ES2215957T3 - Metodo para diagnostico basado en una solucion. - Google Patents

Abstract

Un método de diagnóstico de condiciones médicas relevantes en muestras en bruto, comprendiendo: a) preparación de una solución muestral en base a la muestra en bruto b) detectar los niveles de uno o más marcadores característicos de la condición médica relevante mencionada en la solución muestral dicha c) detectar los niveles de uno o más marcadores de normalización característicos de como mínimo uno de los siguientes parámetros como mínimo: i) la presencia o ausencia de cierto tipo de célula entre las células representadas en la solución muestral ii) la presencia o ausencia de cierto patrón de diferenciación particular en las células representadas en la solución muestral iii) la presencia o ausencia de ciertas propiedades de proliferación de células representadas en la solución d) muestral comparar los niveles de los marcadores característicos de la condición médica relevante mencionada con los niveles de los marcadores de normalización detectados en la solución muestral,normalizando el nivel detectado del marcador característico de la condición médica relevante mencionada respecto a uno o varios parámetros idóneos, y e) diagnosticar la condición médica relevante desde los niveles normalizados de dichos marcadores característicos de la condición médica relevante mencionada dentro de la solución muestral.

Description

Método para diagnóstico basado en una solución.

Este invento proporciona métodos de diagnóstico mejorado de condiciones médicas relevantes mediante procedimientos de ensayo bioquímicos basados en soluciones, realizados en soluciones de muestras de ensayo. El invento proporciona un método de sustituir la información morfológica basada en la célula, contenida en los datos citológicos y/o histológicos de la muestra de ensayo, por información molecular obtenible de la solución, donde se disuelve la muestra de ensayo original, permitiendo así una evaluación precisa y reproducible del diagnóstico médico relevante a partir de muestras de ensayo disueltas. El método según el invento incluye las fases de determinar los niveles de uno o más marcadores asociados con la condición a diagnosticar, determinando el nivel de una serie de marcadores de normalización adecuados para sustituir la información relativa a aspectos morfológicos de la muestra, que habría permitido o soportado el diagnóstico en un sistema de ensayo basado en células, comparando y/o combinando los datos relativos a los niveles de los mencionados marcadores y evaluando el diagnóstico de una condición médica
relevante.

El diagnóstico de una gran cantidad de condiciones médicas relevantes se realiza actualmente mediante marcadores. Estas herramientas moleculares se usan generalmente como un aspecto en exámenes complejos, tomando en consideración diferentes parámetros característicos de la muestra examinada.

En análisis médico relevante se suele usar el examen morfológico de muestras mediante citología o histológía. Estos métodos basados en caracterización morfológica de muestras de células pueden aplicarse p.ej. en el análisis de muestras clínicas como fluidos corporales, sangre, resecciones quirúrgicas, secreciones, frotis o lavados.

En el screening de cáncer cervical por ej. se usan frotis para detectar lesiones neoplásticas del cuello uterino. En este procedimiento hay lesiones varias que hay que distinguir. La causa de las lesiones pueden ser inflamaciones (debido a agentes infecciosos o daños físicos o químicos) o cambios preneoplásticos o neoplásticos. En exámenes morfológicos las lesiones varias son difíciles de distinguir. Por ello, los citólogos y patólogos para examinar frotis tienen que estar específicamente entrenados y aún examinadores experimentados varían mucho entre ellos al evaluar diagnóstico basado en especimenes citológicos. En general, el resultado del examen se basa en la interpretación subjetiva de criterios de diagnóstico por el patólogo o citólogo examinante. Por ello hay una elevada proporción de resultados falsos positivos o negativos en las pruebas de screening.

Por ello numerosas veces los procedimientos de examen citológico o histológico es soportado por marcadores moleculares que se usan muchas veces en reacciones de teñido inmuno-histoquímico o durante reacciones de hibridación in situ. En la técnica actual combinaciones de exámenes morfológicos y reacciones de teñido inmuno-histoquímico basadas en moléculas marcadoras características de diferentes estados relevantes médicos de tejidos o células pueden aumentar los resultados. El examen morfológico sigue siendo laborioso y dura tiempo, siendo costoso aún cuando apoyado por métodos moleculares, que dan resultados más confiables. Además, el diagnóstico del nivel celular morfológico, aún apoyado por parámetros moleculares, está sujeto a percepción individual de morfología por los examinantes. Por ello, el diagnóstico depende de la persona que realiza el examen.

Sólo en muy pocos casos pueden usarse marcadores moleculares para diagnóstico sin ulteriores exámenes morfológicos de la célula, especialmente si los marcadores existen en el entorno y sólo aparecen bajo condiciones exactamente definidas. Así, los métodos de diagnóstico de condiciones sólo a nivel molecular, sin la ayuda de información celular, están limitados a casos, donde hay marcadores adecuados inambiguamente específicos para la condición a caracterizar. Por ej. la detección de infecciones virales puede realizarse el soluciones de muestras porque los marcadores característicos de la presencia de virus en tejidos no existen en tejidos humanos sanos.

Por ello los resultados del examen son más reproducibles usando herramientas moleculares, aún que la preservación y preparación de muestras puede no superarse sólo usando marcadores moleculares adicionales.

Pero especialmente cuando se usan herramientas moleculares en exámenes citológicos o histológicos deben tomarse precauciones estrictas de preservación para evitar artefactos o resultados inadecuados de tests. Ello es en parte debido a la inestabilidad de la información morfológica de la célula y en parte a la de los marcadores moleculares que se detectan durante las15 pruebas. Si no se preparan, transportan o almacenan las muestras adecuadamente, puede perderse o modificarse la información celular o incluso molecular. Así el diagnóstico puede ser imposible o tiende a artefactos. P.ej. la interpretación de biopsias o preparaciones citológicas frecuentemente es difícil o imposible por células dañadas física o bioquímicamente. Además, en cuanto a muestras de tejido o biopsias, la preservación de constituyentes moleculares de las muestras recambiadas rápidamente parece sofisticada debido al tiempo pasado hasta la penetración de los preparativos apropiados en la muestra.

En cambio hay vías robustas, rápidas y fáciles de preservar propiedades moleculares de muestras, perdiéndose la información morfológica. Pueden ser preparadas de forma reproducible, almacenarse y transportarse fácilmente, disolviendo los componentes celulares de la muestra bruta en disolvente apropiado inmediatamente después o mientras se obtiene la muestra. Los fluidos corporales pueden transferirse directamente del cuerpo a una solución con detergentes y sustancias preservantes apropiados. Además pueden transferirse inmediatamente muestras de tejidos a condiciones de Tisis desnaturalizante (ev. soportado por fuerzas físicas), preservándose. Usando ingredientes apropiados en el disolvente, pueden conservarse de la degradación los componentes moleculares originales de la muestra. Puede minimizarse p.ej. la degradación enzimática usandoinhibidores enzimáticos. Así una solución de muestras puede representar propiedades moleculares de la muestra de ensayo en el momento de disolver, sin requerir cuidados de preservación adicionales.

Al disolver la muestra se pierde toda la información celular morfológica característica de la muestra, no pudiéndose usar estos datos para diagnóstico de condiciones.

Los métodos de diagnóstico soportados morfológicamente realizados regularmente en la técnica tienen dos grandes desventajas. Primero dependen en sumo grado de la percepción del examinante y segundo, la información morfológica puede descomponerse, produciendo artefactos después de preparar las muestras. Ambas cosas hacen que los resultados sean menos reproducibles.

Para mejorar el diagnóstico de condiciones médicas relevantes son deseables métodos no dependiendo de la información morfológica de la célula.

Este invento muestra un método de diagnosis de condiciones médicas relevantes en base a marcadores moleculares, caracterizando la muestra, sin basarse en información celular morfológica.

Este invento se basa en los resultados de los inventores (ejemplos 1-4) de que el diagnóstico de condiciones normalmente (en sistemas diagnósticos basados en células) permitido y/o apoyado por exámenes histológicos y/o citológicos, puede realizarse en soluciones de muestras en bruto que contienen varios tipos de células de diferentes características, por un método que comprende los pasos para la obtención de una muestra bruta, disolviendo la muestra en un soluto adecuado, detectando el nivel de uno o varios marcadores asociados a la condición a diagnosticar, y además uno o varios marcadores de normalización dentro de la solución muestral, normalizando los datos correlacionados con los marcadores asociados con tal condición respecto a los datos correlacionados con los marcadores normalizantes y diagnosticando la presencia o ausencia de una condición en la muestra.

El método del presente invento puede aplicarse p.ej. como test de screening primario en casos, donde se realiza usualmente un examen citológico, histológico o patológico. Usando el invento presente se puede discriminar si la condición a ser diagnosticada puede estar presente en la muestra. Si el diagnóstico basado en la solución es negativo respecto a una condición particular, puede omitirse el posterior examen. En caso de resultados positivos puede seguirse con métodos clásicos aplicables. Así se pueden evitar exámenes microscópicos u otros que consumen tiempo por medio de un rápido y económico test de screening primario.

Un aspecto del presente invento es un mejor método para condiciones de diagnóstico ampliadas médicamente relevantes, evaluándose el diagnóstico usando soluciones de muestras lisadas de tejido en bruto o muestras de células. El método de diagnóstico revelado según este invento no se basa en parámetros morfológicos, sino que permite el diagnóstico mediante análisis bioquímico.

En segundo lugar este invento es un método caracterizando una muestra compleja en solución mediante marcadores moleculares característicos para los parámetros de interés, sustituyendo información que se podría obtener de otra forma de exámenes histológicos o citológicos.

El tercer aspecto del presente invento es proporcionar las combinaciones adecuadas de marcadores para el diagnóstico de condiciones particulares de relevancia médica en muestras complejas. Los marcadores de normalización son usados tal que pueden sustituirse parámetros incluidos en la muestra en bruto, permitiendo o apoyando el diagnóstico, que se pierden al disolver la muestra.

Un cuarto aspecto del presente invento consta de kits de ensayo para realizar estudios de diagnóstico o investigación según este invento.

El presente invento permite un ensayo rápido y fácil de diagnóstico de condiciones en muestras en bruto, como fluidos corporales, frotis, lavados, aspirados de agujas o muestras complejas celulares o tisulares. En general el problema del material en bruto es la presencia de diferentes tipos de células en la muestra y además la presencia de microorganismos y sustancias extracelulares. El material en bruto contiene por ello células y composiciones varias que pueden resultar en artefactos en los resultados. La presencia de tipos celulares de características de proliferación diferente, de organismos y sustancias en la muestra en bruto proporciona múltiples factores que pueden contribuir al nivel particular de la molécula marcadora. Detectando únicamente el nivel de un sólo marcador molecular puede proporcionar por ello sólo información útil de diagnóstico si existen más parámetros (morfológicos) respecto a la muestra en bruto. Los datos morfológicos obtenidos de la muestra en bruto se pierden por tisis en solución. Pero hay marcadores moleculares adecuados, correspondientes a parámetros morfológicos particulares u otros obtenibles por medios histológicos o citológicos.

Por ejemplo, la información sobre constituyentes individuales dentro de la muestra en bruto puede obtenerse clásicamente por examen microscópico. La inspección morfológica informa acerca de la diferenciación, la localización celular y del medio, donde aparecen las células. En preparados citológicos de frotis cervicales pueden identificarse las células particulares p.ej. como células epiteliales, categorizándose más tarde p.ej. como células endocervicales o ectocervicales epiteliales. Aún la presencia de células no cervicales como las endocervicales puede detectarse fácilmente por inspección microscópica.

Según el presente invento puede disolverse material en bruto en un disolvente adecuado sin preparación ulterior ni caracterización, independiente de si el material de la muestra es de carácter homogéneo o heterogéneo. Los datos que se pierden durante la lisis del material están contenidos en la solución muestral, codificados por los niveles de una serie de moléculas marcadoras, pudiéndose reconstruir usando los datos mencionados de estas moléculas para normalizar las características morfológicas respectivas. Para ello se usa un set adecuado de marcadores moleculares para cada parámetro característico necesario para un diagnóstico inambiguo. Detectando una variedad de marcadores se pueden evaluar los parámetros relevantes que caracterizan la muestra en bruto, evitando así la pérdida de información por tisis de la muestra.

El procedimiento de ensayo según el presente invento incluye detectar niveles de marcadores característicos para las condiciones celulares en cuestión, y de marcadores para normalizar los datos respecto a parámetros que caracterizan el medio particular de la muestra ensayada. Los marcadores adecuados para el presente invento pueden ser de origen vario. El patrón de expresión de un marcador adecuado para detectar condiciones en cuestión puede depender del estatus proliferativo de las células, del estatus diferenciativo, del tipo de célula o del organismo (ver ejemplos de marcadores apropiados abajo).

El diagnóstico de condiciones médicas relevantes que se usa aquí puede abarcar el examen de cualquier condición detectable a nivel citológico, histológico, bioquímico o biomolecular, que puede ser útil para la salud y/o el cuerpo humano. Estos exámenes pueden abarcar p.ej. métodos de diagnóstico médico y estudios de investigación en ciencias de la vida. En una incorporación del invento se usa el método para diagnosticar condiciones médicas relevantes como p.ej. enfermedades, que pueden abarcar alteraciones caracterizadas por proliferación de tipo no silvestre de células o tejidos.

En una incorporación se trata del diagnóstico de cáncer y las fases precursoras, vigilar el transcurso de esta enfermedad en cánceres, evaluar el pronóstico en cánceres y detectar o diseminar células tumorales p.ej. en el curso de un diagnóstico de mínimo residuo maligno. El método según el presente invento puede usarse p.ej. en el diagnóstico clínico o patológico de cánceres y sus fases precursoras o en pruebas de screening rutinarias como se hacen para cánceres particulares, como p.ej. examen de frotis, p.ej. en tests de screening de lesiones cervicales, lavados bronquiales para cáncer de pulmón o de heces para lesiones del tracto gastrointestinal, p.ej. lesiones colorrectales.

El método según el presente invento es aplicable a todo tipo de condiciones médicas relevantes.

Condiciones médicas relevantes que se usan según el presente invento, son p.ej. composición de tejidos, fluidos corporales, secreciones, lavados o frotis. Estas condiciones pueden comprender p.ej. la composición celular de fluidos corporales como la sangre, la composición de la linfa o la composición del semen. En este contexto las composiciones pueden ser p.ej. la falta o presencia de ciertos tipos celulares (p.ej. patógenos como virus etc., células preneoplásticas, neoplásticas y/o displásticas, etc.), la presencia o ausencia de patrones de diferenciación de ciertos tipos de células, el número total de ciertos tipos de células (p.ej. eritrocitos, leucocitos, esperma, etc.), el número total de células de cualquier tipo de células o la fracción de células de otras características particulares existentes o no en la muestra.

Además, las condiciones médicas relevantes pueden abarcar alteraciones relacionadas a células o tejidos. Las condiciones para ser diagnosticadas pueden abarcar parámetros relativos a células en muestras de tejidos citológicas o histológicas. Las condiciones pueden abarcar tipos de diferenciación de células en una muestra de tejido, como muestras de resección quirúrgica, biopsias, frotis, lavados, etc. Tales condiciones pueden abarcar p.ej. alteraciones congénitas, inflamatorias, mecánicas, traumáticas, vasculares, degenerativas, de crecimiento, neoplasmas benignos y malignos. Otro aspecto de las condiciones según el presente invento puede comprender las condiciones caracterizadas por la presencia o ausencia de características de proliferación. Condiciones caracterizadas por la presencia o ausencia de características de proliferación pueden deberse p.ej. a alteraciones proliferativas de células.

Alteraciones de proliferación celular según el presente invento comprenden enfermedades caracterizadas por propiedades de crecimiento anormal de células o tejidos respecto a propiedades de crecimiento de células o tejidos de control normal. El crecimiento de células o tejidos puede estar p.ej. inusualmente acelerado, decelerado o regulado anormalmente. La regulación anormal indicada antes puede deberse a presencia o ausencia de respuestas no silvestres de células o tejidos ainfluencias reguladoras naturales del crecimiento. Las anormalidades de crecimiento de células o tejidos pueden ser p.ej. neoplasias o hiperplasias.

En una incorporación, las alteraciones de células proliferativas son tumores que pueden abarcar tumor de cabeza y cuello, tumores del tracto respiratorio, tumores del tracto gastrointestinal, tumores del sistema urinario, tumores del sistema reproductor, tumores del sistema endocrino, tumores del sistema nervioso central y periférico, tumores cutáneos y sus apéndices, tumores de tejidos blandos y huesos, tumores del sistema hematopoyético y linfopoyético, etc. Los tumores pueden comprender p.ej. neoplasmias como tumores benignos y malignos, carcinomas, sarcomas, leucemias, linfomas o displasias. En una incorporación particular, el tumor es p.ej. un cáncer de cabeza y cuello, cáncer del tracto respiratorio, cáncer del tracto gastrointestinal, cáncer de piel y sus apéndices, cáncer del sistema nervioso central y periférico, cáncer del sistema urinario, cáncer del sistema reproductor, cáncer del sistema endocrino, cáncer de tejidos blandos y hueso, y cáncer del sistema hematopoyético y linfopoyético. En una incorporación, el método según el presente invento también se relaciona con la detección de células diseminadas tumorales o metástasis.

En una incorporación del invento, el carcinoma es p.ej. un cáncer cervical, un cáncer de colon, un cáncer gástrico, un cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, etc.

Una muestra en bruto según el método de el presente invento puede comprender toda muestra, que comprende células o restos de ellas. Las células pueden p.ej. ser procariotas o eucariotas. Además, las muestras pueden comprender muestras clínicas como p.ej. secreciones, frotis, lavados, fluidos corporales, sangre, orina, semen, heces, bilis, linfa, médula ósea, biopsias y muestras de células y tejidos. Las biopsias que se usan en el contexto del presente invento pueden comprender p.ej. muestras de resecciones de tumores, muestras de tejidos preparadas por medios de endoscopia o biopsias de aguja de órganos. Además, cada muestra que potencialmente contiene moléculas marcadoras a ser detectadas pueden ser una muestra según el presente invento. En una incorporación del invento, la muestra comprende frotis cervicales, lavados bronquiales, heces etc. El material en bruto que se usa en el contexto del presente invento puede comprender muestras de células o tejidos fijadas o conservadas. También pueden utilizarse células conservadas en soluciones adecuadas (alcohol, etc.) o muestras fijadas de tejido como muestras en bruto en los métodos según el presente invento.

Según el presente invento se solubilizan las muestras en bruto en un disolvente adecuado. Estos disolventes pueden ser soluciones acuosas de agentes caotrópicos, tales como urea, GuaSCN, formamida; de detergentes p.ej. de tipo aniónico (SDS, N-lauril sarcosina, deoxicolato sódico, alkil-aril sulfonatos, sulfatos de alcoholes de cadena larga (grasos), sulfatos y sulfonatos de olefinas, sulfatos y sulfonatos de alfaolefinas, monoglicéridos sulfatados, éteres sulfatados, sulfosuccinatos, alkanosulfonatos, ésteres de fosfato, alkilisotionatos, ésteres de sucrosa), detergentes catiónicos (p.ej. cloruro de cetil trimetilamonio), detergentes no fónicos (p.ej. Tween 20, Nonidet P-40, Triton X-100, NP-40, Igepal CA-630, N-Octil-glucósido) o detergentes anfóteros (p.ej. CHAPS, 3-dodecil-dimetilamonio-propano-l-sulfonato, óxido de laurildimetilamina) y/o de hidróxidos alcalinos como NaOH o KOH. Se designa el disolvente de forma que disuelva las células, los restos celulares, los ácidos nucleicos, los polipéptidos, lípidos y otras biomoléculas potencialmente presentes en la muestra en bruto. La solución para disolver las muestras en bruto según el presente invento puede además comprender uno o más agentes que prevengan la degradación de componentes en las muestras en bruto. Estos componentes pueden comprender p.ej. inhibidores enzimáticos como de proteinasas, inhibidores de RNAsas, inhibidores de DNAsas etc. En una incorporación del presente invento se lisa la muestra directamente en la forma obtenible de los individuos testados. En otra incorporación del presente invento puede purificarse la muestra además antes de ser lisada. Esta purificación puede comprender lavar contaminantes como moco y similares, separar o concentrar componentes celulares, preservar y transportar células. Así los componentes celulares de las muestras en bruto se incluyen en una única solución muestral.

La preparación de una muestra para usarse en un método como el indicado aquí puede también contener varias fases de preparación de la muestra, como separación de componentes insolubles, aislamiento de polipéptidos o ácidos nucleicos, preparación de péptidos o ácidos nucleicos fijados a la fase sólida o la preparación de lechos, membranas o cortes a las cuales se acoplan covalente o no covalentemente las moléculas a ser determinadas.

Según el presente invento, la detección de moléculas marcadoras se realiza directamente desde esta solución. La detección puede realizarse en solución o usando reactivos fijados a una fase sólida. La detección de uno o varios marcadores moleculares puede realizarse en una mezcla de reacción única o en dos o más mezclas de reacción separadas. Las reacciones de detección de moléculas marcadoras pueden p.ej. realizarse simultáneamente en vasos de reacción multi-pozos. Los marcadores característicos de disfunciones celulares proliferativas puede detectarse usando reactivos que reconozcan específicamente estas moléculas. Simultáneamente pueden detectarse los marcadores de normalización usando reactivos que los reconozcan específicamente. La reacción de detección para cada clase de marcador comprende una o más reacciones con agentes detectantes que reconocen las moléculas marcadoras iniciales o las moléculas anteriores preferentemente (p.ej. anticuerpos primarios) usados en reconocer los marcadores iniciales. La reacción detectora además puede comprender una reacción informante que indica el nivel de lo: marcadores característicos de las disfunciones proliferativas o los marcadores de normalización.

La sonda detectora de moléculas marcadoras usada en el contexto del presente invento puede se una molécula que se una específicamente a tales moléculas marcadoras. La sonda puede ser p.ejun agente que se une a antígenos (monoclonales o policlonales), fragmentos de anticuerpos c moléculas artificiales que comprenden epitopos que se unen a antígenos, moléculas que se unen a ADN o ARN como proteínas o ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos unidos a otros ácidos nucleicos pueden ser p.ej. oligonucleótidos para el propósito de detección o cebadores.

Se considera que una molécula reconoce a otras moléculas si interacciona específicamente con tal molécula. La interacción específica puede ser p.ej. un enlace específico a o de la otra molécula.

La reacción informante puede ser una reacción que produce una sustancia coloreada. En una incorporación del presente invento, las sustancias informantes correlacionadas con los marcadores particulares desarrollan diferentes colores. En otra incorporación, el informador específico del marcador normalizador puede ser una molécula que apague la señal producida por la molécula informante específica del marcador, característica de la condición médica relevante, en dependencia del nivel de marcador de normalización presente en la muestra. En todavía otra incorporación, las reacciones informantes pueden producir tintes fluorescentes con características de diferentes longitudes de onda. En una posterior incorporación del presente invento, la reacción informante puede constar de reacciones emisoras de luz de diferentes longitudes de onda características para sustancias informantes específicas de cada marcador a detectar. En otra incorporación de este invento, la reacción informante puede comprender la emisión de radiactividad y métodos adicionales para visualizar o cuantificar la radiación. En una incorporación, las diferentes moléculas marcadoras pueden reconocerse mediante agentes radiactivos que llevan radionucleótidos de diferentes niveles energéticos, pudiéndose distinguir las señales relativas a las moléculas marcadoras.

Formatos aplicables a la reacción detectora según el presente invento pueden ser técnicas de bloteo como Western-Blot, Southern-blot, Northern-blot. Las técnicas de bloteo son consideradas entre los técnicos, pudiendo realizarse p.ej. como electro-blot, bloteo semi-húmedo, bloteo por vacío o dot-blot. Además pueden aplicarse métodos inmunológicos para detectar moléculas como p.ej. la inmunoprecipitación o ensayos inmunológicos como ELISA, RIA, ensayos de flujo lateral, tiras inmunocromatográficas etc.

El método de detección del nivel de moléculas marcadoras en una incorporación del presente invento es cualquier método capaz p.ej. de detectar muy pequeñas cantidades de moléculasespecíficas en muestras biológicas. Puede aplicarse además cualquier método de moléculas marcadoras independientemente de la sensibilidad. La reacción detectora según este invento puede abarcar p.ej. reacciones de detección al nivel de ácidos nucleicos y/o reacciones de detección al nivel de polipéptidos. En una incorporación del invento, la detección de las moléculas marcadoras puede comprender la detección de variantes de empalme particular. En otra incorporación del presente invento, el método de detección puede comprender la detección de modificaciones de moléculas marcadoras como fosforilación o giucosilación etc. de polipéptidos o la metilación de moléculas de ácido nucleico en muestras.

En una incorporación del presente invento, la detección del nivel de moléculas marcadoras se realiza por detección del nivel de ácidos nucleicos codificantes de moléculas marcadoras o fragmentos de ellas presentes en la muestra. Los métodos de detección de las moléculas de ácidos nucleicos los conocen los técnicos. El procedimiento para la detección de ácidos nucleicos puede realizarse p.ej. mediante una reacción de enlace de la molécula a detectar a sondas complementarias de ácido nucleico, proteínas de enlaces específicos para ácidos nucleicos u otras entidades que reconozcan y unan específicamente los mencionados ácidos nucleicos. Este método puede realizarse in vitro o directamente in situ, p.ej. durante la detección de reacciones de tinción. Otra forma de detectar las moléculas marcadoras en una muestra al nivel de ácidos nucleicos realizado en el método según este invento es una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, que puede realizarse de forma cuantitativa, p.ej. la reacción en cadena de la polimerasa. En una incorporación del presente invento puede usarse p.ej. RT PCR a tiempo real para cuantificar la cantidad de nivel de ARN marcador en muestras de alteraciones proliferativas de células.

En otra incorporación del invento, la detección del nivel de moléculas marcadoras se realiza determinando el nivel de expresión de una proteína. La determinación de moléculas marcadoras a nivel proteico puede realizarse p.ej. en una reacción que comprenda un agente ligante específico para detectar las moléculas marcadoras. Estos agentes de unión pueden comprender p.ej. fragmentos que enlacen anticuerpos y antígenos, anticuerpos híbridos bifuncionales, peptidomiméticos que contienen epitopos mínimos que se unen a antígenos etc. Los agentes de unión pueden ser usados en numerosas técnicas de detección diferentes, como western-blot, ELISA, ensayo de flujo lateral, aglutinación de látex, tiras inmunocromatográficas o inmuno-precipitación. En general la detección basada en agentes de unión puede realizarse in vitro o directamente in situ p.ej. durante una reacción de teñido inmunocitoquímico. Otros métodos adecuados para determinar la cantidad de polipéptidos particulares en solución de muestras biológicas pueden usarse según el presente invento.

Los técnicos conocen métodos usuales de detección de estados modificados de ácidos nucleicos y/o polipéptidos.

Los métodos de detección de la metilación de ácidos nucleicos son usualmente conocidos a los técnicos y pueden comprender p.ej. métodos que emplean pretratamiento químico de ácidos nucleicos p.ej. con bisulfito sódico, permanganato o hidrazina y la consecuente detección de la modificación mediante endonucleasas específicas de restricción o mediante sondas específicas p.ej. en el transcurso de una reacción de amplificación. La detección de metilación puede además realizarse usando endonucleasas de restricción específicas de metilación. Métodos para la detección de estados metilados en ácidos nucleicos se muestran p.ej. en la aplicación de las patentes EP02010272.9, US5856094, WO0031294, US6331393 etc. Estos documentos se incorporarán aquí como referencia.

La detección de estados modificados de polipéptidos puede comprender p.ej. agentes de enlace que reconozcan específicamente estados modificados o no modificados de polipéptidos. Enzimas alternativas como fosfatasas o glicolasas pueden usarse para eliminar modificaciones en moléculas. La presencia o ausencia de modificaciones puede determinarse pues al determinar el cambio de masa de las moléculas mediante electroforesis, cromatografía, espectrometría de masas etc., antes y después de incubar con un enzima respectivo.

En otra incorporación del presente invento se detectan series de moléculas marcadoras a nivel de polipéptidos, detectándose simultáneamente otra serie de moléculas marcadoras y/o todas o algunas de las mismas moléculas marcadoras a nivel de ácidos nucleicos.

Los marcadores asociados con condiciones celulares médicamente relevantes pueden p.ej. ser moléculas que influyan y/o reflejen características de proliferación y/o diferenciación de células y/o tejidos. Estas moléculas pueden comprender proteínas reguladoras del ciclo celular, proteínas asociadas con la replicación del ADN, proteínas transmembrana, proteínas receptoras, proteínas transductoras de señales, poteínas unidas al calcio, proteínas que contienen dominios de enlace a ADN, metaloproteinasas, kinasas, inhibidores de kinasas, chaperonas, proteínas deembriogénesis, proteínas de choque térmico o enzimas que modifican otras proteínas después de su traducción, regulando así su actividad, o ácidos nucleicos que codifican las citadas proteínas. También mARN codificando las citadas proteínas pueden ser moléculas marcadoras útiles según el presente invento. En una incorporación, el marcador asociado con la alteración proliferativa celular puede expresarse p.ej. sólo en células afectas a tal alteración, pueden no expresarse dichas células o sobreexpresarse en ellas.

Las moléculas marcadoras para usar según este invento pueden incluir uno o varios marcadores elegidos entre p13.5, p14, p15, p16, p19, p21, p27, p53, pRb, p14ARF, ciclina A, ciclina B, ciclina E, MDM-2, MCM2, MCM5, MCM6, CDC2, CDC6, Id1, osteopontina, GRP, dipeptidasa renal, her2/neu, receptor TGF\betaII, marcadores asociados a HPV , p.ej. derivados de genes L1, L2, E1, E2, E4, E5, E6 o E7, etc. de HPV. Una selección de marcadores útil en una incorporación del presente invento para detectar condiciones médicamente relevantes se muestra en la siguiente

\hbox{tabla 1.}

En una incorporación el marcador de la condición médica relevante puede ser un marcador de tumores. Las moléculas marcadoras características de tumores pueden ser p.ej. proteínas que se expresan de forma no silvestre en tumores comparado con el tejido normal de control. La expresión de tipo no silvestre usada aquí puede comprender niveles aumentados o reducidos de expresión o falta de expresión o expresión de formas de tipo no silvestre de las moléculas respectivas. La expresión de formas de tipo no silvestre de proteínas pueden abarcar la expresión de formas mutadas de proteínas, surgidas de inserción, eliminación, sustitución o mutilaciones estructurales u otro tipo de mutilaciones conocidas en proteínas o ácidos nucleicos. En todos los casos, la expresión de proteínas de tipo no silvestre o de niveles de proteínas de tipo no silvestre, las proteínas, polipéptidos o fragmentos de éstos o ácidos nucleicos que codifican estas proteínas, polipéptidos o fragmentos de estos ácidos nucleicos pueden usarse como marcadores moleculares asociados con tumores, entendiéndose pues bajo el término de "marcadores de tumores", tal y como se usa en el contexto del presente invento. Las proteínas que muestran expresión de tipo no silvestre en asociación con tumores, se indican p.ej. en los documentos WO9904265A2, WO0149716A2, WO0055633A2 y WO0142792A2, que se incorporan aquí como referencia.

En una incorporación del invento, el marcador característico de la condición médica relevante puede ser una proteína reguladora del ciclo celular como p.ej. la ciclina, una kinasa ciclil-dependiente o un inhibidor de kinasa ciclil-dependiente. En otra incorporación del presente invento, el marcador característico de la condición médica relevante puede ser un marcador asociado a una infección pasajera o persistente vírica. La infección vírica puede comprender la infección por el virus del papiloma humano (HPV) de alto o bajo riesgo. El HPV de alto riesgo puede abarcar subtipos HPV, tales como HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 y 58. Los marcadores para la infección HPV pueden abarcar productos de expresión HPV de los genes HPV L1, L2, E2, E4, E5, E6 o E7. En una tercera incorporación del invento puede usarse un marcador característico de una infección vírica en combinación con algún otro marcador para una condición médica relevante, como p.ej. en combinación con una proteína reguladora del ciclo celular. Combinaciones de moléculas marcadoras que pueden ser de un interés especial respecto a la asociación HPV se incluyen en el documento WO0208764, que se da aquí como referencia.

En una incorporación las proteínas reguladoras del ciclo celular que se usan en combinación con marcadores HPV pueden elegirse p.ej. de un grupo que comprende pRb, p53, p14 ARF y inhibidores de kinasa ciclin-dependiente. En una incorporación especial se puede usar p.ej. pl6^{INK4a} en combinación con marcadores para infecciones HPV (p.ej. L1, L2, E2, E4, E5, E6 o E7).

Los marcadores normalizantes según este invento pueden abarcar p.ej. genes de mantenimiento como actina, gapdh, proteínas de histona, fosfolipasa, \beta2-microglobulina, proteínas asociadas con la proliferación activa de células como Ki67, PCNA o estatina, o proteínas características de ciertos tipos celulares como CK20 en las células epiteliales o cualquier antígeno específico de la superficie celular. Además, estructuras de carbohidratos presentes en glicoproteínas, proteoglicanos, receptores de lectina como el receptor concanavalina A, mucinas y enzimas actuantes en la biosíntesis de estas moléculas, como las GalNac transferasas y las oligosacariltransferasas también pueden servir como marcadores de normalización. El tipo de proteína marcadora tiene que elegirse según la información, que proporcionará el marcador. En un principio, los marcadores útiles para ciertas condiciones médicamente relevantes pueden bajo ciertas circunstancias ser útiles como marcadores de normalización. Una selección de marcadores útiles en los métodos del presente invento se da en la tabla 1.

Tanto en cuanto a marcadores para condiciones médicalmente relevantes como en cuanto a marcadores de normalización, estados de moléculas modificados (como polipéptidos y ácidos nucleicos) pueden usarse como marcadores en el método según el presente invento. Por ejemplo pueden usarse polipéptidos fosforilados, glicosilados o polipéptidos modificados o ácidos nucleicos metilados de otra forma como marcadores en el método según el presente
invento.

La normalización usada según este invento puede comprender cualquier método adecuado para relacionar los niveles detectados de marcadores a parámetros útiles para evaluar el diagnóstico. Un aspecto de esta normalización puede ser la reconstrucción de información citológica e histológica relevante contenida en la muestra en bruto mediante marcadores moleculares adecuados detectables en las soluciones de muestra. La normalización puede abarcar p.ej. la detección del número total de células presentes en la muestra, la presencia o ausencia de ciertos tipos de células en una muestra, la presencia o ausencia de un organismo o de células de un organismo en una muestra, del número de células de cierto tipo de célula u organismo presente en la muestra, de las características proliferativas de células presentes en la muestra o del patrón de diferenciación de las células presentes en la muestra.

TABLA 1

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Según el presente invento, la normalización puede abarcar la determinación de la presencia de un número de células (humanas) dadas en una muestra. Este es un aspecto crucial del invento. En ciertas incorporaciones sólo pueden evitarse resultados falsos (especialmente falsos negativos) de tests si el procedimiento de ensayo verifica que la muestra contiene los materiales (p.ej. células, tejidos, organismos, etc.) necesarios para realizar el test particular. En diversos tests se tendrá que asegurar que la muestra contiene células. En una gran parte de incorporaciones del invento, la verificación de la idoneidad de la muestra no sólo asegurará la presencia de células, sino que incluirá la detección de la presencia de células de diferente origen o de cierto tipo especial de célula.

Así, la normalización también puede comprender la determinación de células de cierto origen, como p.ej. células de cierto órgano o de cierta localización histológica particular, como la detección de células de diferentes regiones de epitelio o de células del tejido conjuntivo, células originadas de la lámina basal de un tejido o de células de origen heterólogo, como células metastáticas. Ello puede ser necesario en algunos casos porque debe haber células que bajo ciertas circunstancias expresan un marcador que podría utilizarse para detectar una condición médica relevante como la neoplasia o displasia bajo ciertas condiciones normales. La normalización usada de acorde al presente invento puede abarcar la detección de la presencia o ausencia y/o del nivel de tipos de células que puedan posiblemente contribuir al nivel total de un marcador particular seleccionado para diagnosticar una condición médica relevante.

En una incorporación puede usarse el método para detectar cánceres como lesiones cervicales. Marcadores y combinaciones de ellos, útiles para este propósito de detección están incluidos p.ej. en los documentos WO0208764 y EP1217377, que incorporamos aquí como referencia. En esta incorporación el test puede realizarse usando cualquier muestra de origen cervical. La muestra puede comprender p.ej. biopsias o microbiopsias de cuello uterino o frotis tomados de la región cervical. Los frotis cervicales usados aquí son muestras que pueden ser obtenidas p.ej. usando un dispositivo adecuado como un cepillo, tampón, espátula o similar, contactado con el cuello uterino durante el procedimiento de muestreo. El dispositivo de muestreo puede ser cualquiera que utilicen médicos para pruebas convencionales o un sistema de automuestreo.

Marcadores moleculares prometedores para aumentar la evaluación de frotis cervicales son p.ej. p16^{INK4a}, p14ARF, ciclina E, ciclina A, ciclina B, MN, her2/neu, mdm-2, bcl-2, receptor EGF, marcadores indicativos de la infección por el virus del papiloma humano, pRb, p53, etc. que pueden usarse para detectar células displásticas y neoplásticas. La normalización según el presente invento para el propósito de análisis de frotis cervicales puede incluir la detección de la presencia de células humanas en general, la detección de células del epitelio cervical, la detección de la presencia de células endocervicales y ectocervicales, así como la detección de células de origen endometrial. Es un paso crucial asegurar la presencia de células endo y ectocervicales dentro de la muestra para asegurar que el espécimen se tomó en la zona de transformación cervical, donde surgen la mayoría de displasias y neoplasias. Si no hay ahí tales células, la muestra no es adecuada para el procedimiento de prueba al resultar que da resultados negativos falsos. Como p16^{INK4a} puede ser expresado en células endométricas normales, puede ser necesaria la normalización del nivel de expresión p16^{INK4a} respecto al número de células endometriales.

Para habilitar un diagnóstico de confianza, la normalización además debe incluir la detección de presencia o ausencia de los componentes celulares mencionados en la muestra, y además la detección del nivel total de cierto tipo de célula o de la fracción que un tipo particular de célula contribuye respecto al número total de células en la
muestra.

Así, en una incorporación el nivel detectado de proteína p16^{INK4} a puede normalizarse a condiciones citológicas representadas por la muestra particular, de forma que puede constatarse si el nivel detectado de proteína p16^{INK4a} es indicativo de células cervicales que sobreexpresan p16^{INK4a} o si hay abundantes células endometriales presentes en la muestra, imitando la sobreexpresión de p16^{INK4a}.

En aún otra incorporación del invento puede utilizarse el método indicado aquí para detectar disfunciones del tracto respiratorio. En el diagnóstico del cáncer pulmonar de células pequeñas, la detección de la enolasa específica de neuronas (NSE) es uno de los marcadores empleados. Las muestras de especimenes tumorales se proporcionan por broncoscopia, coleccionando células mediante cepillos o lavados broncoalveolares. Al estar NSE también expresada en algunas células normales en el pulmón, el nivel de expresión detectado en la muestra disuelta tiene que ser puesto en relación con el marcador de normalización (p.ej. actina) para detectar la cantidad de células presentes en la
muestra.

Una tercera incorporación del presente invento es la detección de lesiones del tracto gastrointestinal como lesiones colorrectales de muestras de heces. En este caso, el origen de ácidos nucleicos y/o polipéptidos indicativos detectables en muestras de heces puede ser crucial para evaluar el diagnóstico. Según el presente invento, es posible determinar el origen (tipos de células / organismo) de las moléculas marcadoras empleadas. Así pueden eliminarse más bien los falsos resultados basados p.ej. en la detección de moléculas de marcadores provenientes de alimentos ingeridos por individuos que de lesiones de la mucosa del tracto gastrointestinal. Además, pueden eliminarse artefactos producidos por la presencia de trazas de marcadores de la circulación sanguínea u originados de esputo ingerido etc. usando los métodos indicados aquí.

Otro aspecto del presente invento es el kit de ensayo para realizar el método según el presente invento. Puede ser p.ej. un kit diagnóstico, analítico o de investigación.

Un kit según el presente invento puede incluir:

a)

reactivos para la detección de moléculas de marcador,

b)

los reactivos y tampones usualmente usados para llevar a cabo la reacción detectora, como tampones, marcadores de detección, sustancias portadoras y otros,

c)

uno o más marcadores y/o muestras representativas de las condiciones médicas relevantes a diagnosticar para realizar reacciones de control y/o positivas,

d)

una o más muestras de marcador de normalización para realizar reacciones de control y/o positivas.

El reactivo para la detección de las moléculas marcadoras puede ser cualquier agente capaz de unirse a la molécula marcadora. Tales reactivos incluyen proteínas, (poli)péptidos, ácidos nucleicos, ácidos nucleicos pépticos, glucoproteínas, proteoglicanos, polisacáridos o lípidos.

Los marcadores característicos de las condiciones médicas relevantes y/o muestras de marcador de normalización para realizar reacciones de control positivas y/o negativas pueden incluir p.ej. ácidos nucleicos de forma aplicable como solución o sal, péptidos de forma aplicable, muestras de sección tisular, microorganismos o líneas de células positivas o negativas.

En una incorporación del invento, la detección de las moléculas marcadoras se realiza al nivel de polipéptidos. En esta incorporación, el agente de enlace puede ser un anticuerpo específico de las moléculas de marcador o de fragmentos de éstas. Además, los fragmentos de enlace pueden incluir fragmentos de antígeno como fragmentos Fab, anticuerpos de cadena simple, anticuerpos híbridos bifuncionales, peptidomiméticos conteniendo epitopos mínimos unidos a antígenos etc. Además el agente de enlace puede ser una lectina unida a una estructura específica de carbohidrato en la molécula del marcador.

En otra incorporación del kit de ensayo, la detección de moléculas marcadoras se realiza al nivel de ácido nucleico. En esta incorporación del invento, el reactivo para la detección puede ser p.ej. una sonda de ácido nucleico o un cebador complementario inverso al mencionado marcador de ácido nucleico.

Breve descripción de los dibujos Figura 1 Teñido específico inmunohistoquímico de células epiteliales endocervicales y ectocervicales en secciones cervicales

Usando un anticuerpo dirigido contra la citokeratinal8 (CK18) en un procedimiento de teñido inmunohistoquímico, puede detectarse una reacción positiva en el epitelio columnar de la endocerviz (A), mientras que el epitelio escamoso de la ectocerviz no muestra ningún teñido especial (B). El teñido inmunohistoquímico con un anticuerpo dirigido contra la citokeratina 10/13 (CK 10/13) no muestra ninguna tinción del epitelio columnar de la endocerviz (C), mientras que hay un fuerte teñido del epitelio escamoso de la ectocerviz (D). Así CK18 puede usarse como marcador específico para detectar células epiteliales columnares de la endocerviz y CK10/13 como marcador específico de células epiteliales escamosas de la ectocerviz. Ver el ejemplo 1 para detalles experimentales.

Figura 2 Análisis Western Blot de muestras solubilizadas de frotis cervicales

Los números 1 a 4 se refieren a muestras (frotis cervicales) obtenidas de pacientes individuales. La detección inmunoblot se realizó usando anticuerpos específicos dirigidos contra la citokeratina 8 (CK8) y anticuerpos específicos dirigidos dirigidos contra p16^{INK4a} (p16). Las muestras del paciente 1, 2 y 3 no muestran señales de p16^{INK4a}. Ello indica que no existían células displásticas cervicales en estas muestras. La muestra del paciente 4 muestra una fuerte señal de p16^{INK4a} indicando que había células displásticas cervicales en la muestra. Las bandas superiores muestran las señales específicas para citokeratina 8. En la muestra 1, 3 y 4 puede detectarse citokeratina 8, mientras que en la muestra 2 no puede verse ninguna señal. Ello indica que las células columnares endocervicales estaban presentes en las muestras 1, 3 y 4 y ausentes en la muestra 2. Al ser la presencia de células columnares epiteliales endocervicales uno de los parámetros para frotis cervicales adecuados, la muestra 2 se considera inadecuada, no pudiendo sacarse ninguna conclusión diagnóstica del resultado negativo de la detección de p16^{INK4a}. Las muestras 1, 3 y 4 se consideran adecuadas. Así, basándose en la señal negativa de la muestra 1 y 3 para p16^{INK4a}, podría concluirse que estos pacientes no tenían displasia cervical. La muestra 4 mostró una señal positiva para p16^{INK4a}, indicando la presencia de una lesión displástica cervical en este paciente. Ver el ejemplo 2 para los detalles experimentales.

Figura 3 Análisis Western blot y ELISA para demostrar la idoneidad de la muestra

Se analizaron muestras de cuatro pacientes con displasias cervicales avanzadas (ver diagnóstico), utilizando análisis Western blot (panel superior de la figura). Para el blot izquierdo se realizó una detección inmunoblot, usando anticuerpos específicos para (3-actina y p16^{INK4a} para el blot central se usaron anticuerpos específicos de la citokeratina 10/13 y para el blot derecho, anticuerpos específicos de la citokeratina 18. La (3-actina, CK18, y CK10/13 se usaron como marcadores, demostrando la idoneidad de la muestra. La \beta-actina indica la presencia de cualquier célula, CK10/13 la presencia de células escamosas ectocervicales, CK 18 la presencia de células columnares endocervicales. Para las muestras del paciente 1 y 2 la detección inmunoblot muestra posibles señales para todos los marcadores de idoneidad aplicados (CK10/13, CK 18, \beta-actina) y para el marcador (p16 INK4a ) indicativo de células displásticas. Para las muestras 3 y 4, las detecciones inmunoblot sólo muestran señales muy débiles (paciente 3) o ninguna señal (paciente 4) para los marcadores de idoneidad, por lo que la señal negativa p16^{INK4a} no soporta ninguna conclusión diagnóstica. Ver detalles experimentales en el ejemplo 3. El panel inferior de esta figura muestra los resultados del análisis ELISA. Se detectaron señales positivas para los marcadores de idoneidad (CK10/13, CK 18) para las muestras del paciente 1 y 2, mientras que para las muestras del paciente 3 y 4 no se observaron señales para CK10/13 y CK 18. Así, los resultados del análisis ELISA se parecen a los del Western blot, pudiendo sacarse las mismas conclusiones. Ver detalles experimentales en el ejemplo 3.

Se dan los siguientes detalles a título ilustrativo, no limitando el alcance del invento indicado aquí.

Ejemplo 1 Detección específica inmunohistoquímica de células epiteliales endocervicales y ectocervicales en secciones cervicales

Para evaluar marcadores indicando la idoneidad de frotis cervicales, se tintaron secciones cervicales (fijadas en solución de formaldehído al 4% y embebidas en parafina) con anticuerpos dirigidos contra la citokeratina 18 (marcador de epitelio columnar endocervical escamoso). La figura 1 muestra el teñido específico del epitelio endocervical con anticuerpo anti-citokeratina 18 y teñido específico del epitelio ectocervical con anticuerpo anti-citokeratina 10/13. El experimento se realizó como sigue:

Se desparafinaron secciones fijadas en formol y embebidas en parafina, en baño de xileno durante 5 min (se repitió el paso una vez), evacuándose el líquido excesivo y colocándose los cortes en etanol 95-96% durante 3 (\pm1) min, en etanol 70% durante 3 (\pm1) min (se repitió el paso una vez), yen agua destilada finalmente durante un mínimo de 30 seg. Para recuperar el epitopo, se colocaron los cortes en un vaso Coplin, hirviéndose durante 40 min a 95-99°C en un tampón de citrato 10 mM pH 6,0. Los cortes se dejaron enfriar durante 20 min (\pm1 min) a TA en este tampón. Los cortes se cubrieron con reactivo bloqueador de peroxidasa (3% H_{2}O_{2}; NaN_{3} 15 mM), incubándose durante 5 (\pm1) min a TA. Después de 5 min de lavado en el tampón, se incubaron los cortes con anticuerpos primarios (CK 10/13: DE-K13, 1:50, DAKO; CK 18: K18,7, 1 \mug/ml, dianova) durante 30 min.

Seguidamente se rociaron los cortes con tampón de lavado y se lavaron en éste durante 5 min a TA. Después de 30 min de incubación con EnVision (complejo listo para usar de peroxidasa de rábano picante anti-ratón; DAKO), se lavaron los cortes 3x5 min, incubándose en sustrato DAB durante 10 min, contratintándose con hematoxilina y montándose con medio Faramount.

Ejemplo 2 Análisis Western Blot de muestras solubilizadas procedentes de frotis cervicales

Para evaluar si el análisis western blot de muestras solubilizadas permite evaluar el diagnóstico de las lesiones cervicales, se sometieron muestras clínicas de diagnóstico conocido a un análisis inmunoquímico en base a moléculas marcadoras después de la tisis de la muestra.

Las muestras de material clínico (frotis cervicales) se analizaron mediante análisis Standard Western como sigue:

En resumen, el material clínico se solubilizó en un primer paso hirviéndolo (5min, 95°C) en tampón de muestra de proteína Lämmli (100 mM Tris pH 6,8, 2% SDS, 200 mM DTT, 0,05% BpB) antes de sonicarlo. En un segundo paso se resolvieron las muestras proteicas en un SDS-PAGE (12% acrilamida), transfiriéndose seguidamente a una membrana de nitrocelulosa mediante bloteo por tanque (Towbin et al., 1979, Proc Natl Acad Sci;76:4350-4354). En un posterior paso se bloquearon las membranas para evitar la unión de anticuerpos inespecíficos (leche desnatada seca 10% en PBS), incubándose seguidamente con un anticuerpo de ratón específico monoclonal (CK 8: 3513H11, 1:100, DAKO; p16^{INK4a}:D7D7, 1:140, mtm laboratories). La unión del anticuerpo específico se visualizó por reactivos secundarios conjugados de peroxidasa de rábano picante (unidos al anticuerpo específico del marcador), catalizando sustratos emisores de fotones.

Se usó citokeratina 8 (CK 8) como marcador específico de células endocervicales, indicando la idoneidad de la colección de muestras en el presente experimento. Se usó el inhibidor de la kinasa ciclina dependiente p16^{INK4a} como marcador relacionado con la enfermedad específica.

Los resultados de este experimento se dan en la figura 2. Los números 1 a 4 se refieren a muestras de pacientes individuales. El análisis citológico paralelo de los frotis indicó una composición celular normal para la mujer 1 y 3. En la mujer 2 no se logró obtener ningún diagnóstico debido a materialcelular escaso. En la mujer 4, se diagnosticó un elevado grado de displasia. Obsérvese que la banda superior (CK 8) se refiere al marcador de normalización específico de células endocervicales citokeratina 8, indicando la idoneidad de la colección de muestras. La banda inferior indica el marcador p16^{INK4a} relativo a la enfermedad específica. El blot muestra para el paciente 4 una señal positiva para p16^{INK4a} consistente con un elevado nivel de displasia cervical. Las muestras del paciente 1 y 3 muestran sólo la banda específica CK 8, indicando recogida adecuada de muestras, pero sin marcador relativo a enfermedad (p16^{INK4a}), relativo a un epitelio cervical sano normal. La muestra del paciente 2 no muestra señal CK 8 alguna debido al bajo número de células en la muestra, no pudiéndose sacarse ninguna conclusión diagnóstica de la señal negativa para p16^{INK4a}.

Ejemplo 3 El análisis Western blot y el análisis ELISA para demostrar la idoneidad de la muestra

Para evaluar si los resultados del análisis basado en la solución difieren del diagnóstico de muestras debido a muestras inadecuadas, se realizó el análisis Western blot de frotis cervicales de cuatro pacientes diferentes con diagnóstico confirmado (neoplasia intraepitelial cervical de grado sumo según el diagnóstico citológico de Pap IVa and Pap IVb). Se usó anticuerpo contra p16^{INK4a} para indicar la presencia de células displásticas, usándose anticuerpos contra CK18 y CK10/13 para demostrar la idoneidad de la muestra. Como se muestra en la figura 3, las muestras de los pacientes 1 y 2 mostraban señales Western blot para p16^{INK4a} y CK10/13 y CK18 (indicando la idoneidad de las muestras). Las muestras 3 y 4 fueron negativas para bandas p16^{INK4a} en Western blot. De todas formas, en estos casos la \beta-actina y los dos marcadores de citokeratina mostraron una señal extremadamente débil (\beta-actina de paciente 3) o negativa (paciente 4 todos los marcadores, paciente 3 marcadores 3 CK) en el análisis Western blot. Así no puede sacarse ninguna conclusión diagnóstica de la señal negativa para p16^{INK4a}. El análisis Western blot se realizó como sigue: Se recogieron muestras de pacientes con un cepillo cervical, lisándose directamente en tampón de muestra Laemmli (2% SDS, 60 mM Tris pH 6,8, 0,01%, 100 mM DTT) durante 5 min a 95°C (1x10^{7} células/ml) con consiguiente sonicación (impulsos 5x5 seg, máxima intensidad). Los lisados se centrifugaron durante 12 min a 16.600xg en una microcentrifugadora, transfiriéndose el sobrenadante a un nuevo tubo. Se cargaron geles premoldeados de acrilamida de gradiente linear 4-20% (Criterion System, Bio-Rad) con 10 \mu (10^{5} células) de extractos celulares enteros, separándose las proteínas a una corriente constante de 25 mA durante 45 min. Las proteínas se transfirieron del gel a una membrana de nitrocelulosa Hybond ECL (Amersham) por bloteo por tanque standard usando Bio Rad Criterion Blotter (15 min a 100 voltios constantes y seguidamente 45 min a 50 voltios constantes). La membrana de nitrocelulosa se tintó durante 5 min en solución Ponceau S para asegurar la transferencia proteica. Se eliminó la solución Ponceau S mediante lavados de 2x10 min en PBS. Para la inmunodetección, se bloquearon los blots durante la noche en tampón bloqueador (10% leche en polvo en PBS con 0,1% Tween-20). Se incubaron los anticuerpos primarios a diluciones según el fabricante en tampón bloqueador durante 1 h a TA con agitación (CK18: MAB 3236), 1:1000, CHEMICON; CK 10/13: DE-K13, 1:500, DAKO, p16^{INK4a} D7D7, 1:140, mtm laboratories). Después de 6 lavados durante 10 min con PBS/0.1% Tween-20, se incubaron los blots con HRP de conejo anti-ratón (DAKO, diluido 1:5.000 en tampón bloqueador) durante 1 h a TA. Después de 6 lavados durante 10 min con PBS/0,1% Tween-20, se incubaron las membranas durante 5 min en solución sustrato (Super Signal West Femto Maximum Substrate, Pierce), envueltas en una envoltura de plástico y expuestas a una película de rayos X durante 1-5 min. Finalmente las películas de rayos X se revelaron, fijaron, secaron y documentaron con un sistema de imágenes (Bio-Rad). Las mismas muestras se utilizaron para realizar análisis
ELISA para p16^{INK4a}, CK 10/13, CK18. Las señales detectadas y los resultados fueron similares al análisis Western blot, sacándose las mismas conclusiones.

El análisis ELISA se realizó como sigue: Se cubrieron placas planas de 96 pozos (MaxiSorb; Nunc) con anticuerpo capturante (p16^{INK4a} : MTM-E6H4, 2 \mug/ml in PBS, mtm laboratories; CK10: MS481P1ABX, 2 \mug/ml, dianova; CK18: K18,7, 2 \mug/ml, dianova; 50 \mul/pozo) durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron 6x con PBS/0,1% Tween-20, bloqueándose con tampón Superblock (Pierce). El extracto solubilizado de proteína de los frotis cervicales se disolvió en tampón incubador (PBS, 3% Superblock, 0,1% Tween20), y se añadió por triplicado a cada pozo. Después de 1 h de incubación a TA, se lavaron las placas 6x con PBS/0,1% Tween-20, incubándose con anticuerpo detector con capa de biotina (p16^{INK4a} : MTM-D7D7) (0,2 \mug/ml, mtm laboratories, CK10: MS481-BO, 200 \mug/ml, dianova; CK18: MS142-BO, 200 \mug/ml, dianova; en tampón de incubación) durante 1 h a TA. Seguidos 6 lavados con PBS/0,1% Tween-20 TMB, se añadieron 50 \mul de fosfatasa alcalina revestida de estreptavidina (dilución 1:1000; Dianova)durante 30 min. Seguidamente se lavaron las placas 6x con PBS/0,1%. Tween-20 y se añadieron 100 \mul de sustrato de p-nitrofenilfosfato (PnPP; disuelto en tampón de dietanolamina) a cada pozo. Se midió la DO 405 nm (longitud de onda de referencia 620 nm) con lector ELISA (Tecan) al cabo de 30 min, 1 h y 2 h. Este ejemplo muestra que el formato sandwich ELISA tiene una sensibilidad, que es adecuada para usar en los métodos según el presente invento. Para usar en el método indicado aquí, puede aplicarse el formato sandwich ELISA descrito en este ejemplo a múltiples moléculas de marcador, como marcadores de normalización o idoneidad y marcadores característicos de condiciones médicas relevantes.

Ejemplo 4 Análisis Western blot de diferentes muestras de origen pulmonar

Para evaluar si el análisis Western blot de muestras solubilizadas permite evaluar el diagnóstico de lesiones pulmonares, se solubilizaron muestras clínicas de diagnóstico conocido, sometiéndolas a un análisis inmunoquímico en base a moléculas marcadoras y de normalización.

Las muestras clínicas (células recogidas por cepillado o lavado broncoalveolar) se analizaron por análisis Standard Western como sigue: Las células del lavado broncoalveolar se peletizaron por centrifugación (5 min, 1000 rpm), disolviéndose el pelet en tampón de muestra proteica Lämmli (100 mM Tris pH 6,8, 2% SDS, 200 mM DTT, 0,05% BpB). Las células obtenidas por cepillado se disolvieron directamente en tampón de muestra proteica Lämmli (100 mM Tris pH 6,8, 2% SDS, 200 mM DTT, 0,05% BpB). Se hirvió el material (5 min, 95°C) antes de sonicarlo. En una segunda fase, los alícuotas proteicos de la muestra se resolvieron en duplicados en un SDS-PAGE (12% acrilamida), transfiriéndose seguidamente a una membrana de nitrocelulosa por bloteo por tanque (Towbin et al., 1979, Proc Natl Acad Sci;76:4350-4354). En un posterior paso se bloquearon las membranas para evitar un enlace de anticuerpos inespecíficos (10% leche desnatada en PBS), incubándose seguidamente una membrana con anticuerpos específicos monoclonales de ratón contra NSE (DAKO Alemania, clono BSS/NC/VI-H14, ratón monoclonal, dilución 1:1000;) y una membrana fue incubada con el marcador normalizador actina (ICN, USA, clono C4, ratón monoclonal, dilución 1:400). La unión del anticuerpo específico fue visualizada por reactivos secundarios conjugados a la peroxidasa de rábano picante (enlace al anticuerpo específico del marcador), catalizando sustratos emisores de fotones.

En los lavados broncoalveolares de pacientes con cáncer pulmonar de células pequeñas conocido, se detectaron elevados niveles de NSE en comparación con los niveles de expresión de actina, mientras que en pacientes sin tumor casi no se detectó ningún NSE, aunque el nivel de actina fue comparable al nivel en pacientes de cáncer (datos no mostrados).

Los resultados indican que la normalización del procedimiento basado en solución según el método aquí presentado permite evaluar el diagnóstico de enfermedades sin basarse en información morfológica.

Claims (35)

1. Un método de diagnóstico de condiciones médicas relevantes en muestras en bruto, comprendiendo:

a)

preparación de una solución muestral en base a la muestra en bruto

b)

detectar los niveles de uno o más marcadores característicos de la condición médica relevante mencionada en la solución muestral dicha

c)

detectar los niveles de uno o más marcadores de normalización característicos de como mínimo uno de los siguientes parámetros como mínimo:

i)

la presencia o ausencia de cierto tipo de célula entre las células representadas en la solución muestral

ii)

la presencia o ausencia de cierto patrón de diferenciación particular en las células representadas en la solución muestral

iii)

la presencia o ausencia de ciertas propiedades de proliferación de células representadas en la solución muestral

d)

comparar los niveles de los marcadores característicos de la condición médica relevante mencionada con los niveles de los marcadores de normalización detectados en la solución muestral, normalizando el nivel detectado del marcador característico de la condición médica relevante mencionada respecto a uno o varios parámetros idóneos, y

e)

diagnosticar la condición médica relevante desde los niveles normalizados de dichos marcadores característicos de la condición médica relevante mencionada dentro de la solución muestral.

2. El método de la reivindicación 1, donde además una cantidad de células que contribuyen a uno o varios niveles de marcadores detectados representados en la solución muestral es determinada a nivel del marcador molecular.

3. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la condición médica relevante es una condición que se caracteriza por una propiedad seleccionada de un grupo que comprende la presencia o ausencia de tipos de células particulares en una muestra, la presencia o ausencia de cierto patrón de diferenciación relacionado a células dentro de la muestra y la presencia o ausencia de características proliferativas de células dentro de la muestra.

4. El método según reivindicación 3, donde la condición médica relevante es una enfermedad.

5. El método según la reivindicación 4, donde la enfermedad es un desarreglo celular proliferativo, cáncer o lesión precursora.

6. El método según reivindicación 5, donde hay cáncer de cabeza o cuello, cáncer de tracto respiratorio, cáncer de tracto gastrointestinal, cáncer de piel y de sus apéndices, cáncer del sistema nervioso central y periférico, cáncer del sistema urinario, cáncer del sistema reproductivo, cáncer anogenital, cáncer del sistema endocrino, cáncer de tejidos blandos y hueso, cáncer del sistema Iinfopoyético y hematopoyético.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde la muestra en bruto es cualquier muestra que contiene células o restos de ellas.

8. El método según reivindicación 7, donde se trata de células de un organismo eucariota o procariota.

9. El método de la reivindicación 8, donde la muestra se selecciona de un grupo que comprende sangre, una secreción, un frotis, esputo, saliva, heces, bilis, muestras celulares o tisulares, una biopsia o un fluido corporal.

10. El método de la reivindicación 1-9, donde se selecciona como mínimo un marcador característico de condiciones médicas relevantes de un grupo que comprende proteínas reguladoras del ciclo celular, metaloproteinasas, proteínas transmembránicas, proteínas vinculantes de calcio, factores de crecimiento, moléculas de marcadores características de infecciones virales, marcadores de proliferación celular y marcadores asociados a replicación de ADN o de los ácidos nucleicos que codifican las respectivas proteínas.

11. El método de la reivindicación 1-10, donde como mínimo un marcador es una proteína marcadora de tumor o los ácidos nucleicos que la codifican.

12. El método de la reivindicación 10, donde se selecciona como mínimo un marcador tumoral de un grupo que comprende p53, pRb, p14ARF, ciclina E, ciclina A, ciclina B, MN, her2/nuevo, mdm-2, bcl-2, receptor EGF, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7, CDC2, CDC6, proteína kinasa CDC7, proteína fosfatasa CDC14, Dbf4, PCNA, Ki67, KiS1, Id1, osteopontina, GRP, dipeptidasa renal, receptor TGFRII e inhibidores de la kinasa ciclina-dependiente.

13. El método de la reivindicación 12, donde se selecciona un inhibidor de la kinasa ciclina-dependiente de un grupo que comprende p13.5, p14, p15, p16, p19, p21, p27.

14. El método de la reivindicación 10, donde como mínimo un marcador es una proteína viral o un ácido nucleico viral.

15. El método de la reivindicación 14, donde como mínimo una proteína viral es una proteína de HPV o un ácido nucleico derivado de un gen de HPV seleccionado del grupo que comprende HPV L1, HPV L2, HPV El, HPV E2, HPV E4, HPV E5, HPV E6 y HPV E7.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, donde como mínimo un marcador de normalización se selecciona de un grupo que comprende genes de mantenimiento, proteínas superficiales celulares, proteínas receptoras, glicoproteínas y/o proteoglicanos, estructuras de carbohidratos específicas de glicoproteínas y/o proteoglicanos, proteínas reguladoras del ciclo celular, metaloproteinasas, proteínas transmembrana, proteínas ligantes de calcio, factores de crecimiento, marcadores de diferenciación celular y proteínas asociadas a la replicación de ADN.

17. El método de la reivindicación 16, donde como mínimo un marcador de normalización es un antígeno epitélico, una citokeratina o un antígeno CD.

18. El método de la reivindicación 16, donde como mínimo un marcador de normalización es seleccionado de un grupo que comprende una glicoproteína, un proteoglicano y una estructura de carbohidrato presente en estas moléculas.

19. El método de la reivindicación 16, donde como mínimo un marcador de normalización es una enzima afecta a la biosíntesis de glicoproteínas y/o proteoglicanos.

20. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-19, donde se detectan las moléculas marcadoras usando como mínimo una sonda que reconozca específicamente y se una a tales moléculas marcadoras.

21. Un método según la reivindicación 20, donde como mínimo una sonda lleva una etiqueta detectable.

22. El método según la reivindicación 21, donde la etiqueta se selecciona del grupo compuesto por un radioisótopo, una sustancia bioluminescente, una sustancia quimioluminescente, una sustancia fluorescente, un quelato metálico, o enzima, una estructura de enlace biológicamente relevante como biotina o digoxigenina.

23. El método de cualquiera de las reivindicaciones 20-22, donde como mínimo una sonda es un agente de enlace, específicamente unido al polipéptido marcador.

24. El método según la reivindicación 23, donde el agente de enlace se selecciona de un grupo compuesto por anticuerpo, un minianticuerpo y un peptidomimético incluyendo un epitopo unido a antígeno.

25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 20-22, donde como mínimo una sonda es una lectina que comprende un punto de enlace de carbohidrato o un carbohidrato específicamente reconocido por una lectina.

26. El método de cualquiera de las reivindicaciones 20-22, donde como mínimo una sonda es una molécula de ácido nucleico complementaria o inversamente complementaria a un ácido nucleico marcador específicamente hibridizando el mencionado ácido nucleico marcador.

27. El método según la reivindicación 26, donde la detección abarca una reacción de amplificación cuantitativa o semicuantitativa.

28. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para usar en la detección temprana o en tests de screening primarios de lesiones cervicales, donde las muestras se derivan de muestras de frotis cervicales.

29. Un método según la reivindicación 28, donde la normalización incluye evaluar a nivel molecular si la muestra se ha tomado de la forma adecuada para el screening de lesiones cervicales, donde la detección de marcadores indicadores específicos de la presencia de células endocervicales es prueba de que la muestra es adecuada.

30. El método de la reivindicación 29, donde como mínimo un marcador de normalización se elige de un grupo que abarca CK8, CK18, CK10/13, vimentina, receptor de concanavalina A y lectinas, y donde como mínimo se elige un marcador para la condición médica relevante de un grupo que incluye un marcador asociado a HPV, p16, p19, p21, p27, pRb, p53, p14ARF, ciclina E, ciclina A, ciclina B, MN, her2/nuevo, mdm-2, bcl-2, receptor EGF, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7, CDC2, CDC6, proteína kinasa CDC7, proteína fosfatasa CDC14, Dbf4, PCNA, Ki67, KiS1, Id1, osteopontina, GRP, dipeptidasa renal y receptor TGFI\betaII.

31. Un kit de ensayo para realizar el método según cualquiera de las reivindicaciones 1-30, incluyendo:

a)

como mínimo un reactivo fijado a una fase sólida para detectar como mínimo una molecula marcadora característica de una condición médica relevante; y

b)

como mínimo un reactivo fijado a fase sólida para detectar como mínimo un marcador de normalización característico de, como mínimo, uno de los siguientes parámetros:

(1)

la presencia o ausencia de cierto tipo celular o patrón de diferenciación en células representadas dentro de la solución muestral,

(2)

la presencia o ausencia de propiedades de proliferación particulares de células representadas dentro de la solución muestral.

32. Un kit de ensayo según la reivindicación 31 que además comprende como mínimo uno de los siguientes componentes:

a.

como mínimo una muestra de moléculas marcadoras para realizar reacciones de control positivas seleccionadas del grupo que abarca:

i.

muestras de moléculas marcadoras características de condiciones médicas relevantes

ii.

muestras de moléculas de marcadores de normalización características como mínimo de uno de los siguientes parámetros:

\bullet

la presencia o ausencia de cierto patrón de diferenciación en células representadas dentro de la solución muestral,

\bullet

la presencia o ausencia de ciertas propiedades de proliferación de las células representadas dentro de la solución muestral, y

b.

reactivos y tampones usualmente usados para realizar la reacción de detección, como tampones, marcadores de detección y sustancias portadoras.

33. Un kit de ensayo según una de las reivindicaciones 31-32, donde los reactivos para detectar moléculas marcadoras incluyen agentes de enlace específicos de tales moléculas marcadoras y/o sondas de ácido nucleico hibridizantes de ácidos nucleicos codificando las mencionadas moléculas marcadoras.

34. El kit de ensayo según la reivindicación 33, donde como mínimo un agente de enlace es un anticuerpo, un minianticuerpo o un péptidomimético incluyendo un epitopo que se une a antígenos.

35. El kit de ensayo según una de las reivindicaciones 31-34, que es un kit seleccionado de un grupo que incluye un kit de test diagnóstico, un kit de investigación y un kit analítico.