JP3337386B2 - Dnaシーケンスサンプルの精製及び分離検出系への移行方法並びにそれに用いるプレート - Google Patents
Dnaシーケンスサンプルの精製及び分離検出系への移行方法並びにそれに用いるプレートInfo
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Description
のウエル中で生成させた複数の反応産物を、電気泳動に
代表される多数のキャピラリーを用いた解析機に、一度
に(同時に)供することができる、DNAシーケンスサ
ンプルの分離検出系移行用プレートに関する。さらに、
本発明は、このプレートを用いたDNAシーケンスサン
プルの移行方法、このプレートを用いたDNAシーケン
スサンプルの精製方法、およびこのプレートを用いたD
NAシーケンスサンプルの精製・移行方法に関する。
検出手法が発達し、それを用いたレーザー蛍光DNAシ
ーケンサーが大変有用な機器として汎用されている。ま
たこのような技術の発達はゲノム研究やDNA診断にお
ける大量の検体処理(約100レーン/2運転/日/台
以下)を可能にした。レーザーシーケンサーの代表例
として、スラブ型ゲルとキャピラリー型ゲルがある。
理のために、より多くの電気泳動のレーン(例えば、2
00〜1000レーン/運転)を有する機器も考案され
つつある。そのような機器の例として、マルチキャピラ
リー型シーケンサーがある。
が多くなればなる程、レーンに検体を移行する作業に時
間が掛かり、大きな負担となる。即ち、多数の検体を各
キャピラリーゲルにのせるのに、各検体について、キャ
ピラリーの末端と細電極線とを接触させて検体をキャピ
ラリー内に注入する操作を行わなければならない。そこ
で、多数の検体を短時間にしかも簡単にキャピラリーに
移行できる技術の開発が急務となっている。さらに、マ
イクロタイタープレートの各ウエルに反応液を充填する
のも、ウエルの数が増える程その操作に時間を要するこ
とになる。そこで、短時間に各ウエルに反応液を充填す
る手段の提供も必要となる。
る生成物中には、蛍光物質等で標識された種々の長さの
フラグメントと未反応の標識物質とが共存する。共存す
る未反応の標識物質は、その大部分が反応に使用される
ことなく、反応液中に遊離しているため、これをそのま
ま電気泳動に供すると、高濃度の蛍光ラベルも同時に泳
動され、シークレンスのバンドよりも遙に強いシグナル
を出し、シークエンスの解読が不可能になることから、
分離前に除去される必要がある。ところが、数百の生成
物のそれぞれについて未反応の標識物質を除去するに
は、多くの人手と時間とを要する。その結果、DNAシ
ーケンス方法自体の効率が向上しても、その前段階にお
いて律速が生じてしまう。
数ウエルに短時間にしかも簡単に充填できる手段を提供
することにある。本発明の第2の目的は、未反応の標識
物質等を含む複数のDNAシーケンスサンプルから短時
間にしかも簡単に、標識物質等を除去する方法を提供す
ることにある。本発明の第3の目的は、多数のDNAシ
ーケンスサンプルを短時間にしかも簡単に電気泳動キャ
ピラリーに移行できる手段を提供することにある。ま
た、本発明の第4の目的は、未反応の標識物質等を含む
複数のDNAシーケンスサンプルから短時間にしかも簡
単に、標識物質等を除去し、かつ多数のDNAシーケン
スサンプルを短時間に、簡単に電気泳動キャピラリーに
移行できる方法を提供することにある。
厚さ方向に貫通する複数の貫通孔を有する基板からなる
反応用容器前駆体に関する。さらに、本発明の第2の態
様は、前記本発明の容器前駆体を反応液に浸漬して貫通
孔内に前記反応液を充填し、次いで前記貫通孔の一方の
開放口を膜で封鎖して前記貫通孔を反応容器とすること
を特徴とする反応液を内蔵する容器の製造方法に関す
る。
る複数の貫通孔を有する基板とこの貫通孔の一方の開放
口を封鎖するように設けられた膜とからなることを特徴
とするDNAシーケンスサンプルの分離検出系移行用プ
レートに関する。
サンプル中の未反応の低分子化合物を除去する方法であ
って、前記本発明のプレートの貫通孔内にDNAシーケ
ンスサンプルを充填した状態で、貫通孔の開放口と膜の
外側との間に、膜の外側が負圧となるように圧力差を加
えて、前記DNAシーケンスサンプル内の未反応の低分
子化合物を前記膜を介して前記サンプル外に移行させる
ことを特徴とする方法に関する。
サンプル中の未反応の低分子化合物を除去する方法であ
って、前記本発明のプレートの貫通孔内に充填されたD
NAシーケンスサンプルと、前記DNAシーケンスサン
プルを充填した貫通孔を封鎖する膜の外側との間に電圧
を印加して、前記DNAシーケンスサンプル内の未反応
の低分子化合物を膜を介して前記サンプル外に移行させ
ることを特徴とする方法に関する。
ートの貫通孔内に充填されたDNAシーケンスサンプル
を分離検出用の電気泳動キャピラリーに移行する方法で
あって、前記電気泳動キャピラリーの一端を前記貫通孔
内に充填されたDNAシーケンスサンプルに浸漬した状
態で、前記DNAシーケンスサンプルを充填した貫通孔
を封鎖する膜と前記電気泳動キャピラリーの他端との間
に電圧を印加して、前記DNAシーケンスサンプル内の
検体を前記電気泳動キャピラリーに移行させることを特
徴とするDNAシーケンスサンプルの分離検出系への移
行方法に関する。
ートの貫通孔内にDNAシーケンスサンプルを充填した
状態で、電気泳動キャピラリーの一端を、貫通孔の開放
口側から、前記貫通孔内のDNAシーケンスサンプルに
浸漬し、電気泳動キャピラリーの他端から電気泳動キャ
ピラリー内に充填物を吸引することにより前記DNAシ
ーケンスサンプル内の検体を前記電気泳動キャピラリー
内に移行させることを特徴とするDNAシーケンスサン
プルの分離検出系への移行方法に関する。
サンプル中の未反応の低分子化合物を除去し、次いでD
NAシーケンスサンプル中の検体を分離検出用の電気泳
動キャピラリーに移行する方法であって、前記本発明の
プレートの貫通孔内に充填されたDNAシーケンスサン
プルに電気泳動キャピラリーの一端を浸漬した状態で、
前記DNAシーケンスサンプルを充填した貫通孔を封鎖
する膜と前記電気泳動キャピラリーの他端との間に電圧
を印加して、前記DNAシーケンスサンプル内の未反応
の低分子化合物を膜を介して前記サンプル外に移行さ
せ、次いで、前記膜と前記電気泳動キャピラリーの他端
との間に電圧を印加して、前記DNAシーケンスサンプ
ル内の検体を前記電気泳動キャピラリーに移行させる、
ことを特徴とするDNAシーケンスサンプルの精製およ
び分離検出系への移行方法に関する。
サンプル中の未反応の低分子化合物を除去し、次いでD
NAシーケンスサンプル中の検体を分離検出用の電気泳
動キャピラリーに移行する方法であって、前記本発明の
プレートの貫通孔内にDNAシーケンスサンプルを充填
した状態で、貫通孔の開放口と膜の外側との間に、膜の
外側が負圧となるように圧力差を加えて、前記DNAシ
ーケンスサンプル内の未反応の低分子化合物を前記膜を
介して前記サンプル外に移行させ、次いで前記DNAシ
ーケンスサンプルに電気泳動キャピラリーの一端を浸漬
した状態で、前記DNAシーケンスサンプルを充填した
貫通孔を封鎖する膜と前記電気泳動キャピラリーの他端
との間に電圧を印加して、前記DNAシーケンスサンプ
ル内の検体を前記電気泳動キャピラリーに移行させる、
ことを特徴とするDNAシーケンスサンプルの精製およ
び分離検出系への移行方法に関する。
2の態様) 本発明の容器前駆体は、厚さ方向に貫通する複数の貫通
孔を有する基板からなるものである。さらにこの容器前
駆体は、反応用液を内蔵する容器の製造に用いることが
できる。図1に基づいて説明する。容器前駆体20は、
厚さ方向に貫通する複数の貫通孔21を有する基板22
からなる。基板22は、例えば、合成樹脂やガラス等か
ら形成することができ、その大きさや厚さは、貫通孔2
1の寸法(内径と深さ)及び数を考慮して適宜決定でき
る。貫通孔21の寸法(内径と深さ)及び数は、用途に
応じて適宜決定でき、貫通孔21内径は、例えば、0.
05〜10mm、好ましくは0.5〜5mm、深さは、
例えば、0.2〜200mmとすることができる。ま
た、貫通孔21の数は、多ければそれだて多くのサンプ
ルを一度に処理できるが、分離検出機器の電気泳動キャ
ピラリーの数や分離検出機器の性能等を考慮して適宜決
定する。
て貫通孔21内に前記反応液25aを充填し、次いで前
記貫通孔21の一方の開放口を膜23で封鎖して前記貫
通孔を反応容器24とすることで、反応液を内蔵する容
器を製造することができる。上記反応液には特に制限は
なく、用途に応じて適宜決定できる。例えば、各種の酵
素を含む緩衝液であることができる。
づいて説明する。分離検出系移行用プレート1は、厚さ
方向に貫通する複数の貫通孔2を有する基板3とこれら
貫通孔2の一方の開放口4を封鎖するように設けられた
膜5とからなる。基板3は、例えば、合成樹脂やガラス
等から形成することができ、その大きさや厚さは、貫通
孔2の寸法(内径と深さ)及び数を考慮して適宜決定で
きる。貫通孔2の寸法(内径と深さ)及び数は、用途に
応じて適宜決定でき、貫通孔2内径は、例えば、0.1
〜5mm、深さは、例えば、0.2〜200mmとする
ことができる。また、貫通孔2の数は、多ければそれだ
け多くのサンプルを一度に処理できるが、分離検出機器
の電気泳動キャピラリーの数や分離検出機器の性能等を
考慮して適宜決定する。
選択することができる。例えば、DNAシーケンスサン
プル中の検体を電気的に電気泳動キャピラリーに移行さ
せる場合には、膜5は、電解液と接して通電可能な材料
であれば良く、例えば、限外濾過膜のような分子篩の隔
膜として用いられている膜を用いることができる。ま
た、DNAシーケンスサンプル中の検体を圧力差を利用
して電気泳動キャピラリーに移行させる場合には、膜5
は液体透過性材料からなる膜であるば良く、例えば、セ
ロハン膜やポリエーテルスルホン膜等の膜を用いること
ができる。
応の低分子化合物を電気的に膜5を介して系外に除去す
る場合には、膜5は、低分子化合物は透過するが、反応
生成物であるDNA断片は透過しない材料であれば良
い。例えば、限外濾過膜のような膜を用いることができ
る。さらに、DNAシーケンスサンプル中の未反応の低
分子化合物を電気的に膜5を介して系外に除去し、次い
で、DNAシーケンスサンプル中の検体を電気的に電気
泳動キャピラリーに移行させる場合には、膜5は、低分
子化合物は透過するが、反応生成物であるDNA断片は
透過しない材料であり、かつ電解液と接して通電可能な
材料であれば良い。そのような膜としても、例えば、限
外濾過膜のような膜を用いることができる。尚、本発明
のにおいて限外濾過膜としては、ポリエーテルスルホン
膜を用いることができる。
法)(第4の態様) 図3に基づいて説明する。上記本発明のプレート1の貫
通孔2内にDNAシーケンスサンプル7を充填した状態
で、貫通孔の開放口2aと膜5の外側との間に、膜5の
外側が負圧となるように圧力差を加える。具体的には、
例えば、プレート1の膜5側を減圧容器20にセットし
て減圧することで、膜5の外側が負圧となるように圧力
差を加えることができる。DNAシーケンスサンプル内
の未反応の低分子化合物は、膜5を介して、他の低分子
化合物、例えば、水等と共にサンプル外に移行させるこ
とができる。
法)(第5の態様) 本発明の第5の態様には、以下の2つの方法が含まれ
る。第1の方法は、プレートの貫通孔内に充填されたD
NAシーケンスサンプルに電気泳動キャピラリーの一端
を浸漬し、この電気泳動キャピラリーの他端と接触する
電解液に浸漬した電極と、前記DNAシーケンスサンプ
ルを充填した貫通孔を封鎖する膜が接触する電解液に浸
漬した電極との間に電圧を印加する方法である。この方
法を図4に基づいて説明する。上記本発明のプレート1
の貫通孔2内に充填されたDNAシーケンスサンプル7
に電気泳動キャピラリー6の一端6aを浸漬した状態
で、膜5と電気泳動キャピラリー6の他端6bとの間に
電気泳動キャピラリー6の他端6bが陰極となるように
電圧を印加する。電圧の印加は、膜5を電極9を浸漬し
た電解液8と接触させ、電気泳動キャピラリー6の他端
6bを電極10を浸漬した電解液11と接触させ、電極
9を陽極とし、電極10を陰極とすることで行うことが
できる。このようにしてDNAシーケンスサンプル7内
の未反応の低分子化合物を膜5を介してサンプル外に移
行させることができる。尚、図4には、1つの貫通孔2
についてのみ図示されているが、複数の又は全ての貫通
孔2において同時に並行して上記低分子化合物の移行操
作を実施することができる。
されたDNAシーケンスサンプルに電極を浸漬し、この
電極と、前記DNAシーケンスサンプルを充填した貫通
孔を封鎖する膜が接触する電解液に浸漬した電極との間
に電圧を印加する方法である。このDNAシーケンスサ
ンプルに電極を浸漬する場合を図5に示す。上記本発明
のプレート1の貫通孔2内に充填されたDNAシーケン
スサンプル7に電極12を浸漬した状態で、膜5と電極
9との間に電極12が陰極となるように電圧を印加する
ことで行うことができる。このようにしても、DNAシ
ーケンスサンプル7内の未反応の低分子化合物を膜5を
介してサンプル外に移行させることができる。尚、図5
には、1つの貫通孔2についてのみ図示されているが、
複数の又は全ての貫通孔2において同時に並行して上記
低分子化合物の移行操作を実施することができる
面を電解液8に接触させ、電極12又は電気泳動キャピ
ラリー6を各貫通孔内のサンプルに浸漬し、かつ電圧を
印加することで、複数または全ての貫通孔2内のDNA
シーケンスサンプル中の未反応の低分子化合物を膜5を
介して、同時に並行してサンプル外に移行させることが
できる。
(第6の態様) 上記本発明のプレートの貫通孔内に充填されたDNAシ
ーケンスサンプルを分離検出用の電気泳動キャピラリー
に移行する方法である。図4に基づいて説明する。電気
泳動キャピラリーの一端6aを貫通孔2内に充填された
DNAシーケンスサンプル7に浸漬した状態で、膜5と
電気泳動キャピラリー6の他端6bとの間に電圧を印加
する。電圧の印加は、図4に示すように、膜5を電極9
を浸漬した電解液8と接触させ、電気泳動キャピラリー
6の他端6bを電極10を浸漬した電解液11と接触さ
せ、電極9を陰極とし、電極10を陽極とすることで行
うことができる。
充填物(分離系)がポリマー溶液及びアクリルアミドの
いずれの場合にも利用できる。上記電極9と電極10と
の間に1〜10kVの電圧を一〜数十秒間加印して電気
泳動的に行う。これによりDNAシーケンスサンプル7
内の検体を電気泳動キャピラリー6(6aの近傍)に移
行させることができる。尚、図4には、1つの貫通孔2
についてのみ図示されているが、プレート1の膜5の全
面を電解液8に接触させ、各電気泳動キャピラリー6の
他端6bを陽極側とすることで、複数の又は全ての貫通
孔2において同時に並行してDNAシーケンスサンプル
中の検体を各電気泳動キャピラリーに移行させることが
できる。
7の態様) 上記本発明のプレートの貫通孔内に充填されたDNAシ
ーケンスサンプルを分離検出用の電気泳動キャピラリー
に移行する方法である。図6に基づいて説明する。プレ
ート1の貫通孔2内にDNAシーケンスサンプル7を充
填した状態で、電気泳動キャピラリー6の一端6aを、
貫通孔2の開放口側から、前記貫通孔2内のDNAシー
ケンスサンプル7に浸漬し、電気泳動キャピラリー6の
他端6bから電気泳動キャピラリー6内の充填物(例え
ば、ポリマー溶液)6cを吸引することで行うことがで
きる。これにようDNAシーケンスサンプル7内の検体
を電気泳動キャピラリー6内に移行させることができ
る。尚、プレート1の貫通孔2のそれぞれに電気泳動キ
ャピラリー6を浸漬し、吸引することで、全ての貫通孔
2内のDNAシーケンスサンプル中の検体を同時に並行
して各電気泳動キャピラリーに移行させることができ
る。
様) この方法は、DNAシーケンスサンプル中の未反応の低
分子化合物を除去し、次いでDNAシーケンスサンプル
中の検体を分離検出用の電気泳動キャピラリーに移行す
る方法であり、上記DNAシーケンスサンプルの未反応
低分子化合物の除去方法と分離検出系への移行方法とを
逐次行う方法である。低分子化合物の除去には、前記本
発明の第5の態様の方法を用いる。即ち、図4に示すよ
うに、上記本発明のプレート1の貫通孔2内に充填され
たDNAシーケンスサンプル7に電気泳動キャピラリー
6の一端6aを浸漬した状態で、 膜5と電気泳動キャ
ピラリー6の他端6bとの間に電気泳動キャピラリー6
の他端6bが陰極となるように電圧を印加して、DNA
シーケンスサンプル7内の未反応の低分子化合物を膜5
を介して前記サンプル外に移行させる。次いで、サンプ
ルの移行には、前記本発明の第6の態様の方法を用い
る。即ち、膜5と電気泳動キャピラリー6の他端bとの
間に、電気泳動キャピラリー6の他端6bが陽極となる
ように電圧を印加して、DNAシーケンスサンプル7内
の検体を電気泳動キャピラリー6に移行させる。低分子
化合物の除去と検体の移行とは、電極9と10の陰陽を
切り換えることにより簡単に行うことができる。但し、
未反応の低分子化合物を膜5を介して移行させた電解液
8は、検体の移行の前に置換しておくことが、低分子化
合物がサンプル7に還流することを防止するとうい観点
から好ましい。
様) この方法は、DNAシーケンスサンプル中の未反応の低
分子化合物を除去し、次いでDNAシーケンスサンプル
中の検体を分離検出用の電気泳動キャピラリーに移行す
る方法であり、上記DNAシーケンスサンプルの未反応
低分子化合物の除去方法と分離検出系への移行方法とを
逐次行う方法である。低分子化合物の除去には、前記本
発明の第4の態様の方法を用いる。即ち、図3に示すよ
うに、本発明のプレート1の貫通孔2内にDNAシーケ
ンスサンプル7を充填した状態で、貫通孔の開放口2a
と膜5の外側との間に、膜5の外側が負圧となるように
圧力差を加える。具体的には、例えば、プレート1の膜
5側を減圧容器20にセットして減圧することで、膜5
の外側が負圧となるように圧力差を加えることができ
る。DNAシーケンスサンプル内の未反応の低分子化合
物は、膜5を介して、他の低分子化合物、例えば、水等
と共にサンプル外に移行させることができる。
の第6の態様の方法を用いる。即ち、図4に示すよう
に、本発明のプレート1の貫通孔2内の未反応の低分子
化合物を除去したDNAシーケンスサンプル7に電気泳
動キャピラリー6の一端6aを浸漬した状態で、膜5と
電気泳動キャピラリー6の他端bとの間に電圧を印加し
て、DNAシーケンスサンプル7内の検体を電気泳動キ
ャピラリー6に移行させる。
ケンスサンプルは、例えば、プレート上の多数の空間
(穴、孔)内で多数の化学または酵素反応(96反応/
プレート/試技 以上)により生じたものであれること
ができ、反応の種類や反応数等に制限はない。例えば、
DNAシーケンスサンプルは、前記本発明のプレートの
貫通孔内で行われたDNAシーケンス反応の生成物や、
または、別のマイクロタイタープレートのウエル中で行
われたDNAシーケンス反応の生成物であることもでき
る。さらに、DNAシーケンス反応としては、例えば、
ジデオキシヌクレオチド(dideoxynucleotide)を用いた
サンガー反応や、PCR(polymerase chain reaction)
を利用して行うDNAサイクルシーケンスを挙げること
ができる。
ートの貫通孔内に構成された空間で行う場合には、以下
の方法を用いることが好ましい。まず、各孔内に別々の
種類のものを入れる必要性のあるもの(例えば鋳型DN
A等)以外の反応酵素(耐熱性ポリメレース等)や反応
バッファーなどの試薬酵素の注入は、本発明の第1の態
様の容器前駆体を用いて、本発明の第2の態様として説
明したように、容器前駆体プレートの各貫通孔内にまと
めて入れておく。即ち、本発明の第1の態様の容器前駆
体を試薬酵素液の中に漬け、それを引き上げるだけで各
貫通孔の中に一定量の試薬酵素液が保持できる。尚、同
一のプレート上に2つ以上の大きさの異なる貫通孔を設
けることで、試薬酵素液の保持量が異なる反応場を形成
することもできる。次いで、容器前駆体プレートの一方
の面に膜を張り付けて、貫通孔内に試薬酵素液が保持し
た反応液内蔵プレートを形成することができる。このプ
レートを所望のDNAシーケンス反応等の反応に提供す
ることができる。上記容器内で行う反応としては、例え
ば、37℃で行うDNAポリメレースによるシーケンス
反応が膜による反応液の保持性を考慮すると有利であ
る。本発明のこの手法は、最初に試薬酵素液を入れる分
注過程を極めて省力化できる。但し、このような方法を
用いず、一本ずつ試薬酵素液を分注しても構わない。
ーに移行された検体は常法により分離検出される。その
ような常法としては、DNAキャピラリー電気泳動法に
よるDNA塩基配列決定法を挙げることができる。DN
Aキャピラリー電気泳動法に用いるDNA分離系として
は、例えば、図7に示すようなキャピラリーをグリッド
状に配置し三次元的に規則正しく(例えば柱状に)並ん
だキャピラリーレーン31を電気泳動のゲルとして用い
ることができる。グリッド状納められたキャピラリーの
配置を本発明のマルチ貫通孔プレート32の各貫通孔3
3の配置と一致させておくことで、キャピラリーをマル
チ貫通孔プレート32の貫通孔33内にきっちりと挿入
することできる。
レートの底面に装着されている膜を陰極電気泳動槽34
のバッファーの上面に接触させ、陰極電気泳動槽34と
キャピラリー31のもう一端を漬けている陽極電気泳動
槽35の間に電源36を用いて電圧をかける。このよう
にして、電気泳動的にマルチ貫通孔プレート上の全ての
反応検体を一度にキャピラリー内に注入する。次いで、
電気泳動により分離し、かつ分離したフラグメントを検
出器37により検出する。検出器37は、フラグメント
に乗せられたマーカーの種類により選択する。例えば、
蛍光マーカーの場合には蛍光検出器を用い、RIマーカ
ーの場合にはイメージングアナライザー等を用いること
ができる。
以下の実施例においては、図8に示す装置を用いてDN
Aシークエンスサンプルの未反応低分子化合物の除去を
行い、次いで図9に示すキャピラリー電気泳動装置を用
いてDNAシークエンスサンプルの電気泳動キャピラリ
ーへの移行を行った。さらに、図7に示す電気泳動法に
よる分離検出装置により分離検出を行った。
(O.D.220μm, I.D.100μm,SGE:Australia)を約30cmに
切り、官能基を有する試薬(3-メタクリロキシプロピル
トリメトキシシラン等)溶液を通し、数時間放置した。
その後、メタノール及び水でキャピラリー内を洗浄し
た。 (2)アクリルアミドの充填 アクリルアミド溶液[TBE緩衝液(100mM Tris borat
e, pH8.0, 0.2mM EDTA) 、7M尿素、6%アクリルアミ
ド、0〜5%ビスアクリルアミド]を調製し、この後、
減圧機等により脱気を行い、過硫酸アンンモニウム(終
濃度0.05%)、テトラメチルエチレンジアミン(終濃度
0.01%)を加え、注射器等を用い上記石英キャピラリー
中にアクリルアミド溶液を充填した。ゲル過が終了する
まで数時間4℃に放置した。
型DNA(M13phage)0.5pmol 、Sequenase Ver.2.0 緩
衝液(200μM Tris.Cl. pH7.5, 100mM MgCl2, 250mM NaC
l)2μlを加え、滅菌蒸留水にて10μlに合わせ、混
合した後、65℃、10分間加温し、その後室温に戻し
鋳型とプライマーをアニールさせた。次にアニールした
鋳型DNA−プライマー溶液10μlに 0.1Mジチオス
レイトール1μl、dNTPs mix(1μM dATP, dGTP, dTT
P)2μl、[α−32P]dCTP(3000Ci/mmol, 10mCi/ml,
Amershame) 0.5μl 、Sequenase Ver.2.0 (Amersham)2
Uを加えた。次に停止混合液80μM dATP,dGTP,dCTP,dT
TP, 8μM ddTTP, 50mM NaCl) 3.5μl に上記混合液を
2.5μl 加えて混合し37℃で10分間反応させた。10
μlのホルムアミドダイ[95%ホルムアミド、10mM
EDTA、0.05%ブロムフェノールブルー(BPB)、
0.05%キシレンシアノール(XC)]と混合し、80℃
で5分間加熱した。
電気泳動 内径3.5mmの貫通孔を384(16×24)有する
プレートを用意し、その下面(緩衝液に接触させる面)
に超音波溶着等の接着方法を用いポリエーテルスルフォ
ン限外濾過膜を溶着した。このプレートの各穴に上記の
方法で調製したサンプル液を限外濾過膜に接する形で注
入した。サンプルを入れた膜装着プレートを図8に示す
ように吸引器と接続して膜側から、10分間真空で引く
ことにより、減圧で未反応の低分子化合物を除去した。
次に、前記で作製したアクリルアミドゲルを充填したキ
ャピラリーの一方をTBE緩衝液に浸し、もう一方の端
を図9に示すように、サンプル液に浸した。さにこのプ
レート下面の限外濾過膜をTBE緩衝液に浸し、図7に
示すように3kVの電圧を陰極電気泳動槽34と陽極電
気泳動槽35との間に約30秒間加えた。その後、サン
プル液からTBE緩衝液へキャピラリーの一方の端を移
し、3000V、1時間の条件で泳動を行った。
し、BAS2000イメージングアナライザー(FUJI)
により泳動パターンを解析した。その結果を図10に示
す。図10に示すように、シークエンスラダーが前記の
プロトコールにより生成した。
短時間にしかも簡単に充填できる手段を提供することが
できる。また、本発明によれば、未反応の標識物質等を
含む複数のDNAシーケンスサンプルから短時間にしか
も簡単に、標識物質等を除去する方法を提供することが
できる。さらに本発明によれば、多数のDNAシーケン
スサンプルを短時間にしかも簡単に電気泳動キャピラリ
ーに移行できる手段を提供することができる。加えて本
発明によれば、未反応の標識物質等を含む複数のDNA
シーケンスサンプルから短時間にしかも簡単に、標識物
質等を除去し、かつ多数のDNAシーケンスサンプルを
短時間に、簡単に電気泳動キャピラリーに移行できる方
法を提供することができる。
いた本発明の反応用液を内蔵する容器の製造方法の断面
概略説明図。
出系移行用プレートの断面概略説明図。
力差法)の断面概略説明図。
気的方法)及び分離検出系への移行方法(電気的方法)
の断面概略説明図。
気的方法)の断面概略説図。
の断面概略説明図。
図。
の概略説明図。
方法)の概略説明図。
泳動パターンのシークエンスラダー。
Claims (16)
- 【請求項1】 厚さ方向に貫通する複数の貫通孔を有す
る基板からなる反応容器前駆体を反応液に浸漬して貫通
孔内に前記反応液を充填し、次いで前記貫通孔の一方の
開放口を膜で封鎖して前記貫通孔を反応容器とすること
を特徴とする反応液を内蔵する容器の製造方法。 - 【請求項2】 前記貫通孔の内径が0.01〜10mm
の範囲である請求項1に記載の製造方法。 - 【請求項3】 前記反応液が酵素を含む緩衝液である
請求項1又は2に記載の製造方法。 - 【請求項4】 DNAシーケンスサンプル中の未反応
の低分子化合物を除去する方法であって、厚さ方向に貫
通する複数の貫通孔を有する基板からなるプレート前駆
体をDNAシーケンスサンプルに浸漬して貫通孔内に前
記DNAシーケンスサンプルを充填し、次いで前記貫通
孔の一方の開放口を膜で封鎖し、この状態で、前記貫通
孔の開放口と前記膜の外側との間に、前記膜の外側が負
圧となるように圧力差を加えて、前記DNAシーケンス
サンプル内の未反応の低分子化合物を前記膜を介して前
記サンプル外に移行させることを特徴とする方法。 - 【請求項5】 DNAシーケンスサンプル中の未反応の
低分子化合物を除去する方法であって、厚さ方向に貫通
する複数の貫通孔を有する基板とこの貫通孔の一方の開
放口を封鎖するように設けられた膜とからなるDNAシ
ーケンスサンプルの分離検出系移行用プレートの貫通孔
内に充填されたDNAシーケンスサンプルと、前記DN
Aを充填した貫通孔を封鎖する膜の外側との間に電圧を
印加して、前記DNAシーケンスサンプル内の未反応の
低分子化合物を膜を介して前記サンプル外に移行させる
ことを特徴とする方法。 - 【請求項6】 前記貫通孔内に充填されたDNAシーケ
ンスサンプルに電気泳動キャピラリーの一端を浸漬し、
この電気泳動キャピラリーの他端と接触する電解液に浸
漬した電極と、前記DNAシーケンスサンプルが充填さ
れた貫通孔を封鎖する膜が接触する電解液に浸漬した電
極との間に電圧を印加する請求項5に記載の方法。 - 【請求項7】 前記貫通孔内に充填されたDNAシーケ
ンスサンプルに電極を浸漬し、この電極と、前記DNA
シーケンスサンプルを充填した貫通孔を封鎖する膜が接
触する電解液に浸漬した電極との間に電圧を印加する請
求項5に記載の方法。 - 【請求項8】 前記未反応の低分子化合物が未反応蛍光
標識物質である請求項4〜7のいずれか1項に記載の方
法。 - 【請求項9】 DNAシーケンスサンプルが、前記貫通
孔内で行われたDNAシーケンス反応の生成物である請
求項4〜8のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項10】 DNAシーケンスサンプルが、マイク
ロタイタープレートにおいて行われたDNAシーケンス
反応の生成物である請求項4〜8のいずれか1項に記載
の方法。 - 【請求項11】 厚さ方向に貫通する複数の貫通孔を有
する基板からなるプレート前駆体をDNAシーケンスサ
ンプル中に浸漬して貫通孔内に前記DNAシーケンスサ
ンプルを充填し、次いで前記貫通孔の一方の開放口を膜
で封鎖し、前記貫通孔内に充填されたDNAシーケンス
サンプルを分離検出用の電気泳動キャピラリーに移行す
る方法であって、前記電気泳動キャピラリーの一端を前
記貫通孔内に充填されたDNAシーケンスサンプルに浸
漬した状態で、前記DNAシーケンスサンプルを充填し
た貫通孔を封鎖する膜と前記電気泳動キャピラリーの他
端との間に電圧を印加して、前記DNAシーケンスサン
プル内の検体を前記電気泳動キャピラリーに移行させる
ことを特徴とするDNAシーケンスサンプルの分離検出
系への移行方法。 - 【請求項12】 DNAシーケンスサンプルが、前記貫
通孔内で行われたDNAシーケンス反応の生成物である
請求項11に記載の方法。 - 【請求項13】 DNAシーケンスサンプルが、マイク
ロタイタープレートにおいて行われたDNAシーケンス
反応の生成物である請求項11に記載の方法。 - 【請求項14】 厚さ方向に貫通する複数の貫通孔を有
する基板からなるプレート前駆体をDNAシーケンスサ
ンプル中に浸漬して貫通孔内に前記DNAシーケンスサ
ンプルを充填し、次いで前記貫通孔の一方の開放口を膜
で封鎖し、この状態で、電気泳動キャピラリーの一端を
貫通孔の開放口側から前記貫通孔内のDNAシーケンス
サンプルに浸漬し、電気泳動キャピラリーの他端から電
気泳動キャピラリー内に充填物を吸引することにより前
記DNAシーケンスサンプル内の検体を前記電気泳動キ
ャピラリー内に移行させることを特徴とするDNAシー
ケンスサンプルの分離検出系への移行方法。 - 【請求項15】 DNAシーケンスサンプル中の未反応
の低分子化合物を除去し、次いでDNAシーケンスサン
プル中の検体を分離検出用の電気泳動キャピラリーに移
行する方法であって、厚さ方向に貫通する複数の貫通孔
を有する基板とこの貫通孔の一方の開放口を封鎖するよ
うに設けられた膜とからなるDNAシーケンスサンプル
の分離検出系移行用プレートの貫通孔内に充填されたD
NAシーケンスサンプルに電気泳動キャピラリーの一端
を浸漬した状態で、前記DNAシーケンスサンプルが充
填された貫通孔を封鎖する膜と前記電気泳動キャピラリ
ーの他端との間に電圧を印加して、前記DNAシーケン
スサンプル内の未反応の低分子化合物を膜を介して前記
サンプル外に移行させ、次いで、前記膜と前記電気泳動
キャピラリーの他端との間に電圧を印加して、前記DN
Aシーケンスサンプル内の検体を前記電気泳動キャピラ
リーに移行させる、ことを特徴とするDNAシーケンス
サンプルの精製および分離検出系への移行方法。 - 【請求項16】 DNAシーケンスサンプル中の未反応
の低分子化合物を除去し、次いでDNAシーケンスサン
プル中の検体を分離検出用の電気泳動キャピラリーに移
行する方法であって、厚さ方向に貫通する複数の貫通孔
を有する基板からなるプレート前駆体をDNAシーケン
スサンプルに浸漬して貫通孔内に前記DNAシーケンス
サンプルを充填し、次いで前記貫通孔の一方の開放口を
膜で封鎖し、この状態で、前記貫通孔の開放口と前記膜
の外側との間に、膜の外側が負圧となるように圧力差を
加えて、前記DNAシーケンスサンプル内の未反応の低
分子化合物を前記膜を介して前記サンプル外に移行さ
せ、次いで前記DNAシーケンスサンプルに電気泳動キ
ャピラリーの一端を浸漬した状態で、前記DNAシーケ
ンスサンプルを充填した貫通孔を封鎖する膜と前記電気
泳動キャピラリーの他端との間に電圧を印加して、前記
DNAシーケンスサンプル内の検体を前記電気泳動キャ
ピラリーに移行させることを特徴とするDNAシーケン
スサンプルの精製および分離検出系への移行方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP32824696A JP3337386B2 (ja) | 1995-12-08 | 1996-12-09 | Dnaシーケンスサンプルの精製及び分離検出系への移行方法並びにそれに用いるプレート |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP7-320732 | 1995-12-08 | ||
JP32073295 | 1995-12-08 | ||
JP32824696A JP3337386B2 (ja) | 1995-12-08 | 1996-12-09 | Dnaシーケンスサンプルの精製及び分離検出系への移行方法並びにそれに用いるプレート |
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Publication Number | Publication Date |
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JPH09215490A JPH09215490A (ja) | 1997-08-19 |
JP3337386B2 true JP3337386B2 (ja) | 2002-10-21 |
Family
ID=26570192
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP32824696A Expired - Lifetime JP3337386B2 (ja) | 1995-12-08 | 1996-12-09 | Dnaシーケンスサンプルの精製及び分離検出系への移行方法並びにそれに用いるプレート |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3337386B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5601997A (en) | 1995-02-03 | 1997-02-11 | Tchao; Ruy | Chemotaxis assay procedure |
AU772213C (en) * | 1999-02-26 | 2004-12-09 | Exact Sciences Corporation | Biochemical purification devices with immobilized capture probes and their uses |
JP4566509B2 (ja) * | 2001-12-28 | 2010-10-20 | 株式会社エンプラス | プラスチックプレート及びプラスチックプレート組立体 |
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1996
- 1996-12-09 JP JP32824696A patent/JP3337386B2/ja not_active Expired - Lifetime
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