DE10034570A1 - Verfahren zur Herstellung von Mikroarray-Chips mit Nukleinsäuren, Proteinen oder anderen Testsubstanzen - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Mikroarray-Chips mit Nukleinsäuren, Proteinen oder anderen Testsubstanzen

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DE10034570A1 DE2000134570 DE10034570A DE10034570A1 DE 10034570 A1 DE10034570 A1 DE 10034570A1 DE 2000134570 DE2000134570 DE 2000134570 DE 10034570 A DE10034570 A DE 10034570A DE 10034570 A1 DE10034570 A1 DE 10034570A1
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Abstract

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Mikroarray-Chips für die Untersuchung einer großen Anzahl von Einzelwerten, insbesondere von DNS- oder Protein-Mikroarray-Chips. Bei diesem Verfahren wird das Substrat (z. B. DNS, Protein oder sonstige Testsubstanzen) in einer Trägersubstanz homogen verteilt. Die Trägersubstanz mit dem darin enthaltenden Substrat wird in Form von mikroskopisch dünnen Fasern gebracht und verschiedene Fasern werden gebündelt. Alternativ wird die Trägersubstanz mit dem Substrat in Schichten aufeinander aufgetragen, die Gesamtschicht in Streifen geschnitten und verschiedene Streifen zu einem Block vereint. Das Bündel bzw. der Block wird quer zur Längsachse in dünne Scheiben geschnitten, auf eine feste Unterlage gebracht und fixiert. Die Trägersubstanz wird entfernt und das Substrat auf der Unterlage immobilisiert. Dieses Verfahren erlaubt die Herstellung von Mikroarray-Chips mit beliebig vielen Substraten. Die herausragenden Vorteile dieser Methode sind: 1. Die einfache Herstellung von nahezu unbegrenzt vielen Chips (ein Bündel/Block von 10 cm Länge ergeben 1000 Scheiben = Chips à 100 Mikrometer Dicke), 2. die geringe Variabilität unter den Chips einer Serie (die 1000 Scheiben sind vom Substratgehalt nahezu identisch). Dadurch ist eine effiziente und ökonomische Herstellung von Mikroarray-Chips für den steigenden Bedarf in der biomedizinischen Forschung und Industrie möglich.

Description

Nicht zuletzt mit dem Humanen Genomprojekt, das kurz vor der vollständigen Entschlüsselung der menschlichen Erbinformation steht, findet zur Zeit ein drastischer Umbruch im biomedizinischen Feld statt. In diesem Zusammenhang scheint die sogenannte Mikroarray-Technik als erste technische Neuheit hervorzugehen, die ein Potenzial hat vergleichbar der PCR-Technik in den 80er Jahren (siehe "insight"-Artikel der Nature- Ausgabe vom 15 Juni 2000, Vol. 405, ab Seite 819: Functional genomics).
Gegenwärtig wird die Herstellung von sogenannten Mikroarray-Chips für die biomedizinische Forschung vor allem durch zwei Verfahren realisiert: 1. Auf einer Unterlage (Glas oder Membran) werden die Substrate (DNA oder Protein) als Punkte durch mechanisch betriebene feine Metallspitzen aufgetragen; 2. Das Auftragen der Punkte geschieht durch Düsen, die aus den Düsen von Tintenstrahldruckern adaptiert sind.
Beide Verfahren sind zwar in der Lage, Chips mit bis zu Millionen von individuellen Punkten von ca. 10-100 Mikrometer Durchmesser herzustellen, jedoch die Herstellung ist aufwendig aufgrund des Herstellungsprinzips, dass jeder Punkt auf jedem Chip einzeln aufgebracht werden muss. Dieser Nachteil nimmt proportional mit der Anzahl der Substrate (Punkte pro Chip) und der Anzahl der Chips zu. Ein weiterer, qualitativer Nachteil ist die Variabilität der Punkte von Chip zu Chip sogar in derselben Herstellungsserie. Dies ist einerseits durch die mechanische Limitation der Pinspitzen der Auftragungsroboter, andererseits wieder im Herstellungsverfahren (das Auftragen von individuellen Punkten) begründet und beeinträchtigt die Vergleichbarkeit der Resultate.
Vor diesem Hintergrund ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein neues Verfahren für die Herstellung von Mikroarray-Chips. Die Hauptziele der Erfindung sind eine geringe Variabilität der Chips (Qualitätsverbesserung) und eine höhere Ökonomie der Herstellung vor allem von großen Mengen gleicher Chips.
Die Aufgabe der Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß
  • - ein Substrat (z. B. DNA, Protein oder chemische Substanz) in einer Trägersubstanz (z. B. Paraffin, Polyacrylamid) homogen aufgelöst wird,
  • - die Trägersubstanz unter Bedingungen, die das enthaltene Substrat nicht zerstören, in festen Aggregatzustand überführt wird,
  • - die Trägersubstanz mit dem Substrat in eine faserförmige Form mit Durchmesser im Mikrometerbereich gegossen, geformt oder geschnitten wird,
  • - verschiedene faserförmige Trägersubstanzen mit dem jeweiligen Substrat in beliebiger Zusammensetzung zu einem Bündel kombiniert werden,
  • - die einzelnen Fasern durch Trennmaterial voneinander isoliert im Bündel vorliegen,
  • - die Kombination von verschiedenen Fasern in definierter Anordnung gebracht werden,
  • - alternativ die Trägersubstanz mit dem Substrat in Schichten gegossen, geformt oder geschnitten wird,
  • - verschiedene Schichten in Lagen übereinander geschichtet werden und Trennschichten jeweils Schichten mit unterschiedlichen Substraten separieren,
  • - die Gesamtschicht in Streifen geschnitten wird,
  • - verschiedene Streifen zu einem Block zusammengesetzt werden, wobei wiederum Trennschichten zwischen Streifen integriert werden,
  • - die verschiedenen Schichten und Streifen in definierter Anordnung hergestellt werden,
  • - das Trennmaterial bzw. die Trennschicht aus demselben Trägermaterial ohne Substrat besteht,
  • - das Trennmaterial bzw. die Trennschicht aus einem anderen Material besteht, das am Trägermaterial haftet,
  • - die Bündel oder die Blöcke in dünnen Scheiben von wenigen Mikrometern geschnitten werden,
  • - die Scheiben auf einer geeigneten festen Unterlage aufgetragen werden,
  • - die Trägersubstanz von der Unterlage entfernt wird und dabei das Substrat an der jeweiligen Stelle auf der Unterlage immobilisiert wird,
  • - alternativ: die Trägersubstranz nicht entfernt, jedoch das Substrat auf die Oberfläche der Scheibe gebracht und mitsamt der Trägersubstanz auf der Unterlage immobilisiert wird.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird als erster Schritt das Substrat in einer Trägersubstanz homogen verteilt. Als Substrat können verschiedenste Testsubstanzen verwendet werden, die in großer Anzahl vorliegen, insbesondere DNS für Genexpressionsanalysen und Proteine für Proteomanalysen, aber auch chemische Substanzen, wie sie bei der Suche nach neuen Medikamenten untersucht werden. Als Trägersubstanz können verschiedenste Substanzen verwendet werden, die eine homogene Mischung des Substrats ermöglichen und nicht das Substrat beschädigen. Die Trägersubstanz ist zunächst formbar, wird dann entweder chemisch (durch eine chemische Reaktion, z. B. Polyacrylamidgel) oder physikalisch (durch Abkühlung, z. B. Paraffin) in einen festen Zustand überführt.
Die Trägersubstanz mit dem darin enthaltenen Substrat wird in Form von mikroskopisch dünnen Fasern (bis zu Durchmessern von unter 100 Mikrometer) gegossen, gezogen oder geschnitten. Fasern mit unterschiedlichen Substaten werden in definierter Anordung gebündelt. Trennmaterial separiert verschiedene Fasern, so dass die Substrate voneinander isoliert sind. Alternativ wird die Trägersubstanz mit dem Substrat in dünnen Schichten (bis zu Dicken von unter 100 Mikrometer) in Lagen aufeinander aufgetragen. Auch hier isolieren Trennschichten Lagen mit verschiedenen Substraten voneinander. Die Gesamtschicht wird in feinen Streifen (bis zu Breiten von unter 100 Mikrometer) geschnitten. Verschiedene Streifen werden zu einem Block vereint. Das Trennmaterial bzw. die Trennschicht besteht entweder aus demselben Trägermaterial ohne Substrat oder aus einem anderen Material, das sich an das Trägermaterial haften lässt.
Das Faserbündel bzw. der Streifenblock wird quer zur Längsachse in dünne Scheiben (bis zu Dicken von unter 100 Mikrometer) geschnitten, auf eine feste Unterlage gebracht und fixiert. Als Unterlagen werden Glasplatten, Metallplatten oder sonstige Platten verwendet, die geeignet sind, das Substrat kovalent oder nicht-kovalent zu immobilisieren. Die Fixation der Scheiben erfolgt chemisch (z. B. durch kovalente Bindung des Trennmaterial an die chemisch vorbehandelte Unterlage) oder physikalisch (z. B. durch Kleben, Pressen oder Aufbrennen). Während oder nach der Fixierung wird die Trägersubstanz entfernt und das Substrat auf der Unterlage immobilisiert. Alternativ wird die Trägersubstanz belassen, dafür das Substrat aus der Trägersubstanz an die Oberfläche gebracht (z. B. durch ein elektrisches Feld bei einem Polyacrylamidgel als Trägersubstanz) und so fixiert.
Auf diese Weise können Mikroarray-Chips mit Substraten in der Größenordnung von 106 und mehr in einer Serie von 1000 bis 106 Stückzahlen hergestellt werden. Beispielsweise ist ein Chip mit 104 Substrat-Punkten von 100 Mikrometer Durchmesser und einer Trennschichtdicke von ebenfalls 100 Mikrometer (100 × 2 × 100 Mikrometer)2 = 2 × 2 cm2 = 4 cm2 groß, und bei einer Scheibendicke von 100 Mikrometer gehen aus einem Block von 10 cm Länge 1000 Scheiben, also Chips, hervor. Anzahl und Abmessungen der Substrat-Punkte entsprechen der Dimension bei zur Zeit hergestellten Chips durch andere Herstellungsverfahren.
Die herausragenden Vorteile dieser Methode sind:
  • 1. Die ökonomische und schnelle Herstellung von einem Vielfachen der Chipmengen, die nach den bisher üblichen Herstellungsverfahren in einer Serie produziert werden. Beispielsweise ergibt ein Faserbündel von 10 cm Länge 1000 Chips. Diese Zahl erreicht bei den Streifenblöcken eine Million Chips, da bei einer Schichtabmessung von 10 cm × 10 cm parallel 1000 Blöcke verarbeitet werden.
  • 2. Die geringe Variabilität der Chips einer Serie. Dadurch, dass alle Substrate in dem Faserbündel oder Streifenblock in der Längsachse absolut homogen sind und die einzelnen Substrat-Punkte alle die gleiche Größe haben, hängt die Variabilität unter den Chips einer Serie lediglich von der Präzision des Schneidevorgangs ab. Anders als die individuelle Punkt- Auftragung bei der konventionellen Technik der Mikroarray-Chipherstellung, erfolgt der Schnitt in einem Zug durch den gesamten Block, so dass die Variabilität der individuellen Substrat-Punkte prinzipiell geringer ist.
Die Anwendungsgebiete sind bereits jetzt als immens einzuschätzen, eine genaue Abschätzung des gesamten potenziellen Anwendungsgebiets ist kaum möglich. Angespornt durch das Humane Genomprojekt haben beispielsweise DNS-Mikrochips bereits massiven Einzug in Forschungsinstitute und in die pharmazeutische Industrie erhalten, und weitere Anwendungsbereiche eröffnen sich in rasanter Folge. Ein möglicherweise noch größerer Markt ist voraussichtlich in der klinischen Anwendung für Screening-Untersuchungen.
Die bisherigen Herstellungtechniken sind relativ ineffizient, d. h. gemessen an dem finanziellen und zeitlichen Aufwand ist die Produktion gering. Dadurch ist bereits jetzt die Nachfrage größer als das Angebot, und dies wird sich in den kommenden Jahren verschärfen, vor allem nach der Fertigstellung des Humanen Genomprojekts. Wichtiger noch ist, dass aufgrund des hohen technischen Aufwandes die konventionellen Chips sehr teuer sind und damit die Chips für viele Anwendungen, die wissenschaftlich und medizinisch sinnvoll wären, finanziell unerschwinglich machen. Das hier vorgestellte Verfahren wird die Produktionskosten und damit die Preise drastisch senken können und gleichzeitig eine qualitative Verbesserung der Chips erreichen.

Claims (31)

1. Verfahren zur Herstellung von Mikroarray-Chips, dadurch gekennzeichnet, dass
ein Substrat mit einer Trägersubstanz homogen vermischt wird,
die Trägersubstanz mit dem Substrat in eine Form gebracht wird,
verschiedene Substrat-Trägersubstanz-Gemische zu einem Bündel zusammensetzt werden,
anschließend das Bündel in dünne Scheiben geschnitten wird,
die Scheiben auf eine geeignete feste Unterlage gebracht werden und
schließlich die Trägersubstanz entfernt und dabei das Substrat auf der Unterlage immobilisiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein biologisches oder chemisches Testmaterial als Substrat.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch Nukleotidsequenzen als Substrat.
4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch Peptidsequenzen als Substrat.
5. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein Material als Trägersubstanz, das von einem formbaren Zustand in einen festen Aggregatzustand versetzt werden kann, ohne das Substrat zu beschädigen.
6. Verfahren nach Anspruch 1 und 5, gekennzeichnet durch Paraffin als Trägersubstanz.
7. Verfahren nach Anspruch 1 und 5, gekennzeichnet durch Polyacrylamid als Trägersubstanz.
8. Methode zur Verarbeitung und Bündelung von Substrat-Trägersubstanz-Gemischen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
das Substrat-Trägersubstanz-Gemisch in Form von Fasern gezogen oder gegossen wird und
eine gewünschte Anzahl von Fasern mit unterschiedlichen Substraten zu einem geordneten Bündel zusammengesetzt werden.
9. Methode nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass Fasern von beliebigem Durchmesser, insbesondere auch von Durchmessern unter 100 Mikrometer, hergestellt werden.
10. Methode nach Anspruch 8, gekennzeichnet durch eine sonstige Anordnung der Fasern mit verschiedenen Substraten, die geignet ist, um die Fasern im Querschnitt eindeutig zu identifizieren.
11. Methode nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass Fasern von beliebigem Querschnitt, insbesondere auch von quadratischem Querschnitt, hergestellt werden.
12. Methode nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass Fasern mit verschiedenen Substraten in einem konzentrischen Raster (Abb. 1a) geordnet werden.
13. Methode nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass Fasern mit verschiedenen Substraten in einem rechteckigen Raster (Abb. 1b) geordnet werden.
14. Methode zur Verarbeitung und Bündelung von Substrat-Trägersubstanz-Gemischen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
das Substrat-Trägersubstanz-Gemisch in Form von Schichten gebracht wird,
beliebig viele Schichten mit unterschiedlichen Substraten aufeinander geschichtet werden,
die Schichten in Streifen geschnitten werden und
schließlich die Streifen zu einem Bündel zusammengesetzt werden.
15. Methode nach Anspruch 14, gekennzeichnet durch eine beliebige Dicke der Schichten, insbesondere auch Dicken von unter 100 Mikrometer.
16. Methode nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass zwei übereinander liegende Schichten durch eine Trennschicht separiert sind (Abb. 2a).
17. Methode nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die zusammengesetzten Schichten mit beliebig vielen Lagen in Streifen (Abb. 2b) geschnitten werden.
18. Methode nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass geschnittenen Streifen eine beliebige Breite haben, insbesondere Breiten von unter 100 Mikrometer.
19. Methode nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass geschnittenen Streifen mit anderen Streifen an den Schnittstellen zusammengesetzt werden (Abb. 2c).
20. Methode nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass zusammengesetzten Streifen durch eine Trennschicht separiert sind (Abb. 2c).
21. Methode zur Herstellung von Mikroarray-Chips aus Bündeln nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
das Bündel quer zur Längsachse in Scheiben geschnitten wird,
die Scheiben auf eine geeignete feste Unterlage gebracht werden,
die Trägersubstanz entfernt und das Substrat auf der Unterlage immobilisiert wird.
22. Methode nach Anspruch 21, gekennzeichnet durch Scheiben beliebiger Dicke, insbesondere von Dicken unter 100 Mikrometer.
23. Methode nach Anspruch 21, gekennzeichnet durch ein festes Material als Unterlage, das die Haftung des Substrates gewährleistet.
24. Methode nach Anspruch 21, gekennzeichnet durch unbehandeltes Glas als Material der festen Unterlage.
25. Methode nach Anspruch 21, gekennzeichnet durch behandeltes Glas als Material der festen Unterlage.
26. Methode nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägersubstanz chemisch herausgelöst wird.
27. Methode nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägersubstanz physikalisch herausgelöst wird, z. B. Verdampfung durch Wärme-Einwirkung.
28. Methode nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägersubstanz biologisch herausgelöst wird, z. B. Verdauung durch Enzyme.
29. Methode nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat nicht-kovalent auf der Unterlage immobilisiert wird.
30. Methode nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat kovalent an der Unterlage gebunden wird.
31. Methode nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß
das Trägermaterial nicht entfernt wird,
das Substrat an die Oberfläche der Scheibe gebracht wird,
das oberflächliche Substrat mit dem darunter liegenden Trägermatrial an der Unterlage fixiert wird.
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