ES2215957T3 - Metodo para diagnostico basado en una solucion. - Google Patents
Metodo para diagnostico basado en una solucion.Info
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Abstract
Un método de diagnóstico de condiciones médicas relevantes en muestras en bruto, comprendiendo: a) preparación de una solución muestral en base a la muestra en bruto b) detectar los niveles de uno o más marcadores característicos de la condición médica relevante mencionada en la solución muestral dicha c) detectar los niveles de uno o más marcadores de normalización característicos de como mínimo uno de los siguientes parámetros como mínimo: i) la presencia o ausencia de cierto tipo de célula entre las células representadas en la solución muestral ii) la presencia o ausencia de cierto patrón de diferenciación particular en las células representadas en la solución muestral iii) la presencia o ausencia de ciertas propiedades de proliferación de células representadas en la solución d) muestral comparar los niveles de los marcadores característicos de la condición médica relevante mencionada con los niveles de los marcadores de normalización detectados en la solución muestral,normalizando el nivel detectado del marcador característico de la condición médica relevante mencionada respecto a uno o varios parámetros idóneos, y e) diagnosticar la condición médica relevante desde los niveles normalizados de dichos marcadores característicos de la condición médica relevante mencionada dentro de la solución muestral.
Description
Método para diagnóstico basado en una
solución.
Este invento proporciona métodos de diagnóstico
mejorado de condiciones médicas relevantes mediante procedimientos
de ensayo bioquímicos basados en soluciones, realizados en
soluciones de muestras de ensayo. El invento proporciona un método
de sustituir la información morfológica basada en la célula,
contenida en los datos citológicos y/o histológicos de la muestra de
ensayo, por información molecular obtenible de la solución, donde
se disuelve la muestra de ensayo original, permitiendo así una
evaluación precisa y reproducible del diagnóstico médico relevante a
partir de muestras de ensayo disueltas. El método según el invento
incluye las fases de determinar los niveles de uno o más marcadores
asociados con la condición a diagnosticar, determinando el nivel de
una serie de marcadores de normalización adecuados para sustituir la
información relativa a aspectos morfológicos de la muestra, que
habría permitido o soportado el diagnóstico en un sistema de ensayo
basado en células, comparando y/o combinando los datos relativos a
los niveles de los mencionados marcadores y evaluando el
diagnóstico de una condición médica
relevante.
relevante.
El diagnóstico de una gran cantidad de
condiciones médicas relevantes se realiza actualmente mediante
marcadores. Estas herramientas moleculares se usan generalmente como
un aspecto en exámenes complejos, tomando en consideración
diferentes parámetros característicos de la muestra examinada.
En análisis médico relevante se suele usar el
examen morfológico de muestras mediante citología o histológía.
Estos métodos basados en caracterización morfológica de muestras de
células pueden aplicarse p.ej. en el análisis de muestras clínicas
como fluidos corporales, sangre, resecciones quirúrgicas,
secreciones, frotis o lavados.
En el screening de cáncer cervical por ej. se
usan frotis para detectar lesiones neoplásticas del cuello uterino.
En este procedimiento hay lesiones varias que hay que distinguir. La
causa de las lesiones pueden ser inflamaciones (debido a agentes
infecciosos o daños físicos o químicos) o cambios preneoplásticos o
neoplásticos. En exámenes morfológicos las lesiones varias son
difíciles de distinguir. Por ello, los citólogos y patólogos para
examinar frotis tienen que estar específicamente entrenados y aún
examinadores experimentados varían mucho entre ellos al evaluar
diagnóstico basado en especimenes citológicos. En general, el
resultado del examen se basa en la interpretación subjetiva de
criterios de diagnóstico por el patólogo o citólogo examinante. Por
ello hay una elevada proporción de resultados falsos positivos o
negativos en las pruebas de screening.
Por ello numerosas veces los procedimientos de
examen citológico o histológico es soportado por marcadores
moleculares que se usan muchas veces en reacciones de teñido
inmuno-histoquímico o durante reacciones de
hibridación in situ. En la técnica actual combinaciones de
exámenes morfológicos y reacciones de teñido
inmuno-histoquímico basadas en moléculas marcadoras
características de diferentes estados relevantes médicos de tejidos
o células pueden aumentar los resultados. El examen morfológico
sigue siendo laborioso y dura tiempo, siendo costoso aún cuando
apoyado por métodos moleculares, que dan resultados más confiables.
Además, el diagnóstico del nivel celular morfológico, aún apoyado
por parámetros moleculares, está sujeto a percepción individual de
morfología por los examinantes. Por ello, el diagnóstico depende de
la persona que realiza el examen.
Sólo en muy pocos casos pueden usarse marcadores
moleculares para diagnóstico sin ulteriores exámenes morfológicos de
la célula, especialmente si los marcadores existen en el entorno y
sólo aparecen bajo condiciones exactamente definidas. Así, los
métodos de diagnóstico de condiciones sólo a nivel molecular, sin la
ayuda de información celular, están limitados a casos, donde hay
marcadores adecuados inambiguamente específicos para la condición a
caracterizar. Por ej. la detección de infecciones virales puede
realizarse el soluciones de muestras porque los marcadores
característicos de la presencia de virus en tejidos no existen en
tejidos humanos sanos.
Por ello los resultados del examen son más
reproducibles usando herramientas moleculares, aún que la
preservación y preparación de muestras puede no superarse sólo
usando marcadores moleculares adicionales.
Pero especialmente cuando se usan herramientas
moleculares en exámenes citológicos o histológicos deben tomarse
precauciones estrictas de preservación para evitar artefactos o
resultados inadecuados de tests. Ello es en parte debido a la
inestabilidad de la información morfológica de la célula y en parte
a la de los marcadores moleculares que se detectan durante las15
pruebas. Si no se preparan, transportan o almacenan las muestras
adecuadamente, puede perderse o modificarse la información celular o
incluso molecular. Así el diagnóstico puede ser imposible o tiende a
artefactos. P.ej. la interpretación de biopsias o preparaciones
citológicas frecuentemente es difícil o imposible por células
dañadas física o bioquímicamente. Además, en cuanto a muestras de
tejido o biopsias, la preservación de constituyentes moleculares de
las muestras recambiadas rápidamente parece sofisticada debido al
tiempo pasado hasta la penetración de los preparativos apropiados en
la muestra.
En cambio hay vías robustas, rápidas y fáciles de
preservar propiedades moleculares de muestras, perdiéndose la
información morfológica. Pueden ser preparadas de forma
reproducible, almacenarse y transportarse fácilmente, disolviendo
los componentes celulares de la muestra bruta en disolvente
apropiado inmediatamente después o mientras se obtiene la muestra.
Los fluidos corporales pueden transferirse directamente del cuerpo a
una solución con detergentes y sustancias preservantes apropiados.
Además pueden transferirse inmediatamente muestras de tejidos a
condiciones de Tisis desnaturalizante (ev. soportado por fuerzas
físicas), preservándose. Usando ingredientes apropiados en el
disolvente, pueden conservarse de la degradación los componentes
moleculares originales de la muestra. Puede minimizarse p.ej. la
degradación enzimática usandoinhibidores enzimáticos. Así una
solución de muestras puede representar propiedades moleculares de la
muestra de ensayo en el momento de disolver, sin requerir cuidados
de preservación adicionales.
Al disolver la muestra se pierde toda la
información celular morfológica característica de la muestra, no
pudiéndose usar estos datos para diagnóstico de condiciones.
Los métodos de diagnóstico soportados
morfológicamente realizados regularmente en la técnica tienen dos
grandes desventajas. Primero dependen en sumo grado de la percepción
del examinante y segundo, la información morfológica puede
descomponerse, produciendo artefactos después de preparar las
muestras. Ambas cosas hacen que los resultados sean menos
reproducibles.
Para mejorar el diagnóstico de condiciones
médicas relevantes son deseables métodos no dependiendo de la
información morfológica de la célula.
Este invento muestra un método de diagnosis de
condiciones médicas relevantes en base a marcadores moleculares,
caracterizando la muestra, sin basarse en información celular
morfológica.
Este invento se basa en los resultados de los
inventores (ejemplos 1-4) de que el diagnóstico de
condiciones normalmente (en sistemas diagnósticos basados en
células) permitido y/o apoyado por exámenes histológicos y/o
citológicos, puede realizarse en soluciones de muestras en bruto que
contienen varios tipos de células de diferentes características, por
un método que comprende los pasos para la obtención de una muestra
bruta, disolviendo la muestra en un soluto adecuado, detectando el
nivel de uno o varios marcadores asociados a la condición a
diagnosticar, y además uno o varios marcadores de normalización
dentro de la solución muestral, normalizando los datos
correlacionados con los marcadores asociados con tal condición
respecto a los datos correlacionados con los marcadores
normalizantes y diagnosticando la presencia o ausencia de una
condición en la muestra.
El método del presente invento puede aplicarse
p.ej. como test de screening primario en casos, donde se realiza
usualmente un examen citológico, histológico o patológico. Usando el
invento presente se puede discriminar si la condición a ser
diagnosticada puede estar presente en la muestra. Si el diagnóstico
basado en la solución es negativo respecto a una condición
particular, puede omitirse el posterior examen. En caso de
resultados positivos puede seguirse con métodos clásicos aplicables.
Así se pueden evitar exámenes microscópicos u otros que consumen
tiempo por medio de un rápido y económico test de screening
primario.
Un aspecto del presente invento es un mejor
método para condiciones de diagnóstico ampliadas médicamente
relevantes, evaluándose el diagnóstico usando soluciones de muestras
lisadas de tejido en bruto o muestras de células. El método de
diagnóstico revelado según este invento no se basa en parámetros
morfológicos, sino que permite el diagnóstico mediante análisis
bioquímico.
En segundo lugar este invento es un método
caracterizando una muestra compleja en solución mediante marcadores
moleculares característicos para los parámetros de interés,
sustituyendo información que se podría obtener de otra forma de
exámenes histológicos o citológicos.
El tercer aspecto del presente invento es
proporcionar las combinaciones adecuadas de marcadores para el
diagnóstico de condiciones particulares de relevancia médica en
muestras complejas. Los marcadores de normalización son usados tal
que pueden sustituirse parámetros incluidos en la muestra en bruto,
permitiendo o apoyando el diagnóstico, que se pierden al disolver la
muestra.
Un cuarto aspecto del presente invento consta de
kits de ensayo para realizar estudios de diagnóstico o investigación
según este invento.
El presente invento permite un ensayo rápido y
fácil de diagnóstico de condiciones en muestras en bruto, como
fluidos corporales, frotis, lavados, aspirados de agujas o muestras
complejas celulares o tisulares. En general el problema del material
en bruto es la presencia de diferentes tipos de células en la
muestra y además la presencia de microorganismos y sustancias
extracelulares. El material en bruto contiene por ello células y
composiciones varias que pueden resultar en artefactos en los
resultados. La presencia de tipos celulares de características de
proliferación diferente, de organismos y sustancias en la muestra
en bruto proporciona múltiples factores que pueden contribuir al
nivel particular de la molécula marcadora. Detectando únicamente el
nivel de un sólo marcador molecular puede proporcionar por ello sólo
información útil de diagnóstico si existen más parámetros
(morfológicos) respecto a la muestra en bruto. Los datos
morfológicos obtenidos de la muestra en bruto se pierden por tisis
en solución. Pero hay marcadores moleculares adecuados,
correspondientes a parámetros morfológicos particulares u otros
obtenibles por medios histológicos o citológicos.
Por ejemplo, la información sobre constituyentes
individuales dentro de la muestra en bruto puede obtenerse
clásicamente por examen microscópico. La inspección morfológica
informa acerca de la diferenciación, la localización celular y del
medio, donde aparecen las células. En preparados citológicos de
frotis cervicales pueden identificarse las células particulares
p.ej. como células epiteliales, categorizándose más tarde p.ej. como
células endocervicales o ectocervicales epiteliales. Aún la
presencia de células no cervicales como las endocervicales puede
detectarse fácilmente por inspección microscópica.
Según el presente invento puede disolverse
material en bruto en un disolvente adecuado sin preparación ulterior
ni caracterización, independiente de si el material de la muestra es
de carácter homogéneo o heterogéneo. Los datos que se pierden
durante la lisis del material están contenidos en la solución
muestral, codificados por los niveles de una serie de moléculas
marcadoras, pudiéndose reconstruir usando los datos mencionados de
estas moléculas para normalizar las características morfológicas
respectivas. Para ello se usa un set adecuado de marcadores
moleculares para cada parámetro característico necesario para un
diagnóstico inambiguo. Detectando una variedad de marcadores se
pueden evaluar los parámetros relevantes que caracterizan la
muestra en bruto, evitando así la pérdida de información por tisis
de la muestra.
El procedimiento de ensayo según el presente
invento incluye detectar niveles de marcadores característicos para
las condiciones celulares en cuestión, y de marcadores para
normalizar los datos respecto a parámetros que caracterizan el medio
particular de la muestra ensayada. Los marcadores adecuados para el
presente invento pueden ser de origen vario. El patrón de expresión
de un marcador adecuado para detectar condiciones en cuestión puede
depender del estatus proliferativo de las células, del estatus
diferenciativo, del tipo de célula o del organismo (ver ejemplos de
marcadores apropiados abajo).
El diagnóstico de condiciones médicas relevantes
que se usa aquí puede abarcar el examen de cualquier condición
detectable a nivel citológico, histológico, bioquímico o
biomolecular, que puede ser útil para la salud y/o el cuerpo humano.
Estos exámenes pueden abarcar p.ej. métodos de diagnóstico médico y
estudios de investigación en ciencias de la vida. En una
incorporación del invento se usa el método para diagnosticar
condiciones médicas relevantes como p.ej. enfermedades, que pueden
abarcar alteraciones caracterizadas por proliferación de tipo no
silvestre de células o tejidos.
En una incorporación se trata del diagnóstico de
cáncer y las fases precursoras, vigilar el transcurso de esta
enfermedad en cánceres, evaluar el pronóstico en cánceres y detectar
o diseminar células tumorales p.ej. en el curso de un diagnóstico de
mínimo residuo maligno. El método según el presente invento puede
usarse p.ej. en el diagnóstico clínico o patológico de cánceres y
sus fases precursoras o en pruebas de screening rutinarias como se
hacen para cánceres particulares, como p.ej. examen de frotis,
p.ej. en tests de screening de lesiones cervicales, lavados
bronquiales para cáncer de pulmón o de heces para lesiones del
tracto gastrointestinal, p.ej. lesiones colorrectales.
El método según el presente invento es aplicable
a todo tipo de condiciones médicas relevantes.
Condiciones médicas relevantes que se usan según
el presente invento, son p.ej. composición de tejidos, fluidos
corporales, secreciones, lavados o frotis. Estas condiciones pueden
comprender p.ej. la composición celular de fluidos corporales como
la sangre, la composición de la linfa o la composición del semen.
En este contexto las composiciones pueden ser p.ej. la falta o
presencia de ciertos tipos celulares (p.ej. patógenos como virus
etc., células preneoplásticas, neoplásticas y/o displásticas,
etc.), la presencia o ausencia de patrones de diferenciación de
ciertos tipos de células, el número total de ciertos tipos de
células (p.ej. eritrocitos, leucocitos, esperma, etc.), el número
total de células de cualquier tipo de células o la fracción de
células de otras características particulares existentes o no en la
muestra.
Además, las condiciones médicas relevantes pueden
abarcar alteraciones relacionadas a células o tejidos. Las
condiciones para ser diagnosticadas pueden abarcar parámetros
relativos a células en muestras de tejidos citológicas o
histológicas. Las condiciones pueden abarcar tipos de diferenciación
de células en una muestra de tejido, como muestras de resección
quirúrgica, biopsias, frotis, lavados, etc. Tales condiciones pueden
abarcar p.ej. alteraciones congénitas, inflamatorias, mecánicas,
traumáticas, vasculares, degenerativas, de crecimiento, neoplasmas
benignos y malignos. Otro aspecto de las condiciones según el
presente invento puede comprender las condiciones caracterizadas por
la presencia o ausencia de características de proliferación.
Condiciones caracterizadas por la presencia o ausencia de
características de proliferación pueden deberse p.ej. a alteraciones
proliferativas de células.
Alteraciones de proliferación celular según el
presente invento comprenden enfermedades caracterizadas por
propiedades de crecimiento anormal de células o tejidos respecto a
propiedades de crecimiento de células o tejidos de control normal.
El crecimiento de células o tejidos puede estar p.ej. inusualmente
acelerado, decelerado o regulado anormalmente. La regulación anormal
indicada antes puede deberse a presencia o ausencia de respuestas no
silvestres de células o tejidos ainfluencias reguladoras naturales
del crecimiento. Las anormalidades de crecimiento de células o
tejidos pueden ser p.ej. neoplasias o hiperplasias.
En una incorporación, las alteraciones de células
proliferativas son tumores que pueden abarcar tumor de cabeza y
cuello, tumores del tracto respiratorio, tumores del tracto
gastrointestinal, tumores del sistema urinario, tumores del sistema
reproductor, tumores del sistema endocrino, tumores del sistema
nervioso central y periférico, tumores cutáneos y sus apéndices,
tumores de tejidos blandos y huesos, tumores del sistema
hematopoyético y linfopoyético, etc. Los tumores pueden comprender
p.ej. neoplasmias como tumores benignos y malignos, carcinomas,
sarcomas, leucemias, linfomas o displasias. En una incorporación
particular, el tumor es p.ej. un cáncer de cabeza y cuello, cáncer
del tracto respiratorio, cáncer del tracto gastrointestinal, cáncer
de piel y sus apéndices, cáncer del sistema nervioso central y
periférico, cáncer del sistema urinario, cáncer del sistema
reproductor, cáncer del sistema endocrino, cáncer de tejidos blandos
y hueso, y cáncer del sistema hematopoyético y linfopoyético. En una
incorporación, el método según el presente invento también se
relaciona con la detección de células diseminadas tumorales o
metástasis.
En una incorporación del invento, el carcinoma es
p.ej. un cáncer cervical, un cáncer de colon, un cáncer gástrico, un
cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, etc.
Una muestra en bruto según el método de el
presente invento puede comprender toda muestra, que comprende
células o restos de ellas. Las células pueden p.ej. ser procariotas
o eucariotas. Además, las muestras pueden comprender muestras
clínicas como p.ej. secreciones, frotis, lavados, fluidos
corporales, sangre, orina, semen, heces, bilis, linfa, médula ósea,
biopsias y muestras de células y tejidos. Las biopsias que se usan
en el contexto del presente invento pueden comprender p.ej. muestras
de resecciones de tumores, muestras de tejidos preparadas por medios
de endoscopia o biopsias de aguja de órganos. Además, cada muestra
que potencialmente contiene moléculas marcadoras a ser detectadas
pueden ser una muestra según el presente invento. En una
incorporación del invento, la muestra comprende frotis cervicales,
lavados bronquiales, heces etc. El material en bruto que se usa en
el contexto del presente invento puede comprender muestras de
células o tejidos fijadas o conservadas. También pueden utilizarse
células conservadas en soluciones adecuadas (alcohol, etc.) o
muestras fijadas de tejido como muestras en bruto en los métodos
según el presente invento.
Según el presente invento se solubilizan las
muestras en bruto en un disolvente adecuado. Estos disolventes
pueden ser soluciones acuosas de agentes caotrópicos, tales como
urea, GuaSCN, formamida; de detergentes p.ej. de tipo aniónico (SDS,
N-lauril sarcosina, deoxicolato sódico,
alkil-aril sulfonatos, sulfatos de alcoholes de
cadena larga (grasos), sulfatos y sulfonatos de olefinas, sulfatos y
sulfonatos de alfaolefinas, monoglicéridos sulfatados, éteres
sulfatados, sulfosuccinatos, alkanosulfonatos, ésteres de fosfato,
alkilisotionatos, ésteres de sucrosa), detergentes catiónicos (p.ej.
cloruro de cetil trimetilamonio), detergentes no fónicos (p.ej.
Tween 20, Nonidet P-40, Triton
X-100, NP-40, Igepal
CA-630,
N-Octil-glucósido) o detergentes
anfóteros (p.ej. CHAPS,
3-dodecil-dimetilamonio-propano-l-sulfonato,
óxido de laurildimetilamina) y/o de hidróxidos alcalinos como NaOH o
KOH. Se designa el disolvente de forma que disuelva las células, los
restos celulares, los ácidos nucleicos, los polipéptidos, lípidos y
otras biomoléculas potencialmente presentes en la muestra en bruto.
La solución para disolver las muestras en bruto según el presente
invento puede además comprender uno o más agentes que prevengan la
degradación de componentes en las muestras en bruto. Estos
componentes pueden comprender p.ej. inhibidores enzimáticos como de
proteinasas, inhibidores de RNAsas, inhibidores de DNAsas etc. En
una incorporación del presente invento se lisa la muestra
directamente en la forma obtenible de los individuos testados. En
otra incorporación del presente invento puede purificarse la muestra
además antes de ser lisada. Esta purificación puede comprender lavar
contaminantes como moco y similares, separar o concentrar
componentes celulares, preservar y transportar células. Así los
componentes celulares de las muestras en bruto se incluyen en una
única solución muestral.
La preparación de una muestra para usarse en un
método como el indicado aquí puede también contener varias fases de
preparación de la muestra, como separación de componentes
insolubles, aislamiento de polipéptidos o ácidos nucleicos,
preparación de péptidos o ácidos nucleicos fijados a la fase sólida
o la preparación de lechos, membranas o cortes a las cuales se
acoplan covalente o no covalentemente las moléculas a ser
determinadas.
Según el presente invento, la detección de
moléculas marcadoras se realiza directamente desde esta solución. La
detección puede realizarse en solución o usando reactivos fijados a
una fase sólida. La detección de uno o varios marcadores moleculares
puede realizarse en una mezcla de reacción única o en dos o más
mezclas de reacción separadas. Las reacciones de detección de
moléculas marcadoras pueden p.ej. realizarse simultáneamente en
vasos de reacción multi-pozos. Los marcadores
característicos de disfunciones celulares proliferativas puede
detectarse usando reactivos que reconozcan específicamente estas
moléculas. Simultáneamente pueden detectarse los marcadores de
normalización usando reactivos que los reconozcan específicamente.
La reacción de detección para cada clase de marcador comprende una
o más reacciones con agentes detectantes que reconocen las moléculas
marcadoras iniciales o las moléculas anteriores preferentemente
(p.ej. anticuerpos primarios) usados en reconocer los marcadores
iniciales. La reacción detectora además puede comprender una
reacción informante que indica el nivel de lo: marcadores
característicos de las disfunciones proliferativas o los marcadores
de normalización.
La sonda detectora de moléculas marcadoras usada
en el contexto del presente invento puede se una molécula que se una
específicamente a tales moléculas marcadoras. La sonda puede ser
p.ejun agente que se une a antígenos (monoclonales o policlonales),
fragmentos de anticuerpos c moléculas artificiales que comprenden
epitopos que se unen a antígenos, moléculas que se unen a ADN o ARN
como proteínas o ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos unidos a
otros ácidos nucleicos pueden ser p.ej. oligonucleótidos para el
propósito de detección o cebadores.
Se considera que una molécula reconoce a otras
moléculas si interacciona específicamente con tal molécula. La
interacción específica puede ser p.ej. un enlace específico a o de
la otra molécula.
La reacción informante puede ser una reacción que
produce una sustancia coloreada. En una incorporación del presente
invento, las sustancias informantes correlacionadas con los
marcadores particulares desarrollan diferentes colores. En otra
incorporación, el informador específico del marcador normalizador
puede ser una molécula que apague la señal producida por la molécula
informante específica del marcador, característica de la condición
médica relevante, en dependencia del nivel de marcador de
normalización presente en la muestra. En todavía otra incorporación,
las reacciones informantes pueden producir tintes fluorescentes con
características de diferentes longitudes de onda. En una posterior
incorporación del presente invento, la reacción informante puede
constar de reacciones emisoras de luz de diferentes longitudes de
onda características para sustancias informantes específicas de
cada marcador a detectar. En otra incorporación de este invento, la
reacción informante puede comprender la emisión de radiactividad y
métodos adicionales para visualizar o cuantificar la radiación. En
una incorporación, las diferentes moléculas marcadoras pueden
reconocerse mediante agentes radiactivos que llevan radionucleótidos
de diferentes niveles energéticos, pudiéndose distinguir las señales
relativas a las moléculas marcadoras.
Formatos aplicables a la reacción detectora según
el presente invento pueden ser técnicas de bloteo como
Western-Blot, Southern-blot,
Northern-blot. Las técnicas de bloteo son
consideradas entre los técnicos, pudiendo realizarse p.ej. como
electro-blot, bloteo semi-húmedo,
bloteo por vacío o dot-blot. Además pueden aplicarse
métodos inmunológicos para detectar moléculas como p.ej. la
inmunoprecipitación o ensayos inmunológicos como ELISA, RIA, ensayos
de flujo lateral, tiras inmunocromatográficas etc.
El método de detección del nivel de moléculas
marcadoras en una incorporación del presente invento es cualquier
método capaz p.ej. de detectar muy pequeñas cantidades de
moléculasespecíficas en muestras biológicas. Puede aplicarse además
cualquier método de moléculas marcadoras independientemente de la
sensibilidad. La reacción detectora según este invento puede abarcar
p.ej. reacciones de detección al nivel de ácidos nucleicos y/o
reacciones de detección al nivel de polipéptidos. En una
incorporación del invento, la detección de las moléculas marcadoras
puede comprender la detección de variantes de empalme particular. En
otra incorporación del presente invento, el método de detección
puede comprender la detección de modificaciones de moléculas
marcadoras como fosforilación o giucosilación etc. de polipéptidos o
la metilación de moléculas de ácido nucleico en muestras.
En una incorporación del presente invento, la
detección del nivel de moléculas marcadoras se realiza por detección
del nivel de ácidos nucleicos codificantes de moléculas marcadoras o
fragmentos de ellas presentes en la muestra. Los métodos de
detección de las moléculas de ácidos nucleicos los conocen los
técnicos. El procedimiento para la detección de ácidos nucleicos
puede realizarse p.ej. mediante una reacción de enlace de la
molécula a detectar a sondas complementarias de ácido nucleico,
proteínas de enlaces específicos para ácidos nucleicos u otras
entidades que reconozcan y unan específicamente los mencionados
ácidos nucleicos. Este método puede realizarse in vitro o
directamente in situ, p.ej. durante la detección de
reacciones de tinción. Otra forma de detectar las moléculas
marcadoras en una muestra al nivel de ácidos nucleicos realizado en
el método según este invento es una reacción de amplificación de
ácidos nucleicos, que puede realizarse de forma cuantitativa, p.ej.
la reacción en cadena de la polimerasa. En una incorporación del
presente invento puede usarse p.ej. RT PCR a tiempo real para
cuantificar la cantidad de nivel de ARN marcador en muestras de
alteraciones proliferativas de células.
En otra incorporación del invento, la detección
del nivel de moléculas marcadoras se realiza determinando el nivel
de expresión de una proteína. La determinación de moléculas
marcadoras a nivel proteico puede realizarse p.ej. en una reacción
que comprenda un agente ligante específico para detectar las
moléculas marcadoras. Estos agentes de unión pueden comprender p.ej.
fragmentos que enlacen anticuerpos y antígenos, anticuerpos híbridos
bifuncionales, peptidomiméticos que contienen epitopos mínimos que
se unen a antígenos etc. Los agentes de unión pueden ser usados en
numerosas técnicas de detección diferentes, como
western-blot, ELISA, ensayo de flujo lateral,
aglutinación de látex, tiras inmunocromatográficas o
inmuno-precipitación. En general la detección basada
en agentes de unión puede realizarse in vitro o directamente
in situ p.ej. durante una reacción de teñido
inmunocitoquímico. Otros métodos adecuados para determinar la
cantidad de polipéptidos particulares en solución de muestras
biológicas pueden usarse según el presente invento.
Los técnicos conocen métodos usuales de detección
de estados modificados de ácidos nucleicos y/o polipéptidos.
Los métodos de detección de la metilación de
ácidos nucleicos son usualmente conocidos a los técnicos y pueden
comprender p.ej. métodos que emplean pretratamiento químico de
ácidos nucleicos p.ej. con bisulfito sódico, permanganato o
hidrazina y la consecuente detección de la modificación mediante
endonucleasas específicas de restricción o mediante sondas
específicas p.ej. en el transcurso de una reacción de amplificación.
La detección de metilación puede además realizarse usando
endonucleasas de restricción específicas de metilación. Métodos para
la detección de estados metilados en ácidos nucleicos se muestran
p.ej. en la aplicación de las patentes EP02010272.9, US5856094,
WO0031294, US6331393 etc. Estos documentos se incorporarán aquí como
referencia.
La detección de estados modificados de
polipéptidos puede comprender p.ej. agentes de enlace que reconozcan
específicamente estados modificados o no modificados de
polipéptidos. Enzimas alternativas como fosfatasas o glicolasas
pueden usarse para eliminar modificaciones en moléculas. La
presencia o ausencia de modificaciones puede determinarse pues al
determinar el cambio de masa de las moléculas mediante
electroforesis, cromatografía, espectrometría de masas etc., antes y
después de incubar con un enzima respectivo.
En otra incorporación del presente invento se
detectan series de moléculas marcadoras a nivel de polipéptidos,
detectándose simultáneamente otra serie de moléculas marcadoras y/o
todas o algunas de las mismas moléculas marcadoras a nivel de ácidos
nucleicos.
Los marcadores asociados con condiciones
celulares médicamente relevantes pueden p.ej. ser moléculas que
influyan y/o reflejen características de proliferación y/o
diferenciación de células y/o tejidos. Estas moléculas pueden
comprender proteínas reguladoras del ciclo celular, proteínas
asociadas con la replicación del ADN, proteínas transmembrana,
proteínas receptoras, proteínas transductoras de señales, poteínas
unidas al calcio, proteínas que contienen dominios de enlace a ADN,
metaloproteinasas, kinasas, inhibidores de kinasas, chaperonas,
proteínas deembriogénesis, proteínas de choque térmico o enzimas que
modifican otras proteínas después de su traducción, regulando así su
actividad, o ácidos nucleicos que codifican las citadas proteínas.
También mARN codificando las citadas proteínas pueden ser moléculas
marcadoras útiles según el presente invento. En una incorporación,
el marcador asociado con la alteración proliferativa celular puede
expresarse p.ej. sólo en células afectas a tal alteración, pueden no
expresarse dichas células o sobreexpresarse en ellas.
Las moléculas marcadoras para usar según este
invento pueden incluir uno o varios marcadores elegidos entre p13.5,
p14, p15, p16, p19, p21, p27, p53, pRb, p14ARF, ciclina A, ciclina
B, ciclina E, MDM-2, MCM2, MCM5, MCM6, CDC2, CDC6,
Id1, osteopontina, GRP, dipeptidasa renal, her2/neu, receptor
TGF\betaII, marcadores asociados a HPV , p.ej. derivados de genes
L1, L2, E1, E2, E4, E5, E6 o E7, etc. de HPV. Una selección de
marcadores útil en una incorporación del presente invento para
detectar condiciones médicamente relevantes se muestra en la
siguiente
\hbox{tabla 1.}
En una incorporación el marcador de la condición
médica relevante puede ser un marcador de tumores. Las moléculas
marcadoras características de tumores pueden ser p.ej. proteínas que
se expresan de forma no silvestre en tumores comparado con el tejido
normal de control. La expresión de tipo no silvestre usada aquí
puede comprender niveles aumentados o reducidos de expresión o falta
de expresión o expresión de formas de tipo no silvestre de las
moléculas respectivas. La expresión de formas de tipo no silvestre
de proteínas pueden abarcar la expresión de formas mutadas de
proteínas, surgidas de inserción, eliminación, sustitución o
mutilaciones estructurales u otro tipo de mutilaciones conocidas en
proteínas o ácidos nucleicos. En todos los casos, la expresión de
proteínas de tipo no silvestre o de niveles de proteínas de tipo no
silvestre, las proteínas, polipéptidos o fragmentos de éstos o
ácidos nucleicos que codifican estas proteínas, polipéptidos o
fragmentos de estos ácidos nucleicos pueden usarse como marcadores
moleculares asociados con tumores, entendiéndose pues bajo el
término de "marcadores de tumores", tal y como se usa en el
contexto del presente invento. Las proteínas que muestran expresión
de tipo no silvestre en asociación con tumores, se indican p.ej. en
los documentos WO9904265A2, WO0149716A2, WO0055633A2 y WO0142792A2,
que se incorporan aquí como referencia.
En una incorporación del invento, el marcador
característico de la condición médica relevante puede ser una
proteína reguladora del ciclo celular como p.ej. la ciclina, una
kinasa ciclil-dependiente o un inhibidor de kinasa
ciclil-dependiente. En otra incorporación del
presente invento, el marcador característico de la condición médica
relevante puede ser un marcador asociado a una infección pasajera o
persistente vírica. La infección vírica puede comprender la
infección por el virus del papiloma humano (HPV) de alto o bajo
riesgo. El HPV de alto riesgo puede abarcar subtipos HPV, tales como
HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 y 58. Los marcadores para
la infección HPV pueden abarcar productos de expresión HPV de los
genes HPV L1, L2, E2, E4, E5, E6 o E7. En una tercera incorporación
del invento puede usarse un marcador característico de una infección
vírica en combinación con algún otro marcador para una condición
médica relevante, como p.ej. en combinación con una proteína
reguladora del ciclo celular. Combinaciones de moléculas marcadoras
que pueden ser de un interés especial respecto a la asociación HPV
se incluyen en el documento WO0208764, que se da aquí como
referencia.
En una incorporación las proteínas reguladoras
del ciclo celular que se usan en combinación con marcadores HPV
pueden elegirse p.ej. de un grupo que comprende pRb, p53, p14 ARF y
inhibidores de kinasa ciclin-dependiente. En una
incorporación especial se puede usar p.ej. pl6^{INK4a} en
combinación con marcadores para infecciones HPV (p.ej. L1, L2, E2,
E4, E5, E6 o E7).
Los marcadores normalizantes según este invento
pueden abarcar p.ej. genes de mantenimiento como actina, gapdh,
proteínas de histona, fosfolipasa,
\beta2-microglobulina, proteínas asociadas con la
proliferación activa de células como Ki67, PCNA o estatina, o
proteínas características de ciertos tipos celulares como CK20 en
las células epiteliales o cualquier antígeno específico de la
superficie celular. Además, estructuras de carbohidratos presentes
en glicoproteínas, proteoglicanos, receptores de lectina como el
receptor concanavalina A, mucinas y enzimas actuantes en la
biosíntesis de estas moléculas, como las GalNac transferasas y las
oligosacariltransferasas también pueden servir como marcadores de
normalización. El tipo de proteína marcadora tiene que elegirse
según la información, que proporcionará el marcador. En un
principio, los marcadores útiles para ciertas condiciones
médicamente relevantes pueden bajo ciertas circunstancias ser útiles
como marcadores de normalización. Una selección de marcadores útiles
en los métodos del presente invento se da en la tabla 1.
Tanto en cuanto a marcadores para condiciones
médicalmente relevantes como en cuanto a marcadores de
normalización, estados de moléculas modificados (como polipéptidos y
ácidos nucleicos) pueden usarse como marcadores en el método según
el presente invento. Por ejemplo pueden usarse polipéptidos
fosforilados, glicosilados o polipéptidos modificados o ácidos
nucleicos metilados de otra forma como marcadores en el método según
el presente
invento.
invento.
La normalización usada según este invento puede
comprender cualquier método adecuado para relacionar los niveles
detectados de marcadores a parámetros útiles para evaluar el
diagnóstico. Un aspecto de esta normalización puede ser la
reconstrucción de información citológica e histológica relevante
contenida en la muestra en bruto mediante marcadores moleculares
adecuados detectables en las soluciones de muestra. La normalización
puede abarcar p.ej. la detección del número total de células
presentes en la muestra, la presencia o ausencia de ciertos tipos de
células en una muestra, la presencia o ausencia de un organismo o de
células de un organismo en una muestra, del número de células de
cierto tipo de célula u organismo presente en la muestra, de las
características proliferativas de células presentes en la muestra o
del patrón de diferenciación de las células presentes en la
muestra.
\newpage
Según el presente invento, la normalización puede
abarcar la determinación de la presencia de un número de células
(humanas) dadas en una muestra. Este es un aspecto crucial del
invento. En ciertas incorporaciones sólo pueden evitarse resultados
falsos (especialmente falsos negativos) de tests si el procedimiento
de ensayo verifica que la muestra contiene los materiales (p.ej.
células, tejidos, organismos, etc.) necesarios para realizar el test
particular. En diversos tests se tendrá que asegurar que la muestra
contiene células. En una gran parte de incorporaciones del invento,
la verificación de la idoneidad de la muestra no sólo asegurará la
presencia de células, sino que incluirá la detección de la presencia
de células de diferente origen o de cierto tipo especial de
célula.
Así, la normalización también puede comprender la
determinación de células de cierto origen, como p.ej. células de
cierto órgano o de cierta localización histológica particular, como
la detección de células de diferentes regiones de epitelio o de
células del tejido conjuntivo, células originadas de la lámina basal
de un tejido o de células de origen heterólogo, como células
metastáticas. Ello puede ser necesario en algunos casos porque debe
haber células que bajo ciertas circunstancias expresan un marcador
que podría utilizarse para detectar una condición médica relevante
como la neoplasia o displasia bajo ciertas condiciones normales. La
normalización usada de acorde al presente invento puede abarcar la
detección de la presencia o ausencia y/o del nivel de tipos de
células que puedan posiblemente contribuir al nivel total de un
marcador particular seleccionado para diagnosticar una condición
médica relevante.
En una incorporación puede usarse el método para
detectar cánceres como lesiones cervicales. Marcadores y
combinaciones de ellos, útiles para este propósito de detección
están incluidos p.ej. en los documentos WO0208764 y EP1217377, que
incorporamos aquí como referencia. En esta incorporación el test
puede realizarse usando cualquier muestra de origen cervical. La
muestra puede comprender p.ej. biopsias o microbiopsias de cuello
uterino o frotis tomados de la región cervical. Los frotis
cervicales usados aquí son muestras que pueden ser obtenidas p.ej.
usando un dispositivo adecuado como un cepillo, tampón, espátula o
similar, contactado con el cuello uterino durante el procedimiento
de muestreo. El dispositivo de muestreo puede ser cualquiera que
utilicen médicos para pruebas convencionales o un sistema de
automuestreo.
Marcadores moleculares prometedores para aumentar
la evaluación de frotis cervicales son p.ej. p16^{INK4a}, p14ARF,
ciclina E, ciclina A, ciclina B, MN, her2/neu,
mdm-2, bcl-2, receptor EGF,
marcadores indicativos de la infección por el virus del papiloma
humano, pRb, p53, etc. que pueden usarse para detectar células
displásticas y neoplásticas. La normalización según el presente
invento para el propósito de análisis de frotis cervicales puede
incluir la detección de la presencia de células humanas en general,
la detección de células del epitelio cervical, la detección de la
presencia de células endocervicales y ectocervicales, así como la
detección de células de origen endometrial. Es un paso crucial
asegurar la presencia de células endo y ectocervicales dentro de la
muestra para asegurar que el espécimen se tomó en la zona de
transformación cervical, donde surgen la mayoría de displasias y
neoplasias. Si no hay ahí tales células, la muestra no es adecuada
para el procedimiento de prueba al resultar que da resultados
negativos falsos. Como p16^{INK4a} puede ser expresado en células
endométricas normales, puede ser necesaria la normalización del
nivel de expresión p16^{INK4a} respecto al número de células
endometriales.
Para habilitar un diagnóstico de confianza, la
normalización además debe incluir la detección de presencia o
ausencia de los componentes celulares mencionados en la muestra, y
además la detección del nivel total de cierto tipo de célula o de la
fracción que un tipo particular de célula contribuye respecto al
número total de células en la
muestra.
muestra.
Así, en una incorporación el nivel detectado de
proteína p16^{INK4} a puede normalizarse a condiciones citológicas
representadas por la muestra particular, de forma que puede
constatarse si el nivel detectado de proteína p16^{INK4a} es
indicativo de células cervicales que sobreexpresan p16^{INK4a} o
si hay abundantes células endometriales presentes en la muestra,
imitando la sobreexpresión de p16^{INK4a}.
En aún otra incorporación del invento puede
utilizarse el método indicado aquí para detectar disfunciones del
tracto respiratorio. En el diagnóstico del cáncer pulmonar de
células pequeñas, la detección de la enolasa específica de neuronas
(NSE) es uno de los marcadores empleados. Las muestras de
especimenes tumorales se proporcionan por broncoscopia,
coleccionando células mediante cepillos o lavados broncoalveolares.
Al estar NSE también expresada en algunas células normales en el
pulmón, el nivel de expresión detectado en la muestra disuelta tiene
que ser puesto en relación con el marcador de normalización (p.ej.
actina) para detectar la cantidad de células presentes en la
muestra.
muestra.
Una tercera incorporación del presente invento es
la detección de lesiones del tracto gastrointestinal como lesiones
colorrectales de muestras de heces. En este caso, el origen de
ácidos nucleicos y/o polipéptidos indicativos detectables en
muestras de heces puede ser crucial para evaluar el diagnóstico.
Según el presente invento, es posible determinar el origen (tipos de
células / organismo) de las moléculas marcadoras empleadas. Así
pueden eliminarse más bien los falsos resultados basados p.ej. en la
detección de moléculas de marcadores provenientes de alimentos
ingeridos por individuos que de lesiones de la mucosa del tracto
gastrointestinal. Además, pueden eliminarse artefactos producidos
por la presencia de trazas de marcadores de la circulación
sanguínea u originados de esputo ingerido etc. usando los métodos
indicados aquí.
Otro aspecto del presente invento es el kit de
ensayo para realizar el método según el presente invento. Puede ser
p.ej. un kit diagnóstico, analítico o de investigación.
Un kit según el presente invento puede
incluir:
- a)
- reactivos para la detección de moléculas de marcador,
- b)
- los reactivos y tampones usualmente usados para llevar a cabo la reacción detectora, como tampones, marcadores de detección, sustancias portadoras y otros,
- c)
- uno o más marcadores y/o muestras representativas de las condiciones médicas relevantes a diagnosticar para realizar reacciones de control y/o positivas,
- d)
- una o más muestras de marcador de normalización para realizar reacciones de control y/o positivas.
El reactivo para la detección de las moléculas
marcadoras puede ser cualquier agente capaz de unirse a la molécula
marcadora. Tales reactivos incluyen proteínas,
(poli)péptidos, ácidos nucleicos, ácidos nucleicos pépticos,
glucoproteínas, proteoglicanos, polisacáridos o lípidos.
Los marcadores característicos de las condiciones
médicas relevantes y/o muestras de marcador de normalización para
realizar reacciones de control positivas y/o negativas pueden
incluir p.ej. ácidos nucleicos de forma aplicable como solución o
sal, péptidos de forma aplicable, muestras de sección tisular,
microorganismos o líneas de células positivas o negativas.
En una incorporación del invento, la detección de
las moléculas marcadoras se realiza al nivel de polipéptidos. En
esta incorporación, el agente de enlace puede ser un anticuerpo
específico de las moléculas de marcador o de fragmentos de éstas.
Además, los fragmentos de enlace pueden incluir fragmentos de
antígeno como fragmentos Fab, anticuerpos de cadena simple,
anticuerpos híbridos bifuncionales, peptidomiméticos conteniendo
epitopos mínimos unidos a antígenos etc. Además el agente de enlace
puede ser una lectina unida a una estructura específica de
carbohidrato en la molécula del marcador.
En otra incorporación del kit de ensayo, la
detección de moléculas marcadoras se realiza al nivel de ácido
nucleico. En esta incorporación del invento, el reactivo para la
detección puede ser p.ej. una sonda de ácido nucleico o un cebador
complementario inverso al mencionado marcador de ácido nucleico.
Usando un anticuerpo dirigido contra la
citokeratinal8 (CK18) en un procedimiento de teñido
inmunohistoquímico, puede detectarse una reacción positiva en el
epitelio columnar de la endocerviz (A), mientras que el epitelio
escamoso de la ectocerviz no muestra ningún teñido especial (B). El
teñido inmunohistoquímico con un anticuerpo dirigido contra la
citokeratina 10/13 (CK 10/13) no muestra ninguna tinción del
epitelio columnar de la endocerviz (C), mientras que hay un fuerte
teñido del epitelio escamoso de la ectocerviz (D). Así CK18 puede
usarse como marcador específico para detectar células epiteliales
columnares de la endocerviz y CK10/13 como marcador específico de
células epiteliales escamosas de la ectocerviz. Ver el ejemplo 1
para detalles experimentales.
Los números 1 a 4 se refieren a muestras (frotis
cervicales) obtenidas de pacientes individuales. La detección
inmunoblot se realizó usando anticuerpos específicos dirigidos
contra la citokeratina 8 (CK8) y anticuerpos específicos dirigidos
dirigidos contra p16^{INK4a} (p16). Las muestras del paciente 1, 2
y 3 no muestran señales de p16^{INK4a}. Ello indica que no
existían células displásticas cervicales en estas muestras. La
muestra del paciente 4 muestra una fuerte señal de p16^{INK4a}
indicando que había células displásticas cervicales en la muestra.
Las bandas superiores muestran las señales específicas para
citokeratina 8. En la muestra 1, 3 y 4 puede detectarse citokeratina
8, mientras que en la muestra 2 no puede verse ninguna señal. Ello
indica que las células columnares endocervicales estaban presentes
en las muestras 1, 3 y 4 y ausentes en la muestra 2. Al ser la
presencia de células columnares epiteliales endocervicales uno de
los parámetros para frotis cervicales adecuados, la muestra 2 se
considera inadecuada, no pudiendo sacarse ninguna conclusión
diagnóstica del resultado negativo de la detección de p16^{INK4a}.
Las muestras 1, 3 y 4 se consideran adecuadas. Así, basándose en la
señal negativa de la muestra 1 y 3 para p16^{INK4a}, podría
concluirse que estos pacientes no tenían displasia cervical. La
muestra 4 mostró una señal positiva para p16^{INK4a}, indicando la
presencia de una lesión displástica cervical en este paciente. Ver
el ejemplo 2 para los detalles experimentales.
Se analizaron muestras de cuatro pacientes con
displasias cervicales avanzadas (ver diagnóstico), utilizando
análisis Western blot (panel superior de la figura). Para el blot
izquierdo se realizó una detección inmunoblot, usando anticuerpos
específicos para (3-actina y p16^{INK4a} para el
blot central se usaron anticuerpos específicos de la citokeratina
10/13 y para el blot derecho, anticuerpos específicos de la
citokeratina 18. La (3-actina, CK18, y CK10/13 se
usaron como marcadores, demostrando la idoneidad de la muestra. La
\beta-actina indica la presencia de cualquier
célula, CK10/13 la presencia de células escamosas ectocervicales, CK
18 la presencia de células columnares endocervicales. Para las
muestras del paciente 1 y 2 la detección inmunoblot muestra posibles
señales para todos los marcadores de idoneidad aplicados (CK10/13,
CK 18, \beta-actina) y para el marcador (p16 INK4a
) indicativo de células displásticas. Para las muestras 3 y 4, las
detecciones inmunoblot sólo muestran señales muy débiles (paciente
3) o ninguna señal (paciente 4) para los marcadores de idoneidad,
por lo que la señal negativa p16^{INK4a} no soporta ninguna
conclusión diagnóstica. Ver detalles experimentales en el ejemplo 3.
El panel inferior de esta figura muestra los resultados del análisis
ELISA. Se detectaron señales positivas para los marcadores de
idoneidad (CK10/13, CK 18) para las muestras del paciente 1 y 2,
mientras que para las muestras del paciente 3 y 4 no se observaron
señales para CK10/13 y CK 18. Así, los resultados del análisis ELISA
se parecen a los del Western blot, pudiendo sacarse las mismas
conclusiones. Ver detalles experimentales en el ejemplo 3.
Se dan los siguientes detalles a título
ilustrativo, no limitando el alcance del invento indicado aquí.
Para evaluar marcadores indicando la idoneidad de
frotis cervicales, se tintaron secciones cervicales (fijadas en
solución de formaldehído al 4% y embebidas en parafina) con
anticuerpos dirigidos contra la citokeratina 18 (marcador de
epitelio columnar endocervical escamoso). La figura 1 muestra el
teñido específico del epitelio endocervical con anticuerpo
anti-citokeratina 18 y teñido específico del
epitelio ectocervical con anticuerpo
anti-citokeratina 10/13. El experimento se realizó
como sigue:
Se desparafinaron secciones fijadas en formol y
embebidas en parafina, en baño de xileno durante 5 min (se repitió
el paso una vez), evacuándose el líquido excesivo y colocándose los
cortes en etanol 95-96% durante 3 (\pm1) min, en
etanol 70% durante 3 (\pm1) min (se repitió el paso una vez), yen
agua destilada finalmente durante un mínimo de 30 seg. Para
recuperar el epitopo, se colocaron los cortes en un vaso Coplin,
hirviéndose durante 40 min a 95-99°C en un tampón de
citrato 10 mM pH 6,0. Los cortes se dejaron enfriar durante 20 min
(\pm1 min) a TA en este tampón. Los cortes se cubrieron con
reactivo bloqueador de peroxidasa (3% H_{2}O_{2}; NaN_{3} 15
mM), incubándose durante 5 (\pm1) min a TA. Después de 5 min de
lavado en el tampón, se incubaron los cortes con anticuerpos
primarios (CK 10/13: DE-K13, 1:50, DAKO; CK 18:
K18,7, 1 \mug/ml, dianova) durante 30 min.
Seguidamente se rociaron los cortes con tampón de
lavado y se lavaron en éste durante 5 min a TA. Después de 30 min de
incubación con EnVision (complejo listo para usar de peroxidasa de
rábano picante anti-ratón; DAKO), se lavaron los
cortes 3x5 min, incubándose en sustrato DAB durante 10 min,
contratintándose con hematoxilina y montándose con medio
Faramount.
Para evaluar si el análisis western blot de
muestras solubilizadas permite evaluar el diagnóstico de las
lesiones cervicales, se sometieron muestras clínicas de diagnóstico
conocido a un análisis inmunoquímico en base a moléculas marcadoras
después de la tisis de la muestra.
Las muestras de material clínico (frotis
cervicales) se analizaron mediante análisis Standard Western como
sigue:
En resumen, el material clínico se solubilizó en
un primer paso hirviéndolo (5min, 95°C) en tampón de muestra de
proteína Lämmli (100 mM Tris pH 6,8, 2% SDS, 200 mM DTT, 0,05% BpB)
antes de sonicarlo. En un segundo paso se resolvieron las muestras
proteicas en un SDS-PAGE (12% acrilamida),
transfiriéndose seguidamente a una membrana de nitrocelulosa
mediante bloteo por tanque (Towbin et al., 1979, Proc Natl
Acad Sci;76:4350-4354). En un posterior paso se
bloquearon las membranas para evitar la unión de anticuerpos
inespecíficos (leche desnatada seca 10% en PBS), incubándose
seguidamente con un anticuerpo de ratón específico monoclonal (CK 8:
3513H11, 1:100, DAKO; p16^{INK4a}:D7D7, 1:140, mtm laboratories).
La unión del anticuerpo específico se visualizó por reactivos
secundarios conjugados de peroxidasa de rábano picante (unidos al
anticuerpo específico del marcador), catalizando sustratos emisores
de fotones.
Se usó citokeratina 8 (CK 8) como marcador
específico de células endocervicales, indicando la idoneidad de la
colección de muestras en el presente experimento. Se usó el
inhibidor de la kinasa ciclina dependiente p16^{INK4a} como
marcador relacionado con la enfermedad específica.
Los resultados de este experimento se dan en la
figura 2. Los números 1 a 4 se refieren a muestras de pacientes
individuales. El análisis citológico paralelo de los frotis indicó
una composición celular normal para la mujer 1 y 3. En la mujer 2 no
se logró obtener ningún diagnóstico debido a materialcelular escaso.
En la mujer 4, se diagnosticó un elevado grado de displasia.
Obsérvese que la banda superior (CK 8) se refiere al marcador de
normalización específico de células endocervicales citokeratina 8,
indicando la idoneidad de la colección de muestras. La banda
inferior indica el marcador p16^{INK4a} relativo a la enfermedad
específica. El blot muestra para el paciente 4 una señal positiva
para p16^{INK4a} consistente con un elevado nivel de displasia
cervical. Las muestras del paciente 1 y 3 muestran sólo la banda
específica CK 8, indicando recogida adecuada de muestras, pero sin
marcador relativo a enfermedad (p16^{INK4a}), relativo a un
epitelio cervical sano normal. La muestra del paciente 2 no muestra
señal CK 8 alguna debido al bajo número de células en la muestra, no
pudiéndose sacarse ninguna conclusión diagnóstica de la señal
negativa para p16^{INK4a}.
Para evaluar si los resultados del análisis
basado en la solución difieren del diagnóstico de muestras debido a
muestras inadecuadas, se realizó el análisis Western blot de frotis
cervicales de cuatro pacientes diferentes con diagnóstico confirmado
(neoplasia intraepitelial cervical de grado sumo según el
diagnóstico citológico de Pap IVa and Pap IVb). Se usó anticuerpo
contra p16^{INK4a} para indicar la presencia de células
displásticas, usándose anticuerpos contra CK18 y CK10/13 para
demostrar la idoneidad de la muestra. Como se muestra en la figura
3, las muestras de los pacientes 1 y 2 mostraban señales Western
blot para p16^{INK4a} y CK10/13 y CK18 (indicando la idoneidad de
las muestras). Las muestras 3 y 4 fueron negativas para bandas
p16^{INK4a} en Western blot. De todas formas, en estos casos la
\beta-actina y los dos marcadores de citokeratina
mostraron una señal extremadamente débil
(\beta-actina de paciente 3) o negativa (paciente
4 todos los marcadores, paciente 3 marcadores 3 CK) en el análisis
Western blot. Así no puede sacarse ninguna conclusión diagnóstica de
la señal negativa para p16^{INK4a}. El análisis Western blot se
realizó como sigue: Se recogieron muestras de pacientes con un
cepillo cervical, lisándose directamente en tampón de muestra
Laemmli (2% SDS, 60 mM Tris pH 6,8, 0,01%, 100 mM DTT) durante 5 min
a 95°C (1x10^{7} células/ml) con consiguiente sonicación (impulsos
5x5 seg, máxima intensidad). Los lisados se centrifugaron durante
12 min a 16.600xg en una microcentrifugadora, transfiriéndose el
sobrenadante a un nuevo tubo. Se cargaron geles premoldeados de
acrilamida de gradiente linear 4-20% (Criterion
System, Bio-Rad) con 10 \mu (10^{5} células) de
extractos celulares enteros, separándose las proteínas a una
corriente constante de 25 mA durante 45 min. Las proteínas se
transfirieron del gel a una membrana de nitrocelulosa Hybond ECL
(Amersham) por bloteo por tanque standard usando Bio Rad Criterion
Blotter (15 min a 100 voltios constantes y seguidamente 45 min a 50
voltios constantes). La membrana de nitrocelulosa se tintó durante 5
min en solución Ponceau S para asegurar la transferencia proteica.
Se eliminó la solución Ponceau S mediante lavados de 2x10 min en
PBS. Para la inmunodetección, se bloquearon los blots durante la
noche en tampón bloqueador (10% leche en polvo en PBS con 0,1%
Tween-20). Se incubaron los anticuerpos primarios a
diluciones según el fabricante en tampón bloqueador durante 1 h a TA
con agitación (CK18: MAB 3236), 1:1000, CHEMICON; CK 10/13:
DE-K13, 1:500, DAKO, p16^{INK4a} D7D7, 1:140, mtm
laboratories). Después de 6 lavados durante 10 min con PBS/0.1%
Tween-20, se incubaron los blots con HRP de conejo
anti-ratón (DAKO, diluido 1:5.000 en tampón
bloqueador) durante 1 h a TA. Después de 6 lavados durante 10 min
con PBS/0,1% Tween-20, se incubaron las membranas
durante 5 min en solución sustrato (Super Signal West Femto Maximum
Substrate, Pierce), envueltas en una envoltura de plástico y
expuestas a una película de rayos X durante 1-5 min.
Finalmente las películas de rayos X se revelaron, fijaron, secaron y
documentaron con un sistema de imágenes (Bio-Rad).
Las mismas muestras se utilizaron para realizar análisis
ELISA para p16^{INK4a}, CK 10/13, CK18. Las señales detectadas y los resultados fueron similares al análisis Western blot, sacándose las mismas conclusiones.
ELISA para p16^{INK4a}, CK 10/13, CK18. Las señales detectadas y los resultados fueron similares al análisis Western blot, sacándose las mismas conclusiones.
El análisis ELISA se realizó como sigue: Se
cubrieron placas planas de 96 pozos (MaxiSorb; Nunc) con anticuerpo
capturante (p16^{INK4a} : MTM-E6H4, 2 \mug/ml in
PBS, mtm laboratories; CK10: MS481P1ABX, 2 \mug/ml, dianova; CK18:
K18,7, 2 \mug/ml, dianova; 50 \mul/pozo) durante la noche a 4°C.
Las placas se lavaron 6x con PBS/0,1% Tween-20,
bloqueándose con tampón Superblock (Pierce). El extracto
solubilizado de proteína de los frotis cervicales se disolvió en
tampón incubador (PBS, 3% Superblock, 0,1% Tween20), y se añadió por
triplicado a cada pozo. Después de 1 h de incubación a TA, se
lavaron las placas 6x con PBS/0,1% Tween-20,
incubándose con anticuerpo detector con capa de biotina
(p16^{INK4a} : MTM-D7D7) (0,2 \mug/ml, mtm
laboratories, CK10: MS481-BO, 200 \mug/ml,
dianova; CK18: MS142-BO, 200 \mug/ml, dianova; en
tampón de incubación) durante 1 h a TA. Seguidos 6 lavados con
PBS/0,1% Tween-20 TMB, se añadieron 50 \mul de
fosfatasa alcalina revestida de estreptavidina (dilución 1:1000;
Dianova)durante 30 min. Seguidamente se lavaron las placas 6x
con PBS/0,1%. Tween-20 y se añadieron 100 \mul de
sustrato de p-nitrofenilfosfato (PnPP; disuelto en
tampón de dietanolamina) a cada pozo. Se midió la DO 405 nm
(longitud de onda de referencia 620 nm) con lector ELISA (Tecan) al
cabo de 30 min, 1 h y 2 h. Este ejemplo muestra que el formato
sandwich ELISA tiene una sensibilidad, que es adecuada para usar en
los métodos según el presente invento. Para usar en el método
indicado aquí, puede aplicarse el formato sandwich ELISA descrito en
este ejemplo a múltiples moléculas de marcador, como marcadores de
normalización o idoneidad y marcadores característicos de
condiciones médicas relevantes.
Para evaluar si el análisis Western blot de
muestras solubilizadas permite evaluar el diagnóstico de lesiones
pulmonares, se solubilizaron muestras clínicas de diagnóstico
conocido, sometiéndolas a un análisis inmunoquímico en base a
moléculas marcadoras y de normalización.
Las muestras clínicas (células recogidas por
cepillado o lavado broncoalveolar) se analizaron por análisis
Standard Western como sigue: Las células del lavado broncoalveolar
se peletizaron por centrifugación (5 min, 1000 rpm), disolviéndose
el pelet en tampón de muestra proteica Lämmli (100 mM Tris pH 6,8,
2% SDS, 200 mM DTT, 0,05% BpB). Las células obtenidas por cepillado
se disolvieron directamente en tampón de muestra proteica Lämmli
(100 mM Tris pH 6,8, 2% SDS, 200 mM DTT, 0,05% BpB). Se hirvió el
material (5 min, 95°C) antes de sonicarlo. En una segunda fase, los
alícuotas proteicos de la muestra se resolvieron en duplicados en un
SDS-PAGE (12% acrilamida), transfiriéndose
seguidamente a una membrana de nitrocelulosa por bloteo por tanque
(Towbin et al., 1979, Proc Natl Acad
Sci;76:4350-4354). En un posterior paso se
bloquearon las membranas para evitar un enlace de anticuerpos
inespecíficos (10% leche desnatada en PBS), incubándose seguidamente
una membrana con anticuerpos específicos monoclonales de ratón
contra NSE (DAKO Alemania, clono BSS/NC/VI-H14,
ratón monoclonal, dilución 1:1000;) y una membrana fue incubada con
el marcador normalizador actina (ICN, USA, clono C4, ratón
monoclonal, dilución 1:400). La unión del anticuerpo específico fue
visualizada por reactivos secundarios conjugados a la peroxidasa de
rábano picante (enlace al anticuerpo específico del marcador),
catalizando sustratos emisores de fotones.
En los lavados broncoalveolares de pacientes con
cáncer pulmonar de células pequeñas conocido, se detectaron elevados
niveles de NSE en comparación con los niveles de expresión de
actina, mientras que en pacientes sin tumor casi no se detectó
ningún NSE, aunque el nivel de actina fue comparable al nivel en
pacientes de cáncer (datos no mostrados).
Los resultados indican que la normalización del
procedimiento basado en solución según el método aquí presentado
permite evaluar el diagnóstico de enfermedades sin basarse en
información morfológica.
Claims (35)
1. Un método de diagnóstico de condiciones
médicas relevantes en muestras en bruto, comprendiendo:
- a)
- preparación de una solución muestral en base a la muestra en bruto
- b)
- detectar los niveles de uno o más marcadores característicos de la condición médica relevante mencionada en la solución muestral dicha
- c)
- detectar los niveles de uno o más marcadores de normalización característicos de como mínimo uno de los siguientes parámetros como mínimo:
- i)
- la presencia o ausencia de cierto tipo de célula entre las células representadas en la solución muestral
- ii)
- la presencia o ausencia de cierto patrón de diferenciación particular en las células representadas en la solución muestral
- iii)
- la presencia o ausencia de ciertas propiedades de proliferación de células representadas en la solución muestral
- d)
- comparar los niveles de los marcadores característicos de la condición médica relevante mencionada con los niveles de los marcadores de normalización detectados en la solución muestral, normalizando el nivel detectado del marcador característico de la condición médica relevante mencionada respecto a uno o varios parámetros idóneos, y
- e)
- diagnosticar la condición médica relevante desde los niveles normalizados de dichos marcadores característicos de la condición médica relevante mencionada dentro de la solución muestral.
2. El método de la reivindicación 1, donde además
una cantidad de células que contribuyen a uno o varios niveles de
marcadores detectados representados en la solución muestral es
determinada a nivel del marcador molecular.
3. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-2, donde la condición médica
relevante es una condición que se caracteriza por una
propiedad seleccionada de un grupo que comprende la presencia o
ausencia de tipos de células particulares en una muestra, la
presencia o ausencia de cierto patrón de diferenciación relacionado
a células dentro de la muestra y la presencia o ausencia de
características proliferativas de células dentro de la muestra.
4. El método según reivindicación 3, donde la
condición médica relevante es una enfermedad.
5. El método según la reivindicación 4, donde la
enfermedad es un desarreglo celular proliferativo, cáncer o lesión
precursora.
6. El método según reivindicación 5, donde hay
cáncer de cabeza o cuello, cáncer de tracto respiratorio, cáncer de
tracto gastrointestinal, cáncer de piel y de sus apéndices, cáncer
del sistema nervioso central y periférico, cáncer del sistema
urinario, cáncer del sistema reproductivo, cáncer anogenital, cáncer
del sistema endocrino, cáncer de tejidos blandos y hueso, cáncer del
sistema Iinfopoyético y hematopoyético.
7. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, donde la muestra en bruto es
cualquier muestra que contiene células o restos de ellas.
8. El método según reivindicación 7, donde se
trata de células de un organismo eucariota o procariota.
9. El método de la reivindicación 8, donde la
muestra se selecciona de un grupo que comprende sangre, una
secreción, un frotis, esputo, saliva, heces, bilis, muestras
celulares o tisulares, una biopsia o un fluido corporal.
10. El método de la reivindicación
1-9, donde se selecciona como mínimo un marcador
característico de condiciones médicas relevantes de un grupo que
comprende proteínas reguladoras del ciclo celular,
metaloproteinasas, proteínas transmembránicas, proteínas
vinculantes de calcio, factores de crecimiento, moléculas de
marcadores características de infecciones virales, marcadores de
proliferación celular y marcadores asociados a replicación de ADN o
de los ácidos nucleicos que codifican las respectivas proteínas.
11. El método de la reivindicación
1-10, donde como mínimo un marcador es una proteína
marcadora de tumor o los ácidos nucleicos que la codifican.
12. El método de la reivindicación 10, donde se
selecciona como mínimo un marcador tumoral de un grupo que comprende
p53, pRb, p14ARF, ciclina E, ciclina A, ciclina B, MN, her2/nuevo,
mdm-2, bcl-2, receptor EGF, MCM2,
MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7, CDC2, CDC6, proteína kinasa CDC7,
proteína fosfatasa CDC14, Dbf4, PCNA, Ki67, KiS1, Id1, osteopontina,
GRP, dipeptidasa renal, receptor TGFRII e inhibidores de la kinasa
ciclina-dependiente.
13. El método de la reivindicación 12, donde se
selecciona un inhibidor de la kinasa
ciclina-dependiente de un grupo que comprende p13.5,
p14, p15, p16, p19, p21, p27.
14. El método de la reivindicación 10, donde como
mínimo un marcador es una proteína viral o un ácido nucleico
viral.
15. El método de la reivindicación 14, donde como
mínimo una proteína viral es una proteína de HPV o un ácido nucleico
derivado de un gen de HPV seleccionado del grupo que comprende HPV
L1, HPV L2, HPV El, HPV E2, HPV E4, HPV E5, HPV E6 y HPV E7.
16. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1-15, donde como mínimo un marcador
de normalización se selecciona de un grupo que comprende genes de
mantenimiento, proteínas superficiales celulares, proteínas
receptoras, glicoproteínas y/o proteoglicanos, estructuras de
carbohidratos específicas de glicoproteínas y/o proteoglicanos,
proteínas reguladoras del ciclo celular, metaloproteinasas,
proteínas transmembrana, proteínas ligantes de calcio, factores de
crecimiento, marcadores de diferenciación celular y proteínas
asociadas a la replicación de ADN.
17. El método de la reivindicación 16, donde como
mínimo un marcador de normalización es un antígeno epitélico, una
citokeratina o un antígeno CD.
18. El método de la reivindicación 16, donde como
mínimo un marcador de normalización es seleccionado de un grupo que
comprende una glicoproteína, un proteoglicano y una estructura de
carbohidrato presente en estas moléculas.
19. El método de la reivindicación 16, donde como
mínimo un marcador de normalización es una enzima afecta a la
biosíntesis de glicoproteínas y/o proteoglicanos.
20. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1-19, donde se detectan las
moléculas marcadoras usando como mínimo una sonda que reconozca
específicamente y se una a tales moléculas marcadoras.
21. Un método según la reivindicación 20, donde
como mínimo una sonda lleva una etiqueta detectable.
22. El método según la reivindicación 21, donde
la etiqueta se selecciona del grupo compuesto por un radioisótopo,
una sustancia bioluminescente, una sustancia quimioluminescente, una
sustancia fluorescente, un quelato metálico, o enzima, una
estructura de enlace biológicamente relevante como biotina o
digoxigenina.
23. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 20-22, donde como mínimo una sonda
es un agente de enlace, específicamente unido al polipéptido
marcador.
24. El método según la reivindicación 23, donde
el agente de enlace se selecciona de un grupo compuesto por
anticuerpo, un minianticuerpo y un peptidomimético incluyendo un
epitopo unido a antígeno.
25. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 20-22, donde como mínimo una sonda
es una lectina que comprende un punto de enlace de carbohidrato o un
carbohidrato específicamente reconocido por una lectina.
26. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 20-22, donde como mínimo una sonda
es una molécula de ácido nucleico complementaria o inversamente
complementaria a un ácido nucleico marcador específicamente
hibridizando el mencionado ácido nucleico marcador.
27. El método según la reivindicación 26, donde
la detección abarca una reacción de amplificación cuantitativa o
semicuantitativa.
28. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores para usar en la detección temprana o en
tests de screening primarios de lesiones cervicales, donde las
muestras se derivan de muestras de frotis cervicales.
29. Un método según la reivindicación 28, donde
la normalización incluye evaluar a nivel molecular si la muestra se
ha tomado de la forma adecuada para el screening de lesiones
cervicales, donde la detección de marcadores indicadores específicos
de la presencia de células endocervicales es prueba de que la
muestra es adecuada.
30. El método de la reivindicación 29, donde como
mínimo un marcador de normalización se elige de un grupo que abarca
CK8, CK18, CK10/13, vimentina, receptor de concanavalina A y
lectinas, y donde como mínimo se elige un marcador para la condición
médica relevante de un grupo que incluye un marcador asociado a HPV,
p16, p19, p21, p27, pRb, p53, p14ARF, ciclina E, ciclina A, ciclina
B, MN, her2/nuevo, mdm-2, bcl-2,
receptor EGF, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7, CDC2, CDC6,
proteína kinasa CDC7, proteína fosfatasa CDC14, Dbf4, PCNA, Ki67,
KiS1, Id1, osteopontina, GRP, dipeptidasa renal y receptor
TGFI\betaII.
31. Un kit de ensayo para realizar el método
según cualquiera de las reivindicaciones 1-30,
incluyendo:
- a)
- como mínimo un reactivo fijado a una fase sólida para detectar como mínimo una molecula marcadora característica de una condición médica relevante; y
- b)
- como mínimo un reactivo fijado a fase sólida para detectar como mínimo un marcador de normalización característico de, como mínimo, uno de los siguientes parámetros:
- (1)
- la presencia o ausencia de cierto tipo celular o patrón de diferenciación en células representadas dentro de la solución muestral,
- (2)
- la presencia o ausencia de propiedades de proliferación particulares de células representadas dentro de la solución muestral.
32. Un kit de ensayo según la reivindicación 31
que además comprende como mínimo uno de los siguientes
componentes:
- a.
- como mínimo una muestra de moléculas marcadoras para realizar reacciones de control positivas seleccionadas del grupo que abarca:
- i.
- muestras de moléculas marcadoras características de condiciones médicas relevantes
- ii.
- muestras de moléculas de marcadores de normalización características como mínimo de uno de los siguientes parámetros:
- \bullet
- la presencia o ausencia de cierto patrón de diferenciación en células representadas dentro de la solución muestral,
- \bullet
- la presencia o ausencia de ciertas propiedades de proliferación de las células representadas dentro de la solución muestral, y
- b.
- reactivos y tampones usualmente usados para realizar la reacción de detección, como tampones, marcadores de detección y sustancias portadoras.
33. Un kit de ensayo según una de las
reivindicaciones 31-32, donde los reactivos para
detectar moléculas marcadoras incluyen agentes de enlace específicos
de tales moléculas marcadoras y/o sondas de ácido nucleico
hibridizantes de ácidos nucleicos codificando las mencionadas
moléculas marcadoras.
34. El kit de ensayo según la reivindicación 33,
donde como mínimo un agente de enlace es un anticuerpo, un
minianticuerpo o un péptidomimético incluyendo un epitopo que se une
a antígenos.
35. El kit de ensayo según una de las
reivindicaciones 31-34, que es un kit seleccionado
de un grupo que incluye un kit de test diagnóstico, un kit de
investigación y un kit analítico.
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