JP3337386B2 - Ｄｎａシーケンスサンプルの精製及び分離検出系への移行方法並びにそれに用いるプレート - Google Patents
Ｄｎａシーケンスサンプルの精製及び分離検出系への移行方法並びにそれに用いるプレートInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はマルチ反応プレート
のウエル中で生成させた複数の反応産物を、電気泳動に
代表される多数のキャピラリーを用いた解析機に、一度
に（同時に）供することができる、ＤＮＡシーケンスサ
ンプルの分離検出系移行用プレートに関する。さらに、
本発明は、このプレートを用いたＤＮＡシーケンスサン
プルの移行方法、このプレートを用いたＤＮＡシーケン
スサンプルの精製方法、およびこのプレートを用いたＤ
ＮＡシーケンスサンプルの精製・移行方法に関する。
のウエル中で生成させた複数の反応産物を、電気泳動に
代表される多数のキャピラリーを用いた解析機に、一度
に（同時に）供することができる、ＤＮＡシーケンスサ
ンプルの分離検出系移行用プレートに関する。さらに、
本発明は、このプレートを用いたＤＮＡシーケンスサン
プルの移行方法、このプレートを用いたＤＮＡシーケン
スサンプルの精製方法、およびこのプレートを用いたＤ
ＮＡシーケンスサンプルの精製・移行方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】最近、レーザー蛍光を利用したＤＮＡの
検出手法が発達し、それを用いたレーザー蛍光ＤＮＡシ
ーケンサーが大変有用な機器として汎用されている。ま
たこのような技術の発達はゲノム研究やＤＮＡ診断にお
ける大量の検体処理（約１００レーン／２運転／日／台
以下）を可能にした。レーザーシーケンサーの代表例
として、スラブ型ゲルとキャピラリー型ゲルがある。
検出手法が発達し、それを用いたレーザー蛍光ＤＮＡシ
ーケンサーが大変有用な機器として汎用されている。ま
たこのような技術の発達はゲノム研究やＤＮＡ診断にお
ける大量の検体処理（約１００レーン／２運転／日／台
以下）を可能にした。レーザーシーケンサーの代表例
として、スラブ型ゲルとキャピラリー型ゲルがある。
【０００３】さらに、現状を越えた、より大量の検体処
理のために、より多くの電気泳動のレーン（例えば、２
００〜１０００レーン／運転）を有する機器も考案され
つつある。そのような機器の例として、マルチキャピラ
リー型シーケンサーがある。
理のために、より多くの電気泳動のレーン（例えば、２
００〜１０００レーン／運転）を有する機器も考案され
つつある。そのような機器の例として、マルチキャピラ
リー型シーケンサーがある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ところが、レーンの数
が多くなればなる程、レーンに検体を移行する作業に時
間が掛かり、大きな負担となる。即ち、多数の検体を各
キャピラリーゲルにのせるのに、各検体について、キャ
ピラリーの末端と細電極線とを接触させて検体をキャピ
ラリー内に注入する操作を行わなければならない。そこ
で、多数の検体を短時間にしかも簡単にキャピラリーに
移行できる技術の開発が急務となっている。さらに、マ
イクロタイタープレートの各ウエルに反応液を充填する
のも、ウエルの数が増える程その操作に時間を要するこ
とになる。そこで、短時間に各ウエルに反応液を充填す
る手段の提供も必要となる。
が多くなればなる程、レーンに検体を移行する作業に時
間が掛かり、大きな負担となる。即ち、多数の検体を各
キャピラリーゲルにのせるのに、各検体について、キャ
ピラリーの末端と細電極線とを接触させて検体をキャピ
ラリー内に注入する操作を行わなければならない。そこ
で、多数の検体を短時間にしかも簡単にキャピラリーに
移行できる技術の開発が急務となっている。さらに、マ
イクロタイタープレートの各ウエルに反応液を充填する
のも、ウエルの数が増える程その操作に時間を要するこ
とになる。そこで、短時間に各ウエルに反応液を充填す
る手段の提供も必要となる。
【０００５】また、ＤＮＡシーケンス反応により得られ
る生成物中には、蛍光物質等で標識された種々の長さの
フラグメントと未反応の標識物質とが共存する。共存す
る未反応の標識物質は、その大部分が反応に使用される
ことなく、反応液中に遊離しているため、これをそのま
ま電気泳動に供すると、高濃度の蛍光ラベルも同時に泳
動され、シークレンスのバンドよりも遙に強いシグナル
を出し、シークエンスの解読が不可能になることから、
分離前に除去される必要がある。ところが、数百の生成
物のそれぞれについて未反応の標識物質を除去するに
は、多くの人手と時間とを要する。その結果、ＤＮＡシ
ーケンス方法自体の効率が向上しても、その前段階にお
いて律速が生じてしまう。
る生成物中には、蛍光物質等で標識された種々の長さの
フラグメントと未反応の標識物質とが共存する。共存す
る未反応の標識物質は、その大部分が反応に使用される
ことなく、反応液中に遊離しているため、これをそのま
ま電気泳動に供すると、高濃度の蛍光ラベルも同時に泳
動され、シークレンスのバンドよりも遙に強いシグナル
を出し、シークエンスの解読が不可能になることから、
分離前に除去される必要がある。ところが、数百の生成
物のそれぞれについて未反応の標識物質を除去するに
は、多くの人手と時間とを要する。その結果、ＤＮＡシ
ーケンス方法自体の効率が向上しても、その前段階にお
いて律速が生じてしまう。
【０００６】そこで本発明の第１の目的は、反応液を多
数ウエルに短時間にしかも簡単に充填できる手段を提供
することにある。本発明の第２の目的は、未反応の標識
物質等を含む複数のＤＮＡシーケンスサンプルから短時
間にしかも簡単に、標識物質等を除去する方法を提供す
ることにある。本発明の第３の目的は、多数のＤＮＡシ
ーケンスサンプルを短時間にしかも簡単に電気泳動キャ
ピラリーに移行できる手段を提供することにある。ま
た、本発明の第４の目的は、未反応の標識物質等を含む
複数のＤＮＡシーケンスサンプルから短時間にしかも簡
単に、標識物質等を除去し、かつ多数のＤＮＡシーケン
スサンプルを短時間に、簡単に電気泳動キャピラリーに
移行できる方法を提供することにある。
数ウエルに短時間にしかも簡単に充填できる手段を提供
することにある。本発明の第２の目的は、未反応の標識
物質等を含む複数のＤＮＡシーケンスサンプルから短時
間にしかも簡単に、標識物質等を除去する方法を提供す
ることにある。本発明の第３の目的は、多数のＤＮＡシ
ーケンスサンプルを短時間にしかも簡単に電気泳動キャ
ピラリーに移行できる手段を提供することにある。ま
た、本発明の第４の目的は、未反応の標識物質等を含む
複数のＤＮＡシーケンスサンプルから短時間にしかも簡
単に、標識物質等を除去し、かつ多数のＤＮＡシーケン
スサンプルを短時間に、簡単に電気泳動キャピラリーに
移行できる方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明の第１の態様は、
厚さ方向に貫通する複数の貫通孔を有する基板からなる
反応用容器前駆体に関する。さらに、本発明の第２の態
様は、前記本発明の容器前駆体を反応液に浸漬して貫通
孔内に前記反応液を充填し、次いで前記貫通孔の一方の
開放口を膜で封鎖して前記貫通孔を反応容器とすること
を特徴とする反応液を内蔵する容器の製造方法に関す
る。
厚さ方向に貫通する複数の貫通孔を有する基板からなる
反応用容器前駆体に関する。さらに、本発明の第２の態
様は、前記本発明の容器前駆体を反応液に浸漬して貫通
孔内に前記反応液を充填し、次いで前記貫通孔の一方の
開放口を膜で封鎖して前記貫通孔を反応容器とすること
を特徴とする反応液を内蔵する容器の製造方法に関す
る。
【０００８】本発明の第３の態様は、厚さ方向に貫通す
る複数の貫通孔を有する基板とこの貫通孔の一方の開放
口を封鎖するように設けられた膜とからなることを特徴
とするＤＮＡシーケンスサンプルの分離検出系移行用プ
レートに関する。
る複数の貫通孔を有する基板とこの貫通孔の一方の開放
口を封鎖するように設けられた膜とからなることを特徴
とするＤＮＡシーケンスサンプルの分離検出系移行用プ
レートに関する。
【０００９】本発明の第４の態様は、ＤＮＡシーケンス
サンプル中の未反応の低分子化合物を除去する方法であ
って、前記本発明のプレートの貫通孔内にＤＮＡシーケ
ンスサンプルを充填した状態で、貫通孔の開放口と膜の
外側との間に、膜の外側が負圧となるように圧力差を加
えて、前記ＤＮＡシーケンスサンプル内の未反応の低分
子化合物を前記膜を介して前記サンプル外に移行させる
ことを特徴とする方法に関する。
サンプル中の未反応の低分子化合物を除去する方法であ
って、前記本発明のプレートの貫通孔内にＤＮＡシーケ
ンスサンプルを充填した状態で、貫通孔の開放口と膜の
外側との間に、膜の外側が負圧となるように圧力差を加
えて、前記ＤＮＡシーケンスサンプル内の未反応の低分
子化合物を前記膜を介して前記サンプル外に移行させる
ことを特徴とする方法に関する。
【００１０】本発明の第５の態様は、ＤＮＡシーケンス
サンプル中の未反応の低分子化合物を除去する方法であ
って、前記本発明のプレートの貫通孔内に充填されたＤ
ＮＡシーケンスサンプルと、前記ＤＮＡシーケンスサン
プルを充填した貫通孔を封鎖する膜の外側との間に電圧
を印加して、前記ＤＮＡシーケンスサンプル内の未反応
の低分子化合物を膜を介して前記サンプル外に移行させ
ることを特徴とする方法に関する。
サンプル中の未反応の低分子化合物を除去する方法であ
って、前記本発明のプレートの貫通孔内に充填されたＤ
ＮＡシーケンスサンプルと、前記ＤＮＡシーケンスサン
プルを充填した貫通孔を封鎖する膜の外側との間に電圧
を印加して、前記ＤＮＡシーケンスサンプル内の未反応
の低分子化合物を膜を介して前記サンプル外に移行させ
ることを特徴とする方法に関する。
【００１１】本発明の第６の態様は、上記本発明のプレ
ートの貫通孔内に充填されたＤＮＡシーケンスサンプル
を分離検出用の電気泳動キャピラリーに移行する方法で
あって、前記電気泳動キャピラリーの一端を前記貫通孔
内に充填されたＤＮＡシーケンスサンプルに浸漬した状
態で、前記ＤＮＡシーケンスサンプルを充填した貫通孔
を封鎖する膜と前記電気泳動キャピラリーの他端との間
に電圧を印加して、前記ＤＮＡシーケンスサンプル内の
検体を前記電気泳動キャピラリーに移行させることを特
徴とするＤＮＡシーケンスサンプルの分離検出系への移
行方法に関する。
ートの貫通孔内に充填されたＤＮＡシーケンスサンプル
を分離検出用の電気泳動キャピラリーに移行する方法で
あって、前記電気泳動キャピラリーの一端を前記貫通孔
内に充填されたＤＮＡシーケンスサンプルに浸漬した状
態で、前記ＤＮＡシーケンスサンプルを充填した貫通孔
を封鎖する膜と前記電気泳動キャピラリーの他端との間
に電圧を印加して、前記ＤＮＡシーケンスサンプル内の
検体を前記電気泳動キャピラリーに移行させることを特
徴とするＤＮＡシーケンスサンプルの分離検出系への移
行方法に関する。
【００１２】本発明の第７の態様は、前記本発明のプレ
ートの貫通孔内にＤＮＡシーケンスサンプルを充填した
状態で、電気泳動キャピラリーの一端を、貫通孔の開放
口側から、前記貫通孔内のＤＮＡシーケンスサンプルに
浸漬し、電気泳動キャピラリーの他端から電気泳動キャ
ピラリー内に充填物を吸引することにより前記ＤＮＡシ
ーケンスサンプル内の検体を前記電気泳動キャピラリー
内に移行させることを特徴とするＤＮＡシーケンスサン
プルの分離検出系への移行方法に関する。
ートの貫通孔内にＤＮＡシーケンスサンプルを充填した
状態で、電気泳動キャピラリーの一端を、貫通孔の開放
口側から、前記貫通孔内のＤＮＡシーケンスサンプルに
浸漬し、電気泳動キャピラリーの他端から電気泳動キャ
ピラリー内に充填物を吸引することにより前記ＤＮＡシ
ーケンスサンプル内の検体を前記電気泳動キャピラリー
内に移行させることを特徴とするＤＮＡシーケンスサン
プルの分離検出系への移行方法に関する。
【００１３】本発明の第８の態様は、ＤＮＡシーケンス
サンプル中の未反応の低分子化合物を除去し、次いでＤ
ＮＡシーケンスサンプル中の検体を分離検出用の電気泳
動キャピラリーに移行する方法であって、前記本発明の
プレートの貫通孔内に充填されたＤＮＡシーケンスサン
プルに電気泳動キャピラリーの一端を浸漬した状態で、
前記ＤＮＡシーケンスサンプルを充填した貫通孔を封鎖
する膜と前記電気泳動キャピラリーの他端との間に電圧
を印加して、前記ＤＮＡシーケンスサンプル内の未反応
の低分子化合物を膜を介して前記サンプル外に移行さ
せ、次いで、前記膜と前記電気泳動キャピラリーの他端
との間に電圧を印加して、前記ＤＮＡシーケンスサンプ
ル内の検体を前記電気泳動キャピラリーに移行させる、
ことを特徴とするＤＮＡシーケンスサンプルの精製およ
び分離検出系への移行方法に関する。
サンプル中の未反応の低分子化合物を除去し、次いでＤ
ＮＡシーケンスサンプル中の検体を分離検出用の電気泳
動キャピラリーに移行する方法であって、前記本発明の
プレートの貫通孔内に充填されたＤＮＡシーケンスサン
プルに電気泳動キャピラリーの一端を浸漬した状態で、
前記ＤＮＡシーケンスサンプルを充填した貫通孔を封鎖
する膜と前記電気泳動キャピラリーの他端との間に電圧
を印加して、前記ＤＮＡシーケンスサンプル内の未反応
の低分子化合物を膜を介して前記サンプル外に移行さ
せ、次いで、前記膜と前記電気泳動キャピラリーの他端
との間に電圧を印加して、前記ＤＮＡシーケンスサンプ
ル内の検体を前記電気泳動キャピラリーに移行させる、
ことを特徴とするＤＮＡシーケンスサンプルの精製およ
び分離検出系への移行方法に関する。
【００１４】本発明の第９の態様は、ＤＮＡシーケンス
サンプル中の未反応の低分子化合物を除去し、次いでＤ
ＮＡシーケンスサンプル中の検体を分離検出用の電気泳
動キャピラリーに移行する方法であって、前記本発明の
プレートの貫通孔内にＤＮＡシーケンスサンプルを充填
した状態で、貫通孔の開放口と膜の外側との間に、膜の
外側が負圧となるように圧力差を加えて、前記ＤＮＡシ
ーケンスサンプル内の未反応の低分子化合物を前記膜を
介して前記サンプル外に移行させ、次いで前記ＤＮＡシ
ーケンスサンプルに電気泳動キャピラリーの一端を浸漬
した状態で、前記ＤＮＡシーケンスサンプルを充填した
貫通孔を封鎖する膜と前記電気泳動キャピラリーの他端
との間に電圧を印加して、前記ＤＮＡシーケンスサンプ
ル内の検体を前記電気泳動キャピラリーに移行させる、
ことを特徴とするＤＮＡシーケンスサンプルの精製およ
び分離検出系への移行方法に関する。
サンプル中の未反応の低分子化合物を除去し、次いでＤ
ＮＡシーケンスサンプル中の検体を分離検出用の電気泳
動キャピラリーに移行する方法であって、前記本発明の
プレートの貫通孔内にＤＮＡシーケンスサンプルを充填
した状態で、貫通孔の開放口と膜の外側との間に、膜の
外側が負圧となるように圧力差を加えて、前記ＤＮＡシ
ーケンスサンプル内の未反応の低分子化合物を前記膜を
介して前記サンプル外に移行させ、次いで前記ＤＮＡシ
ーケンスサンプルに電気泳動キャピラリーの一端を浸漬
した状態で、前記ＤＮＡシーケンスサンプルを充填した
貫通孔を封鎖する膜と前記電気泳動キャピラリーの他端
との間に電圧を印加して、前記ＤＮＡシーケンスサンプ
ル内の検体を前記電気泳動キャピラリーに移行させる、
ことを特徴とするＤＮＡシーケンスサンプルの精製およ
び分離検出系への移行方法に関する。
【００１５】容器前駆体及びその製造方法（第１及び第
２の態様） 本発明の容器前駆体は、厚さ方向に貫通する複数の貫通
孔を有する基板からなるものである。さらにこの容器前
駆体は、反応用液を内蔵する容器の製造に用いることが
できる。図１に基づいて説明する。容器前駆体２０は、
厚さ方向に貫通する複数の貫通孔２１を有する基板２２
からなる。基板２２は、例えば、合成樹脂やガラス等か
ら形成することができ、その大きさや厚さは、貫通孔２
１の寸法（内径と深さ）及び数を考慮して適宜決定でき
る。貫通孔２１の寸法（内径と深さ）及び数は、用途に
応じて適宜決定でき、貫通孔２１内径は、例えば、０．
０５〜１０ｍｍ、好ましくは０．５〜５ｍｍ、深さは、
例えば、０．２〜２００ｍｍとすることができる。ま
た、貫通孔２１の数は、多ければそれだて多くのサンプ
ルを一度に処理できるが、分離検出機器の電気泳動キャ
ピラリーの数や分離検出機器の性能等を考慮して適宜決
定する。
２の態様） 本発明の容器前駆体は、厚さ方向に貫通する複数の貫通
孔を有する基板からなるものである。さらにこの容器前
駆体は、反応用液を内蔵する容器の製造に用いることが
できる。図１に基づいて説明する。容器前駆体２０は、
厚さ方向に貫通する複数の貫通孔２１を有する基板２２
からなる。基板２２は、例えば、合成樹脂やガラス等か
ら形成することができ、その大きさや厚さは、貫通孔２
１の寸法（内径と深さ）及び数を考慮して適宜決定でき
る。貫通孔２１の寸法（内径と深さ）及び数は、用途に
応じて適宜決定でき、貫通孔２１内径は、例えば、０．
０５〜１０ｍｍ、好ましくは０．５〜５ｍｍ、深さは、
例えば、０．２〜２００ｍｍとすることができる。ま
た、貫通孔２１の数は、多ければそれだて多くのサンプ
ルを一度に処理できるが、分離検出機器の電気泳動キャ
ピラリーの数や分離検出機器の性能等を考慮して適宜決
定する。
【００１６】上記容器前駆体２０を反応液２５に浸漬し
て貫通孔２１内に前記反応液２５ａを充填し、次いで前
記貫通孔２１の一方の開放口を膜２３で封鎖して前記貫
通孔を反応容器２４とすることで、反応液を内蔵する容
器を製造することができる。上記反応液には特に制限は
なく、用途に応じて適宜決定できる。例えば、各種の酵
素を含む緩衝液であることができる。
て貫通孔２１内に前記反応液２５ａを充填し、次いで前
記貫通孔２１の一方の開放口を膜２３で封鎖して前記貫
通孔を反応容器２４とすることで、反応液を内蔵する容
器を製造することができる。上記反応液には特に制限は
なく、用途に応じて適宜決定できる。例えば、各種の酵
素を含む緩衝液であることができる。
【００１７】分離検出系移行用プレート（第３の態様） 本発明の分離検出系移行用プレートについて、図２に基
づいて説明する。分離検出系移行用プレート１は、厚さ
方向に貫通する複数の貫通孔２を有する基板３とこれら
貫通孔２の一方の開放口４を封鎖するように設けられた
膜５とからなる。基板３は、例えば、合成樹脂やガラス
等から形成することができ、その大きさや厚さは、貫通
孔２の寸法（内径と深さ）及び数を考慮して適宜決定で
きる。貫通孔２の寸法（内径と深さ）及び数は、用途に
応じて適宜決定でき、貫通孔２内径は、例えば、０．１
〜５ｍｍ、深さは、例えば、０．２〜２００ｍｍとする
ことができる。また、貫通孔２の数は、多ければそれだ
け多くのサンプルを一度に処理できるが、分離検出機器
の電気泳動キャピラリーの数や分離検出機器の性能等を
考慮して適宜決定する。
づいて説明する。分離検出系移行用プレート１は、厚さ
方向に貫通する複数の貫通孔２を有する基板３とこれら
貫通孔２の一方の開放口４を封鎖するように設けられた
膜５とからなる。基板３は、例えば、合成樹脂やガラス
等から形成することができ、その大きさや厚さは、貫通
孔２の寸法（内径と深さ）及び数を考慮して適宜決定で
きる。貫通孔２の寸法（内径と深さ）及び数は、用途に
応じて適宜決定でき、貫通孔２内径は、例えば、０．１
〜５ｍｍ、深さは、例えば、０．２〜２００ｍｍとする
ことができる。また、貫通孔２の数は、多ければそれだ
け多くのサンプルを一度に処理できるが、分離検出機器
の電気泳動キャピラリーの数や分離検出機器の性能等を
考慮して適宜決定する。
【００１８】膜５は、プレートの使用方法に応じて適宜
選択することができる。例えば、ＤＮＡシーケンスサン
プル中の検体を電気的に電気泳動キャピラリーに移行さ
せる場合には、膜５は、電解液と接して通電可能な材料
であれば良く、例えば、限外濾過膜のような分子篩の隔
膜として用いられている膜を用いることができる。ま
た、ＤＮＡシーケンスサンプル中の検体を圧力差を利用
して電気泳動キャピラリーに移行させる場合には、膜５
は液体透過性材料からなる膜であるば良く、例えば、セ
ロハン膜やポリエーテルスルホン膜等の膜を用いること
ができる。
選択することができる。例えば、ＤＮＡシーケンスサン
プル中の検体を電気的に電気泳動キャピラリーに移行さ
せる場合には、膜５は、電解液と接して通電可能な材料
であれば良く、例えば、限外濾過膜のような分子篩の隔
膜として用いられている膜を用いることができる。ま
た、ＤＮＡシーケンスサンプル中の検体を圧力差を利用
して電気泳動キャピラリーに移行させる場合には、膜５
は液体透過性材料からなる膜であるば良く、例えば、セ
ロハン膜やポリエーテルスルホン膜等の膜を用いること
ができる。
【００１９】また、ＤＮＡシーケンスサンプル中の未反
応の低分子化合物を電気的に膜５を介して系外に除去す
る場合には、膜５は、低分子化合物は透過するが、反応
生成物であるＤＮＡ断片は透過しない材料であれば良
い。例えば、限外濾過膜のような膜を用いることができ
る。さらに、ＤＮＡシーケンスサンプル中の未反応の低
分子化合物を電気的に膜５を介して系外に除去し、次い
で、ＤＮＡシーケンスサンプル中の検体を電気的に電気
泳動キャピラリーに移行させる場合には、膜５は、低分
子化合物は透過するが、反応生成物であるＤＮＡ断片は
透過しない材料であり、かつ電解液と接して通電可能な
材料であれば良い。そのような膜としても、例えば、限
外濾過膜のような膜を用いることができる。尚、本発明
のにおいて限外濾過膜としては、ポリエーテルスルホン
膜を用いることができる。
応の低分子化合物を電気的に膜５を介して系外に除去す
る場合には、膜５は、低分子化合物は透過するが、反応
生成物であるＤＮＡ断片は透過しない材料であれば良
い。例えば、限外濾過膜のような膜を用いることができ
る。さらに、ＤＮＡシーケンスサンプル中の未反応の低
分子化合物を電気的に膜５を介して系外に除去し、次い
で、ＤＮＡシーケンスサンプル中の検体を電気的に電気
泳動キャピラリーに移行させる場合には、膜５は、低分
子化合物は透過するが、反応生成物であるＤＮＡ断片は
透過しない材料であり、かつ電解液と接して通電可能な
材料であれば良い。そのような膜としても、例えば、限
外濾過膜のような膜を用いることができる。尚、本発明
のにおいて限外濾過膜としては、ポリエーテルスルホン
膜を用いることができる。
【００２０】未反応低分子化合物の除去方法（圧力差
法）（第４の態様） 図３に基づいて説明する。上記本発明のプレート１の貫
通孔２内にＤＮＡシーケンスサンプル７を充填した状態
で、貫通孔の開放口２ａと膜５の外側との間に、膜５の
外側が負圧となるように圧力差を加える。具体的には、
例えば、プレート１の膜５側を減圧容器２０にセットし
て減圧することで、膜５の外側が負圧となるように圧力
差を加えることができる。ＤＮＡシーケンスサンプル内
の未反応の低分子化合物は、膜５を介して、他の低分子
化合物、例えば、水等と共にサンプル外に移行させるこ
とができる。
法）（第４の態様） 図３に基づいて説明する。上記本発明のプレート１の貫
通孔２内にＤＮＡシーケンスサンプル７を充填した状態
で、貫通孔の開放口２ａと膜５の外側との間に、膜５の
外側が負圧となるように圧力差を加える。具体的には、
例えば、プレート１の膜５側を減圧容器２０にセットし
て減圧することで、膜５の外側が負圧となるように圧力
差を加えることができる。ＤＮＡシーケンスサンプル内
の未反応の低分子化合物は、膜５を介して、他の低分子
化合物、例えば、水等と共にサンプル外に移行させるこ
とができる。
【００２１】未反応低分子化合物の除去方法（電気的方
法）（第５の態様） 本発明の第５の態様には、以下の２つの方法が含まれ
る。第１の方法は、プレートの貫通孔内に充填されたＤ
ＮＡシーケンスサンプルに電気泳動キャピラリーの一端
を浸漬し、この電気泳動キャピラリーの他端と接触する
電解液に浸漬した電極と、前記ＤＮＡシーケンスサンプ
ルを充填した貫通孔を封鎖する膜が接触する電解液に浸
漬した電極との間に電圧を印加する方法である。この方
法を図４に基づいて説明する。上記本発明のプレート１
の貫通孔２内に充填されたＤＮＡシーケンスサンプル７
に電気泳動キャピラリー６の一端６ａを浸漬した状態
で、膜５と電気泳動キャピラリー６の他端６ｂとの間に
電気泳動キャピラリー６の他端６ｂが陰極となるように
電圧を印加する。電圧の印加は、膜５を電極９を浸漬し
た電解液８と接触させ、電気泳動キャピラリー６の他端
６ｂを電極１０を浸漬した電解液１１と接触させ、電極
９を陽極とし、電極１０を陰極とすることで行うことが
できる。このようにしてＤＮＡシーケンスサンプル７内
の未反応の低分子化合物を膜５を介してサンプル外に移
行させることができる。尚、図４には、１つの貫通孔２
についてのみ図示されているが、複数の又は全ての貫通
孔２において同時に並行して上記低分子化合物の移行操
作を実施することができる。
法）（第５の態様） 本発明の第５の態様には、以下の２つの方法が含まれ
る。第１の方法は、プレートの貫通孔内に充填されたＤ
ＮＡシーケンスサンプルに電気泳動キャピラリーの一端
を浸漬し、この電気泳動キャピラリーの他端と接触する
電解液に浸漬した電極と、前記ＤＮＡシーケンスサンプ
ルを充填した貫通孔を封鎖する膜が接触する電解液に浸
漬した電極との間に電圧を印加する方法である。この方
法を図４に基づいて説明する。上記本発明のプレート１
の貫通孔２内に充填されたＤＮＡシーケンスサンプル７
に電気泳動キャピラリー６の一端６ａを浸漬した状態
で、膜５と電気泳動キャピラリー６の他端６ｂとの間に
電気泳動キャピラリー６の他端６ｂが陰極となるように
電圧を印加する。電圧の印加は、膜５を電極９を浸漬し
た電解液８と接触させ、電気泳動キャピラリー６の他端
６ｂを電極１０を浸漬した電解液１１と接触させ、電極
９を陽極とし、電極１０を陰極とすることで行うことが
できる。このようにしてＤＮＡシーケンスサンプル７内
の未反応の低分子化合物を膜５を介してサンプル外に移
行させることができる。尚、図４には、１つの貫通孔２
についてのみ図示されているが、複数の又は全ての貫通
孔２において同時に並行して上記低分子化合物の移行操
作を実施することができる。
【００２２】第２の方法は、プレートの貫通孔内に充填
されたＤＮＡシーケンスサンプルに電極を浸漬し、この
電極と、前記ＤＮＡシーケンスサンプルを充填した貫通
孔を封鎖する膜が接触する電解液に浸漬した電極との間
に電圧を印加する方法である。このＤＮＡシーケンスサ
ンプルに電極を浸漬する場合を図５に示す。上記本発明
のプレート１の貫通孔２内に充填されたＤＮＡシーケン
スサンプル７に電極１２を浸漬した状態で、膜５と電極
９との間に電極１２が陰極となるように電圧を印加する
ことで行うことができる。このようにしても、ＤＮＡシ
ーケンスサンプル７内の未反応の低分子化合物を膜５を
介してサンプル外に移行させることができる。尚、図５
には、１つの貫通孔２についてのみ図示されているが、
複数の又は全ての貫通孔２において同時に並行して上記
低分子化合物の移行操作を実施することができる
されたＤＮＡシーケンスサンプルに電極を浸漬し、この
電極と、前記ＤＮＡシーケンスサンプルを充填した貫通
孔を封鎖する膜が接触する電解液に浸漬した電極との間
に電圧を印加する方法である。このＤＮＡシーケンスサ
ンプルに電極を浸漬する場合を図５に示す。上記本発明
のプレート１の貫通孔２内に充填されたＤＮＡシーケン
スサンプル７に電極１２を浸漬した状態で、膜５と電極
９との間に電極１２が陰極となるように電圧を印加する
ことで行うことができる。このようにしても、ＤＮＡシ
ーケンスサンプル７内の未反応の低分子化合物を膜５を
介してサンプル外に移行させることができる。尚、図５
には、１つの貫通孔２についてのみ図示されているが、
複数の又は全ての貫通孔２において同時に並行して上記
低分子化合物の移行操作を実施することができる
【００２３】上記方法において、プレート１の膜５の全
面を電解液８に接触させ、電極１２又は電気泳動キャピ
ラリー６を各貫通孔内のサンプルに浸漬し、かつ電圧を
印加することで、複数または全ての貫通孔２内のＤＮＡ
シーケンスサンプル中の未反応の低分子化合物を膜５を
介して、同時に並行してサンプル外に移行させることが
できる。
面を電解液８に接触させ、電極１２又は電気泳動キャピ
ラリー６を各貫通孔内のサンプルに浸漬し、かつ電圧を
印加することで、複数または全ての貫通孔２内のＤＮＡ
シーケンスサンプル中の未反応の低分子化合物を膜５を
介して、同時に並行してサンプル外に移行させることが
できる。
【００２４】分離検出系への移行方法（電気的方法）
（第６の態様） 上記本発明のプレートの貫通孔内に充填されたＤＮＡシ
ーケンスサンプルを分離検出用の電気泳動キャピラリー
に移行する方法である。図４に基づいて説明する。電気
泳動キャピラリーの一端６ａを貫通孔２内に充填された
ＤＮＡシーケンスサンプル７に浸漬した状態で、膜５と
電気泳動キャピラリー６の他端６ｂとの間に電圧を印加
する。電圧の印加は、図４に示すように、膜５を電極９
を浸漬した電解液８と接触させ、電気泳動キャピラリー
６の他端６ｂを電極１０を浸漬した電解液１１と接触さ
せ、電極９を陰極とし、電極１０を陽極とすることで行
うことができる。
（第６の態様） 上記本発明のプレートの貫通孔内に充填されたＤＮＡシ
ーケンスサンプルを分離検出用の電気泳動キャピラリー
に移行する方法である。図４に基づいて説明する。電気
泳動キャピラリーの一端６ａを貫通孔２内に充填された
ＤＮＡシーケンスサンプル７に浸漬した状態で、膜５と
電気泳動キャピラリー６の他端６ｂとの間に電圧を印加
する。電圧の印加は、図４に示すように、膜５を電極９
を浸漬した電解液８と接触させ、電気泳動キャピラリー
６の他端６ｂを電極１０を浸漬した電解液１１と接触さ
せ、電極９を陰極とし、電極１０を陽極とすることで行
うことができる。
【００２５】この電気的注入は電気泳動キャピラリーの
充填物（分離系）がポリマー溶液及びアクリルアミドの
いずれの場合にも利用できる。上記電極９と電極１０と
の間に１〜１０ｋＶの電圧を一〜数十秒間加印して電気
泳動的に行う。これによりＤＮＡシーケンスサンプル７
内の検体を電気泳動キャピラリー６（６ａの近傍）に移
行させることができる。尚、図４には、１つの貫通孔２
についてのみ図示されているが、プレート１の膜５の全
面を電解液８に接触させ、各電気泳動キャピラリー６の
他端６ｂを陽極側とすることで、複数の又は全ての貫通
孔２において同時に並行してＤＮＡシーケンスサンプル
中の検体を各電気泳動キャピラリーに移行させることが
できる。
充填物（分離系）がポリマー溶液及びアクリルアミドの
いずれの場合にも利用できる。上記電極９と電極１０と
の間に１〜１０ｋＶの電圧を一〜数十秒間加印して電気
泳動的に行う。これによりＤＮＡシーケンスサンプル７
内の検体を電気泳動キャピラリー６（６ａの近傍）に移
行させることができる。尚、図４には、１つの貫通孔２
についてのみ図示されているが、プレート１の膜５の全
面を電解液８に接触させ、各電気泳動キャピラリー６の
他端６ｂを陽極側とすることで、複数の又は全ての貫通
孔２において同時に並行してＤＮＡシーケンスサンプル
中の検体を各電気泳動キャピラリーに移行させることが
できる。
【００２６】分離検出系への移行方法（圧力差法）（第
７の態様） 上記本発明のプレートの貫通孔内に充填されたＤＮＡシ
ーケンスサンプルを分離検出用の電気泳動キャピラリー
に移行する方法である。図６に基づいて説明する。プレ
ート１の貫通孔２内にＤＮＡシーケンスサンプル７を充
填した状態で、電気泳動キャピラリー６の一端６ａを、
貫通孔２の開放口側から、前記貫通孔２内のＤＮＡシー
ケンスサンプル７に浸漬し、電気泳動キャピラリー６の
他端６ｂから電気泳動キャピラリー６内の充填物（例え
ば、ポリマー溶液）６ｃを吸引することで行うことがで
きる。これにようＤＮＡシーケンスサンプル７内の検体
を電気泳動キャピラリー６内に移行させることができ
る。尚、プレート１の貫通孔２のそれぞれに電気泳動キ
ャピラリー６を浸漬し、吸引することで、全ての貫通孔
２内のＤＮＡシーケンスサンプル中の検体を同時に並行
して各電気泳動キャピラリーに移行させることができ
る。
７の態様） 上記本発明のプレートの貫通孔内に充填されたＤＮＡシ
ーケンスサンプルを分離検出用の電気泳動キャピラリー
に移行する方法である。図６に基づいて説明する。プレ
ート１の貫通孔２内にＤＮＡシーケンスサンプル７を充
填した状態で、電気泳動キャピラリー６の一端６ａを、
貫通孔２の開放口側から、前記貫通孔２内のＤＮＡシー
ケンスサンプル７に浸漬し、電気泳動キャピラリー６の
他端６ｂから電気泳動キャピラリー６内の充填物（例え
ば、ポリマー溶液）６ｃを吸引することで行うことがで
きる。これにようＤＮＡシーケンスサンプル７内の検体
を電気泳動キャピラリー６内に移行させることができ
る。尚、プレート１の貫通孔２のそれぞれに電気泳動キ
ャピラリー６を浸漬し、吸引することで、全ての貫通孔
２内のＤＮＡシーケンスサンプル中の検体を同時に並行
して各電気泳動キャピラリーに移行させることができ
る。
【００２７】精製・分離検出系への移行方法（第８の態
様） この方法は、ＤＮＡシーケンスサンプル中の未反応の低
分子化合物を除去し、次いでＤＮＡシーケンスサンプル
中の検体を分離検出用の電気泳動キャピラリーに移行す
る方法であり、上記ＤＮＡシーケンスサンプルの未反応
低分子化合物の除去方法と分離検出系への移行方法とを
逐次行う方法である。低分子化合物の除去には、前記本
発明の第５の態様の方法を用いる。即ち、図４に示すよ
うに、上記本発明のプレート１の貫通孔２内に充填され
たＤＮＡシーケンスサンプル７に電気泳動キャピラリー
６の一端６ａを浸漬した状態で、 膜５と電気泳動キャ
ピラリー６の他端６ｂとの間に電気泳動キャピラリー６
の他端６ｂが陰極となるように電圧を印加して、ＤＮＡ
シーケンスサンプル７内の未反応の低分子化合物を膜５
を介して前記サンプル外に移行させる。次いで、サンプ
ルの移行には、前記本発明の第６の態様の方法を用い
る。即ち、膜５と電気泳動キャピラリー６の他端ｂとの
間に、電気泳動キャピラリー６の他端６ｂが陽極となる
ように電圧を印加して、ＤＮＡシーケンスサンプル７内
の検体を電気泳動キャピラリー６に移行させる。低分子
化合物の除去と検体の移行とは、電極９と１０の陰陽を
切り換えることにより簡単に行うことができる。但し、
未反応の低分子化合物を膜５を介して移行させた電解液
８は、検体の移行の前に置換しておくことが、低分子化
合物がサンプル７に還流することを防止するとうい観点
から好ましい。
様） この方法は、ＤＮＡシーケンスサンプル中の未反応の低
分子化合物を除去し、次いでＤＮＡシーケンスサンプル
中の検体を分離検出用の電気泳動キャピラリーに移行す
る方法であり、上記ＤＮＡシーケンスサンプルの未反応
低分子化合物の除去方法と分離検出系への移行方法とを
逐次行う方法である。低分子化合物の除去には、前記本
発明の第５の態様の方法を用いる。即ち、図４に示すよ
うに、上記本発明のプレート１の貫通孔２内に充填され
たＤＮＡシーケンスサンプル７に電気泳動キャピラリー
６の一端６ａを浸漬した状態で、 膜５と電気泳動キャ
ピラリー６の他端６ｂとの間に電気泳動キャピラリー６
の他端６ｂが陰極となるように電圧を印加して、ＤＮＡ
シーケンスサンプル７内の未反応の低分子化合物を膜５
を介して前記サンプル外に移行させる。次いで、サンプ
ルの移行には、前記本発明の第６の態様の方法を用い
る。即ち、膜５と電気泳動キャピラリー６の他端ｂとの
間に、電気泳動キャピラリー６の他端６ｂが陽極となる
ように電圧を印加して、ＤＮＡシーケンスサンプル７内
の検体を電気泳動キャピラリー６に移行させる。低分子
化合物の除去と検体の移行とは、電極９と１０の陰陽を
切り換えることにより簡単に行うことができる。但し、
未反応の低分子化合物を膜５を介して移行させた電解液
８は、検体の移行の前に置換しておくことが、低分子化
合物がサンプル７に還流することを防止するとうい観点
から好ましい。
【００２８】精製・分離検出系への移行方法（第９の態
様） この方法は、ＤＮＡシーケンスサンプル中の未反応の低
分子化合物を除去し、次いでＤＮＡシーケンスサンプル
中の検体を分離検出用の電気泳動キャピラリーに移行す
る方法であり、上記ＤＮＡシーケンスサンプルの未反応
低分子化合物の除去方法と分離検出系への移行方法とを
逐次行う方法である。低分子化合物の除去には、前記本
発明の第４の態様の方法を用いる。即ち、図３に示すよ
うに、本発明のプレート１の貫通孔２内にＤＮＡシーケ
ンスサンプル７を充填した状態で、貫通孔の開放口２ａ
と膜５の外側との間に、膜５の外側が負圧となるように
圧力差を加える。具体的には、例えば、プレート１の膜
５側を減圧容器２０にセットして減圧することで、膜５
の外側が負圧となるように圧力差を加えることができ
る。ＤＮＡシーケンスサンプル内の未反応の低分子化合
物は、膜５を介して、他の低分子化合物、例えば、水等
と共にサンプル外に移行させることができる。
様） この方法は、ＤＮＡシーケンスサンプル中の未反応の低
分子化合物を除去し、次いでＤＮＡシーケンスサンプル
中の検体を分離検出用の電気泳動キャピラリーに移行す
る方法であり、上記ＤＮＡシーケンスサンプルの未反応
低分子化合物の除去方法と分離検出系への移行方法とを
逐次行う方法である。低分子化合物の除去には、前記本
発明の第４の態様の方法を用いる。即ち、図３に示すよ
うに、本発明のプレート１の貫通孔２内にＤＮＡシーケ
ンスサンプル７を充填した状態で、貫通孔の開放口２ａ
と膜５の外側との間に、膜５の外側が負圧となるように
圧力差を加える。具体的には、例えば、プレート１の膜
５側を減圧容器２０にセットして減圧することで、膜５
の外側が負圧となるように圧力差を加えることができ
る。ＤＮＡシーケンスサンプル内の未反応の低分子化合
物は、膜５を介して、他の低分子化合物、例えば、水等
と共にサンプル外に移行させることができる。
【００２９】次いで、サンプルの移行には、前記本発明
の第６の態様の方法を用いる。即ち、図４に示すよう
に、本発明のプレート１の貫通孔２内の未反応の低分子
化合物を除去したＤＮＡシーケンスサンプル７に電気泳
動キャピラリー６の一端６ａを浸漬した状態で、膜５と
電気泳動キャピラリー６の他端ｂとの間に電圧を印加し
て、ＤＮＡシーケンスサンプル７内の検体を電気泳動キ
ャピラリー６に移行させる。
の第６の態様の方法を用いる。即ち、図４に示すよう
に、本発明のプレート１の貫通孔２内の未反応の低分子
化合物を除去したＤＮＡシーケンスサンプル７に電気泳
動キャピラリー６の一端６ａを浸漬した状態で、膜５と
電気泳動キャピラリー６の他端ｂとの間に電圧を印加し
て、ＤＮＡシーケンスサンプル７内の検体を電気泳動キ
ャピラリー６に移行させる。
【００３０】本発明において処理対象であるＤＮＡシー
ケンスサンプルは、例えば、プレート上の多数の空間
（穴、孔）内で多数の化学または酵素反応（９６反応／
プレート／試技 以上）により生じたものであれること
ができ、反応の種類や反応数等に制限はない。例えば、
ＤＮＡシーケンスサンプルは、前記本発明のプレートの
貫通孔内で行われたＤＮＡシーケンス反応の生成物や、
または、別のマイクロタイタープレートのウエル中で行
われたＤＮＡシーケンス反応の生成物であることもでき
る。さらに、ＤＮＡシーケンス反応としては、例えば、
ジデオキシヌクレオチド（dideoxynucleotide)を用いた
サンガー反応や、ＰＣＲ（polymerase chain reaction)
を利用して行うＤＮＡサイクルシーケンスを挙げること
ができる。
ケンスサンプルは、例えば、プレート上の多数の空間
（穴、孔）内で多数の化学または酵素反応（９６反応／
プレート／試技 以上）により生じたものであれること
ができ、反応の種類や反応数等に制限はない。例えば、
ＤＮＡシーケンスサンプルは、前記本発明のプレートの
貫通孔内で行われたＤＮＡシーケンス反応の生成物や、
または、別のマイクロタイタープレートのウエル中で行
われたＤＮＡシーケンス反応の生成物であることもでき
る。さらに、ＤＮＡシーケンス反応としては、例えば、
ジデオキシヌクレオチド（dideoxynucleotide)を用いた
サンガー反応や、ＰＣＲ（polymerase chain reaction)
を利用して行うＤＮＡサイクルシーケンスを挙げること
ができる。
【００３１】尚、ＤＮＡシーケンス反応を本発明のプレ
ートの貫通孔内に構成された空間で行う場合には、以下
の方法を用いることが好ましい。まず、各孔内に別々の
種類のものを入れる必要性のあるもの（例えば鋳型ＤＮ
Ａ等）以外の反応酵素（耐熱性ポリメレース等）や反応
バッファーなどの試薬酵素の注入は、本発明の第１の態
様の容器前駆体を用いて、本発明の第２の態様として説
明したように、容器前駆体プレートの各貫通孔内にまと
めて入れておく。即ち、本発明の第１の態様の容器前駆
体を試薬酵素液の中に漬け、それを引き上げるだけで各
貫通孔の中に一定量の試薬酵素液が保持できる。尚、同
一のプレート上に２つ以上の大きさの異なる貫通孔を設
けることで、試薬酵素液の保持量が異なる反応場を形成
することもできる。次いで、容器前駆体プレートの一方
の面に膜を張り付けて、貫通孔内に試薬酵素液が保持し
た反応液内蔵プレートを形成することができる。このプ
レートを所望のＤＮＡシーケンス反応等の反応に提供す
ることができる。上記容器内で行う反応としては、例え
ば、３７℃で行うＤＮＡポリメレースによるシーケンス
反応が膜による反応液の保持性を考慮すると有利であ
る。本発明のこの手法は、最初に試薬酵素液を入れる分
注過程を極めて省力化できる。但し、このような方法を
用いず、一本ずつ試薬酵素液を分注しても構わない。
ートの貫通孔内に構成された空間で行う場合には、以下
の方法を用いることが好ましい。まず、各孔内に別々の
種類のものを入れる必要性のあるもの（例えば鋳型ＤＮ
Ａ等）以外の反応酵素（耐熱性ポリメレース等）や反応
バッファーなどの試薬酵素の注入は、本発明の第１の態
様の容器前駆体を用いて、本発明の第２の態様として説
明したように、容器前駆体プレートの各貫通孔内にまと
めて入れておく。即ち、本発明の第１の態様の容器前駆
体を試薬酵素液の中に漬け、それを引き上げるだけで各
貫通孔の中に一定量の試薬酵素液が保持できる。尚、同
一のプレート上に２つ以上の大きさの異なる貫通孔を設
けることで、試薬酵素液の保持量が異なる反応場を形成
することもできる。次いで、容器前駆体プレートの一方
の面に膜を張り付けて、貫通孔内に試薬酵素液が保持し
た反応液内蔵プレートを形成することができる。このプ
レートを所望のＤＮＡシーケンス反応等の反応に提供す
ることができる。上記容器内で行う反応としては、例え
ば、３７℃で行うＤＮＡポリメレースによるシーケンス
反応が膜による反応液の保持性を考慮すると有利であ
る。本発明のこの手法は、最初に試薬酵素液を入れる分
注過程を極めて省力化できる。但し、このような方法を
用いず、一本ずつ試薬酵素液を分注しても構わない。
【００３２】本発明の方法により、電気泳動キャピラリ
ーに移行された検体は常法により分離検出される。その
ような常法としては、ＤＮＡキャピラリー電気泳動法に
よるＤＮＡ塩基配列決定法を挙げることができる。ＤＮ
Ａキャピラリー電気泳動法に用いるＤＮＡ分離系として
は、例えば、図７に示すようなキャピラリーをグリッド
状に配置し三次元的に規則正しく（例えば柱状に）並ん
だキャピラリーレーン３１を電気泳動のゲルとして用い
ることができる。グリッド状納められたキャピラリーの
配置を本発明のマルチ貫通孔プレート３２の各貫通孔３
３の配置と一致させておくことで、キャピラリーをマル
チ貫通孔プレート３２の貫通孔３３内にきっちりと挿入
することできる。
ーに移行された検体は常法により分離検出される。その
ような常法としては、ＤＮＡキャピラリー電気泳動法に
よるＤＮＡ塩基配列決定法を挙げることができる。ＤＮ
Ａキャピラリー電気泳動法に用いるＤＮＡ分離系として
は、例えば、図７に示すようなキャピラリーをグリッド
状に配置し三次元的に規則正しく（例えば柱状に）並ん
だキャピラリーレーン３１を電気泳動のゲルとして用い
ることができる。グリッド状納められたキャピラリーの
配置を本発明のマルチ貫通孔プレート３２の各貫通孔３
３の配置と一致させておくことで、キャピラリーをマル
チ貫通孔プレート３２の貫通孔３３内にきっちりと挿入
することできる。
【００３３】キャピラリーをセットしたマルチ貫通孔プ
レートの底面に装着されている膜を陰極電気泳動槽３４
のバッファーの上面に接触させ、陰極電気泳動槽３４と
キャピラリー３１のもう一端を漬けている陽極電気泳動
槽３５の間に電源３６を用いて電圧をかける。このよう
にして、電気泳動的にマルチ貫通孔プレート上の全ての
反応検体を一度にキャピラリー内に注入する。次いで、
電気泳動により分離し、かつ分離したフラグメントを検
出器３７により検出する。検出器３７は、フラグメント
に乗せられたマーカーの種類により選択する。例えば、
蛍光マーカーの場合には蛍光検出器を用い、ＲＩマーカ
ーの場合にはイメージングアナライザー等を用いること
ができる。
レートの底面に装着されている膜を陰極電気泳動槽３４
のバッファーの上面に接触させ、陰極電気泳動槽３４と
キャピラリー３１のもう一端を漬けている陽極電気泳動
槽３５の間に電源３６を用いて電圧をかける。このよう
にして、電気泳動的にマルチ貫通孔プレート上の全ての
反応検体を一度にキャピラリー内に注入する。次いで、
電気泳動により分離し、かつ分離したフラグメントを検
出器３７により検出する。検出器３７は、フラグメント
に乗せられたマーカーの種類により選択する。例えば、
蛍光マーカーの場合には蛍光検出器を用い、ＲＩマーカ
ーの場合にはイメージングアナライザー等を用いること
ができる。
【００３４】
【実施例】以下本発明を実施例によりさらに説明する。
以下の実施例においては、図８に示す装置を用いてＤＮ
Ａシークエンスサンプルの未反応低分子化合物の除去を
行い、次いで図９に示すキャピラリー電気泳動装置を用
いてＤＮＡシークエンスサンプルの電気泳動キャピラリ
ーへの移行を行った。さらに、図７に示す電気泳動法に
よる分離検出装置により分離検出を行った。
以下の実施例においては、図８に示す装置を用いてＤＮ
Ａシークエンスサンプルの未反応低分子化合物の除去を
行い、次いで図９に示すキャピラリー電気泳動装置を用
いてＤＮＡシークエンスサンプルの電気泳動キャピラリ
ーへの移行を行った。さらに、図７に示す電気泳動法に
よる分離検出装置により分離検出を行った。
【００３５】（１）石英キャピラリー内壁の前処理 内径０．１ｍｍ、外径０．２２ｍｍの石英キャピラリー
(O.D.220μm, I.D.100μｍ，SGE:Australia)を約30cmに
切り、官能基を有する試薬（3-メタクリロキシプロピル
トリメトキシシラン等）溶液を通し、数時間放置した。
その後、メタノール及び水でキャピラリー内を洗浄し
た。 （２）アクリルアミドの充填 アクリルアミド溶液［ＴＢＥ緩衝液（100mM Tris borat
e, pH8.0, 0.2mM EDTA) 、７Ｍ尿素、６％アクリルアミ
ド、０〜５％ビスアクリルアミド］を調製し、この後、
減圧機等により脱気を行い、過硫酸アンンモニウム（終
濃度0.05％）、テトラメチルエチレンジアミン（終濃度
0.01％）を加え、注射器等を用い上記石英キャピラリー
中にアクリルアミド溶液を充填した。ゲル過が終了する
まで数時間４℃に放置した。
(O.D.220μm, I.D.100μｍ，SGE:Australia)を約30cmに
切り、官能基を有する試薬（3-メタクリロキシプロピル
トリメトキシシラン等）溶液を通し、数時間放置した。
その後、メタノール及び水でキャピラリー内を洗浄し
た。 （２）アクリルアミドの充填 アクリルアミド溶液［ＴＢＥ緩衝液（100mM Tris borat
e, pH8.0, 0.2mM EDTA) 、７Ｍ尿素、６％アクリルアミ
ド、０〜５％ビスアクリルアミド］を調製し、この後、
減圧機等により脱気を行い、過硫酸アンンモニウム（終
濃度0.05％）、テトラメチルエチレンジアミン（終濃度
0.01％）を加え、注射器等を用い上記石英キャピラリー
中にアクリルアミド溶液を充填した。ゲル過が終了する
まで数時間４℃に放置した。
【００３６】（３）鋳型ＤＮＡの調製 サンプリングチューブに、Ｍ13プライマー0.5pmol 、鋳
型ＤＮＡ（Ｍ13phage)0.5pmol 、Sequenase Ver.2.0 緩
衝液(200μM Tris.Cl. pH7.5, 100mM MgCl2, 250mM NaC
l)２μｌを加え、滅菌蒸留水にて１０μｌに合わせ、混
合した後、６５℃、１０分間加温し、その後室温に戻し
鋳型とプライマーをアニールさせた。次にアニールした
鋳型ＤＮＡ−プライマー溶液１０μｌに 0.1Ｍジチオス
レイトール１μｌ、dNTPs mix(１μＭ dATP, dGTP, dTT
P)２μｌ、［α−32Ｐ］dCTP(3000Ci/mmol, 10mCi/ml,
Amershame) 0.5μl 、Sequenase Ver.2.0 (Amersham)２
Ｕを加えた。次に停止混合液80μＭ dATP,dGTP,dCTP,dT
TP, ８μＭ ddTTP, 50mM NaCl) 3.5μl に上記混合液を
2.5μl 加えて混合し３７℃で１０分間反応させた。10
μｌのホルムアミドダイ［９５％ホルムアミド、10mM
ＥＤＴＡ、0.05％ブロムフェノールブルー（ＢＰＢ）、
0.05％キシレンシアノール（ＸＣ）］と混合し、８０℃
で５分間加熱した。
型ＤＮＡ（Ｍ13phage)0.5pmol 、Sequenase Ver.2.0 緩
衝液(200μM Tris.Cl. pH7.5, 100mM MgCl2, 250mM NaC
l)２μｌを加え、滅菌蒸留水にて１０μｌに合わせ、混
合した後、６５℃、１０分間加温し、その後室温に戻し
鋳型とプライマーをアニールさせた。次にアニールした
鋳型ＤＮＡ−プライマー溶液１０μｌに 0.1Ｍジチオス
レイトール１μｌ、dNTPs mix(１μＭ dATP, dGTP, dTT
P)２μｌ、［α−32Ｐ］dCTP(3000Ci/mmol, 10mCi/ml,
Amershame) 0.5μl 、Sequenase Ver.2.0 (Amersham)２
Ｕを加えた。次に停止混合液80μＭ dATP,dGTP,dCTP,dT
TP, ８μＭ ddTTP, 50mM NaCl) 3.5μl に上記混合液を
2.5μl 加えて混合し３７℃で１０分間反応させた。10
μｌのホルムアミドダイ［９５％ホルムアミド、10mM
ＥＤＴＡ、0.05％ブロムフェノールブルー（ＢＰＢ）、
0.05％キシレンシアノール（ＸＣ）］と混合し、８０℃
で５分間加熱した。
【００３７】（４）キャピラリー中への試料の注入及び
電気泳動 内径３．５ｍｍの貫通孔を３８４（１６×２４）有する
プレートを用意し、その下面（緩衝液に接触させる面）
に超音波溶着等の接着方法を用いポリエーテルスルフォ
ン限外濾過膜を溶着した。このプレートの各穴に上記の
方法で調製したサンプル液を限外濾過膜に接する形で注
入した。サンプルを入れた膜装着プレートを図８に示す
ように吸引器と接続して膜側から、１０分間真空で引く
ことにより、減圧で未反応の低分子化合物を除去した。
次に、前記で作製したアクリルアミドゲルを充填したキ
ャピラリーの一方をＴＢＥ緩衝液に浸し、もう一方の端
を図９に示すように、サンプル液に浸した。さにこのプ
レート下面の限外濾過膜をＴＢＥ緩衝液に浸し、図７に
示すように３ｋＶの電圧を陰極電気泳動槽３４と陽極電
気泳動槽３５との間に約３０秒間加えた。その後、サン
プル液からＴＢＥ緩衝液へキャピラリーの一方の端を移
し、3000Ｖ、１時間の条件で泳動を行った。
電気泳動 内径３．５ｍｍの貫通孔を３８４（１６×２４）有する
プレートを用意し、その下面（緩衝液に接触させる面）
に超音波溶着等の接着方法を用いポリエーテルスルフォ
ン限外濾過膜を溶着した。このプレートの各穴に上記の
方法で調製したサンプル液を限外濾過膜に接する形で注
入した。サンプルを入れた膜装着プレートを図８に示す
ように吸引器と接続して膜側から、１０分間真空で引く
ことにより、減圧で未反応の低分子化合物を除去した。
次に、前記で作製したアクリルアミドゲルを充填したキ
ャピラリーの一方をＴＢＥ緩衝液に浸し、もう一方の端
を図９に示すように、サンプル液に浸した。さにこのプ
レート下面の限外濾過膜をＴＢＥ緩衝液に浸し、図７に
示すように３ｋＶの電圧を陰極電気泳動槽３４と陽極電
気泳動槽３５との間に約３０秒間加えた。その後、サン
プル液からＴＢＥ緩衝液へキャピラリーの一方の端を移
し、3000Ｖ、１時間の条件で泳動を行った。
【００３８】（５）オートラジオグラフィー ＢＰＢがキャピラリーの下端へ達した時、泳動を終了
し、ＢＡＳ2000イメージングアナライザー（ＦＵＪＩ）
により泳動パターンを解析した。その結果を図１０に示
す。図１０に示すように、シークエンスラダーが前記の
プロトコールにより生成した。
し、ＢＡＳ2000イメージングアナライザー（ＦＵＪＩ）
により泳動パターンを解析した。その結果を図１０に示
す。図１０に示すように、シークエンスラダーが前記の
プロトコールにより生成した。
【００３９】
【発明の効果】本発明によれば、反応液を多数ウエルに
短時間にしかも簡単に充填できる手段を提供することが
できる。また、本発明によれば、未反応の標識物質等を
含む複数のＤＮＡシーケンスサンプルから短時間にしか
も簡単に、標識物質等を除去する方法を提供することが
できる。さらに本発明によれば、多数のＤＮＡシーケン
スサンプルを短時間にしかも簡単に電気泳動キャピラリ
ーに移行できる手段を提供することができる。加えて本
発明によれば、未反応の標識物質等を含む複数のＤＮＡ
シーケンスサンプルから短時間にしかも簡単に、標識物
質等を除去し、かつ多数のＤＮＡシーケンスサンプルを
短時間に、簡単に電気泳動キャピラリーに移行できる方
法を提供することができる。
短時間にしかも簡単に充填できる手段を提供することが
できる。また、本発明によれば、未反応の標識物質等を
含む複数のＤＮＡシーケンスサンプルから短時間にしか
も簡単に、標識物質等を除去する方法を提供することが
できる。さらに本発明によれば、多数のＤＮＡシーケン
スサンプルを短時間にしかも簡単に電気泳動キャピラリ
ーに移行できる手段を提供することができる。加えて本
発明によれば、未反応の標識物質等を含む複数のＤＮＡ
シーケンスサンプルから短時間にしかも簡単に、標識物
質等を除去し、かつ多数のＤＮＡシーケンスサンプルを
短時間に、簡単に電気泳動キャピラリーに移行できる方
法を提供することができる。
【図１】 本発明の容器前駆体及びこの容器前駆体を用
いた本発明の反応用液を内蔵する容器の製造方法の断面
概略説明図。
いた本発明の反応用液を内蔵する容器の製造方法の断面
概略説明図。
【図２】 本発明のＤＮＡシーケンスサンプルの分離検
出系移行用プレートの断面概略説明図。
出系移行用プレートの断面概略説明図。
【図３】 本発明の未反応低分子化合物の除去方法（圧
力差法）の断面概略説明図。
力差法）の断面概略説明図。
【図４】 本発明の未反応低分子化合物の除去方法（電
気的方法）及び分離検出系への移行方法（電気的方法）
の断面概略説明図。
気的方法）及び分離検出系への移行方法（電気的方法）
の断面概略説明図。
【図５】 本発明の未反応低分子化合物の除去方法（電
気的方法）の断面概略説図。
気的方法）の断面概略説図。
【図６】 本発明の分離検出系への移行方法（圧力法）
の断面概略説明図。
の断面概略説明図。
【図７】 電気泳動法による分離検出方法の概略説明
図。
図。
【図８】 未反応低分子化合物の除去方法（圧力差法）
の概略説明図。
の概略説明図。
【図９】 電気泳動キャピラリーへの移行方法（電気的
方法）の概略説明図。
方法）の概略説明図。
【図１０】 イメージングアナライザーにより得られた
泳動パターンのシークエンスラダー。
泳動パターンのシークエンスラダー。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 27/26 ３２１Ｚ (56)参考文献 特開 平３−297379（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−142198（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−127049（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−100054（ＪＰ，Ａ) 国際公開88／6723（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12M 1/00 G01N 27/447 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (16)
- 【請求項１】 厚さ方向に貫通する複数の貫通孔を有す
る基板からなる反応容器前駆体を反応液に浸漬して貫通
孔内に前記反応液を充填し、次いで前記貫通孔の一方の
開放口を膜で封鎖して前記貫通孔を反応容器とすること
を特徴とする反応液を内蔵する容器の製造方法。 - 【請求項２】 前記貫通孔の内径が０．０１〜１０ｍｍ
の範囲である請求項１に記載の製造方法。 - 【請求項３】 前記反応液が酵素を含む緩衝液である
請求項１又は２に記載の製造方法。 - 【請求項４】 ＤＮＡシーケンスサンプル中の未反応
の低分子化合物を除去する方法であって、厚さ方向に貫
通する複数の貫通孔を有する基板からなるプレート前駆
体をＤＮＡシーケンスサンプルに浸漬して貫通孔内に前
記ＤＮＡシーケンスサンプルを充填し、次いで前記貫通
孔の一方の開放口を膜で封鎖し、この状態で、前記貫通
孔の開放口と前記膜の外側との間に、前記膜の外側が負
圧となるように圧力差を加えて、前記ＤＮＡシーケンス
サンプル内の未反応の低分子化合物を前記膜を介して前
記サンプル外に移行させることを特徴とする方法。 - 【請求項５】 ＤＮＡシーケンスサンプル中の未反応の
低分子化合物を除去する方法であって、厚さ方向に貫通
する複数の貫通孔を有する基板とこの貫通孔の一方の開
放口を封鎖するように設けられた膜とからなるＤＮＡシ
ーケンスサンプルの分離検出系移行用プレートの貫通孔
内に充填されたＤＮＡシーケンスサンプルと、前記ＤＮ
Ａを充填した貫通孔を封鎖する膜の外側との間に電圧を
印加して、前記ＤＮＡシーケンスサンプル内の未反応の
低分子化合物を膜を介して前記サンプル外に移行させる
ことを特徴とする方法。 - 【請求項６】 前記貫通孔内に充填されたＤＮＡシーケ
ンスサンプルに電気泳動キャピラリーの一端を浸漬し、
この電気泳動キャピラリーの他端と接触する電解液に浸
漬した電極と、前記ＤＮＡシーケンスサンプルが充填さ
れた貫通孔を封鎖する膜が接触する電解液に浸漬した電
極との間に電圧を印加する請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 前記貫通孔内に充填されたＤＮＡシーケ
ンスサンプルに電極を浸漬し、この電極と、前記ＤＮＡ
シーケンスサンプルを充填した貫通孔を封鎖する膜が接
触する電解液に浸漬した電極との間に電圧を印加する請
求項５に記載の方法。 - 【請求項８】 前記未反応の低分子化合物が未反応蛍光
標識物質である請求項４〜７のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項９】 ＤＮＡシーケンスサンプルが、前記貫通
孔内で行われたＤＮＡシーケンス反応の生成物である請
求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１０】 ＤＮＡシーケンスサンプルが、マイク
ロタイタープレートにおいて行われたＤＮＡシーケンス
反応の生成物である請求項４〜８のいずれか１項に記載
の方法。 - 【請求項１１】 厚さ方向に貫通する複数の貫通孔を有
する基板からなるプレート前駆体をＤＮＡシーケンスサ
ンプル中に浸漬して貫通孔内に前記ＤＮＡシーケンスサ
ンプルを充填し、次いで前記貫通孔の一方の開放口を膜
で封鎖し、前記貫通孔内に充填されたＤＮＡシーケンス
サンプルを分離検出用の電気泳動キャピラリーに移行す
る方法であって、前記電気泳動キャピラリーの一端を前
記貫通孔内に充填されたＤＮＡシーケンスサンプルに浸
漬した状態で、前記ＤＮＡシーケンスサンプルを充填し
た貫通孔を封鎖する膜と前記電気泳動キャピラリーの他
端との間に電圧を印加して、前記ＤＮＡシーケンスサン
プル内の検体を前記電気泳動キャピラリーに移行させる
ことを特徴とするＤＮＡシーケンスサンプルの分離検出
系への移行方法。 - 【請求項１２】 ＤＮＡシーケンスサンプルが、前記貫
通孔内で行われたＤＮＡシーケンス反応の生成物である
請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 ＤＮＡシーケンスサンプルが、マイク
ロタイタープレートにおいて行われたＤＮＡシーケンス
反応の生成物である請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１４】 厚さ方向に貫通する複数の貫通孔を有
する基板からなるプレート前駆体をＤＮＡシーケンスサ
ンプル中に浸漬して貫通孔内に前記ＤＮＡシーケンスサ
ンプルを充填し、次いで前記貫通孔の一方の開放口を膜
で封鎖し、この状態で、電気泳動キャピラリーの一端を
貫通孔の開放口側から前記貫通孔内のＤＮＡシーケンス
サンプルに浸漬し、電気泳動キャピラリーの他端から電
気泳動キャピラリー内に充填物を吸引することにより前
記ＤＮＡシーケンスサンプル内の検体を前記電気泳動キ
ャピラリー内に移行させることを特徴とするＤＮＡシー
ケンスサンプルの分離検出系への移行方法。 - 【請求項１５】 ＤＮＡシーケンスサンプル中の未反応
の低分子化合物を除去し、次いでＤＮＡシーケンスサン
プル中の検体を分離検出用の電気泳動キャピラリーに移
行する方法であって、厚さ方向に貫通する複数の貫通孔
を有する基板とこの貫通孔の一方の開放口を封鎖するよ
うに設けられた膜とからなるＤＮＡシーケンスサンプル
の分離検出系移行用プレートの貫通孔内に充填されたＤ
ＮＡシーケンスサンプルに電気泳動キャピラリーの一端
を浸漬した状態で、前記ＤＮＡシーケンスサンプルが充
填された貫通孔を封鎖する膜と前記電気泳動キャピラリ
ーの他端との間に電圧を印加して、前記ＤＮＡシーケン
スサンプル内の未反応の低分子化合物を膜を介して前記
サンプル外に移行させ、次いで、前記膜と前記電気泳動
キャピラリーの他端との間に電圧を印加して、前記ＤＮ
Ａシーケンスサンプル内の検体を前記電気泳動キャピラ
リーに移行させる、ことを特徴とするＤＮＡシーケンス
サンプルの精製および分離検出系への移行方法。 - 【請求項１６】 ＤＮＡシーケンスサンプル中の未反応
の低分子化合物を除去し、次いでＤＮＡシーケンスサン
プル中の検体を分離検出用の電気泳動キャピラリーに移
行する方法であって、厚さ方向に貫通する複数の貫通孔
を有する基板からなるプレート前駆体をＤＮＡシーケン
スサンプルに浸漬して貫通孔内に前記ＤＮＡシーケンス
サンプルを充填し、次いで前記貫通孔の一方の開放口を
膜で封鎖し、この状態で、前記貫通孔の開放口と前記膜
の外側との間に、膜の外側が負圧となるように圧力差を
加えて、前記ＤＮＡシーケンスサンプル内の未反応の低
分子化合物を前記膜を介して前記サンプル外に移行さ
せ、次いで前記ＤＮＡシーケンスサンプルに電気泳動キ
ャピラリーの一端を浸漬した状態で、前記ＤＮＡシーケ
ンスサンプルを充填した貫通孔を封鎖する膜と前記電気
泳動キャピラリーの他端との間に電圧を印加して、前記
ＤＮＡシーケンスサンプル内の検体を前記電気泳動キャ
ピラリーに移行させることを特徴とするＤＮＡシーケン
スサンプルの精製および分離検出系への移行方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32824696A JP3337386B2 (ja) | 1995-12-08 | 1996-12-09 | Ｄｎａシーケンスサンプルの精製及び分離検出系への移行方法並びにそれに用いるプレート |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7-320732 | 1995-12-08 | ||
| JP32073295 | 1995-12-08 | ||
| JP32824696A JP3337386B2 (ja) | 1995-12-08 | 1996-12-09 | Ｄｎａシーケンスサンプルの精製及び分離検出系への移行方法並びにそれに用いるプレート |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09215490A JPH09215490A (ja) | 1997-08-19 |
| JP3337386B2 true JP3337386B2 (ja) | 2002-10-21 |
Family
ID=26570192
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32824696A Expired - Lifetime JP3337386B2 (ja) | 1995-12-08 | 1996-12-09 | Ｄｎａシーケンスサンプルの精製及び分離検出系への移行方法並びにそれに用いるプレート |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3337386B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5601997A (en) | 1995-02-03 | 1997-02-11 | Tchao; Ruy | Chemotaxis assay procedure |
| AU772213C (en) * | 1999-02-26 | 2004-12-09 | Exact Sciences Corporation | Biochemical purification devices with immobilized capture probes and their uses |
| JP4566509B2 (ja) * | 2001-12-28 | 2010-10-20 | 株式会社エンプラス | プラスチックプレート及びプラスチックプレート組立体 |
-
1996
- 1996-12-09 JP JP32824696A patent/JP3337386B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09215490A (ja) | 1997-08-19 |
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