticuerpo policlonal purificado diluido con BSA al
1%-PBS que contenía NaCl 0,5 M (0,1 a 7,29 \mug/ml) se distribuyó
en fracciones de 50 \mul/pocillo y a continuación 3 ng/ml de VEGF
humano marcado con ^{125}I (producido por Amersham) se
distribuyeron en fracciones de 50 \mul/pocillo, realizando
posteriormente la reacción a temperatura ambiente durante 1,5 horas.
Después del lavado con Tween al 0,05%-PBS, se secaron los pocillos a
50ºC y se distribuyó Microscinti-0 (producido por
Packard) en fracciones de 30 \mul/pocillo para medir la
radioactividad del VEGF humano marcado con ^{125}I ligado a cada
pocillo utilizando Top Count (producido por Packard).
Los resultados del examen de las actividades de
los sobrenadantes del cultivo de hibridoma se presentan en la Fig.
6. Entre los 17 anticuerpos monoclonales creados, tres anticuerpos
monoclonales, KM1748, KM1750 y KM1732 inhibieron el enlace del VEGF
humano al receptor Flt-1 del VEGF humano en
proporciones de inhibición del 62,6%, 66,3% y 83,1%,
respectivamente.
En general, la identificación del anticuerpo
monoclonal que produce hibridomas se realiza utilizando la misma
proteína que el antígeno utilizado como inmunógeno. Un total de 11
anticuerpos monoclonales seleccionados que utilizan
Flt-1 7N como inmunógeno no presentaban ninguna
actividad de inhibición del enlace, y entre 6 anticuerpos
monoclonales seleccionados que utilizan Flt-1 3N
(KM1748, KM1749, KM1750, KM1730, KM1731 y KM1732), KM1748, KM1750 y
KM1732 presentaban la actividad de inhibición del enlace. Fue un
efecto inesperado que los anticuerpos monoclonales con actividad de
inhibición de enlace se obtuvieran mediante la utilización de
Flt-1 3N en la identificación de hibridomas. Por lo
tanto, se puso de manifiesto que Flt-1 3N es muy
importante en la creación de anticuerpos monoclonales con actividad
de inhibición de enlace.
La Fig. 7 presenta los resultados del examen de
la actividad de inhibición de enlace utilizando los anticuerpos
monoclonales KM1732, KM1748 y KM1750
anti-Flt-1 purificados. Estos
anticuerpos KM1732, KM1748 y KM1750 inhibieron el enlace del VEGF
humano al receptor Flt-1 del VEGF humano en función
de la concentración. Las concentraciones de KM1732, KM1748 y KM1750,
que indican 50% de inhibición del enlace del VEGF humano al receptor
Flt-1 del VEGF humano (IC_{50}), fueron 1,1, 1,3 y
2,0 \mug/ml, respectivamente. Por otra parte, un anticuerpo
monoclonal KM231
anti-sialil-Le^{a} de una clase
IgG1 de ratón (Anticancer Research, 10, 1579 (1990))
utilizado como referencia no presentó actividad de inhibición.
La actividad de los anticuerpos monoclonales
KM1732, KM1748 y KM1750 antirreceptor Flt-1 del VEGF
humano para inhibir el enlace de un VEGF humano al receptor
Flt-1 del VEGF humano se confirmó de la manera
siguiente.
PBS que contiene albúmina de suero bovino al 1%
(BSA) se distribuyó en fracciones de 100 \mul en pocillos de una
placa MultiScreen-HV (producida por Millipore) de 96
pocillos, se llevó a cabo una hora de la reacción a temperatura
ambiente para efectuar el bloqueo de los grupos activos en los
pocillos y a continuación se pusieron en suspensión células
NIH3T3-Flt-1 en
BSA-PBS al 1% que contiene NaN_{3} al 0,05% se
distribuyeron en fracciones de 5\times10^{4} células/pocillo.
Después del lavado con BSA-PBS al 1%, se distribuyó
un anticuerpo monoclonal purificado (0,1 a 7,29 \mug/ml) en
fracciones de 50 \mul/pocillo y a continuación 3 ng/ml de VEGF
humano marcado con ^{125}I (producido por Amersham) se distribuyó
en fracciones de 50 \mul/pocillo y se llevó a cabo la reacción
bajo enfriamiento durante 2 horas. Tras el lavado con PBS, se
secaron los pocillos a 50ºC y se distribuyó
Microscinti-0 (producido por Packard) en fracciones
de 30 \mul/pocillo para medir la radioactividad del VEGF humano
marcado con ^{125}I ligado a cada pocillo utilizando Top Count
(producido por Packard).
La Fig. 8 presenta los resultados del examen de
actividad de inhibición de enlace utilizando anticuerpos KM1732,
KM1748 y KM1750 monoclonales
anti-Flt-1 purificados. Estos
anticuerpos KM1732, KM1748 y KM1750 inhibieron el enlace del VEGF
humano a las células NIH3T3-Flt-1 en
función de la concentración. Las concentraciones de KM1732, KM1748 y
KM1750, que indican 50% de inhibición del enlace del VEGF humano a
las células NIH3T3-Flt-1
(IC_{50}), fueron de 0,050, 0,037 y 0,041 \mug/ml,
respectivamente. Por otra parte, el anticuerpo monoclonal KM231
anti-sialil-Le^{a} de una clase
IgG1 de ratón utilizado como referencia no presentó actividad de
inhibición.
Se confirmó la especificidad de los anticuerpos
monoclonales antirreceptor Flt-1 del VEGF humano
descritos en el apartado 5 anterior utilizando el método de tinción
de inmunocitos según el procedimiento siguiente.
Un total de 5\times10^{5} células de las
células NIH3T3 con expresión del receptor Flt-1 del
VEGF humano (NIH3T3-Flt-1) y de las
células NIH3T3 de referencia (NIH3T3-Neo)
(Oncogene, 10, 135 (1995)) se pusieron en suspensión
en 100 \mul de una solución de tampón para la utilización de la
tinción de inmunocitos (PBS que contiene BSA al 1%, EDTA al 0,02% y
azida sódica al 0,05%) y se distribuyeron en una placa de fondo
redondo de 96 pocillos. Después de la centrifugación a 4ºC y a 350
\times g durante 1 minuto, el fluido del sobrenadante se descartó
y las células resultantes se mezclaron con 50 \mul de un
sobrenadante de cultivo de hibridoma o anticuerpo purificado (10
\mug/ml) y la reacción se llevó a cabo a 4ºC durante 30 minutos.
Tras la reacción, se añadieron 200 \mul de la solución del tampón
para la utilización de la tinción de inmunocitos a cada pocillo, y
las células se lavaron por centrifugación a 4ºC y 350 \times g
durante 1 minuto seguido de descarte del sobrenadante resultante.
Después de repetir esta etapa de lavado dos veces, las células se
mezclaron con 50 \mul de la solución de tampón para utilización de
la tinción de inmunocitos que contiene 1 \mug/ml de un anticuerpo
de inmunoglobulina antirratón marcado con FITC o un anticuerpo de
inmunoglobulina antirrata marcado con FITC (producido por Wako Pure
Chemical Industries) y la reacción se llevó a cabo a 4ºC durante 30
minutos. Tras esta reacción, se repitió tres veces la etapa de
lavado descrita anteriormente y a continuación se realizó el
análisis utilizando citómetro de flujo (producido por Coulter).
Los resultados se presentan en la Fig. 9. Los
anticuerpos monoclonales KM1730, KM1731 y KM1732 antirreceptor
Flt-1 del VEGF humano no reaccionaron con las
células de referencia pero reaccionaron específicamente en
cantidades significativas con las células de expresión de
Flt-1. Ni el anticuerpo monoclonal KM1748
antirreceptor Flt-1 del VEGF humano (10 \mug/ml)
ni el sobrenadante del cultivo de hibridoma KM1748 reaccionaron con
las células de referencia. Cada uno reaccionó específicamente en
cantidades significativas con las células (B) con expresión de
Flt-1. Como resultados, se descubrió que los
anticuerpos monoclonales KM1730, KM1731, KM1732, KM1748 y KM1750
reconocen específicamente al receptor Flt-1 del VEGF
humano en la superficie celular. Por otra parte, KM1735, KM1736,
KM1742, KM1743 y KM1745 sólo reaccionaron débilmente con las células
con expresión del receptor Flt-1 del VEGF humano en
comparación con KM1730, KM1731, KM1732, KM1748 y KM1750.
Se prepararon componentes de la membrana celular
a partir de células NIH3T3-Flt-1 y
de células NIH3T3 de referencia (NIH3T3-Neo) según
un método conocido (Cancer Research, 46, 4438 (1986))
y se sometieron a electroforesis por el método
SDS-PAGE. Se llevó a cabo la
SDS-PAGE según un método conocido (Anticancer
Research, 12, 1121 (1992)) sometiendo 15 \mug, como
proteína por banda, de componentes de la membrana celular a
electroforesis utilizando un gel con gradiente 5 al 20% (producido
por Atto) en condiciones reductoras. Las proteínas tratadas de este
modo se transfirieron a una membrana de PVDF según un método
conocido (Anticancer Research, 12, 1121, (1992)). A
continuación, se dejó reaccionar la membrana de PVDF con PBS que
contenía BSA al 1% a temperatura ambiente durante 30 minutos para
efectuar el bloqueo y a continuación reaccionar con el sobrenadante
del cultivo del anticuerpo monoclonal KM1737 antirreceptor
Flt-1 del VEGF humano durante la noche a 4ºC. La
membrana tratada de este modo se lavó con PBS que contenía Tween al
0,05% y a continuación se dejó reaccionar con IgG antirratón de
cabra marcada con peroxidasa (dilución 5.000 veces: producido por
Chemicon) a temperatura ambiente durante 2 horas. Después del lavado
con PBS que contiene 0,05% de Tween, se detectaron las bandas a las
que el anticuerpo monoclonal KM1737 antirreceptor
Flt-1 del VEGF humano estaba unido utilizando
reactivos ECL^{TM} para detección de transferencia Western
(producidos por Amersham).
Los resultados se presentan en la Fig. 10. Se
confirmó que el anticuerpo monoclonal KM1737 antirreceptor
Flt-1 VEGF humano puede detectar el receptor
Flt-1 del VEGF humano de 180 kilodaltons en el peso
molecular expresado en las células
NIH3T3-Flt-1.
El anticuerpo monoclonal KM1732 antirreceptor
Flt-1 del VEGF humano se diluyó con PBS hasta una
concentración de 10 \mug/ml y se distribuyó en fracciones de 50
\mul/pocillo en una placa de 96 pocillos para EIA (producido por
Greiner) y se dejó en reposo durante la noche a 4ºC para
recubrimiento. Después del lavado, el PBS que contenía albúmina de
suero bovino al 1% (BSA) se distribuyó en fracciones de 100
\mul/pocillo y se llevó a cabo 1 hora de reacción a temperatura
ambiente para efectuar el bloqueo de los grupos activos restantes.
Después de descartar el BSA al 1%-PBS, los receptores
Flt-1 7N y Flt-1 3N del VEGF humano
soluble purificado obtenidos en la etapa 1-(4) descrita
anteriormente y diluidos con BSA al 1%-PBS hasta una concentración
de 1.000 a 0,0056 ng/ml se dejaron reaccionar con el anticuerpo
durante la noche a 4ºC. Después del lavado con Tween al 0,05%-PBS,
el anticuerpo monoclonal KM1730 antirreceptor Flt-1
del VEGF humano marcado con biotina por un método conocido
(Enzyme Antibody Method: publicado por Gakusai Kikaku, 1985)
se diluyó con BSA al 1%-PBS hasta una concentración de 0,1 \mug/ml
y se distribuyó en fracciones de 50 \mul/pocillo para realizar la
reacción a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de lavar
con Tween al 0,05%-PBS, la peroxidasa marcada con avidina (producida
por Vector) diluida 4.000 veces con BSA al 1%-PBS se distribuyó en
fracciones de 50 \mul/pocillo para llevar a cabo la reacción a
temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar con Tween al
0,05%-PBS, se produjo el desarrollo del color utilizando la solución
del sustrato ABTS (sal amónica de 2,2-azinobis(ácido
3-etilbenzotiazol-6-sulfónico))
para medir la absorbancia a una DO 415 nm utilizando E max
(producido por Molecular Devices).
Los resultados se presentan en la Fig. 11. Como
resultados, se observó que los receptores Flt-1 3N y
Flt-1 7N del VEGF humano soluble pueden medirse
desde concentraciones mínimas de 0,46 ng/ml y 1,37 ng/ml,
respectivamente, mediante la utilización del anticuerpo monoclonal
KM1732 antirreceptor Flt-1 del VEGF humano y del
anticuerpo monoclonal KM1730 antirreceptor Flt-1 del
VEGF humano marcado con biotina.
La reactividad de los anticuerpos monoclonales
antirreceptor Flt-1 del VEGF humano descritos en el
apartado 5 anteriormente con células HUVEC endoteliales vasculares
humanas se confirmó mediante tinción de inmunocitos de la siguiente
manera.
Se pusieron en suspensión un total de
2\times10^{5} células de las células endoteliales de la vena
umbilical humana (HUVEC) en 100 \mul de una solución tampón para
su utilización en la tinción de inmunocitos (PBS que contenía BSA al
1%, EDTA al 0,02% y azida sódica al 0,05%) y se distribuyeron en una
placa de 96 pocillos de fondo redondo. Tras la centrifugación a 4ºC
y a 350 \times g durante 1 minuto, se descartó el fluido
sobrenadante y las células resultantes se mezclaron con 50 \mul
(10 \mug/ml) de cada uno de los anticuerpos KM1730 y KM1750
purificados biotinados y los anticuerpos de referencia de los
mismos, individualmente, y posteriormente se incubaron a 4ºC durante
30 minutos. Como anticuerpo de referencia de KM1730, se utilizó un
anticuerpo monoclonal KM1135 anti-MxA (documento WO
96/05230) de tipo IgG1 que es la misma subclase del KM1730. Como
anticuerpo de referencia de KM1750, se utilizó un anticuerpo
monoclonal KM365 con cadena \gamma antirreceptor de linfocito T
(solicitud de patente japonesa no examinada publicada nº 491/90) de
IgG2b que es la misma subclase que la del KM1750. A continuación, se
añadieron a cada pocillo 200 \mul de la solución tampón para su
utilización para la tinción de inmunocitos, y se lavaron las células
realizando la centrifugación a 4ºC y a 350 \times g durante 1
minuto y a continuación se descartó el sobrenadante resultante.
Después repitiendo otra vez esta etapa de lavado dos veces, se
mezclaron las células con 20 \mul de la solución tampón para su
utilización en la tinción de inmunocitos que contenía 5 \mug/ml en
una concentración de avidin-PE
(estreptoavidina-R-ficoeritrina)
(producida por Gibco) y se llevó a cabo la reacción a 4ºC durante 30
minutos. Después de la reacción, se repitió tres veces la etapa de
lavado descrita anteriormente y a continuación se realizó el
análisis utilizando un citómetro de flujo (producido por
Coulter).
Los resultados se presentan en la Fig. 12. Los
anticuerpos monoclonales KM1730 y KM1750 antirreceptor
Flt-1 del VEGF humano reaccionaron con HUVEC en
comparación con sus anticuerpos de referencia. Estos resultados
demuestran que los anticuerpos monoclonales KM1730 y KM1750 pueden
detectar el receptor Flt-1 del VEGF humano en las
células endoteliales vasculares humanas.
Como modelo de células endoteliales vasculares
en una zona de angiogénesis, se examinaron los cambios en la
expresión del receptor Flt-1 del VEGF humano antes y
después de la estimulación con VEGF utilizando el anticuerpo
monoclonal KM1730 antirreceptor Flt-1 de VEGF humano
según el siguiente procedimiento.
Un total de 4 a 6\times10^{5} células de
cada uno de los cuatro lotes de HUVEC (lote nº 4031, nº 4102, nº
2477 y nº 4723; adquiridos en Clonetics) se pusieron en suspensión
en 20 ml de un medio (producido por KURABO) (medio de referencia)
compuesto por medio E-BM enriquecido además con
suero bovino fetal al 5% (FBS), 10 ng/ml de factor de crecimiento
epidérmico de tipo recombinante humano, 1 mg/ml de hidrocortisona,
50 mg/ml de gentamicina y 50 ng/ml de anfotericina, y la solución se
continuó mezclando con 1,2 mg/ml de extracto de cerebro bovino
(BBE) (producido por KURABO) como factor del crecimiento y se
sometió a 2 a 3 días de cultivo a 37ºC. Cuando las células
proliferaron entre 1 y 2\times10^{6} células, se eliminó el
medio y se sustituyó con 20 ml de medio de referencia reciente para
realizar un total de 2 días de cultivo. Después del cultivo durante
1 día, se añadió VEGF humano hasta una concentración final de 5
ng/ml y las células tras el cultivo adicional durante 1 día se
utilizaron como células estimuladas por VEGF. Las células cultivadas
durante 2 días sin añadir VEGF se utilizaron como células de
referencia (células no estimuladas por VEGF). Tras el cultivo, se
recogieron las células para examinar la reactividad del anticuerpo
monoclonal KM1730 antirreceptor Flt-1 del VEGF
humano mediante el método de tinción de inmunocitos según el
procedimiento descrito en el apartado 13 anterior.
Los resultados del examen de su reactividad con
el lote nº 2477 de HUVEC se presentan en la Fig. 13. KM1730
reaccionó con HUVEC no estimulado por VEGF pero más fuertemente con
HUVEC estimulado por VEGF. La reactividad del anticuerpo KM1135 de
referencia no cambió independientemente de la estimulación o no
estimulación por VEGF. La Fig. 14 presenta los cambios en la
expresión de Flt-1 en cuatro lotes de HUVEC (lote nº
4031, nº 4102, nº 2477 y nº 4723) por estimulación por VEGF. La
cantidad de expresión de Flt-1 que puede expresar la
reactividad de KM1730 como índice se presenta como un valor
relativo cuando la reactividad del anticuerpo de referencia está
definida como 1. Se puso de manifiesto que los cuatro lotes de HUVEC
pueden expresar Flt-1 por falta de estimulación por
VEGF y la cantidad de expresión de Flt-1 aumenta
mediante la estimulación por VEGF.
El aumento de la cantidad de expresión de
Flt-1 y la reactividad del anticuerpo monoclonal
anti-Flt-1 en las células
endoteliales vasculares humanas HUVEC estimuladas por VEGF como
modelo de angiogénesis demuestra que el anticuerpo monoclonal sirve
para el diagnóstico o el tratamiento de enfermedades en las que sus
estados patológicos evolucionan mediante la aceleración de la
angiogénesis producida por VEGF, tales como tumores, artritis
reumatoide, retinopatía diabética y similares.
La presente invención hace posible el aporte de
anticuerpos monoclonales que se unen específicamente al receptor
Flt-1 de VEGF humano que se considera que se expresa
específicamente en las células endoteliales vasculares de las zonas
de angiogénesis humana. Los anticuerpos monoclonales de la presente
invención son útiles para la detección inmunológica de las zonas de
angiogénesis humana mediante tinción de inmunocitos y para el
diagnóstico o tratamiento, mediante la inhibición de las actividades
biológicas del VEGF humano, de las enfermedades en las que sus
estados patológicos evolucionan por angiogénesis anormal, tales como
proliferación o metástasis de tumores sólidos, artritis en artritis
reumatoide, retinopatía diabética, retinopatía del prematuro,
psoriasis y similares.
SEC. ID. nº: 1
| Longitud de la secuencia: 23 |
| Tipo de secuencia: ácido nucleico |
| Número de cadenas: una |
| Configuración: lineal |
| Tipo molecular: otro ácido nucleico, ADN sintético |
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGACAAACCA ATATAATCTA AGC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 2
| Longitud de la secuencia: 25 |
| Tipo de secuencia: ácido nucleico |
| Número de cadenas: una |
| Configuración: lineal |
| Tipo molecular: otro ácido nucleico, ADN sintético |
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCCGCTTAG ATTATATTGG TTTGT
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 3
| Longitud de la secuencia: 21 |
| Tipo de secuencia: ácido nucleico |
| Número de cadenas: una |
| Configuración: lineal |
| Tipo molecular: otro ácido nucleico, ADN sintético |
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAATCTACA TTTGCATAGC T
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 4
| Longitud de la secuencia: 33 |
| Tipo de secuencia: ácido nucleico |
| Número de cadenas: una |
| Configuración: lineal |
| Tipo molecular: otro ácido nucleico, ADN sintético |
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTATGCGGCC GCTTATCCTT GAACAGTGAG GTA
\hfill33
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ANTICUERPO MONOCLONAL Antirreceptor Flt-1 del VEGF humano
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- REMITENTE: Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 6-1, Ohtemachi 1-chome, Chiyoda-ku
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Tokyo 100
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Japón
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- LISTADO DESCIFRABLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM COMPATIBLE
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1,25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: EP 97913427.7 (PCT/JP97/04259)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 20.08.1998
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL APODERADO / AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Kinzebach, Werner, Dr.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA / NÚMERO DE ETIQUETA: M/39246
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (089) 998397-0
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (089) 987304
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGACAAACCA ATATAATCTA AGC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCCGCTTAG ATTATATTGG TTTGT
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAATCTACA TTTGCATAGC T
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTATGCGGCC GCTTATCCTT GAACAGTGAG GTA
\hfill33
Claims (14)
1. Anticuerpo monoclonal que reacciona
específicamente con el receptor Flt-1 (tirosina
cinasa de tipo fms) del factor de crecimiento endotelial vascular
(VEGF) humano, reconoce un epítopo presente en una zona de las 1ª a
la 338ª posiciones del aminoácido N-terminal,
incluyendo una secuencia señal, del receptor Flt-1
del VEGF humano, inhibe el enlace del VEGF humano al receptor
Flt-1 del VEGF humano e inhibe de esta manera las
actividades biológicas del VEGF humano.
2. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación
1, que es un anticuerpo monoclonal que puede obtenerse a partir de
un hibridoma seleccionado de entre el grupo constituido por
FERM BP-5698 (KM1732) que
pertenece a la subclase IgG1 de ratón;
FERM BP-5699 (KM1748) que
pertenece a la subclase IgG2b de ratón; y
FERM BP-5700 (KM1750) que
pertenece a la subclase IgG2b de ratón.
3. Hibridoma que produce un anticuerpo
monoclonal según la reivindicación 1 ó 2 y que es seleccionado de
entre el grupo constituido por FERM BP-5698
(KM1732); FERM BP-5699 (KM1748); y FERM
BP-5700 (KM1750).
4. Composición farmacéutica que comprende por lo
menos un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 ó 2.
5. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación
1 ó 2, para su utilización en terapia o diagnóstico.
6. Procedimiento para la producción de un
anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 ó 2, que comprende
el cultivo de un hibridoma con el fin de producir el anticuerpo, y
recuperar el anticuerpo.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en
el que el hibridoma es un hibridoma según la reivindicación 3.
8. Método in vitro para detectar
inmunológicamente el receptor Flt-1 (tirosina cinasa
de tipo fms) del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)
humano, que comprende la utilización del anticuerpo monoclonal
según la reivindicación 1 ó 2.
9. Método in vitro para detectar
inmunológicamente células en las que el receptor
Flt-1 (tirosina cinasa de tipo fms) del factor de
crecimiento endotelial vascular (VEGF) humano se expresa en la
superficie de las mismas, que comprende la utilización del
anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 ó 2.
10. Método in vitro para detectar
inmunológicamente y determinar el receptor Flt-1
(tirosina cinasa de tipo fms) del factor de crecimiento endotelial
vascular (VEGF) humano soluble, que comprende la utilización del
anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 ó 2.
11. Método in vitro para inhibir el
enlace del receptor Flt-1 (tirosina cinasa de tipo
fms) del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) humano,
que comprende la utilización del anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 1 ó 2.
12. Método in vitro para inhibir las
actividades biológicas del factor de crecimiento endotelial vascular
(VEGF) humano, que comprende la utilización del anticuerpo
monoclonal según la reivindicación 1 ó 2.
13. Utilización de por lo menos un anticuerpo
monoclonal según la reivindicación 1 ó 2, para la preparación de una
composición farmacéutica para la inhibición de la angiogénesis.
14. Utilización de por lo menos un anticuerpo
monoclonal según la reivindicación 1 ó 2 para la preparación de una
composición farmacéutica destinada al diagnóstico o al tratamiento
de una enfermedad seleccionada de entre el grupo constituido por
proliferación o metástasis de tumores sólidos, artritis reumatoide,
retinopatía diabética, retinopatía del prematuro y psoriasis.
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