ES2242183T3 - Proteinas de fusion entre secuencias de aminoacidos antigenas y beta-2-microglobulina. - Google Patents
Proteinas de fusion entre secuencias de aminoacidos antigenas y beta-2-microglobulina.Info
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18811—Sendai virus
- C12N2760/18822—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Abstract
SE PRESENTA UNA PROTEINA DE FUSION HIBRIDA QUE COMPRENDE UNA PRIMERA SECUENCIA DE AMINOACIDO ANTIGENICA FUNDIDA A UNA SEGUNDA SECUENCIA DE AMINOACIDO SUBSTANCIALMENTE HOMOLOGA CON B2M O UN FRAGMENTO DEL MISMO.
Description
Proteínas de fusión entre secuencias de
aminoácidos antígenas y
beta-2-microglobulina.
La invención se refiere a nuevas proteínas de
fusión de beta-2-microglobulina
híbridas. También se refiere a ácido nucleico (ADN o ARN) que
codifica todo o parte de tales proteínas, y a su preparación.
Composiciones farmacéuticas que contienen tales proteínas de fusión
son útiles como componentes de vacunas profilácticas y como
inmuno-terapéuticos para el tratamiento
post-exposición de infección y malignidad
vírica.
Las respuestas inmunes tienen dos componentes
principales, humoral y mediado por células. La primera comprende
anticuerpos, producidos por B-linfocitos, que se
unen a antígenos específicos y que sirven para un cierto número de
funciones importantes tales como neutralización de virus, fijación
de complemento y formación de complejo inmune. La producción de
anticuerpos depende de células T auxiliares, que median en el
reconocimiento específico para el antígeno de epítopes péptidos
mostrados por moléculas de Complejo de Histocompatibilidad Principal
(MHC) de Clase II en la superficie de células que presentan
antígeno.
La segunda arma del sistema inmune implica
células T efectoras, en particular linfocitos T citotóxicos (CTLs)
que pueden reconocer y destruir células infectadas o transformadas.
Tales respuestas son particularmente importantes en la defensa
contra, y la inmunidad de, infecciones víricas, aunque también
están implicados en respuestas del hospedante contra ciertos
tumores. Las respuestas de los CTL también son específicas para el
antígeno, implicando subgrupos de células T CD8 positivas. El
reconocimiento inmune es mediado por el receptor de células T que
reconoce el antígeno péptido mostrado en las moléculas de MHC Clase
I.
Las moléculas de MHC Clase I se expresan
ubicuamente y consisten en dos cadenas de polipéptidos. La primera
es una cadena alfa de aproximadamente 45 kDa que comprende 3
dominios. Dos de estos dominios se unen a péptidos derivados del
tratamiento de proteínas sintetizadas endógenamente, tales como
componentes víricos, y los presentan al receptor de células T. Estos
dos dominios se enlazan a una región de anclaje de extensión de
membrana simple por un tercer dominio de tipo inmunoglobulina. El
segundo componente es beta-2 microglobulina (B2M),
una proteína de 100 aminoácidos que puede existir libre en el suero
así como parte de MHC Clase I. Las dos cadenas se asocian
normalmente en el ER, junto con péptidos producidos por degradación
de proteínas endógenas para formar un complejo ternario que se
presenta en la superficie celular. Aunque pueden formarse complejos
binarios carentes de péptido, éstos son inestables y se recirculan o
degradan normalmente (Ljungren et al. Nature 346, 476-
(1990).
Los datos cristalográficos revelan que el péptido
antígeno se une a una ranura entre los dos primeros dominios de la
subunidad alfa, cuya base está formada de cadenas de lámina beta y
las paredes de dos hélices alfa (Bjorkman et al. Nature 329,
506-512 (1987)). La naturaleza de las cadenas
secundarias en esta región de la cadena alfa es crítica para
determinar la selectividad de péptido de la molécula, y de aquí la
capacidad de diferentes alelos de MHC Clase I para responder a
epítopes particulares (Bjorkman et al. Nature 329,
512-518 (1987)). Aunque es la subunidad alfa la que
se une al péptido, la B2M juega un papel esencial para permitir la
unión, presumiblemente estabilizando el complejo ternario (Vitiello
et al. Science 250, 1423-1426 (1990); Rock
et al. PNAS 88, 310-304 (1991)). Aunque
alguna subunidad alfa libre puede alcanzar la superficie celular en
ausencia de B2M, y puede unirse y presentar péptido, es
considerablemente menos eficaz que en presencia de B2M (Bix y
Raulet. Exp. Med. 176, 829-834
(1992).
(1992).
Aunque la vía normal de presentación de antígeno
por MHC Clase I implica la degradación de proteínas sintetizadas
endógenamente, es posible conseguir presentación de antígeno por
adición de altas concentraciones de péptido a células que presentan
antígeno (APC) in vitro. El uso de péptidos como inmunógenos
tiene un cierto número de ventajas potenciales, de las que las más
significativas son que evita el uso de partículas víricas
inactivadas o atenuadas, y que pueden sintetizarse químicamente
péptidos pequeños, evitando el requisito de vías de producción
biológicas. La presentación más eficaz se obtiene con péptidos de
9-11 residuos de longitud, que se corresponde con la
longitud de la ranura si están en conformación extendida.
Sin embargo, hay problemas principales asociados
con este método de obtención de una respuesta de CTL. Aunque tal uso
de péptidos es adecuado para demostrar respuestas inmunes tales como
dentrucción in vitro mediada por células T, no es un
procedimiento eficaz y no ofrece una vía práctica a la inmunización
in vivo. Pueden inducirse respuestas de CTL por inmunización
con ciertos pequeños fragmentos de péptidos, pero tales péptidos
pueden obtener malas respuestas de anticuerpos. Además, en una
población engendrada fuera individuos de diferentes haplotipos de
MHC Clase I y Clase II responderán a diferentes epítopes péptidos;
pueden requerirse muchos péptidos para cebar todos los haplotipos
posibles.
Buena parte de la evidencia disponible indica
también que la inmunización con proteínas completas no da lugar a
respuesta de CTL. Tales respuestas de CTL que se han inducido
requieren la presencia de coadyuvantes fuertes o vector vivo que no
se han autorizado para su uso en seres humanos. Por ejemplo, el HIV
recombinante gp 160 presentado en ISCOMs, pro no en FCA, FIA o
solución salina tamponada, inducía actividad de CTL específica para
la envoltura de HIV-1 en ratones BALB/c. Se tiene la
impresión generalmente de que es improbable que sea próxima la
aprobación para el uso de ISCOMs en seres humanos. Virus de vacunas
recombinantes que expresan la región V3 del gp 160 de envoltura de
HIV inducen también respuestas de CTL específicas a la región V3,
pero la inmunización con vacunas ha planteado preocupaciones acerca
de la seguridad para pacientes inmunocomprometidos y acerca de la
eficacia. Una forma más simple y más eficaz para inducir respuestas
de CTL es por tanto un objtivo importante, y se ha buscado
activamente durante un cierto número de años aunque con sólo un
éxito limitado.
Se ha mostrado que el intercambio de cadenas de
B2M en MHC Clase I tiene lugar en presencia de B2M libre (Hayfil y
Strominger, PNAS USA 76(11) 5834-5838
(1979)), y que la unión de péptidos exógenos a estas moléculas tiene
lugar por asociación y reasociación de cadenas ligeras de B2M (Rock
et al., PNAS USA 87 7517-7521 (1990);
Kozlowski et al. Nature 349, 74-77 (1991)).
La presentación de péptido añadido exógenamente puede hacerse por
tanto más eficaz por adición de B2M. El uso de B2M exógena de esta
manera para aumentar respuestas inmunes contra péptidos in
vivo se describe en el documento
WO-A-91/16924.
Sin embargo, hay un cierto número de problemas
con este método. El uso de una mezcla, aunque es una herramienta
conveniente para uso in vitro, es menos apropiado para
administración in vivo, debido a los problemas de
polifarmacia para registro de productos.
Además, a pesar de que la secuencia de ADN de B2M
es conocida, no ha sido posible producir eficazmente B2M
recombinante. La B2M para uso en el aumento de respuestas inmunes
necesitaría por tanto purificarse de fuentes naturales tales como
suero u orina. No sólo esto es difícil y caro, sino que debe
examinarse un cierto número de contaminantes en productos de la
sangre antes de ser aceptable para su uso en vacunas.
A pesar del hecho de que se han mostrado
esenciales para la unión y presentación del péptido interacciones
entre el término C del péptido y la subunidad alfa, la presente
invención ha encontrado que péptidos fusionados al término N de B2M
son aún capaces de unirse a la ranura en la subunidad alfa. Esta
unión se consigue sin sacrificar la capacidad del complejo ternario
para unirse y accionar al receptor de células T.
Según el primer aspecto de la invención, se
proporciona una proteína de fusión híbrida que comprende una primera
secuencia de aminoácidos antígena fusionada directa o indirectamente
al término N de una segunda secuencia de aminoácidos al menos 60%
homóloga con B2M o una secuencia que retenga al menos el 60% de sus
residuos, caracterizada porque la primera secuencia de aminoácidos
antígena corresponde a una secuencia derivada de, o asociada con, un
tumor o un agente etiológico, distinta de la secuencia señal de
E. coli OmpA MKKTAIAIAVALAGFATVAQA.
Preferiblemente, la primera secuencia antígena
está fusionada a la secuencia de B2M mediante una secuencia
enlazadora corta, para extenderse sobre la separación entre el
péptido y la B2M con disrupción mínima de la conformación de la
cadena ligera.
El uso de fusiones de B2M ofrece ventajas
considerables. El complejo binario entre la subunidad alfa y la
fusión de B2M se estabiliza con relación al complejo ternario
correspondiente, prolongando la capacidad del péptido para estimular
al receptor de células T, aumentando por ello la actividad eficaz
del péptido. Se evitan los problemas de polifarmacia, simplificando
el desarrollo del compuesto. Este método tiene también un cierto
número de ventajas de registro de productos minimizando el número de
proteínas presentes en la vacuna, y puede conformarse más
estrechamente a líneas de guía en calidad y seguridad. Finalmente,
sólo se requiere una vía de producción de GMP simple. Estas últimas
consideraciones son particularmente importantes poque pueden
requerirse epítopes múltiples para producir una vacuna eficaz contra
el fondo de diversidad de MHC. Una ventaja final es que, puesto que
el péptido se entrega eficazmente al MHC, puede obviarse el
requisito de coadyuvantes.
La expresión "sustancialmente homóloga",
cuando se describe la relación de una secuencia de aminoácidos con
una proteína natural, significa que la secuencia de aminoácidos
puede ser idéntica a la proteína natural o puede ser una forma
eficaz aunque truncada o modificada de la proteína natural. En
términos prácticos, sin embargo, muchos análogos tendrán un alto
grado de homología con la molécula prototipo si ha de conservarse
sustancialmente la actividad biológica. Se comprenderá que la
naturaleza de los cambios de la molécula prototipo es más importante
que la cantidad de ellos. Como guía, no obstante, en el nivel de
aminoácidos, puede ser que al menos el 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o
incluso 99% de los residuos sean los mismos que la molécula
prototipo; en el nivel de ácidos nucleicos, el ácido nucleico que
codifica un análogo puede hibridarse por ejemplo bajo condiciones
rigurosas (tales como a aproximadamente 35ºC a 65ºC en una solución
de sal aproximadamente 0,9 molar) con el ácido nucleico que codifica
la molécula prototipo, o lo haría así salvo por la degeneración del
código genético.
Los fragmentos de B2M de uso en esta invención
conservan la capacidad para aumentar respuestas inmunes a los
péptidos a los que se fusionan. Preferibledmente, se conservan al
menos el 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o incluso 99% de los residuos.
Las proteínas sustancialmente homólogas a B2M
incluyen B2M de origen natural y B2M modificada, una variante
encontrada en relación con una variedad de tipos de cáncer y
trastornos del sistema inmune.
La primera secuencia antígena corresponde a una
secuencia derivada de, o asociada con, un agente etiológico o un
tumor. El agente etiológico puede ser un microorganismo tal como un
virus, bacteria, hongo o parásito. El virus puede ser: un
retrovirus, tal como HIV-1, HIV-2,
HTLV-I, HTLV-II,
HTLV-III, SIV, BIV, LAV, ELAV, CIAV, virus de
leucemia de ratón, virus de leucemia de ratón de Moloney y virus de
leucemia de felino; un ortomixovirus, tal como influenza A o B; un
paramixovirus, tales como virus de parainfluenza, paperas,
sarampión, RSV y virus de Sendai; un papovavirus, tal como HPV; un
arenavirus, tal como LCMV de seres humanos o ratones; un
hepadnavirus, tal como virus de Hepatitis B; un virus de herpes, tal
como HSV, VZV, CMV o EBV. El antígeno asociado con, o derivado de,
tumor puede ser por ejemplo un antígeno de tumor humano proteínico,
tal como un antígeno asociado con melanoma, o un antígeno asociado
con tumor epitelial tal como carcinoma de pecho o colon.
La secuencia antígena puede derivarse también de
una bacteria, tal como del género Neisseria, Campyobacter,
Bordetella, Listeria, Mycobacteria o Leishmania, o un parásito,
tal como del género Trypanosoma, Schizosoma, Plasmodium,
especialmente P. falciparum, o de un hongo, tal como del
género Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Histoplasma o
Blastomyces.
Las secuencias antígenas preferidas corresponden
a epítopes de CTL de un retrovirus, un paramixovirus, un arenavirus
o un virus hepadna, o una célula de tumor humano. Los ejemplos
incluyen epítopes de:
1) gp 120 de HIV (particularmente
HIV-1),
2) p24 de HIV (particularmente
HIV-1),
3) gpI, gpII y gpIII de VZV,
4) nucleoproteína de LCMV,
5) nucleoproteína del virus de la influenza,
6) proteínas L1 y L2 de HPV,
7) virus de papiloma humano E5 y E7,
8) antígenos de CSP o RESA de malaria,
9) p6 de micobacteria,
10) antígeno asociado con tumor epitelial GA
733-2,
11) secuencia de repetición de
MUC-1 de antígeno asociado con tumor epitelial,
12) antígenos de melanoma
MZ2-E,
13) antígeno asociado con melanoma p97,
Las secuencias antígenas particularmente
preferidas se derivan del tercer dominio variable de una proteína de
envoltura de un lentivirus. Esta región de lentivirus, conocida como
el lazo V3 o lazo GPGR se encuentra entre los aminoácidos 300 y 330
de gp 120 de HIV-1 y en posiciones análogas de otros
lentivirus. El lazo V3 es, para HIV-1 al menos, el
principal epítope neutralizante del virus (Putney et al 1986
Science 234, 1392; Rusche et al 1988 Proc. Natl.
Acad. Sci. 85, 3198; Palker et al 1988 Proc. Natl.
Acad. Sci. 85 1932; y Goudsmit et al., 1988 AIDS 2
157). La porción antígena de elección puede constituir la totalidad
del lazo V3 cuando se deriva de cepas diferentes. Sin embargo,
pueden ser útiles copias múltiples de una secuencia conservada del
lazo V3 para conferir inmunidad contra más de un aislado de un virus
(tal como HIV-1).
Las proteínas de fusión de B2M según la invención
pueden fabricarse en principio por cualquier método conveniente,
incluyendo acoplamiento entre sí de residuos de aminoácidos
sucesivos, o por el acoplamiento químico de dos o más cadenas de
oligo o polipéptidos o de proteínas existentes (por ejemplo,
naturales). Aunque pueden sintetizarse en principio proteínas total
o parcialmente por medios químicos, la vía de elección será
traducción ribosómica, preferiblemente in vivo, de una
secuencia de ácidos nucleicos correspondiente.
Según un segundo aspecto de la invención, por
tanto, se proporciona un ácido nucleico que codifica una proteína de
fusión como se ha descrito antes. Ambos ADN y ARN están dentro del
alcance de la invención. El ADN puede ser sintetizado químicamente
y/o recombinante.
El ADN recombinante según la invención puede
estar en forma de un vector. El vector puede ser, por ejemplo, un
plásimido, cósmido o fago. Los vectores incluyen frecuentemente uno
o más marcadores seleccionables para permitir la selección de
células transformadas (o transfectadas: los términos se usan
intercambiablemente en esta memoria descriptiva) con ellos y,
preferiblemente, para permitir la selección de células que albergan
vectores que incorporan ADN heterólogo. Están generalmente presentes
señales que inician y de terminación de la traducción apropiadas.
Adicionalmente, si el vector se pretende para expresión, se incluyen
secuencias reguladoras de la transcripción suficientes para conducir
la expresión. Son útiles como vectores de clonación vectores que no
incluyen secuencias reguladoras. Según un tercer aspecto de la
invención, se proporciona un vector que incluye ácido nucleico como
se ha descrito antes. Ha de entenderse que el término "vector"
se usa en esta memoria descriptiva en un sentido funcional y no ha
de considerarse como estando limitado necesariamente a una molécula
de ácido nucleico simple.
Los vectores de expresión según la invención
contienen habitualmente un promotor. La naturaleza del promotor
dependerá de la célula de expresión hospedante propuesta. Para
levadura, PGK es un promotor preferido, pero puede usarse
cualquier otro promotor adecuado si es necesario o deseable. Los
ejemplos incluyen GAPD, GAL1-10,
PHO5, ADH1, CYC1, secuencia Ty delta,
PYK y promotores híbridos fabricados a partir de componentes
de más de un promotor (tales como los listados). Para células de
insectos, un promotor preferido es el promotor de polihedrina de
virus de polihedrosis nuclear de Autographica californica
(AcNPV). Los expertos en la técnica serán capaces de determinar
otros promotores apropiados adaptados para expresión en éstas u
otras células. Pueden usarse vectores que no incluyen promotores
como vectores de clonación , en lugar de vectores de expresión.
Los vectores de clonación pueden introducirse en
E. coli o cualesquiera otros hospedantes adecuados que
faciliten su manipulación. Los vectores de expresión pueden
adaptarse para expresión procariota en células bacterianas, tales
como E. coli. Sin embargo, como preferencia, se adaptan los
vectores para expresión en una célula eucariota microbiana, tal como
una levadura (incluyendo, aunque sin limitarse a ellas,
Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris) u una
célula eucariota superior tal como linajes celulares de insectos
tales como Spodoptera frugiperda SF9, o células de mamífero
incluyendo células de ovario de hámster chino (CHO), linajes
celulares de mieloma de ratón tales como
P3X63-Ag8.653, células COS, células HeLa, células
BHK, linajes celulares de melanoma tales como el linaje celular de
Bowes, células L de ratón, linales celulares de hepatoma humano
tales como Hep G2, fibroblastos de ratón y células NIH 3T3 de ratón.
El funcionamiento de la invención no depende ni está limitado a
ninguna cepa particular de microorganismo o tipo de célula: los
adecuados para su uso con la invención serán evidentes para los
expertos en la técnica, siguiendo la enseñanza de esta memoria
descriptiva. Según un cuarto aspecto de la invención, se proporciona
una célula hospedante transfectada o transformada con el ADN
descrito antes.
A pesar de ser conocida la secuencia de ADN de
B2M, no ha sido posible hasta ahora producir eficazmente B2M
recombinante. Se producen rendimientos extremadamente bajos por
expresión en células de mamíferos, y la proteína se pliega
incorrectamente tras la expresión en E. coli. Ni hay
levaduras hospedantes universalmente para este propósito. Las
técnicas estándares para obtener la expresión de B2M en quizás la
levadura usada más extensamente para tales fines, es decir, S.
cerevisiae, produjeron muy malos rendimienos.
El sistema de expresión de Pichia pastoris
es muy conocido, y tiene ventajas particulares en su facilidad de
cambio de escala para producción a gran escala. Se ha obtenido un
alto nivel de expresión para un cierto número de proteínas en ese
hospedante, pero, igualmente, algunas han demostrado dificultad de
producción. No hay una correlación obvia entre las propiedades de un
polipépido particular y su capacidad para ser expresado altamente en
el sistema Pichia.
Como contraste con el bajo nivel de expresión de
B2M en S. cerevisiae, pueden obtenerse rendimientos
razonables de las proteínas de fusión de esta invención en el
sistema Pichia.
Por tanto, la invención incluye un método para
producir proteínas de fusión de la invención cultivando una levadura
metilotrópica que alberga un vector de expresión que comprende ADN
que codifica la proteína de fusión pertinente, y recuperando la
proteína de fusión expresada.
Las cepas de levadura metilotrópica incluyen
Pichia, en particular P. pastoris, Hansenula, Candida
y Torulopsis. Se prefiere actualmente el uso de Pichia
pastoris.
El ADN recombinante que codifica las proteínas de
fusión de la invención puede incorporarse en un vector de expresión
de levadura para expresión en levadura metilotrópica según la
invención. Tales vectores contienen usualmente un promotor.
AOX es un promotor preferido, pero puede usarse si es
necesario o deseable cualquier otro promotor adecuado. Los ejemplos
incluyen GAPD, GAL1-10, PHO5,
ADH1, PGK, CYC1, secuencia Ty delta, PYK
y promotores híbridos fabricados a partir de componentes de más de
un promotor (tales como los listados).
Para obtener secreción de la proteína de fusión
de las células de levadura después de la expresión, el vector de
expresión incluye preferiblemente una secuencia líder de secreción
fusionada a la secuencia de B2M de la proteína de fusión híbrida.
Después de la secreción, la secuencia líder se divide
automáticamente de la proteína B2M por
\hbox{enzima(s)}producida(s) naturalmente durante el cultivo de las células de levadura transformadas. Tales técnicas de secreción son muy conocidas. Las líderes de secreción conocidas en la técnica incluyen el factor alfa, Pho1, HSA y Suc2. Si la división no es 100% precisa, la producción final de la proteína de fusión puede contaminarse con una fusión de B2M/híbrido de epítope con parte de la secuencia del factor de secreción, indicando una separación incompleta de la líder de factor de secreción. Aunque la proteína híbrida de la invención puede separarse del contaminante por métodos de purificación estándares, por ejemplo los basados en pesos moleculares diferentes, sería deseable evitar la dificultad si es posible.
Aparece que la líder Pho1 se divide en general
correctamente de las proteínas de fusión híbridas de la invención, y
es por tanto el factor de secreción preferido actualmente para su
uso según la invención.
Las proteínas de fusión de B2M del primer aspecto
son útiles como vacunas. Éstas podrían usarse antes de la exposición
como agentes profilácticos, o después de la exposición como agentes
inmunoterapéuticos para aumentar la liquidación de infección vírica.
Tales proteínas de fusión se administrarían por vías convencionales,
i.v., i.m. o s.c., aunque puede preferirse la vía s.c.
Según un quinto aspecto de la invención, se
proporciona una formulación farmacéutica o veterinaria que comprende
una proteína de fusión de B2M como se ha descrito antes y un
excipiente aceptable farmacéutica o veterinariamente. Una o más
proteínas de fusión del primer aspecto pueden estar presentes en
asociación con uno o más excipientes aceptables farmacéutica o
veterinariamente no tóxicos, tales como solución salina fisiológica
estéril o PBS estéril, y/o diluyentes y/o coadyuvantes y, si se
desea, otros ingredientes activos. La esterilidad es generalmente
esencial para vacunas administrables parenteralmente. También pueden
estar presentes uno o más coadyuvantes apropiados. Los ejemplos de
coadyuvantes adecuados incluyen compuestos péptidos de muramilo
tales como dipéptido de muramilo prototipo, hidróxido de aluminio y
saponina. Puede considerarse también la coadministración con
citoquinas, por ejemplo IFN\gamma puede potenciar la respuesta
inmune induciendo la expresión de MHC Clase I.
Puede preferirse que, cuando se usan como vacunas
profilácticas, los agentes de B2M se usen en combinación con vacunas
subunitarias diseñadas para inducir buenas respuestas de anticuerpos
neutralizantes. Sin embargo, esto puede no ser necesario porque hay
alguna evidencia de que las respestas de CTL solas pueden proteger
contra infección.
Según un sexto aspecto de la invención, se
proporciona una proteína de fuión de B2M que comprende una primera
secuencia de aminoácidos antígena fusionada directa o indirectamente
al término N de una segunda secuencia de aminoácidos homóloga al
menos un 60% a beta-2-microglobulina
(B2M) o una secuencia que conserve al menos el 60% de sus residuos,
caracterizada porque la primera secuencia de aminoácidos antígena
corresponde a una secuencia derivada de, o asociada con, un tumor o
agente etiológico, para su uso como una vacuna profiláctica o
inmunoterapéutica. Según un séptimo aspecto de la invención, se
proporciona también el uso de una proteína de fusión de B2M de la
invención en la preparación de una vacuna profiláctica o
inmunoterapéutica.
La invención proporciona también un procedimiento
para preparar una formulación farmacéutica o veterinaria de la
invención, cuyo procedimiento comprende mezclar una proteína de
fusión de B2M de la invención y un excipiente aceptable farmacéutica
o veterinariamente.
El ingrediente activo puede administrarse
parenteralmente en un medio estéril. Dependiendo del vehículo y la
concentración usados, el fármaco puede suspenderse o disolverse en
el vehículo. Ventajosamente, pueden disolverse en el vehículo
coadyuvantes tales como agentes anestésico local, de conservación y
de tamponación.
Pueden ser útiles antígenos en partículas
producidos según la invención en la preparación de vacunas, por
ejemplo vacunas inmunoterapéuticas, que forman un aspecto adicional
de la invención.
El siguiente Ejemplo ilustra la invención:
La Figura 1 muestra el vector de expresión de
levadura pSW6, en el que se clona el gen de B2M según el ejemplo
2.
La Figura 2 muestra el vector de expresión de
Pichia pHILD1 usado como punto de partida en el ejemplo 3
para la construcción del vector de expresión para expresión de alto
nivel de B2M en P. pastoris, usando la secuencia líder de
factor alfa.
La Figura 3 muestra el vector intermedio pLHD4
usado en el ejemplo 3 en la construcción del vector de expresión de
factor alfa de P. pastoris/B2M.
La Figura 4 muestra el vector de expresión de
factor alfa de P. pastoris/B2M pLH15 preparado según el
ejemplo 3.
La Figura 5 muestra el vector de expresión de
Pichia pHILS1 usado como punto de partida en el ejemplo 4
para la construcción del vector de expresión para expresión de alto
nivel de B2M en P. pastoris, usando la secuencia líder de
Pho1, y las manipulaciones que conducen al vector de expresión de
Pho1 de P. pastoris/B2M pLH46 preparado según el ejemplo
4.
La Figura 6 muestra la secuencia de la fusión
Pho1/B2M incluida en pLH46 (Figura 5), en la que la secuencia
subrayada representa el lugar de clonación, las letras cursivas
representan la secuencia señal de Pho 1 y las letras negritas son
idénticas a la secuencia del gen de B2M.
La Figura 7 muestra el resultado del ensayo
descrito en el Ejemplo 9.
Se purificó ARN de células sanguíneas humanas
usando el método de isotiocianato guanidinio (RNAzol B®,
Biogenesys). Este ARN se usó como plantilla para síntesis de cADN de
primera cadena con el uso de cebadores oligo dT usando el método de
Maniatis (en Molecular Cloning, 1989).
El cADN se multiplicó después en reacciones PCR
usando el cebador
(5'-GACAAGCTTGGATAAAAGAATCC-
GCGTACTCCAAAG-3') SEQ ID 1 para añadir un lugar de restricción de HindIII y una secuencia adaptadora que codifica los últimos 5 aminoácidos del factor de acoplamiento alfa de S. cedrevisiae en el extremo 5' del gen, y (5'-CATAGGATCCTTATTACATGTCTCCGATCCCACTT-3') SEQ ID 2, que añadió un codón de terminación y un lugar de BamH1 en el extremo 3' del gen. Los productos de PCR se generaron en 30 ciclos de desnaturalización a 97ºC durante 1 min, reasociación a 60ºC durante 1 min y alargamiento a 72ºC durante 30 segundos. Las reacciones se realizaron en MgCl_{2} 1 mM, KCl 50 mM, Tris 10 mM pH 3 usando 50 ng de cebador en un volumen de 50 \mul. La secuencia del gen se muestra en la Figura 2. Después de multiplicación por PCR, se digirió el ADN con HindIII y BamHI y se ligó en M13mp19 tratado con fosfatasa intestinal de becerro HindIII y BamHI. Se determinó después la secuencia de los clones de M13 para identificar aislados que no tenían diferencia con la secuencia publicada usando el cebador universal (5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3') SEQ ID 3. Se purificó después el ADN de uno de estos clones y se subclonó en el vector de expresión de S. cerevisiae pSW6 (véase Ejemplo 2).
GCGTACTCCAAAG-3') SEQ ID 1 para añadir un lugar de restricción de HindIII y una secuencia adaptadora que codifica los últimos 5 aminoácidos del factor de acoplamiento alfa de S. cedrevisiae en el extremo 5' del gen, y (5'-CATAGGATCCTTATTACATGTCTCCGATCCCACTT-3') SEQ ID 2, que añadió un codón de terminación y un lugar de BamH1 en el extremo 3' del gen. Los productos de PCR se generaron en 30 ciclos de desnaturalización a 97ºC durante 1 min, reasociación a 60ºC durante 1 min y alargamiento a 72ºC durante 30 segundos. Las reacciones se realizaron en MgCl_{2} 1 mM, KCl 50 mM, Tris 10 mM pH 3 usando 50 ng de cebador en un volumen de 50 \mul. La secuencia del gen se muestra en la Figura 2. Después de multiplicación por PCR, se digirió el ADN con HindIII y BamHI y se ligó en M13mp19 tratado con fosfatasa intestinal de becerro HindIII y BamHI. Se determinó después la secuencia de los clones de M13 para identificar aislados que no tenían diferencia con la secuencia publicada usando el cebador universal (5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3') SEQ ID 3. Se purificó después el ADN de uno de estos clones y se subclonó en el vector de expresión de S. cerevisiae pSW6 (véase Ejemplo 2).
Se diseñó un vector de expresión para permitir la
secreción de B2 microglobulina en el medio extracelular después de
la expresión en S. cerevisiae. La secreción ayuda a la
purificación y análisis rápido de B2M. Las señales de secreción del
factor alfa de tipo acoplamiento de levadura se usaron para dirigir
la exportación de la proteína de B2 microglobulina.
El vector de expresión de levadura pSW6 (Figura
1) se basa en el círculo de 2 micrómetros de S. cerevisiae.
(El pSW6 está depositado en la cepa BJ2168 de S. cerevisiae
en la National Collection of Industrial and Marine Bacteria Limited,
23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Reino Unido, con el Nº de
Admisión NCIMB 40326). El pSW6 es un vector lanzadera capaz de
replicación en E. coli y S. cerevisiae y contiene un
origen de replicación de ADN para ambos organismos, el gen de
leu2 (un marcador seleccionable para mantenimiento de
plásmido en el hospedante levadura) y el lugar de resistencia a
ampicilina para selección de mantenimiento de plásmido en E.
coli. (La secuencia de ADN para el vector se describe en el
documento WO-A-09125). La capacidad
de pasar este vector a través de E. coli facilita en gran
medida su manipulación genética y la facilidad de purificación. El
pSW6 contiene un gen pre-pro-péptido
de factor alfa fusionado enmarcado a un gen que codifica factor de
crecimiento epidérmico humano (EGF). La expresión de esta fusión
está bajo el control de un promotor regulado por galactosa eficaz
que contiene secuencias de ADN híbrido del GAL 1-10
de S. cerevisiae y promotores de fosfoglicerato quinasa
(PGK). La transcripción del gen de EGF se termina en este vector por
el terminador de PGK de levadura natural. El gen de EGF en pSW6
puede separarse por digestión con endonucleasas de restricción
HindIII y BamHI. Esto separa ADN que codifica EGF y 5
aminoácidos del término C del pro-péptido de factor
alfa. Los genes a insertar en el vector de expresión pSW6 deben
tener por tanto la composición general: lugar de
HindIII-adaptador de factor
alfa-gen-lugar de BamHI. El
gen de B2M preparado en el Ejemplo 1 tiene esta composición
general.
Después de digestión con endonucleasas
HindIII y BamHI, el vector pSW6 contiene el gen de
factor alfa menos los codones para los últimos cinco residuos de
aminoácidos. El gen de B2M preparado como en el Ejemplo 1 se clonó
después en el vector pSW6. El vector resultante se transformó
después en la cepa hospedante BJ2168 usando el método de Ito et
al J. Bacteriol. (1983) 153 163-168.
Los vectores de expresión usados para este
trabajo se derivaron del vector de expresión de Phillips Petroleum
pHILD1.
El vectos de expresión de Pichia pHILD1
(Figura 2) es un vector lanzadera capaz de propagación en E.
coli (por facilidad de manipulación genética) y en la levadura
metilotrófica Pichia pastoris. El pHILD1 puede obtenerse bajo
licencia de la Phillips Petroleum Company, Bartlesville Oklahoma,
EE.UU. El vector comprende secuencias derivadas del vector de E.
coli pBR322 y secuencias derivadas del genoma de Pichia
pastoris. Los aspectos esenciales son la región 5' del gen de
AOX de Pichia que incluye el promotor AOX regulable para
transcripción de alto nivel, la región 3' del gen de AOX que
contiene la secuencia terminadora transcripcional de alcohol
oxidasa; se incluye una región adicional de la parte 3' del gen de
-AOX que, junto con la región de AOX 5', se requiere para
integración dirigida por el lugar de la cassette de expresión en el
genoma del hospedante. El gen de histidinol deshidrogenasa de P.
pastoris HIS4 se lleva y usa para complementar el gen
HIS 4 defectuoso en cepas del hospedante Pichia. Se
lleva el gen de resistencia a ampicilina para permitir la selección
en los hospedantes E. coli usados durante la manipulación
genética.
El vector pHILD1 se manipuló para permitir la
expresión del gen de B2M bajo el control de la señal de secreción de
factor alfa. El pHILD1 no lleva ninguna secuencia que codifique
señales de secreción para permitir la exportación de proteínas
heterólogas. Para incluir tal señal, se manipuló el vector por
adición de secuencias del líder de factor alfa de S.
cerevisiae. El vector se diseñó adicionalmente para proporcionar
un contexto de promotor más óptimo y para separar lugares de
restricción de Hind III indeseables que pueden interferir con
la clonación del gen de B2M, se introdujo después un lugar de
Bam HI 3' hacia el Hind III restante para permitir la
clonación del gen de B2M en un lugar de restricción de
HindIII-BamHI y para incluir una cassette de
resistencia a canamicina que permite la selección de integrantes
multicopia en cepas hospedantes de Pichia. Las fases de las
manipulaciones se muestran seguidamente.
Las secuencias de factor alfa se clonaron en el
vector pHILD1 a partir del vector de expresión pSW6 de S.
cerevisiae (Figura 1) (véase el ejemplo 2 para tener detalles).
Las secuencias de factor alfa se aislaron de pSW6 en un fragmento de
ADN de BgI II-BamHI de unos 430 pb; este fragmento
contiene las secuencias de factor alfa fusionadas a un gen sintético
de factor de crecimiento epidérmico humano (EGF). Los extremos
sobresalientes de este fragmento de ADN se llenaron primero usando
fragmento de Klenow de polimerasa I de ADN de E. coli junto
con los desoxinucleósido trifosfatos requeridos según metodología
estándar.El fragmento de extremo enrasado se clonó después en el
vector pHILD1 que se había tratado con Eco RI y hecho después
de extremos romos como antes. Se comprobó la integridad del plásmido
resultante pLH001 mediante una combinación de digestón con
restricción y análisis de secuencia de ADN. El cebador usado para
análisis de la secuencia fue
(5'-GCATTCTGACATCCTCT-3'), SEQ ID 4.
Se confirmó la secuencia de la fusión de factor alfa.
Para separar lugares de restricción de
Hind III no deseados, optimizar la región de promotor e
introducir un lugar de Bam H1 a partir del vector pLHOO1, se
clonaron fragmentos pertinentes en el bacteriófago M13 para
mutagénesis dirigida por el lugar. Los fragmentos clonados, los
cebadores usados para mutagénesis y los cebadores usados para
determinación de secuencia se detallan después. Además, se modificó
un cassette de resistencia a canamicina para introducción en el
vector de expresión final a fin de permitir selección para
integrantes multicopia cuando se introduce el vector en cepas
hospedantes de Pichia.
Un fragmento de SacI-SacI de 1220
pb se aisló de pLH001 y se clonó en M13 mp19. Esta construcción de
M13 se usó después para mutagénesis en la que se separó un lugar de
HindIII usando el cebador oligonucleótido
(5'-CGTTAAAATCAACAACTTGTCAATTG-GAACC-3'),
SEQ ID 5, y los mutantes se identificaron por análisis de secuencia
con el cebador de determinación de secuencia
(5'-GGAAATCTCACAGATCT-3'), SEQ ID 6.
Este fragmento se modificó adicionalmente por mutagénesis de
supresión para optimizar la región líder no traducida 5' que precede
al promotor AOX, que es ahora idéntico al encontrado en la líder no
traducida 5' natural del gen de AOX1 en el genoma de Pichia.
Se prefiere para expresión máxima tener el contexto correcto
alrededor de la líder no traducida 5'. El cebador de mutagénesis
usado para esta etapa fue
(5'-GAAGGAAATCTCATCGTTTCGAATA-3'),
SEQ ID 7. El mutante se identificó por análisis de secuencia con el
cebador de determinación de secuencia
(5'-GCTAATGCGG-AGGATGC-3'),
SEQ ID 8.
Dos lugares de HindIII adicionales se
separaron del fragmento de SacI-XbaI de 770 pb de
pLH001 por mutagénesis. El fragmento de SacI-XbaI de
pLH001 se clonó primero en M13 mp18 y se separó uno de los lugares
de Hind III usando el cebador
(5'-CCGGCATTACAACTTATCGATAAGCTTGCAC-3'),
SEQ ID 9. La identidad de este mutante se confirmó por análisis de
secuencia usando el cebador de determinación de secuencia
(5'-GCGCATTGTTAGATTTC-3'), SEQ ID
10. Se separó un segundo lugar de HindIII de este fragmento
recién mutagenizado usando el cebador de mutagénesis
(5'-CTTATCGATCAACTTGCACAAACG-3'),
SEQ ID 11. Se identificó el mutante correcto por análisis de
secuencia usando el cebador de determinación de secuencia SEDQ ID 9
(véase antes).
Antes de volver a montar, se introdujo un lugar
de BamHI en el fragmento de SacI-XbaI suprimido
de HindIII para permitir la clonación subsiguiente del gen de
B2M del ejemplo 1 en un fragmento de HindIII-BamHI. El
cebador de mutagénesis usado para introducir el lugar de
BamH1 fue
(5'-GTCATGTCTAAGGCGGATCCTTATTAAC-3'),
SEQ ID 12. La identidad del mutante se identificó usando el cebador
de determinación de secuencia
(5'-GCATTCTGACATCCTCT-3'), SEQ ID
13.
Se compró una cassette de resistencia a
canamicina de Pharmacia Biosystems Limited, Davy Avenue. Knowhill,
Milton Keynes, MK5 8PH. Gran Bretaña. Esta cassette se suministró
como un fragmento de EcoRI por Pharmacia y éste se clonó en M13 mp19
como un fragmento de EcoR1. El HindIII interno se
suprimió usando el cebador de mutagénesis
(5'-GAGAATGGCAACAACTTATGCATT-3'),
SEQ ID 14. Se confirmó la mutación usando el cebador de
determinación de secuencia
(5'-CCAACATCAATACAACC-3'), SEQ ID
15.
El vector se reconstruyó de una manera por etapas
usando el vector pHILD1 de Phillips Petroleum como cadena principal
para la clonación.
Para reconstruir el vector de expresión
incluyendo los fragmentos mutagenizados, el fragmento de
SacI-XbaI de unos 770 pb modificado se ligó primero en
vector pHILD1 tratado con SacI-XbaI. Se confirmó
después la integridad de la construcción recombinante por análisis
de restricción y análisis de la secuencia de ADN usando el cebador
de determinación de secuencia oligonucleótido
(5'-GCGCATTGTTAGATTTC-3'), SEQ ID
16, y se denominó a la construcción vector intermedio 1. El
fragmento de SacI-SacI modificado se clonó a
continuación en el vector intermedio 1 que se había tratado con
SacI y fosfatasa intestinal de becerro. La construcción
resultante, denominada vector intermedio 2, se confirmó de nuevo por
análisis de restricción y análisis de la secuencia de ADN con los
cebadores oligonucleótidos
(5'-GGAAATCTCATAGATCT-3'), SEQ ID
17, para leer a través del lugar de HindIII suprimido y
(5'-GCTAATGCGGAGGATGC-3'), SEQ ID
18, para leer a través de la región líder no traducida 5'
optimizada. El vector intermedio 2 es un homólogo de pHILD1 que
carece de los lugares de HindIII no deseados, tiene una
región no traducida 5' optimizada, contiene secuencias que codifican
las señales de secreción de factor alfa de S. cerevisiae,
seguidas por el lugar de HindIII restante y que tiene un
lugar de BamHI 3' hacia el lugar de HindIII para
permitir la clonación del gen de B2M.
Un fragmento de Hinc11 de 1.200 pb que
contenía la cassette de canamicina mutagenizada se separó del vector
de mutagénesis M13 mp19 (usado para separar el lugar de Hind
III del gen de resistencia a canamicina) y se clonó en el lugar de
Nae 1 único del vector intermedio 2.El vector se volvió a
denominar pLHD4. La integridad de pLHD4 se confirmó por análisis de
restricción. Un mapa de pLHD4 se muestra en la Figura 3. El pLHD4
contiene el gen de EGF humano fusionado a la señal de secreción de
S. cerevisiae.
El vector de expresión final para expresión de B2
microglobulina se construyó clonando el fragmento de Hind
III-Bam HI del ejemplo 2 en pLHD4. (Este fragmento de
Hind III-Bam HI de 320 pb contiene el gen de B2M
fusionado al extremo 3' de una secuencia que codifica los 5
aminoácidos del factor alfa de levadura que precede al lugar de
división de KEX2 requerido para liberación del péptido maduro tras
la secreción desde el hospedante Pichia).
El fragmento de Hind III-Bam H1 se
obtuvo por digestión con restricción del vector de expresión de
S. cerevisiae pSW6 B2M. Este fragmento se purificó en un gel
de agarosa de baja temperatura de fusión del 1,5% y se ligó después
a Hind III-Bam H1, y pLHD4 tratado con fosfatasa
intestinal de becerro. El recombinante resultante se denominó pLH15.
El vector se muestra en la Figura 4. (En este momento, el gen de
resistencia a canamicina era defectuoso, debido a una supresión de
bases entonces desconocida, que tuvo lugar durante la mutagénesis
para suprimir el lugar de Hind III interno. Un fragmento de
Sac I-Xba I de unas 2.070 pb se separó de la
construcción resultante y se clonó en el vector de expresión pHILD4,
confiriendo así resistencia a canamicina). La integridad de la
construcción se confirmó por análisis de restricción y análisis de
determinación de secuencia usando el cebador de determinación de
secuencia (5'-GCATTCTGACATCCTCT-3'),
SEQ ID 19.
Los vectores de expresión usados para este
trabajo se derivaron del vector de expresión de Phillips Petroleum
pHILS1 (Figura 5).
El vector de expresión de partida para
manipulación fue el vector lanzadera de Pichia pastoris
pHILS1 (obtenible bajo licencia de Phillips Petroleum) capaz de
propagación en E. coli (por facilidad de manipulación
genética) y en la levadura metilotrópica Pichia pastoris.
Contiene la secuencia líder de Pho 1 del gen de fosfatasa ácida de
Pichia pastoris. Contiene también secuencias del vector de
E. coli pBR322 y secuencias derivadas del genoma de Pichia
pastoris. Los aspectos esenciales son la región 5' del gen de
AOX que incluye el promotor AOX regulable con metanol para
transcripción de alto nivel, la región 3' del gen de AOX que
contiene la secuencia terminadora transcripcional de alcohol
oxidasa, una región adicional de la región 3' que, junto con la
región de AOX 5', se requiere para integración dirigida por el lugar
en la cassette de expresión en el cromosoma. El gen de histidinol
deshidrogenasa de Pichia HIS4 se lleva y usa para
complementar la copia defectuosa del gen his4 defectuoso en el
genoma del hospedante. Se lleva el gen de resistencia a ampicilina
para permitir la selección en el hospedante E. coli usado
durante la manipulación genética.
El vector pHILS1 se manipuló para permitir la
expresión del gen de B2M bajo el control de la señal de secreción de
Pho 1:
El gen que codifica B2M se clonó en el vector
pHILSI del vector de expresión de S. cerevisiae pSW6 que
contiene el gen como un fragmento de HindIII-BamHI
(Ejemplo 2). El extremo sobresaliente del fragmento de ADN en el
lugar de HindIII se llenó primero para crear un extremo romo
usando el fragmento de Klenow de polimerasa I de ADN junto con los
trifosfatos de desoxinucleótidos requeridos según una metodología
estándar. El vector pHILSI se restringió con las endonucleasas de
restricción EcoR1 y Bam H1. El extremo sobresaliente
del fragmento de ADN y el lugar de EcoRI se llenaron como se
ha descrito antes para crear un extremo romo. El gen de B2M, como un
lugar de BamHI de extremo romo se clonó en el vector tratado
con BamHI de extremo romo. La integridad del vector
resultante, vector intermedio 3, se confirmó por análisis de
restricción.
El fragmento de HindIII-BamHI del
vector de expresión pSW6 contiene el gen de B2M fusionado en el
extremo 3' hacia los últimos 5 aminoácidos del factor alfa de
levadura que precede al lugar de división de KEX2 requerido para
liberacióndel péptido maduro tras secreción del hospedante Pichia
pastoris cuando se usa la secuencia del factor alfa. Esta
secuencia y unas pocas bases en el lugar de clonación se suprimieron
para permitir la fusión directa de la secuencia líder de Pho 1 y el
gen de B2M. La secuencia suprimida es
(5'-CGAGAATTAGCTTGGATAAAAGA-3'), SEQ
ID 20.
\newpage
Un fragmento de SacI-BamHI de unos
1.150 pb (SstI) se aisló del vector intermedio 3 y se clonó
en el vector M13mp18. Este fragmento contiene 700 pb de la secuencia
del promotor AOX 5', la secuencia señal de Pho1 y el gen de B2M. La
construcción M13 se usó después para mutagénesis a fin de suprimir
la secuencia que interviene entre la secuencia de Pho1 y el gen de
B2M. El cebador oligonucleótido usado para mutagénesis fue
(5'-GGAGTACGCTGGATAGCGAAGACAGATTG-3'),
SEQ ID 21. Los mutantes se identificaron por análisis de secuencia
usando el cebador de determinación de secuencia
(5'-CCATTCTCTGCTGGATG-3'), SEQ ID
22. La secuencia de Pho1/B2M se muestra en la Figura 6, SEQ ID
23.
El vector se reconstruyó usando el vector de
expresión pLH15 (Ejemplo 3(5)) como cadena principal para la
clonación. El vector se restringió con las endonucleasas de
restricción (Sst) SacI y BamHI para liberar un
fragmento de unos 1.150 pb que contenía un fragmento de 700 pb de la
secuencia del promotor AOX 5' y la secuencia señal de factor alfa
fusionados al gen de B2M, que se sustituyó después por el fragmento
de (Sst) SacI-BamHI mutagenizado que contenía un
fragmento de 700 pb de la secuencia del promotor AOX 5', la
secuencia señal de Pho1 fusionada al gen de B2M. El recombinante
resultante se denominó pLH46. El vector se muestra en la Figura 6.
La integridad de la construcción se confirmó por análisis de
restricción usando el cebador de determinación de secuencia
(5'-GCATTCTGACATCCTCT-3'), SEQ ID
24.
El vector de expresión pGC633 contiene el gen que
codifica B2M fusionado en el extremo 5' al epítope de virus de
Sendai (Kast et al Proc. Natl. Acad. Sci. 88,
2283-2287 (1991)) mediante un enlazador corto. La
secuencia epítope/enlazador péptido fusionada a la secuencia de B2M
es FAPGNYPALGGGGG, SEQ ID 25. Los aminoácidos subrayados
constituyen la secuencia enlazadora, diseñada para extenderse sobre
el espacio entre el péptido y la B2M con disrupción mínima a la
conformación de la cadena ligera.
El vector de expresión pLH46 (Ejemplo 3) se
restringió con las endocucleasas de restricción SacI
(SstI) y BamHI para liberar un fragmento de unos 1.150
pb que contenía un fragmento de 700 pb de la secuencia del promotor
AOX 5', la secuencia señal de Pho1 fusionada al gen de B2M. Este
fragmento se clonó en M13mp18 que se había restringido con
SacI (SstI) y BamHI. Se usó después para
mutagénesis la construcción de M13 a fin de insertar la secuencia
que codifica el péptido de Sendai. El cebador oligonucleótido usado
para mutagénesis fue
(5'-GGAGTACGCTGGATACCACCACCACCACCCAAAGCTGGGTAGTTACCTGGAGCGAAAGCGAAGZCAGATT-3'),
SEQ ID 26. Los mutantes se identificaron por analisis de secuencia
usando el cebador de determinación de secuencia
(5'-CCATTCTCTG-
CTGGATG-3'), SEQ ID 27.
CTGGATG-3'), SEQ ID 27.
Se reconstruyó el vector usando el vector de
expresión pLH46 (Ejemplo 3) como cadena principal para la clonación.
El vector se restringió con las endocucleasas de restricción
SacI (SstI) y BamHI para liberar un fragmento
de unos 1.150 pb que contenía un fragmento de 700 pb de la secuencia
del promotor AOX 5', la secuencia señal de Pho1 fusionada al gen de
B2M, y se sustituyó por el fragmento mutagenizado. Se confirmó la
integridad de la construcción por análisis de restricción y análisis
de determinación de secuencia usando el cebador de determinación de
secuencia (5'-GCATTCTGACATCCTCT-3'),
SEQ ID 28.
El vector de expresión pGC638 contiene el gen que
codifica B2M fusionado en el extremo 5' al epítope del virus de la
influenza (Current Biology, 3, Nº 12 1993).. La secuencia
epítope/enlazador péptido fusionada a la secuencia de B2M es
GILGFVFTLGGGGGGSSS, SEQ ID 29. Los aminoácidos subrayados
constituyen la secuencia enlazadora, diseñada para extenderse sobre
el espacio entre el péptido y la B2M con disrupción mínima a la
conformación de la cadena ligera.
El vector de expresión pLH46 (Ejemplo 3) se
restringió con las endocucleasas de restricción SacI
(SstI) y BamHI para liberar un fragmento de unos 1.150
pb que contenía un fragmento de 700 pb de la secuencia del promotor
AOX 5', la secuencia señal de Pho1 fusionada al gen de B2M. Este
fragmento se clonó en M13mp18 que se había restringido con
SacI (SstI) y BamHI. Se usó después para
mutagénesis la construcción de M13 para insertar la secuencia que
codifica el péptido de Sendai. El cebador oligonucleótido usado para
mutagénesis fue (5'-GGAGTACGCTGGATAGAA-
GAACCACCACCGACCACCACCACCACCACCCAAAGTGAAAACGAAACCCAAAATACCAGCGAAGACAG-
ATT-3'), SEQ ID 30. Los mutantes se identificaron por análisis de secuencia usando el cebador de determinación de secuencia (5'-CCATTCTCTGCTGGATG-3'), SEQ ID 27.
GAACCACCACCGACCACCACCACCACCACCCAAAGTGAAAACGAAACCCAAAATACCAGCGAAGACAG-
ATT-3'), SEQ ID 30. Los mutantes se identificaron por análisis de secuencia usando el cebador de determinación de secuencia (5'-CCATTCTCTGCTGGATG-3'), SEQ ID 27.
Se reconstruyó el vector usando el vector de
expresión pLH46 (Ejemplo 2) como cadena principal para la clonación.
El vector se restringió con las endonucleasas de restricción
SacI (SstI) y BamHI para liberar un fragmento
de unos 1.150 pb que contenía un fragmento de 700 pb de la secuencia
del promotor AOX 5', la secuencia señal de Pho1 fusionada al gen de
B2M, y se sustituyó por el fragmento mutagenizado. Se confirmó la
integridad de la construcción por análisis de restricción y análisis
de determinación de secuencia usando el cebador de determinación de
secuencia (5'-GCATTCTGACATCCTCT-3'),
SEQ ID 31.
Se linealizó ADN de cada uno de los plásmidos
pGC633 y pGC638 (Ejemplos 4 y 5) cortando con la endonucleasa de
restricción Sac I. Esto fue para permitir que se integrase la
cassette de expresión mediante recombinación homóloga de secuencias
en la cassette de expresión y el cromosoma del hospedante. En cada
caso, se transformó después el plásmido linealizado en cepa GS115 de
P. pastoris (NRRL Y-1585) que tiene el
genotipo his 4. El uso de esta cepa no es crítico para
utilizarla en esta preparación o en la invención en general. Puede
usarse cualquier cepa adecuada, tal como, por ejemplo, las cepas
SMD1163 y KM71, que tienen los genotipos his4, prB1,
pep4 e his4, aox1::SARG4. Las cepas GS115 y
KM71 se describen en la patente de Phillips número
AU-B-63882/86 (Modificación genómica
selectiva para el lugar de levadura del género Pichia).
Los plásmidos se linealizaron con SacI y se
usaron para transformar la cepa hospedante. La cepa de levadura
GS115 se desarrolló durante la noche en 200 ml de YEPD a 30ºC en un
sacudidor orbital. Se cosecharon los cultivos con A600 entre 1,3 y
1,5 por centrifugación a 3.000 rpm durante 5 min, se lavaron en agua
estéril enfriada con hielo, se recentrifugaron y se resuspendieron
en 8 ml de sorbitol 1 M enfriado con hielo. Se añadieron 40 \mul
de células a 1 \mug de ADN linealizado en una cubeta de
electroporación de 0,2 cm enfriada con hielo. Después de 5 min en
hielo, se pulsaron las células usando la unidad impulsadora de genes
BioRad a 25 \muF, 1,5 kv y 400 ohmios. Se añadió a la cubeta 1 ml
de sorbitol 1 M enfriado con hielo. Se pusieron en placas de agarosa
400 \mul de esto y se dejó crecer durante 2-4 días
a 30ºC.
Todos los medios de levadura y tampones de
transformación fueron como se describe en el apéndice.
Se recogieron transformantes junto con la capa
superpuesta de agarosa que se había desarrollado, se transfirieron a
un tubo de centrífuga de 50 ml y se resuspendieron en tampón de
fosfato sódico 50 mM pH 6. Después de un mezclado y agitación
adecuados para separar las células de la agarosa, se diluyeron y
pusieron en placas de agar YEPD que contenían el antibiótico G418 en
concentraciones entre 0 y 2.000 \mug/ml. Sólo las células en las
que se habían integrado en el cromosoma del hospedante varias copias
de la cassette de expresión serían capaces de crecer en altos
niveles de antibiótico en virtud de las varias copias del gen de
resistencia a canamicina que llevarían. Tales células se consideran
deseables porque llevarán también varias copias del gen de B2M. El
trabajo previo ha mostrado que tales integrantes multicopias son
altos productores en condiciones en las que se expresa el gen
extraño (Clare, J.J., Rayment, F.B., Ballantine, S.P., Sreekrishna,
K. y Romanos, M.A., BIO/TECHNOLOGY, 9,
455-460, 1991). Las placas se incubaron a 30ºC
durante 5-7 días. Se recogieron después colonias que
tenían lugar en placas que contenían altas concentraciones del
antibiótico y se estriaron sobre placas de agar MD reciente. Se
obtuvieron colonias simples después de 3-4 días de
crecimiento a 30ºC.
En experimentos separados, se usaron colonias
simples de cepas transformadas que albergaban pGC633 y
(separadamente) pGC638 para inocular 5 ml de medio BMGC y se
desarrollaron los cultivos durante la noche a 30ºC en un sacudidor
orbital. Este cultivo nocturno de 5 ml se usó después para inocular
matraces de sacudidas tabicados de 2 l que contenían 50 ml del medio
BMGC. Después de 24 h de crecimiento a 30ºC en un incubdor orbital,
se cosecharon células por centrifugación a 3.000 rpm durante 5 min y
se resuspendieron en 50 ml del medio BMGC. Esto induce la expresión
genética a partir del promotor AOX1. Se realizó la inducción por
crecimiento en el medio que contenía metanol a 30ºC durante 48
horas. Después de 24 horas, se añadieron al matraz 250 \mul de
metanol estéril para sustituir la pérdida por evaporación.
Después de 48 horas, se recogió el sobrenadante
de cultivo por centrifugación a 3.000 rpm durante 5 min. Se usó el
sobrenadante para análisis adicional. Se estimó por
SDS-PAGE que los niveles de producción de cepas con
la secuencia líder de factor alfa eran del orden de 150 mg/l.
Se inmunizaron subcutáneamente ratones C57BL/6
(H-2^{b}) con 50, 10, 2 o 0,4 \mug de la
proteína de fusión de Sendai NP-B2M híbrida
expresada por pGC633 según el ejemplo 7, o 50 \mug de B2M más 20
ng del epítope de Sendai NP (FAPGNYPAL)- parte de SEQ ID 9. Después
de 6 días, se separaron los bazos de dos ratones por grupo y una
suspensión de células simples preparada que se reestimuló in
vitro con el péptido de Sendai NP. Después de 24 horas, se
añadió 2% de una preparación de IL2. Después de 7 días de
reestimulación in vitro, se ensayó la capacidad de estas
células efectoras para lisar células objetivo de péptido de Sendai
NP-EL4 (H-2^{b}) pulsado. Las
relaciones de células efectoras (E) a objetivo (T) fueron 100:1,
33,3:1, 11,1:1 y 3,7:1. Los resultados de este ensayo se registraron
como % de lisis no específica, que se calcula sustrayendo la lisis
de objetivos no pulsados con péptido de la obtenida usando objetivos
pulsados con péptido.
Los resultados se representan en la Figura 7. Se
vio una lisis específica del péptido del 24,4% con una relación ET
de 100:1 tras la inmunización con 50 \mug de la proteína de
fusión. Todas las dosis de inmunización de la proteína de fusión
dieron respuestas similares a las obtenidas inmujnizando con una
mezcla de B2M y péptido de Sendai NP.
BMGC
Cantidades por litro:
Tampón de fosfato sódico 1 M, pH 6 | 100 ml | |
Casaminoácidos (100 g/l) | 100 ml | |
Base de nitrógeno de levadura (13,4 g/l) | 100 ml | |
Biotina (0,5 g/l) | 2 ml | |
Glicerol | 10 ml |
Esterilizar con filtro
BMMC
Como antes, pero sustituir glicerol por 5 ml de
metanol
YEPD
Extracto de levadura | 10 g/l | |
Peptona | 20 g/l | |
Glucosa | 10 g/l |
Para medio sólido, añadir 15 g/l de agar.
Autoclave a 121ºC 15 min.
Claims (22)
1. Una proteína de fusión de B2M que comprende
una primera secuencia de aminoácidos antígena fusionada directa o
indirectamente al término N de una segunda secuencia de aminoácidos
al menos 60% homóloga a
beta-2-microglobulina (B2M) o una
secuencia que retenga al menos el 60% de sus residuos,
caracterizada porque la primera secuencia de aminoácidos
antígena corresponde a una secuencia derivada de, o asociada con, un
tumor o un agente etiológico, de uso como vacuna profiláctica o
inmunoterapéutica.
2. Una proteína de fusión según la reivindicación
1ª, en la que la segunda secuencia de aminoácidos es la de B2M de
origen natural.
3. Una proteína de fusión según la reivindicación
1ª, en la que el agente etiológico es un microorganismo tal como un
virus, bacteria, hongo o parásito.
4. Una proteína de fusión según la reivindicación
3ª, en la que el virus es un retrovirus, tal como
HIV-1, HIV-2,
HTLV-I, HTLV-II,
HTLV-III, SIV, BIV, LAV, ELAV, CIAV, virus de
leucemia de ratón, virus de leucemia de ratón de Moloney y virus de
leucemia de felino; un ortomixovirus, tal como influenza A o B; un
paramixovirus, tales como virus de parainfluenza, paperas,
sarampión, RSV y virus de Sendai; un papovavirus, tal como HPV; un
arenavirus, tal como LCMV de seres humanos o ratones; un
hepadnavirus, tal como virus de Hepatitis B; un virus de herpes, tal
como HSV, VZV, CMV o EBV.
5. Una proteína de fusión según la reivindicación
3ª, en la que la secuencia antígena se deriva de una bacteria, tal
como del género Neisseria, Campyobacter, Bordetella, Listeria,
Mycobacteria o Leishmania, o un parásito, tal como del género
Trypanosoma, Schizosoma, Plasmodium, especialmente P.
falciparum, o de un hongo, tal como del género Candida,
Aspergillus, Cryptococcus, Histoplasma o Blastomyces.
6. Una proteína de fusión según la reivindicación
1ª, en la que la secuencia antígena es un antígeno de tumor humano
proteímico, tal como un antígeno asociado con melanoma, o un
antígeno asociado con tumor epitelial tal como de carcinoma de pecho
o colon.
7. Una proteína de fusión según la reivindicación
3ª, en la que la secuencia antígena es un epítope de:
1) gp 120 de HIV (particularmente
HIV-1),
2) 24 de HIV (particularmente
HIV-1),
3) gpI, gpII y gpIII de VZV,
4) nucleoproteína de LCMV,
5) nucleoproteína del virus de la influenza,
6) proteínas L1 y L2 de HPV,
7) virus de papiloma humano E5 y E7,
8) antígenos de CSP o RESA de malaria,
9) p6 de micobacteria,
10) antígeno asociado con tumor epitelial GA
733-2,
11) secuencia de repetición de
MUC-1 de antígeno asociado con tumor epitelial,
12) antígenos de melanoma
MZ2-E,
13) antígeno asociado con melanoma p97.
8. Una proteína de fusión según la reivindicación
3ª, en la que la secuencia antígena es un epítope del tercer dominio
variable de una proteína de envoltura de un lentivirus.
9. Una proteína de fusión según alguna de las
reivindicaciones precedentes, en la que la secuencia antígena está
fusionada a la B2M mediante una secuencia enlazadora.
10. El uso de una proteína de fusión de B2M según
una cualquiera de las reivindicaciones 1ª-9ª, en la preparación de
una vacuna profiláctica o inmunoterapéutica.
11. Una proteína de fusión híbrida que comprende
una primera secuencia de aminoácidos antígena fusionada directa o
indirectamente al término N de una segunda secuencia de aminoácidos
al menos 60% homóloga a
beta-2-microglobulina (B2M) o una
secuencia que retenga al menos el 60% de sus residuos,
caracterizada porque la primera secuencia de aminoácidos
antígena corresponde a una secuencia derivada de, o asociada con, un
tumor o un agente etiológico, distinta de la secuencia señal de
E. coli OmpA, MKKTAIAIAVALAGFATVAQA.
12. Una proteína de fusión según la
reivindicación 11ª, en la que la proteína de fusión es como se ha
definido en una cualquiera de las reivindicaciones 2ª a 9ª.
13. Un ácido nucleico que codifica una proteína
de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 9ª o 11ª
a 12ª.
14. Un vector que incluye ácido nucleico según la
reivindicación 13ª.
15. Una célula hospedante que lleva un vector
según la reivindicación 14ª.
16. Una célula hospedante según la reivindicación
15ª, en la que la célula hospedante es E. coli.
17. Una célula hospedante según la reivindicación
15ª, en la que la célula hospedante es una célula de levadura tal
como Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris.
18. Células hospedantes según la reivindicación
15ª, en las que la célula hospedante es una célula de insecto tal
como Spodoptera frugiperda SF9, o células de mamífero
incluyendo células de ovario de hámster chino (CHO), linajes
celulares de mieloma de ratón tales como
P3X63-Ag8.653, células COS, células HeLa, células
BHK, linajes celulares de melanoma tales como el linaje celular de
Bowes, células L de ratón, linales celulares de hepatoma humano
tales como Hep G2, fibroblastos de ratón y células NIH 3T3 de
ratón.
19. Una formulación farmacéutica o veterinaria
que comprende una proteína de fusión de B2M según una cualquiera de
las reivindicaciones 1ª a 9ª o 11ª a 12ª y un excipiente aceptable
farmacéutica o veterinariamente.
20. Una formulación farmacéutica o veterinaria
según la reivindicación 19ª, que comprende además una vacuna
subunitaria diseñada para inducir buenas respuestas de anticuerpos
neutralizantes.
21. Un método para producir una proteína de
fusión de B2M según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 9ª o
11ª a 12ª, cultivando una levadura metilotrópica que alberga un
vector de expresión que comprende ADN que codifica la proteína de
fusión pertinente, y recuperando la proteína de fusión
expresada.
22. Un método según la reivindicación 21ª, en el
que la levadura es Pichia pastoris.
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