ES2251734T3 - Genes sinteticos de hiv. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A MOLECULAS SINTETICAS DE ADN QUE CODIFICAN PARA GENES DE VIH Y PARA MODIFICACIONES DE DICHOS GENES. LOS CODONES DE LAS MOLECULAS SINTETICAS UTILIZAN CODONES PREFERIDOS POR LA CELULA HUESPED PROYECTADA. DICHAS MOLECULAS SINTETICAS SE PUEDEN UTILIZAR COMO UNA VACUNA POLINUCLEOTIDICA QUE PROPORCIONA INMUNOPROFILAXIS EFECTIVA FRENTE A LA INFECCION POR VIH, MEDIANTE LA NEUTRALIZACION DE LOS ANTICUERPOS Y DE LA INMUNIDAD MEDIADA POR CELULAS.

Description

Genes sintéticos de HIV.

Referencias cruzadas con las solicitudes relacionadas

Esta es una solicitud no provisional relacionada con el Documento de los Estados Unidos con Nº de Serie 60/
012.082, presentado el 22 de Febrero de 1996.

Campo de la invención

Vacunas HIV

Antecedentes de la invención 1. Infección por HIV

El Virus-1 de la Inmunodeficiencia humana (HIV-1) es el agente etiológico del síndrome de inmuno deficiencia humana adquirida (SIDA) y los transtornos relacionados. El HIV-1 es un virus ARN de la familia Retroviridae y presenta la organización 5'LTR-gag-pol-env-LTR3' de todos los retrovirus. De manera adicional, el HIV-1 comprende un puñado de genes con funciones regulatorias o desconocidas, que incluyen los genes tat y rev. El gen env codifica la envoltura de glicoproteína vírica que se traduce en forma de un precursor de 160 kilodalton (kDa) (gp160) y que a continuación se rompe mediante una proteasa celular para dar como resultado la envoltura de glicoproteína (gp120) externa de 120 kDa y la envoltura de glicoproteína (gp41) transmembrana de 41 kDa. Gp120 y gp41 permanecen asociadas, y se despliegan sobre las partículas víricas y la superficie de las células infectadas por HIV. Gp120 enlaza con el receptor CD4 presente sobre la superficie de los linfocitos T auxiliares, los macrófagos y otras células diana. Después que la gp120 se enlaza con el CD4, la gp41 media la fusión siendo incluso responsable de la entrada del virus.

La infección comienza cuando la gp120 sobre las partículas víricas se enlaza con el receptor CD4 en la superficie de los linfocitos T4 u otras células diana. El virus enlazado se fusiona con la célula diana y transcribe de manera inversa su genoma de ARN en el ADN de doble hélice de la célula. El ADN vírico se incorpora al material genético en el núcleo de la célula, donde el ADN vírico dirige la producción del nuevo ARN vírico, las proteínas víricas y las nuevas partículas de virus. Las nuevas partículas brotan desde la membrana de la célula diana, e infectan otras células.

La destrucción de los linfocitos T4, que son críticos para la defensa inmune, es la causa principal de la disfunción inmune progresiva que es la marca característica de la infección por HIV. La pérdida de células diana perjudica de manera grave la capacidad del cuerpo para combatir a la mayor parte de invasores, pero tiene un impacto grave de manera particular en las defensas frente a los virus, hongos, parásitos y algunas bacterias, entre las que se incluyen mycobacteria.

El HIV-1 mata las células que infecta mediante replicación, salida de las mismas y daño de la membrana celular. El HIV-1 puede matar las células diana mediante la gp120 vírica que se muestra sobre la superficie de una célula infectada. Puesto que el receptor CD4 de las células T tiene una fuerte afinidad por la gp120, las células sanas que muestran el receptor CD4 se pueden enlazar con la gp120 y fusionarse con células infectadas para formar un sincitio. Un sincitio no puede sobrevivir.

El HIV-1 puede también excitar las defensas normales de las células inmunes frente a las células infectadas. Con o sin ayuda de los anticuerpos, las células defensivas citotóxicas pueden destruir una célula infectada que muestra proteínas víricas en su superficie. Finalmente, la gp120 libre puede circular por la sangre de los individuos infectados con HIV-1. La proteína libre puede enlazarse con el receptor CD4 de las células no infectadas haciéndolas aparecer como infectadas y evocar la respuesta inmune.

La infección con HIV-1 es casi siempre fatal, y en la actualidad no existe cura para la infección por HIV-1. Todavía no están disponibles vacunas efectivas contra la infección por HIV-1. Debido al peligro de inversión o de infección, no se pueden usar probablemente virus vivos atenuados como vacuna. La mayor parte de soluciones con subunidades de vacuna no han resultado útiles en la prevención de una infección por HIV. Los tratamientos de la infección por HIV-1, aunque prolongan la vida de algunas personas infectadas, muestran importantes efectos secundarios. Existe por tanto una gran necesidad de tratamientos y vacunas efectivos para combatir esta infección letal.

2. Vacunas

La vacunación es una forma efectiva de prevenir enfermedades y se ha demostrado que tiene éxito contra algunos tipos de infección vírica. Determinar la forma de presentar antígenos HIV-1 al sistema inmunológico humano, con el fin de excitar inmunidad humoral y celular protectora, es una tarea difícil. Hasta la fecha, los intentos de generar una vacuna efectiva contra HIV no han tenido éxito. En los pacientes de SIDA los virus libre sólo están presentes en bajas cantidades. La transmisión de HIV-1 se estimula por interacción intercelular, por fusión y formación de sincitios. Por tanto, los anticuerpos generados frente a virus libres o subunidades víricas resultan por lo general ineficaces para eliminar las células infectadas por virus.

Las vacunas explotan la capacidad del cuerpo de "recordar" un antígeno. Después de los primeros encuentros con un antígeno dado, el sistema inmune genera células que retienen un recuerdo inmunológico del antígeno durante toda la vida del individuo. La exposición posterior al antígeno estimula la respuesta inmune, es decir, que da como resultado la eliminación o inactivación del patógeno.

El sistema inmune se enfrenta a los patógenos en dos formas: mediante respuestas humorales y mediadas por células. En la respuesta humoral, los linfocitos generan anticuerpos específicos que se enlazan con el antígeno inactivando de esta manera el patógeno. La respuesta mediada por células implica linfocitos T citotóxicos y auxiliares que atacan y destruyen de forma específica las células infectadas.

El desarrollo de vacunas con virus HIV-1 presenta problemas debido a que los HIV-1 infectan algunas de las mismas células del sistema inmunológico que la vacuna necesita activar (es decir, los linfocitos T4). Sería ventajoso desarrollar una vacuna que desarrolle una vacuna que inactive el HIV antes que se produzca el desequilibrio del sistema inmunológico. Una tipo de vacuna de HIV particularmente adecuada generaría una respuesta inmune anti-HIV que reconocería las variantes del HIV y que funcionaría en individuos HIV positivos al inicio de su infección.

Un desafío principal para el desarrollo de vacunas frente a virus, de forma particular aquellos que tienen una tasa de mutaciones muy elevada, tal como el virus de la inmunodeficiencia humana, contra la que sería deseable la excitación de respuestas neutralizantes y protectoras, es la diversidad de proteínas de envoltura vírica entre las diferentes cepas o aislados víricos. Puesto que los linfocitos T citotóxicos (CTL) tanto de ratones como de seres humanos son capaces de reconocer epitopos derivados de proteínas víricas internas preservadas, y se cree que son importantes en la respuesta inmune frente al virus, se han dirigido los esfuerzos al desarrollo de vacunas CTL capaces de proporcionar protección heteróloga frente a diferentes cepas víricas.

Se sabe que los CTL CD8^{+} matan las células infectadas con virus cuando sus receptores de células T reconocen péptidos víricos asociados con las moléculas MHC de clase 1. Los péptidos víricos se derivan de proteínas víricas sintetizadas por vía endógena, sin tener en cuenta la localización o función de la proteína frente al virus. De esta forma, debido al reconocimiento de los epitopos procedentes de las proteínas víricas preservadas, los CTL pueden proporcionar protección de cepa cruzada. Los péptidos capaces de asociarse con las MHC de clase I para el reconocimiento de CLT se originan a partir de proteínas que están presentes o de paso a través del citoplasma o del retículo endoplasmático. Por lo general, las proteínas exógenas que entran en la ruta de procesado endosómico (como es el caso de los antígenos que presentan las moléculas MHC de clase II), no son efectivos para generar respuestas CTL CD8^{+}.

La mayor parte de los esfuerzos para generar respuestas CTL han usado vectores replicantes para producir el antígeno de la proteína en el interior de la célula, o se han centrado en la introducción de péptidos en el citosol. Estas soluciones tienen limitaciones que pueden reducir su utilidad como vacunas. Los vectores retrovirales muestran restricciones en el tamaño y estructura de los péptidos que pueden expresar en forma de proteínas de fusión a la vez que mantienen la capacidad del virus recombinante para replicarse, y la eficacia de vectores tales como vaccinia para posteriores inmunizaciones puede quedar comprometida por las respuestas inmunes frente a los propios vectores. Igualmente, los vectores víricos y los patógenos modificados tienen riesgos inherentes que pueden prohibir su uso en seres humanos. Además, la selección de epitopos de péptido a presentar depende de la estructura del antígeno MHC del individuo y, por tanto, las vacunas de péptido pueden tener eficacia limitada debida a la diversidad haplotipos de MHC en poblaciones no consanguíneas.

3. Vacunas de ADN

Benvenisty, N., y Reshef, L. [PNAS 83, 9551-9555, (1986)] demostraron que se podía expresar el ADN precipitado con CaCl_{2} introducido en ratones por vía intraperitoneal (i.p.) intravenosa (i.v.) o intramuscular (i.m.). La inyección i.m. de vectores de expresión de ADN sin el tratamiento con CaCl_{2} en ratones, dio como resultado la captación de ADN por las células musculares, y la expresión de la proteína codificada por el ADN. Los plásmidos se mantuvieron de manera episomal y no se replicaron. Posteriormente se observó expresión persistente tras inyección i.m. en el músculo esquelético de ratas, peces y primates y en el músculo cardíaco de ratas. La técnica de utilizar ácidos nucleicos como agentes terapéuticos se describe en el Documento WO 90/11092 (4 de Octubre de 1990), en el que se usan polinucleótidos desnudos para vacunar vertebrados.

No es necesario para el éxito del procedimiento que la inmunización sea intramuscular. La introducción de microproyectiles de oro recubiertos con ADN que codifica la hormona de crecimiento bovina (BGH) en la piel de los ratones dio como resultado la producción de anticuerpos anti BGH en el ratón. Se utilizó un inyector de chorro para transfectar los tejidos de piel, músculo, grasa y mamarios de los animales vivos. Se han revisado los procedimientos para introducir ácidos nucleicos. Zhu y col. demostraron que la inyección intravenosa de un complejo ADN:liposoma catiónico en ratones daba como resultado la expresión sistémica de un transgen clonado [Science 261:209-211 (9 de Julio de 1993). Ulmer y col., [Science 259:1745-1749, (1993)] informaron de la protección heteróloga frente a la infección del virus de la gripe por inyección intramuscular de ADN que codificaba proteínas del virus de la gripe.

La necesidad de agentes terapéuticos y profilácticos específicos capaces de excitar respuestas inmunes deseadas frente a patógenos y antígenos tumorales se consigue mediante la presente invención. De particular importancia en esta solución terapéutica es la capacidad de inducir respuestas inmunes de las células T que pueden evitar infecciones o enfermedades causadas incluso por cepas de virus que son heterólogas de la cepa a partir de la cual se ha obtenido el gen del antígeno. Esto es de particular interés cuando se trata con un virus como el HIV, del que se sabe que muta rápidamente y del que se han aislado muchos aislados virulentos [véase por ejemplo, LaRosa y col., Science 249:932-935 (1990), que identifica 245 aislados distintos de HIV]. En respuesta a esta diversidad reconocida, los investigadores han intentado generar CTL basados en la inmunización de péptidos. De esta forma, Takahashi y col., [Science 255;333-336 (1992] han informado de la inducción de células T citotóxicas con amplia reactividad cruzada que reconocen un determinante de cubierta de HIV (gp160). Sin embargo, estos investigadores reconocieron la dificultad de conseguir una respuesta CTL con reactividad cruzada verdadera, y sugieren que existe una dicotomía entre el cebado o reestimulación de células T que es muy riguroso, y el estímulo de la función del efector, incluyendo la citotoxicidad para CTL ya estimulados.

Wang y col., informaron acerca de la estimulación de respuestas inmunes en ratones frente a HIV por inoculación intramuscular con un gen HIV clonado genómico (no conectado). Sin embargo, el nivel de respuestas inmunes conseguido en estos estudios fue muy bajo. De manera adicional a Wang y col., el constructo utilizado como pieza esencialmente genómica de HIV codifica las secuencias que codifican Tat/REV-gp160-Tat/REV contiguos. Tal como se describe en detalle a continuación, este es un sistema subóptimo para obtener un nivel alto de expresión de la gp160. Esto es también potencialmente peligroso debido a que la expresión de Tat contribuye a la progresión del Sarcoma de Kaposi.

El Documento WO 93/17706 describe un procedimiento para la vacunación de un animal frente a un virus, en el que las partículas del vehículo se recubrieron con un constructo de gen y las partículas recubiertas se aceleraron hacia el interior de las células de un animal. Con relación al HIV, se propuso usar esencialmente el genoma entero, menos las repeticiones del extremo terminal de gran tamaño. Este procedimiento representa un riesgo sustancial para los pacientes. Se cree de manera general que los constructos de HIV deberían contener menos de aproximadamente el 50% del genoma de HIV para asegurar la seguridad de la vacuna; esto asegura que las fracciones enzimáticas y las proteínas reguladoras víricas, muchas de las cuales que tienen funciones desconocidas o mal comprendidas se han eliminado. De esta manera, quedan numerosos problemas si va a surgir una vacuna útil para el HIV humano a partir de la tecnología de liberación de genes.

La presente invención contempla cualquiera de los procedimientos conocidos para introducir polinucleótidos en el tejido vivo para inducir la expresión de las proteínas. Sin embargo, esta invención proporciona un inmunógeno nuevo para introducir HIV y otras proteínas en la ruta de procesado del antígeno para generar de manera eficiente CTL y anticuerpos específicos de HIV. El producto farmacéutico es efectivo como una vacuna para inducir respuestas inmunes neutralizantes anti HIV y HIV tanto celulares como humorales En esta presente invención, los problemas señalados anteriormente se dirigen y resuelven mediante el suministro de inmunógenos de polinucleótidos que, cuando se introducen en una animal, dirigen la expresión eficiente de las proteínas de HIV y los epitopos. Las respuestas inmunes generadas de esta manera son efectivas en el reconocimiento de HIV, en la inhibición de la replicación de HIV, en la identificación y muerte de las células infectadas con HIV, y presentan reactividad cruzada frente a muchas cepas de HIV.

4. Utilización del Códon y el Contexto del códon

Los emparejamientos de los códones de los organismos no son precisamente aleatorios, y difieren de organismo a organismo. Esta información se usa para construir y expresar genes alterados o sintéticos que tienen los niveles deseados de eficiencia de traducción, para determinar qué regiones en un genoma son regiones codificadoras de proteínas, para introducir los emplazamientos de pausa de traducción en genes heterólogos, y para determinar las relaciones o el origen ancestral de las secuencias de nucleótidos.

La expresión de genes heterólogos extraños en organismos transformados es en la actualidad cosa común. Se han insertado con éxito un gran número de genes de mamíferos, entre los que se incluyen, por ejemplo, murina y genes humanos, en organismos monocelulares. Las técnicas estándar a este respecto incluyen la introducción de genes extraños que se van a expresar en un vector tal como un plásmido o un fago, y utilizar este vector para insertar el gen en un organismo. Los promotores nativos de dichos genes se sustituyen de manera habitual con promotores fuertes compatibles con el huésped en el que el gen se inserta. La maquinaria de secuenciamiento de proteínas permite la elucidación de las secuencias de aminoácidos de incluso cantidades insignificantes de proteína nativa. A partir de estas secuencias de aminoácidos se pueden inferir las secuencias de ADN que codifican dichas proteínas. La síntesis de ADN es una técnica en rápido desarrollo, y se pueden construir fácilmente los genes sintéticos que corresponden a aquellas secuencias de ADN inferidas

A pesar del conocimiento naciente de los sistemas de expresión y el ADN recombinante, quedan obstáculos significativos cuando se intenta expresar un gen extraño o sintético en un organismo. Muchas proteínas activas nativas, por ejemplo, se glicosilan de manera diferente de la que se produce cuando se expresan en un huésped extraño. Por esta razón, se pueden preferir huéspedes eucariotas tales como levaduras a los huéspedes bacterianos para expresar muchos genes de mamíferos. El problema de la glicosilación continua siendo tema de investigación.

Otro problema se comprende peor. A menudo la traducción de un gen sintético, incluso cuando se acopla con un promotor fuerte, procede de manera mucho menos eficiente a la que cabría esperar. Esto último es especialmente verdadero para los genes exógenos extraños al organismo de expresión. Incluso cuando el gen se transcribe de manera suficientemente eficiente, de tal manera que se producen cantidades recuperables del producto de la traducción, la proteína está inactiva o distinta de cualquier manera en sus propiedades respecto de las de la proteína nativa.

Se reconoce que el último problema se debe de manera habitual a las diferencias en el plegado de la proteína en diversos organismos. La solución a este problema ha sido elusiva, y los mecanismos que controlan el plegado de la proteína son poco comprendidos.

Se cree que los problemas relacionados con la eficiencia de traducción están relacionados con el efecto de contexto del códon. La las regiones de los genes que codifican proteínas en todos los organismos están sujeta a una amplia variedad de restricciones funcionales, algunas de las cuales depende de los requerimientos para codificar una proteína que funciona de manera apropiada, así como a las señales de traducción apropiadas de inicio y detención. Sin embargo, se han discernido diversas características de las regiones que codifican la proteína que no son fácilmente comprensibles en los términos de estas restricciones. Dos tipos importantes de dichas características son aquellos que implican la utilización del códon y el contexto del códon.

Se sabe que la utilización del códon está muy sesgada y varía de manera considerable entre diferentes organismos. Se ha demostrado que los modelos de utilización del códon están relacionados con la abundancia relativa de isoaceptores del ARNt. Los genes que codifican proteínas de abundancia alta frente a baja muestran diferencias en sus preferencias por el códon. Ha sido ampliamente descrita la posibilidad de desviaciones en el uso de los codones que altera las velocidades de elongación de los péptidos. Aunque las diferencias en la utilización del códon se asocian con diferencias en las velocidades de traducción, los efectos directos de la elección de códon han sido difíciles de demostrar. Otras restricciones propuestas sobre los modelos de utilización del códon incluyen maximizar la fidelidad de la traducción y optimizar la eficiencia cinética de la síntesis de proteínas.

Aparte del uso no aleatorio de los codones, se ha acumulado evidencia considerables acerca de que el reconocimiento códon/anticódon está influenciado por secuencias externas al propio códon, un fenómeno denominado "contexto del códon". Existe una fuerte influencia de los nucleótidos cercanos sobre la eficiencia de la supresión de codones sin sentido así como codones con sentido incorrecto. Claramente, la abundancia de la actividad supresora en poblaciones bacterianas naturales, así como el uso de codones de "terminación" para codificar la selenocisteína y la fosfoserina requieren que la terminación sea dependiente del contexto. Se ha demostrado que los efectos de contexto similares influencian la fidelidad de la traducción, así como la eficiencia de la iniciación de la traducción.

Los análisis estadísticos de las regiones que codifican proteínas de E. coli han demostrado otra manifestación del "contexto del códon". La presencia de un códon concreto en una posición influencia fuertemente la frecuencia de incidencia de algunos nucleótidos en los codones vecinos, y estas restricciones del contexto difieren de manera marcada para los genes expresados a niveles altos frente a bajos. Aunque se ha reconocido el efecto contexto, el valor predictivo de las reglas estadísticas que relacionan los nucleótidos preferidos adyacentes a los codones es relativamente bajo. Esto ha limitado la utilidad de dichos datos de preferencia de nucleótidos para seleccionar codones para efectuar los niveles deseados de eficiencia de traducción.

La llegada de los equipos de secuenciamiento automatizado de nucleótidos ha hecho que se disponga de grandes cantidades de datos de secuencias para una amplia variedad de organismos. La compresión de estos datos presenta sustanciales dificultades. Por ejemplo, es importante identificar las regiones que codifican el genoma con el fin de relacionar los datos de la secuencia genética con las secuencias de proteína. De manera adicional, los ancestros del genoma de algunos organismos son de sustancial interés. Algunas secuencias que son víricas en origen se han incorporado ahora de manera estable en el genoma de los organismos eucariotas. Las propias secuencias víricas se pueden haber originado en otra especie esencialmente no relacionada. Puede ser importante una comprensión del ancestro de un gen para destacar analogías correctas entre genes relacionados y sus productos de traducción en otros
organismos.

Existe necesidad de una mejor comprensión de los efectos del contexto del códon sobre la traducción, y de un procedimiento para determinar los codones apropiados para cualquier efecto de traducción deseados. Existe también necesidad de un procedimiento para identificar las regiones que codifican el genoma a partir de los datos de las secuencias de nucleótidos. Existe también necesidad de un procedimiento para controlar el plegado de la proteína y para asegurar que un gen extraño se plegará de manera apropiada cuando se exprese en un huésped. Los genes alterados o construidos de acuerdo con las eficiencias traducciones adecuadas serían de un valor significativo.

Otro aspecto de la práctica de las técnicas de ADN recombinante para la expresión por microorganismos de las proteínas de interés industrial y farmacéutico es el fenómeno de "preferencia del códon". Aunque se ha indicado anteriormente que la maquinaria existente para la expresión del gen está formada por células huésped genéticamente transformadas, que "operarán" para construir un producto deseado dado, los niveles de expresión alcanzados en un microorganismo pueden estar sujetos a una amplia variación, dependiendo en parte de las formas alternativas específicas del código genético que especifica el aminoácido en un gen exógeno insertado. Un códon "triplete" de cuatro posibles bases de nucleótidos puede existir en 64 formas variantes. Que estas formas proporcionan el mensaje para únicamente 20 aminoácidos diferentes (así como la iniciación y terminación de la transcripción) significa que algunos aminoácidos se pueden codificar por más de un códon. Debido a ello, algunos aminoácidos tienen tanto como seis codones alternativos "redundantes" mientras que algunos otros tienen un único códon requerido. Por razones no completamente comprendidas, los codones alternativos no están todos presentes de manera uniforme en el ADN endógeno de diferentes tipos de células y parece existir una jerarquía natural variable o "preferencia" para algunos codones en algunos tipos de células.

Como ejemplo, el aminoácido leucina se especifica por uno cualquiera de los seis codones de ADN que incluyen CTA, CTC, CTG, CTT, TTA, y TTG (que corresponden, respectivamente a los codones del ARN, CUA, CUC, CUG, CUU, UUA y UUG). El análisis exhaustivo de las frecuencias de los codones del genoma de los microorganismos ha revelado que el ADN endógeno de E. coli contiene de manera más habitual el códon específico de la leucina CTG, mientras que el ADN de levaduras y mohos del limo incluye de manera común un códon TTA que específico de la leucina. En vista de esta jerarquía, se mantiene de manera general que la probabilidad de obtener altos niveles de expresión de un polipéptido rico en leucina por un huésped de E. coli dependerá en alguna extensión de la frecuencia de utilización del códon. Por ejemplo, un gen rico en codones TTA será con toda probabilidad mal expresado en E. coli, mientras que un gen rico en CTG expresará el polipéptido probablemente de manera superior. De manera similar, cuando las células de levadura son la transformación proyectada de las células huésped para la expresión de un polipéptido rico en leucina, un códon preferido para uso en un ADN insertado será TTA.

Las implicaciones del fenómeno de preferencia del códon en las técnicas de ADN recombinante son manifiestas, y el fenómeno puede servir para explicar errores anteriores en alcanzar altos niveles de expresión de genes exógenos en organismos huésped transformados con éxito – un códon menos "preferido" puede estar presente de forma repetida en el gen insertado, y la maquinaria de expresión de la célula huésped puede no funcionar de forma tan eficaz. Este fenómeno sugiere que los genes sintéticos que se han diseñado para incluir codones preferidos de células huésped proyectadas proporcionan una forma preferida de material genético extraño para la práctica de técnicas de ADN recombinante.

5. Vehiculado de proteínas

La diversidad de funciones que tipifican las células eucariotas depende de la diferenciación estructural de sus límites de membrana. Para generar y mantener estas estructuras, las proteínas deben ser transportadas desde su emplazamiento de síntesis en el retículo endoplasmático a los destinos predeterminados por toda la célula. Esto requiere que las proteínas en transito desplieguen señales de clasificación que sean reconocidas por la maquinaria molecular responsable de dirigir la selección de la vía, localizada en los puntos de acceso de las rutas de vehiculado principales. Las decisiones de clasificación de la mayor parte de proteínas necesitan realizarse sólo una vez a medida que atraviesan sus rutas biosintéticas, ya que su destino final, la localización celular donde realizan su función, se convierte en su residencia permanente.

El mantenimiento de la integridad intracelular depende en parte de la clasificación selectiva y el transporte preciso de las proteínas a sus destinos correctos. En los últimos años se ha diseccionado la maquinaria molecular de reconocimiento y se estudiado ampliamente la localización de las proteínas. Se han identificado motivos de secuencia definidos en proteínas que pueden actuar como "marcadores de dirección". Se han encontrado numerosas señales de clasificación asociadas con las regiones citoplásmicas de las proteínas de membrana.

Resumen de la invención

Se proporcionan moléculas de ADN sintético que codifican env de HIV y se proporcionan modificaciones de env de HIV. Los codones de las moléculas sintéticas incluyen los codones preferidos de las células huésped proyectadas. Las moléculas sintéticas proporcionan formas preferidas del material genético extraño. Se pueden usar las moléculas sintéticas en forma de vacuna de polinucleótido que proporciona inmunoprofilaxis efectiva frente a la infección por HIV mediante la neutralización de la inmunidad mediada por células y anticuerpos. Esta invención proporciona polinucleótidos que, cuando se introducen directamente en un vertebrado in vivo, incluyendo mamíferos tales como primates y seres humanos, inducen la expresión de las proteínas codificadas en el interior del
animal.

De manera específica se proporciona un polinucleótido sintético según se define en la reivindicación 1.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra el cassette de env de HIV en función de las estrategias de expresión.

La Figura 2 muestra las respuestas de la vacuna de ADN mediada por las respuestas anti-gp120.

La Figura 3 muestra los títulos ELISA de anti-gp120 del suero de vacuna de ADN de murina.

La Figura 4 muestra la expresión relativa de la gp120 tras la transfección del cultivo celular PNV con env de HIV.

La Figura 5 muestra las respuestas medias anti-gp120 según ELISA que siguen a la vacunación con tPA-gp143/optA frente al ADN optB

La Figura 6 muestra la neutralización de HIV mediante el suero de vacuna de ADN de murina.

La Figura 7 muestra la neutralización de HIV medianotes sueros procedentes de vacunas de ADN de murina con env de HIV.

La Figura 8 es un análisis inmunoblot de constructos de ADN optimizados con env de HIV.

Descripción detallada de la invención

Se proporcionan moléculas de ADN sintético que codifican env de HIV y moléculas de ADN sintético que codifican formas modificadas de env de HIV. Se diseñan los codones de las moléculas sintéticas de forma que se usen los codones preferidos por la célula huésped proyectada. Se pueden usar las moléculas sintéticas en forma de vacuna de polinucleótido que proporciona una inmunoprofilaxis efectiva frente a la infección por HIV mediante anticuerpos neutralizantes e inmunidad mediada por células. Se pueden usar las moléculas sintéticas como una composición inmunógena. Esta invención proporciona polinucleótidos que, cuando se introducen directamente en un vertebrado in vivo, incluyendo mamíferos tales como primates y seres humanos, inducen la expresión de proteínas codificadas en el interior del animal.

Tal como se usa en el presente documento, un polinucleótido es una combinación de ácidos nucleicos que contiene elementos reguladores tales que tras la introducción en una célula viva de vertebrado, el polinucleótido es capaz de dirigir la maquinaria celular para producir productos de traducción codificados por los ácidos nucleicos que comprenden el polinucleótido. En una forma de realización de la invención, el polinucleótido es un ácido polidesoxiribonucleico que comprende al menos un gen de HIV enlazado de manera operativa con un promotor de transcripción. En otra forma de realización de la invención, la vacuna de polinucleótido (PNV) comprende ácido poliribonucleico que codifica al menos un gen de HIV que es responsable de la traducción mediante la maquinaria celular eucariota (ribosomas, ARNt y otros factores de traducción). Cuando la proteína codificada por el polinucleótido sea una que no se produce de manera normal en el animal excepto en condiciones patológicas, (es decir, una proteína heteróloga) tales como las proteínas asociadas con el virus de la inmunodeficiencia adquirida, (HIV), el agente etiológico de síndrome de inmuno deficiencia adquirida, (SIDA), el sistema inmune del animal se activa para lanzar una respuesta inmuno protectora. Debido a que estas proteínas exógenas se producen por los tejidos del animal, las proteínas expresadas se procesan por el sistema de mayor histocompatibilidad, MHC, de una manera análoga a la que se produce con una infección real del organismo relacionado (HIV). El resultado es la inducción de respuestas inmunes frente al patógeno cognado.

Los polinucleótidos de la presente descripción, cuando se introducen en un sistema biológico, inducen la expresión de las proteínas y epitopos del HIV, y la producción de una respuesta inmune específica. La respuesta inducida de anticuerpos es específica para la proteína de HIV expresada, y neutraliza el HIV. De manera adicional se inducen los linfocitos T citotóxicos (CTL) que reconocen y destruyen de manera específica las células infectadas por HIV.

La presente descripción proporciona procedimientos para usar un polinucleótido que, tras la introducción en el tejido de mamífero, induce la expresión en una célula única, in vivo, de los productos del gen discretos. La descripción proporciona una solución que no requiere manipulaciones múltiples de genes de HIV dependientes de REV para obtener genes independientes de REV. El sistema de expresión independiente de REV descrito en el presente documento es útil por derecho propio, y es un sistema para demostrar la expresión en una célula única in vivo, de un producto de gen deseado único.

Debido a que muchas de las aplicaciones de la presente invención se aplican a la vacunación antivírica, los polinucleótidos se denominan con frecuencia como vacuna(s) de polinucleótido, o PNV. Esto no significa que se considera que estén fuera del alcance de la invención las utilidades adicionales de estos polinucleótidos, en la estimulación inmune y en las terapéuticas antitumorales,

De acuerdo con la invención, un gen que codifica un producto de gen de HIV se incorpora a un vector de expresión. El vector contiene un promotor de transcripción reconocido por una ARN polimerasa eucariota y un terminador de transcripción al extremo de la secuencia de codificación del gen de HIV. En una forma de realización preferida, el promotor es el promotor de citomegalovirus con la secuencia del intrón A (CMV-intA), aunque aquellos expertos en la técnica reconocerán que se puede usar cualquiera del resto de numerosos promotores conocidos, tales como la inmunoglobulina fuerte u otros promotores de genes eucariotas. Un terminador de transcripción preferido es el terminador de la hormona de crecimiento bovina. La combinación de terminador CMVintA-BGH es particularmente preferida.

Para ayudar a la preparación de los polinucleótidos en las células procariotas, se puede incluir en el vector de expresión un marcador de resistencia a un antibiótico; el marcador puede estar bajo control de transcripción de un promotor procariota de tal manera que la expresión del marcador no ser produce en células eucariotas. Se pueden usar genes de resistencia a la ampicilina, genes de resistencia a la neomicina y otros marcadores de resistencia a antibióticos aceptables. Para ayudar a la producción de altos niveles de polinucleótido mediante la fermentación en organismos procariotas, puede ser útil que el vector contenga un origen de replicación procariota y ser de alto número de copias. Numerosos vectores de clonación procariota comercialmente disponibles proporcionan estos beneficios. Es deseable eliminar las secuencias no esenciales de ADN y asegurar que los vectores no son capaces de replicarse en células eucariotas. Esto minimiza el riesgo de integración de secuencias de la vacuna de polinucleótido en el genoma del huésped. Se pueden usar promotores específicos de tejido siempre que estos sea deseable para limitar la expresión del polinucleótido en un tipo concreto de tejido.

Entre los ejemplos de vectores se incluyen V1, un vector pBR322 mutado en el que se clonaron el promotor CMV y el terminador trancripcional BGH. En otro vector se han combinado los elementos V1 y pUC19 para producir un vector de expresión denominado V1J. En otro refinamiento, se elimina el gen de resistencia a la ampicilina del V1J y se sustituye por un gen de resistencia a la neomicina, para generar ViJ-neo. En la invención, el vector es V1Jns, que es el mismo que VIJneo excepto en que se ha diseñado un único emplazamiento de restricción Sfil en el emplazamiento Kpn1 único en la posición 2114 del ViJ-neo. La incidencia de los emplazamientos Sfil en el ADN genómico humano es muy baja (aproximadamente 1 emplazamiento por 100.000 bases). De esta manera, este vector permite monitorizar cuidadosamente la integración del vector de expresión en el ADN del huésped, simplemente mediante digestión Sfil del ADN genómico extraído. En un refinamiento adicional, el vector es V1R. En este vector, se "recorta" tanto ADN como sea posible del vector para producir un vector muy compacto. Este vector es un derivado de V1Jns. Este vector permite que se usen grandes insertos con menor preocupación de que se codifiquen las secuencias no deseadas y se optimiza la captación por las células.

Una forma de realización de esta invención incorpora genes que codifican gp160 de HIV, gp120, gag y otros productos de genes procedentes de cepas de HIV adaptadas de laboratorio tales como SF2, IIIB o MN. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que se podría esperar que el uso de genes de cepas de HIV-2 que tienen funciones análogas a las de los genes de HIV-1 genere respuestas análogas a aquellas descritas en el presente documento para constructos de HIV-1. Se conocen los procedimientos de clonación y manipulación de estos genes por aquellos expertos en la técnica.

Se reconoce que la excitación de respuestas inmunes frente a cepas de HIV adaptadas de laboratorio puede no ser adecuada para proporcionar la neutralización de los aislados de HIV de campo primario. De esta manera, en otra forma de realización de esta invención, se incorporan genes procedentes de aislados virulentos de HIV de campo primario en el inmunógeno de polinucleótido. Esto se lleva a cabo preparando copias de ADNc de los genes víricos y a continuación subclonando los genes individuales en el inmunógeno de polinucleótido. Las secuencias de muchos genes de muchas cepas de HIV están en la actualidad públicamente disponibles mediante GENBANK y dichos aislados de campo primario de HIV están disponibles en el National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) que ha contratado con la Quality Biological, Inc [7581 Lindbergh Drive, Gaitherburg, Maryland 20879] para que estas cepas estén disponibles. Dichas cepas están también disponibles en la World Health Organization (OMS) [[Network for HIV Isolation and Characterization, Vaccine Development Unit, Office of Research, Global Programme on AIDS, CH-1211 Ginebra 27, Suiza]. A partir de este trabajo, aquellos expertos en la técnica reconocerán que una de las utilidades de la presente invención es proporcionar un sistema para ensayar y analizar tanto in vivo, como in vitro de forma que se puede llevar a cabo una correlación entre la diversidad de secuencias de HIV y la serología de la neutralización de HIV, así como otros parámetros. La incorporación de genes procedentes de aislados primarios de cepas de HIV proporciona un inmunógeno que induce respuestas inmunes frente a los aislados clínicos de los virus, y de esta manera se cumple una necesidad que no se ha cubierto todavía en el campo. Además, como los aislados virulentos cambian, se puede modificar el inmunógeno tanto como sea necesario para reflejar nuevas secuencias.

Para mantener consistente la terminología, se siguen las siguientes convenciones en el presente documento para describir los constructos de inmunógeno de polinucleótido "Nombre del vector-cepa de HIV-gen-elementos adicionales". De esta manera, un constructo en el que se clona el gen gp160 de la cepa MN en el vector de expresión V1Jneo, el nombre que se da en el presente documento es: "V1Jneo-MN-gp160". Se describen con más detalle a continuación los elementos adicionales que se añaden al constructo. Como cepa etiológica de los cambios en virus, se puede cambiar el gen preciso que es óptimo para la incorporación en el producto farmacéutico. Sin embargo, tal como se demuestra a continuación, debido a que se inducen respuestas CTL que son capaces de proteger frente a cepas heterólogas, la variabilidad de la cepa es menos crítica en el inmmunógeno y las vacunas de esta invención, en comparación las vacunas basadas en el virus completo o subunidad de polipéptido. De manera adicional, debido a que el producto farmacéutico se manipula fácilmente para insertar un nuevo gen, este es un ajuste que se hace fácilmente mediante técnicas estándar de biología molecular.

El término "promotor" tal como se usa en el presente documento se refiere a un emplazamiento de reconocimiento en una cadena de ADN al que se enlaza la ARN polimerasa. El promotor forma un complejo de iniciación con la ARM polimerasa para iniciar y dirigir la actividad de transcripción. Se puede modificar el complejo activando las secuencias denominadas "mejoradores" o inhibiendo las secuencias denominadas "silenciadores".

El término "lider" tal como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de ADN en el extremo 5' de un gen estructural que se transcribe junto con el gen. El líder de manera usual da como resultado una proteína que tiene una extensión del péptido N-terminal denominada algunas veces como pro-secuencia. Para las proteínas destinadas bien a la secreción en el medio extracelular o a una membrana, esta secuencia señal, que es generalmente hidrófoba, dirige la proteína en el retículo endoplasmático desde el que se descarga al destino apropiado.

El término "intrón" tal como se usa en el presente documento se refiere a una sección del ADN que se encuentra en el medio de un gen que no codifica un aminoácido en el producto del gen. El precursor de ARN en el intrón se corta y por tanto no se transcribe en el ADN ni se traduce a proteínas.

El término "cassette" se refiere a la secuencia de la presente invención que contiene la secuencia del ácido nucleico que se va a expresar. El cassette es similar en concepto a una cinta cassette. Cada cassette tendrá su propia secuencia . De esta manera, intercambiando el cassette el vector expresará una secuencia diferente. Debido a los emplazamientos de restricción en los extremos 5' y 3', el cassette se puede insertar fácilmente, eliminarse o sustituirse con otro cassette.

El termino "región 3' no traducida" o "3' UTR" se refiere a la secuencia en el extremo 3' de un gen estructural que se transcribe de manera usual con el gen. Esta región 3' UTR contiene de manera usual la secuencia poli A. Sin embargo, la 3' UTR se transcribe desde el ADN y se corta antes de la traducción a proteína.

El término "Región no codificante" o "NCR" se refiere a la región contigua a la región 3' UTR del gen estructural. La región NCR contiene una señal de terminación de transcripción.

El término "emplazamiento de restricción" se refiere a un emplazamiento de rotura de la secuencia específica de las endonucleasas de restricción.

El término "vector" se refiere a algunos medios por los cuales se pueden introducir los fragmentos de ADN en un organismo huésped o en un tejido huésped. Existen diversos tipos de vectores que incluyen plásmidos, bacteriófagos y cósmidos.

El término "cantidad efectiva" significa que se inyecta suficiente PNV para producir los niveles adecuados de polipéptido. Una persona experta en la técnica reconoce que este nivel puede variar.

Para proporcionar una descripción de la presente invención, se proporciona el siguiente antecedente sobre el HIV. El virus de la inmunodeficiencia humana tiene un genoma de ácido ribonucleico (ARN), la estructura del cual se representa en la Figura 1. Este genoma de ARN se debe transcribir de manera inversa de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica con el fin de producir una copia de ADNc para la clonación y manipulación de acuerdo con los procedimientos mostrados en el presente documento. Cada uno de los extremos del genoma es una repetición a largo plazo que actúa como un promotor. Entre estos términos, el genoma codifica, en diversos marcos de lectura, gag -pol- env como los principales productos del gen: gag es el antígeno específico de grupo; pol es la transcriptasa inversa, o polimerasa; se codifica también un esta región, en un marco de lectura alternado, la proteasa vírica responsable del procesamiento post-traducción, por ejemplo, de gp160 en gp120 y gp41; env es la proteína de la envoltura; vif es el factor de infectividad del virión; REV es el regulador de la expresión de la proteína del virión; neg es el factor de regulación negativo; vpu es el factor de productividad del virión, "u"; tat es el trans-activador de la transcripción; vpr es la proteína vírica r. Se ha descrito la función de cada uno de estos elementos.

En una forma de realización de esta invención, un gen que codifica una proteína de HIV o SIV se enlaza directamente con un promotor de transcripción. El gen env codifica una proteína grande enlazada a la membrana, la gp160, que se modifica en post-traducción a gp41 y gp120. El gen de gp120 se puede colocar bajo el control del promotor de citomegalovirus para la expresión. Sin embargo, la gp120 no se enlaza a la membrana y por tanto, tras la expresión, se puede secretar desde la célula. Como el HIV tiende a permanecer durmiente en células infectadas, es deseable que se generen también respuestas inmunes dirigidas a los epitopos de HIV enlazados con la célula. De manera adicional, es deseable que la vacuna produzca un antígeno oligomérico ENV enlazado con la membrana que tenga una estructura similar a la que se produce mediante infección vírica con el fin de generar las respuestas de anticuerpo más eficaces para la neutralización vírica. Esta meta se lleva a cabo en el presente documento mediante la expresión in vivo del epitopo asociado con la membrana de la célula, gp160, para primar el sistema inmune. Sin embargo, la expresión de gp160 se reprime en ausencia de REV debido a la no salida desde el núcleo de los genes no unidos. Para una comprensión de este sistema, se describirá con mayor detalle el ciclo de vida del HIV.

En el ciclo de vida del HIV, tras la infección de una célula huésped, el ARN del genoma del HIV se transcribe de forma inversa en el ADN provírico que se integra en el ADN genómico del huésped como una unidad de transcripción única. El LTR proporciona el promotor que transcribe los genes del HIV en la dirección 5' a 3' (gag, pol, env), para formar un transcripto no unido con el genoma entero. El transcripto no unido actúa como el ARNm a partir del cual se traduce aunque puede tener lugar una unión limitada durante la traducción de los genes codificados env. Para el producto del gen regulador REV que se va a expresar, se puede producir más de un episodio de unión debido a que en la regulación genómica, REV y env se solapan, tal como se muestra en la figura 1. Con el fin que se produzca la transcripción de env, debe pararse la transcripción de REV, y viceversa. De manera adicional, se requiere la presencia de REV para exportar el ARN no unido desde el núcleo. Para que REV funcione de esta manera, sin embargo, debe estar presente en el transcripto un elemento responsable de REV (RRE) [Malim y col., Nature 338:254-257 (1989)]

En la vacuna de polinucleótido de esta invención, se elimina la unión obligatoria de algunos genes de HIV proporcionando genes completamente unidos (es decir: el suministro de un marco de lectura abierto completo para el producto de gen deseado sin necesidad de cambios en el marco de lectura o la eliminación de regiones no codificadas; aquellos normalmente expertos en la técnica reconocerían que cuando se une un gen completo, existe alguna libertad en la secuencia precisa que resulta; sin embargo en tanto en cuanto se obtenga una secuencia de codificación funcional, esto es aceptable). De esta manera, en una forma de realización, la secuencia de codificación completa de gp160 se une de tal manera que se requiere la expresión no intermitente de cada gen.

La doble respuesta inmune, humoral y celular, generada de acuerdo con esta invención resulta particularmente significativa para inhibir la infección por HIV, dada la propensión del HIV a mutar dentro de la población, así como en individuos infectados. Con el fin de formular una vacuna protectora efectiva para el HIV es deseable generar tanto una respuesta de anticuerpo multivalente por ejemplo para gp160 (se conservan aproximadamente un 80% de env a través de las diferentes cepas HIV-1 clado B, que son las cepas predominantes en las poblaciones humanas de los Estados Unidos), la diana principal de neutralización sobre HIV, así como las células T citotóxicas reactivas a las porciones conservadas de gp160 y, las proteínas víricas internas codificadas por gag. Hemos hecho una vacuna para HIV que comprende genes de gp160 seleccionados entre cepas comunes de laboratorio; predominantemente de aislados víricos primarios que se encuentran dentro de la población infectada; a partir de gp160 mutados diseñados para desenmascarar cepas cruzadas, neutralizando los epitopos del anticuerpo; y de otros genes de HIV representativos tales como los genes gag y pol (\sim un 95% de conservación a través de aislados de HIV)

Virtualmente, todos los pacientes HIV seropositivos que no han avanzado hacia un estado inmunodeficiente hospedan CTL anti-gag mientras aproximadamente un 60% de estos pacientes muestran CTL específicos de gp160 en cepas cruzadas. La cantidad de CTL específicos de HIV encontrados en individuos infectados que han progresado en el estado de enfermedad conocido como SIDA es, sin embargo, mucho menor, demostrando la significación de nuestros hallazgos que podemos inducir respuestas CTL de cepa cruzada.

Las respuestas inmunes inducidas por nuestros constructos de vacuna de polinucleótido env y gag se demostraron en ratones y primates. La monitorización de la producción de anticuerpos contra env en ratones permite la confirmación que un constructo dado es un inmunógeno adecuado, es decir, una proporción alta de los animales vacunados muestra una respuesta de anticuerpos. Los ratones proporcionan también el modelo animal más fácil adecuado para ensayar la inducción de CTL por nuestros constructos, y se usa por tanto para evaluar si un constructo concreto es capaz de generar dicha actividad. Los monos (cercopiteco verde, rhesus, chimpancés) proporcionan especies adicionales que incluyen primates para la evaluación de anticuerpos en animales grandes no roedores. Se prefieren también estas especies a los ratones para los ensayos de neutralización de antisueros debido a los altos niveles de actividades neutralizantes endógenas frente a los retrovirus observados en suero de ratón. Estos datos demuestran que se suscita inmunogenicidad suficiente por nuestras vacunas para conseguir la protección en los experimentos en un modelo desencadenador chimpancé/HIV_{IIIB} basado en niveles protectores conocidos de anticuerpos neutralizantes para este sistema. Sin embargo, la definición de protección actualmente emergente y crecientemente aceptada en la comunidad científica se separa de la así denominada "inmunidad esterilizante" que indica la protección completa de la infección por HIV, para prevenir la enfermedad. Varios correlatos de este objetivo incluyen la reducción del título vírico en sangre, medida bien por la transcriptasa inversa de HIV, por la infectividad de las muestras de suero, por el ensayo ELISA de p24 o la concentración en sangre de otros antígenos de HIV, la concentración aumentada de células T CD4^{+}, y por las velocidades extendidas de supervivencia [véase, por ejemplo, Cohen, J., Science 262:1820-1821, 1993, para una descripción de la evolución de la definición de la eficacia de la vacuna anti-HIV]. Los inmunógenos de la presente invención generan también respuestas inmunes neutralizantes frente a aislados infecciosos de HIV (campo clínico primario).

Inmunología A. Respuesta de los anticuerpos a env

1. gp160 y gp120. Se usó un ensayo ELISA para determinar si los vectores de vacuna que expresan bien la gp120 secretada o la gp160 enlazada a la membrana son eficaces en la producción de anticuerpos específicos de env. La caracterización inicial in vitro de la expresión de env en nuestros vectores de vacunación se proporciona mediante análisis inmunoblot de los lisados de células transfectadas con gp160. Estos datos confirman y cuantifican la expresión de gp160 usando anticuerpos monoclonales anti-gp41 y anti-gp120 para visualizar la expresión de gp160 de la célula transfectante. En una forma de realización de esta invención, se prefiere gp160 a gp120 por las siguientes razones: (1) un vector gp120 inicial produjo inmunogenicidad inconsistente en ratones y tuvo una respuesta muy pobre o ninguna en Cercopiteco verde; (2) gp160 contribuye de manera adicional a neutralizar anticuerpos así como epitopos de CTL proporcionando la adición de aproximadamente 190 residuos de aminoácidos debido a la inclusión de gp41; (3) la expresión de gp160 es más similar al env vírico con respecto al conjunto de tetrámeros y a la conformación global, lo que puede proporcionar epitopos de neutralización dependientes del oligómero; y (4) encontramos que, al igual que el éxito del enlace de la membrana, los constructos HA de la gripe para la producción de respuestas de anticuerpo neutralizantes en ratones, hurones y primates no humanos de generación de anticuerpos anti-gp160 es superior a la generación de anticuerpos anti-gp120. La selección de qué tipo de env o que cocktail de subfragmentos de env se prefiere, se determina mediante los experimentos que se detallan más adelante.

2. Presencia y extensión de la actividad neutralizante

Se ensayó antisuero ELISA positivo procedente de monos y demostró que neutralizaba cepas de HIV tanto homólogas como heterólogas.

3. Anticuerpos neutralizantes V3 frente a no V3

Un objetivo principal de los PNV de env es generar anticuerpos ampliamente neutralizantes. Se ha demostrado en la actualidad que los anticuerpos dirigidos contra bucles V3 son muy específicos de la cepa, y se ha usado la serología de esta respuesta para definir cepas.

a. Los anticuerpos neutralizantes No V3 parecen reconocer principalmente epitopos estructurales discontinuos en el interior de gp120 que son responsables del enlace CD4. Los anticuerpos de este dominio son policlonales y más ampliamente neutralizantes cruzados debido probablemente a las restricciones impuestas sobre las mutaciones por la necesidad de los virus de enlazar su ligando celular. Se usó un ensayo in vitro para ensayar el bloqueo del enlace de gp120 con CD4 inmovilizado en placas de 96 pocillos mediante sueros procedentes de animales inmunizados. Un segundo ensayo in vitro detecta el enlace directo de los anticuerpos con los péptidos sintéticos que representan los dominio seleccionados de V3 inmovilizados sobre plástico. Estos ensayos son compatibles para antisueros de cualquiera de los tipos de animales usados en nuestros estudios y definen los tipos de anticuerpos neutralizantes que nuestras vacunas han generado así como proporcionan un correlato in vitro para la neutralización del virus.

b. gp41 hospeda al menos un determinante principal de neutralización, que corresponde con epitopos lineales altamente conservados reconocidos por el anticuerpo monoclonal 2F5 ampliamente neutralizante (comercialmente comercializado por Vírico Testing System Corp., Texas Commerce Tower, 600 Travis Street, Suite 4750, Houston, TX 77002-3005 (USA), o Waldheim Pharmazeutika GMBH, Boltzmangasse 11, A-1091 Viena, Austria) así como otros emplazamientos potenciales el dominio bien conservado "péptido de fusión" localizado en el término N de gp41. Además de la detección de anticuerpos dirigidos contra gp41 mediante técnicas de inmunoblot tal como se ha descrito anteriormente, se usó un ensayo in vitro para anticuerpos que enlazan con péptidos sintéticos que representan estos dominios inmovilizados sobre plástico.

4. Maduración de la respuesta del anticuerpo

En pacientes HIV seropositivos, las respuestas del anticuerpo neutralizante progresan principalmente desde anti-V3 para incluir anticuerpos neutralizantes de mayor espectro que comprenden los epitopos del dominio gep120 estructural descritos anteriormente (#3), que incluyen epitopos gp41, Estos tipos de respuestas de anticuerpos se monitorizan durante el curso del tiempo y las subsiguiente vacunaciones.

B. Reactividades de las células T frente a env y gag

1. Generación de respuestas CTL. Las proteínas víricas que se sintetizan en el interior de las células producen un aumento de respuestas CTL limitadas a MHC I. Cada una de estas proteínas excita CTL en pacientes seropositivos. Nuestras vacunas son también capaces de excitar CTL en ratones. Las inmunogenéticas de las cepas de ratón conducen a dichos estudios, tal como se demuestra con la gripe NP. Se han definido diversos epitopos para las proteínas de HIV env, REV, nef y gag en ratones Balb/c, facilitando de esta manera el cultivo de CTL in vitro y los ensayos de citotoxicidad. Es ventajoso usar líneas de tumor singénico, tales como el mastocitoma P815 de murina, transfectado con estos genes para proporcionar dianas para CTL así como para la reestimulación in vitro de antígenos específicos. Se conocen procedimientos para definir inmunógenos capaces de excitar linfocitos T citotóxicos limitados a MHC de clase I. Se encuentra también que un péptido que abarca los aminoácidos 152-176 induce los anticuerpos que neutralizan el HIV], y se pueden usar estos procedimientos para identificar epitopos inmunogénicos para la inclusión en el PNV de esta invención. De manera alternativa se podría usar el gen completo que codifica gp 160, gp120, la proteasa o gag. Tal como se usa en el presente documento, la función del efector de la célula T se asocia con el fenotipo de las células T maduras, por ejemplo, la citotoxicidad, la activación de las células B para la secreción de citoquina, y/o el restablecimiento o la estimulación de macrófagos y neutrófilos.

2. Medida de las actividades de T_{H.}

Se ensayaron cultivos celulares de bazo derivados de animales vacunados para determinar los antígenos específicos mediante la adición bien de la proteína recombinante o de los epitopos del péptido. La activación de las células T por dichos antígenos, presentada mediante el acompañamiento de células que presentan el antígeno esplénico, las APC, se monitoriza mediante la proliferación de estos cultivos o mediante la producción de citoquina. El modelo de producción de citoquina permite también la clasificación de la respuesta T_{H} como tipo 1 o tipo 2. Debido a que las respuestas T_{H}2 dominantes parecen correlacionarse con la exclusión de la inmunidad celular en pacientes seropositivos inmunocomprometidos, es posible definir el tipo de respuesta suscitada por un PNV dado en los pacientes, lo que permite la manipulación de las respuestas inmunes resultantes.

3. Hipersensibilidad de tipo retardado (DTH). La DTH del antígeno vírico tras la inyección i.d. es indicadora de la inmunidad celular restringida principalmente a MHC II. Debido a la disponibilidad comercial de las proteínas de HIV recombinantes y los péptidos sintéticos para epitopos conocidos, las respuestas DTH se determinan fácilmente en vertebrados vacunados usando estos reactivos, proporcionando de esta manera un correlato adicional in vivo para inducir la inmunidad celular.

Protección

Basándose en los anteriores estudios inmunológicos, es predecible que nuestra vacunas sean efectivas en vertebrados frente a la estimulación por HIV virulento. Estos estudios se llevaron a cabo en un modelo de estimulación HIV_{IIIB}/chimpancé tras la vacunación suficiente de estos animales con un constructo de PNV, o un cocktail de constructos de PNV que comprende de gp160IIIb, gagIIIB, nefIIIB y REVIIIB, La cepa IIIB es útil a este respecto como se ha establecido en el título de dosis letales de esta cepa en chimpancé. Sin embargo, se proyectaron los mismos estudios usando cualquier cepa de HIV y los epitopos específicos de o los heterólogos de la cepa dada. Un segundo modelo vacunación/estimulación, de manera adicional al de los chimpancés es el scid-hu de PBL de ratón. Este modelo permite ensayar los linfocitos del sistema inmune de los seres humanos y nuestra vacuna tras el subsiguiente estímulo del HIV en un ratón huésped. Este sistema es ventajoso así como fácilmente adaptado al uso con cualquier cepa de HIV y proporciona evidencias de protección frente a múltiples cepas de aislados de HIV de campo primario. Un tercer modelo de estimulación utiliza virus HIV/SIV híbridos, algunos de los cuales han demostrado infectar monos rhesus y conducen a la enfermedad de inmunodeficiencia dando como resultado la muerte [véase Li, J., y col., J. AIDS 5:639-646, 1992]. La vacunación de rhesus con nuestros constructos de vacuna de polinucleótido es protectora frente a la estimulación subsiguiente con dosis letales de SHIV.

Resumen del constructo de PNV

El HIV y otros genes se ligan en un vector de expresión que se ha optimizado para vacunaciones de polinucleótido. Esencialmente, se elimina todo el ADN extraño, dejando los elementos esenciales del promotor de transcripción, epitopos inmunogénicos, terminador trancripcional y genes de resistencia a antibióticos y replicación de origen bacteriano.

La expresión de los genes antiguos de HIV tal como env y gag es dependiente de REV y requiere que el elemento de respuesta de REV (RRE) esté presente en el transcripto del gen vírico. Se puede generar una forma secretada de gp120 en ausencia de REV mediante sustitución del péptido líder gp120 con un líder heterólogo tal como a partir de tPA (tejido - activador del plasminógeno tipo), y de manera preferible mediante un péptido líder tal como el que se encuentra en las proteínas de mamífero altamente expresadas tales como los péptidos líder de inmunoglobulina. Hemos insertado un gen quimérico tPA-gp120 en V1Jns que expresa de manera eficiente la gp120 secretada en las células transfectadas (RD, una línea de rabdomiosarcoma humano). La gp160 monocistrónica no produce ninguna proteína tras la transfección sin la adición de un vector de expresión REV.

Los componentes representativos de los constructos incluyen (pero no se restringen a):

1.

tPA-gp120_{MN};

3.

gp160_{IIIB}

10.

gagIIIB: para anti-gag de CTL;

11.

tPA-gp120_{IIIB};

12.

gp160 con mutaciones estructurales: supresiones o sustituciones de bucles V1, V2, y/o V3

20.

genes que codifican antígenos expresados mediante diferentes patógenos que HIV, tales como, pero no limitándose a, nucleoproteína del virus de la gripe, hemaglutinina, matriz, neuroaminidasa, y otras proteínas antigénicas; genes del virus del herpes simple; antígenos del virus de la hepatitis A, B, o C.

La eficacia protectora de los inmunógenos de polinucleótido de HIV frente a la subsiguiente estimulación vírica se demuestra mediante la inmunización con el plásmido de ADN no replicante de esta invención. Esto es ventajoso ya que no está implicado el agente infeccioso, no se requiere la concurrencia de las partículas de virus, y se permite la selección determinante. Además, debido a que se conservan la secuencia de gag y la proteasa y otros diversos productos de genes víricos entre diversas cepas de HIV, se conserva la protección frente a la subsiguiente estimulación por una cepa virulenta de HIV que es homóloga a, asi como las cepas heterólogas de la cepa de la que se obtiene el gen clonado.

La inyección i.m. de un vector de expresión del ADN que codifica la gp160 da como resultado la generación de inmunidad protectora significativa frente a la subsiguiente estimulación vírica. De manera particular, se producen los anticuerpos específicos de gp160 y los CTL primarios. Las respuestas inmunes dirigidas contra las proteínas conservadas pueden ser efectivas a pesar del cambio antigénico e impulsar las proteínas de envoltura variable. Debido a que cada uno de los productos de gen de HIV presentan algún grado de conservación, y debido a que el CTL se genera en respuesta a la expresión intracelular y al procesado de MHC, es predecible que muchos genes de virus aumenten las respuestas análogas que se han alcanzado para gp160. De esta manera, se han clonado muchos de estos genes, tal como se muestra mediante las uniones secuenciadas y clonadas en el vector de expresión (véase a continuación) de tal manera que estos constructos son agente inmunógenos en forma disponible.

La invención ofrece un medio para inducir inmunidad protectora de cepa cruzada sin necesidad de agentes auto replicantes o coadyuvantes. De manera adicional, la inmunización con los polinucleótidos presentes ofrece otras numerosas ventajas. Esta solución de vacunación debería ser aplicable a los tumores así como a los agentes infecciosos, ya que la respuesta CD8^{+} CTL es importante para los procesos patofisiológicos [K. Tanaka y col., Annu. Rev. Immunol. 6, 359 (1988)]. Por tanto, obtener una respuesta inmune frente a una proteína crucial para el proceso de transformación puede ser un medio efectivo de protección o inmunoterapia frente al cáncer. La generación de un título alto de anticuerpos frente a las proteínas expresadas tras la inyección de la proteína vírica y el ADN de la hormona de crecimiento humano sugiere que esto es un medio fácil y altamente efectivo para fabricar vacunas basadas en anticuerpos, bien de manera separada o en combinación con vacunas de linfocitos T citotóxicos dirigidas hacia los antígenos conservados.

La facilidad de producir y purificar constructos de ADN se compara de manera favorable con los procedimientos tradicionales de purificación de proteínas, facilitando de esta manera la generación de vacunas de combinación. De acuerdo con esto, se pueden preparar constructos múltiples, que codifican por ejemplo gp160, gp120, gp41 o cualquier otro gen de HIV, mezclados y coadministrados. Debido a que se mantiene la expresión de la proteína tras la inyección de ADN, se puede mejorar la persistencia de la memoria de las células B- y T- , suscitando por tanto inmunidad mediada humoral y celular de larga vida.

Las técnicas estándar de biología molecular para preparar y purificar constructos de ADN permite la preparación de los inmunógenos de ADN de esta invención. Aunque las técnicas estándar de biología molecular son por tanto suficientes para la producción de los productos de esta invención, los constructos específicos descritos en el presente documento proporcionan nuevos inmunógenos de polinucleótido que producen de manera sorprendente cepas cruzadas y la neutralización del aislado de HIV primario, un resultado por tanto inalcanzable con la vacunas de virus completo inactivado estándar o subunidad de proteína.

La cantidad de ADN expresable o ARN transcrito a introducir en una vacuna dependerá de la fuerza de los promotores de transcripción y traducción usados y de la inmunogenicidad del producto de gen expresado. De manera general, se administra directamente una dosis inmunológica o profilácticamente efectiva de aproximadamente 1 ng a 100 mg, y de manera preferible aproximadamente 10 mg a 300 mg en el tejido muscular. Se contemplan también la inyección subcutánea, introducción intradérmica e impresión a través de la piel, y otros modos de administración tales como intraperitoneal, intravenoso o liberación por inhalación. Se contempla también que se proporcione el estímulo de las vacunaciones. Tras la vacunación con inmunógenos de polinucleótido de HIV, se contempla también la estimulación con inmunógenos de proteína HIV tales como productos del gen de gp160, gp120 y gag. Es también ventajosa la administración parenteral, tal como por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea u otros medios de administración de la proteína interleuquina-12, en paralelo con o subsiguiente a la introducción parenteral del PNV de esta invención.

El polinucleótido puede estar desnudo, es decir, sin asociar con ninguna proteína, coadyuvante u otros agentes que alteren el sistema inmune del huésped. En este caso, es deseable que el polinucleótido esté en una solución fisiológicamente aceptable, tal como, pero no limitándose a, solución salina estéril o solución salina tamponada estéril. De manera alternativa, el ADN puede estar asociado con liposomas, tales como liposomas de lecitina u otros liposomas conocidos en la técnica, como una mezcla ADN-liposoma, o el ADN puede estar asociado con un coadyuvante conocido en la técnica para estimular las respuestas inmunes, tales como una proteína u otro vehículo. Se pueden usar también con ventaja agentes que asisten en la captación celular del ADN, tales como, pero no limitándose a, iones de calcio. Estos agentes se denominan de manera general en el presente documento como reactivos facilitantes de la transfección y vehículos farmacéuticamente aceptables. Se conocen en la técnica las técnicas para recubrir microproyectiles recubiertos con polinucleótido y son también útiles en conexión con esta invenciones. Se ofrecen los siguientes ejemplos a modo de ilustración y no se pretende que limiten la invención de ninguna manera.

Ejemplo 1 Descripción de los materiales

Vectores pF411 y pF412: Estos vectores se subclonaron a partir del vector pSP62 que se construyó en los laboratorios R. Gallo. El pSP62 es un reactivo comercializado por Biotech Research Laboratories, Inc. El pSP62 tiene un fragmento Xbal de 12,5 kb del genoma HXB2 subclonado de lambda HXB2. La digestión de pSP62 con SalI y Xba I da como resultado los fragmentos de HXB2: 5'-XbaI/SaII, de 6,5 kb y 3'-SaII/XbaI, de 6 kb. Se subclonaron estos insertos en pUC 18 en los emplazamientos SmaI y SaII dando como resultado pF411 (5'-Xbal/SaII) y pF412 (39-XbaI/SaII). PF411 contiene gag/pol y PF412 contiene tat/rev/env/nef.

Reactivos repligen

Rev (IIIB) recombinante, #RP1024-10

Gp120 (IIIB) rec., #RP1001-10

Anticuerpo monoclonal anti-rev, #RP1029-10

Anti-gp120 mAB, #RP1010-10

Investigación del SIDA y programa de reactivos de referencia Hibridoma de anti-gp41 mAB, Chessie 8, #526

Se diseñaron las estrategias para inducir las respuestas a HIV de los linfocitos T citotóxicos y el anticuerpo neutralizante dirigidas de manera principal a los productos del gen de gag de HIV (conservado \sim un 95%) y env gp160 o gp120; conservado un 70-80%). La gp160 contiene los únicos epitopos de anticuerpos neutralizantes conocidos en la partícula de HIV mientras se subraya la importancia de las respuestas CTL anti-env y anti-gag mediante la asociación conocida con el inicio de estas inmunidades celulares con rotura de la viremia primaria seguida por infección, que se produce antes de la aparición de los anticuerpos neutralizantes, así como un papel para los CTL en el mantenimiento del estado libre de enfermedad. Debido a que el HIV es notorio por su diversidad genética, tenemos la esperanza de obtener anticuerpos de mayor espectro que incluyan diversos genes env representativos derivados de aislados clínicos y gp41 (conservado \sim un 90%), mientras que el gen gag altamente conservado debería generar amplias respuestas CTL de cepa cruzada.

Ejemplo 2 Expresión heteróloga de los últimos productos del gen HIV

Los genes estructurales de HIV tales como env y gag requieren la expresión del gen regulador de HIV, rev, con el fin de producir de manera eficiente proteínas de longitud completa. Hemos encontrado que la expresión de gag dependiente de rev da como resultado bajos niveles de proteína, y que el propio rev puede ser tóxico para las células. Aunque hemos conseguido niveles relativamente altos de expresión de gp160 dependiente de rev in vitro, esta vacuna estimula bajos niveles de anticuerpos contra gp160 tras la inmunización in vivo con ADN de rev/gp160. Esto puede dar como resultado los efectos citotóxicos conocidos de rev así como un aumento de la dificultad en obtener la función de rev en los miotúbulos que contienen cientos de núcleos (la proteína rev necesita estar en los mismos núcleos como un transcripto dependiente de rev para que se produzca la expresión de la proteína gag o env). Sin embargo, ha sido posible obtener la expresión independiente de rev usando modificaciones seleccionadas de los genes de env y gag. Está en marcha la evaluación de estos plásmidos con objetivo de vacuna.

De manera general, nuestras vacunas han utilizado principalmente genes env y gag de HIV (IIIB) para la optimización de la expresión dentro de nuestro vector generalizado de vacunación, ViJns, que está comprendido por un promotor temprano inmediato (IE) de CMV, el emplazamiento de poliadenilación BGH, y un pUC como espina dorsal. Se pueden conseguir eficiencias variables dependiendo de cuan largo es el segmento de gen que se usa (por ejemplo, gp120 frente a gp160) en la expresión de env independiente de rev sustituyendo su péptido líder secretorio nativo con el del gen activador del plasminógeno especifico del tejido (tPA) y expresando el gen quimérico resultante detrás del promotor CMVIE don el intrón A de CMV. TPA-gp120 es un ejemplo de un vector gp120 secretado construido de esta manera que funciona lo suficientemente bien como para estimular las respuestas inmunes anti-gp120 en ratones y monos vacunados.

Puesto que los informes acerca de las proteínas ancladas a la membrana pueden inducir respuestas de anticuerpo mucho más sustanciales (y quizás más específicas para la neutralización con HIV en comparación con las proteínas secretadas así como para ganar epitopos inmunes adicionales, se prepararon V1Jns-tPA-gp160 y V1Jns-rev/gp160. El tPA-gp160 produce cantidades detectables de gp160 y gp120, sin la adición de rev, tal como se muestra por el análisis inmunoblot de células transfectadas, aunque los niveles de expresión son mucho menores que los obtenidos para rev/gp160, un plásmido dependiente de rev que expresa gp160. Esto es probablemente debido a las regiones inhibitorias (designadas INS), que confiere dependencia de rev sobre el transcripto de gp160, se producen en emplazamientos múltiples dentro de gp160 que incluyen un terminal de COOH de gp41 (véase esquema a continuación). Se preparó un vector para una forma truncada de terminal COOH de tPA-gp160, tPA-gp143, que se diseñó para aumentar los niveles de expresión global de env mediante eliminación de estas secuencias inhibitorias. El vector gpo143 elimina también las regiones gp41 intracelulares que contienen motivos péptidos (tales como leu-leu) conocidos por producir la desviación de las proteínas de membrana en los lisosomas más bien que en la superficie de la célula. De esta manera, se puede esperar que gp143 aumente la expresión de la proteína env (disminuyendo la dependencia de rev) y la eficiencia de transporte de la proteína en la superficie de la célula en comparación con la longitud completa de gp160 donde estas proteínas pueden ser más capaces de estimular los anticuerpos anti-gp160 que siguen a la vacunación del ADN. Se modificó tPA-gp143 de manera adicional mediante mutagénesis silenciosa extensiva de la secuencia del elemento de respuesta de rev (RRE). Este constructo, gp143/mutRRE, se preparó de dos formas: bien eliminando (forma A) o reteniendo (forma B) los emplazamientos de rotura proteolítica para gp120/41. Se prepararon ambas formas debido a los informes bibliográficos de la vacunación de ratones usando gp160 sin romper expresado en una vacuna que estimula muco más los niveles de anticuerpos que las formas gp160 preparadas rotas.

Se desarrolló un ELISA cuantitativo para la expresión de gp160/gp120 en células transfectantes para determinar las capacidades de expresión relativa de estos vectores. La transfección in vitro de 293 células seguida por la cuantificación de la gp120 asociada a las células frente a la secretada/liberada dio los siguientes resultados: (1) tPA-gp160 expresó entre 5 y 10 veces menos gp120 que rev/gp160 con similares proporciones retenidas intracelularmente respecto de las vehiculadas hacia la superficie celular; (2) tPA-gp143 produjo 3-6 veces más secreción de gp120 que rev/gp160 con solamente bajos niveles de gp143 asociado a células, confirmando que la cola citoplasmática de gp160 origina la retención intracelular de gp120 que se puede resolver por el borrado parcial de esta secuencia; y, (3) tPA-gp143/mutRRE A y B dieron 10 veces más niveles de expresión de proteína de lo que lo hizo el pariente tPA-gp143 aunque la eliminación de procesado proteolítico se confirmó para la formación de A.

Así, nuestra estrategia de incrementar la expresión independiente de rev ha producido incrementos escalonados en la expresión global así como la redirección de la gp143 anclada a la membrana hacia la superficie celular lejos de los lisosomas. Es importante reseñar que debería ser posible insertar secuencias gp120 en el interior de varios aislados víricos en el interior de la cassette de un vector que contiene estas modificaciones, que pueden residir en el extremo NH_{2} (líder tPA) o extremo COOH (gp41), donde existen pocas diferencias antigénicas entre distintas cepas víricas. En otras palabras, se trata de un constructo genérico que se puede modificar con facilidad insertando un gp120 derivado de diferentes aislados víricos primarios para obtener vacunas clínicamente relevantes.

Para aplicar estas estrategias de expresión a los virus que son relevantes para los objetivos de vacuna y confirmar la generalidad de nuestras hipótesis también preparamos un vector tPA-gp120 derivado a partir de un aislado primario de HIV (conteniendo el bucle del péptido V3 norteamericano de consenso; fenotipos macrófago-trópico e inductor sin sincitio). Este vector produjo una elevada expresión/secreción de gp120 con las 293 células transfectadas, y desarrolló anticuerpos anti-gp120 en ratones demostrando que se clonaron de forma funcional. Se usarán también los genes gp160 de un aislado primario para la expresión de la misma forma que para la gp160 derivado de cepas de laboratorio.

Ejemplo 3 Respuestas inmunes a vacunas de polinucleótidos env de HIV-1

Los monos Cercopiteco verde (AGM) y Rhesus (RHM) que recibieron vacunas de ADN de gp120 mostraron bajos niveles de anticuerpos neutralizantes tras 2-3 vacunaciones, que no pudieron aumentarse con vacunación adicional. Estos resultados así como una mayor conciencia en el campo de la vacunación de HIV acerca de que la gp160 oligomérica es de manera probable un antígeno diana para estimular anticuerpos neutralizantes de los monómeros de gp120 (Moore y Ho, J. Virol. 67: 863 (1993), nos han permitido centrarnos en la obtención de la expresión efectiva de vectores basados en gp160 (véase anterior). Se vacunaron también ratones y AGM con el aislado primario derivado de la vacuna de tpA-gp120. Estos animales presentaron títulos de anticuerpo de punto final recíprocos de péptido anti V-3 (usando secuencias homólogas) que oscilaban entre 500-500, demostrando que este diseño de vacuna es funcional para aislados víricos clínicamente relevantes.

Las vacunas basadas en gp160, rev-gp160 y tPA-gp160 fracasan en estimular de manera consistente las respuestas de anticuerpos en ratones y primates no humanos o dan como resultado títulos de anticuerpos bajos. Nuestros resultados iniciales con el plásmido de tPA-gp143 dieron como resultado títulos de media geométrica > 10^{3} en ratones y AGM tras dos vacunaciones. Estos datos indican que hemos mejorado de manera significativa la inmunogenicidad de las vacunas similares a gp160 aumentando los niveles de expresión. Este constructo, así como los vectores tPA-gp143/mutRRE A y B, continuará caracterizándose por respuestas de anticuerpo, especialmente para la neutralización del virus.

De manera significativa, la vacunación con ADN de gp120 produce potentes respuestas de células T auxiliares en todos los compartimentos linfáticos ensayados (bazo, sangre, inguinal, mesentérico y nódulos iliacos) con perfiles de secreción de citoquina similares a T_{H}1 (es decir, producción de interferón g e IL-2 con poco o sin IL-4). Estas citoquinas promueven de manera general inmunidad celular fuerte y se han asociado con el mantenimiento de un estado libre de enfermedad para pacientes HIV seropositivos. Se han mostrado los nódulos linfáticos por ser emplazamientos primarios para la replicación del HIV, hospedando grandes reservorios de virus incluso cuando el virus no puede detectarse de manera fácil en la sangre. Una vacuna que puede estimular las respuestas inmunes anti-VIH en una variedad de emplazamientos linfáticos, tal como hemos mostrado con nuestra vacuna de ADN, puede ayudar a evitar la colonización con éxito de los emplazamientos linfáticos que sigue a la infección inicial.

Como hemos indicado anteriormente, consideramos la realización de los siguientes objetivos eran esenciales para maximizar bazas de éxito con este programa: (1) vectores basados en env capaces de generar respuestas de anticuerpo neutralizante más fuertes en primates; (2) los vectores gag y env que estimulan las respuestas fuertes de los linfocitos T como se caracteriza mediante los CTL y las funciones del efector auxiliar en primates; (3) estimulan el uso de los genes de env y gag procedentes de cepas de HIV-1 clínicamente relevantes; (4) la demostración de la protección en un modelo de estímulo animal tal como el de Chimpancé/HIV (IIIB) o Rhesus/SHIV usando vacunas optimizadas apropiadas; y, (5) la determinación de la duración de las respuestas inmunes apropiadas para el uso clínico. Se ha hecho un progreso significativo en los tres primeros de estos objetivos y los experimentos siguen en progreso para determinar si nuestros constructos de vacunación reciente para gp160 y gag mejorarán tras estos resultados iniciales.

Ejemplo 4 Vectores para producción de vacunas A. Vector de expresión V1Jneo

Fue necesario eliminar el gen amp^{r} usado para la selección con antibiótico de las bacterias que hospedad V1J debido a que no se puede usar la ampicilina en fermentadores a gran escala. Se eliminó el gen amp^{r} del pUC del esqueleto de V1J mediante digestión con los enzimas de restricción SspI y Eam1105I. El plásmido restante se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa, se enromó con T4 ADN polimerasa, y a continuación se trató con fosfatasa alcalina de intestino de ternero. El gen kan^{r} comercialmente disponible, derivado del transposoma 903 y contenido en el interior del plásmido pUC4K, se rompió usando el enzima de restricción PstI, se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa, y se enromó con T4 ADN polimerasa. Este fragmento se ligó con el V1J del esqueleto y los plásmidos con el gen kan^{r} se derivaron en cualquier orientación que se designara como V1Jneo # s 1 y 3. Se confirmó cada uno de estos plásmidos mediante análisis con digestión mediante enzima de restricción, secuenciando el ADN de las regiones de unión, y se mostró que produce cantidades similares de plásmido como V1J. La expresión de los productos de gen heterólogo fue también comparable a V1J para estos vectores V1Jneo. Seleccionamos de manera arbitraria V1Jneo#3, denominado a partir de ahora en el presente documente como V1Jneo, que contiene el gen kan^{r} en la misma orientación que el gen amp^{r} en V1J como el constructo de expresión.

B. Vector de expresión VIJNS

Se añadió un emplazamiento Sfi I a V1Jneo para facilitar los estudios de integración. Se añadieron 13 pares de bases Sfi enlazantes comercialmente disponibles (New England BioLabs en el emplazamiento Kpn I en el interior de la secuencia BGH del vector. Se linealizó V1Jneo con gel purificado de Kpn I, enromado mediante T4 ADN polimerasa, y se ligó al enlazante Sfi I romo. Se escogieron aislados clónicos mediante un mapeado de restricción y se verificaron mediante secuenciamiento a través del enlazante. Se designó el nuevo vector V1Jns. La expresión de los genes heterólogos en V1Jns (con Sfi I) fue comparable a la expresión de los mismos genes en V1Jneo (con Kpn I).

C. V1Jns-tPA

Con el fin de proporcionar una secuencia de péptido líder heteróloga para proteínas de membrana y/o secretadas, se modificó V1Jn para incluir el activador del plasminógeno específico del tejido humano (tPA) líder. Se templaron dos oligómeros complementarios sintéticos y a continuación se ligaron en V1Jn que había sido digerido con BgIII. Los oligómeros sentido y antisentido fue 5'-GATC ACC ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGC TGT GTG CTG CTG CTG TGT GGA GCA GTC TTC GTT TCG CCC AGC GA-3', SEC. ID:18, y 5'-GAT CTC GCT GGG CGA AAC GAA GAC TGC TCC ACA CAG CAG CAG CAC ACA GCA GAG CCC TCT CTT CAT TGC ATC CAT CGT-3'. Se subraya la secuencia Kozak en el sentido del oligómero. Estos oligómeros bases sobresalientes compatibles para la ligadura con las secuencias rotas mediante BgIII. Tras la ligadura se destruye el emplazamiento de BgIII corriente arriba mientras se retiene el de BgIII corriente abajo para ligaduras subsiguientes. Se verificaron los emplazamientos de unión así como la secuencia líder de tPA completa mediante el secuenciamiento del ADN. De manera adicional, con el fin de conformar con nuestro consenso el vector optimizado V1Jns (= V1Jneo con un emplazamiento Sfil), se colocó un emplazamiento de restricción Sfil en el emplazamiento KpnI en el interior de la región del terminador BGH de V1Jn-tPA mediante enromado del emplazamiento KpnI con t4 ADN polimerasa seguido por ligadura con un enlazante SfiI (catálogo #1138, New Englands Biolabs) Esta modificación se verificó mediante digestión por restricción y electroforesis en gel de agarosa.

Ejemplo 5 I. Constructos de vacuna HIV env Vacunas que producen antígeno derivado de env secretado (gp120 y gp140)

Se llevó a cabo la expresión del gen de env dependiente de REV como gp120 como sigue: gp120 se clonó mediante PCR a partir de la cepa MN de HIV con cualquiera de las secuencias péptido líder nativas (V1Jns-gp120), o como una fusión con el péptido líder activador del plasminógeno del tejido (tPA) sustituyendo el péptido líder nativo (V1Jns-tPA-gp120) Se ha mostrado la expresión de tPA-gp120 por ser independiente de REV [B.S. Chapman y col., Nuc. Acids Res. 19, 3979 (1991); debería señalarse que otras secuecias líder proporcionarían una función similar en volver independiente de REV el gen de gp120]. Esto se llevó a cabo preparando los siguientes constructos de gp120 utilizando los vectores anteriormente descritos.

Ejemplo 6 Constructos de vacuna de gp120 A. V1Jns-tPA-HIV_{MN}-gp120

Se amplificó mediante PCR el gen HIV_{MN} gp120 (Medimmume) usando oligómeros diseñados para eliminar los primeros 30 aminoácidos de la secuencia del péptido líder y para facilitar la clonación en V1Jns-tPA creando una proteína quimérica constituida por el péptido líder tPA seguido por el resto de secuencias gp120 seguido por 30 residuos de aminoácido. Este diseño permitió la expresión de gp120 independiente de REV y la secreción de gp120 soluble a partir de células que hospedan este plásmido. Los oligómeros sentido y antisentido de PCR usados fueron 5'-CCC CGG ATC CTG ATC ACA GAA AAA TTG TGGGTC ACA GTC-3', y 5'-c CCC AGG AATC CAC CTG TTA GCG CTT TTC TCT CTG CAC CAC TCT TCT C-3'. Se subraya el códon de detención de la traducción. Estos oligómeros contienen los emplazamientos del enzima de restricción BamHI en cualquier extremo del marco abierto de lectura y traducción con un emplazamiento BcII localizado en 3' del BamHI del oligómero sentido. Se digirió de manera secuencial el producto de PCR con BcII seguido por BamHI y se ligó en V1Jns-tPA que se ha digerido con BgIII seguido por tratamiento con fosfatasa alcalina de intestino de ternero. Se secuenció el vector resultante para confirmar la fusión en marcos entre la secuencia de codificación del tPA líder y la gp120, y la expresión y secreción de gp120 se verificaron mediante análisis inmunoblot de las células RB transfectadas.

B. V1Jns-tPA-HIV_{IIIB} gp120

Este vector es análogo a I. A. excepto en que la cepa de HIV IIIB se usó para la secuencia de gp120. Los oligómeros sentido y antisentido de PCR usados fueron: 5'-CGT ACA TGA TCA CA GAA AAA TTG TGG GTC ACA GTC-3', y 5'-CCA CAT TGA TCA GAT ATC TTA TCT TTT TTC TCT CTG CAC CAC TCT TC-3', de manera respectiva. Estos oligómeros proporcionan emplazamientos BcII en cualquier extremo del inserto así como un EcoRV justo corriente arriba del emplazamiento BcII en el extremo 3'. El emplazamiento BcII 5' terminal permite la ligadura en el emplazamiento BgIII de V1Jns-tPA para crear un gen tpA-gp120 quimérico que codifica la secuencia líder de tPA y gp120 sin su secuencia líder nativa. Se verificaron los productos de la ligadura mediante digestión por restricción y secuenciamiento del ADN.

Ejemplo 7 Constructos de vacunas de gp140

Se prepararon estos constructos mediante PCR de manera similar como tPA-gp120 con el tPA líder en lugar del líder nativo, pero diseñado para producir antígeno secretado mediante terminación inmediata del gen NH_{2}-terminal del péptido de la transmembrana (secuencia del aminoácido carboxiterminal proyectado = NH_{2}-.....TNWLWYIK-COOH). A diferencia de los constructos que producen gp120, los constructos de gp140 deberían producir antígeno oligomérico y retener epitopos de neutralización del anticuerpo contenido en gp41 conocido tales como ELDKWA definido mediante el anticuerpo monoclonal 2F5.

Se prepararon los constructos de dos formas (A o B) dependiendo de si los emplazamientos de rotura proteolítica de gp160 en la unión de gp120 y gp41 se retenían (B) o eliminaban (A) mediante sustituciones de aminoácidos apropiadas tal como se describe por Kieny y col., (Prot. Eng. 2: 219-255 (1988)) (secuencia de tipo salvaje = NH_{2}-...KAKRRVVQREKR...COOH y la secuencia mutada = NH_{2}-...KAQNHVVQNEHQ...COOH con los aminoácidos mutados subrayados).

A. V1Jns-tPA-gp140/mutRRE-A/SRV-1-3'-UTR (basándose en HIV-1_{IIIB})

Se obtuvo este constructo mediante PCR usando el siguiente sentido y anti sentido de los oligómeros de PCR: 5'-CT GAA AGA CCA GCA ACT CCT AGG GAAT TTG GGG TTG CTC TGG-3', SEC. ID. :, y 5'-CGC AGG GGA GGT GGT CTA GAT ATC TTA TTA TTT TAT ATA CCA CAG CCA ATT TGT TAT G-3' para obtener un segmento AvrII/EcoRV del vector IVB (que contiene el segmento optimizado de RRE-A). El 3'-UTR, preparado como un segmento de gen sintético, que se deriva del Retrovirus-1 de Simios (SRV-1, véase a continuación) se insertó en un emplazamiento del enzima de restricción SrfI introducido de manera inmediata en 3' del marco de lectura abierto de gp140. Esta secuencia UTR ha sido descrita anteriormente como facilitante de la expresión independiente de rev de env y gag de HIV.

B. V1Jns-tPA-gp140/mutRRE-B/SRV-1 3'-UTR (Basándose en HIV-1_{IIIB})

Este constructo es similar a IIA excepto en que los emplazamientos de rotura proteolítica de env se han retenido usando el constructo IVC como material de partida.

C. V1Jns-tPA-gp140/opt30-A (basándose en HIV-1_{IIIB})

Se derivó este constructo de IVB mediante digestión del enzima de restricción AvrII y SrfI seguido por ligadura de un segmento de ADN sintético que corresponde a gp30 pero comprendido por codones óptimos para la traducción (véase gp32-opt a continuación). El ADN de gp30-opt se obtuvo de gp32-opt mediante amplificación del PCR usando el siguiente sentido y anti sentido de los oligómeros: 5'-CGT ACA CCT AGG CAT CTG GGG CTG CTC TGG-3'; y, 5'-CCA CAT GAT ATC G CCC GGG C TTA TTA TTT GAT GTA CCA CAG CCA GTT GGT GAT G-3', de manera respectiva. Este segmento de ADN se digirió con enzimas de restricción AvrII y EcoRV y se ligó en V1Jns-tPA-gp143/opt32-A (IVD) que ha sido digerido con AvrII y SrfI para eliminar el segmento de ADN correspondiente. Los productos resultante se verificaron mediante secuenciamiento del ADN de la ligadura de las uniones y análisis inmunoblot.

D. V1jns-tPA-gp140/opt30-B (basándose en HIV-1_{IIIB})

Este constructo es similar a IIC excepto en que se han retenido los emplazamientos de rotura proteolítica de env.

E. V1Jns-tPA-gp140/opt aII-A

El gen env de este constructo está comprendido de manera completa por codones óptimos. Las regiones constantes (C1, C5, gp32) son aquellas descritas en IVB, D, H con un segmento de ADN sintético adicional que corresponde a las regiones variables 1-5 se insertan usando un segmento de ADN sintético comprendido por codones óptimos para la traducción (véase ejemplo a continuación basándose en HIV-1 MN V1-V5).

F. V1Jns-tPA-gp1430/opt aII-B

Este constructo es similar a IIE en se han retenido los emplazamientos de rotura proteolítica de env.

G. V1Jns-tPA-gp140/opt aII-B

Este constructo es similar al IIE anterior excepto en que se usan secuencias de aminoácidos de env a partir de otras cepas que IIIB para determinar la utilización del códon óptimo a través de las regiones variables (V1-V5).

H. V1Jns-tPA-gp140/opt aII-B (cepas no III-B)

Este constructo es similar a IIG, excepto en que se han retenido los emplazamientos de rotura proteolítica de
env.

Ejemplo 8 Constructos de la vacuna gp160

Los constructos se prepararon de dos formas (A y B), dependiendo de los emplazamientos de rotura proteolítica de la gp160 que se han descrito anteriormente.

A. V1Jns-rev/env

Este vector es una variación del que se describe en la sección D anterior, excepto en que la región de codificación completa tat del exón 1 de borra hasta el principio del marco abierto de lectura REV. Se digirió el V1Jns-gp160_{IIIB} (ver la sección A anterior) con los enzimas de restricción PstI y KpnI para eliminar la región 5' del gen de gp160, Se usó la ampliación mediante PCR para obtener un segmento de ADN que codificaba el primer exón REV hasta el emplazamiento KpnI en la gp160 desde el clon genómico HXB2. Los oligómeros PCR sentido y anti sentido fueron 5'-GGT ACA CTG CAG TCA CCG TCC T ATG GCA GGA AGA AGC GGA GAC-3, y 5'-CCA CAT CA GGT ACC CCA TAA TAG ACT GTG ACC-3', respectivamente. Estos oligómeros proporcionan los emplazamientos de los enzimas de restricción PstI y KpnI en los extremos 5'- y 3'- del fragmento de ADN, respectivamente. El ADN resultante se digirió con PstI y KpnI, se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa, y se ligó con V1Jns-gp160 (PstI/KpnI). El plásmido resultante se verificó por digestión con enzimas de restricción.

B. V1Jns-gp160

El HIV_{IIIb} gp160 se clonó mediante amplificación PCR a partir del plásmido pF412 que contiene la mitad 3'-terminal del genoma HIV_{IIIb} derivado del clon HIVIIIB de HXB2. Los oligómeros PCR sentido y anti sentido fueron 5'-GGT ACA TGA TCA ACC ATG AGA GTG AAG GAC AAA TAT CAG C-3', y 5'-CCA CAT TGA TCA GAT ATC CCC ATC TTA TAG CAA AAT CCT TTC C-3' respectivamente. La secuencia de Kozak y el codon de fin de traducción se muestran subrayados. Estos oligómeros proporcionan los emplazamientos del enzima de restricción BcII fuera del marco de lectura de traducción abierta en ambos extremos del gen env. (los emplazamientos digeridos con BcII son compatibles por ligadura con los emplazamientos digeridos con BgIII así como por los emplazamientos BamHI). El oligómero anti sentido también inserta un emplazamiento EcoRV justo antes del emplazamiento BcII, tal como se ha descrito anteriormente con otros genes derivados mediante PCR. El gen de gp160 amplificado se purificó en gel de agarosa, se digirió con BcII y se enlazó con V1Jns que se había digerido con BgIII y tratado con fosfatasa alcalina de intestino de ternera. El gen clonado tuvo un tamaño aproximado de 2,6 kb, y cada unión de la gp160 con el V1Jns se confirmó mediante secuenciamiento de ADN.

C. V1Jns-tPA-gp160 (basado en HIV-1IIIB)

Este vector es similar al del Ejemplo 1(C) anterior, mediante PCR el excepto en que se obtuvo gp160 de longitud completa, sin la secuencia líder nativa. El oligómero con sentido es el mismo que el usado en I.C., y el oligómero anti sentido fue 5'-CCA CAT TGA TCA GAT ATC CCC ATC TTA TAG CAA AAT CCT TTC C-3'. Estos oligómeros proporcionan emplazamientos BcII tanto al final del inserto como un EcoRV justo aguas arriba del emplazamiento BcII en el extremo 3'. El emplazamiento BcII 5'-terminal permite la ligadura en el emplazamiento BgIII de V1Jns-tPA para crear un gen quimérico tPA-gp160 que codifica la secuencia líder tPA y gp160 sin su secuencia nativa líder. Los productos de ligazón se verificaron mediante enzimas de restricción y secuenciamiento de ADN.

D. V1Jns-tPA-gp160/opt C1/opt41-A (basado en HIVIIIB)

Este constructo se basó en IVH, teniendo un segmento de codon completo optimizado para C5 y gp41, mejor que para gp32, con un segmento de codon completo optimizado adicional (ver más adelante) que sustituye a C1 en el término amino de la gp120 que sigue al líder tPA. El nuevo segmento C1 se junto al resto del segmento gp143 mediante SOE PCR usando los siguientes oligómeros de PCR para sintetizar el segmento unido C1/143 5'-CCT GTG TGT GAC TTT AAA C TGC ACT GAT TTG AAG AAT GAT ACT AAT AC-3'. El gen de gp143 resultante contiene el uso óptimo del codon, excepto las regiones V1-V5, y tiene un único emplazamiento del enzima de restricción PmeI en la unión de C1 y V1 para la inserción de regiones variables procedentes de otros genes HIV.

E. V1Jns-tPA-gp160/opt C1/opt41-B (basado en HIV-1IIIB)

Este constructo es similar a IIID excepto en que los emplazamientos de rotura proteolítica env se han retirado.

F. V1Jns-tPA-gp160/opt all-A (Basado en HIV-1IIIB)

El gen env de este constructo está comprendido completamente por los codones óptimos anteriormente descritos. Las regiones constantes (C1, C5, gp32) son las que se describen en IIID,E que se usan como cassette (empleado para la gp160s completamente optimizado), mientras que las regiones variables, V1-V5, se derivan de un segmento de ADN sintético comprendido por codones óptimos.

G. V1Jns-tPA-gp160/opt all-B

Este constructo es similar a IIIF excepto en que los emplazamientos de rotura proteolítica env se han retirado.

H. V1Jns-tPA-gp160/opt all-A (cepas no-IIIB)

Este constructo es similar a IIIF anterior excepto en que se usaron las secuencias de aminoácidos env procedentes de cepas distintas a IIIB para determinar el uso optimo del codon a través de las regiones variables (V1-V5).

I. V1Jns-tPA-gp160/opt all-B (cepas no-IIIB)

Este constructo es similar a IIIH excepto en que los emplazamientos de rotura proteolítica env se han retirado.

Ejemplo 9 Constructos de vacuna gp143

Estos constructos se prepararon mediante PCR de manera similar al resto de constructos que contienen tPA descritos anteriormente (tPA-gp120, tPA-gp140, y tPA-gp160), con el líder tPA en lugar de la nativa líder, pero diseñada para producir env terminado en COOH ligado a la membrana (secuencia de aminoácidos celular proyectada = NH2-NRVRQGYSP-COOH). Este constructo se diseño con el objetivo de combinar la expresión aumentada de env que acompaña la introducción de tPA, y minimizar la posibilidad de que un transcripto o región del péptido correspondiente a la porción intracelular de env podría afectar negativamente a la expresión o estabilidad/trasporte de la proteína hasta la superficie celular. Los constructos se prepararon de dos formas (A y B), dependiendo de los emplazamientos de rotura proteolitica de la gp160 como se han descrito anteriormente. El fragmento residual gp41 que resulta del truncamiento de gp143 se denomina gp32.

A. V1Jns-tPA-gp143

Este constructo se preparó mediante PCR usando el plásmido pF412 con los siguientes oligómeros PCR sentido y anti sentido 5'-GGT ACA TGA TCA CA GAA AAA TTG TGG GTC ACA GTC-3', ID DE SEC..:, y 5'-CCA CAT TGA TCA G CCC GGG C TTA GGG TGA ATA GCC CTG CCT CAC TCT GTT CAC-3'. El segmento de ADN resultante contiene el emplazamiento de restricción BcII en ambos extremos para clonación en el V1Jns-tPA/digerido con BgIII con un emplazamiento SrfI localizado inmediatamente 3'- al marco abierto de lectura env. Los constructos se verificaron mediante secuenciamiento de ADN de las uniones de ligadura y análisis por inmunoblot de las células transfectadas.

B. V1Jns-tPA-gp143/mutRRE-A

Este constructo estuvo basado en el IVA

Rompiendo el segmento de ADN usando el único emplazamiento del enzima de restricción MunI y el emplazamiento SrfI situado aguas abajo anteriormente descrito. Este segmento corresponde a una porción gp120 del dominio C5, y la gp32 completo. Un segmento de ADN sintético correspondiente al elemento de respuesta rev de 350 bp (RRE A) de la gp160, comprendido por codones óptimos de traducción, se juntó con el resto del segmento gp32 mediante PCR de extensión solapada de uniones (SOE) creando un emplazamiento del enzima de restricción AvrII en la unión de los dos segmentos (pero sin cambios en la secuencia de aminoácidos). Estas reacciones PCR se llevaron a cabo usando los mismos oligómeros sentido y anti sentido que para usar la región que contenía gp32 5'-CT GAA AGA CCA GCA ACT CCT AGG GAT TTG GGG TTG CTG TGG-3' y 5'-CCA CAT TGA TCA G CCC GGG C TTA GGG TGA ATA GCC CTG CCT CAC TCT GTT CAC-3' (que se usó como oligómero anti sentido para IVA), respectivamente. El segmento RRE mutado (mutRRE-A) se junto con la secuencia salvaje de gp32 mediante SOE PCR usando el siguiente oligómero con sentido 5'-GGT ACA CAA TTG GAC GAC CGA GTT ATA TAA ATA TAA G-3' y el oligómero anti sentido usado para fabricar el segmento gp32. El segmento de ADN unido resultante se digirió con los enzimas de restricción MunI y SrfI y se ligó en el plásmido digerido pariente gp143/MunI/SrfI. El constructo resultante se verifico por secuenciamiento de ADN de la ligadura, y mediante análisis SOE PCR de las uniones e inmunoblot de las células transfectadas.

C. V1Jns-tPA-gp143/mutRRE-B

Este constructo es similar a IVB excepto en que los emplazamientos de rotura proteolítica env se han retenido usando el segmento del gen sintético mutRRE-B en lugar de mutRRE-A.

\newpage

D. V1Jns-tPA-gp143/opt32-A

Este constructo se derivó a parir de IVB mediante digestión con los enzimas de restricción AvrII y Srfl seguido de ligadura con un segmento sintético de ADN que corresponde a gp32, pero que comprendo codones óptimos para traducción (ver gp32 opt, más adelante). Los productos resultantes se verificaron mediante secuenciamiento de ADN de las uniones de ligadura y análisis por inmunoblot.

E. V1Jns-tPA-gp143/opt32-B

Este constructo es similar a IVD excepto en que los emplazamientos de rotura proteolítica env se han retenido usando IVC como plásmido inicial.

G. V1Jns-tPA-gp143/SRV-1 3'-UTR

Este constructo es similar a IVA excepto en que el 3'-UTR derivado del Retrovirus-1 de simio (SRV-1, ver más adelante) se insertó en el emplazamiento del enzima de restricción SrfI introducido inmediatamente 3'- después de marco de lectura abierta gp143. Esta secuencia UTR se ha descrito anteriormente como facilitador de la expresión independiente de rev del env y gac de HIV.

H. V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32A

Este constructo se basó en IVD, teniendo un segmento codon completo optimizado para C5 y gp32 con un segmento codon completo optimizado adicional (ver más adelante) sustituyendo C1 en el extremo terminal de la gp120 siguiendo el líder tPA. El nuevo segmento C1 se unió al segmento gp143 restante mediante SOE PCR usando los siguientes oligómeros para sintetizar mediante PCR el segmento unido C1/143 5'-CCT GTG TGT GAC TTT AAA C TGC ACT GAT TTG AAG AAT GAT ACT AAT AC-3'. El gen de gp143 resultante contiene el codon de uso óptimo, excepto por las regiones V1-V5 y tiene un único emplazamiento del enzima de restricción PmeI colocado en la unión de C1 y V1 para la inserción de regiones variables procedentes otros genes HIV.

I. V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32B

Este constructo es similar a IVH excepto en que los emplazamientos de rotura proteolítica env se han retenido.

J. V1Jns-tPA-gp143/opt all-A

El gen env de este constructo esta comprendido completamente por codones óptimos. Las regiones constantes (C1, C5, gp32) son los que se describen en 4B,D,H con un segmento adicional sintético correspondiente a las regiones variables V1-V5 insertado usando un segmento sintético de ADN comprendido por codones óptimos para la
traducción.

K. V1Jns-tPA-gp143/opt all-B

Este constructo es similar a IVJ excepto en que los emplazamientos de rotura proteolítica env se han retenido.

L. V1Jns-tPA-gp143/opt all-A (cepas no IIIB)

Este constructo es similar a IIIG anterior excepto en que se usaron secuencias de aminoácidos env procedentes de cepas diferentes a IIIB para determinar codones de uso optimo a través de las regiones variables (V1-V5).

M. V1Jns-tPA-gp143/opt all-B (cepas no IIIB)

Este constructo es similar a IIIG anterior excepto en que se usaron secuencias de aminoácidos env procedentes de cepas diferentes a IIIB para determinar codones de uso optimo a través de las regiones variables (V1-V5).

Ejemplo 10 Constructos de vacuna gp143/gly

Estos constructos se prepararon mediante PCR de manera similar al resto de constructos que contienen tPA descritos anteriormente (tPA-gp120, tPA-gp140, tPA-gp143, y tPA-gp160), con el líder tPA en lugar de la nativa líder, pero diseñada para producir env terminado en COOH ligado a la membrana, como gp143. Sin embargo, los constructos gp143/glyB difieren de gp143 en que los seis aminoácidos proyectados para comprender la región del péptido intracelular, los últimos 4 son iguales que los que tienen el extremo carboxilo de la glicoforina humana (glyB) (secuencia de aminoácidos intracelular proyectada = NH_{2}-NRLIKA-COOH, con los residuos subrayados correspondientes a glyB y "R" comunes tanto a env como a gly). Este constructo se diseñó con el objetivo de conseguir más expresión de env y visando directamente la superficie celular eliminando completamente cualquier transcripto o región del péptido correspondiente a la porción intracelular de env que podría afectar negativamente a la expresión o estabilidad/trasporte de la proteína hasta la superficie celular, sustituyendo esta región por una secuencia de péptido procedente de una proteína abundantemente expresada (glyB), que tiene una región citoplasmática corta (secuencia de aminoácidos intracelular = NH_{2}-RRLIKA-COOH). Los constructos se prepararon de dos formas (A y B), dependiendo de cómo los emplazamientos de rotura proteolitica de la gp160 se han eliminado o retenido, como se ha descrito anterior-
mente.

A. V1Jns-tPA-gp143/op32-A/glyB

Este constructo es el mismo que IVD excepto en que se usó el siguiente oligómero anti sentido PCR para sustituir la región del péptido intracelular gp143 con el de la glicoforina B que se ha descrito anteriormente: 5'-CCA CAT GAT ATC G CCC GGG C TTA TTA GGC CTT GAT CAG CCG GTT CAC AAT GGA CAG CAC AGC-3.

B. V1Jns-tPA-gp143/opt32-B/glyB

Este constructo es similar a VA excepto en que en que los emplazamientos de rotura proteolítica env se han retenido.

C. V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32-A/glyB

Este constructo es similar a VA, excepto que la primera región constante (C1) de gp120 se sustituye por los codones óptimos para la traducción como en IVH.

D. V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32-B/glyB

Este constructo es similar a VC excepto en que los emplazamientos de rotura proteolítica env se han retenido.

E. V1Jns-tPA-gp143/opt all-A/glyB

El gen env de este constructo esta comprendido enteramente por codones óptimos, tal como se ha descrito anteriormente.

F. V1Jns-tPA-gp143/opt all-B/glyB

Este constructo es similar a VE excepto en que los emplazamientos de rotura proteolítica env se han retenido.

G. V1Jns-tPA-gp143/opt all-A/glyB (cepas no IIIB)

Este constructo es similar a IIIG anterior excepto en que se usaron secuencias de aminoácidos env procedentes de cepas diferentes a IIIB para determinar codones de uso optimo a través de las regiones variables (V1-V5).

H. V1Jns-tPA-gp143/opt all-B/glyB (cepas no-IIIB)

Este constructo es similar a VG excepto que en que los emplazamientos de rotura proteolítica env se han retenido.

Constructos de vacuna HIV env con eliminaciones de bucle variable

Estos constructos pueden incluir todas las formas env anteriormente relacionadas (gp120, gp140, gp143, gp160, gp143/glyB) pero tiene bucles variables en el interior de la región gp120 borradas durante la preparación de (por ejemplo, V1, V2, y/o V3). El objetivo de estas modificaciones es eliminar los segmentos de péptido que pueden ocluir la exposición de los epitopos de neutralización conservados tales como el emplazamiento de enlace CD4. Por ejemplo, se uso el siguiente oligómero en una reacción PCR para crear un borrado V1/V2 que resulta de juntar los segmentos C1 y C2: 5'-CTG ACC CCC CTG TGT GTG GGG GCT GGC AGT TGT AAC ACC TCA GTC ATT ACA
CAG-3.

Ejemplo 11 Diseño de segmentos de gen sintético para aumentar la expresión del gen env

Los segmentos de gen se convirtieron en secuencias que tenias idénticas secuencias traducidas/excepto donde se indica), pero con un uso alternativo del codon como define R. Lathe en un artículo de investigación J. Molec. Biol. Vol. 183, pp. 1-12 (1985) entitled "Synthetic Oligonucleotide Probes Deduced from Aminoácido Sequence Data: Theoretical y Practical Considerations". La metodología que se describe más adelante para incrementar la expresión independiente de rev de los segmentos de genes env de HIV se basó en nuestra hipótesis que la conocida incapacidad para expresar este gene de forma eficaz en células de mamífero es consecuencia de la composcion del transcripto global. Así, usando codones alternativos que codifican la misma secuencia de proteína se pueden eliminar las restricciones de la expresión de env en ausencia de rev. La inspección del utilización del códon en el interior de env revela que un elevado porcentaje de codones están entre los que se usan de forma infrecuente por los genes humanos altamente expresados. El procedimiento de sustitución específica del codon se puede describir como siguen, empleando los datos de Lathe y col.:

1.

Identificar la localización de codones para un marco de lectura abierta adecuado.

2.

Comparar los codones de tipo salvaje respecto de las de las frecuencias observadas de uso por los genes humanos (se referencia a la Tabla 3 de Lathe y col.).

3.

Si el codon no es el que se emplea más habitualmente, se sustituye por un codon óptimo para una expresión elevada basada en los datos de la Tabla 5.

4.

Inspeccionar el tercer nucleótido del nuevo codon, y el primer nucleótido del codon adyacente inmediatamente 3'- del primero. Si se ha creado un par 5'-CG-3' por la nueva selección del codon, sustituirlo por la elección indicada en la Tabla 5.

5.

Repetir este procedimiento hasta que se haya sustituido la secuencia completa del gen.

6.

Inspeccionar la secuencia del nuevo gen respecto de las secuencias indeseables generadas por estas sustituciones del codon (por ejemplo, secuencias "ATTTA", creación inadvertida de emplazamientos de unión de intrones, emplazamientos no deseados de enzimas de restricción, y sustituir los codones que eliminan estas secuencias.

7.

ensamblar los segmentos de los genes sintéticos, y ensayar la expresión mejorada.

Estos procedimientos se usaron para crear los siguientes segmentos del gen sintético del env de HIV creando un gen enteramente comprendido por el uso de codones óptimos para la expresión (i) gp120-C1 (opt); (ii) V1-V5 (opt); (iii) RRE-A/B (mut ó opt); y (iv) gp30 (opt) con porcentajes de sustitución de codon/sustituciones de nucleótido de 56/19, 73/26, 78/28, y 61/25 obtenidos para cada segmento, respectivamente. Cada uno de estos segmentos se ha descrito en detalle anteriormente, listándose a continuación las secuencias reales.

gp120-C1 (opt)

Se trata de una región constante 1 (C1) del segmento de gen de gp120 procedente del V1 desde el extremo N hasta el principio, diseñado para tener un uso optimo del codon para expresión.

1

\newpage

MN V1-V5 (opt)

Se trata de un segmento de gen que corresponde a la secuencia de la proteína derivada de HIV MN V1-V5 (1066BP) que tiene un uso óptimo del codon para expresión

2

3

\vskip1.000000\baselineskip

RRE.Mut (A)

Se trata de un segmento de Y que corresponde al elemento de respuesta rev (RRE) de HIV-1 que comprende el uso optimo del codon para expresión. La forma "A" se ha eliminado también mediante los emplazamientos de rotura proteolítica en las uniones gp120/gp41 usando los nucleótidos indicados en negrita.

\vskip1.000000\baselineskip

4

\newpage

RRE.Mut (B)

Se trata de un segmento de Y que corresponde al elemento de respuesta rev (RRE) de HIV-1 que comprende el uso optimo del codon para expresión. La forma "B" retiene los emplazamientos de rotura proteolítica en las uniones gp120/gp41.

5

gp32 (opt)

Se trata de un segmento del gen de gp32 procedente del emplazamiento AvrII (que comienza inmediatamente al final del RRE) hasta el extremo de la gp143 comprendido por los codones óptimos para la expresión.

6

SRV-1 CTE (A)

Se trata de un segmento del gen sintético que corresponde a 3'-UTR procedente del Retrovirus-1 de genoma de simio. Este ADN está colocado en la siguiente orientación en el extremo 3'- de los genes HIV para incrementar la expresión independiente de rev.

7

SRV-1 CTE (B)

Este segmento de gen sintético es idéntico al SRV-1 CTE (A) mostrado anteriomente, excepto en que se uso una única mutación del nucleótido (que se indica en negrita) para eliminar una secuencia ATA. Se ha asociado esta secuencia con una mayor sustitución de ARNm.

8

Ejemplo 12 Expresión In Vitro de la vacuna gp120

La expresión In vitro se ensayó en células de rabdomiosarcoma (RD) humanas transfectadas respecto de estos constructos. La cuantificación de la tPA-gp120 secretada procedente de las células RD transfectadas mostró que el vector V1Jns-tPA-gp120 produjo gp120 segregado.

Vacunación In Vivo con gp120

Ver la Fig. 12 (datos de ratón)

Reactividades específicas con el antígeno de los linfocitos T respecto de gp120 V1Jns-tPA-gp120MN inducido con PNV de Clase II restringido con MHC

Se sacrificaron ratones Balb/c que se habían vacunado dos veces con 200 \mug de V1Jns-tPA-gp120MN, y se extrajeron sus bazos para las determinaciones in vitro de las reactividades de los linfocitos T auxiliares respecto de la gp120 recombinante. Se llevaron a cabo los ensayos de proliferación de células T con PBMC (células mononucleares de la sangre periférica) usando gp120IIIB recombinante (Repligen, catalogo #RP1016-20) a 5 \mug/ml usando 4 x 10^{5}. células/ml. Se obtuvieron los niveles basales de captación de ^{3}-timidina cultivando las células solamente en medio, a la vez que se inducía la máxima proliferación con estimulación con 2 \mug/ml de ConA. Las reactividades inducidas con ConA alcanzaron el máximo a \sim3 días, y se recogieron en ese momento, con muestras con medio de control a la vez que las muestras tratadas con antígeno se recogieron a los 5 días con más medio de control. Las respuestas de los ratones vacunados se compararon con ratones singénicos de edad similar. Los controles ConA positivos produjeron una proliferación elevada, tanto para los ratones inmunizados como no inmunizados. Se obtuvieron respuestas de memoria en células auxiliares T4 fuertes con el tratamiento con gp120 en los ratones vacunados, mientras que los ratones no inmunizados no presentaron respuesta (el umbral de la reactividad específica es un índice de estimulación (SI) de >3-4; el SI se calcula como la relación entre cpm de la muestra/cpm del medio. Se obtuvieron SI de 65 y 14 para los ratones vacunados, cuando se les compara con los títulos ELISA anti-gp120 de 5.643 y 11.900, respectivamente, para estos ratones. De forma interesante, para estos dos ratones, el mayor respondedor al anticuerpo produjo una reactividad de células T significativamente inferior a del ratón que tenia el menor titulo de anticuerpos. Este experimento demuestra que el vector gp120 secretado activa de forma eficiente las células auxiliares T tanto in vivo como in vitro, ya que genera fuertes respuestas de anticuerpo. Además, cada uno de estas respuestas inmunes se determino usando un antígeno que era heterólogo, comparado con la que se codifica mediante la inoculación de PNV
(IIIB vs. MN):

Ejemplo 13 Vacunas gp160

Además de los constructos gp120 secretados, hemos preparado constructos de expresión para la gp160 de longitud completa enlazado a la membrana. Las razones de un constructo gp160, además de la gp120, son (1) más epitopos disponibles, tanto para la estimulación de CTL como para la producción de anticuerpos neutralizantes que incluyen gp41, frente al que se dirige un potente anticuerpo monoclonal de HIV (2F5, ver más adelante); (2) se puede obtener una estructura de proteína más nativa respecto al gp160 producido por virus; y, (3) el éxito de los constructos HA de la gripe ligados a la membrana respecto de la inmunogenicidad [Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993; Montgomery, D., et al., DNA y Célula Biol., 12:777-783, 1993]. La gp160 retiene sustancialmente la dependencia REV incluso con una secuencia líder de péptido heterólogo, de forma que se fabricaron más constructos para incrementar la expresión en ausencia de REV.

Ejemplo 14 Ensayo de linfocitos T HIV citotóxicos

Los procedimientos descritos en esta sección ilustran el ensayo usado para ratones vacunados. Se puede usar un ensayo similar en lo esencial con primates, salvo que las líneas de células B autólogas deben establecerse para uso como células diana para cada animal. Esto se puede llevar a cabo para seres humanos usando el virus Epstein-Barr y para mono rhesus, el virus del herpes B.

Se derivaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se tanto de sangre recientemente extraída como de bazo usando centrifugación de Ficoll-Hypaque para separar los eritrocitos de los glóbulos blancos. Para los ratones, se pueden usar también los ganglios linfáticos. Se pueden preparar los efectores CTL a partir de los PBMC mediante tanto cultivo in vitro en L-2 (20 U/ml) y concanavalina A (2 \mug/ml) durante 6-12 días o usando un antígeno específico que emplea un número igual de células que presentan antígeno irradiado. El antígeno específico puede consistir tanto de péptidos sintéticos (9-15 aminoácidos normalmente) que son epitopos conocidos para el reconocimiento de CTL en los haplotipos MHC de los animales usados, o constructos del virus vaccinia diseñados para expresar el antígeno apropiado. Las células diana pueden ser líneas celulares tanto singénicas como emparejadas con el haplotipo MHC que se han tratado para presentar el antígeno apropiado, como se describe para la estimulación in vitro de los CTL. Para los ratones Balb/c, se puede usar el péptido P18 (ArgIIeHisIIeGlyProGlyArgAlaPheTyrThrThrLysAsn, ID DE SEC.: 51., para la cepa MN de HIV) en concentración 10 \muM para reestimular el CTL in vitro usando esplenocitos singenéticos irradiados, y se puede usar para sensibilizar células diana durante el ensayo de citotoxicidad a 1-10 \muM por incubación a 37ºC durante aproximadamente dos horas antes del ensayo. Para este haplotipo de ratón MHC, H-2^{d}, la línea de células de mastotitoma de murina P815 proporciona buenas células diana. Las células diana sensibilizadas al antígeno se cargan con Na^{51}CrO_{4}, que se libera desde el interior de las células diana tras matarlas con CTL, por incubación de las dianas durante 1-2 horas a 37ºC. (0,2 mCi para \approx 5 x 10^{6} células), seguido por varios lavados de las células diana. Las poblaciones CTL se mezclaron con las células diana en relaciones diferentes de efector a diana, tales como 100:1, 50:1, 25:1, etc., se peletizaron conjuntamente, y se incubaron durante 4-6 horas a 37ºC antes de recoger los sobrenadantes, que a continuación se ensayaron respecto de la liberación de radioactividad usando un contador gamma. Se calculó la citotoxicidad en forma de cuentas que se pueden liberar desde las células diana (que se pueden obtener usando tratamiento con Triton X-100 al 0,2%) del que se había restado la liberación espontánea procedente de las células diana.

Ejemplo 15 Ensayo de anticuerpos Hiv específicos

Se diseño ELISA para detectar los anticuerpos generados frente a HIV usando tanto proteína recombinante específica o péptidos sintéticos como antígenos sustrato. Re recubrieron placas de microvaloración de 96 pocillos a 4ºC durante toda la noche con el antígeno recombinante a 2 \mug/ml en solución PBS (solucion salina de fosfato tamponada) usando 50 \mul/pocillo, en una plataforma oscilante. Los antígenos consistieron tanto en proteína recombinante (gp120, rev: Repligen Corp.; gp160, gp41: American Bio-Technologies, Inc.) o péptido sintético (péptido V3 correspondiente a secuencias de aislado de virus a partir de IIIB, etc.: American Bio-Technologies, Inc.; epitopo gp41: American Bio-Technologies, Inc; epitopo gp41 del anticuerpo monoclonal 2F5). Las placas se lavaron dos veces con tampón de lavado (PBS/Tween 20 al 0,05%) seguido por la adición de 200 \mul/pocillo de tampón de bloqueo (solución de leche de Carnation al 1% en PBS/Tween 20 al 0,05%) durante 1 h a temperatura ambiente con oscilación. Se diluyeron el pre-suero y el suero inmune en el tampón del bloqueo en el intervalo de concentraciones deseado, y se añadieron 100 \mul por pocillo. Las placas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con oscilación, y después se lavaron cuatro veces con tampón de lavado. Se añadieron a continuación a cada muestra anticuerpos secundarios conjugados con la peroxidasa del rábano picante (Ig anti-rhesus, Southern Biotechnology Associates; Ig anti-mouse y anti-rabbit, Jackson Immuno Research) diluída a 1:2000 en tampón de bloqueo a 100 ml/pocillo y se incubaron 1 h a temperatura ambiente con oscilación. Las placas se lavaron cuatro veces con tampón de lavado, y se revelaron a continuación por adición de 100 \mul/pocillo de una solucion de o-fenilendiamina (o-PD, Calbiochem) al 1 mg/ml en 100 mM de tampón de citrato a pH 4,5. Se leyó la absorbancia de las placas a 450 nm tanto cinéticamente (primeros diez minutos de reacción) y a los puntos finales de 10 y 30 minutos (lector de microplacas Thermo-max, Molecular Devices).

Ejemplo 16 Ensayo de anticuerpos Hiv neutralizantes

Se llevo a cabo como sigue los ensayos de neutralización in vitro de asilados de HIV usando sueros derivados de animales vacunados. Los sueros de ensayo y pre-inmune se inactivaron térmicamente a 56ºC durante 60 minutos antes del uso. Se añadió una cantidad valorada de HIV-1 con diluciones 1:2 en serie de suero de ensayo, y se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente antes de la adición de 10^{5} células linfoides humanas MT-4 en placas de microvaloración de 96 pocillos. Las mezclas virus/célula se incubaron durante días a 37ºC y se ensayó la muerte de células muertas por virus en cultivos teñidos con tinción de tetrazolio. La neutralización de los virus se observa evitando la muerte de las células mediada por virus.

Ejemplo 17 Aislamiento de genes procedentes de asilados clínicos de Hiv

Los genes víricos HIV se clonaron a partir de PBMC infectados que se habían activado mediante tratamiento con ConA. El procedimiento preferido para obtener los genes víricos fue la amplificación con PCR a partir del genoma celular infectado usando oligómeros específicos que flanqueaban los genes deseados. Un segundo procedimiento para obtener genes víricos es la purificación de ARN vírico procedente de los sobrenadantes de células infectadas, y preparando ADNc a partir de este material con posterior PCR. Este procedimiento fue muy parecido al que se ha descrito anteriormente para la clonación del gen B7 de murina, excepto en los oligómeros de PCR usados, y los hexámeros aleatorios usados para fabricar ADNc en lugar de los oligómeros cebadores específicos.

El ADN genómico se purifico desde los residuos celulares infectados mediante lisis en solucion STE (NaCl 10 mM, EDTA 10 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,0) a las que se añadieron Proteinasa K y SDS a concentraciones finales de 0,1 mg/ml y 0,5%, respectivamente. Esta mezcla se incubó durante toda la noche a 56ºC y se extrajo con 0,5 volúmenes de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1). La fase acuosa se precipitó a continuación por adición de acetato de sodio hasta una concentración final de 0,3 M y dos volúmenes de etanol frío. Tras peletizar el ADN a partir de las solucion, se resuspendió el ADN en la solucion 0,1 x TE (1 x TE = Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM). En este punto, se añadió SDS al 0,1% con 2 U de ARNasa con incubación durante 30 minutos a 37ºC. Esta solución se extrajo con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico y se precipitó a continuación con etanol, como antes. Se suspendió el ADN en 0,1 x TE y se cuantificó midiendo su absorbancia en el ultravioleta a 260 nm. Las muestras se almacenaron a -20ºC hasta que se usaron en PCR.

Se llevó a cabo el PCR usando el kit y procedimiento Perkin-Elmer Cetus usando los siguientes oligómeros sentido y antisentido para gp160: 5'-GA AAG AGC AGA AGA CAG TGG CAA TGA -3', y 5'-GGG CTT TGC TAA ATG GGT GGC AAG TGG CCC GGG C ATG TGG-3', respectivamente. Estos oligómeros se añaden en un emplazamiento SrfI en el extremo 3'- del fragmento de ADN resultante. Los segmentos derivados por PCR se clonan en cualquiera de los vectores de vacunación V1Jns o V1R y en las regiones V3 así como en los emplazamientos de unión de ligaduras que se confirma por secuenciamiento del ADN.

Ejemplo 18 Ensayo de proliferación de células T

Se obtuvieron las PBMC, y se ensayaron respecto a respuestas de memoria para un antígeno específico, tal como se ha determinado mediante proliferación dentro de la población de PBMC. Se siguió la proliferación mediante ^{3}H-timidina, que se añade a los cultivos de células en las últimas 18-24 horas de incubation antes del cultivo. Las células recogidas retienen en ADN que contiene el isótopo sobre los filtros, si se ha producido la proliferación, mientras que las células durmientes no incorporan el isótopo, que no se retiene en el filtro de forma libre. Para cualquier especie de roedor o primate, se plaquean a x 10^{5} células en placas de micro valoración de 96 pocillos en un total de 200 m\mul de medio completo (RPMI/fetal de ternera al 10%). Se determinaron las respuestas de proliferación de fondo usando solamente PBMC y medio, mientras que no se generaron respuestas específicas por el uso de lectinas tales como fitohemoaglutina (PHA) o concanavalina A (ConA) a concentraciones de 1-5 \mug/ml para servir como control positivo. El antígeno específico consiste de cualquier epitopo de péptido conocido, proteína purificada, o virus inactivo. Las concentraciones de antígeno están comprendidas entre 1-10 \muM para péptidos y 1-10 \mug/ml para proteína. Los máximos de proliferación inducidas por lectinas se produjeron a los 3-5 días de incubación de las células de cultivo, mientras que el máximo de las respuestas al antígeno ocurrieron a 5-7 días. La proliferación específica se produce cuando el conteo de radiación que se obtiene es al menos tres veces superior al del fondo del medio, y es a menudo una relación respecto del fondo, o Índice de Estimulación (SI). Se sabe que la gp160 del HIV contiene varios péptidos conocidos por producir proliferación de las células T inmunizadas con gp160/gp120 o individuos infectados por HIV. Los más frecuentemente usado de estos son: T1(LysGlnIIeIIeAsnMetTrpGlnGluValGlyLysAlaMetTyrAla; T2 (HisGluAspIIeIIeSerLeuTrpAspGlnSerLeuLys); y, TH4 (AspArgVaIIIeGluValValGlnGlyAalTyrArgAlaIIeArg). Se ha demostrado que estos péptidos estimulan la proliferación de PBMC en ratones, primates no humanos y seres humanos sensibilizados al antígeno.

Ejemplo 19 Preparación del Vector V1R

En un esfuerzo por continuar optimizando nuestro vector básico de vacunación, preparamos un derivado de V1Jns que se denominó V1R. El objetivo de la construcción de este vector fue obtener un vector vacuna de tamaño mínimo, es decir, sin secuencias innecesarias ADN, que siguiera reteniendo todas las características de expresión del gen heterólogo optimizado y con un rendimiento de plásmido tan alto como los que obtuvieron V1J y V1Jns. Determinamos a partir de la bibliografía así como mediante experimentación que (1) las regiones en el interior del esqueleto pUC que comprende el origen de replicación de E. coli podían eliminarse sin afectar al rendimiento del plásmido a partir de la bacteria; (2), la región 3'- del gen kan^{T} seguido del marco abierto de lectura de la kanamicina podrían eliminarse si se inserta en su lugar un terminador bacteriano; y, (3), se podían eliminar \approx 300 bp procedentes de la mitad 3' del terminador BGH sin afectar su función reguladora (siguiendo el emplazamiento original del enzima de restricción KpnI en el interior del elemento BGH).

El V1R se construyó usando PCR para sintetizar tres segmentos de ADN a partir de V1Jns, que representaban el promotor CMVintA/terminador BGH, origen de replicación, y los elementos de resistencia a la kanamicina, respectivamente. Se añadieron enzimas de restricción únicos para cada segmento en cada extremo del segmento usando oligómeros PCR: SspI y XhoI para CMVintA/BGH; EcoRV y BamHI para el gen kan^{r} gene; y, BcII y SalI para el ori^{r}. Estos emplazamientos de enzima se eligieron debido a que permiten la ligadura direccional de cada uno de los segmentos de ADN derivados mediante PCR, con pérdida posterior de cada emplazamiento: EcoRV y SspI dejan ADN de extremos romos que son compatibles para enlace, mientras que BamHI y BcII dejan salientes complementarios, al igual que SalI y XhoI. Tras la obtención de estos segmentos mediante PCR, cada segmento se digirió con los enzimas de restricción apropiados anteriormente indicados, y a continuación se ligaron entre sí en una única reacción de mezcla que contenía los tres segmentos de ADN. Se diseñó el extremo 5'- del ori^{r} para que contuviera el la secuencia independiente del terminador T2 rho que se encuentra normalmente en esta región, de forma que pueda proporcionar información de terminación para el gen de resistencia a la kanamicina. El producto ligado se confirmó por digestión con enzimas de restricción (> 8 enzimas), así como mediante secuenciamiento de ADN de las uniones de ligadura. Los rendimientos del plásmido de ADN y la expresión heteróloga usando genes víricas dentro de V1R parecieron similares al de V1Jns. La reducción neta conseguida en el tamaño del vector fue de 1346 bp (V1Jns = 4,86 kb; V1R =3,52 kb), ver la Fig. 11, ID de SEC.:45:.

Las secuencias de oligómero PCR usadas para sintetizar el V1R (los emplazamientos del enzima de restricción están subrayados e identificados entre corchetes detrás de la secuencia.

(1) 5'-GGT ACA AAT ATT GG CTA TTG GCC ATT GCA TAC G-3' [SspI], ID de SEC.:,

(2) 5'-CCA CAT CTC GAC GAA CCG GGT CAA TTC TTC AGC ACC-3' [XhoI], ID DE SEC.::

(para el segmento CMVintA/BGH)

(3) 5'-GGT ACA GAT ATC GGA AAG CCA CGT TGT GTC TCA AAA TC-3' [EcoRV], ID DE SEC.::

(4) 5'-CCA CAT GGA TCC G TAA TCC TCT GCC AGT GTT ACA ACC-3' [BamHI], ID DE SEC.::

(para el segmento del gen de resistencia a la kanamicina)

(5) 5'-GGT ACA TGA TCA CGT AGA AAA GAT CAA AGG ATC TTC TTG-3' [BclI], ID DE SEC.::,

(6) 5'-CCA CAT GTC GAC CC GTA AAA AGG CCG CGT TGC TGG-3' [SalI], ID DE SEC.::

(para el origen de replicación de E. coli)

Las uniones de ligadura se secuenciaron para V1R usando los oligómeros siguientes:

5'-GAC CCA ATA TAA ATG TAC-340 , ID de SEC:: [unión CMVintA kan^{r}.]

5'-CAA TAG CAG GCA TGC-3', ID de SEC.:: [unión BGH/ori]

5'-G CAA GCA GCA GAT TAC-3', ID de SEC.:: [unión ori/kan^{r}]

Ejemplo 20 Productos génicos finales de expresión heteróloga de HIV

Los genes estructurales de HIV tales como env y gac requieren la expresión del gen regulador rev, con el fin de producir proteínas de longitud completa de manera eficiente. Hemos encontrado que la expresión de gac dependiente de rev produjo niveles menores de proteínas, y que el propio rev podía ser tóxico para las células. Aunque hemos conseguido niveles relativamente elevados de expresión dependiente de rev de la gp160 in vitro, esta vacuna excita bajos niveles de anticuerpos a la gp160 tras la inmunización in vivo con ADN rev/gp160. Esto puede ser el resultado de los conocidos efectos citotóxicos del rev, que incrementan la dificultad de obtener la función rev en los miotúbulos que contienen cientos núcleos (las proteínas rev necesitan estar en el mismo núcleo que el transcripto dependiente de rev con el fin que tenga lugar la expresión de la proteína rev o gac). Sin embargo, ha sido posible obtener la expresión independiente de rev usando modificaciones del gen env.

1. Expresión independiente de rev de env

Por lo general, nuestras vacunas han usado principalmente los genes env y gac de HIV (IIIB) para la optimización de la expresión en el interior de nuestro vector de vacunación generalizado, V1Jns, comprendido por un promotor CMV inmediato-temprano (IE), una secuencia de poliadenilación y de finalización de la transcripción derivada de la BGH, y un esqueleto pUC. Se pueden conseguir eficacias variables, dependiente de la longitud del segmento de gen usado (por ejemplo, gp120 vs. gp160), o se puede conseguir para env la expresión independiente de rev sustituyendo su péptido líder nativo secretor con otra procedente del gen del activador del plasminógeno específico del tejido (tPA) t expresar el gen quimérico resultante detrás del promotor CMVIE con el intrón CMV. Un tPA-gp120 es un ejemplo de vector gp120 construido de esta forma que funciona lo suficientemente bien para excitar respuestas inmunes anti-gp120 en ratones y monos vacunados.

Debido a los informes acerca que las proteínas ancladas a la membrana pueden inducir respuestas de anticuerpo mucho más sustanciales (y quizás más específicas para la neutralización de HIV), en comparación con las proteínas secretadas así como ganancia de epitopos adicionales, preparamos V1Jns-tPA-gp160 y V1Jns-rev/gp160. El vector tPA-gp160 produjo cantidades detectables de gp160 y gp120, sin añadir rev, como se muestra por análisis por inmunoblot de las células transfectadas, aunque los niveles de expresión fueron mucho menores de los obtenidos con rev/gp160, un plásmido que expresa gp160 dependiente de rev. Esto es debido, probablemente, a que las regiones inhibitorias, que confieren dependencia de rev al transcripto de gp160, se encuentran en múltiples emplazamientos dentro de gp160, incluyendo un extremo en COOH de la gp41. Se preparó un vector para una forma truncada terminada en COOH de tPA-gp160 (tPA-gp143) que se diseño para incrementar los niveles globales de expresión de env por eliminación de estas secuencias inhibitorias. El vector gp143 también elimina las regiones go41 intracelulares que contienen modelos de péptido (tales como Leu-Leu) de los que se sabe que provocan la desviación de las proteínas de la membrana hacia los lisosomas, en lugar de hacia la superficie de la célula. De esta forma, se puede esperar que gp143 tenga mayores niveles de expresión de la proteína env (disminuyendo la dependencia de rev) y mayor eficiencia de transporte de la proteína hasta la superficie de la célula, en comparación con la gp160 de longitud completa, en las que estas proteínas pueden ser más capaces de excitar los anticuerpos anti-gp160 tras la vacunación con ADN. El tPA-gp143 se modificó aún más mediante mutagénesis silenciosa extensa de la secuencia del elemento de respuesta rev (RRE) (350 bp) para eliminar secuencias inhibitorias de la expresión adicionales. Este constructo, gp143/mutRRE, se preparó en dos formas. Tanto eliminando (forma A) como reteniendo (forma B) los emplazamientos de rotura proteolítica de gp120/41. Ambas formas se prepararon debido a que la bibliografía informa que la vacunación de ratones usando gp160 irrompible expresado en vaccinia excitó niveles de anticuerpos mucho más elevados al gp160 que las formas rompibles.

Se desarrolló un ELISA cuantitativo para la expresión de gp160/gp120 en transfectantes celulares para determinar las capacidades de expresión relativa de estos vectores. La transfección in vitro de 293 células seguido por la cuantificación de gp120 secretada/liberada asociada a las células produjo los siguientes resultados (1) tPA-gp160 expresó 5-10 veces menos gp120 que rev/gp160 con proporciones similares retenidas en el interior de la célula vs, a liberada desde la superficie celular; (2) 2) tPA-gp143 produjo de 3 a 6 veces más secreción de gp120 que rev/gp160, con únicamente bajos niveles de gp143 asociada a células, confirmando que la cola citoplasmática de gp160 da lugar a la retención intracelular de gp160 que se puede superar mediante el borrado parcial de dicha secuencia; y (3) tPA-gp143/mutRRE A y B produjeron \approx10 veces más niveles de expresión de proteína que el tPA-gp143 pariente, mientras que se confirmó para A la eliminación del procesado proteolítico.

De esta forma, nuestra estrategia de incrementar la expresión independiente de rev ha producido incrementos escalonados en los niveles de expresión totales, así como un redireccionamiento de la gp143 anclado a la membrana hacia la superficie de la célula, lejos de los lisosomas. Es importante tener en cuenta que se trata de un constructo genérico en cuyo interior debería ser posible insertar secuencias gp120 derivadas de diferentes asilados víricos primarios en el interior de un cassette vector que contenga dichas modificaciones, que residen tanto en el extremo NH2 (líder tPA) como en el extremo COOH (gp41), en los que existen pocas diferencias antigénicas entre las diferentes cepas víricas.

2. Expresión de gp120 derivado de un aislado clínico

Para aplicar estas estrategias de expresión a los virus que son relevantes a efectos de vacunaciones, y para confirmar la generalidad de nuestras hipótesis, preparamos también un vector a tPA-gp120 derivado de un aislado primario de HIV (que contiene el bucle de péptido V3 norteamericano de consenso; fenotipos macrófago-trópico e inductor de no-sincitia). Este vector produjo una elevada expresión/secreción de gp120 con 293 células transfectadas, y excitó anticuerpos anti-gp120 en ratones, demostrando de esta forma que se había clonado de forma funcional. Los genes gp160 del aislado primario se usarán también para la expresión en la misma forma que los gp160 derivados de cepas de laboratorio.

B. Respuestas inmunes a las vacunas de polinucleótido env de HIV-1

Efecto de la ruta de vacunación sobre la respuesta inmune en ratones: aunque continúan los esfuerzos para mejorar la expresión de gp160, hemos utilizado el constructo tPA-gp120 ADN para evaluar las respuestas inmunes y las formas de aumentarlas. Se compararon las rutas de vacunación intramuscular (i.m.) e intradermal (i.d.) respecto de este vector a dosis de 100, 10, y 1 \mug en ratones. La vacunación por cualquiera de las rutas excito la respuesta de anticuerpos (GMT = 10^{3}-10^{4}) en todos los pacientes tras 2-3 vacunaciones en los tres niveles de dosificación. Cada ruta excitó similares títulos de anticuerpos anti-gp120 con respuestas claramente dependientes de la dosis. Sin embargo, observamos mayor variabilidad para las respuestas con vacunación i.d., de forma particular en los niveles menores tras la inoculación inicial. Más aún, las respuestas de las células T auxiliares, tal como se determina mediante la proliferación in vitro específica del antígeno y la secreción de citoquinas, fueron más elevadas con vacunación i.m. que con i.d. Concluimos que la vacunación i.d. no ofrece ninguna ventaja, comparada con la i.m., para esta vacuna.

2. Inmunidad de células T auxiliares mediada por la vacuna de ADN de gp120 en ratones

La vacunación con ADN de gp120 produjo potentes respuestas de las células T4 auxiliares en todos los compartimentos linfáticos ensayados (bazo, sangre, y ganglios inguinal, mesentérico e ilíaco) con perfiles de secreción de citoquinas similares a los de T_{H} 1 (es decir producción de g-interferón e IL-2 con poco o nada de IL-4). Estas citoquinas promueven por lo general fuerte inmunidad celular, y se han asociado con el mantenimiento de un estado libre de enfermedad en pacientes HIV-seropositivos. Se ha demostrado que los ganglios linfáticos son los emplazamientos de replicación principales del HIV, albergando grandes depósitos de virus incluso cuando los virus no se detectan fácilmente en la sangre. Una vacuna que excite respuestas inmunes anti-HIV en varios emplazamientos linfáticos, tal como hemos demostrado con nuestra vacuna de ADN, puede ayudar a evitar la colonización exitosa de los ganglios linfáticos, tras la infección inicial.

3. Respuesta de anticuerpos mediada por la vacuna de ADN de env

Los monos Cercopiteco Verde (AGM) y Rhesus (RHM) que recibieron vacunas de ADN de gp120 mostraron niveles inferiores de anticuerpos neutralizantes tras 2-3 vacunaciones, que no se pudieron incrementar mediante vacunación adicional. Estos resultados, así como la mayor concienciación en el campo de la vacuna de HIV que la gp160 oligomérico es probablemente un antígeno diana más relevante para excitar anticuerpos neutralizantes que los monómeros de gp120 nos ha conducido a centrarnos en la obtención de la expresión efectiva de vectores basados en gp160 (ver más arriba). Los ratones y AGM fueron también vacunados con la vacuna tPA-gp120 derivada del aislado primario. Estos animales mostraron títulos de anticuerpo con punto final recíproco anti-V3 (usando secuencia homóloga) comprendidos entre 500-5000, demostrando que este diseño de vacuna era funcional para aislado víricos clínicamente relevantes.

Las vacunas basadas en gp160, rev-gp160 y tPA-gp160, fallaron en la excitación consistente de respuestas de anticuerpos en ratones y primates no humanos, o dieron bajos títulos de anticuerpos. Nuestros resultados iniciales con el plásmido tPA-gp143 produjeron una media geométrica de títulos (GMT) > 10^{3} en ratones y AGM después de dos vacunaciones. Estos datos indican que hemos mejorado de forma significativa la inmunogenicidad de las vacunas similares a gp160 incrementando los niveles de expresión, y vehiculando de forma más eficaz el env hacia la superficie de la célula. Este constructo, así como los vectores tPA-gp143/mutRRE A y B continuarán caracterizándose por sus respuestas de anticuerpo, especialmente para la neutralización de virus.

4. Respuestas CTL mediadas por la vacuna de ADN env en monos

Continuamos caracterizando las respuestas CTL de RHM que se habían vacunado con gp120 y gp160/IRES/ADN de rev. Los cuatro monos que recibieron esta vacuna mostraron actividades CTL significativas MHC de Clase I restringida (20-35% de muerte específica con una efector/diana 20) tras dos vacunaciones. Tras una cuarta vacunación, estas actividades aumentaron a un 50-60% de muerte en similares condiciones de ensayo, indicando que una vacunación adicional estimula la respuesta de manera significativa. Las actividades CTK persistieron durante al menos siete meses después de la vacunación final con aproximadamente el 50% de sus niveles máximos, indicando que se había establecido una memoria a largo plazo.

Claims (4)

1. Un polinucleótido sintético que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína env de HIV, comprendiendo la secuencia de ADN codones optimizados para la expresión en un huésped de mamífero, en el que el polinucleótido se selecciona entre.

V1Jns-tPA-gp140/mutRRE-A/SRV-1 3'-UTR;

V1Jns-tPA-gp140/mutRRE-B/SRV-1 3'-UTR;

V1Jns-tPA-gp140/opt30-A;

V1Jns-tPA-gp140/opt30-B;

V1Jns-tPA-gp140opt all-A;

V1Jns-tPA-gp140/opt aII-B (sin cepas IIIB);

V1Jns-tPA-gp140/opt aII-A (sin cepas IIIB);

V1Jns-tPA-gp140opt all-B;

V1Jns-tPA-gp143/mutRRE-A;

V1Jns-tPA-gp143/mutRRE-B;

V1Jns-tPA-gp143/opt-32-A;

V1Jns-tPA-gp143/opt32-B;

V1Jns-tPA-gp143/SRV-1 3'-UTR;

V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32A;

V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32B;

V1Jns-tPA-gp143/opt aII-A;

V1Jns-tPA-gp143/opt aII-B

V1Jns-tPA-gp143/opt all-A;

V1Jns-tPA-gp143/opt all-B;

V1Jns-tPA-gp143/opt32-A/glyB;

V1Jns-tPA-gp143/opt32-B/glyB;

V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32-A/glyB;

V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32-B/glyB;

V1Jns-tPA-gp143/opt all-A/glyB;

V1Jns-tPA-gp143/opt all-B/glyB;

V1Jns-tPA-gp143/opt all-A/glyB;

V1Jns-tPA-gp143/opt all-B/glyB;

tal como se describe en los ejemplos 1-11 en el presente documento; y las combinaciones de los mismos.

2. El uso del polinucleótido de la Reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de la infección por HIV en vertebrados.

3. Una vacuna contra la infección por HIV que comprende el polinucleótido de la Reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

4. El uso de acuerdo con la Reivindicación 2 en el que dicho medicamento induce un antígeno que está presente en la célula para estimular la proliferación de las células T auxiliares y citotóxicas y las funciones del efector que incluyen la secreción específica de linfoquina para los antígenos de HIV.