ES2260157T3 - Metodo para ser dispositivos de alta densidad. - Google Patents

Metodo para ser dispositivos de alta densidad.

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ES2260157T3 ES01203716T ES01203716T ES2260157T3 ES 2260157 T3 ES2260157 T3 ES 2260157T3 ES 01203716 T ES01203716 T ES 01203716T ES 01203716 T ES01203716 T ES 01203716T ES 2260157 T3 ES2260157 T3 ES 2260157T3
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James R. Hudson, Jr.
Elliot P. Dawson
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BioVentures Inc
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Abstract

Un método para producir agrupamientos de alta densidad de sustancias objeto que comprende un haz de hebras objeto, que comprende sustancias objeto caracterizado por qué el método comprende la etapa de seccionar el haz de hebras objeto y combinar el haz seccionado con uno o más haces seccionados, donde la combinación resulta en un agrupamiento de alta densidad que tiene sustancias objeto presentes en tres ejes cartesianos.

Description

Método para ser dispositivos de alta densidad.
Antecedentes
Los agrupamientos de alta en modo densidad de sustancias naturales o sintéticas objetivo permiten el estudio simultáneo de analitos para la presencia de propiedades específicas. Tales agrupamientos de alta densidad se han mostrado útiles en una gran variedad de campos tecnológicos incluyendo química, genética, inmunología, ciencias materiales, medicina, biología molecular y farmacología. Por ejemplo, los agrupamientos de alta densidad de ácidos nucleicos se utilizan para establecer secuencias genéticas, para detectar la presencia de mutaciones genéticas y para detectar la expresión diferencial cualitativa y cuantitativa de productos genéticos. De la misma forma, los agrupamientos de alta densidad repetidos se utilizan para mapear secuencias tópicas que elicitan respuestas inmunes. Adicionalmente, los agrupamientos de sustancias objetivo se utilizan para identificar compuestos para el desarrollo de agentes farmacéuticos.
Actualmente, los métodos para la construcción de agrupamientos de alta densidad de sustancias de prueba son generalmente de dos tipos. Primero, los agrupamientos se construyen aplicando individualmente sustancias objetivo preformadas natural o sintéticamente, tales como biomoléculas, directamente en localizaciones específicas sobre un soporte. Los soportes incluyen membranas de nailon de nitrocelulosa, dicloruro de polivinilidino, vidrio, silicio u otros materiales, y las sustancias objetivo pueden ser inmovilizadas sobre un soporte exponiendo el soporte a la radiación ultravioleta o calentando soporte, entre otras técnicas. Un método tal está descrito en Pietu et al., "Novel Gene Transcripts Preferentially Expressed in Human Muscles Revealed by Quantitative Hybridization of a High Density cDNA Array", Genome Research (1996) 6: 492-503, incorporada aquí como referencia en su integridad. Diversos dispositivos han sido diseñados para automatizar el método de aplicación.
Otro método, descrito en WO96/17246, consiste en juntar entre sí elementos transportadores delgados elongados, teniendo cada uno de estos elementos una molécula seleccionada y seccionando esos haces para producir agrupamientos bidimensionales.
El segundo método para construir agrupamientos de alta densidad incluye la síntesis de sustancias objetivo individuales en localizaciones específicas in situ sobre un soporte. En una versión de este método, se utiliza la química fotosintética para preparar simultáneamente series de diferentes sustancias objetivo en localizaciones únicas sobre un soporte. En otra versión de este método, las sustancias objetivo son sintetizadas por enmascaramiento o un bloqueo físico de áreas seleccionadas sobre un soporte y la reacción de síntesis química deseada se lleva cabo sobre la porción no enmascarada del soporte. Ejemplos de este método se describen en Fodor et al., "Light-Directed, Spatially Adderssable Parallel Chemical Síntesis", Science (1991) 251:767-777; Patente de los Estados Unidos 5,436,327; y Southern, E.M. et al., "Analysing and Comparing Nucleic Acid Sequences by Hybridization to Arrays of Oligonucleotides"; Evaluation using Experimental Models. Genomics (1992) 13:1008-1017, incorporada aquí como referencia en su totalidad.
Ambos métodos para construir agrupamientos de alta densidad están asociados con diversas desventajas. Primero, los métodos sólo pueden producir un número relativamente limitado de agrupamientos idénticos a la vez. En segundo lugar, es difícil revisar los agrupamientos que están siendo producidos por estos métodos durante la producción para determinar la integridad de las etapas de producción. Tercero, muchas sustancias objetivo potenciales no puede ser aplicadas a soportes y no pueden ser sintetizadas in situ sobre soportes por métodos utilizados actualmente. Además, los agrupamientos compuestos de sustancias de prueba de más de una categoría química, tales como agrupamientos de péptidos y ácidos nucleicos como sustancias de prueba, no son descritos. También, los métodos son solamente capaces de producir agrupamientos de sustancias objetivo en una capa que tiene espesor relativamente limitado. Adicionalmente, cada método puede producir agrupamientos de dimensiones de zona de sustancia objetivo que tienen solamente tamaños limitados relativamente.
Por lo tanto, hay necesidad de un método alternativo para producir agrupamientos de alta densidad que no tengan las desventajas inherentes en los métodos conocidos de producción de agrupamientos de alta densidad. Por ejemplo, el método tendría que ser preferiblemente capaz de producir grandes números de agrupamientos idénticos simultáneamente, rápidamente, y con efectividad en costes. El método debería ser capaz de utilizar una amplia variedad de sustancias y soportes objetivo, incluyendo sustancias de prueba y soportes que no pueden ser incorporados en los agrupamientos por los métodos utilizados en el presente. El método debería ser capaz de producir agrupamientos en más de dos dimensiones, en espesores y tamaños variables, y en configuraciones diferentes a la configuración plana. Adicionalmente, el método debería ser capaz de producir agrupamientos que tengan una variedad de dimensiones de zona de sustancia objetivo, incluyendo zonas de tamaños disímiles para diferentes sustancias objetivo en un agrupamiento. También, el método debería ser capaz de producir agrupamientos de alta densidad de sustancias de prueba a partir de diferentes categorías o clases químicas, tales como agrupamientos de sustancias de péptidos y ácidos nucleicos. Además, el método debería ser capaz de utilizar sustancias objeto preformadas o de usar sustancias objeto que son sintetizadas in situ, según sea necesario, para incorporar las ventajas de éstos métodos.
Resumen
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se provee un método para producir agrupamientos de alta densidad de sustancias objetivo según se define en la reivindicación 1. El método también comprende una etapa de estabilización del haz incorporando un material adicional en el haz o la interrogación del agrupamiento de alta densidad.
También, se provee un agrupamiento de alta densidad como se define en la reivindicación 16. Los agrupamientos de alta densidad pueden tener sustancias objeto presentes en tres ejes cartesianos.
También, se provee un método para establecer secuencias genéticas, detectar la presencia de mutaciones genéticas, detectar la expresión diferencial cualitativa o cuantitativa de productos genéticos, mapear secuencias tópicas que elicitan respuestas inmunes, o identificar compuestos para el desarrollo de agentes farmacéuticos, usando los agrupamientos de alta densidad producidos de acuerdo con la presente invención.
Figuras
Las características, aspectos y ventajas de la presente invención serán mejor entendidas con relación a la siguiente descripción, reivindicaciones anexas y Figuras acompañantes en las cuales:
las Figuras 1 a 3 representan la producción de agrupamientos de alta densidad utilizando un haz de fibras que comprende sustancias objetivo de acuerdo con la presente invención;
las Figuras 4 a 5 representan la producción de agrupamientos de alta densidad utilizando un haz que comprende una membrana que tiene líneas de sustancias objeto aplicadas sobre la membrana de acuerdo con la presente invención;
las Figuras 6 a 8 representan la producción de agrupamientos de alta densidad utilizando un haz que comprende una pluralidad de membranas que tienen líneas de sustancias objetivo conocidas aplicadas sobre la membrana de acuerdo con la presente invención;
las Figuras 9 a 11 representan la producción de agrupamientos de alta densidad utilizando un haz que comprende una membrana arrollada que tiene líneas de sustancias objeto conocidas aplicadas sobre la membrana de acuerdo con la presente invención;
las Figuras 2 a 14 representa la producción de agrupamientos de alta densidad usando un haz que comprende tubos llenos con sustancias objeto de acuerdo con la presente invención;
la Figura 15 es una fotografía de una autorradiografía que muestra el resultado de un estudio de hibridización llevado a cabo sobre un agrupamiento producido de acuerdo con la presente invención; y
la Figura 16 es una fotografía de una autorradiografía que muestra el resultado de un estudio de hibridización llevado a cabo sobre otro agrupamiento producido de acuerdo con la presente invención.
Descripción
De acuerdo con una modalidad de la presente invención, se provee un método para hacer un agrupamiento de alta densidad sustancias objeto para determinar la identidad o propiedades de los analitos para determinar la identidad o propiedades de las sustancias objeto. De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, se provee un agrupamiento de alta densidad de las tasas objeto para determinar la identidad o propiedades de analitos o para determinar la identidad o propiedades de sustancias objeto
Según se usa aquí, el término "sustancia objeto" se refiere al componente del agrupamiento de alta densidad que potencialmente interactúa con uno o más analitos de interés. Las sustancias objeto pueden ser átomos, moléculas, sustancias químicas complejas, organelos, virus, células o materiales, o pueden ser combinaciones de estas entidades, o pueden ser otras entidades como será entendido por los expertos en la técnica con respecto a esta divulgación. Por ejemplo, la sustancias objeto de un agrupamiento de alta densidad de acuerdo con la presente invención puede ser seleccionada de uno o más del grupo de átomos tales como zinc, azufre, y oro; biomoléculas tales como polinucleótidos, ADN, ARN, péptidos, proteínas, glicoproteínas, lipoproteínas, carbohidratos, lípidos, inmunoglobulinas, y sus análogos y variantes sintéticas, virus; componentes sub-celulares tales como cromosomas micro diseccionados y mitocondriales, células que incluyen células procarióticas, arcabacterias, y células eucarióticas, y materiales tales como aleaciones metálicas, cerámicas, vidrios, semiconductores, superconductores, plásticos, materiales poliméricos, madera, textiles y concreto.
Según se usa aquí, el término "analito" se refiere a una entidad cuya identidad o propiedades pueden ser determinadas por la interacción con sustancias objeto sobre un agrupamiento de alta densidad de acuerdo con la presente invención. Alternativamente o simultáneamente, el analito puede ser usado para determinar la identidad o propiedades de la sustancias objeto por interacción con la sustancias objeto sobre un agrupamiento de alta densidad de acuerdo con la presente invención. Los analitos pueden ser seleccionados del mismo grupo que la sustancias objeto, tales como proteínas o ácidos nucleicos, o pueden ser una condición física o ambiental tal como una o más condiciones seleccionadas del grupo de temperatura, pH, o concentración de sales.
Según se usa aquí, el término "hebra objeto" se refiere a una banda de sustancia. Estas bandas pueden consistir completamente de una o más sustancias objeto, o puede comprender una o más sustancias objeto con un soporte un contenedor. La sustancias objeto pueden estar absorbidas en, adsorbidas a, enlazadas a, embebidas en, recubiertas sobre el soporte, o pueden estar contenidas dentro del contenedor. Por ejemplo, las hebras objeto pueden incluir barras fundidas de sustancias objeto tales como aleaciones metálicas, concreto o plástico o pueden incluir sustancias objeto adsorbidas sobre fibras de vidrio, hebras de seda, enlazadas a fibras de polímeros, embebidas en una barra porosa, recubiertas sobre un alambre metálico, o contenidas dentro de una matriz de gelatina. Además, las hebras objeto pueden incluir líneas de sustancias objeto que están escritas, dibujadas, impresas, hongos fijadas sobre una lámina de vidrio o sobre una membrana tal como una lámina plana delgada de una sustancia polimérica, o sobre un soporte equivalente. Adicionalmente, las hebras objeto pueden incluir sustancias objeto enlazadas en el interior de tubos.
Según se usa aquí, el término matriz se refiere al material en el que las sustancias objeto pueden estar embebidas o al cual las sustancias objeto pueda ser enlazadas para suministrar un soporte estructural adicional, para servir como separador, para desplegar la sustancia objeto hacia el analito, o para influir en la interacción entre los soportes objeto y el analito tal como por ejemplo sustancias objeto para aislamiento eléctrico una entre una y otra. Las matrices pueden ser materiales poliméricos tales como una o más sustancias seleccionadas del grupo consistente de aerogel, agarosa, albúmina, gelatina, hidrogel y poliacrilamida.
Según se usa aquí, el término "haz" se refiere a una disposición ordenada o agrupamiento de hebras objeto. Por ejemplo, un haz puede incluir un manojo de hebras objeto donde cada hebra objeto comprende un tubo lleno con una sustancia objeto, o donde cada hebra objeto comprende líneas de sustancias objetivo dibujadas sobre una membrana, o donde cada hebra objeto comprende un alambre de una sustancia.
Método para producir agrupamientos de alta densidad
El método para producir agrupamientos de alta densidad de acuerdo con la presente invención comprende las etapas de (a) ensamblar un haz de hebras objeto, y (de) seccionar el haz para producir un agrupamiento. Adicionalmente, el método puede incluir una etapa de estabilizar las hebras objeto o los haces. Además, el método puede incluir una etapa de incorporar uno o más materiales adicionales dentro de los agrupamientos de alta densidad. También, el método puede incluir una etapa de interrogación del agrupamiento de alta densidad.
Ensamblaje de un haz de hebras objeto
Agrupamiento de haces de hebras objeto puede ser producidos por un cierto número de metros. Por ejemplo, un haz de hebras objeto puede ser producido llenando primero tubos con sustancias objeto o con sustancias objeto en combinación con una matriz. Las sustancias objeto pueden estar incluidas dentro de la matriz sin estar químicamente enlazada a la matriz o puede estar enlazada a la matriz por fuerzas covalentes, por fuerzas iónicas, por puentes de hidrógeno o por otras formas de enlace. Los tubos son luego dispuestos y asegurados sustancialmente paralelos a sus ejes longitudinales para producir el haz de hebras objeto.
Un haz de hebras objeto también puede ser producido recubriendo inicialmente o impregnando un soporte, tal como una membrana, fibra, tubo o barra, con una sustancia objeto, o aplicando soluciones de sustancia objeto sobre un soporte con una plumafuente tal como una pluma de cuervo de pintor o un cepillo de aire, o una impresora de chorro, o fijando o transfiriendo térmicamente soluciones de sustancias objeto sobre un soporte. A continuación, estos soportes son apilados, enrollados o doblados para producir el haz hebras objeto el haz resultante contiene barras de sustancias objeto que están alineadas relativamente paralelas al eje longitudinal de la aplicación de la sustancia objeto.
Seccionamiento de los haces para producir los agrupamientos
Después de ensamblar, los haces son seccionados para producir los agrupamientos. Los haces puede ser seccionados con un micrótomo, láser, sierra, alambre caliente u otro dispositivo de un método de corte según será entendido por los expertos en la técnica con referencia a esta presente divulgación el seccionamiento puede resultar en un dispositivo de alta densidad con sustancias objeto y tienen cualquiera de una amplia variedad de espesores. Por ejemplo, el agrupamiento puede tener sustancias objeto con espesor de entre aproximadamente cero. Un micrones hasta aproximadamente 1 mm o más gruesos. Adicionalmente, métodos conocidos anteriores poco probables para producir agrupamientos, el método descrito aquí puede producir fácilmente agrupamientos que tienen sustancias con espesor de más de 50 micrones. Esto es ventajoso puesto que puede incrementar la señal generada por las sustancias objeto en comparación con las señales generadas por sustancias objeto sobre agrupamientos más delgados.
En una modalidad preferida, el haz ensamblado tiene hebras objeto que tienen ejes largos sustancialmente paralelos entre sí y el haz diseccionado sustancialmente de forma perpendicular a los ejes longitudinales de las hebras objeto para producir los agrupamientos de alta densidad. El seccionamiento también puede llevarse a cabo en un ángulo diferente al sustancialmente perpendicular a los ejes longitudinales de las hebras objeto, de tal manera que se produzcan agrupamientos ovales a partir de un haz cilíndrico.
Dependiendo de la forma del haz y de la dirección del seccionamiento, la etapa de seccionamiento puede producir agrupamientos de alta densidad con uno, dos o tres ejes analíticos, esto es, agrupamientos de alta densidad que tienen sustancias objeto en uno, dos o tres ejes cartesianos. Por ejemplo, los agrupamientos con un eje analítico pueden resultar del seccionamiento transversal de un haz que tiene sustancias objeto depositadas sobre un plano sencillo. Los agrupamientos con dos ejes analíticos pueden resultar del seccionamiento transversal de un haz que tiene sustancias objeto depositadas sobre una pluralidad de planos. Los agrupamientos con dos ejes analíticos también pueden ser producidos combinando múltiples agrupamientos de eje analítico sencillo. Los dispositivos con tres ejes analíticos pueden ser producidos combinando agrupamientos de ejes analíticos sencillos y múltiples, combinando un agrupamiento de eje analítico sencillo con un agrupamiento con dos ejes analíticos, o combinando una pluralidad de agrupamientos con dos ejes analíticos.
Por ejemplo, un agrupamiento de alta densidad con un analito puede ser producido seccionando un haz formado a partir de hebras objeto hechas por la deposición de sustancias objeto sobre líneas paralelas sobre una membrana plana donde el seccionamiento es llevado a cabo en un plano perpendicular al plano formado por las líneas. De la misma forma, un agrupamiento de alta densidad con dos ejes analíticos puede ser producido seccionando un haz formado a partir de hebras objeto que comprende en un apilamiento de membranas, donde cada membrana tienen sustancias objeto depositadas en líneas paralelas, y donde el seccionamiento es ejecutado en un plano perpendicular al eje longitudinal de las líneas de sustancia objeto. Además, un agrupamiento de alta densidad con tres ejes analíticos puede ser producido apilando una pluralidad de agrupamientos de alta densidad con dos ejes analíticos producidos por ese seccionamiento.
Estabilización del haz de hebras objeto
El método de producir agrupamientos de alta densidad de acuerdo con la presente invención también puede incluir la etapa de estabilizar el haz de hebras objeto. La estabilización puede mejorar la forma o la función del haz o agrupamiento, tal como hacer que el haz sea más fácil de seccionar las sustancias objeto una de otra en el agrupamiento. La etapa de estabilización puede ser una etapa llevada a cabo cualquier momento durante o después del ensamblaje del haz de hebras objeto, según sea apropiado para este tipo de estabilización. Por ejemplo, la estabilización puede ser llevada a cabo embebiendo el haz de hebras objeto en una matriz, tal como un epoxi, un polipropileno, o poliestireno.
Incorporación de materiales adicionales en los agrupamientos de alta densidad
El método para producir agrupamientos de alta densidad de acuerdo con la presente invención también puede incluir una etapa de incorporar uno o más materiales adicionales en agrupamientos de alta densidad durante o después del ensamblaje del haz de hebras objeto, incluyendo después la etapa del seccionamiento. Estos materiales pueden mejorar la forma con la función del agrupamiento de alta densidad. Por ejemplo, la etapa de incorporación puede incluir la adición de antioxidantes o de inhibidores microbianos o de otras sustancias para mantener la integridad del agrupamiento de alta densidad con el tiempo. Además, la etapa de incorporación puede incluir la adición de sustancias a la matriz que reducen el ruido de fondo, tal como un contracolorante no fluorescente, o que incrementan la señal de detección. De la misma forma, la etapa de incorporación puede incluir la adición de un escintilador a la matriz para facilitar la detección de los analitos radiactivos. También, la etapa de incorporación puede incluir la adición de cofactores necesarios para ciertos modos de detección de la matriz tales como enzimas secundarias y son necesarias para el desarrollo del color enzimático, un colorante de transferencia de energía y puede mejorar la detección de un marcador fluorescente. Adicionalmente, una superficie de un agrupamiento de alta densidad producida por el método descrito puede ser recubierta con plata u otro material reflectivo para mejorar la cantidad de luz disponible para la detección.
Interrogación de los agrupamientos de alta densidad
El método para producir agrupamientos de alta densidad de acuerdo con la presente invención también puede incluir una etapa para interrogación de los agrupamientos de alta densidad. En una modalidad preferida, la etapa de interrogación es seleccionada del grupo de inspección visual con o sin magnificación, deposición química, sondeo eléctrico, sensibilización mecánica y sensibilización magnética. En otra modalidad, la etapa de interrogación comprende colocar el agrupamiento en cercana proximidad a una colección de electrodos interdigitados y medir los cambios de capacitancia de las interacciones entre la sustancias objeto sobre el agrupamiento de alta densidad y los electrodos interdigitados.
Producción de agrupamientos de alta densidad a partir de haces que comprenden fibras
En una modalidad, son producidos agrupamientos de alta densidad a partir de haces de hebras objeto que comprenden fibras o hebras. Las fibras o hebras pueden comprender materiales naturales o sintéticos seleccionados del grupo consistente de algodón, seda, nailon y poliéster, o pueden ser otros materiales como será fácilmente entendido por los expertos en la técnica con referencia a la presente divulgación.
En una modalidad preferida, los haces de hebras objeto son producidos impregnando directamente fibras con una solución acuosa de la sustancia objeto. Una serie tales fibras es impregnada con diferentes sustancias objeto y la identidad de cada una de las sustancias objeto que cada fibra contiene el registrado en una base de datos. Las fibras son lavadas para eluir sustancias objeto no enlazadas y son tratadas con una sustancia no interferente para bloquear sitios de enlace no especificos sobre las fibras y la sustancias objeto inmovilizadas. Las fibras son secadas entonces para fijar el agente de bloqueo a la fibra y a las sustancias objeto inmovilizadas.
Las fibras son entonces ensambladas en haces con la localización de cada fibra y su sustancia objeto asociada inmovilizada es anotada en la base de datos. El haz de fibras es preferiblemente estabilizado embebiéndolo o de otra manera impregnando el haz en una matriz para proveer soporte estructural al haz.
El haz es entonces seccionado sustancialmente de forma perpendicular al eje longitudinal de las fibras utilizando instrumentación adecuada para proveer una pluralidad de agrupamientos de alta densidad. Preferiblemente, el seccionamiento resulta en una pluralidad de agrupamientos de alta densidad idénticos. La identidad y localización de las sustancias objetos sobre cada agrupamiento son seguidas a través de la información en la base de datos. Estos agrupamientos pueden ser utilizados para examinar simultáneamente analitos en cuanto a la presencia de propiedades específicas, o pueden ser utilizados para otros propósitos como será entendido por los expertos en la técnica con referencia a la presente divulgación.
Con referencia ahora a las Figuras 1 a 3, se muestran respectivamente, hebras estándar 10 que comprenden una serie de fibras recubiertas 2 impregnadas con sustancias objeto conocidas; las hebras objeto 10 embebidas en una matriz 14 y ensambladas en un haz 16; y el hazs 16 seccionado para producir una pluralidad de agrupamientos de alta densidad idénticos 18, donde cada agrupamiento tiene sustancias objeto en dos ejes.
Producción de agrupamientos de alta densidad a partir de haces que comprenden membranas
En una modalidad, los agrupamientos de alta densidad son producidos a partir de haces que comprenden membranas las membranas pueden comprender láminas planas delgadas de una sustancia polimérica o puede comprender otros materiales serán entendidos por los expertos en la técnica con referencia a la presente divulgación
En una modalidad preferida, los haces son producidos aplicando líneas de una composición que contienen las sustancias objeto sobre las membranas mediante escritura, dibujo, impresión o un bosquejo. La identidad y localización de cada una de las sustancias objeto es registrada en una base de datos. Las membranas son entonces tratadas, si es necesario, para fijar las sustancias objeto a la membrana.
Una membrana producida de esta manera puede ser seleccionada para producir una pluralidad de agrupamientos de alta densidad, teniendo cada agrupamiento sustancias objetivo dispuestas en un eje analítico. Con referencia ahora a las Figuras 4 y 5, se muestran respectivamente, haces 20 que comprenden una membrana 22 que tiene líneas de sustancias objeto conocidas 24 aplicadas sobre la membrana 22 y el haz 20 seccionado para producir una pluralidad de agrupamientos de alta densidad 26, donde cada agrupamiento tiene sustancias objeto dispuestas en un ejemplo en.
Alternativamente, una pluralidad de membranas producidas de esta manera pueden ensamblarse en haces con la identidad y localización de cada sustancia objeto inmovilizada anotados en la base de datos. El ensamblaje puede comprender el enrollamiento o doblado de la membrana, o puede comprender el apilamiento de una pluralidad de membranas impregnadas con la sustancia objeto si es necesario, el haz se estabiliza como tal embebiendo o de otra manera impregnando el haz en una matriz para proveer soporte estructural al haz.
El haz es entonces seccionado sustancialmente perpendicular al eje longitudinal de las líneas de sustancia objeto sobre las membranas utilizando instrumentación adecuada para proveer una pluralidad de agrupamientos de alta densidad, donde cada agrupamiento tienen sustancias objeto dispuestas en dos ejes analíticos. Preferiblemente, el seccionamiento resulta en una pluralidad de agrupamientos de alta densidad idénticos la localización de identidad de la sustancias objeto seguidas a través de la información en la base de datos. Estos agrupamientos pueden ser utilizados para examinar analitos en cuanto a la presencia de propiedades específicas, o pueden ser utilizados para otros propósitos que serán entendidos por los expertos en la técnica con referencia a la presente divulgación.
Con referencia ahora a las Figuras 6 a 8, se muestran respectivamente, una pluralidad de membranas 28 que tienen líneas de sustancias objeto 30 aplicadas sobre cada membrana 28; las membranas 28 apiladas y estabilizadas para formar el haz 32; y el haz 32 seccionado para producir una pluralidad de agrupamientos de alta densidad 34, donde cada agrupamiento tiene sustancias objeto 28 dispuestas en dos ejes analíticos.
Con respecto a obra a las Figuras 9 a 11, se muestran respectivamente,1 membrana 36 que tiene líneas de sustancias objeto conocidas 38 aplicadas sobre la membrana 36; la membrana 36 es enrollado y estabilizada para formar un haz 40; y en las 40 es seccionado para producir naturalidad de agrupamientos de alta densidad 42, donde cada agrupamiento tienen sustancias objeto 38 dispuestas en dos ejes analíticos.
Producción de agrupamientos de alta densidad a partir de haces que comprenden tubos
En una modalidad, se producen agrupamientos de alta densidad a partir de hebras objeto que comprenden tubos. Los tubos pueden comprender poliimida, nailon, polipropileno, poliuretano, silicona, y etil vinil acetato, acero inoxidable, cobre, vidrio o sílica fundida o pueden ser otros materiales como lo podrán entender los expertos en la técnica con referencia a la presente divulgación.
En una modalidad preferida, las hebras objeto son producidas por recubrimiento del interior de los tubos, con solución acuosa de la sustancia objeto de tal forma que la sustancia objeto sea absorbida, adsorbida o enlazada covalentemente a la superficie interior de los tubos. Alternativamente, los tubos pueden ser rellenos con la sustancias objeto con o sin embeber las sustancias objeto en una matriz. Una serie de tales tubos se producen recubriendo o llenando los tubos con diferentes sustancias objeto y la identidad de cada hebra objeto y la sustancia objeto que contiene es registrada en una base de datos.
Los tubos son entonces ensamblados en haces con la localización de cada tubo de sustancia objeto asociada anotada en las bases de datos. El haz de tubos es estabilizado preferiblemente embebiendo el haz en una matriz para proveer soporte estructural al haz.
El haz es entonces seccionado sustancialmente de forma perpendicular al eje longitudinal de los tubos utilizando instrumentación adecuada para proveer una pluralidad de agrupamientos de alta densidad. Preferiblemente, el seccionamiento resulta en una pluralidad de agrupamientos idénticos de alta densidad. La identidad y localización de las sustancias objeto es seguida través de la información en la base de datos. Estos agrupamientos pueden ser utilizados para examinar simultáneamente analitos en cuanto a la presencia de propiedades específicas, o pueden ser utilizados para otros propósitos como será entendido por los expertos en la técnica con referencia a la presente divulgación.
Con referencia ahora a las Figuras 2 a 14, se muestran respectivamente, hebras objeto 44 que comprende una serie de tubos 46 llenos con sustancias objeto conocidas 40 y; en las hebras objeto 44 embebidas en una matriz 50 y ensambladas en un haz 42; y el haz 52 ciento seccionado para producir agrupamientos de alta densidad 54, donde cada agrupamiento tiene sustancias objeto 48 dispuestas en dos ejes analíticos.
Ejemplo I Producción y uso de agrupamientos de alta densidad que comprenden hebras recubiertas de ADN
El método de producir agrupamientos de alta densidad a partir de un haz que comprende fibras o hebras de acuerdo con la presente invención, se utiliza para producir agrupamientos de alta densidad de sustancias objeto de ADN como sigue. Una hebra de algodón es evaluada en cuanto a su humectabilidad por una solución acuosa sumergiendo la hebra en agua. El agua que se deposita en glóbulos sobre la superficie de la hebra indica que la hebra podría tener enlazantes, aceites u otros materiales sobre su superficie que puedan afectar negativamente la humectabilidad de la hebra para producir hebras objetivo. Si la formación de glóbulos ocurre durante la prueba de humectabilidad, las hebras deben ser lavadas en metanol, etanol u otro solvente adecuado inmiscible con agua para remover los materiales indeseados. Las hebras son colocadas luego en agua y el agua es intercambiará varias veces hasta que cada hebra es humedecida completamente.
A continuación, las hebras son transferidas a una solución acuosa de una sustancia catiónica polimérica tal poli L-lisina y se deja equilibrar con la solución de poli L-lisina durante unas pocas horas. Las hebras son removidas de la solución de poli L-lisina y secadas para fijar la poli L-lisina a la superficie de las hebras. Después de la aplicación, las hebras son lavadas en solución regulada y el regulador es intercambiado varias veces. Las hebras son removidas del regulador y se dejan secar.
Las hebras son luego cortadas en longitudes que varían desde 1 cm hasta unos pocos metros, según será apropiado para las dimensiones del haz que está siendo construido. Cada hebra destinada para un haz es preferiblemente cortada a la misma longitud.
A continuación, cada hebra cortada es colocada en contacto con una solución de ADN que tiene una secuencia conocida específica y que va a ser la sustancia objeto inmovilizada. La secuencia de ADN es preferiblemente diferente para cada hebra. El ADN usado preferiblemente debería ser de hebra sencilla si va a ser utilizado para estudios de hibridización de ácidos nucleicos, pero de otra forma puede dejarse en forma de doble hebra. El ADN puede ser de fuentes naturales tales como preparaciones de plásmidos, cromosomas artificiales de levadura, bibliotecas BAC, bibliotecas YAC u otras bibliotecas de ADN tales como marcadores de secuencia expresados, o pueden ser sintéticamente producidos por la reacción en hebra de la polimerasa u otros procesos sintéticos. La hebra y la solución de ADN son incubadas durante un período que varía desde unos pocos minutos hasta unas pocas horas, según sea necesario para saturar por completo los sitios de enlace disponibles sobre la hebra con ADN.
Las hebras recubiertas con ADN son secadas luego en un horno a aproximadamente 60ºC durante un período suficiente para fijar el ADN a las hebras. Alternativamente, el ADN puede ser fijado a las hebras humectando las hebras recubiertas con ADN con etanol o metanol al 100% durante unos pocos minutos y dejando que las hebras se sequen. La identidad de cada hebra y su secuencia y sustancia de ADN objeto inmovilizada es registrada en una base de datos. A continuación, las hebras son lavadas individualmente en un regulador tal como 1xTE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.6) para remover el ADN no enlazado de la hebra. Las hebras recubiertas con ADN son secadas de nuevo.
Un haz de hebras recubiertas con ADN es ensamblado entonces colocando las hebras paralelas y adyacentes unas a otras localizando cada hebra en el haz y su ADN asociado registrado en la base de datos. El haz de hebras es estabilizado embebiéndolo en una matriz tal como polimetacrilato, epoxirresinas, polietilenglicoln, ceras de parafina, gomas, poliacrilamida y otros materiales similares que puedan, preferiblemente, ser manejados en forma líquida a temperatura elevada o en forma no polimerizada adecuada para embeber las hebras. Las hebras embebidas se dejan secar o entrecruzar para impartir una estructura rígida al haz.
En una modalidad preferida, se previene que las hebras se impregnen completamente con la matriz de embebimiento y que secuestre el ADN inmovilizado recubriendo las hebras con una sustancia tal como gelatina, sacarosa o alcohol polivinílico, al cual la matriz es impermeable. Esto se logra humedeciendo las hebras que soportan el ADN fijo inmovilizado en una solución de aproximadamente 0. 01% hasta aproximadamente 10% en peso de la sustancia y dejando que las hebras se sequen antes de ser embebidas en la matriz.
El haz estabilizado es seccionado entonces perpendicularmente al eje longitudinal de las hebras utilizando un micrótomo o un dispositivo similar para crear un pluralidad de agrupamientos de alta densidad que tienen preferiblemente un espesor de entre aproximadamente 0. 1 y 100 micrones. Cada agrupamiento de alta densidad resultante tiene el mismo patrón de secuencias de ADN en regiones o zonas espaciales específicas del agrupamiento con la sustancias objeto dispuestas en dos ejes analíticos.
Un uso de estos agrupamientos de ADN es detectar secuencias de ADN marcadas en una muestra que es complementaria a sustancias objeto de ADN de hebra sencilla en el agrupamiento incubando la muestra y el agrupamiento bajo condiciones de hibridización durante un período de tiempo suficiente para que ocurra la hibridización. El ADN no hibridizado es removido por lavado. Las marcas son detectadas entonces y se determinan las zonas que proveen la señal. Estas zonas son comparadas con las bases de datos que contienen la identidad de la sustancias objeto de ADN sobre el agrupamiento para establecer la identidad del ADN marcado en la muestra.
Ejemplo II Producción y uso de agrupamientos de alta densidad que comprenden hebras recubiertas con péptidos
El método para producir agrupamientos de alta densidad a partir de un haz que comprende fibras o hebras de acuerdo con la presente invención se utiliza para producir agrupamientos de alta densidad de sustancias objeto peptídicas como sigue. Se evalúa una hebra de algodón en cuanto a humectabilidad mediante una solución acuosa sumergiendo la hebra en agua. La formación de glóbulos de agua sobre la superficie de la hebra indica que la hebra podría tener enlazantes, aceites u otros materiales sobre su superficie que pueden afectar negativamente la estabilidad de la hebra para producir una hebra sujeto. Si ocurre la formación de glóbulos durante la la prueba de inestabilidad, las hebras deberían ser lavadas en metanol, etanol u otro solvente adecuado miscible con agua para remover los materiales indeseables. Las hebra se colocan entonces en agua y el agua se intercambia varias veces hasta que cada hebra es humedecida completamente.
A continuación, las hebras son transferidas hacia una solución acuosa de una sustancia catiónica polimérica tal como poli L-lisina y se deja en equilibrio con la solución de poli L-lisina durante unas pocas horas. Las hebras son removidas de la solución de poli L-lisina y se secan para fijar la poli L-lisina a la superficie de las hebras. Después de la fijación, las hebras son lavadas en solución regulada y el regulador es intercambiado varias veces. Las hebras son removidas entonces del regulador y se dejan secar.
Las hebras son entonces cortadas en longitudes que varían desde 1 cm hasta unos pocos metros, según sea apropiado para las dimensiones del haz que está siendo construido. Cada hebra destinada para el haz cortada preferiblemente de la misma longitud. La hebra de algodón es evaluada en cuanto a su humectabilidad por una solución acuosa, transferida a una solución acuosa de una sustancia catiónica polimérica tal como poli L-lisina, y se deja en equilibrio con la solución de poli L-lisina durante unas pocas horas. Las hebras son removidas de la solución de poli L-lisina y se dejan secar para fijar la poli L-lisina a la superficie de las hebras. Después de la fijación, las hebras son lavadas en solución regulada y el regulador es intercambiado varias veces. Las hebras son removidas del regulador y se dejan secar.
A continuación, cada corte de hebra es colocado en contacto con una solución de dimetilsulfóxido (DMSO) del péptido que tiene una secuencia conocida específica que va a ser la sustancia objeto inmovilizada. La secuencia de péptidos es preferiblemente diferente para cada hebra. Péptidos individuales para su uso como sustancias objeto se obtienen comercialmente o se hacen por la síntesis de Marifield, (tal como se discute en Bodansky, M. y Troust, B. Eds. Principles of Peptide Síntesis, 2nd ed., Springer-Verlag, New Cork, 1993, incorporada aquí como referencia en su totalidad), como podrá ser entendido por los expertos en la técnica con referencia a la presente divulgación. Cada hebra y solución de péptidos son incubadas durante un período que varía desde unos pocos minutos hasta unas pocas horas, según sea necesario para saturar completamente los sitios de enlace disponibles sobre la hebra completa.
Las hebras recubiertas con péptido son mapeadas libres de la solución de DMSO en exceso y luego se incuban con pentanos mixtos o con una sustancia equivalente para precipitar los péptidos sobre la superficie de las hebras. Las hebras recubiertas de péptidos son secadas a temperatura ambiente o entre aproximadamente 60ºC y 70ºC, con o sin vacío. La identidad de cada hebra y su secuencia de sustancia objeto de péptido inmovilizado es registrada en una base de datos. Las hebras recubiertas con péptidos son lavadas entonces en un regulador acuoso tal como Tris 0. 01 a 1.0 M, pH 7.0 o solución salina regulada de fosfatos pH 7.0, tal como cloruro de sodio 120 mM, cloruro de potasio 2.7 mM y fosfato 10 mM (disponible en Sigma Chemical, Co, St. Louis, MO, EEUU) para remover los péptidos no enlazados a las hebras y son secadas de nuevo a temperatura ambiente o entre aproximadamente 60ºC y 70ºC, con o sin vacío.
Un haz de hebras recubiertas de péptidos es ensamblado entonces colocando las hebras paralelas y adyacentes una a otra con la localización de cada hebra en el péptido asociado registrado en la base de datos. El haz de haces es estabilizado embebiéndolo en una matriz tal como poli-metacrilato, resinas epóxicas, polietilenglicol, ceras de parafina, gomas, poliacrilamida y otros materiales similares que pueden, preferiblemente ser manejados en forma líquida a temperatura elevada o en formas no pulverizadas adecuadas para embeber las hebras. Las hebras embebidas se dejan endurecer o entrecruzar para impartir una estructura rígida al haz.
En una modalidad preferida, se previene que las hebras se impregnen completamente con la matrix de embebimiento y secuestro del péptido inmovilizado recurriendo las hebras con una sustancia tal como gelatina, sacarosa o alcohol policlínico, al cual la matriz sea impermeable. Esto se logra humedeciendo las hebras y portan en adén de inmovilizado fijo en una solución que contiene desde aproximadamente cero. 01 hasta aproximadamente 10% en peso de la sustancia y se permite que las hebra se sequen antes de ser embebidas en la matriz.
El haz estabilizado es seccionado entonces perpendicular al eje lo penal de las hebras utilizando un micrótomo un dispositivo similar para crear una pluralidad de agrupamientos de alta densidad que tiene preferiblemente un espesor de entre aproximadamente 0.1 y 100 micrones. Cada agrupamiento de alta densidad resultante tiene mismo patrón de secuencias de péptidos en regiones o zonas espaciales específicas del agrupamiento.
Un uso para esos agrupamientos de péptidos es detectar la presencia de un analítico anticuerpo en una muestra, donde el anticuerpo es capaz de enlazarse al menos una sustancia objeto péptido sobre el agrupamiento. La presencia de los analitos de anticuerpo es determinada incubando la muestra y el agrupamiento bajo condiciones adecuadas durante un período de tiempo suficiente para que ocurra el enlace entre el analítico anticuerpo. La muestra no enlazada es removida por lavado. El anticuerpo enlazado es detectado entonces utilizando detección por anticuerpos secundarios bioestannilados y estreptavidina marcada tal como fosfatasa alcalina, fluoresceína o estreptavicina marcada con oro, de acuerdo con las técnicas conocidas por los expertos en la técnica, y la identidad de las sustancias objeto de péptidos sobre las zonas que despliegan enlaces son establecidas con referencia a las bases de datos. El enlanzamiento indica la presencia de un anticuerpo que tiene un dominio epitópico para el péptido en la zona. Este lanzamiento puede ser evidencia de exposición o infección por parte de un organismo, si la muestra ha sido derivada del suero de un paciente.
Ejemplo III Producción y uso de agrupamientos de alta densidad que comprenden ADN impregnado sobre una membrana
El método para producir agrupamientos de alta densidad de sustancias objeto de acuerdo con la presente invención fue usado para crear agrupamientos a partir de ADN impregnado sobre una membrana según se explica a continuación. La Saccharomyces Genome Database en Stamford University, Palo Alto, California, EEUU, fue usada como fuente para identificar secuencias genómicas existentes. Usando esta información, se seleccionaron al azar 16 oligo nucleótidos que tenían temperatura de fusión similares, a partir del genoma de levadura como sustancias objeto. Cada secuencia estaba entre 28 y 35 nucleótidos y fue sintetizada por química de cianoetilfosforamidita estándar de acuerdo con el método descrito en Gatith, M.J., Ed., Oligonucleotide Síntesis: A practical Approach, IRL Press, Oxford 1984. Cada sustancia objeto en secuencia tenía 100 residuos de timidina en el extremo 3' para facilitar el enlanzamiento del oligonucleótido a la membrana. Véase, por ejemplo, Erlich, Henry A. y Begawan, Teodorica L., HLA Class II Gene Polymorphism: DNA Typing, Evolution and Relationship to Disease Susceptibility in PCR Technology: Principles an Applications for DNA Amplification, Stockton Press, New Cork, pp. 193-208, 1989, incorporada aquí como referencia su totalidad. Las 16 sustancias objeto, marcadas 1 a 16, fueron disueltas individualmente en agua tratada con dietilpirocarconato hasta una concentración final de 10 \mug/\mul.
Las sustancias objeto fueron aplicadas utilizando una punta de aplicación que tenía un reservorio con una capacidad de 11 \mul conectada a la punta mediante un pequeño canal capilar. La punta fue usada para dibujar líneas de sustancias objeto aproximadamente de 1 mm a 3 mm separadas sobre membranas de 20 cm x 20 cm de membranas de nailon de Hybond^{TM}cargadas N+ (Amersham, Arlington Heights, IL, EEUU). El reservorio de la. Punta fue llenado con 10.5 \mul de una solución de la primera de las 16 sustancias objeto utilizando una pipeta Eppendorf® de 2-10 \mul.
La primera membrana, membrana 1, fue colocada sobre una superficie plana limpia con la lámina de una papel encerado más grande que la membrana usada como separador en el empaque de la manufactura colocado entre la membrana y la superficie plana. La punta fue alineada de tal forma que ambos lados del canal capilar tocaran el papel encerado aproximadamente a 1 cm del borde de la membrana y la punta fue desplazada suavemente a través del papel encerado y la membrana utilizando una regla como guía para dibujar una línea recta de sustancia objeto paralela a un borde de la membrana. La solución de sustancia objeto fue dibujada con la punta y agotada después de dibujar una línea de aproximadamente 12 a 16 cm de longitud. Este ciclo fue repetido para cada solución de sustancia objeto sobre la primera membrana hasta que la membrana 1 comprendía 16 líneas paralelas de diferentes sustancias objeto de ADN de aproximadamente 1 mm hasta 3 mm de separación entre una y otra.
Este procedimiento fue repetido para producir dos membranas adicionales, membranas 2 y 3, excepto que cada solución de sustancia objeto de ADN fue aplicada tres veces consecutivamente resultando en un total de 48 líneas paralelas de sustancias objeto sobre las membranas 2 y 3. Cada línea de sustancia objeto fue marcada para propósitos de identificación sobre todas las membranas.
Las membranas que comprendían las líneas de sustancias objeto de ADN se dejaron secar al aire por aproximadamente dos horas y luego fueron entrecruzadas mediante la aplicación de 1200 micro joules de radiación electromagnética por 35 segundos utilizando un Stratagene 2400 Stratalinker® (Stratagene, La Jolla, CA, EEUU). Comenzando con el borde la membrana que contenía el borde de guía de las líneas de sustancia objeto, se cortó una tira de aproximadamente 2 cm de ancho por 20 cm de longitud de cada una de las tres membranas de manera que las líneas de las sustancias objeto eran paralelas al corte de 2 cm de las tiras.
Se prepararon sondas de ADN marcadas radiactivamente que eran complementarias a la secuencia de las sustancias objeto 1 y 7 utilizando técnicas estándar. La hibridización se intentó entre las sondas radiactivamente marcadas y un agrupamiento producido desde la membrana 1 utilizando técnicas estándar. En resumen, los oligonucleótidos de ADN fueron marcados utilizando el kit ReadytoGoKinase^{TM} (Pharmacia, Piscataway, NJ, EEUU) usando
gamma-^{32}P-ATP (ICN Radiochemicals, Irving, CA, EEUU) de acuerdo con asistencia del fabricante y se diluyeron hasta aproximadamente 1 x 10^{6} cpm/ml.
La prehibridización y la hibridización fueron ejecutadas utilizando 10 ml del regulador HyperHyb^{TM} (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL, EEUU) de acuerdo con las instrucciones del fabricante en un horno de hibridización Mini-6^{TM} (Hybaid, Ltd., Middlesex, RU) a 42ºC durante una hora cada uno. Los lavados posthibridización fueron ejecutados utilizando tres lavados de 10 ml durante 15 minutos cada uno en dodecil sulfato de sodio (SDS) a 42ºC. Un lavado final fue llevado a cabo en 100 ml del regulador 1xSSC (0.15 M NaCl, 0.015 M citrato de sodio, pH 7.2) (Research Genetics), 0.01% de SDS (Sigma) a 42ºC durante 15 minutos. Un enjuague final se ejecutó en 10 ml de regulador 1xSSC. Las membranas fueron secadas al aire durante 1-2 horas a temperatura ambiente.
Se ejecutó una autorradiografía colocando los agrupamientos en contacto con película de rayos X. Biomax^{TM} MS o MR (Eastman Kodak, Rochester, NY, EEUU) a temperatura ambiente por aproximadamente media hora hasta cuatro horas hasta que la intensidad deseada de la imagen fue obtenida. Las sondas hibridizaron con la sustancia objeto apropiada sobre el agrupamiento demostrando que las sustancias objeto de ADN estaban enlazadas a la membrana y estaban disponibles para el sondeo, y que tales sondas dieron resultados de hibridización específicos, no ambiguos.
A continuación, la porción restante de 20 cm x 18 cm de las membranas números 1,2 y 3 fueron utilizadas para producir agrupamientos como sigue. Las membranas fueron sumergidas en gelatina de teleosteano al 3% (Sigma) en agua desionizada durante la noche a temperatura ambiente para bloquear las membranas. Las membranas fueron lavadas entonces tres veces en 600 ml de agua desionizada para remover la gelatina no enlazada. Las membranas fueron mapeadas libres del exceso de humedad entre dos láminas de papel de mapeo 903 (Schleicher and Schuell, Keene, NH, EEUU) y se dejaron secar al aire a temperatura ambiente durante la noche.
A continuación, se cortó una tira de 2 cm x 20 cm de cada una de las tres membranas 1, 2 y 3 perpendicular a las líneas de las sustancias objeto con el borde de 2 cm paralelo a las líneas de las sustancias objeto. Cada una de las bandas fue enrollada apretadamente alrededor de un eje paralelo a las líneas de las sustancias objeto para producir un cilindro con la porción de la membrana que no tenía sustancias objeto aplicada a ella, siendo la parte más interna del cilindro. Se utilizó barniz transparente de uñas para sellar el borde libre de 3 mm de las tiras para prevenir que el cilindro se desenrollara. Cada cilindro fue sumergido en un bulbo plástico de 1. 25 cm por 7. 5 cm de lado como un medio de embebimiento suave LR White^{TM} no polimerizado preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante hasta que el cilindro se impregnó completamente con el medio. Cada cilindro fue colocado entonces en la base del tubo de medio lleno, centrado y se dejó polimerizardurante la noche a 60ºC. Cada bulbo que contenía un cilindro fue removido y colocado a temperatura ambiente y se observó que la polimerización era completa.
Una pluralidad de agrupamientos de aproximadamente 10 micras de espesor fue producida entonces por seccionamiento repetido de cada cilindro embebido perpendicularmente a su eje longitudinal, que es perpendicular al eje longitudinal de cada línea de sustancia objeto. El seccionamiento fue ejecutado utilizando un micrótomo modelo DK-10 (Edmund Scientific, Barrington, NJ, EEUU).
Las sondas de ADN radiactivamente marcadas que eran complementarias a la secuencia de sustancias objeto #1 y #7 se prepararon utilizando técnicas estándar. La hibridización fue alcanzada entre las sondas radiactivamente marcadas y un agrupamiento producido a partir de la membrana #1 utilizando técnicas estándar. En resumen, los oligonucleótidos de ADN fueron marcados utilizando el kit Ready to Go Kinase^{TM} (Pharamcia, Piscataway, NJ, EEUU) usando gamma-^{32}P-ATP (ICN Radiochemiucals, Irving, CA, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las sondas marcadas fueron purificadas utilizando columnas Nick^{TM} (Pharmacia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se diluyeron hasta 1x10^{6} cpm/ml.
La polimerización y la hibridización fueron llevadas a cabo utilizando 10 m de regulador HyperHyb^{TM} (Research Genetics, Inc. Huntsville, AL, EEUU) de acuerdo con las instrucciones del fabricante en tubos de microcentrífuga de tapa rosca de 1.5 ml a 42ºC durante una hora en un horno hibridización Mini-6 (Hybaid, Ltd., Middlesex, RU) a 42ºC. Los lavados post hibridización fueron ejecutados utilizando tres lavados de 1.5 mililitros por 15 minutos cada uno en 1xSSC, 0.01% de dodecilsulfato de sodio (SDS) a 42ºC. Un lavado final se hizo en 100 ml de del regulador 1xSSC (0.15 M NaCL, 0.015 M citrato de sodio, pH 7.2) (Research Genetics), 0.01% SDS (Sigma) a 42ºC por 15 minutos, y un enjuague final fue ejecutado en 10 ml de regulador 1xSSC. Los agrupamientos fueron entonces secados al aire durante aproximadamente 15-30 minutos. La autorradiografía fue ejecutada colocando los agrupamientos en contacto con película de rayos X Biomax^{T}M MS o MR (Eastman Kodak, Rochester, NY, EEUU) a temperatura ambiente durante aproximadamente media hora hasta cuatro horas hasta que la intensidad de imagen deseada fue obtenida. Se hicieron entonces fotografías de las autorradiografías desarrolladas.
La hibridización fue iniciada entre las sondas marcadas radiactivamente y un agrupamiento producido desde la membrana #1 utilizando técnicas estándar. Todas las sondas hibridizaron con la sustancia objeto apropiada sobre el agrupamiento, demostrando que las sustancias objeto de ADN estaban unidas a la membrana y eran disponibles para el sondeo, y que tal sondeo dio resultados de hibridización específicos, no ambiguos.
Los agrupamientos fueron probados en cuanto a funcionalidad como sigue. Una sonda de ADN radiactivamente marcada complementaria a la sustancia objeto #1 fue utilizada para sondear un agrupamiento producido a partir de la membrana #2. Con referencia ahora la Figura 15, puede verse una fotografía de la autorradiografía del resultado. Como puede verse, la hibridización se presentó entre la sonda y las tres zonas sobre el agrupamiento que contenía la sustancia objeto #1, con mínima hibridización cruzada para las otras 45 zonas que representaban las 15 sustancias objeto de ADN restantes. Por lo tanto, el agrupamiento demostró tanto funcionalidad para la los estudios de hibridización como especificidad.
A continuación, un agrupamiento producido a partir de la membrana #3 fue sondeado con ADN marcado radiactivamente complementario a las sustancias objeto #1 y #7. Con referencia ahora a la Figura 16, puede verse una autorradiografía del resultado. Como puede verse, la hibridización entre las sondas y las seis zonas del agrupamiento se presentó, con mínima hibridización cruzada para las otras 42 zonas que representaban las 14 sustancias objeto de ADN restantes.
Aunque la presente invención ha sido discutida en detalle considerable con referencia a ciertas modalidades preferidas, son posibles otras modalidades. Por lo tanto, el alcance de las reivindicaciones anexas no debería ser limitado a la descripción de las modalidades preferidas contenidas aquí.

Claims (22)

1. Un método para producir agrupamientos de alta densidad de sustancias objeto que comprende un haz de hebras objeto, que comprende sustancias objeto caracterizado porque el método comprende la etapa de seccionar el haz de hebras objeto y combinar el haz seccionado con uno o más haces seccionados, donde la combinación resulta en un agrupamiento de alta densidad que tiene sustancias objeto presentes en tres ejes cartesianos.
2. Un método como el reivindicado en la reivindicación 1, que incluye adicionalmente la etapa de estabilizar el haz.
3. Un método como el reivindicado en la reivindicación 2, donde la etapa de estabilización es ejecutada embebiendo el haz en un material seleccionado del grupo consistente de epoxi, polipropileno y poliestireno.
4. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que incluye adicionalmente la etapa de incorporar un material adicional dentro del haz.
5. Un método como el reivindicado en la reivindicación 4, donde el material adicional es seleccionado del grupo consistente de un antioxidante, un inhibidor microbiano, un contracolorante no fluorescente, una enzima secundaria y una sustancia reflectante.
6. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que incluye adicionalmente la etapa de interrogar un agrupamiento de alta densidad.
7. Un método como el reivindicado la reivindicación 6, donde la etapa de interrogación comprende una actividad seleccionada del grupo consistente de inspección visual, deposición química, sondeo eléctrico, sensibilización mecánica, sensibilización magnética, y la medición de cambios de capacitancia resultantes de las interacciones entre las sustancias objeto sobre el agrupamiento de alta densidad y los electrodos interdigitados.
8. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde al menos una de las sustancias objeto en la etapa de seccionamiento es seleccionada del grupo consistente de zinc, azufre, oro, polinucleótidos, ADN, ARN, péptidos, proteínas, glicoproteínas, lipoproteínas, carbohidratos, lípidos, inmunoglobulinas, virus, cromosomas, mitocondrias, células procarióticas, arcabacterias, células eucarióticas; aleaciones metálicas, cerámicas, vidrios, semiconductores, superconductores, plásticos, materiales poliméricos, madera, textiles y concreto.
9. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el haz en la etapa de seccionamiento comprende una hebra objeto seleccionada del grupo consistente de una barra fundida de una sustancia objeto, una sustancia objeto absorbida sobre una fibra de vidrio, una sustancia objeto absorbida sobre una hebra de seda, una sustancia objeto unida a una fibra de polímero, una sustancia objeto embebida en una barra porosa, una sustancia objeto recubierta sobre un alambre metálico, una sustancia objeto contenida dentro de una matriz de gelatina, una línea de una sustancia objeto dibujada sobre una lámina de vidrio, una línea de una sustancia objeto dibujada sobre una membrana y una sustancia objeto enlazada a la parte interior de un tubo.
10. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde el seccionamiento es ejecutado con un dispositivo de corte del grupo consistente en micrótomo, láser, sierra y alambre caliente.
11. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde el seccionamiento es ejecutado de tal manera que el agrupamiento de alta densidad resultante tiene un espesor desde aproximadamente 0.1 \mum hasta aproximadamente 1.0 mm.
12. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde el seccionamiento es ejecutado de tal manera que el agrupamiento de alta densidad resultante tiene un espesor mayor de 50 \mum.
13. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 donde la etapa de combinar los haces seccionados comprende apilar una pluralidad de haces de hebras objeto seccionados.
14. Un agrupamiento de alta densidad producido de acuerdo con un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
15. Un método para establecer secuencias genéticas, detectar la presencia de mutaciones genéticas, detectar la expresión diferencial cualitativa o cuantitativa de productos genéticos, mapear las secuencias epitópicas que elicitan respuestas inmunes, o identificar compuestos para el desarrollo de agentes farmacéuticos, comprendiendo el método la etapa de proveer agrupamientos de alta densidad de acuerdo con la reivindicación 14.
16. Un agrupamiento de alta densidad de sustancias objeto presente en tres ejes cartesianos producido seccionando un haz que comprende una pluralidad de hebras objeto y combinando el haz seccionado con uno o más haces seccionados diferentes, donde la pluralidad de hebras objeto comprende sustancias objeto.
17. Un agrupamiento de alta densidad como el reivindicado en la reivindicación 16, donde al menos una de las sustancias objeto es seleccionada del grupo consistente de zinc, azufre, oro, polinucleótidos, ADN, ARN, péptidos, proteínas, glicoproteínas, lipoproteínas, carbohidratos, lípidos, inmunoglobulinas, virus, cromosomas, mitocondrias, células procarióticas, arcabacterias, células eucarióticas; aleaciones metálicas, cerámicas, vidrios, semiconductores, superconductores, plásticos, materiales poliméricos, madera, textiles y concreto.
18. Un agrupamiento de alta densidad como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 17, que comprende adicionalmente una sustancia seleccionada del grupo consistente de epoxi, polipropileno y poliestireno.
19. Un agrupamiento de alta densidad, como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, que comprende adicionalmente un material seleccionado del grupo consistente de un antioxidante, un inhibidor microbiano, un contracolorante no fluorescente, una enzima secundaria y sustancia reflectante.
20. Un agrupamiento de alta densidad como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, que tiene un espesor de desde aproximadamente 0.1 \mum hasta aproximadamente 1.0 mm.
21. Un agrupamiento de alta densidad como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, que tiene un espesor mayor de 50 \mum.
22. Un método para establecer secuencias genéticas, detectar la presencia de mutaciones genéticas, detectar la expresión diferencial cualitativa o cuantitativa de productos genéticos, mapear secuencias epitópicas que elicitan respuestas inmunes, o identificar compuestos para el desarrollo de agentes farmacéuticos, comprendiendo el método la etapa de proveer un agrupamiento de alta densidad de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21.
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