ES2221198T3 - Vacuna contra pvh. - Google Patents
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Abstract
Una proteína de fusión que comprende un antígeno de papilomavirus humano seleccionado del grupo constituido por: i) proteína E6, ii) proteína E7, iii) proteína de fusión E6E7, iv) proteína E7 en la que se introduce una mutación para reducir la unión al producto del gen de retinoblastoma, o v) proteína E6 en la que se introduce una mutación en la región p53 de la proteína E6; dicha proteína ligada a la proteína D o a un derivado de la misma de Haemophilus influenzae, en la que el derivado de proteína D comprende aproxiamdamente los primeros 100 aminoácidos N- terminales de la proteína D.
Description
Vacuna contra PVH.
La presente invención se refiere a proteínas de
fusión, que comprenden una proteína o parte de una proteína que
proporciona epítopos auxiliares de T y un antígeno de un
papilomavirus humano, que encuentran utilidad en el tratamiento o
la profilaxis de tumores inducidos por papiloma humano. En
particular, la invención se refiere a proteínas de fusión que
comprenden una proteína E6 o E7 de PVH de cepa 16 ó 18 ligada a
proteína D de Haemophilus influenzae B.
Los papilomavirus son virus tumorales pequeños de
ADN desnudo (7,9 kilobases, bicatenarios) que son altamente
específicos de especie. Se han descrito más de 70 genotipos de
papilomavirus humanos (PVH) individuales. Los papilomavirus se
clasifican basándose en la especie de origen (humana, bovina, etc.)
y en el grado de relación genética con otros papilomavirus de la
misma especie. Los PVH son generalmente específicos de las
superficies dérmica o mucosa, y se han clasificado ampliamente en de
"alto" y "bajo" riesgo basándose en su detección rara y
común, respectivamente, en tejido anormal o tumoral. Los PVH de bajo
riesgo causan habitualmente lesiones (verrugas o papilomas)
que persisten durante varios meses o años. Los PVH de alto riesgo
están asociados al cáncer. La asociación positiva más fuerte entre
un virus PVH y el cáncer humano es la que existe entre PVH 16 y 18
y el carcinoma cervical. Se han encontrado también más de otros
diez tipos de PVH en carcinomas cervicales incluyendo PVH 31 y PVH
33, aunque con menos frecuencia.
La infección genital por PVH en mujeres jóvenes
sexualmente activas es común, y la mayoría de los individuos
eliminan la infección, o si se desarrollan lesiones, éstas
retroceden. Sólo un subconjunto de individuos afectados tiene
lesiones que progresan a neoplasia intraepitelial de alto grado y
sólo una fracción de estos progresan adicionalmente a carcinoma
invasivo.
Los eventos moleculares que conducen a la
infección por PVH no se han establecido claramente. La falta de un
sistema in vitro adecuado para propagar los papilomavirus
humanos ha obstaculizado la progresión a una mejor información sobre
el ciclo viral.
Hoy en día, se han aislado y caracterizado
diferentes tipos de PVH con la ayuda de sistemas de clonación en
bacterias y más recientemente mediante amplificación por PCR. La
organización molecular de los genomas de PVH se ha definido
comparativamente con el bien caracterizado papilomavirus bovino de
tipo I (PVB1).
Aunque aparecen variaciones menores, todos los
genomas de PVH descritos tienen al menos siete genes tempranos, E1
a E7 y dos genes tardíos L1 y L2. Además, una región reguladora
cadena arriba alberga las secuencias reguladoras que parecen
controlar la mayoría de los eventos transcripcionales del genoma de
PVH.
Los genes E1 y E2 están implicados en la
replicación y el control transcripcional viral, respectivamente, y
tienden a desestabilizarse mediante integración viral. E6 y E7 están
implicados en la transformación viral. E5 se ha implicado también en
este proceso.
En los PVH implicados en carcinoma cervical tales
como PVH 16 y 18, el proceso oncogénico se inicia después de la
integración de ADN viral. La integración da como resultado la
inactivación de genes que codifican las proteínas de cápsida L1 y
L2, y la pérdida de la función represora de E2 conduce a la
desregulación del marco abierto de lectura E6/E7 instalando una
sobreexpresión continua de las dos proteínas tempranas E6 y E7, que
conducirá a una pérdida gradual de la diferenciación celular normal
y al desarrollo del carcinoma. E6 y E7 superan el ciclo celular
normal inactivando las proteínas supresoras de tumores
mayoritarias, p53 y pRB, el producto del gen de retinoblastoma,
respectivamente.
El carcinoma del cuello del útero es común en
mujeres y se desarrolla mediante una etapa intermedia precancerosa
hasta el carcinoma invasivo, que frecuentemente conduce a la muerte.
Las etapas intermedias de la enfermedad son conocidas como neoplasia
intraepitelial cervical y se gradúan de I a III en términos de
gravedad creciente (NIC I-III).
Clínicamente, la infección por PVH en el tracto
anogenital femenino se manifiesta en forma de condilomas planos
cervicales, cuya marca es la coilocitosis que afecta
predominantemente a células superficiales e intermedias del epitelio
escamoso cervical.
Los coilocitos, que son la consecuencia de un
efecto citopático del virus, aparecen en forma de células
multinucleadas con un halo transparente perinuclear. El epitelio se
engrosa con una queratinización anormal responsable de la apariencia
verrugosa de la lesión.
Dichos condilomas planos, cuando son positivos de
los serotipos PVH 16 ó 18, son factores de alto riesgo para la
evolución de neoplasia intraepitelial cervical (NIC) y de carcinoma
in situ (CIS), que se consideran como lesiones precursoras de
carcinoma invasivo del cuello de la matriz.
El historial natural de la infección por PVH
oncogénico presenta 3 fases consecutivas, a saber:
(1) una fase de infección latente,
(2) una fase de replicación viral intranuclear
que produce viriones completos, que corresponde a la aparición de
coilocitos. En esta etapa, el PVH está produciendo todo el
intervalo de proteínas incluyendo E2, E5, E6, E7, L1 y L2.
(3) una fase de integración viral en el genoma
celular, que desencadena el inicio de la transformación maligna, y
corresponde a NIC II y NIC III/CIS con desaparición progresiva de
los coilocitos. En esta etapa, la expresión de E2 está inhibida y
la expresión de E6 y E7 está potenciada. Entre NIC II/III y NIC
III/carcinoma cervical, el ADN viral cambia de ser episomal en las
células basales a la integración de sólo los genes E6 y E7
(células tumorales). El 85% de todos los carcinomas cervicales son
carcinomas de células escamosas relacionadas principalmente con el
serotipo PVH 16. El 10% y 5% son adenocarcinomas y carcinomas de
células escamosas, respectivamente, y ambos tipos están
relacionados principalmente con el serotipo PVH 18. Sin embargo,
existen otros PVH oncogénicos.
La solicitud de patente internacional nº WO
96/19496 da a conocer variantes de las proteínas E6 y E7 de
papilomavirus humano, particularmente proteínas de fusión de E6/E7
con una deleción en ambas proteínas E6 y E7. Estas proteínas de
fusión con deleción se dice que son inmunogénicas.
La presente invención proporciona composiciones
que comprenden una proteína E6 o E7 o de fusión E6/E7 ligada a un
asociado de fusión inmunológico que tiene epítopos de células T.
En una forma preferida de la invención, el
asociado de fusión inmunológico deriva de proteína D de
Haemophilus influenzae B. Preferiblemente, el derivado de
proteína D comprende aproximadamente el primer tercio de la
proteína, en particular aproximadamente los primeros
100-110 aminoácidos N-terminales. La
proteína D puede lipidarse (lipoproteína D). Otros asociados de
fusión inmunológicos incluyen la proteína no estructural del virus
de la gripe NS1 (hemaglutinina). Típicamente, se utilizan los 81
aminoácidos N-terminales, aunque pueden utilizarse
diferentes fragmentos a condición de que incluyan epítopos
auxiliares de T.
En consecuencia, la presente invención en una
realización preferida proporciona proteínas de fusión que
comprenden proteína D-E6 de PVH 16, proteína
D-E7 de PVH 16, proteína D-E7 de PVH
18, proteína D-E6 de PVH18 y proteína
D-E6E7 tanto de PVH16 como PVH18. La parte de
proteína D comprende preferiblemente el primer tercio de proteína
D. Se apreciará que pueden utilizarse otras proteínas E6 y E7 de
otros subtipos de PVH.
Las proteínas de la presente invención se
expresan preferiblemente en E. coli. En una realización
preferida, las proteínas se expresan con una cola de histidina que
comprende entre 5 y 9, y preferiblemente 6 residuos de histidina.
Éstas son ventajosas para ayudar a la purificación.
La proteína E7 puede portar en una realización
preferida una mutación para reducir la unión al sitio rb (producto
del gen de retinoblastoma) y eliminar por tanto cualquier capacidad
transformante potencial. Las mutaciones preferidas para E7 de PVH16
implican reemplazar Cys_{24} por glicina, o ácido
glutámico_{26} por glutamina. En una realización preferida, la
proteína E7 contiene ambas de estas mutaciones.
Las mutaciones preferidas para E7 de PVH18
implican reemplazar Cys_{27} por glicina y/o ácido
glutámico_{29} por glutamina. De nuevo, están presentes
preferiblemente ambas mutaciones.
Pueden introducirse también mutaciones sencillas
o dobles en la región p53 de E6 para eliminar cualquier capacidad
transformante potencial.
En una realización adicional de la invención, se
proporciona una proteína de fusión E6E7 de PVH ligada a un asociado
de fusión inmunológico. Es un asociado de fusión inmunológico
preferido la proteína D, más preferiblemente el primer tercio de la
proteína D.
La presente invención proporciona también un ADN
que codifica las proteínas de la presente invención. Dichas
secuencias pueden insertarse en un vector de expresión adecuado y
expresarse en un hospedador adecuado.
Puede sintetizarse una secuencia de ADN que
codifica las proteínas de la presente invención utilizando técnicas
de síntesis de ADN estándar, tales como mediante ligamiento
enzimático como se describe por D.M. Roberts et al. en
Biochemistry 1985, 24, 5090-5098,
mediante síntesis química, mediante polimerización enzimática
in vitro o mediante tecnología de PCR utilizando por ejemplo
una polimerasa termoestable, o mediante una combinación de estas
técnicas.
La polimerización enzimática de ADN puede
llevarse a cabo in vitro utilizando una ADN polimerasa tal
como la ADN polimerasa I (fragmento Klenow) en un tampón adecuado
que contiene los trifosfatos de nucleósidos dATP, dCTP, dGTP y dTTP
según sean necesarios a una temperatura de 10-37ºC,
generalmente en un volumen de 50 \mul o menor. El ligamiento
enzimático de fragmentos de ADN puede llevarse a cabo utilizando
una ADN ligasa tal como ADN ligasa T4 en un tampón apropiado, tal
como Tris 0,05 M (pH 7,4), MgCl_{2} 0,01 M, ditiotreitol 0,01 M,
espermidina 1 mM, ATP 1 mM y seroalbúmina bovina 0,1 mg/ml, a una
temperatura de 4ºC a ambiente, generalmente en un volumen de 50 ml o
menor. La síntesis química del polímero de ADN o fragmentos puede
llevarse a cabo mediante la química convencional de fosfotriéster,
fosfito o fosforamidita, utilizando técnicas en fase sólida tales
como las descritas en "Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene
Fragments - A Laboratory Manual" (ed. H.G. Gassen y A. Lang),
Verlag Chemie, Weinheim (1982), o en otras publicaciones
científicas, por ejemplo M.J. Gait, H.W.D. Mathes, M. Singh, B.S.
Sproat y R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10,
6243; B.S. Sproat y W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983,
24, 5771; M.D. Matteucci y M.H. Caruthers, Tetrahedron
Letters, 1980, 21, 719; M.D. Matteucci y M.H. Caruthers,
Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185;
S.P. Adams et al., Journal of the American Chemical
Society, 1983, 105, 661; N.D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus y
H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; y H.W.D.
Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801.
El procedimiento de la invención puede realizarse
mediante técnicas recombinantes convencionales tales como las
descritas en Maniatis et al., "Molecular Cloning - A
Laboratory Manual"; Cold Spring Harbor,
1982-1989.
En particular, el procedimiento de la invención
puede comprender las etapas de:
- i)
- preparar un vector de expresión replicable o integrador capaz, en una célula hospedadora, de expresar un polímero de ADN que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la proteína o un derivado inmunogénico de la misma;
- ii)
- transformar una célula hospedadora con dicho vector;
- iii)
- cultivar dicha célula hospedadora transformada en condiciones que permitan la expresión de dicho polímero de ADN para producir dicha proteína; y
- iv)
- recuperar dicha proteína.
El término "transformar" se utiliza en la
presente memoria para indicar la introducción de ADN extraño en una
célula hospedadora. Esto puede conseguirse por ejemplo mediante
transformación, transfección o infección con un plásmido o vector
viral apropiado utilizando, por ejemplo, técnicas convencionales
como las descritas en "Genetic Engineering"; ed. S.M. Kingsman
y A.J. Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford,
Inglaterra, 1988. El término "transformado" o
"transformante" se aplicarán en adelante en la presente memoria
a la célula hospedadora resultante que contiene y expresa al gen
extraño de interés.
Preferiblemente, el antígeno recombinante de la
invención se expresa en E. coli. La estrategia de expresión
incluye la fusión de E7, E6 o la fusión E6/E7 con el tercio
N-terminal de la proteína D de Haemophilus influenzae
B, un asociado de fusión inmunológico que proporciona epítopos de
células T auxiliares. Se inserta por ingeniería genética una cola de
polihistidina de afinidad en la terminación carboxi de la proteína
de fusión, permitiendo una purificación simplificada. Dicho
antígeno recombinante se sobreexpresa en E. coli. en forma
de proteína insoluble.
Preferiblemente, las proteínas de la invención se
coexpresan con tioredoxina en trans (TIT). Se prefiere la
coexpresión de la tioredoxina en trans frente a cis para mantener
al antígeno exento de tioredoxina sin necesidad de proteasa. La
coexpresión de tioredoxina facilita la solubilización de las
proteínas de la invención. La coexpresión de tioredoxina tiene
también un impacto significativo sobre el rendimiento de
purificación de proteína y sobre la solubilidad y calidad de la
proteína purificada.
Los vectores de expresión son nuevos y forman
también parte de la invención.
Los vectores de expresión replicables pueden
prepararse según la invención, escindiendo un vector compatible con
la célula hospedadora para proporcionar un segmento de ADN lineal
que tiene un replicón intacto, y combinando dicho segmento lineal
con una o más moléculas de ADN que, junto con dicho segmento lineal,
codifican el producto deseado, tal como el polímero de ADN que
codifica la proteína de la invención, o derivado de la misma, en
condiciones de ligamiento.
Por tanto, el polímero de ADN puede preformarse o
formarse durante la construcción del vector, si se desea.
La elección del vector se determinará en parte
por la célula hospedadora, que puede ser procariótica o eucariótica,
pero que es preferiblemente E. coli. Los vectores adecuados
incluyen plásmidos, bacteriófagos, cósmidos y virus
recombinantes.
La preparación del vector de expresión replicable
puede llevarse a cabo convencionalmente con enzimas apropiadas para
restricción, polimerización y ligamiento del ADN, mediante
procedimientos descritos en, por ejemplo, Maniatis et al.,
citado anteriormente.
La célula hospedadora recombinante se prepara,
según la invención, transformando una célula hospedadora con un
vector de expresión replicable de la invención en condiciones
transformantes. Las condiciones transformantes adecuadas son
convencionales y se describen, por ejemplo, en Maniatis et
al., citado anteriormente, o en "DNA Cloning", vol. II,
D.M. Glover ed., IRL Press Ltd., 1985.
La elección de las condiciones transformantes se
determina por la célula hospedadora. Por tanto, una bacteria
hospedadora tal como E. coli puede tratarse con una
solución de CaCl_{2} (Cohen et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. 1973, 69, 2110) o con una solución que comprende
una mezcla de RbCl, MnCl_{2}, acetato de potasio y glicerol, y
después con ácido 3-[N-morfolino]propanosulfónico,
RbCl y glicerol. Las células de mamífero en cultivo pueden
transformarse mediante coprecipitación con calcio del ADN vectorial
en las células. La invención se extiende también a una célula
hospedadora transformada con un vector de expresión replicable de la
invención.
El cultivo de la célula hospedadora transformada
en condiciones que permitan la expresión del polímero de ADN se
lleva a cabo convencionalmente, como se describe, por ejemplo, en
Maniatis et al. y "DNA Cloning", citados anteriormente.
Por tanto, preferiblemente se suministra a la célula nutriente y se
cultiva a una temperatura menor de 50ºC.
Se recupera el producto mediante procedimientos
convencionales según la célula hospedadora. Por tanto, cuando la
célula hospedadora es bacteriana, tal como E. coli, puede
lisarse física, química o enzimáticamente y aislarse el producto de
proteína del lisado resultante. Cuando la célula hospedadora es de
mamífero, el producto puede aislarse generalmente del medio
nutriente o de extractos exentos de células. Las técnicas de
aislamiento de proteína convencionales incluyen precipitación
selectiva, cromatografía de adsorción y cromatografía de afinidad,
incluyendo una columna de afinidad de anticuerpo monoclonal.
Cuando las proteínas de la presente invención se
expresan con una cola de histidina (marcaje de histidina), las
proteínas pueden purificarse fácilmente mediante cromatografía de
afinidad utilizando una columna de cromatografía de afinidad de
metal iónico (IMAC).
Puede utilizarse una segunda etapa
cromatográfica, tal como Q-Sepharose, antes o
después de la columna IMAC para proporcionar una proteína altamente
purificada.
Las proteínas de la presente invención se
proporcionan preferiblemente al menos un 80% puras, más
preferiblemente un 90% puras como se visualiza por SDS PAGE. La
proteína presenta una banda única mayoritaria cuando se analiza por
SDS PAGE en condiciones reductoras, y el análisis de transferencia
Western muestra menos de un 5% de contaminación de proteína de
célula hospedadora.
La presente invención proporciona también una
composición farmacéutica que comprende una proteína de la presente
invención en un excipiente farmacéuticamente aceptable. Una
composición de vacuna preferida comprende al menos proteína
D-E6 de PVH16 o un derivado de la misma junto con
proteína D-E7 de PVH16. Como alternativa, E6 y E7
pueden presentase en una sola molécula, preferiblemente una fusión
de proteína D-E6/E7. Dicha vacuna puede contener
opcionalmente una cualquiera o ambas proteínas E6 y E7 de PVH18,
preferiblemente en forma de una proteína de fusión proteína
D-E6 o proteína D-E7 o proteína
D-E6/E7. Las vacunas de la presente invención pueden
contener otros antígenos de PVH de PVH16 o 18. En particular, la
vacuna puede contener antígenos monoméricos L1 o L2. Como
alternativa, dichos antígenos L1 o L2 pueden presentarse juntos en
forma de una partícula viroide o la proteína L1 sola puede
presentarse en forma de una partícula viroide o estructura de
capsómero. Dichos antígenos, partículas viroides y capsómeros son
conocidos por sí mismos. Véanse por ejemplo los documentos WO
94/00152, WO 94/20137, WO 94/05792 y WO 93/02184. Pueden incluirse
proteínas tempranas adicionales tales como E2 o preferiblemente E5,
por ejemplo. La vacuna de la presente invención puede comprender
adicionalmente antígenos de otras cepas de PVH, preferiblemente de
las cepas PVH6, 11, PVH 31 ó 33.
La preparación de vacuna se describe en general
en "Vaccine Design - The subunit and adjuvant approach" (ed.
Powell y Newman), "Pharmaceutical Biotechnology" vol. 6,
Plenum Press 1995. La encapsulación con liposomas se describe por
Fullerton, patente de EE.UU. 4.235.877.
Las proteínas de la presente invención se
coadyuvan preferiblemente en la formulación de vacuna de la
invención. Los coadyuvantes preferidos incluyen una sal de aluminio
tal como gel de hidróxido de aluminio (alúmina) o fosfato de
aluminio, pero pueden ser también una sal de calcio, hierro o cinc,
o pueden ser una suspensión insoluble de tirosina acilada, o
azúcares acilados, polisacáridos derivatizados catiónica o
aniónicamente o polifosfazonas.
En la formulación de la invención se prefiere que
la composición de coadyuvante induzca una respuesta preferencial
TH1. Los sistemas coadyuvantes adecuados incluyen, por ejemplo, una
combinación de monofosforil-lípido A,
preferiblemente monofosforil-lípido A
3-des-O-acilado
(3D-MPL) junto con una sal de aluminio.
Un sistema potenciado implica la combinación de
un monofosforil-lípido A y un derivado de saponina,
particularmente la combinación de QS21 y 3D-MPL como
se da a conocer en el documento WO 94/00153, o una composición menos
reactogénica en la que el QS21 se inactiva con colesterol como se da
a conocer en el documento WO 96/33739.
Se describe una formulación coadyuvante
particularmente potente que implica QS21, 3D-MPL y
tocoferol en una emulsión de aceite en agua en el documento WO
95/17210, y es una formulación preferida.
En consecuencia, en una realización de la
presente invención se proporciona una vacuna que comprende una
proteína D (o derivado de la misma)-E6 o una
proteína D (o derivado de la misma)-E7 coadyuvada
con un monofosforil-lípido A o derivado del
mismo.
Preferiblemente, la vacuna comprende
adicionalmente una saponina, más preferiblemente QS21.
Preferiblemente, la formulación comprende
adicionalmente una emulsión de aceite en agua y tocoferol. La
presente invención proporciona también un procedimiento para
producir una formulación de vacuna que comprende mezclar una
proteína de la presente invención junto con un excipiente
farmacéuticamente aceptable, tal como
3D-MPL.
3D-MPL.
La invención se describirá con más detalle con
referencia a los siguientes ejemplos:
a) El plásmido pMG MCS prot D1/3 (=pRIT14589) es
un derivado de pMG81 (descrito en la solicitud de patente del R.U.
nº 9513261.9 publicada como WO 97/01640) en el que los codones
4-81 de la región de codificación de NS1 de la gripe
se reemplazaron por los codones correspondientes a los residuos
Ser20\rightarrowThr127 de proteína D madura de Haemophilus
influenzae de cepa 772, biotipo 2 (H. Janson et al.,
1991, Infection and Immunity, enero. pág.
119-125). La secuencia de protD1/3 es seguida por
un sitio de clonación múltiple (11 residuos) y una región de
codificación de una cola de histidina C-terminal (6
His). Este plásmido se utiliza para expresar la proteína de fusión
D1/3-E7-His.
b) Las secuencias E6 y E7 de PVH genómico de tipo
PVH16 (véase Dorf et al., Virology 1985, 145, pág.
181-185) se amplificaron del genoma de PVH16
completo clonado en pBR322 (obtenido del Deutsches
\hbox{Krebsforschungszentrum}(DKFZ), Referenzzentrum für human pathogen Papillomaviruses - D 69120 - Heidelberg) y se subclonaron en pUC19 proporcionando TCA 301 (=pRIT14462).
Se amplifican las secuencias nucleotídidicas
correspondientes a los aminoácidos 1\rightarrow98 de la proteína
E7 de pRIT14462. Durante la reacción en cadena con polimerasa, se
generaron sitios de restricción NcoI y SpeI en los extremos 5' y 3'
de las secuencias de E7, permitiendo la inserción en los mismos
sitios del plásmido pMGMCS prot D/13, proporcionando el plásmido
TCA 308 (=pRIT14501). Se secuenció el inserto para verificar que no
se había generado ninguna modificación durante la reacción en
cadena con polimerasa. La secuencia para la fusión proteína
D1/3-E7-His (PVH16) se describe en
la figura 1.
Se introdujo el plásmido pRIT14501 en AR58 de
E. coli (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad.
Sci., 82: 88), un lisógeno \lambda defectivo que contiene un
represor termosensible del promotor pL \lambda.
Se hicieron crecer células AR58 transformadas con
plásmido pRIT14501 en 100 ml de medio LB suplementado con 50
\mug/ml de canamicina a 30ºC. Durante la fase de crecimiento
logarítmico, se cambiaron las bacterias a 39ºC para inactivar el
represor \lambda y activar la síntesis de proteína
D1/3-E7-His. La incubación a 39ºC se
continuó durante 4 horas. Se sedimentaron las bacterias y se
almacenaron a -20ºC.
Se descongelan células congeladas y se
resuspenden en 10 ml de tampón PBS. Se rompen las células en una
prensa French de celda a presión SLM Aminco a 138 MPa (tres
pasadas). Se centrifuga el extracto a 16.000 g durante 30 minutos a
4ºC.
Después de la centrifugación de los extractos
descrita anteriormente, se analizaron alícuotas del sobrenadante y
sedimento mediante electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida y transferencia Western. Se
visualizó una banda mayoritaria de aproximadamente 33 kDa localizada
en la fracción de sedimento mediante geles teñidos con Coomasie, y
se identificó en transferencias Western mediante anticuerpo
policlonal de conejo anti-proteína D y mediante
conjugado Ni-NTA acoplado a fosfatasa alcalina
intestinal bovina (nº de catálogo Qiagen 34510), que detecta la cola
de histidina accesible. El nivel de expresión representa
aproximadamente un 5% de la proteína total como se muestra en un gel
de SDS-poliacrilamida teñido con Coomasie.
Se centrifuga un litro de cultivo de bacterias
que expresan proteína D1/3-E7-His a
11.300 g durante 30 min a 4ºC, y se mantiene el sedimento celular a
-80ºC hasta tratamiento posterior. Después de la resuspensión en 75
ml de tampón PBS, se rompen las células de E. coli en una
prensa French de celda a presión (SLM Aminco®) a 138 MPa. Se
sedimentan las células lisadas mediante centrifugación a 17.000 g
durante 30 minutos. El sedimento, que contiene la proteína
D1/3-E7-His, se lava una vez con 30
ml de NaCl 2 M, fosfato 50 mM, pH 7,5, y después dos veces con 30 ml
de fosfato 50 mM pH 7,5. Las proteínas se solubilizan después de 2
horas de incubación del sedimento en 30 ml de urea 8 M, fosfato 50
mM, pH 7,5 a TA. Se eliminan los residuos celulares mediante
centrifugación de 15 min a 17.000 g, 4ºC. Se lleva a cabo la
purificación de proteína a TA, se aplican 15 ml de proteína
solubilizada a 5 ml de resina Ni2+NTA (Qiagen) (columna Pharmacia
XK 16/20) preequilibrada con urea 8 M, fosfato 50 mM, pH 7,5 a un
caudal de 0,2 ml/min. Se lava la columna con el mismo tampón hasta
que la absorbancia a 280 nm alcanza la línea base. Se eluye la
proteína con un gradiente de imidazol 0-600 mM en
urea 8 M, fosfato 50 mM, pH 7,5. Se lleva el caudal de estas dos
etapas a 1 ml/min. Se analizan las fracciones eluidas mediante
electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y
mediante transferencia Western. La prot
D1/3-E7-His, visualizada mediante
tinción con azul de Coomasie, mediante un anticuerpo policlonal
anti-proteína D o mediante un anticuerpo monoclonal
anti-E7, aparece en forma de una banda mayoritaria
de aproximadamente 32 kDa y se estima como proteína pura a un 95%.
No se observan contaminantes de E. coli analizando con un
anticuerpo policlonal anti-proteínas de
E. coli.
E. coli.
Para eliminar la urea, se dializan 9 ml de
antígeno purificado a 1,33 mg/ml (Bradford) frente a 3 litros de
tampón PBS durante una noche a TA, seguido de una diálisis de 4
horas frente a tampón PBS reciente. Se recupera un 80% de proteína
exenta de urea en forma de proteína soluble. Para eliminar las
endotoxinas contaminantes, se incuban 6 ml de proteína dializada con
1 ml de gel de polimixina Affiprep (Biorad) durante 3 horas a 4ºC
con agitación suave. Se realiza una segunda incubación con 500
\mul de resina de polimixina Affiprep para minimizar el nivel de
endotoxina a 8,8 UE/\mug de proteína. Después de filtración
estéril en un dispositivo de filtrado de 0,22 \mum (Millex 0,22
GV, Millipore), se ensaya la estabilidad de la prot
D1/3-E7-His a 0,665 mg/ml. El
análisis de SDS-PAGE no mostró evolución de la
proteína después de 7 días de incubación a -20ºC, 4ºC, TA o
37ºC.
a) El plásmido pMG MCS prot D1/3 (= pRIT14589) es
un derivado de pMG81 (descrito en el documento WO 97/01640) en el
que los codones 4-81 de la región de codificación de
NS1 de la gripe se reemplazaron por los codones correspondientes a
los residuos Ser20\rightarrowThr127 de la proteína D madura de
Haemophilus influenzae cepa 772, biotipo 2 (H. Janson et
al., 1991, Infection and Immunity, enero. pág.
119-125). La secuencia de la
prot-D1/3 es seguida por un sitio de clonación
múltiple (11 residuos) y una región de codificación de una cola de
histidina C-terminal (6 His). Este plásmido se
utiliza para expresar la proteína de fusión
D1/3-E6-His.
b) Se amplificaron las secuencias E6 y E7 de PVH
genómico de tipo PVH16 (Seedorf et al., Virology 1985,
145, pág. 181-185) a partir del genoma de PVH16
completo clonado en pBR322 (obtenido del Deutsches
Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum für human pathogen
Papillomaviruses - D 69120 - Heidelberg) y se subclonaron en pUC19
proporcionando TCA 301 (=pRT14462).
Las secuencias nucleotídicas correspondientes a
los aminoácidos 1\rightarrow151 de la proteína E6 se amplificaron
a partir de pRIT14462. Durante la reacción en cadena con
polimerasa, se generaron sitios de restricción NcoI y SpeI en los
extremos 5' y 3' de las secuencias E6, permitiendo la inserción en
los mismos sitios del plásmido pMGMCS prot D1/3, proporcionando el
plásmido TCA 307 (= pRIT14497) (véase la figura 2). Se secuenció el
inserto para verificar que no se había generado ninguna
modificación durante la reacción en cadena con polimerasa. Se
describe la secuencia de codificación para la fusión
proteína-D1/3-E6-His
en la figura 3.
Se introdujo el plásmido pRIT14497 en AR58 de
E. coli (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad.
Sci. 82: 88), un lisógeno \lambda defectivo que contiene un
represor termosensible del promotor pL \lambda.
Se hicieron crecer células AR58 transformadas con
plásmido pRIT14497 en 100 ml de medio LB suplementado con 50
\mug/ml de canamicina a 30ºC. Durante la fase de crecimiento
logarítmico, las bacterias se cambiaron a 39ºC para inactivar el
represor \lambda y activar la síntesis de proteína
D1/3-E6-His. La incubación a 39ºC
se continuó durante 4 horas. Se sedimentaron las bacterias y se
almacenaron a -20ºC.
Se descongelan células congeladas y se
resuspenden en 10 ml de tampón PBS. Se rompen las células en una
prensa French de celda a presión SLM Aminco a 138 MPa (tres
pasadas). Se centrifuga el extracto a 16.000 g durante 30 minutos a
4ºC.
Después de la centrifugación de los extractos
descrita anteriormente, se analizaron alícuotas de sobrenadante y
sedimento mediante electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida y transferencia Western.
Se visualizó una banda mayoritaria de
aproximadamente 32 kDa, localizada en la fracción de sedimento,
mediante geles teñidos con Coomasie y se identificó en
transferencias Western mediante anticuerpo policlonal de conejo
anti-proteína D y conjugado Ni-NTA
acoplado con fosfatasa alcalina intestinal bovina (nº de catálogo
Qiagen 34510), que detecta la cola de histidina accesible. El nivel
de expresión representa aproximadamente un 5% de la proteína
total.
De forma análoga a la expresión de la prot
D1/3-E7-His de PVH18 (ejemplo XIII),
se transformó una cepa AR58 de E. coli con un plásmido que
codifica tioredoxina y proteína
D1/3-E7-His (PVH16).
Se expresó antígeno recombinante prot
D1/3-E6 de PVH16 en E. coli (AR58). La
estrategia de expresión incluía la fusión de E6 con la porción del
tercio N-terminal de la proteína D de Haemophilus
influenzae, un asociado de fusión inmunlógico que proporciona
epítopos de células T auxiliares. Se insertó por ingeniería
genérica una cola de afinidad de polihistidina en la terminación
carboxi de la proteína de fusión. Se sobreexpresó el antígeno
recombinante en E. coli en forma de proteínas
insolubles.
La solubilización del antígeno requirió agentes
desnaturalizantes. En ausencia de agente desnaturalizante, precipitó
prot D1/3-E6-His a pH neutro. Para
evitar los problemas de solubilidad, se llevó a cabo la coexpresión
de estas proteínas con tioredoxina en trans (TIT), un asociado de
plegamiento.
Las expresiones bacterianas se realizan en medio
LB en presencia de 0,05 mg/ml de canamicina a 30ºC más 0,2 mg/ml de
ampicilina cuando se coexpresa la tioredoxina. La expresión de
proteína recombinante se induce térmicamente transfiriendo las
células a 42ºC cuando se alcanza una densidad óptica celular
(DO_{600 nm}) de 0,4. La expresión de proteína se mantiene
durante 4 horas. La purificación se llevó a cabo según el siguiente
protocolo.
- Sedimento de cultivo celular
- DO_{600}60 Pefabloc 1 mM, NaCl 2 M, PBS, pH 7,4 (tampón A)
- Disruptor de prensa French
- Tres pasadas 138 Mpa
- Centrifugación
- 17.000 g, 30 min, 4ºC
- Lavados de sedimento
- NaCl 2 M, PBS, pH 7,5 (tampón B) x 1 PBS pH 7,4 (tampón C) \hskip1.6cm x 2
- Centrifugación
- 17.000 g, 30 min, 4ºC
- Solubilización de sedimento
- cloruro de guanidina 6 M, PO4 20 mM, pH 7,0 (tampón D), durante una noche a 4ºC
- Centrifugación
- 17.000 g, 30 min, 4ºC
- Sobrenadante en IMAC
- Equilibrado: Cloruro de guanidina 6 M, PO4 20 mM, pH 7,0 (Tampón D). Elución: etapas de imidazol (0,025 M, 0,1 M, 0,5 M) en urea 8 M, PO4 20 mM, pH 7,0
- Polimixina Affiprep
- Urea 8 M, PO4 20 mM, pH 7,0 (tampón E) 2 h a TA
\newpage
- Diálisis
- Urea 4 M, arginina 0,5 M, NaCl 150 mM, PO4 10 mM, pH 6,8 (tampón I) Urea 2 M, arginina 0,5 M, NaCl 150 mM, PO4 10 mM, pH 6,8 (tampón J) Urea 0 M, arginina 0,5 M, NaCl 150 mM, PO4 10 mM, pH 6,8 (tampón K)
Las células se rompen eficazmente mediante
homogeneización a alta presión utilizando un dispositivo de celda a
presión French. Se extrae el antígeno con alta concentración de
desnaturalizante proteico. Esta primera etapa abre la pared de la
célula bacteriana y extrae dicho antígeno de la fracción bacteriana
insoluble. Se llevó a cabo la siguiente purificación en un cultivo
de 4 l.
A. PBS/NaCl 2 M/Pefabloc 1 mM
B. PBS/NaCl 2 M
C. PBS: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM,
NaH_{2}PO_{4} 8,1 mM, KH_{2}PO_{4} 1,47 mM, pH 7,4
D: cloruro de guanidina 6 M, PO4 20 mM
(NaH_{2}PO_{4} (2H_{2}O)/K_{2}HPO_{4} (3H_{2}O)), pH
7,0
El material de partida es 10 matraces de 400 ml
de cultivo cada uno.
Se suspende la pasta celular a DO_{600} 60 en
tampón A (240 ml de tampón A en este caso), antes de la lisis
celular mediante tres pasadas a través de un disruptor de prensa
French (138 MPa). Se sedimentan las células lisadas durante 30 min a
15.000 g a 4ºC. Se lava una vez el sedimento de células bacterianas
que contiene la proteína recombinante con 240 ml de tampón B,
después dos veces con 240 ml de tampón C.
Se solubiliza la prot
D-E6-His (TIT) mediante 240 ml de
tampón D durante una noche a 4ºC en una rueda giratoria. Se
sedimentan los residuos celulares durante 30 min a 15.000 g a 4ºC.
Se almacena el sobrenadante (230 ml) a -20ºC. Se somete después el
material a cromatografía IMAC.
Se une el ligando quelante NTA (ácido
nitrilotriacético) a un soporte de agarosa (Qiagen). Se carga el
ligando NTA con ión metálico níquel, con el que interacciona a
través de 4 de los 6 sitios de coordinación del níquel. Los dos
sitios de coordinación restantes del níquel interaccionan
fuertemente con los residuos de histidina de la proteína marcada
con 6 His. Se consigue la elución mediante competición con
imidazol, que se une a Ni-NTA y desplaza al antígeno
marcado.
Se utilizó agarosa Ni-NTA Qiagen
(número de catálogo: 30250).
D: cloruro de guanidina 6 M, PO4 20 mM
(NaH_{2}PO_{4} (2H_{2}O)/K_{2}HPO_{4} (3H_{2}O)), pH
7,0
E: urea 8 M, PO4 20 mM (NaH_{2}PO_{4}
(2H_{2}O)/K_{2}HPO_{4} (3H_{2}O)), pH 7,0
F: E + imidazol 0,025 M
G: E + imidazol 0,1 M
H: E + imidazol 0,5 M
NaOH 0,5 M
Agua desionizada
NaN_{3} al 0,02%
a) Se empaqueta la resina (15 ml de resina/230 ml
de muestra) y se equilibra en 10 volúmenes de columna (VC) de
tampón D a 15 cm h^{-1}.
b) Se inyecta el sobrenadante de la fracción
solubilizada en la columna a 15 cm h^{-1}.
c) Se lava la columna a 15 cm h^{-1} con tampón
D hasta que la DO280 nm vuelve a la línea base.
d) Se lava la columna con 2 VC de tampón E a 15
cm h^{-1}. Se recupera la fracción de lavado.
e) Se eluye primero la columna con 5 VC de tampón
F. Se elimina el contaminante mayoritario de 25 kDa.
f) Se eluye después la columna con 2 VC de tampón
G.
g) Se eluye finalmente la columna con 3 VC de
tampón H. Elución del antígeno.
Se combinan las fracciones positivas de antígeno
(30 ml).
Se retira la endotoxina mediante cromatografía
Affiprep.
El soporte de polimixina
Affi-Prep® consiste en polimixina B de pureza USP
acoplada a la matriz Affi-Prep®. Debido a su alta
afinidad por el resto de lípido A de las endotoxinas, la polimixina
B se une a moléculas de endotoxina con alta capacidad y
selectividad.
E: Urea 8 M, PO4 20 mM (NaH_{2}PO_{4}
(2H_{2}O)/K_{2}HPO_{4} (3H_{2}O)), pH 7,0 (apirogénico)
NaOH 0,5 M
Agua apirogénica desionizada
1) Se lava la resina de polimixina
Affi-Prep® en 10 volúmenes de NaOH 0,1 M, seguido
de 10 volúmenes de agua exenta de pirógenos.
2) Se equilibra la resina en 10 volúmenes de
tampón E.
3) Se incuban 15 ml (media combinación) de
muestra eluida de IMAC con 3 ml de resina polimixina
Affi-Prep® en modo por cargas.
4) Se prosigue la incubación durante 4 horas a
temperatura ambiente o durante una noche a 4ºC en una rueda
giratoria.
5) Se centrifuga la muestra durante 10 min a 2000
g (Beckman GS-6R).
6) Se recoge el sobrenadante que contiene el
antígeno y se somete a ensayos de endotoxinas y proteínas.
7) Se desecha la resina.
Las moléculas pequeñas se difunden a través de
una membrana semipermeable, mientras que las moléculas grandes se
retienen. El proceso de diálisis es impulsado por la diferencia de
concentración de los solutos en los dos lados de la membrana. Se
introduce nueva solución tampón hasta que se iguala la composición
de tampón en cada lado.
I: Urea 4 M, arginina 0,5 M, NaCl 0,15 M, PO4
10mM (NaH_{2}PO_{4} (2H_{2}O)/K_{2}HPO_{4} (3H_{2}O)),
pH 6,8
J: Urea 2 M, arginina 0,5 M, NaCl 0,15 M, PO4 10
mM (NaH_{2}PO_{4} (2H_{2}O)/K_{2}HPO_{4} (3H_{2}O)), pH
6,8
K: Urea 0 M, arginina 0,5 M, NaCl 0,15 M, PO4 10
mM (NaH_{2}PO_{4} (2H_{2}O)/K_{2}HPO_{4} (3H_{2}O)), pH
6,8.
1) se introduce la muestra (15 ml) en un tubo de
diálisis (20,4 mm de diámetro y 6 cm de altura),
2) se dispone el tubo de diálisis en un cilindro
de 2 litros que contiene tampón I con agitación a 4ºC durante 2
horas,
3) se dispone el tubo de diálisis en un cilindro
de 2 litros (con agitación) que contiene tampón J a 4ºC durante 2
horas,
4) se dispone el tubo de diálisis en un cilindro
de 2 litros que contiene tampón K (con agitación) a 4ºC durante una
noche. Se cambia el tampón y se prosigue la diálisis 2 horas más a
4ºC.
Millipore Sterile Millex-GV 0,22
\mum, 13 mm. Número de catálogo: SLGV1030S.
Se realizan todas las etapas a temperatura
ambiente (TA 22ºC), el antígeno parece estable.
Se filtra la solución de antígeno a través de un
filtro de 0,2 \mum para evitar cualquier crecimiento bacteriano.
Se mantiene el antígeno a -20ºC en viales Nunc.
La proteína
D1/3-E6-His se caracteriza de la
manera siguiente:
La proteína
D1/3-E6-His es un péptido de 273
aminoácidos de longitud con 112 aminoácidos que proceden de la parte
de proteína D. La proteína
D1/3-E6-His tiene un peso molecular
medio teórico de 32 kDa y migra en SDS-PAGE en forma
de una proteína de 33 kDa. El punto isoeléctrico teórico de la
proteína D1/3-E6-His es 8,17.
La proteína viral E6 es una proteína básica que
contiene 14 residuos de cisteína, ocho de ellos (Cys 30, 33, 63, 66
y Cys 103, 106, 136, 139) están implicados en dos motivos de unión a
cinc C-terminales.
La proteína
D1/3-E6-His se expresa en forma de
proteína insoluble en la cepa AR58 de E. coli con tioredoxina
en trans, un asociado de plegamiento. El cultivo celular se produce
en un matraz de 400 ml.
Se obtienen 5,4 mg de proteína pura al 95% por
litro de cultivo.
a) El plásmido pMG MCS prot D1/3 (=pRIT14589) es
un derivado de pMG81 (descrito anteriormente) en el que los codones
4-81 de la región de codificación de NS1 de la gripe
se reemplazaron por los codones correspondientes a los residuos
Ser20\rightarrowThr127 de proteína D madura de Haemophilus
influenzae cepa 772, biotipo 2 (H. Janson et al.,
Infection and Immunity, enero. pág.
119-125). La secuencia de prot-D1/3
es seguida por un sitio múltiple de clonación (11 residuos) y una
región de codificación de una cola de histidina
C-terminal (6 His). Este plásmido se utiliza para
expresar la fusión proteína
D1/3-E6E7-His.
b) las secuencias E6 y E7 de PVH genómico de tipo
PVH16 (Seedorf et al., Virology 1985, 145, pág.
181-185) se amplificaron del genoma de PVH16
completo clonado en pBR322 (obtenido del Deutsches
Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum für human pathogen
Papillomaviruses - D 69120 - Heidelberg) y se subclonaron en pUC19
proporcionando TCA 301 (=pRT14462).
c) Se modificaron las secuencias de codificación
de E6 y E7 en TCA301 (=pRIT14462) con un adaptador de
oligonucleótidos sintéticos (insertado entre los sitios Afl III y
Nsi I), introduciendo una deleción de 5 nucleótidos entre los genes
E6 y E7 para retirar el codón de paro de E6 y crear secuencias de
codificación de E6 y E7 condensadas en el plásmido TCA309
(=pRIT14556), véase la figura 4.
Se amplifican las secuencias nucleotídicas
correspondientes a los aminoácidos 1\rightarrow249 de la proteína
condensada E6E7 de pRIT14556. Durante la reacción en cadena con
polimerasa, se generaron sitios de restricción NcoI y SpeI en los
extremos 5' y 3' de las secuencias de E6E7, permitiendo la
inserción en los mismos sitios del plásmido pMGMCS prot D/13,
proporcionando el plásmido TCA 311 (=pRIT14512) (véase la figura
5). Se secuenció el inserto para verificar que no se había generado
ninguna modificación durante la reacción en cadena con polimerasa.
La secuencia de codificación para la fusión proteína
D1/3-His se describe en la figura 6.
Se introdujo el plásmido pRIT14512 en AR58 de
E. coli (Mott et al., 1985, Prot. Natl. Acad.
Sci. , 82: 88), un lisógeno \lambda defectivo que contiene un
represor termosensible del promotor pL \lambda.
Se hicieron crecer células AR58 transformadas con
el plásmido pRIT14512 en 100 ml de medio LB suplementado con
50 \mug/ml de canamicina a 30ºC. Durante la fase de crecimiento
logarítmico, las bacterias se cambiaron a 39ºC para inactivar el
represor \lambda y activar la síntesis de proteína
D1/3-E6E7-His. La incubación a 39ºC
se continuó durante 4 horas. Se sedimentaron las bacterias y se
almacenaron a -20ºC.
Se descongelan células congeladas y se
resuspenden en 10 ml de tampón PBS. Se rompen las células en una
prensa French de celda a presión SLM Aminco a 138 MPa (tres
pasadas). Se centrifuga el extracto a 16.000 g durante 30 minutos a
4ºC.
\newpage
Después de la centrifugación de los extractos
descrita anteriormente, se analizaron las alícuotas de sobrenadante
y sedimento mediante electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida y transferencia Western.
Se visualizó una banda mayoritaria de
aproximadamente 48 kDa, localizada en la fracción de sedimento,
mediante geles teñidos con Coomasie y se identificó en
transferencias Western mediante anticuerpo policlonal de conejo
anti-proteína D y mediante conjugado
Ni-NTA acoplado a fosfatasa alcalina intestinal
bovina (nº de catálogo Qiagen 34510), que detecta la cola de
histidina accesible. El nivel de expresión representa
aproximadamente un 1% de la proteína total.
De forma análoga, se expresó la proteína de
fusión lipo D1/3-E6E7 de PVH16 en E. coli en
presencia de tioredoxina.
La terminación N de la preproteína (388
aa) contiene residuos de MDP seguidos de 16 aminoácidos del péptido
señal de lipoproteína D (de Haemophilus influenzae), que se
escinden in vivo proporcionando la proteína madura (370 aa).
La porción de lipoproteína (aa 1 a 127) es seguida por las proteínas
E6 y E7 condensadas. La terminación C de la proteína se prolonga
con TDGHHHHHH.
Se purificó la proteína mediante el siguiente
protocolo:
Se suspende pasta celular a DO_{600} 60 en NaCl
2 M, fosfato 20 mM (NaH_{2}PO_{4}/K_{2}HPO_{4}), pH 7,5 en
presencia de Pefabloc 1 mM como inhibidor de proteasa antes de la
lisis celular mediante tres pasadas a través de un disruptor de
prensa French (138 MPa). Las células lisadas se sedimentan durante
30 min a 15.000 g a 4ºC. Para reducir el nivel de endotoxina, se
lava el sedimento celular bacteriano que contiene la proteína
recombinante dos veces con urea 4 M, NaCl 2 M, fosfato 20 mM, pH
7,5, una vez con 2% de Emphigen BB, fosfato 20 mM, pH 7,5 y
finalmente dos veces con tampón fosfato 20 mM a pH 7,0 para
eliminar las trazas de detergente (cada lavado se realiza en el
mismo volumen utilizado para la suspensión celular). Se solubiliza
la lipoprot. D1/3-E6E7-His (TIT)
(en el mismo volumen utilizado para la suspensión celular) mediante
urea 8 M en \beta-mercaptoetanol 0,2 M
(=\beta-MeOH), PO4 20 mM, pH 12 durante una noche
a 4ºC, seguido de una incubación de dos horas a TA frente al mismo
tampón. Se sedimentan los residuos celulares durante 30 min a 15.000
g a 4ºC. Se mantiene el sobrenadante a -20ºC.
Se descongelan 225 ml de muestra congelada a
temperatura ambiente en un baño de agua fría y se aplican a una
columna de Q-Sepharose de flujo rápido (Pharmacia,
XK 26/20) preequilibrada con urea 8 M, \betaMeOH 0,2 M, PO4 20 mM,
pH 12 (30 ml resina/225 ml sobrenadante) a 45 cm/h. Se lava la
columna con urea 8 M, \betaMeOH 0,2 M, PO4 20 mM, pH 12, hasta que
la DO280 alcanza la línea base, seguido de un segundo lavado en urea
8 M, fosfato 20 mM, pH 12 (en 2 volúmenes de columna). La elución se
realiza con etapas de NaCl (NaCl 0,1 M, 0,25 M, 0,5 M, cada etapa en
aproximadamente 2 volúmenes de columna) en urea 8 M, fosfato 20 mM,
pH 12, a 45 cm/h. Se combinan las fracciones eluidas de NaCl 0,5
M.
Se combinan las fracciones eluidas de NaCl 0,5 M
de la etapa de Q-Sepharose y se dializan frente a
NaCl 0,2 M, urea 8 M, fosfato 20 mM, pH 10 antes de cargarlas en una
columna de Ni2+NTA (Qiagen) (XK 26/20, Pharmacia) preequilibrada con
urea 8 M, PO4 20 mM, pH 12 (30 ml resina/61 ml muestra) a 5,6 cm/h.
Se lava la columna con urea 8 M, PO4 20 mM, pH 12 hasta que se
alcanza la línea base y después con urea 8 M, PO4 20 mM, pH 10. Se
eluye el antígeno mediante etapas de imidazol (imidazol 0,025 M,
0,05 M, 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,5 M, cada etapa en dos volúmenes de
columna) en urea 8 M, PO4 20 mM, pH 10 a 45 cm/h. Se combinan las
fracciones eluidas de imidazol 0,05 M.
Se concentra la muestra de IMAC aproximadamente 5
veces (hasta 0,407 mg/ml) en una membrana Filtron Omega de 5 kDa en
una celda agitada de AMICON a TA.
Se dializa la muestra concentrada a TA frente a
etapas de concentración decreciente de urea (urea 4 M, 2 M) en
arginina 0,5 M, NaCl 150 mM, PO4 10 mM, pH 6,8. La última diálisis
frente a arginina 0,5 M, NaCl 150 mM, PO4 10 mM, pH 6,8 se realiza a
4ºC.
La etapa de IMAC es capaz de eliminar un
contaminante de 32 kDa a imidazol 0,025 M, que eluyó también con
algo de antígeno. El antígeno eluido con imidazol 0,05 M se estima
puro al 90% por tinción con azul de Coomasie de
SDS-PAGE. Después de estas dos etapas de
purificación, la muestra está exenta de contaminantes de E.
coli. El análisis de transferencia Western utilizando
anticuerpos específicos de antígeno de terminación N y/o C muestra
un patrón heterogéneo de bandas con PM mayor y menor que la proteína
completa. Este patrón sugiere la presencia de agregados y proteína
procesada incompletamente y/o degradada, copurificados con la
proteína completa.
a)- Plásmido pRIT14501 (=TCA 308) que codifica la
fusión protD1/3-E7-His
b)- Plásmido LITMUS 28 (New England Biolabs, nº
de cat. 306-28), un vector de clonación derivado de
pUC.
c)- Plásmido pMG MCS ProtD1/3 (pRIT14589), un
derivado de pMG81 (descrito anteriormente) en el que los codones
4-81 de la región de codificación de NS1 de la gripe
se reemplazaron por los codones correspondientes a los residuos
Ser20\rightarrowThr127 de la proteína D madura de Haemophilus
influenzae cepa 772, biotipo 2 (H. Janson et al., 1991,
Infection and Immunity, enero. pág.
119-125). La secuencia de Prot-D1/3
es seguida por un sitio de clonación múltiple (11 residuos) y una
región de codificación para una cola de histidina
C-terminal (6 His).
Se subclonó el fragmento
NcoI-XbaI de pRIT14501 (=TCA 308) que porta la
secuencia de codificación del gen E7 de PVH16, prolongada con una
cola de His, en un vector intermedio Litmus 28 útil para
mutagénesis, proporcionando pRIT14909 (=TCA337). Se eligieron dobles
mutaciones cys24\rightarrowgly (Edmonds y Vousden, J.
Virology 63: 2650 (1989) y glu26\rightarrowgln (Phelps et
al., J. Virology 66: 2418-2427 (1992)
para deteriorar la unión al producto antioncogénico del gen de
retinoblastoma (pRB). La introducción de mutaciones en el gen E7 se
realizó con el kit "Quick Change Site directed Mutagenesis"
(nº de cat. Stratagene 200518), proporcionando el plásmido
pRIT14681 (=TCA 343). Después de la verificación de la presencia de
mutaciones y de la integridad del gen E7 completo mediante
secuenciación, se introdujo el gen E7 mutado en el vector pRIT14589
(=pMG MCS prot D1/3), proporcionando el plásmido pRIT14733 (=TA
347) (Figura 7).
La secuencia para la fusión proteína
D1/3-E7 mutada
(cys24\rightarrowgly,glu26\rightarrowgln)-His se
describe en la figura 8.
Se introdujo el plásmido pRIT14733 en AR58 de
E. coli (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad.
Sci., 82: 88), un lisógeno \lambda defectivo que contiene un
represor termosensible del promotor pL \lambda, proporcionando la
cepa B1002, mediante selección de transformantes resistentes a la
canamicina.
Se hicieron crecer células AR58 transformadas con
plásmido pRIT14733 (cepa B1002) a 30ºC en 100 ml de medio LB
suplementado con 50 \mug/ml de canamicina. Durante la fase de
crecimiento logarítmico, las bacterias se cambiaron a 39ºC para
inactivar el represor \lambda y activar la síntesis de proteína
D1/3-E7 mutada-His/PVH16. La
incubación a 39ºC se continuó durante 4 horas. Las bacterias se
sedimentaron y se congelaron a -20ºC.
Se descongelaron células congeladas y se
resuspendieron en 10 ml de tampón PBS. Se lisaron las células en una
prensa French de celda a presión SLM Aminco a 138 MPa (tres
pasadas). Se centrifugó el extracto a 16.000 g durante 30 minutos a
4ºC.
Después de la centrifugación de los extractos
descrita anteriormente, se analizaron alícuotas de sobrenadante y
sedimento mediante electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida y transferencia Western. Se
visualizó una banda mayoritaria de aproximadamente 33 kDa,
localizada en la fracción de sedimento, mediante geles teñidos con
Coomasie, y se identificó en transferencias Western mediante
anticuerpo policlonal de conejo 22J 70 anti-proteína
D, mediante anticuerpo monoclonal anti-E7/PVH16 de
Zymed y mediante conjugado Ni-NTA acoplado a
fosfatasa alcalina intestinal bovina (nº de cat. Qiagen 34510), que
detecta la cola de histidina accesible. El nivel de expresión
representa aproximadamente 3 a 5% de la proteína total.
Se separaron las células B1002 del caldo de
cultivo mediante centrifugación. Las células B1002 concentradas se
almacenaron a -65ºC.
Se descongelaron células B1002 concentradas
congeladas y se resuspendieron en un tampón de disrupción celular a
+4ºC (véase la Tabla 1) hasta una densidad óptica final DO_{650}
de 60 (correspondiente a una concentración celular de
aproximadamente 25 g de DCW l^{-1}).
Se rompieron las células mediante dos pasadas a
1000 bar a través de un homogeneizador a alta presión (Rannie). Se
recogió la suspensión de células rotas en un matraz mantenido a
4ºC.
Tampón de disrupción celular: Na_{2}HPO_{4}
(0,02 N), NaCl (2 M) pH ajustado a 7,5 con HCl 3 N (Merck).
Se cargan 2 l de suspensión de células rotas (DO
60) en el DMF®, un sistema de filtración dinámica de PALL equipado
con una membrana de corte de 0,2 \mum.
La concentración de 2 l a 1 l proporciona la
muestra PCC1,
el lavado a volumen constante con 3 volúmenes (3
l) de tampón Empigen-EDTA (concentración de EDTA
1,86 g, Empigen (al 30%) 3,33 ml, PO_{4}^{3-} 0,5 M, 40,00 ml)
proporcionó la muestra PD1,
la concentración de 1 l a 300 ml proporcionó la
muestra PCC2,
el lavado a volumen constante con 10 volúmenes (3
l) de tampón Empigen (concentración en l^{-1}: Empigen al 30%,
3,33 ml, PO_{4}^{3-} 0,5 M, 40 ml), pH 7,5, proporcionó la
muestra PD2,
solubilización de la proteína mediante la adición
del mismo volumen (300 ml) de tampón clorhidrato de guanidina 8 M
(concentración en l^{-1} de Gu\cdotHCl 764 g; Empigen al 30%,
3,33 ml, PO_{4}^{3-} 0,5 M, 40 ml), pH 7,5,
recuperación de la proteína: recogida del
permeado, muestra P3, durante la concentración al volumen
inicial (300 ml) y
diafiltración con 3 volúmenes de tampón de
clorhidrato de guanidina 4 M (concentración en l^{-1}:
Gu\cdotHCl 328,12 g, Empigen (30%), 3,33 ml de PO_{4}^{3-}
0,5 M, 40,00 ml) pH 7,5.
Todas estas etapas se realizan en una sala fría
(2-8ºC), con el pH ajustado con PO_{4}^{3-} 0,5
M.
La fracción P3 se almacena a -20ºC esperando a la
siguiente etapa de purificación.
Se descongela la fracción P3 y se inyecta en una
columna de Sepharose FFF quelante de Zn empaquetada y
equilibrada.
Después de ello, la columna
se lava con aproximadamente 3 volúmenes de tampón
de clorhidrato de guanidina 4 M (véase anteriormente), muestra
Zn-FT,
se lava con aproximadamente 5 volúmenes de tampón
de urea 4 M (concentración en l^{-1}: urea 240,24 g, empigen 3,33
ml, PO_{4}^{3-} 0,5 M, 40,00 ml), muestra
Zn-W,
se eluye con aproximadamente 3 volúmenes de
tampón de urea 4 M-imidazol 20 mM (concentración en
l^{-1}:urea 240,24 g, Empigen (al 30%) 3,33 ml, imidazol (1,36 g),
PO_{4}^{3-} 0,5 M, 40,00 ml, pH 7,5) como anteriormente, pero
la concentración en l^{-1} de imidazol es de 34,04 g, muestra
Zn-20,
se eluye con urea 4 M-imidazol
500 mM hasta el final del pico UV, muestra
Zn-500
se lava la columna con EDTA 50 mM y NaOH 0,5 M.
Se almacena el eluido de Sepharose quelante de Zn
(Zn-500) a entre 2-8ºC antes de la
siguiente etapa de purificación.
Las operaciones de cromatografía en Sepharose
quelante de Zn se llevan a cabo a temperatura ambiente.
Se inyecta la fracción Zn-500 en
una columna de Q-Sepharose FF empaquetada y
equilibrada.
Después de ello, la columna
se lava con aproximadamente 7 volúmenes de tampón
de urea 4 M sin Empigen (concentración en l^{-1}: urea 240,24 g,
PO_{4}^{3-} 0,5 M, 40,00 ml), muestra
QS-W1,
se lava con aproximadamente 10 volúmenes de
tampón de urea 6 M sin Empigen (urea 360,36 g/l), muestra
QS-W2,
se eluye con aproximadamente 5 volúmenes de
tampón de urea 6 M-NaCl 200 mM (concentración en
l^{-1}: urea 360,36 g, NaCl 11,69 g, 40,00 ml de
PO_{4}^{3-},
se eluye con aproximadamente 3 volúmenes de
tampón de urea 6 M-NaCl 500 mM (como anteriormente,
pero con NaCl 29,22 g/l). Se determina el final exacto de la
fracción mediante el final del pico UV, muestra
QS-500,
se eluye con 4 volúmenes de tampón de urea 4
M-NaCl 1 M (concentración en l^{-1}: urea 360,36,
NaCl 58,44, 40,00 ml de PO_{4}^{3-} (0,5), muestra
QS-1M,
la columna se lava después con NaOH 0,5 M,
se almacena el eluido de
QS-Sepharose (QS-500) a entre
2-8ºC antes de la siguiente etapa de
purificación.
Las etapas de cromatografía en
Q-Sepharose se llevan a cabo a temperatura
ambiente.
Se trata después la fracción
QS-500 en una unidad de ultrafiltración de 10 kDa
(Ultrasette-Pall Filtron).
Se concentra primero el producto aproximadamente
a 1 mg/ml de proteína y después se diafiltra de nuevo frente a 10
volúmenes de tampón fosfato.
Se desecha el permeado (fracción
UF-P) y se almacena el retenido (fracción
UF-R) a 2-8ºC esperando la
filtración final.
Las operaciones de ultrafiltración se llevan a
cabo a 2-8ºC.
Se filtra el producto bruto final (fracción
UF-R) a través de un filtro estéril de 0,22 \mum
(Millipak-Millipore) a flujo laminar y en una sala
aséptica de clase 100. La concentración final está entre 0,5 y 1,0
\mug/ml. El producto bruto estéril se almacena a -20ºC.
Ejemplo comparativo
X
a) Plásmido pRIT14497 (=TCA 307) que codifica la
fusión prot D1/3-E6-His/PVH16
b) Plásmido pRIT14661 (=DVA2), un vector
intermedio que contiene la secuencia de codificación de los 117
codones C-terminales de LytA de Streptococcus
pneumoniae. Lyta deriva de Streptococcus pneumoniae, que
sintetiza una
N-acetil-L-alaninamidasa, la
amidasa LYTA (codificada por el gen lytA {Gene, 43 (1986),
pág. 265-272}, una autolisina que degrada
específicamente ciertos enlaces en la cadena principal de
peptidoglicano. El dominio C-terminal de la
proteína LYTA es responsable de la afinidad por la colina o algunos
análogos de la colina tales como
DEAE.
DEAE.
a) La primera etapa fue la purificación del
fragmento de restricción grande NcoI-AflII del
plásmido pRIT14497 y la purificación del fragmento de restricción
pequeño AflII-AflII de pRIT14661.
b) La segunda etapa fue la unión de las
secuencias de clyta a las secuencias de E7-His (NcoI
y AflII son sitios de restricción compatibles), que dio lugar al
plásmido pRIT14634 (=TCA332), que codifica la proteína de fusión
clyta-E6-His bajo el control del
promotor pL (véase la figura 9).
La secuencia de codificación para la proteína de
fusión clyta-E6-His se describe en
la figura 10.
Se introdujo el plásmido pRIT14634 en AR58 de
E. coli (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad.
Sci., 82: 88), un lisógeno \lambda defectivo que contiene un
represor termosensible del promotor pL \lambda.
Se hicieron crecer células AR58 transformadas con
plásmido pRIT14634 en 100 ml de medio LB suplementado con 50
\mug/ml de canamicina a 30ºC. Durante la fase de crecimiento
logarítmico, las bacterias se cambiaron a 39ºC para inactivar el
represor ë y activar la síntesis de proteína
clyta-E6-His. La incubación a 39ºC
se continuó durante 4 horas. Las bacterias se sedimentaron y
almacenaron a -20ºC.
Se descongelaron células congeladas y se
resuspendieron en 10 ml de tampón PBS. Se rompieron las células en
una prensa French de celda a presión SLM Aminco a 138 MPa (tres
pasadas). Se centrifugó el extracto a 16.000 g durante 30 minutos a
4ºC. Después de la centrifugación de los extractos descrita
anteriormente, se analizaron alícuotas de sobrenadante y sedimento
mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida
y transferencia Western. Se visualizó una banda mayoritaria de
aproximadamente 33 kDa, localizada en la fracción de sedimento,
mediante geles teñidos con Coomasie y se identificó en
transferencias Western mediante anticuerpos policlonales de conejo
anti-clyta y conjugado Ni-NTA
acoplado a fosfatasa alcalina intestinal bovina (nº de cat. Qiagen
34510), que detecta la cola de histidina accesible. El nivel de
expresión representa aproximadamente un 3% de la proteína total.
Ejemplo comparativo
XI
a) Plásmido pRIT14501 (=TCA 308) que codifica la
fusión prot D1/3-E7-His/PVH16
b) Plásmido pRIT14661 (=DVA2), un vector
intermedio que contiene la secuencia de codificación de los 117
codones C-terminales de LytA de Streptococcus
pneumoniae.
a) La primera etapa fue la purificación del
fragmento de restricción grande NcoI-AflII del
plásmido pRIT14501 y la purificación del fragmento de restricción
pequeño AflII-AflIII de pRIT14661.
b) La segunda etapa fue la unión de las
secuencias de clyta a las secuencias de E7-His (NcoI
y AflII son sitios de restricción compatibles), que dio lugar al
plásmido pRIT14626 (=TCA330), que codifica la proteína de fusión
clyta-E7-His bajo el control del
promotor pL (figura 11).
La secuencia de codificación para la proteína de
fusión clyta-E7-His se describe en
la figura 12.
Se introdujo el plásmido pRIT14626 en AR58 de
E. coli (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad.
Sci., 82: 88), un lisógeno \lambda defectivo que contiene un
represor termosensible del promotor pL \lambda.
Se hicieron crecer células AR58 transformadas con
plásmido pRIT14626 en 100 ml de medio LB suplementado con 50
\mug/ml de canamicina a 30ºC. Durante la fase de crecimiento
logarítmico, las bacterias se cambiaron a 39ºC para inactivar el
represor ë y activar la síntesis de proteína
clyta-E7- His. La incubación a 39ºC se continuó
durante 4 horas. Las bacterias se sedimentaron y almacenaron a
-20ºC.
Se descongelaron células congeladas y se
resuspendieron en 10 ml de tampón PBS. Se rompieron las células en
una prensa Frencha de celda a presión SLM Aminco a 138 MPa (tres
pasadas). Se centrifugó el extracto a 16.000 g durante 30 minutos a
4ºC. Después de la centrifugación de los extractos descrita
anteriormente, se analizaron alícuotas de sobrenadante y sedimento
mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida
y transferencia Western. Se visualizó una banda mayoritaria de
aproximadamente 35 kDa, localizada en la fracción de sedimento,
mediante geles teñidos con Coomasie y se identificó en
transferencias Western mediante anticuerpos policlonales de conejo
anti-clyta y conjugado Ni-NTA
acoplado a fosfatasa alcalina intestinal bovina (nº de cat. Qiagen
34510), que detecta la cola de histidina accesible. El nivel de
expresión representa aproximadamente un 5% de la proteína total.
Ejemplo comparativo
XII
a) Plásmido pRIT14512 (=TCA 311) que codifica la
fusión prot D1/3-E6E7-His/PVH16
b) Plásmido pRIT14661 (=DVA2), un vector
intermedio que contiene la secuencia de codificación de los 117
codones C-terminales de LytA de Streptococcus
pneumoniae.
a) La primera etapa fue la purificación del
fragmento de restricción grande NcoI-AflII del
plásmido pRIT14512 y la purificación del fragmento de restricción
pequeño AflII-AfIlII de pRIT14661.
b) La segunda etapa fue la unión de las
secuencias de clyta a las secuencias de E7-His
(NcoI y AflII son sitios de restricción compatibles) que dio lugar
al plásmido pRIT14629 (=TCA331), que codifica la proteína de fusión
clyta-E6E7-His bajo el control del
promotor pL (véase la figura 13).
La secuencia de codificación para la proteína de
fusión clyta-E6E7-His se describe en
la figura 14.
Se introdujo el plásmido pRIT14629 en AR58 de
E. coli (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad.
Sci., 82: 88), un lisógeno \lambda defectivo que contiene un
represor termosensible del promotor pL \lambda.
Se hicieron crecer células AR58 transformadas con
plásmido pRIT14629 en 100 ml de medio LB suplementado con 50
\mug/ml de canamicina a 30ºC. Durante la fase de crecimiento
logarítmico, las bacterias se cambiaron a 39ºC para inactivar el
represor \lambda y activar la síntesis de proteína
clyta-E7-His. La incubación a 39ºC
se continuó durante 4 horas. Las bacterias se sedimentaron y
almacenaron a -20ºC.
Se descongelaron células congeladas y se
resuspendieron en 10 ml de tampón PBS. Se rompieron las células en
una prensa French de celda a presión SLM Aminco a 138 MPa (tres
pasadas). Se centrifugó el extracto a 16.000 g durante 30 minutos a
4ºC.
Después de la centrifugación de los extractos
descrita anteriormente, se analizaron alícuotas de sobrenadante y
sedimento mediante electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida y transferencia Western.
Se visualizó una banda mayoritaria de
aproximadamente 48 kDa, localizada en la fracción de sedimento,
mediante geles teñidos con Coomasie y se identificó en
transferencias Western mediante anticuerpos policlonales de conejo
anti-clyta y conjugado Ni-NTA
acoplado a fosfatasa alcalina intestinal bovina (nº de cat. Qiagen
34510), que detecta la cola de histidina accesible. El nivel de
expresión representa aproximadamente un 1% de la proteína total.
a) El plásmido pMG MCS prot D1/3 (=pRIT14589) es
un derivado de pMG81 (descrito en la solicitud de patente del R.U.
nº 9513261.9 publicada como WO 97/01640) en el que los codones
4-81 de la región de codificación de NS1 de la gripe
se reemplazaron por los codones correspondientes a los residuos
Ser20\rightarrowThr127 de proteína D madura de Haemophilus
influenzae de cepa 772, biotipo 2 (H. Janson et al.,
1991, Infection and Immunity, enero. pág.
119-125). La secuencia de prot D1/3 es seguida por
un sitio de clonación múltiple (11 residuos) y una región de
codificación de una cola de histidina C-terminal (6
His). Este plásmido se utiliza para expresar la proteína de fusión
D1/3-E7-His.
b) Se amplificaron las secuencias E6 y E7 de PVH
genómico del prototipo PVH18 (Cole et al., J. Mol.
Biol. (1987) 193, 599-608) del genoma
completo de PVH16 clonado en pBR322 (obtenido del Deutsches
Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum für human pathogen
Papillomaviruses - D 69120 - Heidelberg) y se subclonaron en pUC19
proporcionando TCA 302 (=pRT14467).
Se amplificaron las secuencias nucleotídicas
correspondientes a los aminoácidos 1\rightarrow105 de la proteína
E7 de pRIT14467. Durante la reacción en cadena con polimerasa, se
generaron sitios de restricción NcoI y SpeI en los extremos 5' y 3'
de las secuencias de E7, permitiendo la inserción en los mismos
sitios del plásmido pMGMCS prot D1/3, proporcionando el plásmido
TCA 316 (=pRIT14532). Se secuenció el inserto y se identificó una
modificación frente a la secuencia prototípica de E7/PVH18 en el
gen E7 (nucleótido 128 G\rightarrowA) que generaba una
sustitución de una glicina por un ácido glutámico (aa43 en E7,
posición 156 en la proteína de fusión). La secuencia para la fusión
proteína D1/3-E7-His/PVH18 se
describe en la figura 16.
a) Plásmido pBBR1MCS4 (Antoine R, y C. Locht,
Mol. Microbiol. 1992, 6, 1785-1799; M.E.
Kovach et al., Biotechniques 16, (5),
800-802), que es compatible con plásmidos que
contienen orígenes de replicación ColE1 o P15a.
b) Plásmido pMG42 (descrito en el documento WO
93/04175) que contiene la secuencia del promotor pL del fago
lambda.
c) Plásmido pTRX (Invitrogen, kit Thiofusion
K350-01) que porta la secuencia de codificación de
la tioreoxina seguida del terminador de la transcripción AspA.
Se purificaron el fragmento
EcoRI-NdeI de pMG42, que porta el promotor pL, y el
fragmento NdeI-HindIII de pTRX, que porta la
secuencia de codificación de la tioredoxina seguida por el
terminador AspA, y se ligaron en los sitios EcoRI y HindIII del
vector de plásmido pBBR1MCS4, proporcionando el plásmido TCA313
(=pRIT14523) (véase la figura 17).
Se describe la secuencia de la tioredoxina en la
figura 18.
2).a Para obtener la cepa B1011 que expresa la
prot D1/3-E7-His/PVH18, se introdujo
el plásmido pRIT14532 en AR58 de E. coli (Mott et al.,
1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 88), un lisógeno \lambda
defectivo que contiene un represor termosensible del promotor pL
\lambda, mediante selección de transformantes resistentes a la
canamicina.
Se introdujeron el plásmido pRIT14532 y pRIT14523
en AR58 de E. coli (Mott et al., 1985, Proc. Natl.
Acad. Sci., 82: 88), un lisógeno \lambda defectivo que
contiene un represor termosensible del promotor pL \lambda,
mediante doble selección de transformantes resistentes a canamicina
y ampicilina.
Se hicieron crecer células AR58 transformadas con
plásmidos pRIT14532 (cepa B1011) y células AR58 transformadas con
plásmidos PRIT14532 y pRIT14523 (cepa B1012) a 30ºC en 100 ml
de medio LB suplementado con 50 \mug/ml de canamicina para la cepa
B1011 y suplementado con 50 \mug/ml de canamicina y 100 \mug/ml
de ampicilina para la cepa B1012. Durante la fase de crecimiento
logarítmico, se cambiaron las bacterias a 39ºC para inactivar el
represor ë y activar la síntesis de proteína
D1/3-E7-His/PVH18 y tioredoxina. La
incubación a 39ºC se continuó durante 4 horas. Las bacterias se
sedimentaron y se almacenaron a -20ºC.
Se descongelan células congeladas y se
resuspenden en 10 ml de tampón PBS. Se rompen las células en una
prensa French de celda a presión SLM Aminco a 138 mPa (tres
pasadas). Se centrifuga el extracto a 16.000 g durante 30 minutos a
4ºC.
Después de la centrifugación de los extractos
descrita anteriormente, se analizaron alícuotas de sobrenadante y
sedimento mediante electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida y transferencia Western.
La fusión prot
D1/3-E7-His (aproximadamente 31 kDa)
se visualizó mediante geles teñidos con Coomasie en la fracción de
sedimento para la cepa B1011, se localizó parcialmente (al 30%) en
la fracción de sobrenadante de la cepa B1012 y se identificó en
transferencias Western mediante anticuerpo policlonal de conejo
anti-proteína D y conjugado Ni-NTA
acoplado a fosfatasa alcalina intestinal bovina (nº de cat. Qiagen
nº 34510), que detecta la cola de histidina accesible. El nivel de
expresión representa aproximadamente 1-3% de
proteína total mostrada en un gel de
SDS-poliacrilamida teñido con Coomasie.
Para el extracto de la cepa B1012, se visualizó
la tioredoxina (aproximadamente 12 kDa) mediante gel teñido con
Coomasie en el sobrenadante, y se identificó en transferencias
Western mediante anticuerpo monoclonal
anti-tioredoxina (Invitrogen
R920-25).
Se expresa prot
D1/3-E7-His de PVH18 en la cepa AR58
de E. coli (como se describe anteriormente). Todas las etapas
se realizan a temperatura ambiente (TA \approx 22ºC). Las
proteínas se siguen mediante el control de la DO_{280 nm}. Entre
las etapas, se mantienen las fracciones positivas de antígeno a
-20ºC.
El antígeno purificado es estable durante una
semana a -20ºC y a 4ºC (sin degradación), pero parece más
susceptible de oxidación después de incubación a 37ºC.
La solubilidad de la proteína depende del pH
(véase a continuación) con una reducción de la solubilidad para pH
< 7,4:
PBS pH 7,4 | 686 \mug/ml | 100% |
PBS pH 7,2 | 560 \mug/ml | 81% |
PBS pH 7,0 | 498 \mug/ml | 72% |
PBS pH 6,8 | 327 \mug/ml | 48% |
e) La proteína ProtD1/3-E7 de
PVH18 está compuesta por 227 aminoácidos. Su peso molecular teórico
es de 25,9 kDa, y su punto isoeléctrico teórico de 5,83. Migra
aproximadamente a 31,5 kDa en SDS PAGE reductor.
Se suspende la pasta celular a DO_{600}60 en
NaCl 2 M, fosfato 20 mM (NaH_{2}PO_{4}/K_{2}HPO_{4}), pH 7,6
antes de la lisis celular mediante dos pasadas a través de un
disruptor Rannie. Las células lisadas se sedimentan durante 30
minutos a 9.000 rpm en un rotor JA 10 a 4ºC. Para reducir el nivel
de endotoxinas, se lava el sedimento de células bacterianas que
contiene la proteína recombinante una vez en EDTA 5 mM, NaCl 2 mM,
PBS, pH 7,4; una vez en urea 4 M, fosfato 20 mM, pH 7,4 y
finalmente una vez en PBS, pH 7,4 para eliminar las trazas de EDTA
(cada lavado se realiza en el doble del volumen utilizado para la
suspensión celular). Se solubiliza la prot
D1/3-E7-His de PVH18 (TIT para
tioredosina en trans) (en el mismo volumen utilizado para la
suspensión celular) con cloruro de guanidina 6 M, PO4 50 mM, a pH
7,6 durante una noche a 4ºC. Se sedimentan los residuos celulares
durante 30 minutos a 9.000 rpm en un rotor JA 10 a 4ºC. Se
suplementa el sobrenadante con 0,5% de Empigen BB y es incuba
durante 30 minutos a TA.
Se cargan 125 ml de muestra en una columna de
Sepharose FF quelante de Zn (XK 26/20, Pharmacia; 50 ml gel/125 ml
de solubilización) preequilibrada con 0,5% de Empigen BB, cloruro de
guanidina 6 M, PO4 50 mM, pH 7,6 a 4 ml/min. Se lava la columna con
cloruro de guanidina 6 M, PO4 50 mM, pH 7,6 hasta alcanzar la línea
base, y después con urea 6 M, NaCl 0,5 M, PO4 50 mM, pH 7,6. Se
eluye el antígeno con imidazol 0,25 M en urea 6 M, NaCl 0,5 M, PO4
50 mM, pH 7,6 a 2 ml/min (Fig. 1B). La muestra eluida de IMAC se
dializa a 4ºC frente a PBS a pH 7,4.
Para reducir el nivel de endotoxina, se incuban
28 mg (37 ml) de antígeno en modo de cargas con 2 ml de resina
polimixina Affiprep preequilibrada con PBS a pH 7,4 durante una
noche a temperatura ambiente. La recuperación de proteína se estima
en un 60% y el contenido de endotoxinas se reduce 6,5 veces.
El antígeno purificado analizado en
SDS-PAGE reductor presenta una banda mayoritaria a
30 kDa con una segunda banda a 55 kDa, después de tinción con azul
de Coomasie o plata. En un SDS-PAGE no reductor, la
prot D1/3-E7-His de PVH18 aparece
principalmente como una mancha con peso molecular = 175 kDa. Sin
embargo, esta oxidación puede invertirse mediante la adición de
\beta-mercaptoetanol 5 mM. Este patrón se confirma
mediante análisis de transferencia Western
anti-protD o anti-His.
El antígeno purificado es estable durante una
semana a -20ºC y a 4ºC (sin degradación), pero parece más
susceptible de oxidación después de incubación a 37ºC.
La solubilidad de la proteína depende del pH
(véase a continuación) con una reducción de la solubilidad para pH
< 7,4.
PBS pH 7,4 | 686 \mug/ml | 100% |
PBS pH 7,2 | 560 \mug/ml | 81% |
PBS pH 7,0 | 498 \mug/ml | 72% |
PBS pH 6,8 | 327 \mug/ml | 48% |
La proteína prot
D1/3-E7-His de PVH18 está compuesta
por 227 aminoácidos. Su peso molecular teórico es de 25,9 kDa.
Migra aproximadamente a 31,5 kDa en SDS-PAGE
reductor. El punto isoeléctrico teórico es 5,83.
a) Plásmido pRIT14532 (=TCA 316) que codifica la
fusión protD1/3-E7-His
b) Plásmido LITMUS 28 (nº de cat. New England
Biolabs 306-28), un vector de clonación derivado de
pUC
c) Plásmido pMG MCS prot D1/3 (pRIT14589), un
derivado de pMG81 (descrito anteriormente) en el que los codones
4-81 de la región de codificación de NS1 de la gripe
se reemplazaron por los codones correspondientes a los residuos
Ser20\rightarrowThr127 de la proteína D madura de Haemophilus
influenzae cepa 772, biotipo 2 (H. Janson et al., 1991,
Infection and Immunity, enero. pág.
119-125). La secuencia de prot D1/3 es seguida por
un sitio de clonación múltiple (11 residuos) y una región de
codificación para una cola de histidina C-terminal
(6 His).
Se subclonó el fragmento
NcoI-XbaI de pRIT14532 (=TCA 316) que porta la
secuencia de codificación del gen E7 de PVH18, prolongada con una
cola de His, en un vector intermedio Litmus 28 útil para
mutagénesis, proporcionando pRIT14910 (=TCA348). Por analogía con
la mutagénesis de E7/PVH16, se eligieron las dobles mutaciones
cys27\rightarrowgly y glu20\rightarrowgln para deteriorar la
unión al producto antioncogénico del gen de retinoblastoma
(pRB).
Se realizó la introducción de mutaciones en el
gen E7 con el kit (Quick Change Site directed Mutagenesis (nº de
cat. Stratagene 200518). Como la secuenciación de pRIT14532 había
indicado la presencia de un ácido glutámico en posición 43 de E7 en
lugar de una glicina en la secuencia prototípica de PVH18, se
realizó un segundo ciclo de mutagénesis para introducir una glicina
en posición 43. Se obtuvo el plásmido pRIT14829 (=TCA 353). Después
de la verificación de la presencia de mutaciones y de la integridad
del gen E7 completo mediante secuenciación, se introdujo el gen E7
mutado en el vector pRIT14589 (=pMG MCS prot D1/3), proporcionando
el plásmido pRIT14831 (=TCA 355) (véase la figura 17).
Se describe la secuencia de la fusión proteína
D1/3-E7 mutada
(cys27\rightarrowgly,glu29\rightarrowgln)-His en
la figura 18.
Se introdujo el plásmido pRIT14831 en AR58 de
E. coli (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad.
Sci. 82: 88), un lisógeno \lambda defectivo que contiene un
represor termosensible del promotor pL \lambda, proporcionando la
cepa B1098, mediante selección de transformantes resistentes a la
canamicina.
Se hicieron crecer células AR58 transformadas con
el plásmido pRIT14831 (cepa B1098) a 30ºC en 100 ml de medio LB
suplementado con 50 \mug/ml de canamicina. Durante la fase de
crecimiento logarítmico, se cambiaron las bacterias a 39ºC para
inactivar el represor \lambda y activar la síntesis de prot
D1/3-E7 mutada-His/PVH18. La
incubación a 39ºC se continuó durante 4 horas. Las bacterias se
sedimentaron y se almacenaron a -20ºC.
Se descongelaron células congeladas y se
resuspendieron en 10 ml de tampón PBS. Se rompieron las células en
una prensa French de celda a presión SLM Aminco a 138 MPa (tres
pasadas). Se centrifugó el extracto a 16.000 g durante 30 minutos a
4ºC).
Después de la centrifugación de los extractos
descrita anteriormente, se analizaron alícuotas de sobrenadante y
sedimento mediante electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida y transferencia Western. Se
visualizó una banda mayoritaria de aproximadamente 31 kDa,
localizada en la fracción de sedimento, mediante geles teñidos con
Coomasie y se identificó en transferencias Western mediante
anticuerpo policlonal de conejo 22 J70 anti-proteína
D y anticuerpo monoclonal penta-His (nº de cat.
Qiagen 34660), que detecta la cola de histidina accesible. El nivel
de expresión representa aproximadamente 3 a 5% de la proteína
total.
a) El plásmido pMG MCS prot D1/3 (=pRIT14589) es
un derivado de pMG81 (descrito anteriormente) en el que los codones
4-81 de la región de codificación de NS1 de la
gripe se reemplazaron por los codones correspondientes a los
residuos Ser20\rightarrowThr127 de la proteína D madura de
Haemophilus influenzae de cepa 772, biotipo 2 (H. Janson
et al., 1991, Infection and Immunity, enero. pág.
119-125). La secuencia de prot D1/3 es seguida por
un sitio de clonación múltiple (11 residuos) y una región de
codificación de una cola de histidina C-terminal (6
His). Este plásmido se utiliza para expresar la proteína de fusión
D1/3-E6-His.
Las secuencias E6 y E7 de PVH genómico de tipo
PVH18 (Cole et al., J. Mol. Biol. 1987, 193, pág.
599-608) se amplificaron del genoma de PVH18
completo clonado en pBR322 (obtenido del Deutsches
Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum für human pathogen
Papillomaviruses - D 69120 - Heidelberg) y se subclonaron en pUC19
proporcionando TCA 302 (=pRT14467).
Se amplifican las secuencias nucleotídidicas
correspondientes a los aminoácidos 1\rightarrow158 de pRIT14467.
Durante la reacción en cadena con polimerasa, se generaron sitios
de restricción NcoI y SpeI en los extremos 5' y 3' de las
secuencias de E6, permitiendo la inserción en los mismos sitios del
plásmido pMGMCS prot D/13, proporcionando el plásmido TCA 314
(=pRIT14526) (véase la figura 21). Se secuenció el inserto para
verificar que no se había generado ninguna modificación durante la
reacción en cadena con polimerasa. La secuencia para la fusión
proteína D1/3-E6-His se describe en
la figura 22.
Se introdujo el plásmido pRIT14526 en AR58 de
E. coli (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad.
Sci., 82: 88), un lisógeno \lambda defectivo que contiene un
represor termosensible del promotor pL \lambda.
Se hicieron crecer células AR58 transformadas con
plásmido pRIT14526 en 100 ml de medio LB suplementado con 50
\mug/ml de canamicina a 30ºC. Durante la fase de crecimiento
logarítmico, se cambiaron las bacterias a 39ºC para inactivar el
represor \lambda y activar la síntesis de proteína
D1/3-E6-His. La incubación a 39ºC se
continuó durante 4 horas. Se sedimentaron las bacterias y se
almacenaron a -20ºC.
Se descongelan células congeladas y se
resuspenden en 10 ml de tampón PBS. Se rompen las células en una
prensa French de celda a presión SLM Aminco a 138 MPa (tres
pasadas). Se centrifuga el extracto a 16.000 g durante 30 minutos a
4ºC. Después de la centrifugación de los extractos descrita
anteriormente, se analizaron alícuotas de sobrenadante y sedimento
mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida
y transferencia Western. Se visualizó una banda mayoritaria de
aproximadamente 32 kDa, localizada en la fracción de sedimento,
mediante geles teñidos con Coomasie, y se identificó en
transferencias Western mediante anticuerpo policlonal de conejo
anti-proteína D y mediante conjugado
Ni-NTA acoplado a fosfatasa alcalina intestinal
bovina (nº de cat. Qiagen 34510), que detecta la cola de histidina
accesible. El nivel de expresión representa aproximadamente 3 a 5%
de la proteína total.
a) El plásmido pMG MCS prot D1/3 (=pRIT14589) es
un derivado de pMG81 (descrito anteriormente) en el que los codones
4-81 de la región de codificación de NS1 de la
gripe se reemplazaron por los codones correspondientes a los
residuos Ser20\rightarrowThr127 de proteína D madura de
Haemophilus influenzae de cepa 772, biotipo 2 (H. Janson
et al., 1991, Infection and Immunity, enero. Pág.
119-125). La secuencia de prot D1/3 es seguida por
un sitio de clonación múltiple (11 residuos) y una región de
codificación de una cola de histidina C-terminal (6
His). Este plásmido se utiliza para expresar la proteína de fusión
D1/3-E6E7-His.
b) Las secuencias E6 y E7 de PVH genómico de tipo
PVH18 (Cole et al., J. Mol. Biol. 1987, 193, pág.
599-608) se amplificaron del genoma de PVH18
completo clonado en pBR322 (obtenido del Deutsches
Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum für human pathogen
Papillomaviruses - D 69120 - Heidelberg) y se subclonaron en pUC19
proporcionando TCA 302 (=pRT14467).
c) Las secuencias de codificación para E6 y E7 en
TCA 302 (=pRIT14467) se modificaron con un adaptador de
oligonucleótidos sintéticos (insertado entre los sitios HgaI y NsI),
introduciendo una deleción de 11 nucleótidos entre los genes E6 y
E7, retirando el codon de paro de E6 y creando secuencias
condensadas E6 y E7 en el plásmido TCA 320 (=pRIT14618), véase la
figura 23.
Se amplifican las secuencias nucleotídicas
correspondientes a los aminoácidos 1\rightarrow263 de pRIT14618.
Durante la reacción en cadena con polimerasa, se generaron sitios de
restricción NcoI y SpeI en los extremos 5' y 3' de las secuencias
condensadas de E6E7, permitiendo la inserción en los mismos sitios
del plásmido pMGMCS prot D/13, proporcionando el plásmido TCA 328
(=pRIT14567) (véase la figura 24). Se secuenció el inserto para
verificar que no se había generado ninguna modificación durante la
reacción en cadena con polimerasa. La secuencia para la fusión
proteína D1/3-E6E7-His se describe
en la figura 25.
Se introdujo el plásmido pRIT14567 en AR58 de
E. coli (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad.
Sci., 82: 88), un lisógeno \lambda defectivo que contiene un
represor termosensible del promotor pL \lambda.
Se hicieron crecer células AR58 transformadas con
plásmido pRIT14512 en 100 ml de medio LB suplementado con 50
\mug/ml de canamicina a 30ºC. Durante la fase de crecimiento
logarítmico, se cambiaron las bacterias a 39ºC para inactivar el
represor \lambda y activar la síntesis de proteína
D1/3-E6E7-His. La incubación a 39ºC
se continuó durante 4 horas. Se sedimentaron las bacterias y se
almacenaron a -20ºC.
Se descongelan células congeladas y se
resuspenden en 10 ml de tampón PBS. Se rompen las células en una
prensa French de celda a presión SLM Aminco a 138 MPa (tres
pasadas). Se centrifuga el extracto a 16.000 g durante 30 minutos a
4ºC.
Después de la centrifugación de los extractos
descrita anteriormente, se analizaron alícuotas de sobrenadante y
sedimento mediante electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida y transferencia Western. Se
visualizó una banda mayoritaria de aproximadamente 48 kDa,
localizada en la fracción de sedimento, mediante geles teñidos con
Coomasie, y se identificó en transferencias Western mediante
anticuerpo policlonal de conejo anti-proteína D y
mediante conjugado Ni-NTA acoplado a fosfatasa
alcalina intestinal bovina (nº de cat. Qiagen 34510), que detecta la
cola de histidina accesible. El nivel de expresión representa
aproximadamente un 1% de la proteína total.
Se formulan vacunas con una proteína de los
ejemplos anteriores expresada en E. coli de la cepa AR58 y,
como coadyuvante, la formulación comprende una mezcla de
monofosforil-lípido A
3-des-O-acilado
(3D-MPL) e hidróxido de aluminio o
3D-MPL y/o QS21 opcionalmente en una emulsión de
aceite/agua, y opcionalmente formulada con colesterol.
\newpage
3D-MPL: es una forma
químicamente detoxificada del lipopolisacárido (LPS) de la bacteria
gram-negativa
Salmonella minnesota. Los experimentos realizados en Smith Kline Beecham Biologicals han mostrado que el 3D-MPL combinado con diversos vehículos potencia fuertemente tanto el tipo humoral como TH1 de inmunidad celular.
Salmonella minnesota. Los experimentos realizados en Smith Kline Beecham Biologicals han mostrado que el 3D-MPL combinado con diversos vehículos potencia fuertemente tanto el tipo humoral como TH1 de inmunidad celular.
QS21: es una saponina purificada de un
extracto bruto de la corteza del árbol Quillaja Saponaria
Molina, que tiene una fuerte actividad coadyuvante: activa
tanto la linfoproliferación específica de antígeno como los CTL
ante diversos antígenos.
La vacuna que contiene un antígeno de la
invención que contiene 3D-MPL y alúmina puede
prepararse de manera análoga a la descrita en los documentos WO
93/19780 o WO 92/16231.
Los experimentos realizados en Smith Kline
Beecham Biologicals han demostrado un claro efecto sinérgico de las
combinaciones de 3D-MPL y QS21 en la inducción
tanto de respuestas humorales como de celulares de tipo TH1. Las
vacunas que contienen un antígeno como dichos antígenos se describen
en el documento US 5750110.
La emulsión de aceite/agua está compuesta por dos
aceites (un tocoferol y escualeno) y PBS que contiene Tween 80 como
emulsionante. La emulsión comprendía 5% de escualeno, 5% de
tocoferol, 0,4% de Tween 80 y tenía un tamaño medio de partícula de
180 nm, y es conocida como SB62 (véase el documento WO
95/17210).
Los experimentos realizados en Smith Kline
Beecham Biologicals han probado que la adición de esta emulsión de
A/A a MPL/QS21 aumenta adicionalmente sus propiedades
inmunoestimulantes.
Se disuelve Tween 80 en solución salina tamponada
con fosfato (PBS), proporcionando una solución al 2% en PBS. Para
proporcionar 100 ml de emulsión concentrada dos veces, se someten a
vórtex 5 g de DL-alfa-tocoferol y 5
ml de escualeno para mezclar concienzudamente. Se añaden 90 ml de
solución PBS/Tween y se mezcla concienzudamente. Se pasa después la
emulsión resultante a través de una jeringuilla y finalmente se
microfluidiza utilizando una máquina de microfluidificación M110S.
Las gotitas de aceite resultantes tienen un tamaño de
aproximadamente 180 nm.
Se diluyó prot D1/3-E7 (5 \mug)
en PBS concentrado 10 veces a pH 6,8 y H_{2}O antes de la adición
consecutiva de SB62, 3D-MPL (5 \mug), QS21 (5
\mug) y tiomersal 50 \mug/ml como conservante a intervalos de 5
min. El volumen de emulsión es igual al 50% del volumen total (50
\mul para una dosis de 100 \mul). Todas las incubaciones se
llevaron a cabo a temperatura ambiente con agitación. Los controles
de coadyuvante sin antígeno se prepararon reemplazando la proteína
por PBS.
La proteína D es una lipoproteína expuesta en la
superficie de la bacteria gram-negativa
Haemophilus influenzae. La inclusión de los primeros 109
residuos de la proteína D como asociado de fusión se incorpora para
proporcionar al antígeno de vacuna las presentes propiedades
auxiliares. El antígeno se formuló con QS21, 3D-MPL
y SB62 como se describe anteriormente.
Se inmortalizaron células epiteliales de pulmón
primarias de ratones C57BL6 mediante E6 y E7 de PVH16, y se
transformaron después con un oncogén ras activado, produciendo una
línea celular tumorigénica que expresa E6 y E7 (Lin K.Y. et
al., 1996). La expresión de E7 se ha verificado mediante
análisis FACS de células TC1 fijas y permeabilizadas utilizando el
Mab anti-E7 de PVH16 de ratón (Triton Corp.,
Alameda, CA).
Se tripsinizaron células TC1 que crecen en
cultivo in vitro, se lavaron dos veces con medio exento de
suero y se inyectaron por vía s.c. en el costado derecho de los
ratones. Para evaluar el tratamiento de los tumores establecidos,
se inyectaron células TC1 a una dosis de 3 x 10^{4}
células/ratón. Una y dos semanas después de la inyección de células
tumorales, se vacunaron los ratones con 5 \mug en 100 \mul de
prot D1/3-E7-His a través de la
almohadilla de la pata (50 \mul/almohadilla de pata) en PBS o en
3D-MPL, QS21 y SB62, o con PBS o con el coadyuvante
solo. Se utilizaron cinco ratones C57BL/6 (Iffa Credo) en cada
grupo. Se controló en los ratones dos veces a la semana el
crecimiento tumoral. Se muestra la media de masa tumoral/grupo en la
figura 26, los ratones vacunados con prot
D1/3-E7-His en PBS o con PBS o
coadyuvante solo desarrollaron tumores progresivamente crecientes
(0-1 animales exentos de tumor/grupo). Por el
contrario, cuatro de los cinco ratones vacunados con prot
D1/3-E7-His en coadyuvante no
desarrollaron un tumor y un animal desarrolló un tumor muy pequeño
y estable el día 40. Este resultado indica que la proteína prot
D1/3-E7-His de PVH16 formulada en
coadyuvante es capaz de inducir la regresión de pequeños tumores
establecidos que expresan este antígeno.
Para el ensayo in vitro se prepararon
linfocitos triturando el bazo o los nódulos linfáticos poplíteos de
los ratones vacunados el día 69. Se sembró una alícuota de 2 x
10^{5} células por triplicado en placas de 96 pocillos con
concentraciones decrecientes (10, 1, 0,1 \mug/ml) de prot
D1/3-E7-His recubierta o no sobre
microperlas de látex (Sigma) para reestimular las células in
vitro (72 horas). Se midió la proliferación de células T
mediante la incorporación de ^{3}H-timidina.
Las figuras 27 y 28 comparan la capacidad de la
prot D-E7 de estimular la proliferación de
esplenocitos y células de nódulo linfático cebadas in vivo
con PBS, 3D-MPL, QS21, SB62, prot
D1/3-E7-His y prot
D1/3-E7-His + coadyuvante
3D-MPL, QS21, SB62, y muestran que se detectaron
respuestas de alta proliferación en bazo sólo en ratones
inmunizados con protD1/3-E7-His en
coadyuvante en comparación con los demás grupos.
Se tomaron sueros individuales al mismo tiempo
que se extrajeron los órganos y se sometieron a ELISA
indirectas.
Se utilizaron 5 \mug/ml de proteína E7
purificada como antígeno recubierto. Después de saturación en PBS +
1% de suero de ternero recién nacido durante 1 h a 37ºC, se
diluyeron en serie los sueros (empezando a 1/100) en tampón de
saturación y se incubaron durante una noche a 4ºC o durante 90 min a
37ºC. Después de lavar en PBS-Tween 20 al 0,1%, se
utilizaron Ig biotinilada de cabra anti-ratón
(1/1000) o antisueros de cabra de subclase IgG (IgG total,
IgG1,IgG2a, IgG2b) (1/5000) como segundos anticuerpos, después de
una incubación de 90 min a 37ºC se añadió estreptavidina acoplada a
peroxidasa y se utilizó TMB (tetrametilbencidina/peróxido) como
sustrato, después de 10 min se detuvo la reacción con
H_{2}SO_{4} 0,5 M y se determinó la DO_{450}.
Las titulaciones anti-E7
específicas de subclase desencadenadas por las vacunaciones en los
diferentes grupos de ratones se muestran en la Figura 29 en
comparación con el punto medio relativo de dilución del suero.
Estos resultados muestran que se desencadena una
débil respuesta de anticuerpo con 2 inyecciones de protD
1/3-E7-PVH16 sola.
Se generan muchos más anticuerpos
anti-E7 cuando se inyectó la prot
D1/3-E7 en presencia del coadyuvante SB62, QS21 +
3D-MPL.
No se detectaron IgA ni IgM en ninguna de las
muestras de suero, ni siquiera en el suero de ratones que recibieron
prot D1/3-E7 en coadyuvante SB62 + QS21 +
3D-MPL (datos no mostrados). Por el contrario,
aumentó ligeramente el nivel de IgG total mediante la vacunación de
los ratones con prot D1/3 sola y aumentó en gran medida mediante la
adición del coadyuvante SB62 + QS21 + 3D-MPL a la
proteína. El análisis de las concentraciones de las diferentes
subclases de IgG muestra que se ha inducido una respuesta de
anticuerpo mixta, ya que la concentración de todos los tipos de IgG
analizados (IgG1, IgG2a e IgG2b) aumentaba en el suero de los
ratones que recibieron el antígeno coadyuvado, en comparación con la
concentración observada en el suero de ratones que recibieron el
antígeno o el coadyuvante solo. El isotipo predominante encontrado
fue IgG2b (que representaba más de un 80% de la IgG total), este
isotipo se dice generalmente que está asociado a la inducción de
una respuesta inmune de tipo TH1.
Se inmunizaron ratones 2 veces en un intervalo de
14 días con PBS, coadyuvante del ejemplo 1, 5 \mug de prot
D1/3-E7-His o 5 \mug de prot
D1/3-E7-His en el coadyuvante del
ejemplo 1 a través de la almohadilla de pata en un volumen de 100
\mul (50 \mul/almohadilla de pata).
Cuatro semanas después de la última vacunación,
se expusieron los ratones a 2 x 10^{5} células TC1/ratón por vía
s.c. en el costado. Se tripsinizaron células TC1 que crecían en
cultivo in vitro, se lavaron dos veces con medio exento de
suero y se inyectaron. Se controló en 5 ratones utilizados en cada
grupo dos veces por semana el crecimiento tumoral.
La Figura 30 muestra que la vacunación con la
proteína E7 en el coadyuvante SB62 + QS21, 3D-MPL
protege a los ratones frente al desarrollo de tumores (sólo un
animal de cinco tiene un tumor muy pequeño y estable), en todos los
demás grupos que recibieron la proteína E7 sin el coadyuvante o el
coadyuvante solo desarrollaron tumores crecientes.
Tres semanas después de la última vacunación,
antes de la exposición a tumor, se sacrificaron 5 ratones en cada
grupo para lectura inmunológica.
Para el ensayo in vitro, se prepararon
linfocitos como se describe anteriormente del bazo y de los nódulos
linfáticos poplíteos de drenaje.
Se sembró una alícuota de 2 x 10^{5} células
por triplicado en placas de 96 pocillos con concentraciones
decrecientes (10, 1, 0,1 \mug/ml) de prot
D1/3-E7-His recubiertas o no sobre
microperlas de látex (Sigma) para reestimular las células in
vitro (72 horas). Se midió la proliferación de células T
mediante la incorporación de ^{3}H-timidina.
Las Figuras 31 y 32 muestran respectivamente que,
tanto con esplenocitos como con células de nódulo linfático
poplíteo, como se observó en los ajustes terapéuticos, se obtenía
una mejor actividad linfoproliferativa para los ratones que
recibieron la proteína E7 en la respuesta de anticuerpo al
coadyuvante SB62 + QS21 + 3D-MPL.
La Figura 33 muestra que, como en los ajustes
terapéuticos, se observó una mejor respuesta de anticuerpo en el
suero de ratones vacunados con la proteína prot
D1/3-E7 formulada en el coadyuvante
3D-MPL + QS21, A/A. Se desencadenó una respuesta de
anticuerpo mixta, ya que se ensayaron todas las subclases de IgG
(IgG2a, IgG2b, IgG1); en este caso también la IgG2b fue el isotipo
predominante encontrado, representando un 75% de la IgG total.
Se vacunaron dos veces ratones, separados 2
semanas, con 5 \mug en 100 \mul de prot
D1/3-E7-His/PVH18 a través de la
almohadilla de pata (50 \mul/almohadilla de pata) en PBS o QS21,
3D-MPL y SB62, DQ-MPL como se
describe en el documento WO 96/33739 o
DQ-alúmina-MPL como se describe en
el documento WO 98/15827. Se utilizaron ocho ratones Balb/c de
6-8 semanas (Iffa Credo) en cada grupo. Catorce
días después de II, se extrajeron el bazo y los nódulos linfáticos
para lectura inmunológica y toma de muestra de sangre para
serología.
Para el ensayo in vitro, se prepararon los
linfocitos triturando el bazo o los nódulos linfáticos poplíteos de
los ratones vacunados el día 28.
Se sembró una alícuota de 2 x 10^{5} células
por triplicado en placas de 96 pocillos con concentraciones
decrecientes (10, 1, 0,1, 0,01 \mug/ml) de prot
D1/3-E7-His/PVH18 para reestimular
las células in vitro (72 h). Se midió la proliferación de
células T mediante la incorporación de
^{3}H-timidina. Los resultados se expresan como
índice de estimulación (cpm de muestra/cpm de línea base).
Las Figuras 34 y 35 comparan la capacidad de la
prot D1/3-E7/PVH18 de estimular la proliferación de
esplenocitos o células de nódulo linfático cebadas in vivo
con prot D1/3-E7-His/PVH18 o prot
D1/3-E7-His/PVH18 + coadyuvante, y
muestran que sólo se observa una linfoproliferación basal en ratones
que recibieron la proteína sola; por el contrario, se detectaron
respuestas proliferativas altas en bazo y respuestas muy altas en
nódulos linfáticos en ratones inmunizados con prot
D1/3-E7-His/PVH18 en
coadyuvante.
- \bullet
- Se midieron las citoquinas (IL-5 e IFNg) producidas en el sobrenadante de cultivo después de un periodo de 96 horas de reestimulación in vitro de células de bazo o nódulo linfático con medio o con la prot D1/3-E7/PVH18 (1 ó 3 \mug/ml) mediante ELISA como se describe:
- \bullet
- IFNg (Genzyme)
Se realizó la cuantificación de IFN\gamma
mediante ELISA utilizando reactivos de Genzyme. Se utilizaron
soluciones de muestra y anticuerpo a 50 \mul por pocillo. Se
recubrieron placas de microvaloración de 96 pocillos (Maxisorb
Immuno-plate, Nunc, Dinamarca) durante una noche a
4ºC con 50 \mul de IFNg de hámster anti-ratón
diluida a 1,5 \mug/ml en tampón carbonato a pH 9,5. Se incubaron
después las placas durante 1 h a 37ºC con 100 \mul de PBS que
contenía 1% de seroalbúmina bovina y 0,1% de Tween 20 (tampón de
saturación). Se añadieron diluciones dobles de sobrenadante de
estimulación in vitro (empezando a ½) en tampón de
saturación a las placas recubiertas con anticuerpo
anti-IFNg, y se incubaron durante 1,5 horas a 37ºC.
Se lavaron las placas 4 veces con PBS-Tween al 0,1%
(tampón de lavado) y se añadió IFNg de cabra
anti-ratón conjugada a biotina diluida en tampón de
saturación a una concentración final de 0,5 \mug/ml a cada
pocillo, y se incubó durante 1 h a 37ºC. Después de una etapa de
lavado, se añadió conjugado AMDEX (Amersham) diluido 1/10000 en
tampón de saturación durante 30 min a 37ºC. Se lavaron las placas
como anteriormente y se incubaron con 50 \mul de TMB (Biorad)
durante 15 min. Se detuvo la reacción con H_{2}SO_{4} 0,4 N y
se leyó a 450 nm. Se calcularon las concentraciones utilizando una
curva patrón (patrón de IFN\gamma estándar) mediante SoftmaxPro
(ecuación de cuatro parámetros) y se expresó en pg/ml.
- \bullet
- IL5 (Pharmingen)
Se realizó la cuantificación de
IL-5 mediante ELISA utilizando reactivos de
Pharmingen. Se utilizaron soluciones de muestras y anticuerpos a 50
\mul por pocillo. Se recubrieron placas de microvaloración de 96
pocillos (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dinamarca)
durante una noche a 4ºC con 50 \mul de IL-5 de
rata anti-ratón diluida a 1 \mug/ml en tampón
carbonato a pH 9,5. Se incubaron después las placas durante 1 h a
37ºC con 100 \mul de PBS que contenía 1% de seroalbúmina bovina y
0,1% de Tween 20 (tampón de saturación). Se añadieron diluciones
dobles de sobrenadante de la estimulación in vitro (empezando
a ½) en tampón de saturación a las placas recubiertas con
anti-IFNg, y se incubó durante 1,5 horas a 37ºC. Se
lavaron las placas 4 veces con PBS-Tween al 10%
(tampón de lavado) y se añadió IL-5 de rata
anti-ratón conjugada a biotina diluida en tampón de
saturación a una concentración final de 1 \mug/ml a cada pocillo,
y se incubó durante 1 h a 37ºC. Después de una etapa de lavado, es
añadió conjugado AMDEX (Amersham) diluido 1/10000 en tampón de
saturación durante 30 min a 37ºC. Se lavaron las placas como
anteriormente y se incubaron con 50 \mul de TMB (Biorad) durante
15 min. Se detuvo la reacción con H_{2}SO_{4} 0,4 N y se leyó a
450 nm. Se calcularon las concentraciones utilizando una curva
patrón (IL-5 recombinante de ratón) mediante
SoftmaxPro (ecuación de cuatro parámetros) y se expresó en
pg/ml.
Partiendo de células de bazo, no pudo detectarse
IL-5 en ninguno de los grupos ensayados; por el
contrario, se observó una alta producción de IFNg en todos los
grupos, con sólo un ligero aumento en el grupo de ratones que
recibió la proteína coadyuvada con SBAS1c en comparación con los
otros grupos. Esto sugiere la inducción de una respuesta inmune de
tipo TH1.
Respecto a las células de nódulo linfático, se
obtuvo una muy débil producción de IFNg en el grupo de ratones que
recibió la proteína sola y se observa un aumento de
5-10 veces con la proteína coadyuvada. IL5 no pudo
detectarse en el grupo de ratones que recibieron la proteína
coadyuvada con SBAS2.
Las Figura 36 y 37 comparan la capacidad de la
prot D1/3-E7-His/PVH18 de estimular
la producción de citoquinas (IFNg e IL5) después de la
reestimulación in vitro de células de bazo o nódulo
linfático, respectivamente.
Se tomaron sueros individuales al mismo tiempo
que los órganos se sometían a ELISA indirectas.
Se utilizaron 2,5 \mug/ml de proteína prot
D1/3-E8/PVH18 purficada como antígeno recubierto.
Después de la saturación con PBS + 1% de suero de ternero recién
nacido durante 1 h a 37ºC, se diluyeron en serie los sueros
(empezando a 1/100) en tampón de saturación y se incubaron durante
una noche a 4ºC o durante 90 min a 37ºC. Después de lavar en
PBS-Tween 20, se utilizaron Ig de cabra
anti-ratón biotinilada al 0,1% (1/1000) o antisueros
de una subclase de IgG de cabra anti-ratón (IgG
total, IgG1, IgG2a, IgG2b) (1/5000) como segundos anticuerpos;
después de una incubación de 90 min a 37ºC, se añadió estreptavidina
acoplada a peroxidasa y se utilizó TMB
(tetrametilbencidina/peróxido) como sustrato, después de 10 min la
reacción se detuvo con H_{2}SO_{4} 0,5 M y se determinó la
DO_{450}.
Se desencadena una muy débil respuesta de
anticuerpo con 2 inyecciones de prot D1/3-E7/PVH18
sola. El nivel de IgG total aumentó en gran medida mediante la
adición de coadyuvantes a la vacuna de proteína.
El análisis de las concentraciones de las
diferentes subclases de IgG muestra que cuando la proteína se
inyectó en presencia de los coadyuvantes DQS21,
3D-MPL o SB62, QS21/3D-MPL, se
obtuvo un ligero aumento del porcentaje del subtipo IgG2a: 28% de
IgG1, 48% de IgG2a y 43% de IgG1, 44% de IgG2a, respectivamente, en
comparación con 46% de IgG1, 32% de IgG2a con la proteína no
coadyuvada. La respuesta de anticuerpo más fuerte se obtiene con la
proteína formulada en DQ-alúmina, con un claro
desplazamiento de la concentración de isotipo (80% de IgG1, 8% de
IgG2a). Ya que el isotipo IgG2a en ratones Balb/c se considera
generalmente asociado a la inducción de una respuesta inmune de tipo
TH1, estos resultados sugieren que los coadyuvantes DQS21,
3D-MPL y SB62, QS21/3D-MPL tienden
a aumentar el perfil de tipo TH1 de la respuesta humoral, mientras
que SBAS5 induce un tipo de respuesta claramente TH2.
Figura 38. Se muestran la comparación de la
dilución de punto medio del suero y el porcentaje relativo de los
diferentes isotipos desencadenados por las vacunaciones en los
diferentes grupos de ratones.
Los inventores han demostrado que la proteína
condensada prot D1/3 y la proteína temprana E7 de PVH16 inducían una
potente inmunidad sistémica antitumoral, y que la proteína de fusión
protD1/3 y E7 de PVH18 han mostrado ser también inmunogénicas en
ratones. La vacunación con la proteína de fusión prot
D1/3-E7/PVH16 protegía a los ratones de la
exposición a tumores con células tumorales que expresaban E7, y
eliminó tumores pequeños preestablecidos que expresaban E7 de PVH16
inyectados en un sitio distante del sitio de vacunación.
Han demostrado que la proteína prot
D1/3-E7/PVH16 en coadyuvante es capaz de potenciar
la proliferación de células T auxiliares, sugiriendo que la
respuesta inmune antitumoral inducida por esta vacuna está al menos
en parte asociada a una respuesta de células T CD4+.
Han demostrado también que se desencadenó una
mejor respuesta de anticuerpo por la vacunación con la prot
D1/3-E7 en presencia de coadyuvante que contiene
3D-MPL. Al ser IgG2b el isotipo predominante
encontrado en el suero de ratones C57BL/6, se sugiere que se provocó
una respuesta inmune de tipo TH1.
Claims (24)
1. Una proteína de fusión que comprende un
antígeno de papilomavirus humano seleccionado del grupo constituido
por: i) proteína E6, ii) proteína E7, iii) proteína de fusión E6E7,
iv) proteína E7 en la que se introduce una mutación para reducir la
unión al producto del gen de retinoblastoma, o v) proteína E6 en la
que se introduce una mutación en la región p53 de la proteína E6;
dicha proteína ligada a la proteína D o a un derivado de la misma
de Haemophilus influenzae, en la que el derivado de
proteína D comprende aproximadamente los primeros 100 aminoácidos
N-terminales de la proteína D.
2. La proteína de fusión de la reivindicación 1,
en la que el derivado de proteína D comprende aproximadamente el
primer tercio de la proteína D.
3. La proteína de fusión de la reivindicación 1 ó
2, en la que el derivado de proteína D está lipidado.
4. Una proteína según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que el papilomavirus humano es PVH16
o PVH18.
5. La proteína de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en la que la proteína E7 de PVH16 mutada
comprende un miembro seleccionado del grupo constituido por: (i)
reemplazo de Cys_{24} por glicina, (ii) reemplazo de ácido
glutámico_{26} por glutamina y (iii) reemplazo de Cys_{24} por
glicina y de ácido glutámico_{26} por glutamina.
6. La proteína de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en la que la proteína E7 de PVH18 mutada
comprende un miembro seleccionado del grupo constituido por: (i)
reemplazo de Cys_{27} por glicina, (ii) reemplazo de ácido
glutámico_{29} por glutamina y (iii) reemplazo de Cys_{27} por
glicina y de ácido glutámico_{29} por glutamina.
7. Una proteína según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, que comprende adicionalmente un marcaje de
histidina de al menos 4 residuos de histidina.
8. Una secuencia de ADN que codifica una proteína
según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Una vacuna que contiene una proteína según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un diluyente o
excipiente farmacéuticamente aceptable.
10. Una vacuna según la reivindicación 9, que
comprende adicionalmente un coadyuvante.
11. Una vacuna según la reivindicación 9 ó 10, en
la que la proteína se presenta en un vehículo de emulsión de aceite
en agua.
12. Una vacuna según la reivindicación 10 u 11,
en la que el coadyuvante comprende 3D-MPL o QS21 o
ambos.
13. Una vacuna según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 12, que comprende un antígeno de PVH
adicio-
nal.
nal.
14. La vacuna de la reivindicación 13, en la que
el antígeno de PVH adicional es uno o más miembros seleccionados
del grupo constituido por E2, E5, L1 y L2.
15. La vacuna de la reivindicación 14, en la que
L1 y L2 se presentan conjuntamente en forma de una partícula
viroide o en la que L1 sola se presenta en forma de una partícula
viroide o estructura de capsómero.
16. Una vacuna según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 15 para uso en medicina.
17. Uso de una proteína según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7 para la fabricación de una vacuna para
tratar, mediante inmunoterapia, un paciente que sufre lesiones
tumorales inducidas por PVH (benignas o malignas).
18. Uso de una proteína según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7 para la fabricación de una vacuna para
prevenir la infección viral por PVH.
19. Un vector que contiene una secuencia de ADN
de la reivindicación 8.
20. Un vector que contiene una secuencia de ADN
según la reivindicación 8 y una secuencia de ADN que codifica
tioredoxina, que permite la coexpresión de la proteína de fusión
con tioredoxina en trans.
21. Una célula hospedadora bacteriana
transformada con una secuencia de ADN de la reivindicación 8.
22. Una célula hospedadora bacteriana
transformada con un vector de las reivindicaciones 19 ó 20.
\newpage
23. Un procedimiento para la producción de una
proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que
comprende transformar una célula hospedadora con una secuencia de
ADN que codifica la proteína, expresar dicha secuencia y aislar el
producto deseado.
24. Un procedimiento para la producción de una
vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, que
comprende mezclar la proteína con un coadyuvante, diluyente u otro
excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado.
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