ES2221841T3 - Dispositivos de purificacion bioquimica con sondas de captacion inmovilizadas y su utilizacion. - Google Patents

Dispositivos de purificacion bioquimica con sondas de captacion inmovilizadas y su utilizacion.

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ES2221841T3 ES00915860T ES00915860T ES2221841T3 ES 2221841 T3 ES2221841 T3 ES 2221841T3 ES 00915860 T ES00915860 T ES 00915860T ES 00915860 T ES00915860 T ES 00915860T ES 2221841 T3 ES2221841 T3 ES 2221841T3
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Abstract

Dispositivo para la purificación de una molécula de ácido nucleico objetivo de una muestra de pruebas, que comprende como mínimo una unidad de purificación, incluyendo la unidad de purificación un conducto que comprende: (a) una primera región que incluye un receptáculo para recibir una muestra; (b) una segunda región que incluye un medio electroforético con una sonda de captación inmovilizada como mínimo, seleccionada para hibridizar con respecto al ácido nucleico objetivo, de manera que la sonda de captación es copolimerizada con respecto al medio electroforético; y (c) una tercera región que incluye una cámara de recogida para recibir la muestra de prueba que pasa a través de la región segunda, separando la región segunda la región primera con respecto a la región tercera.

Description

Dispositivos de purificación bioquímica con sondas de captación inmovilizadas y su utilización.
Antecedentes de la invención
La necesidad de disponer de un ADN altamente purificado surge frecuentemente en la investigación biológica y molecular y sus aplicaciones, por ejemplo, en el secuenciado de ADN. Los protocolos actuales para el secuenciado de ADN requieren una purificación substancial del ADN antes del análisis automatizado. De manera típica, el ADN es sometido a un protocolo de replicación que utiliza un vector replicante, por ejemplo, un sistema de vector fago M13, así como polimerasa de ADN, desoxinucleótidos, cebadores, sales, y otros componentes de replicación. Los productos de ampliación o extensión formados durante esta etapa de replicación requieren procesos adicionales a efectos de obtener un preparado relativamente purificado que contiene solamente los propios productos de extensión. Una metodología frecuentemente utilizada para purificar los productos de extensión de ADN es la precipitación con etanol. La precipitación con etanol es relativamente eficaz en la eliminación de nucleótidos no incorporados y sales del preparado que contiene los productos de extensión. También es deseable eliminar cualquier matriz de ADN y cebadores en exceso del preparado antes de llevar a cabo el análisis de secuencia en los productos de extensión. No obstante, la precipitación requiere mucho tiempo y gran cuidado a efectos de conseguir rendimientos de productos continuados.
Sería necesario un dispositivo para minimizar los factores de tiempo necesario y para proporcionar una plataforma que garantice resultados altamente reproducibles. Además, sería ventajoso tener un dispositivo de purificación que pudiera clasificar los productos de reacciones de secuenciado multiplexadas. Además, sería ventajoso disponer de un dispositivo de purificación que pudiera clasificar los productos de las reacciones de secuenciado de preparación multiplexadas.
Características de la invención
La presente invención pertenece a dispositivos que comprenden como mínimo una unidad de purificación, de acuerdo con la reivindicación 1, utilizada para purificar y/o concentrar una molécula objetivo contenida dentro de una muestra de pruebas y un método de acuerdo con la reivindicación 8. De manera típica, la molécula objetivo o molécula diana en una muestra de pruebas será un ácido nucleico. Estos ácidos nucleicos purificados pueden ser utilizados en una serie de formas, incluyendo análisis de secuencia de nucleótidos. También se prevén métodos de utilización del dispositivo y equipos que contienen el propio dispositivo.
El dispositivo de purificación de la presente invención contiene como mínimo una unidad de purificación. De modo alternativo, el dispositivo puede contener una serie de unidades de purificación, por ejemplo, puede ser un dispositivo de unidades múltiples. Cada unidad de purificación comprende una región que recibe una muestra de pruebas que comprende una molécula objetivo o diana y una segunda región para purificar y/o concentrar la molécula objetivo si existe en la muestra de prueba. De manera típica, cada una de las unidades de purificación comprende tres componentes que pueden ser regiones individuales o semi-individuales de la unidad de purificación. También se puede hacer referencia a las regiones como cámaras. De manera típica, la muestra de pruebas se desplaza desde la primera región a la segunda región y a continuación a la tercera región. La primera región recibe una muestra de pruebas que incluye la molécula objetivo junto con componentes no objetivo, tales como proteínas contaminantes o sales tampón. Se hace referencia a la primera región como receptáculo. La muestra de pruebas es introducida en el receptáculo. La segunda región es utilizada para purificar y/o concentrar la molécula objetivo desde otras moléculas contaminantes contenidas en la muestra de pruebas. De manera específica, esta región de separación comprende una matriz electroforética, por ejemplo, un gel de poliacrilamida, que tiene una o varias especies o clases de sondas de captación inmovilizadas dentro del medio electroforético. La sonda de captación inmovilizada hibridiza específicamente con la molécula objetivo. De este modo, la molécula objetivo queda retenida dentro de la matriz en la región de separación del dispositivo, mientras que los componentes que no son objetivo, por ejemplo, los componentes contaminantes de la muestra, atraviesan la región de separación. Para dispositivos con unidades de purificación que contienen terceras regiones, el medio electroforético separa el receptáculo de la tercera región que es utilizada para contener una parte o la totalidad de moléculas que atraviesan la segunda región del dispositivo. Esta tercera región es la que se llama cámara de recogida.
En una realización alternativa, el dispositivo de purificación puede incluir una serie de unidades de purificación. En una realización preferente, el dispositivo es una placa de microtitulación y cada unidad de purificación es un pocillo de microtitulación.
El dispositivo de purificación puede incluir también una unidad de prepurificación que incluye un receptáculo, un medio electroforético y una cámara de recogida. El medio electroforético separa el receptáculo con respecto a la cámara de recogida.
En otras realizaciones, la cámara de recogida comprende un orificio de salida. En realizaciones preferentes, el orificio de salida contiene una membrana semipermeable.
El dispositivo que contiene una unidad única de purificación puede contener una serie de sondas de captación idénticas o casi idénticas. El dispositivo que contiene una unidad de purificación única puede contener también una serie de distintas sondas de captación. El dispositivo puede contener también una serie de sondas de captación, una parte de las cuales son idénticas, o casi idénticas, y otra parte son distintas.
El dispositivo que contiene una serie de unidades de purificación puede contener una serie de sondas de captación idénticas o casi idénticas. El dispositivo que contiene una serie de unidades de purificación puede contener también una serie de sondas de captación distintas. El dispositivo puede contener también una serie de sondas de captación, una parte de las cuales son idénticas, o casi idénticas, y otra parte que son distintas.
Según otro aspecto, la invención corresponde a un método de introducción de una muestra de pruebas que contiene la molécula de ácido nucleico objetivo en el receptáculo de una unidad de un dispositivo de purificación incluyendo un receptáculo y un medio electroforético, comprendiendo como mínimo una sonda de captación inmovilizada seleccionada para la hibridización de la molécula de ácido nucleico objetivo; someter el medio electroforético a un campo eléctrico con el resultado de la emigración de la muestra de pruebas a través del medio, en condiciones apropiadas en la molécula objetivo en la muestra de pruebas para hibridizar la sonda de captación, formando de esta manera un complejo de molécula objetivo/sonda de captación, y en cuanto a los componentes restantes de la muestra de pruebas, emigrar a través del medio y efectuar su elución; y recogiendo el resto de la muestra de pruebas en la cámara de recogida.
En una realización, el método comprende además la etapa de tratamiento del medio electroforético para liberar la molécula objetivo. En realizaciones preferentes, la molécula objetivo puede ser liberada del medio electroforético al elevar la temperatura de dicho medio electroforético a una temperatura suficiente para desnaturalizar el complejo de molécula objetivo/sonda de captación, rompiendo el enlace químico que inmoviliza las sondas de captación dentro del medio electroforético o incrementando la intensidad del campo electroforético a un nivel suficiente para alterar el complejo molécula objetivo/sonda de captación. En una realización, la molécula objetivo es liberada al receptáculo.
El dispositivo utilizado en el método comprende además una cámara de recogida en la que la cámara de recogida está separada con respecto al receptáculo por el medio electroforético.
En una realización adicional, el método comprende además una etapa de amplificación de la molécula objetivo.
En otra realización, el método puede tener como resultado un incremento de la concentración de la molécula objetivo.
En una realización alternativa, el método puede ser utilizado con un dispositivo de purificación que comprende una serie de unidades de purificación. En una realización preferente, se purifica una serie de moléculas objetivo simultáneamente, por ejemplo, el método es un método multiplex.
En una realización preferente, puede tener lugar la purificación y concentración de una molécula de ácido nucleico objetivo en una etapa de proceso única.
En otra realización, el método puede incluir también una etapa de proceso de prepurificación. En otra realización adicional, la muestra de pruebas puede ser obtenida a partir de la cámara de recogida de una unidad de purificación.
Según otro aspecto, la invención corresponde a métodos para desarrollar condiciones óptimas para los métodos de purificación de ácidos nucleicos objetivo. En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos objetivo son ácidos nucleicos mutantes conocidos por ser informativos en la detección de enfermedades. En otras realizaciones, las condiciones que requieren optimización son las que afectan la captación de los ácidos nucleicos objetivo y la elución de los ácidos nucleicos objetivo.
Según otro aspecto, la invención corresponde a un equipo para preparar un ácido nucleico objetivo en una muestra de pruebas a utilizar en aplicaciones de secuenciado de ácido nucleico que incluyen un dispositivo para purificar un ácido nucleico objetivo de una muestra de pruebas que contiene como mínimo una unidad de purificación, incluyendo la unidad de purificación un receptáculo y un medio electroforético que contiene como mínimo una sonda de captación inmovilizada seleccionada para hibridizar el ácido nucleico objetivo.
En una realización, el dispositivo del equipo comprende además una unidad de purificación que comprende una cámara de recogida, en la que dicha cámara de recogida está separada del receptáculo por el medio electroforético.
En una realización alternativa, el equipo puede incluir un dispositivo que contiene una serie de unidades de purificación.
En una realización, el equipo puede incluir además una unidad de prepurificación que incluye un receptáculo, un medio electroforético y una cámara de recogida, en el que el medio electroforético separa el receptáculo de la cámara de recogida.
En una realización, el ácido nucleico objetivo es un ácido nucleico mutante utilizable en la detección de una enfermedad humana. En una realización preferente, la enfermedad humana es cáncer.
Los dispositivos de la presente invención permiten una purificación rápida y altamente reproducible de los ácidos nucleicos a partir de mezclas complejas de moléculas.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una representación esquemática de un método para la purificación de un ADN objetivo a utilizar en otros análisis, por ejemplo, secuenciado de ADN, utilizando unidades de purificación de un dispositivo que son pocillos de placas de microtitulación.
La figura 2 es una representación esquemática de un método para la purificación de un ADN objetivo para su utilización en otros análisis, por ejemplo, secuenciado de ADN, utilizando un dispositivo con una unidad de purificación que contiene una cámara de recogida que contiene una membrana semipermeable.
La figura 3A es una representación esquemática de un método para la purificación de productos de oligonucleótidos de múltiples reacciones llevadas a cabo en una unidad de purificación en la que se disponen un cebador principal, un cebador inverso, y un plásmido que tiene un inserto oligonucleótido a secuenciar. Los productos múltiplex de la reacción de amplificación son purificados utilizando dispositivos apilados que contienen un medio electroforético que contiene sondas de captación inmovilizada, por ejemplo, dispositivos sonda-gel-punta ("tip"), teniendo el dispositivo superior una sonda de captación principal en el medio electroforético y teniendo el dispositivo inferior una sonda de captación inversa en el medio electroforético.
Las figuras 3B y 3C son fotografías de los resultados de purificación conseguidos utilizando el método mostrado en la figura 3A. Los productos de replicación principal son separados de los productos de replicación inversa.
La figura 3D muestra la secuencia inversa.
La figura 3E muestra las secuencias utilizadas en el método que se ha mostrado en la figura 3A.
La figura 4A es una representación esquemática de un método que utiliza un dispositivo en el que un medio electroforético que no contiene sondas de captación inmovilizadas, por ejemplo, un dispositivo de punta de carga de gel, es utilizado en tándem con un dispositivo que contiene un medio electroforético que contiene sondas de captación inmovilizadas, por ejemplo, un dispositivo de punta de gel-sonda ("probe-gel-tip"), para purificar, y opcionalmente concentrar, una molécula objetivo de ADN, por ejemplo, productos de reacciones de secuenciado de ADN. Se utiliza un cambio de temperatura para desnaturalizar el complejo de hibridización y liberar la molécula objetivo de ADN.
La figura 4B es una fotografía que muestra la distribución de la molécula objetivo en la región de medio electroforético después de la electroforesis, y antes de la elución.
La figura 5 es una fotografía de un gel de electroforesis que muestra la distribución de componentes de muestras tomadas 1) antes de la purificación en el dispositivo de la invención y 2) después de la hibridización y retirada del dispositivo.
La figura 6 es una fotografía de un medio electroforético de placa vertical en el que sondas de captación inmovilizadas que contienen medio electroforético, por ejemplo, una capa de sonda-gel ("probe-gel-layer"), es abrazada en sandwich entre un medio electroforético superior y el medio electroforético inferior sin sondas de captación inmovilizadas, por ejemplo, una capa de carga de gel. La sonda es distribuida de manera uniforme en la capa de sonda-gel. Se aplicó un gradiente de temperatura de 24,7ºC a 53,4ºC de la izquierda a la derecha durante la electroforesis de un oligonucleótido objetivo con etiqueta de colorante.
La figura 7 es una fotografía de una placa vertical de medio electroforético con una serie de pistas. Cada pista tiene un gradiente de temperatura de 23ºC a 45ºC desde la parte superior a la parte inferior. Cada una de las pistas está dotada de una sonda de captación de tamaño distinto. La sonda de captación complementaria de la pista 1 es una 13 mer; la pista 2 es 15 mer; la pista 3 es 17 mer; la pista 4 es 19 mer; y la pista 5 es 21 mer. Se somete a electroforesis en cada pista el mismo oligonucleótido con una etiqueta de colorante.
Descripción detallada de la invención
La presente invención corresponde a dispositivos que comprenden como mínimo una unidad de purificación, utilizada para purificar y/o concentrar una molécula objetivo contenida dentro de una muestra de prueba. La expresión "molécula objetivo" y su plural "moléculas objetivo" se utiliza esencialmente de forma intercambiable en la totalidad de esta solicitud, y está destinada a incluir cualquier molécula cargada que pueda ser purificada o concentrada adicionalmente utilizando los dispositivos y métodos de la invención.
Preferentemente, la molécula objetivo será un ácido nucleico. La expresión "ácido nucleico" está destinada a incluir ácido desoxirribonucleico, indicado a continuación "ADN", o ácido ribonucleico, indicado "ARN". Estos ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, productos de extensión de polimerasa de ADN generados por procesos de secuenciado de ADN. Estos productos pueden variar en su longitud y requieren frecuentemente purificación adicional antes de los procesos de secuenciado de ADN. Los ácidos nucleicos objetivo purificados pueden ser utilizados en una serie de formas, incluyendo el someterlas a análisis adicional, por ejemplo, análisis de secuencias de nucleótidos.
Los ácidos nucleicos objetivo pueden estar contenidos en muestras de pruebas que contienen una serie de componentes. Además, una muestra de pruebas se puede originar de una serie de fuentes distintas. Por ejemplo, una muestra de pruebas se puede originar de una planta o de un órgano animal, tejidos o células. Una muestra de pruebas se puede originar de un sistema de cultivo de células, tejidos u órganos. Una muestra de pruebas se puede originar a partir de cADN o biblioteca genómica. El ADN utilizado en la muestra de pruebas puede ser extraído de un organismo que se encuentra en una muestra corporal, tal como sangre, orina, fluido cerebroespinal, materiales de tejidos y similares por una amplia variedad de técnicas tales como las descritas por Maniatis, y otros, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Clonado molecular: Manual de laboratorio), Cold Spring Harbor, N.Y. páginas 280-281 (1982). Una muestra de prueba puede ser también semipurificada, por ejemplo, un preparado sobrenadante de una muestra de tejido puede ser utilizada como muestra de prueba.
La presente invención da a conocer dispositivos de purificación utilizables para purificar y concentrar una molécula objetivo contenida dentro de una muestra de pruebas. Los dispositivos de la invención incluyen como mínimo una unidad de purificación que contiene regiones separadas o discretas o semidiscretas. De manera típica, cada unidad de purificación comprende como mínimo tres regiones, a las que se hace referencia también en esta descripción como cámaras o componentes.
La primera región comprende un receptáculo. La expresión "receptáculo" está destinada a incluir la región de una unidad de purificación que puede recibir una muestra.
La segunda región comprende un medio electroforético. El lenguaje "medio electroforético" o "medio de electroforesis" es un término de esta especialidad y está destinado a incluir todos los medios conocidos adecuados para purificar y/o concentrar un ácido nucleico objetivo en una muestra de pruebas. El medio electroforético del dispositivo puede ser, por ejemplo, un gel de poliacrilamida con sondas de captación de oligonucleótidos inmovilizadas dentro del medio, por ejemplo, el medio de electroforesis descrito en la Patente U.S.A. Nº. 5.932.711 de Boles y otros. Las sondas de captación pueden ser diseñadas para interaccionar específicamente con una molécula objetivo contenida dentro de la muestra de pruebas, y para su hibridización. La expresión "sonda de captación" y su plural "sondas de captaciones" están destinadas a incluir las sondas que pueden hibridizar con respecto a una molécula objetivo, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico objetivo.
La tercera región comprende una cámara de recogida. La expresión "cámara de recogida" está destinada a incluir una región que contiene la muestra de pruebas después de que ha emigrado a través del medio de electroforesis. Esta cámara puede ser físicamente contigua a la segunda región, o puede actuar como interfaz con la segunda región al encontrarse en la proximidad de la segunda región. La tercera región puede ser separada de la segunda región, permitiendo el vaciado o llenado de la cámara de recogida y el intercambio de tampones.
El receptáculo y cámara de recogida están físicamente separados entre sí por el medio electroforético que forma una barrera entre ellos.
Los dispositivos de purificación de la invención pueden ser formados a partir de muchos materiales. Son materiales preferentes los más compatibles con moléculas biológicas, tales como ADN y ARN. Materiales tales como plástico, acero inoxidable, latón, cerámica, cristal, sílice o varias combinaciones de los mismos se pueden utilizar para formar los dispositivos de purificación. Si bien la configuración geométrica real del dispositivo de purificación no es crítica para su funcionamiento, ciertas formas pueden ser beneficiosas para aplicaciones específicas. Por ejemplo, en algunas aplicaciones es preferible que la circunferencia de la unidad de purificación presente diferencias en las regiones que contienen los diferentes componentes del dispositivo.
Preferentemente, el dispositivo de purificación puede ser puesto en contacto con una fuente de potencia eléctrica de manera tal que se puede establecer un gradiente de voltaje para facilitar la emigración de moléculas a través del medio electroforético contenido dentro de la segunda región. La fuente de potencia eléctrica para purificación puede ser separada y aislada con respecto al dispositivo de purificación real, o se puede integrar en el diseño para el dispositivo de purificación. Una característica importante del dispositivo consiste en disponer del dispositivo de purificación capaz de acoplarse, o de quedar sometido, a un gradiente de voltaje producido por una fuente de potencia. Los electrodos de la fuente de potencia, o receptáculos para los electrodos, pueden ser una característica integrada del dispositivo de purificación.
Una muestra de pruebas puede ser introducida en un dispositivo de purificación al colocarla en el receptáculo. Un campo eléctrico, suficiente para permitir la emigración de la molécula objetivo y otros componentes de muestra a través del medio electroforético de separación, por ejemplo, de 0,1 a 100-200 voltios/cm aproximadamente, se puede aplicar de manera que las moléculas cargadas en el receptáculo pueden emigrar a través del medio electroforético hacia el polo apropiado. De manera típica, las moléculas de ácido nucleico objetivo poseen una carga negativa y, por lo tanto, emigran hacia un ánodo. La molécula objetivo puede continuar emigrando a través del medio hasta que establece contacto con una sonda de captación inmovilizada específica para dicha molécula determinada, por ejemplo, una sonda de captación con la que hibridizará. Se puede formar un complejo de hibridización entre la sonda de captación inmovilizada y la molécula objetivo. Son sondas de captación preferentes los oligonucleótidos modificados con grupos 5'-acrilamida que pueden copolimerizar con un gel de electroforesis, por ejemplo, un gel de poliacrilamida. Las moléculas objetivo se pueden unir a secuencias complementarias contenidas dentro de una sonda de captación, si existe complementariedad substancial entre las dos moléculas.
La expresión "complementariedad substancial" está destinada a incluir secuencias de ácido nucleico de la sonda de captación que pueden hibridizar a la molécula objetivo correspondiente. Estas secuencias no es necesario que reflejen la secuencia de ácido nucleico exacta de la molécula objetivo. Estas secuencias deben ser solamente suficientemente similares en identidad de secuencia para hibridizar con la molécula objetivo en condiciones específicas. Por ejemplo, bases no complementarias, o nucleótidos adicionales, pueden ser entremezclados dentro de secuencias, a condición de que las secuencias tengan bases suficientemente complementarias para hibridizar con aquéllas. Las condiciones de hibridización específicas pueden ser determinadas empíricamente por los técnicos en la materia.
Por ejemplo, se deben escoger condiciones de estringencia que disminuyan significativamente las reacciones de hibridización no específicas. Se explican las condiciones de estringencia para hibridizaciones de ácido nucleico en varias referencias de libros de texto, por ejemplo, "Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel, F.M., y otros, Vol. 1, Supl. 26 (1991), cuya materia se incorpora a la descripción actual a título de referencia en su totalidad. Factores tales como la longitud de la sonda, composición de la base, desequilibrio percentual entre secuencias hibridizantes, temperatura e intensidad iónica influyen en la estabilidad de los híbridos de los ácidos nucleicos. Las condiciones de estringencia, por ejemplo, estringencia baja, moderada o elevada, se pueden determinar empíricamente, dependiendo en parte de las características de la sonda de captación y de la molécula objetivo en la muestra de pruebas.
El complejo de hibridización impide otras emigraciones de la molécula objetivo a través del medio electroforético, pero no afecta la emigración continuada de moléculas no objetivo, realizando de esta manera la purificación de la molécula objetivo contenida dentro de la muestra de prueba. Las moléculas no objetivo pueden incluir, por ejemplo, proteínas, péptidos, azúcares, sales y ácidos nucleicos.
Las moléculas no objetivo contenidas en la muestra de pruebas pueden continuar a través del medio electroforético, y son separadas de manera efectiva de la molécula objetivo. Las moléculas no objetivo contenidas dentro de la muestra pueden atravesar el gel pasando al tampón de electroforesis contenido en la cámara de recogida del dispositivo. El tampón de la cámara de recogida pueden ser substituido por tampón de electroforesis reciente. La molécula objetivo puede ser eluida a continuación desde la sonda de captación y medio electroforético para análisis subsiguiente.
La expresión "elución" está destinada a incluir la fusión del híbrido y desplazamiento del objetivo en la dirección de la elución. La fusión o disociación del objetivo con respecto a la sonda se puede conseguir aplicando alta temperatura al dispositivo, al alterar las condiciones del tampón, por ejemplo, incrementando el pH o añadiendo disolventes tales como formamida, o aplicando un voltaje elevado.
Por ejemplo, se puede aplicar un voltaje suficiente de manera que el complejo de hibridización formado entre la molécula objetivo y la sonda de captación es desnaturalizado, liberando la molécula objetivo. El campo eléctrico puede ser aplicado utilizando la misma polaridad aplicada originalmente, permitiendo de esta manera la emigración continuada de la molécula objetivo liberada hacia adentro de la cámara de recogida que contiene tampón de electroforesis reciente. Alternativamente, el campo eléctrico puede ser invertido llevando la muestra nuevamente al pocillo de muestra de la placa de microtitulación. La molécula objetivo purificada puede recibir acceso y ser sometida a análisis adicional, tal como análisis de secuencia de nucleótidos. De manera alternativa, la molécula objetivo puede ser introducida en una reacción de amplificación, por ejemplo, una reacción de cadena de polimerasa (PCR), una reacción de cadena de ligado, una amplificación basada en secuencia de ácido nucleico u otros procesos equivalentes.
En una realización, el dispositivo contiene una sola unidad de purificación, y adopta forma de un microtubo, o una punta de pipeta de un solo uso, por ejemplo, puntas de pipeta Gilson o de tipo Eppendorf. En otra realización, el dispositivo contiene una serie de unidades de purificación y adopta la forma de una placa de microtitulación. La placa de microtitulación puede contener múltiples pocillos, por ejemplo, noventa y seis (96) pocillos, cada uno de los cuales forma una unidad de purificación separada o discreta. La realización facilita la purificación de múltiples muestras. Si el dispositivo comprende una placa de microtitulación de 96 pocillos, entonces se pueden introducir 96 muestras de prueba separadas, por ejemplo, cargadas en el dispositivo. Las placas de microtitulación que contienen un número distinto de 96 pocillos se encuentran también dentro del ámbito de la invención. El pocillo de la placa de microtitulación puede contener tres regiones. La primera región del pocillo contiene un receptáculo para recibir una muestra. El receptáculo puede tener, preferentemente, un volumen aproximado de 5,0 \mul hasta aproximadamente 1000 \mul, si bien se pueden utilizar también muestras más grandes. El receptáculo está situado entre la superficie superior del pocillo y la superficie límite formada por el medio electroforético. El medio electroforético comprende, como mínimo, una especie de sonda de captación, por ejemplo, una secuencia de oligonucleótido, inmovilizada dentro del medio. De manera alternativa, se pueden inmovilizar dentro del medio múltiples especies de sondas de captación, por ejemplo, secuencias de oligonucleótidos múltiples (ver, por ejemplo, el documento USSN 08/971.845, titulado "Electrophoretic Analysis of Molecules Using Immobilized Probes" de Boles y otros, ("Análisis electroforético de moléculas utilizando sondas inmovilizadas"), presentada en 8 de agosto de 1997, cuyo contenido se incorpora por completo a título de referencia). En una realización preferente, la sonda es unida de forma covalente al medio del gel electroforético. La segunda región está localizada desde la superficie inferior del receptáculo a la superficie superior de la cámara de recogida, cuando es contiguo con la primera región.
En otra realización, se puede utilizar una unidad de pre-purificación conjuntamente con una unidad de purificación de la invención. El medio electroforético de la unidad de pre-purificación no contiene sondas inmovilizadas sino que, en vez de ello, la unidad está destinada a proporcionar una separación no específica inicial de la muestra de pruebas que tiene como resultado una muestra parcialmente purificada. La muestra de pruebas es situada en el receptáculo de la unidad de pre-purificación, preferentemente, en tampón de electroforesis. En la presencia de un gradiente de voltaje, la muestra es desplazada con rapidez a través del medio electroforético, por ejemplo, en la región de carga del gel. Esta región de separación elimina los componentes basados principalmente en el tamaño, en una muestra en la que la mayor parte de las moléculas llevan la misma carga. De manera típica, la muestra es llevada hacia el ánodo, con las moléculas más pequeñas tendiendo a desplazarse a través de la región de separación con mayor rapidez. Por esta razón, los productos de extensión pasan a través de la cámara de recogida más rápidamente que la matriz que es retenida en el medio electroforético.
El contenido de la cámara de recogida de la unidad de pre-purificación puede ser purificada adicionalmente en una unidad de purificación de un dispositivo según la invención. La muestra parcialmente purificada es puesta en contacto con la superficie superior de la segunda región, usualmente depositando la muestra parcialmente purificada en el receptáculo. La tercera región puede ser contigua de la segunda región. La punta del pocillo de microtitulación puede ser retirada por excisión u otro método igualmente efectivo. El orificio creado por la eliminación de la punta basal del pocillo se puede cubrir utilizando una membrana semipermeable. La membrana semipermeable puede tener un corte de peso molecular adecuado para permitir el paso a través de la membrana de los componentes contaminantes de la muestra.
La placa de microtitulación puede ser asociada con una fuente de potencia tal como un campo eléctrico que puede ser aplicado a pocillos contenidos dentro de la placa de microtitulación. El campo eléctrico puede tener cualquier geometría con respecto a los pocillos. Preferentemente, el campo eléctrico, una vez aplicado, saldrá según el eje longitudinal de los pocillos de manera tal que las moléculas cargadas en el receptáculo pueden emigrar en dirección longitudinal a través del medio de electroforesis contenido dentro de la segunda región. Una vez que la muestra ha sido cargada, se puede aplicar un campo eléctrico al dispositivo de purificación de manera tal que las moléculas cargadas emigrarán bajo la influencia del campo eléctrico.
Cualquier medio de electroforesis o matriz adecuada para electroforesis puede ser utilizada en los dispositivos de la presente invención. Se incluye dentro de las matrices adecuadas acrilamida y agarosa, utilizadas ambas habitualmente para electroforesis de ácido nucleico. No obstante, también se pueden utilizar otros materiales. Entre los ejemplos se incluyen acrilamidas modificadas químicamente, almidón, dextrano y polímeros basados en celulosa. Entre los ejemplos adicionales se incluyen acrilamidas modificadas y ésteres de acrilato (ver Polysciences, Inc., "Polymer & Monomer Catalog", 1996-1997, Warrington, PA), almidón (ver Smithies, "Biochem. J.", 71:585 (1959), y número de producto S5651, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), dextranos (ver Polysciences, Inc. "Polymer & Monomer Catalog", 1996-1997, Warrington, PA), y polímeros basados en celulosa (ver Quesada, "Current Opin. In Biotechnology", 8:82-93 (1997)). Cualquiera de los polímeros descritos puede ser modificado clínicamente para permitir el acoplamiento específico de sondas de captación al medio electroforético para utilización en la presente invención. Una matriz especialmente preferente es la acrilamida.
Se puede utilizar una variedad de sondas de captación en los dispositivos de la presente invención. De manera típica, las sondas de captación de la presente invención comprenden un ácido nucleico con una secuencia de nucleótido con complementariedad substancial a una región de la secuencia de nucleótido contenida dentro de una molécula objetivo, de manera que la molécula objetivo puede hibridizar la sonda de captación. La complementaridad de las sondas de captación de ácido nucleico se requiere solamente que sea suficiente para unir de manera específica la molécula objetivo y, por lo tanto, para efectuar la purificación de la molécula objetivo en una muestra de prueba. Se incluyen entre las sondas adecuadas para su utilización en la presente invención las formadas a partir de ácidos nucleicos, por ejemplo, ARN, ADN, análogos de ácido nucleico, ácidos nucleicos modificados y sondas quiméricas de una clase mixta que comprende un ácido nucleico con otro componente orgánico, por ejemplo, ácidos nucleicos péptidos. Las sondas de captación pueden ser ácidos nucleicos de hebra simple o doble. Preferentemente, la longitud de la sonda de captación es como mínimo de 5 nucleótidos, más preferentemente la longitud está comprendida entre 5 y 50 nucleótidos, pero la longitud puede llegar a varios miles de nucleótidos.
Se incluyen entre los ácidos nucleicos utilizables para las sondas de la invención los ácidos nucleicos obtenidos por métodos conocidos en esta técnica. Estos ácidos nucleicos incluyen substancialmente ácidos nucleicos puros, ácidos nucleicos producidos por síntesis química y por combinaciones de métodos biológicos y químicos, y ácidos nucleicos recombinantes. Se pueden utilizar tanto ADN como ARN.
La expresión "análogo de ácido nucleico" está destinada a incluir ácidos nucleicos que contienen grupos de azúcar modificados, grupos fosfato o bases modificadas. Se incluyen, por ejemplo, entre los ejemplos de ácidos nucleicos con bases modificadas, bases acetiladas, carboxiladas o metiladas, por ejemplo, 4-acetilcitidina, 5-carboximetilaminometiluridina, 1-metilinosina, norvalina, o alo-isoleucina. Estos análogos de ácidos nucleicos son conocidos por los técnicos en la materia. Un ejemplo de un análogo de ácido nucleico utilizable es ácido nucleico péptido (APN), en el que las bases de ADN estándar están acopladas a un armazón de péptido modificado formado por unidades repetitivas de N-(2-aminoetil)glicina (Nielsen, y otros, "Science", 254:1497-1500, (1991)). El núcleo de péptido es capaz de retener las bases a la distancia apropiada al par de bases con ADN y ARN estándar de hebras únicas. Los dúplex APN-ADN son mucho más resistentes que los dúplex equivalentes ADN-ADN, probablemente debido al hecho de que no hay enlaces fosfodiéster cargados negativamente en la hebra de APN. Además, a causa de su estructura poco habitual los APN son muy resistentes a la degradación por nucleasa. Por estas razones, los análogos de ácidos nucleicos de APN son útiles para ensayos de sondas inmovilizadas. Será evidente para los técnicos en la materia que se pueden utilizar estrategias de diseños similares para construir otros análogos de ácido nucleico que tendrán propiedades útiles para ensayos de sondas inmovilizadas.
También pueden ser útiles sondas que contienen oligonucleótidos modificados. Por ejemplo, se pueden utilizar oligonucleótidos que contienen deazaguanina y bases de uracilo en lugar de guanina y oligonucleótidos que contienen timina para disminuir la estabilidad térmica de las sondas hibridizadas. De manera similar, se puede substituir la 5-metilcitosina por citosina si se desean híbridos con estabilidad térmica incrementada (Wetmur, "Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology", 26: 227-259 (1991)). Las modificaciones del grupo de azúcar de ribosa, tal como la adición de grupos 2'-O-metilo pueden reducir la susceptibilidad a la nucleasa de las sondas de ARN inmovilizadas (Wagner, "Nature", 372:333-335 (1994)). Las modificaciones que eliminan carga negativa del núcleo de fosfodiéster pueden incrementar la estabilidad térmica de los híbridos (Moody, y otros, "Nucleic Acids Res.", 17:4769-4782 (1989)); Iyer, y otros, "J. Biol. Chem.", 270:14712-14717 (1995)).
Se conocen por los técnicos en la materia métodos para el acoplamiento de ácidos nucleicos para formar medios electroforéticos que contienen sondas inmovilizadas y no forman parte de la invención. Se pueden acoplar ácidos nucleicos, ácidos nucleicos modificados y análogos de ácidos nucleicos a agarosa, dextranos, celulosa, y polímeros de almidón utilizando bromuro de cianogeno o activación por cloruro cianúrico. Los polímeros que contienen grupos carboxilos se pueden acoplar a sondas de captación sintéticas que tienen grupos amina primarios utilizando acoplamiento de carboimida. Los polímeros que llevan aminas primarias se pueden acoplar a sondas que contienen aminas con glutaraldehído o cloruro cianúrico. Muchos polímeros pueden ser modificados con grupos tiol-reactivos que pueden ser acoplados a sondas sintéticas que contienen tiol. Se pueden encontrar en la literatura muchos otros métodos adecuados (ver un resumen en Wong, "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking", CRC Press, Boca Raton, FL (1993)).
También se han desarrollado métodos para el acoplamiento covalente de las sondas de captación a grupos químicamente polimerizables. Cuando se copolimerizan con mezclas adecuadas de compuestos monómeros polimerizables, se pueden producir matrices que contienen altas concentraciones de ácidos nucleicos inmovilizados. Se encuentran ejemplos de métodos preferentes para acoplar de forma covalente ácidos nucleicos a grupos químicos polimerizables en Boles, y otros, Patente U.S.A. Nº 5.932.711, titulada "Nucleic Acid-Containing Polymerizable Complex", (Complejo polimerizable que contiene ácido nucleico) y en la publicación de Rehman y otros "NucleicAcid Res.", 27:649-655 (1999), cuyas materias se incorporan a la descripción actual como referencia en su totalidad.
Para algunas realizaciones del dispositivo, pueden ser útiles matrices compuestas que contienen una mezcla de dos o más materiales que forman matrices, por ejemplo, el gel compuesto acrilamida-agarosa. Estos geles contienen de manera típica desde aproximadamente 2-5% de acrilamida y 0,5-1% de agarosa. En estos geles, la acrilamida proporciona la función principal de cribado, pero sin la agarosa, estos geles de acrilamida de baja concentración carecen de suficiente resistencia mecánica para su conveniente manipulación. La adición de agarosa proporciona soportes mecánicos sin alterar significativamente las características de cribado de la acrilamida. En estas realizaciones, el ácido nucleico puede ser acoplado a un componente que confiere la función de cribado del gel, puesto que este componente constituye el contacto más íntimo con el ácido nucleico objetivo en fase de solución. De manera alternativa, se puede disponer un material de refuerzo o soporte sobre el que está unida la matriz del gel (por ejemplo, ver Jones y otros, USSN 60/176.839; presentada en 19 de enero de 2000, titulada "Method of Detecting Nucleic Acid Using a Thin Gel Support and An Apparatus Therefor" (Método para la detección de ácido nucleico utilizando un soporte de gel delgado y aparato para el mismo), cuya materia se incorpora a la actual a título de referencia en su totalidad).
Los ácidos nucleicos pueden ser acoplados en partículas que por su parte se pueden incorporar en medios electroforéticos. Las partículas pueden ser macroscópicas, microscópicas, o coloidales en su naturaleza (ver Polysciences, Inc., "Polymer & Monomer Catalog", 1996-1997, Warrington, PA.). Cantor y otros, en la Patente U.S.A. Nº. 5.482.863 describen un método para moldear geles de electroforesis conteniendo suspensiones de partículas. Las partículas están enlazadas a los ácidos nucleicos utilizando métodos similares a los anteriormente descritos, mezclándose con compuestos formadores de geles y se moldean como suspensión en la forma de matriz deseada.
La observación de las figuras facilitará la compresión de los dispositivos y métodos de la presente invención. Haciendo referencia a la figura 1, se ha mostrado el método para la utilización del dispositivo de la invención. En la etapa (1), una muestra de pruebas (10) que comprende las moléculas objetivo de ADN (15) junto con una matriz de ADN, sales, monómeros y un tampón es colocada en la primera región (110) de un pocillo de microtitulación (100). La muestra de pruebas se encuentra en contacto con el medio electroforético situado en la segunda región (120) que comprende, como mínimo, una sonda de captación (20). En la etapa (2), se aplica un campo eléctrico al contenido del pocillo de microtitulación de manera que las moléculas cargadas negativamente pueden emigrar a través de la matriz de electroforesis en la segunda región. El objetivo ADN (15) es captado en la matriz de electroforesis (120) por la sonda de captación (20). En la etapa (3), el tampón de electroforesis es substituido con tampón reciente (preferentemente con un volumen menor que el volumen de la muestra del analito de ADN) en la primera cámara (110). Se aplica corriente para desnaturalizar el complejo formado por la sonda de captación y el objetivo de ADN, liberando de esta manera el objetivo (15) de analito de ADN de la sonda de captación. Se aplica un campo eléctrico inverso para eluir electroforéticamente el analito de ADN en el volumen de la muestra en la primera región de la unidad de purificación. En la etapa (4), se ha mostrado la eliminación del analito de ADN de la primera región de la unidad de purificación. El analito de ADN puede ser eliminado utilizando una pipeta (200) u otros medios, y la muestra de analito de ADN en el tampón se encuentra entonces listo para otros análisis tales como, por ejemplo, secuenciado de ADN.
Haciendo referencia a continuación a la figura 2, se ha mostrado un método para la preparación de una muestra que comprende productos de extensión del cebador para el secuenciado. En la etapa (1), se lleva a cabo una reacción de cadena de polimerasa en tampón para proporcionar productos de extensión (22) en una solución de muestra. La solución de muestra, además de contener productos de extensión, contiene también ddNTPs (24), enzima polimerasa (26), sales y otros componentes. En la etapa (2), la solución de muestras es colocada en el receptáculo (110) por encima del medio electroforético que contiene las sondas (120) de captación inmovilizadas. La parte baja o fondo del medio electroforético se encuentra en contacto con un tampón de electroforesis contenido en la cámara de recogida (130). Se establece un campo eléctrico entre el receptáculo y la cámara de recogida (130). Los ddNTPs (24), la enzima (26) de polimerasa y los otros componentes no objetivo de la muestra de pruebas pasan hacia adentro del tampón de electroforesis (30), mientras que los productos de extensión (22) hibridizan con la sonda de captación formando un complejo de hibridación (222) capturado dentro de la matriz del gel. El tampón de electroforesis es eliminado y se coloca un tampón de desnaturalización tanto en el receptor (110) como en la cámara de recogida (130). En la etapa (3), la cámara de recogida es una membrana semipermeable (132) en el orificio de su base (135). El dispositivo está expuesto a condiciones de desnaturalización para liberar el producto de extensión (22) del complejo de hibridación (222), permitiendo que entre en la cámara de recogida (130). La membrana semipermeable impide que los productos de extensión (22) entren en la cámara inferior (140) del electrodo hasta que se elimina el exceso de tampón. Los productos de extensión pueden ser entonces cargados en un secuenciador automático para secuenciado de ADN.
En una realización alternativa para la disposición de una muestra de ADN purificado para secuenciado que no se ha mostrado en las figuras, la secuencia de ADN captada en el gel es introducida directamente en un capilar en un secuenciador automático, eliminado de esta manera las etapas de elución y de recuperación que se han descrito anteriormente. Por ejemplo, se pueden preparar gránulos de Acrydite al preparar una solución de Hybrigel (40% de acrilamida (29:1 monómero acrilamida; bis-acrilamida) y 10 x TBE (90 mM Tris-Borato-EDTA tampón pH 8,3; reactivos comprados en Biorad Laboratories, Inc. Hercules, CA). Una sonda de captación formada por un derivado de acrilamida fosforamidita (polímero Acrydite™ de la firma Mosaic Technologies, Inc. Boston, MA) es añadida a continuación. La polimerización se inicia por la adición de 10% de persulfato amónico y N, N, N', N'-tetra-metil-etilendiamina (TEMED; BioRad, Hercules, CA). Se pipetean gotitas de aproximadamente 1,0 \mul hasta 10,0 \mul, en aceite y se permite que se realice la polimerización hasta completar la formación de gránulos. Se puede colocar un gránulo con la secuencia de sonda de captación deseada en un pocillo de una placa de microtitulación, en una punta, o en un dispositivo de soporte similar sin interferencia. Una muestra a purificar y concentrar es introducida en la superficie superior del gránulo. A continuación, se establece un gradiente de voltaje a través del gránulo en presencia del tampón de electroforesis utilizando electrodos de platino y una fuente de potencia. La muestra se deja penetrar por electroforesis en el gránulo y se produce la captación de la secuencia complementaria a la secuencia de la sonda de captación. El gránulo en un pequeño volumen de tampón es depositado a continuación sobre el electrodo del secuenciador. Los elevados voltajes utilizados para el secuenciado son suficientes para desnaturalizar el complejo de hibridación de objetivo/sonda de captación, y la secuencia de ADN se desplaza hacia afuera del gránulo de Hybrigel a través del líquido pasando al capilar.
Haciendo referencia a la figura 3A, se ilustra un método de purificación de los productos de una reacción de multiplexado utilizando una realización del dispositivo. En una reacción de multiplexado, ambas hebras de un oligonucleótido de dos hebras son replicadas simultáneamente en un mismo recipiente utilizando cebadores principal e inverso. De este modo, se sintetiza una serie de fragmentos de oligonucleótido. Se consigue un plásmido que tiene un inserto de doble hebra a replicar. Cada uno de dichos cebadores principal e inverso replican sus respectivas matrices ("templates"). Cada una genera una serie de fragmentos de oligonucleótidos de longitud variable. De manera típica, se producen secuencias de solapado tal como se ha mostrado en la figura 3A. Los fragmentos de oligonucleótidos generados por el cebador principal son separados de los fragmentos de oligonucleótidos generados por el cebador inverso utilizando una unidad de purificación del dispositivo. Una punta de sonda-gel de captación principal (40) es apilada por encima de la punta de sonda-gel de captación inversa (50) y se aplica tampón de electroforesis en su conjunto. La muestra de prueba de la reacción múltiple es cargada en el receptáculo de la punta de sonda-gel de captación principal (40) y es desplazada a través de ambas puntas bajo la influencia del campo eléctrico. Se captan fragmentos de oligonucleótido por sus sondas de captación correspondientes tal como pone en evidencia las fotografías del gel mostradas en las figuras 3B y 3C. De manera alternativa, antes de introducir la muestra en el apilamiento de la punta sonda-gel, la muestra puede ser sometida a electroferosis, por ejemplo, prepurificada, a través de una punta de carga de gel para eliminar componentes no deseados que permanecen de la reacción de multiplexado.
Los dispositivos de la invención son particularmente útiles para concentrar selectivamente un ácido nucleico mutante que se sabe que es informativo en la detección de una enfermedad. Además, las moléculas objetivo purificadas encuentran su aplicación en huellas dactilares, tipificado de tejidos, aplicaciones forenses, maternidad y comprobación de paternidad, determinación de sexo fetal, así como control de calidad en agricultura, productos alimenticios e industrias farmacéuticas.
Comparando la secuencia de ADN hallada en una muestra desconocida con secuencias de ADN conocidas, se pueden desarrollar procedimientos de diagnóstico que se basan en la identificación de secuencias mutadas características de una predisposición a cáncer o del potencial de desarrollo de una enfermedad genética. Por ejemplo, en un ensayo de detección de cáncer, el ácido nucleico mutante que caracteriza un célula cancerosa puede ser hallada en los tejidos neoplásicos en los que se ha originado el cáncer, así como en otras muestras biológicas dependientes de la etapa del cáncer, del tipo del mismo, y del tejido canceroso.
De manera específica, diferentes modelos de delecciones o mutaciones puntuales, por ejemplo, cambios de base, en secuencias de genes son características de diferentes etapas de cáncer colorectal. Se han utilizado muestras de excrementos para detectar células de cáncer colorectal al distinguir las secuencias de ADN mutante características de la enfermedad. Como ejemplo, ver Volgelstein, y otros, Patente USA Nº 5.380.645, 5.580.729 y 5.910.407. Cuando un tejido canceroso hace metástasis, se puede encontrar ácido nucleico mutante en la sangre y en los nodos del linfa. No obstante, en comparación con la cantidad de secuencia de ácido nucleico normal, la secuencia de oligonucleótido mutante se encuentra presente en cantidades muy pequeñas, típicamente en una cantidad menor de 10% del total presente. La invención da a conocer un método para concentrar el oligonucleótido mutante para permitir una determinación de secuencia precisa para la detección de la enfermedad.
Un método para utilizar el dispositivo de la invención comporta el obtener una muestra de sangre, aislar ácido nucleico, por ejemplo, ADN, de la muestra, y purificar y concentrar opcionalmente el ácido nucleico. Esto se puede conseguir colocando la muestra de prueba de ácido nucleico obtenida por extracción de la sangre en el receptáculo de un dispositivo que contiene un medio electroforético con una sonda de captación de unión covalente suficientemente específica para la secuencia de ácido nucleico objetivo para permitir la hibridación con la sonda de captación. El ácido nucleico objetivo puede ser sometido a electroforesis hasta que hibridiza la sonda de captación. El ácido nucleico pude ser eliminado de la sonda, y opcionalmente amplificado para proporcionar suficiente ácido nucleico para el secuenciado. Alternativamente, se puede secuenciar directamente. La concentración de la muestra puede ser conseguida utilizado una pequeña cantidad de tampón cuando se recoge una secuencia de ácido nucleico objetivo liberada del complejo de hibridación.
También se incluyen dentro del ámbito de la invención métodos para desarrollar condiciones óptimas para métodos de purificar ácidos nucleicos objetivo. Los ácidos nucleicos objetivo, particularmente ácidos nucleicos mutantes objetivo que se sabe que son informativos en una detección de enfermedades, se pueden purificar de manera más efectiva cuando se optimizan las condiciones que afectan la captación de los ácidos nucleicos objetivo y la elución de los ácidos nucleicos objetivo.
También se prevén dispositivos o equipos ("kits") que contienen dispositivos según la invención utilizables para practicar los métodos descritos. Un dispositivo para la preparación acelerada de productos de secuencia de ADN para electroforesis capilar puede incluir un contenedor de puntas de carga de gel y, un contenedor de puntas de sonda-gel. También puede incluir electrodos dimensionados para acoplarse a las puntas, y un contenedor de tampón de electroforesis y/o una fuente de potencia para el acoplamiento de los electrodos.
Un dispositivo para multiplexado acelerado puede incluir un contenedor de puntas de sonda 1-gel (que puede ser un complemento de secuencia de cebador principal) y un contenedor de puntas de sonda 2-gel (que puede ser un complemento de secuencia de cebador inverso). Adicionalmente, el dispositivo puede incluir un contenedor de puntas de carga de gel, electrodos, una fuente de potencia y un tampón o cualquier combinación de estos componentes.
También se prevé un equipo para acelerar la detección de ADN mutante característico de la secuencia de ADN asociada con tejidos cancerosos. Este equipo puede comprender un contenedor de puntas de sonda-gel, en el que la secuencia de la sonda inmovilizada en el medio electroforético complementario a una secuencia de ADN mutante que se conoce que está asociada con un tipo determinado de cáncer.
Cualquiera de los dispositivos puede ser configurado para contener equipos con una serie de unidades de purificación.
Ejemplos Ejemplo 1 Purificación de un producto de ADN único complementario de la secuencia M13mp18
La figura 5 es una fotografía de un gel que muestra los resultados de purificación de una secuencia de oligonucleótido deseada a partir de una reacción de secuenciado de ADN que incluye cebadores, sales, modelo o matriz de ADN ("template"), nucleótidos no incorporados y determinadores de colorante. En primer lugar, el ADN a utilizar en la reacción de secuenciado fue purificado por punta de carga de gel para proporcionar una muestra en crudo, a continuación la muestra en crudo fue purificada por captación de la punta de sonda de gel. La pista 1 muestra el modelo proporcionado antes de la purificación. La pista 2 facilita el modelo después de purificación utilizando una punta de carga de gel. La eliminación del modelo o matriz de ADN queda demostrada. La pista 3 muestra el modelo visto después de purificación utilizando una punta de sonda-gel de captación. La localización de la secuencia deseada en ausencia de la matriz o modelo de ADN queda demostrada.
A. Preparación de un dispositivo de separación con sonda de captación inmovilizada con punta de sonda de gel ("Probe-Gel-Tip") y sin punta de carga de gel ("Gel-Loading-Tip")
La preparación de la punta de sonda-gel, dispositivo de purificación que contiene gel de oligonucleótido Acrydite^{TM} se llevó a cabo del modo siguiente:
Se preparó una solución de Hybrigel a partir de soluciones de material de 40% de acrilamida (29:1 monómero acrilamida: bis-acrilamida) y 10x TBE (90mM Tris-Borato-EDTA tampón pH 8,3; los reactivos fueron adquiridos a Biorad Laboratories, Inc.; Hercules, CA). El oligonucleótido Acrydite^{TM} para la sonda de captación fue sintetizado utilizando oligonucleótidos (obtenidos de la firma Operon Technologies, Inc.; Alameda, CA) y acrilamida fosforamidita (polímero Acrydite^{TM} de la firma Mosaic Technologies, Inc.; Waltham, MA) de acuerdo con los métodos que se dan a conocer en la Patente USA Nº 5.641.658 y del artículo de Kenney, Ray, and Boles, Bio Techniques 25, 516-521 (1998). El Hybrigel contenía 5% de acrilamida (29:1),1 x TBE y 10 \muM de sonda de captación de oligonucleótido Acrydite^{TM} con la siguiente secuencia:
5'-acrilamida GCT GAG ATC TCC TAG GG 3' (Sonda 1) (SEQ ID NO:1)
La sonda de captación seleccionada para este ejemplo tiene una secuencia que es complementaria a una parte del polienlazador del vector M13mp18 que proporciona la molécula objetivo, un producto de reacción de secuenciado ADN, pero la sonda de captación no incluye ninguna de las secuencias de cebador. Cuando se añadieron 10% de persulfato amónico y N, N, N', N'-Tetra-metiletilenediamina (TEMED; BioRad, Hercules, CA) a la solución Hybrigel, la polimerización tubo lugar rápidamente (dentro de dos minutos).
Para preparar la punta de sonda-gel, se añadieron 1,0 \mul de persulfato amónico al 10% y 0,5 \mul de TEMED a 200,0 \mul de solución Hybrigel. 10,0 \mul de la solución que contenía el oligonucleótido polimerizante Hybrigel se pipetearon rápidamente en una punta de 200,0 \mul (Fisher Scientific, Co., Pittsburgh, PA) y se dejó polimerizar. Las puntas de sonda-gel fueron realizadas ocho o doce a la vez utilizando un dispositivo de multipipeteado (puntas de pipeta de un sólo uso de 200 \mul y dispositivos de multipipeteado son disponibles de la firma Gilson, Middleton, WI). Para almacenamiento, se expulsaron puntas de sonda-gel en puntas de microtubo conteniendo aproximadamente 0,3 ml de 1x TBE. Se debe tener cuidado en no separar el gel de la punta. A continuación las puntas de sonda de gel fueron superpuestas con 150,0 \mul de 1x TBE.
Las puntas de carga de gel fueron utilizadas para eliminar ADN modelo o matriz. Las puntas de carga de gel fueron preparadas conteniendo acrilamida (29:1) solamente (es decir, sondas de captación sin Acrydite^{TM}). Las puntas de carga de gel fueron preparadas tal como se ha descrito anteriormente utilizando una solución que contiene 5% acrilamida (29:1), 1x TBE, realizada a partir de soluciones de 40% de acrilamida (29:1 monómero:bis) y 10x TBE. Se añadieron 10% de persulfato amónico y TEMED a la solución y 200,0 \mul de la solución final fueron pipeteados en cada una de las puntas. Las puntas de carga de gel pueden ser también almacenadas tal como se ha descrito anteriormente.
B. Preparación de un producto de secuencia de ADN y sondas de captación
Se prepararon productos de secuenciado PE-Applied Biosystems siguiendo el protocolo del equipo de secuenciado de ciclo de cebador PE Applied Biosystems BigDye (de la firma PE-Applied BioSystems, Wellesley, MA) con el cebador principal -21 M13 en un dispositivo GeneAmp 2400 utilizando las condiciones de ciclo recomendadas por PE Applied Biosystems. Se utilizó el vector M13mp18. Se insertó un segmento de ADN con una secuencia conocida después del primer lugar. Se prepararon productos de ampliación o extensión. Se realizaron sondas de captación correspondientes a la región entre el cebador y el ADN insertado. Se seleccionaron las sondas de captación capaces de hibridizar productos de ampliación o extensión del cebador principal. Las sondas de captación comprenden un oligonucleótido sintetizado con Acrydite™ en el extremo 5'.
De manera alternativa, se puede utilizar el equipo de secuenciado de ciclos DYEnamic ET Terminator de la firma Amersham-Pharmacia.
C. Captación del producto de extensión de la secuencia de ADN
Se llevó a cabo la captación y separación electroforéticas de un producto de extensión escogido (objetivo en la muestra de pruebas), de la manera siguiente: 10,0 \mul de solución de reacción de secuenciado (es decir, ½ de una reacción) que contenía cebadores, sal, nucleótidos no incorporados, terminadores de colorante, ADN matriz o modelo, y los productos de extensión de ADN objetivo sintetizados a partir del modelo de ADN, se añadieron a 1,0 \mul de un tamón de carga 10x ficoll (35% ficoll 400, 0,1% azul Bromofenol, 0,1% cianol de xileno, 100 mM EDTA) para conseguir una solución de muestra. Se dispuso en forma de capas un volumen, aproximadamente de 200 \mul, de tampón de electroforesis sobre la superficie del gel en la punta de carga de gel, mientras que un volumen más pequeño, suficiente para mantener húmeda la superficie y proporcionar contacto eléctrico) se aplicó en forma de capa sobre la superficie de la punta de sonda de gel ("probe-gel-tip"). La solución de muestra fue dispuesta en capas sobre la superficie del gel que se encuentra en una punta de carga de gel ("gel-loading-tip"), (es decir, sin sonda de captación de Acrydite™), para eliminar el modelo de ADN. Esta punta fue apilada sobre una punta de sonda de gel, punta que contiene Hybrigel, tal como se muestra en la figura 4A. Se dispuso en forma de capas un pequeño volumen del tampón de electroforesis sobre la superficie del gel en la punta de sonda de gel y la punta de carga de gel fue colocada en contacto con el tampón de electroforesis. De este modo, se formó una conexión de líquido entre los dos geles, permitiendo la conexión eléctrica cuando se encontraban en su lugar los electrodos y la fuente de potencia.
Después de que la solución de muestra fue cargada en la superficie del gel de la punta de carga de gel, ambas puntas fueron colocadas en microtubos de (1,5 ml) conteniendo 1x TBE, de tampón de electroforesis. Se colocaron electrodos de platino en el tampón de electroforesis por encima y por debajo de las puntas de gel apiladas y se aplicó un voltaje de 100V durante 10 minutos. El electrodo superior fue conectado al conductor negativo del suministro de potencia, mientras que el electrodo inferior fue acoplado al electrodo positivo del suministro de potencia. La punta de carga de gel proporcionó por lo tanto una solución de muestras parcialmente purificada para introducción en la punta de sonda de gel ("probe-gel-tip"). (En este momento, se puede eliminar la punta de carga de gel). Los fragmentos de ADN más pequeños pasan al tampón y a continuación a la punta de carga de gel más rápidamente que la matriz o modelo de ADN y colorante, que quedan retenidos en la punta de carga de gel.
El tampón de electroforesis que permanece sobre la superficie de gel de la punta de sonda de gel fue eliminado. El tampón de electroforesis fue substituido con 4 \mul de un tinte de carga de formamida (5:1 de formamida desionizada, 25mg/ml de azul de dextrano, 25mM EDTA) La temperatura del gel en la punta de sonda de gel se elevó 55ºC para facilitar el desacoplamiento de la secuencia de oligonucleótido objetivo de la sonda de captación al colocar las puntas de microtubo que contienen el recipiente tampón inferior en un baño seco, (VWR). Una segunda punta de carga de gel limpia con el 30% de gel de acrilamida conteniendo 5% de ácido acrílico fue aplicada al colorante de carga de formamida. Se colocó un electrodo de platino en la punta de carga de gel superior. La dirección de la corriente se invirtió para conducir el oligonucleótido liberado del complejo de hibridización hacia arriba. Un minuto (1) a 40V fue suficiente para expulsar al oligonucleótido fuera de la punta de sonda de gel y hacia adentro del colorante de carga de formamida. Se eliminó una muestra de 4,0 \mul mediante pipeta y se retuvo para análisis de secuencia. Después de la electroforesis, el gel de la punta de sonda de gel se visualizó utilizando un dispositivo Molecular Dynamics Fluorimager 595. Los resultados mostrados en la figura 4B demuestran que la captación tiene lugar en la superficie superior del gel en la punta de carga de gel.
D. Análisis de purificación de secuencia por ensayo de Hybrigel
Se montaron placas de cristal para un minigel de poliacrilamida vertical (separadores de 10 x 10 cm, 0,75 mm) y el sandwich se llenó aproximadamente hasta la mitad con 20% de acrilamida (29:1; Bio-Rad), 1x TBE (tampón Tris-borato 90 mM, pH 8,3, 2 mM EDTA). La polimerización fue iniciada por inclusión de persulfato amónico acuoso al 10% (APS) y TEMED a 1/100 y 1/1000 de volumen de gel, respectivamente. Para geles que contienen una capa de captación, se polimerizaron 600 \mul de una solución de gel (20% poliacrilamida, 1x TBE, 4 \mul 10% APS y 4 \mul 10% TEMED) conteniendo oligonucleótido marcado con Acrydite™ con una concentración final de 10 \muM. Después de polimerización de la capa de captación, el espacio restante de la placa de sandwich fue llenado con un gel al 5%. Este gel compuesto fue aplicado en un aparato minigel conteniendo 1x TBE y sometido a electroforesis a 100-150 V durante \sim45 minutos. Después de electroforesis el gel fue visualizado utilizando un dispositivo Molecular Dynamics Fluorimager 595. Los resultados confirman que la secuencia captada por la sonda de Hybrigel es el complemento del modelo o matriz de ADN.
E. Secuenciado automático del oligonucleótido captado
Siguiendo los procedimientos anteriormente descritos y analizando la secuencia de oligonucleótido purificada por el dispositivo de la invención con un secuenciador automatizado, experimentos repetidos con vectores estándar han demostrado que la exactitud de secuenciado de los primeros 500 nucleótidos se aproxima al 100%. La secuencia legible se extiende a un mínimo de 750 nucleótidos.
Ejemplo 2 Separación simultánea de productos de secuencia de ADN
Este ejemplo demuestra que el dispositivo y método de la invención son útiles para el secuenciado de un inserto de oligonucleótido replicado en un plásmido. Se utilizan cebadores principal y de inversión tal como se muestran en la figura 3A. Se secuenció un plásmido con un inserto grande simultáneamente utilizando dos cebadores en un recipiente de reacción. Se dispusieron en tándem dos puntas de sonda de gel cada una de las cuales contenía una sonda de captación distinta. La secuencias de sonda fueron diseñadas basándose en los cebadores principal y de inversión utilizados. De la placa de gel mostrada en la figura 5, se muestra la purificación de los dos oligonucleótidos objetivos en la muestra de pruebas en comparación con el producto en crudo. Se debe observar que la secuencia del producto inverso (derecho) no muestra contaminación con la secuencia principal. Se debe observar también que se ha eliminado la contaminación del modelo o matriz de ADN.
A. Preparación del dispositivo de separación con y sin sonda de captación inmovilizada
Se prepararon puntas de carga de gel tal como se describe en el Ejemplo 1.
Se prepararon puntas de sonda de gel tal como se describe en el Ejemplo 1, excepto que una de ellas fue dotada de una sonda de cebador principal (sonda 2) y la otra fue dotada de una sonda de cebador inverso (sonda 3) tal como se muestra en la figura 3a. De este modo, se realizaron dos puntas de gel de sonda Hybrigel separadas, una con oligonucleótido acridita 6269-17ac (SEQ ID NO: 2) y el otro con oligonucleótido acridita 6231-19ac (SEQ ID NO: 3). Se utilizó el plásmido p698 que es un vector plásmido pGEM3Zf(-) (Promega Biotech, WI) con un inserto de 3,8 kb en el lugar Xba I del polienlazador. Las dos sondas se derivan de la secuencia de uno u otro lado del lugar Xba I dentro del polienlazador. La sonda 6269-17ac es complementaria, y por lo tanto es capaz de efectuar la captación de productos de secuencia realizados con utilización del cebador inverso. De manera similar, la sonda 6231-19ac puede captar la secuencia del cebador principal.
6269-17ac 5'acrilamida-TGCGGCATGCAAGCTT (SEQ ID NO: 2)
62331-19ac 5'acrilamida-GGGTACCGAGCTCGAATTC (SEQ ID NO: 3)
De este modo, cada una de las sondas de cebador de oligonucleótido es sintetizada con Acrydite en el extremo 5' y es capaz de hibridizar un producto de extensión. Cada una de las secuencias de sonda de captación es complementaria tanto con una secuencia de producto de extensión como con el cebador. Cada secuencia de sonda de captación es específica para un vector específico derivado de la región existente entre el primer lugar y el ADN de inserto.
B. Productos de purificación de reacciones múltiples
La punta de gel de sonda (2) fue colocada en tándem (apilada) con una punta de gel de sonda (3) tal como se ha mostrado en la figura 3a. Se colocó tampón de electroforesis corriente sobre la superficie superior de la punta de gel de sonda (3) para proporcionar contacto eléctrico y para impedir el secado. La muestra de pruebas de una reacción de secuenciado múltiple fue sometida a electroforesis a través de la punta de gel de sonda (2) y de la punta de gel de sonda (3). La figura 3b muestra la captación en las dos puntas separadas por las dos sondas distintas.
Ejemplo 3 Elución de objetivo de la sonda de captación utilizando un gradiente de temperatura
Se puede utilizar el siguiente método para determinar la temperatura óptima para captación y elución.
La estabilidad del complejo de hibridación depende de la temperatura. Se preparó una placa vertical de gel conteniendo una capa de sonda de captación de Acrydite en sandwich entre capas de gel sin sonda de captación. El gel para las capas superior e inferior fue el utilizado para la punta de carga de gel. La capa de sonda de Acrydite se realizó tal como se ha descrito en el Ejemplo 1 para la punta de sonda de gel utilizando la secuencia de sonda de captación 6249-17ac (SEQ ID NO: 4). La muestra en este caso era un oligonucleótido fluorescente con una secuencia complementaria con respecto a 6249-17ac. La misma muestra fue cargada en cada uno de los pocillos. El gel en su conjunto fue sometido a un gradiente de temperatura utilizando una placa posterior de aluminio y dos baños de agua. La temperatura del gel de la izquierda es de 23ºC. La temperatura aumentó en el gel hasta 53ºC en la derecha. A baja temperatura el objetivo fue captado eficazmente en la parte superior de la capa de captación. Al aumentar la temperatura la captación del objetivo se inhibió hasta que la muestra pasa a través de la capa. La temperatura de transición, es decir, la temperatura a la que la diana u objetivo deja de ser captado, se relaciona con T_{m}. Las temperaturas por debajo de esa temperatura de transición son utilizables para captación, mientras que las que se encuentran por encima de esa temperatura de transición son utilizables para elución.
Ejemplo 4 Dependencia de la elución de la secuencia con respecto a la temperatura y de las dimensiones de la sonda de captación
Para definir condiciones de temperatura para captación y elución de productos de secuenciado se llevó a cabo el experimento mostrado en la figura 7. Este experimento demostró que la temperatura de elución está afectada por las dimensiones de la sonda de captación. La temperatura de elución se observó que estaba afectada por las dimensiones de la sonda de captación. Los cinco paneles mostrados en la figura 7 muestran la misma placa de gel vertical a cinco diferentes temperaturas empezando con 23ºC, de manera que se utilizaron cinco sondas de captación distintas. El número de bases de cada secuencia de sonda fue de 13, 15, 17, 19, y 21 nucleótidos, tal como se indica en la figura 7 (de la izquierda a la derecha). Se cargó una reacción de secuenciado M13 (Dynamic^{TM} ET) en cada pista. La 13 mer no captó bien a 23ºC mientras que las otras si lo hicieron. A 30ºC 15 mer liberó la secuencia mientras que 17 mer empezó a liberar a 35ºC y así sucesivamente hasta que a 50ºC habían salido todas las secuencias objetivo. Estos resultados muestran las condiciones de temperatura para la captación y elución de productos de secuenciado.
La sonda 17 mer Acrydite^{TM} fue escogida como sonda de captación en el proceso estándar teniendo lugar la elución a 45ºC.
Si bien la presente invención ha sido especialmente mostrada y descrita con referencia a realizaciones preferentes de la misma, se comprenderá por los técnicos de la materia que se pueden introducir diferentes cambios en la forma y detalles en la misma sin salir del ámbito de la invención que queda comprendida en las siguientes reivindicaciones.

Claims (16)

1. Dispositivo para la purificación de una molécula de ácido nucleico objetivo de una muestra de pruebas, que comprende como mínimo una unidad de purificación, incluyendo la unidad de purificación un conducto que comprende:
(a)
una primera región que incluye un receptáculo para recibir una muestra;
(b)
una segunda región que incluye un medio electroforético con una sonda de captación inmovilizada como mínimo, seleccionada para hibridizar con respecto al ácido nucleico objetivo, de manera que la sonda de captación es copolimerizada con respecto al medio electroforético; y
(c)
una tercera región que incluye una cámara de recogida para recibir la muestra de prueba que pasa a través de la región segunda, separando la región segunda la región primera con respecto a la región tercera.
2. Dispositivo, según la reivindicación 1, que comprende además una serie de unidades de purificación.
3. Dispositivo, según la reivindicación 2, en el que el dispositivo es una placa de microtitulación y cada unidad de purificación es un pocillo de microtitulación.
4. Dispositivo, según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 3, en el que la cámara de recogida es un orificio de salida.
5. Dispositivo, según la reivindicación 4, en el que el orificio de salida comprende una membrana semipermeable.
6. Dispositivo, según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 3, que comprende una serie de sondas de captación idénticas.
7. Dispositivo, según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 3, que comprende una serie de sondas de captación distintas.
8. Método para la purificación de una molécula de ácido nucleico objetivo de una muestra de prueba, que comprende las siguientes etapas:
(a)
introducir una muestra de pruebas que contiene la molécula de ácido nucleico objetivo en el receptáculo de una unidad de un dispositivo de purificación que comprende:
(1)
una primera región que comprende un receptáculo para recibir una muestra;
(2)
una segunda región que incluye un medio electroforético que tiene como mínimo una sonda de captación inmovilizada seleccionada para hibridizar con respecto al ácido nucleico objetivo, de manera que la sonda de captación es copolimerizada con respecto al medio electroforético; y
(3)
una tercera región que incluye una cámara de recogida para recibir la muestra de pruebas que pasa a través de la segunda región, separando la segunda región la primera con respecto a la tercera; y
(b)
someter el medio electroforético a un campo eléctrico resultante en la emigración de la muestra de pruebas a través del medio, en condiciones apropiadas para que la molécula objetivo de la muestra de pruebas hibridice con respecto a la sonda de captación, formando de esta manera un complejo de molécula objetivo/sonda de captación, y que el resto de componentes de la muestra de pruebas emigre del medio y se eluya del mismo.
9. Método, según la reivindicación 8, que comprende además el tratamiento del medio electroforético para liberar la molécula objetivo.
10. Método, según la reivindicación 9, en el que la molécula objetivo es liberada del medio electroforético por un tratamiento seleccionado entre el grupo que consiste en elevar la temperatura del medio electroforético a una temperatura suficiente para desnaturalizar el complejo de molécula objetivo/sonda de captación, fraccionando el enlace químico que inmoviliza las sondas de captación dentro del medio electroforético e incrementando la intensidad en el campo electroforético a un nivel suficiente para alterar el complejo de molécula objetivo/sonda de captación.
11. Método, según la reivindicación 9, en el que la molécula objetivo es liberada hacia el receptáculo.
12. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 8, 9 y 10, que comprende además la amplificación de la molécula objetivo.
13. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que la muestra es una muestra de excrementos.
14. Método, según la reivindicación 13, que comprende además el análisis de la molécula de ácido nucleico objetivo para detectar la presencia de cáncer colorectal.
15. Utilización, para la detección de una enfermedad humana, de un ácido nucleico objetivo purificado mediante un dispositivo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 por un método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, siendo el ácido nucleico objetivo un ácido nucleico mutante.
16. Utilización, según la reivindicación 15, en la que
(a)
la enfermedad es cáncer; o bien
(b)
la enfermedad es cáncer colorectal.
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