ES2911415T3 - Métodos y kits - Google Patents
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Abstract
Un método para la detección de la presencia del componente del complejo de mantenimiento de minicromosomas (Mcm5) en un sujeto, comprendiendo el método: (a) preparar una muestra de orina de dicho sujeto, en donde la preparación de la muestra de orina comprende exponer la muestra de orina a un tampón de lisis capaz de liberar Mcm5 de las células en la muestra de orina liberando de este modo Mcm5 de las células en la muestra de orina, y en donde el tampón de lisis comprende un detergente que comprende triton X-100; (b) realizar un ensayo para determinar la concentración de Mcm5 liberada de las células en la muestra de orina exponiendo la muestra de orina a un primer anticuerpo monoclonal y un segundo anticuerpo monoclonal, y midiendo la cantidad de Mcm5 que se une al primer anticuerpo monoclonal y al segundo anticuerpo monoclonal, en donde el ensayo es un ensayo de ELISA tipo sándwich que comprende capturar Mcm5 utilizando un anticuerpo de captura y detectar la concentración de Mcm5 utilizando un anticuerpo de detección, y en donde el anticuerpo de captura es el primer anticuerpo monoclonal y el anticuerpo de detección es el segundo anticuerpo monoclonal, o el anticuerpo de captura es el segundo anticuerpo monoclonal y el anticuerpo de detección es el primer anticuerpo monoclonal; y (c) comparar la concentración de Mcm5 determinada en la etapa (b) con un valor de referencia obtenido previamente de una muestra de un sujeto sano; en donde el primer anticuerpo monoclonal y el segundo anticuerpo monoclonal se unen a Mcm5, y en donde el primer anticuerpo monoclonal se une a un epítopo que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, y el segundo anticuerpo monoclonal se une a un epítopo que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos y kits
Campo de la invención
La invención se refiere a métodos para la detección de la presencia de una Mcm5 en una muestra de un paciente y a kits que pueden utilizarse en tales métodos.
Antecedentes de la invención
Los cánceres urológicos (en ocasiones denominados 'cánceres del aparato urinario') son un problema epidemiológico importante y en aumento. Dos de los cánceres urológicos de mayor importancia económica son el cáncer de vejiga y el cáncer de próstata.
El cáncer de próstata es el segundo cáncer más común en hombres después del cáncer de piel no melanoma, con más de 35.000 nuevos casos diagnosticados cada año en el RU; el cáncer de próstata provoca aproximadamente 10.200 muertes al año. Cada año se producen alrededor de 300.000 casos nuevos en Europa, 190.000 en los Estados Unidos y 670.000 en todo el mundo. Cancer Research UK informa que un cuarto de todos los casos nuevos de cáncer diagnosticados en hombres en el RU son cánceres de próstata y que el 60 % de los nuevos diagnósticos son en hombres de más de 70 años. La forma más común de la enfermedad es el adenocarcinoma. La tasa de supervivencia a 5 años es de casi el 80 % en el RU. No se conoce una causa ambiental, pero las personas con parientes cercanos con cáncer de próstata o de mama tienen más riesgo de desarrollar la enfermedad. Los hombres de África Occidental y afrocaribeños tienen un mayor riesgo de cáncer de próstata.
Los síntomas del cáncer de próstata son similares a los provocados por la hiperplasia benigna de la próstata e incluyen la necesidad imperiosa de orinar, dificultad o disuria, y rara vez, sangre en la orina o en el semen. Sin embargo, en muchos hombres, la enfermedad permanece asintomática hasta que se forman metástasis dolorosas, predominantemente en los huesos.
El tratamiento depende del estadio y del grado de malignidad del tumor, y de la salud general y edad del paciente. Las opciones incluyen vigilancia activa, prostatectomía parcial o radical, orquiectomía, el tratamiento hormonal y radioterapia, tal como la braquirradioterapia.
La orquiectomía y el tratamiento hormonal reducen o eliminan la producción de testosterona, que es esencial para el crecimiento tumoral.
El diagnóstico definitivo de cáncer de próstata precisa un enfoque multifacético. La prueba de diagnóstico de referencia actual para el cáncer de próstata es el examen histológico del material de biopsia. La decisión de tomar una biopsia está basada en el nivel sérico del PSA (forma siglada de prostate specific antigen, antígeno prostático específico) relacionado con la edad y/o en tacto rectal (TR) anómalo. El TR, en el cual se palpa la glándula por vía transrectal para examinar la morfología anómala, también es inespecífico. Los tumores que son demasiado pequeños para alterar la morfología de la glándula no se detectarán, y las afecciones benignas también provocan una morfología o agrandamiento anómalos. Este es un problema en la técnica. Las muestras de próstata se toman comúnmente utilizando biopsia por punción guiada por TRUS (forma siglada de trans-rectal ultrasound, ecografía transrectal). Se toman varias muestras con aguja gruesa, normalmente hasta 12, para maximizar el área de glándula de la que se toma una muestra. El procedimiento lo lleva a cabo un urólogo en el servicio de consultas externas, con anestesia local, con la ayuda de personal de enfermería o un auxiliar de clínica. Este procedimiento tiene inconvenientes, que incluyen ser algo doloroso para el paciente y exponer al paciente a un riesgo de sepsis y/o hemorragia. Las muestras de tejido con aguja gruesa se examinan al microscopio en el laboratorio en cuanto a la presencia de células malignas, lo que tiene el problema de ser laborioso y de precisar citólogos muy entrenados, además de ser susceptible de error humano.
Se puede apreciar que las biopsias son invasivas y costosas. Existe una necesidad en la técnica de una herramienta más rentable, fiable y/o no invasiva para el diagnóstico y/o vigilancia del cáncer urológico, tal como el cáncer de próstata. Los procedimientos conocidos de diagnóstico alternativos y/o menos invasivos para el cáncer de próstata implican el análisis de marcadores biológicos específicos ('biomarcadores').
Un ejemplo de un biomarcador de ácido nucleico del cáncer de próstata es la prueba de PCA3 (gen de cáncer de próstata 3). Este ensayo urinario identifica el ARNm no codificante del gen PCA3, que se sobrexpresa en el cáncer de próstata (Hessels y Schalken, The use of PCA3 in the diagnosis of prostate cancer. Nat Rev Urol, 6, 255-61; 2009). La prueba PCA3 (Gen-Probe, Inc) se basa en el análisis de una muestra de ensayo de la primera micción producida después de una forma definida de masaje prostático, utilizado para expresar secreciones prostáticas, que contienen células epiteliales de la uretra. Como diagnóstico del cáncer de próstata PCA3 tiene un valor de curva ROC (curva de eficacia diagnóstica) de 0,68 (Chun et al, Prostate Cancer Gene 3 (PCA3): development and internal validation of a novel biopsy nomogram. Eur Urol; 2009 vol. 56 pág. 659-668), que es similar al de la prueba de PSA analizada a
continuación. Sin embargo, la prueba PCA3 es costosa y no es apta para el uso como análisis de diagnóstico inmediato, que son los problemas con esta técnica de la técnica anterior.
Un ejemplo de biomarcador proteico, que se usa con frecuencia para indicar la presencia de cáncer de próstata, es el PSA (antígeno prostático específico). A los pacientes sintomáticos que se presentan en atención primaria generalmente se les realiza una prueba de PSA sérica y un TR. Sin embargo, el PSA no es específico para el cáncer de próstata. El PSA es una enzima intracelular específica de tejido expresada constitutivamente. El PSA está presente a bajas concentraciones en el suero de hombres con una próstata sana. Un nivel elevado de PSA en suero se produce debido a la filtración procedente de la próstata y es una indicación del tamaño relativo de la glándula. El PSA elevado puede producirse en afecciones benignas, tales como la hiperplasia prostática benigna y la prostatitis, y también en el cáncer de próstata. A medida que los hombres se hacen mayores, el volumen de la glándula aumenta, lo que da como resultado un aumento de los niveles de PSA, en ausencia de neoplasia maligna. En un estudio reciente se descubrió que el 60 - 70 % de las pruebas de PSA 'positivas' (nivel sérico de PSA mayor que 4 ng/ml) no estaban asociadas con cáncer (Kilpelainen et al., False-positive screening results in the Finnish prostate cancer screening trial, British Journal of Cancer. 102, 469-474; 2010). La alta tasa de resultados positivos falsos conduce a muchas operaciones de biopsia innecesarias y hace que la prueba sea inapropiada para el cribado poblacional. Además, la prueba de PSA no detecta un número significativo de casos de cáncer de próstata, particularmente en hombres más jóvenes. La precisión de la prueba de PSA medida en el análisis ROC (curva de eficacia diagnóstica) es de 0,678 (Thompson et al., Operating characteristics of a prostate-specific antigen in men with an initial PSA level of 3.0 ng/ml or lower. JAMA, 294, 66-70; 2005). En el RU, Habitualmente, las pruebas de PSA se llevan a cabo en laboratorios de hospitales, aunque están disponibles análisis de diagnóstico inmediato rápidos.
El cáncer de vejiga es el cuarto cáncer más común en los hombres y el noveno cáncer más común en las mujeres, y da como resultado una morbilidad y mortalidad significativas (Jemal et al. CA Cancer J Clin. 2007. 57:43-66.). La mayoría de los pacientes con cáncer de vejiga reciben el diagnóstico después de presentar hematuria macroscópica o microscópica, o con otros síntomas de micción irritativa, tal como la frecuencia y la disuria. En el diagnóstico inicial, aproximadamente el 70 % de los pacientes tienen cánceres de vejiga que se restringen al epitelio o al tejido conjuntivo subepitelial. Estos cánceres se pueden tratar con resección endoscópica y terapia intravesical. La tasa de recidiva de estos tumores varía del 50 % al 70 %, y del 10 % al 15 % de los casos progresa a invasión muscular a lo largo de un período de 5 años (Shariat et al., 2008. Rev Urol. 10:120-135). La recidiva se puede ver de forma local y más raramente en las vías urinarias superiores, incluso después de varios años, necesitando una vigilancia de por vida. El 30 % restante de los pacientes tiene cáncer invasivo de músculo en el momento del diagnóstico inicial. De esta población, el 50 % tiene metástasis a distancia dentro de los 2 años y el 60 % muere dentro de los 5 años, a pesar del tratamiento.
El diagnóstico definitivo de cáncer de vejiga requiere una combinación de procedimientos. Actualmente no existen métodos para identificar con precisión y facilidad la presencia de cáncer de vejiga temprano. El cribado de cáncer de vejiga en pacientes que se presentan en el consultorio de urología con los síntomas apropiados se realiza actualmente con análisis de orina, cistoscopia y un procedimiento de exploración tal como ecografía abdominal, urografía intravenosa, tomografía computarizada o resonancia magnética. La citología de orina, en que se examinan microscópicamente células de muestras de orina, se usa de forma ocasional. La cistoscopia, el pilar para la detección del cáncer de vejiga, es un procedimiento relativamente corto, mínimamente traumático, realizado con anestesia local de la uretra, que identifica casi todas las lesiones papilares y sésiles. No obstante, sigue siendo invasivo y una causa de malestar y angustia para el paciente. Además, en ocasiones la cistoscopia puede no ser concluyente debido a al aspecto anómalo macroscópico de la mucosa de la vejiga, especialmente en pacientes con una sonda permanente o inflamación activa, y es incapaz de detectar cánceres dentro de los uréteres. Aunque se la considera el diagnóstico de referencia del cáncer de vejiga debido a que permite la visualización directa y la biopsia del urotelio de la vejiga, ya sea por error del operador o por pequeñas áreas de "carcinoma in situ", que pueden ser difíciles de detectar, (van der Poel y Debruyne. Curr Opin Urol. 2001; 11:503-509; Herr. BJU Int. 1999; 84:1102-1103.)
En la citología urinaria para el cáncer de vejiga, se pueden investigar células exfoliadas en cuanto a la presencia de antígenos específicos de la superficie celular, la morfología nuclear, expresión génica u otros marcadores biológicos. La citología urinaria tiene una alta sensibilidad y especificidad para la detección del cáncer de vejiga de gran malignidad, pero carece de sensibilidad para detectar tumores de baja malignidad (Wiener et al., Acta Cytol.
1993;37:163-169). La precisión de la citología urinaria para predecir la recidiva del cáncer de vejiga puede variar ampliamente, en parte debido a que hay un elemento de subjetividad en la interpretación de los resultados. Por eso, la citología no es ideal para cribar y vigilar el cáncer de vejiga.
Mcm5 es un biomarcador de cáncer (documento WO99021014). Un nivel aumentado de proteínas Mcm, tal como Mcm5, en el sedimento urinario está asociado con cambios malignos en la próstata.
Por lo tanto, los niveles aumentados de estas proteínas Mcm podrían usarse para detectar el cáncer de próstata. Usando el DELFIA® (forma siglada de dissociation-enhanced lanthanide fluorometric immunoassay inmunoensayo fluorométrico de intensificación disociativa de la fluorescencia por lantánido) y los anticuerpos monoclonales anti Mcm5 4B4 y 12A7 en un doble ensayo de anticuerpos, Dudderidge et al. (BJC, 103, 701 - 707; 2010) investigaron el uso de Mcm5 como un biomarcador urinario para la detección del cáncer de próstata y concluyeron que 'parece ser un método sencillo, preciso y no invasivo para la identificación de pacientes con cáncer de próstata'. En comparación con la
prueba de PSA, que tiene una especificidad del 30 %, la especificidad de Mcm5 se estimó como de entre el 73 % y 93 %. Es importante destacar que, la hiperplasia prostética benigna no generó resultados positivos falsos, lo cual es una desventaja de la prueba de PSA.
Un nivel aumentado de proteínas Mcm, tal como Mcm5, en el sedimento urinario esté asociado con cambios malignos en la próstata. Por lo tanto, los niveles aumentados de estas proteínas Mcm podrían usarse para detectar el cáncer de próstata. Utilizando el DELFIA® y los anticuerpos monoclonales anti Mcm5 en un doble ensayo de anticuerpos, Dudderidge et al. (BJC, 103, 701 - 707; 2010) investigaron el uso de Mcm5 como un biomarcador urinario para la detección del cáncer de próstata y concluyeron que 'parece ser un método sencillo, preciso y no invasivo para la identificación de pacientes con cáncer de próstata'. En comparación con la prueba de PSA, que tiene una especificidad del 30 %, la especificidad de Mcm5 se estimó como de entre el 73 % y 93 %. Es importante destacar que, la hiperplasia prostética benigna no generó resultados positivos falsos, lo cual es una desventaja de la prueba de pSa . La evaluación de Mcm5 y otras proteínas Mcm actualmente precisa un laboratorio especializado con instrumentación sofisticada y personal altamente calificado, por lo que el ensayo no es adecuado para el laboratorio de anatomía patología o las aplicaciones en el diagnóstico inmediato.
Esto se ve agravado por los métodos complicados que se utilizan para preparar muestras para el análisis mediante la detección de biomarcadores. Dado que las proteínas Mcm están presentes en las células, las proteínas Mcm deben liberarse de las células de una muestra, tal como una muestra de orina. Un método para la preparación de tales muestras se divulga en, Dudderidge et al. (BJC, 103, 701 - 707; 2010), que describe que las muestras deben procesarse utilizando una gran cantidad de etapas, que incluyen (1) centrifugación a 1500 g durante 5 minutos a 4 °C, (2) descarte del sobrenadante, (3) lavado del sedimento celular tres veces con 500 pl de PBS, (3) resuspensión de los sedimentos celulares en 250 pl o 500 pl de tampón de procesamiento (PBS, dodecilsulfato de sodio al 0,4 % y azida de sodio al 0,02 %), (4) incubación de las muestras resuspendidas a 95 °C durante 45 minutos, (5) rotura del ADN de la muestra haciendo pasar la lisis a través de una aguja de 0,813 mm de diámetro, (6) digestión de los ácidos nucleicos con ADNasa I y ARNasa A durante 2 h a 37 °C, y (7) centrifugación a 15000 g durante 10 min. Este método también se observa en otros documentos, tal como Stoeber et al 2002 (Journal of the National Cancer Institute, 94, 1071-1079; 2002). Este método de preparación de muestras de orina implica múltiples etapas utilizando múltiples reactivos y es extremadamente lento. Normalmente, estos métodos toman al menos dos horas. Por lo tanto, existe la necesidad de un método para preparar muestras de orina que sea considerablemente menos molesto. Dicho método sería más adecuado para en el laboratorio de anatomía patológica o en aplicaciones en análisis de diagnóstico inmediato.
Los actuales ensayos para la detección de proteínas Mcm, particularmente de Mcm5, precisan el uso de la tecnología DELFIA, que es complicada de utilizar e implica equipos y reactivos caros. Por lo tanto, un ensayo basado en DELFIA no es adecuado para en el laboratorio de anatomía patológica o en aplicaciones en análisis de diagnóstico inmediato, y existe la necesidad de un ensayo que sea adecuado para tales aplicaciones.
Adicionalmente, no hay una divulgación de secuencias de anticuerpos que se unan a Mcm5 de una manera altamente específica y, por tanto, que sean adecuadas para diseñar un ensayo de alta afinidad para Mcm5.
Sumario de la invención
En el presente documento se describen métodos, composiciones y kits útiles para la detección temprana del cáncer urológico, tal como el cáncer de próstata, sin la necesidad de intervenciones quirúrgicas invasivas. Los métodos y composiciones son adecuados para su uso en el laboratorio clínico y/o para aplicaciones en análisis de diagnóstico inmediato.
La invención se define en las reivindicaciones 1 y 3. Los aspectos y realizaciones preferentes adicionales se definen en las reivindicaciones dependientes. Cualquier aspecto, realización y ejemplo de la presente divulgación que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención y se proporciona meramente con fines ilustrativos.
Los presentes inventores han demostrado que los complicados métodos de preparación de muestras de orina descritos en la técnica anterior no son necesarios para la liberación de biomarcadores, tales como Mcm5, de las células de las muestras, tales como muestras de orina. En su lugar, todo lo que se precisa es exponer la muestra a un tampón de lisis que sea capaz de liberar el biomarcador de las células de la muestra. Esto es mucho más simple que los métodos de la técnica anterior. De acuerdo con la presente invención, en algunas realizaciones las células de una muestra de orina pueden prepararse y lisarse mediante la adición de un único tampón de lisado.
Los presentes inventores también han demostrado que un ensayo de proteína Mcm que no utiliza inmunofluorescencia puede detectar con precisión si un sujeto tiene un cáncer urológico. Esto es beneficioso con respecto a las técnicas de la técnica anterior, que utilizan marcadores de Europio y detección DELFIA. Dichos métodos son caros y complicados y, por lo tanto, inadecuados para su uso en el laboratorio de anatomía patológica o en aplicaciones en análisis de diagnóstico inmediato.
Además, la presente invención se refiere a anticuerpos que se unen a biomarcadores tales como una proteína Mcm,
por ejemplo Mcm5, de una manera altamente específica. Estos anticuerpos son útiles para la detección de niveles del biomarcador y los presentes inventores han demostrado que estos anticuerpos pueden utilizarse en los métodos de la invención. Los inventores han demostrado que estos anticuerpos se unen a Mcm5 de muestras que se han expuesto a un tampón de lisis que es capaz de liberar el biomarcador de las células de la muestra. La presente invención se refiere a anticuerpos que se unen a Mcm5 pero que se unen a epítopos diferentes entre sí (12A7 se une a la SEQ ID NO: 1 y 4B4 se une a la SEQ ID NO: 2). Dichos anticuerpos son ventajosos dado que pueden usarse en ensayos para detectar Mcm5 (o proteínas Mcm similares que contienen estos epítopos). En particular, estos anticuerpos pueden utilizarse en los métodos de la invención, que comprenden un ensayo de tipo sándwich (de dos sitios), a saber, un ensayo de ELISA tipo sándwich.
Sin embargo, para que desarrollar tal ensayo, deben identificarse dos anticuerpos que se unan a Mcm5. De manera ideal, estos dos anticuerpos deben unirse a epítopos distintos entre sí, pero además los dos epítopos distintos a los que se unen los dos anticuerpos deben estar ubicados desde el punto de vista espacial de forma que ambos anticuerpos puedan unirse a Mcm5 al mismo tiempo (sin impedimento estérico sustancial). Los presentes inventores han desarrollado dos de tales anticuerpos (llamados 12A7 y 4B4). Estos dos anticuerpos se unen respectivamente a la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2. La Se Q ID NO: 1 y la SEQ iD NO: 2 representan dos epítopos de Mcm5 distintos que están dispuestos espacialmente en Mcm5 como para permitir que los dos anticuerpos se unan a Mcm5 al mismo tiempo. Esto se demuestra en los Ejemplos 2 y 3. Los presentes inventores son los primeros en determinar dos epítopos de Mcm5 que están dispuestos de forma que los anticuerpos para cada epítopo puedan unirse simultáneamente. Adicionalmente, los inventores son los primeros en proporcionar secuencias de dos anticuerpos que pueden unirse independientemente a Mcm5.
Por consiguiente, en un primer aspecto de la invención se proporciona un método para la detección de la presencia del componente 5 del complejo de mantenimiento de minicromosomas (Mcm5) en una muestra de un sujeto, comprendiendo el método:
(a) preparar una muestra de orina de dicho sujeto, en donde la preparación de la muestra de orina comprende exponer la muestra de orina a un tampón de lisis capaz de liberar Mcm5 de las células en la muestra de orina liberando de este modo Mcm5 de las células en la muestra de orina, y en donde el tampón de lisis comprende un detergente que comprende triton X-100;
(b) realizar un ensayo para determinar la concentración de Mcm5 liberada de las células en la muestra de orina exponiendo la muestra de orina a un primer anticuerpo monoclonal y un segundo anticuerpo monoclonal, y midiendo la cantidad de Mcm5 que se une al primer anticuerpo monoclonal y al segundo anticuerpo monoclonal, en donde el ensayo es un ensayo de ELISA tipo sándwich que comprende capturar Mcm5 utilizando un anticuerpo de captura y detectar la concentración de Mcm5 utilizando un anticuerpo de detección, y en donde el anticuerpo de captura es el primer anticuerpo monoclonal y el anticuerpo de detección es el segundo anticuerpo monoclonal, o el anticuerpo de captura es el segundo anticuerpo monoclonal y el anticuerpo de detección es el primer anticuerpo monoclonal; y
(c) comparar la concentración de Mcm5 determinada en la etapa (b) con valores de referencia; en donde el primer anticuerpo monoclonal y el segundo anticuerpo monoclonal se unen a Mcm5, y en donde el primer anticuerpo monoclonal se une a un epítopo que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, y el segundo anticuerpo monoclonal se une a un epítopo que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
En un segundo aspecto de la invención, se proporciona un kit que comprende un tampón de lisis que es capaz de liberar Mcm5 de las células en una muestra de orina, en donde el tampón de lisis comprende un detergente que comprende tritón X-100; y un primer anticuerpo monoclonal y un segundo anticuerpo monoclonal en donde el primer anticuerpo monoclonal es un anticuerpo que:
(i) se une a un epítopo que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1;
(ii) comprende una CDRH1 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 9; una CDRH2 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 11; una CDRH3 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 13; una CDRL1 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 3; una CDRL2 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 5; y una CDRL3 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 7; o
(iii) comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia idéntica a la SEQ ID NO: 29 y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia idéntica a la SEQ ID NO: 27;
y el segundo anticuerpo monoclonal es un anticuerpo que:
(i) se une a un epítopo que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2;
(ii) comprende una CDRH1 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 21; una CDRH2 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 23; una CDRH3 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 25; una CDRL1 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 15; una CDRL2 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 17; y una CDRL3 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 19; o
(iii) comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia idéntica a la SEQ ID NO: 33 y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia idéntica a la SEQ ID NO: 31.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra un gráfico que describe la absorbancia a 450 nm de distintas concentraciones de Mcm5. La Figura 2 muestra un diagrama que describe cómo diluir la solución de calibración concentrada.
La Figura 3 muestra un gráfico que compara la cantidad de Mcm5 liberada de células de carcinoma urotelial después de la exposición a 4 tampones de lisis distintos (Uro TL "desoxicolato de sodio al 0,08 %, CHAPS al 0,08 %, EDTA 2 mM, Trizma 150 mM pH 7,6), Cytobuster TM, Glolysis TM y SDS al 0,1 % Trizma 50 mM pH 7,6, NaC 150 mM, EDTA 1 mM.
La Figura 4 muestra un gráfico que compara la cantidad de Mcm5 liberada de células de carcinoma urotelial después de la exposición a 4 tampones de lisis distintos (Uro TL "desoxicolato de sodio al 0,08 %, CHAPS al 0,08 %, EDTA 2 mM, Trizma 150 mM pH 7,6), Cytobuster TM, Glolysis TM y SDS al 0,1 % Trizma 50 mM pH 7,6, NaC 150 mM, EDTA 1 mM.
La Figura 5 muestra un gráfico que compara el CytoBuster, el tampón RIPA y el tampón TBS-T antes de la modificación.
La Figura 6 muestra un gráfico que compara tampones basados en tampón TBST y que comprenden elementos del tampón RIPA, antes y después de la congelación y descongelación del lisado.
La Figura 7 muestra un gráfico que compara tampones basados en tampón RIPA pero en los que se han eliminados algunos elementos del tampón RIPA, antes y después de la congelación y descongelación del lisado.
La Figura 8 muestra un gráfico que compara tampones que tienen distintas concentraciones de Tris y de Tritón X-100, utilizando lisados frescos.
La Figura 9 muestra un gráfico que compara distintas formulaciones de la base del tampón (TBS, PBS, bicarbonato, MOPS y HEPES), utilizando lisados frescos.
La Figura 10 muestra un gráfico que compara tampones con distintas concentraciones de Tris (100 mM - 350 mM), utilizando lisados frescos.
La Figura 11 muestra un gráfico que compara los tampones basados en los tampones TBS-T y RIPA pero que tienen una fuerza iónica modificada, utilizando lisados congelados y descongelados.
La Figura 12 muestra un gráfico que compara tampones TBS-T que tienen una fuerza de NaCl modificada, utilizando lisados congelados y descongelados.
Las Figuras 13A y 13B muestran gráficos que comparan tampones TBS-T que comprenden adicionalmente diversos agentes estabilizadores.
La Figura 14 muestra un gráfico que compara tampones TBST que comprenden distintas concentraciones de agentes estabilizadores, después de 6 días de almacenamiento.
Las figuras 15A, 15B y 15C muestran gráficos que evalúan la eficacia del tampón TBST /- BSA al 2,5 % en diversas líneas celulares.
La Figura 16 muestra un gráfico que compara tampones TBST BSA al 2,5 % con o sin ProClin950.
La Figura 17 muestra un gráfico que compara tampones TBST BSA al 2,5 % con o sin azida de sodio (NaN3).
Descripción detallada
Métodos para la detección de la presencia de una Mcm5 en una muestra de un sujeto
En el presente documento se describe un método para la detección de la presencia de Mcm5, indicativa de un cáncer urológico en un sujeto, comprendiendo el método:
(a) preparar una muestra de dicho sujeto, en donde preparar la muestra comprende exponer la muestra a un tampón de lisis;
(b) realizar un ensayo para determinar la concentración de Mcm5 exponiendo la muestra a un primer anticuerpo monoclonal y/o un segundo anticuerpo monoclonal, y midiendo la cantidad de Mcm5 que se une al primer anticuerpo monoclonal y/o al segundo anticuerpo monoclonal; y
(c) comparar la concentración de Mcm5 determinada en la etapa (b) con valores de referencia; en donde el primer anticuerpo monoclonal y el segundo anticuerpo monoclonal se unen a Mcm5.
En algunas realizaciones, la presencia de niveles de Mcm5 superiores a los normales en la muestra es indicativa de un cáncer urológico. Se puede determinar si el nivel de Mcm5 en la muestra es superior o no a lo normal comparando la cantidad detectada con la cantidad detectada en una muestra de referencia. En algunas realizaciones, el método es un método para la detección de un cáncer urológico.
Proteínas de mantenimiento de minicromosomas (Mcm5)
Las proteínas de mantenimiento de minicromosomas (MCM; forma siglada de minichromosome maintenance) se han utilizado anteriormente como biomarcadores de diagnóstico para el cáncer de cuello de uterino. Los niveles elevados de una proteína de la familia del complejo de mantenimiento de minicromosomas (MCM), tal como la proteína nuclear Mcm5, se pueden utilizar para detectar células del cáncer de vejiga en sedimentos de orina así como cáncer de próstata. La evaluación de Mcm5 a menudo se lleva a cabo en un laboratorio especializado con instrumentación sofisticada y operarios altamente cualificados (Stoeber et al. JNCI. 2002: 94: 1071-1079) y este estilo de análisis puede ser costoso o poco práctico de llevar a cabo en las en el laboratorio de anatomía patológica o en aplicaciones en
análisis de diagnóstico inmediato. Sin embargo, es una ventaja que los inventores de la presente solicitud hayan logrado desarrollar un formato de ELISA tipo sándwich de doble de anticuerpo modificado utilizando una pareja de anticuerpos monoclonales específicos que son adecuados para el laboratorio de anatomía patológica o en aplicaciones en análisis de diagnóstico inmediato, para medir con precisión los niveles de Mcm5 en sedimentos urinarios. Sin embargo, este tipo preferente de ensayo no limita el análisis de Mcm5 a este modo, de acuerdo con la divulgación Mcm5 puede someterse a ensayo de acuerdo con cualquier método adecuado conocido en la técnica.
Las proteínas MCM 2-7 comprenden parte de los complejos de prerreplicación que se forman en la cromatina y que son prerrequisitos esenciales, o factores permisivos, para la posterior replicación del ADN. Los complejos de proteínas MCM actúan como helicasas replicativas y, por lo tanto, son componentes centrales de la maquinaria de replicación del ADN. Las MCM están reguladas al alza en la transición de la fase G0 a G1/S del ciclo celular y participan activamente en la regulación del ciclo celular. Las proteínas MCM forman una estructura anular alrededor de la cromatina.
El gen de Mcm5 humana mapea en 22q 13.1 y la proteína Mcm5 madura consiste en 734 aminoácidos (SEQ ID NO: 1; Figura 1: UNIPROT P33992: factor permisivo de replicación MCM5, ADN HUMANO). El término "Mcm5' se refiere a un polipéptido de la SEQ ID NO: 35, un polipéptido con el 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % de identidad con la SEQ ID NO: 35. Mcm5 puede estar codificada por un polinucleótido que tiene una secuencia el 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 36.
Preparación de una muestra de dicho sujeto
El método de la invención comprende una etapa de preparación de una muestra del sujeto en donde la preparación de la muestra comprende exponer la muestra a un tampón de lisis. La expresión "preparación de la muestra" se refiere a las etapas realizadas para liberar Mcm5 de las células dentro de la muestra para permitir que tenga lugar la etapa (b) de la invención (la realización de un ensayo para determinar la concentración de Mcm5). Esta etapa comprende exponer la muestra a un tampón de lisis. De manera adecuada, la etapa de "preparación de la muestra" comprende una etapa de concentración de células en la muestra de orina. De forma opcional, las células se concentran por filtración o por centrifugación.
Se puede considerar que la expresión 'exponer la muestra de orina a un tampón de lisis' se refiere a la manipulación de la muestra de orina de tal manera que las células dentro de la muestra de orina (o una parte sustancial de estas células) estén en contacto con el tampón de lisis. La muestra es una muestra de orina. De manera adecuada, la muestra se centrifuga para proporcionar un sedimento de muestra, el sobrenadante se descarta y el sedimento de muestra se resuspende en el tampón de lisis. Como alternativa, por ejemplo, se añaden a una muestra de orina líquida componentes de tampón concentrados para formar una solución que comprende la muestra expuesta al tampón de lisis.
Opcionalmente, el método de la invención comprende una etapa de "proporcionar una muestra de un sujeto", en donde esta etapa es no invasiva (no quirúrgica), por ejemplo, recolección de orina. La muestra comprende orina o sedimento urinario.
Mcm5 se encuentra normalmente en los núcleos de las células presentes en la orina. Por lo tanto, de manera adecuada, la muestra comprende células dentro de la orina. De manera más adecuada, esas células pueden concentrarse mediante cualquier técnica conocida común en la técnica, tal como la filtración o de forma más adecuada la recolección centrífuga de las células de la orina. Enriquecer las células de la orina puede aumentar la señal y puede facilitar la detección. Cuando se analiza el cáncer de próstata, de forma muy adecuada la muestra es orina del primer chorro, como se puede obtener después del masaje de la próstata (cuando el sujeto es hombre). De manera aún más adecuada, la muestra puede comprender los primeros pocos mililitros de orina del primer chorro. En otras palabras, de manera adecuada, la muestra puede comprender la primera parte del chorro de orina, de manera adecuada, la primera parte del chorro de orina producida después del masaje de la próstata. De manera aún más adecuada, la muestra puede comprender sedimento de orina, tal como células sedimentadas recogidas de la orina (tal como de la orina total, o la orina del primer chorro, como se explicó anteriormente).
En una realización, se prepara una muestra que comprende células utilizando un procedimiento que consiste en las siguientes etapas: a. centrifugación de la muestra para proporcionar un sedimento de muestra; y b. resuspensión de las células sedimentadas de la muestra en un tampón de lisis.
De manera adecuada, la muestra se centrifuga entre 1 minuto y 30 minutos a entre 500 g y 5000 g, entre 1 minuto y 20 minutos entre 750 g y 2500 g, entre 3 minutos y 10 minutos entre 750 g y 2000 g, o durante alrededor de 5 minutos a 1500 g. De manera adecuada, el sedimento se resuspende utilizando una pipeta ajustable con una punta desechable.
En una realización, el método no comprende la incubación de la muestra a una temperatura mayor que 90 °C durante alrededor de 45 minutos. Opcionalmente, el método no comprende la incubación de la muestra a una temperatura alta. De acuerdo con la presente invención, una temperatura alta es una temperatura mayor que 50 °C, mayor que
60 °C, mayor que 70 °C, mayor que 80 °C, mayor que 90 °C, entre 50 °C y 120 °C, entre 60 °C y 110 °C, entre 70 °C y 100 °C, o entre 80 °C y 100 °C. Opcionalmente, el método no comprende la incubación de la muestra a una temperatura mayor que 50 °C, mayor que 60 °C, mayor que 70 °C, mayor que 80 °C, mayor que 90 °C, entre 50 °C y 120 °C, entre 60 °C y 110 °C, entre 70 °C y 100 °C, o entre 80 °C y 100 °C durante más de 30 minutos, más de 35 minutos, más de 40 minutos, más de 45 minutos, entre 30 minutos y 2 horas, entre 35 minutos y 2 horas, o entre 40 minutos y 2 horas.
En una realización adicional, el método no comprende la rotura de los ácidos nucleicos haciendo pasar la muestra a través de una aguja de 0,813 mm de diámetro. En una realización adicional, el método no comprende la exposición de la muestra a rotura mecánica.
Opcionalmente, el método no comprende la incubación de la muestra de orina a una temperatura mayor que 90 °C durante más de 45 minutos, la rotura de los ácidos nucleicos en la muestra de orina haciendo pasar la muestra de orina a través de una aguja de 0,813 mm de diámetro, la digestión de los ácidos nucleicos mediante la exposición de la muestra de orina a ADNasa I o ARNasa A, la centrifugación de la muestra a 15.000 g durante 10 minutos, en donde el tampón de lisis no es PBS que contiene desoxicolato de sodio al 0,4 % y azida de sodio al 0,02 %.
En un método adicional, el método no comprende la digestión de los ácidos nucleicos exponiendo la muestra a ADNasa I o ARNasa A.
La expresión 'no comprende la digestión de los ácidos nucleicos exponiendo la muestra de orina a ADNasa I o ARNasa A' significa que la muestra no debe exponerse a una concentración de ADNasa I o ARNasa A que sea eficaz para provocar una digestión significativa de los ácidos nucleicos en la muestra. Preferentemente, la muestra no se expone a más de 20 U/ml de ADNasa I o más de 1 pg/ml de ARNasa A. De manera adecuada, la muestra no se expone a más de 1 U/ml, más de 5 U/ml, más de 10 U/ml, más de 15 U/ml, entre 1 U/ml y 500 U/ml, entre 5 U/ml y 250 U/ml, entre 10 U/ml y 100 U/ml o entre 15 U/ml y 100 U/ml de ADNasa I. De manera adecuada, la muestra no se expone a más de 0,1 pg/ml, más de 0,2pg/ml, más de 0,5pg/ml, más de 0,7 pg/ml, entre 0,1 pg/ml y 100 pg/ml, entre 0,5 pg/ml y 50 pg/ml o entre 0,5 pg/ml y 25 pg/ml de RNasa A.
En una realización adicional, el método no comprende la centrifugación de la muestra a 15.000 g durante diez minutos. En una realización adicional, el método no comprende la centrifugación de la muestra. En una realización adicional, el método no comprende centrifugar la muestra a más de 10.000 g, más de 12.000 g, más de 14.000 g o más de 14.500 g. En una realización adicional, el método no comprende centrifugar la muestra durante más de 2 minutos, más de 5 minutos, más de 7 minutos o más de 8 minutos.
Tampones de lisis
Los tampones de lisis son, generalmente, tampones que se utilizan con el fin de lisar células. El tampón de lisis es, preferentemente, compatible con el método utilizado para el análisis posterior. Por ejemplo, cuando el método de análisis es ELISA tipo sándwich de doble anticuerpo, el tampón de lisis no debe degradar el anticuerpo de captura unido a la superficie de la placa de microtitulación. Los tampones de lisis en general, pero no exclusivamente, comprenden uno o más detergentes (también conocidos como tensioactivos), una o más sales y un agente tamponador. Las concentraciones de estos componentes afectan la eficacia del tampón de lisis. El tampón de lisis es capaz de liberar un Mcm5 de las células de la muestra.
El tampón de lisis es capaz de liberar un biomarcador, tal como Mcm5, de las células de la muestra. Se considerará que un tampón de lisis es "capaz de liberar un biomarcador, tal como Mcm5, de las células de la muestra" si la cantidad del biomarcador, tal como Mcm5, liberada es mayor que el 40 %, 50 %, 60 %, 70 % u 80 % de la cantidad liberada cuando se utiliza un tampón que contiene desoxicolato de sodio al 0,08 %, CHAPS al 0,08 %, EDTA 2 mM, Trizma 150 mM pH 7,6. En una realización, se considerará que un tampón de lisis es "capaz de liberar un biomarcador, tal como Mcm5, de las células de la muestra" si la cantidad de un biomarcador, tal como Mcm5, liberada es mayor que el 40 %, 50 %, 60 %, 70 % u 80 % de la cantidad liberada cuando se utiliza un tampón que contiene Tris 10 mM (pH 7,6), NaCl 200 mM, BSA al 2,5 %, Tritón X100 al 0,1 % y azida de sodio al 0,09 %. La cantidad de un biomarcador, tal como Mcm5, que se libera utilizando un tampón de lisis se puede determinar sometiendo a ensayo la cantidad presente después de la exposición al tampón de lisis y comparándola con una muestra de referencia (preferentemente una muestra que sea sustancialmente la misma o idéntica a la primera muestra) que se ha expuesto a un tampón que contiene desoxicolato de sodio al 0,08 %, CHAPS al 0,08 %, EDTA 2 mM, Trizma 150 mM pH 7,6. En una realización, la cantidad de un biomarcador, tal como Mcm5, que se libera utilizando un tampón de lisis se puede determinar sometiendo a ensayo la cantidad presente después de la exposición al tampón de lisis y comparándola con una muestra de referencia (preferentemente una muestra que sea sustancialmente la misma o idéntica a la primera muestra) que se ha expuesto a un tampón que contiene Tris 10 mM (pH 7,6), NaCl 200 mM, BSA al 2,5 %, Tritón X100 al 0,1 % y azida de sodio al 0,09 %. La cantidad de un biomarcador, tal como Mcm5, que se libera puede medirse utilizando un ensayo de ELISA tipo sándwich tal como el ensayo descrito en el Ejemplo 4. Los anticuerpos utilizados en el ensayo tipo sándwich deben ser anticuerpos que se unan al biomarcador, tal como Mcm5, por ejemplo, un primer anticuerpo monoclonal o un segundo anticuerpo monoclonal utilizado en la invención. Preferentemente, se utilizan los anticuerpos 12A7 y 4B4.
En una realización aún más preferente de la invención, el tampón de lisis es capaz de liberar Mcm5 a partir de las células de la muestra de orina y no degrada sustancialmente la proteína Mcm5. Se puede considerar que un tampón no degrada sustancialmente la proteína Mcm5 si la cantidad de Mcm5 intacta presente después de la exposición de la muestra al tampón de lisis es mayor al 40 %, 50 %, 60 %, 70 % u 80 % de la cantidad de Mcm5 intacta después de la exposición a un tampón que contiene desoxicolato de sodio al 0,08 %, CHAPS al 0,08 %, EDTA 2 mM, Trizma 150 mM pH 7,6. La proteína Mcm5 puede considerarse intacta, si los sitios de unión para los anticuerpos que se unen a la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2 (tal como el primer anticuerpo monoclonal y el segundo anticuerpo monoclonal, 0 los anticuerpos 12A7 y 4B4) están presentes. Está dentro de las capacidades del experto en la materia determinar cuánta Mcm5 se degrada dentro de una muestra. La muestra debe analizarse para observar si la Mcm5 dentro de la muestra puede unirse al primer anticuerpo monoclonal y al segundo anticuerpo monoclonal utilizados en la invención. Esto puede medirse utilizando un ensayo de ELISA tipo sándwich, tal como el descrito en el Ejemplo 4. Los anticuerpos utilizados en el ensayo tipo sándwich deben ser anticuerpos que se unan a Mcm5, por ejemplo, un primer anticuerpo monoclonal o un segundo anticuerpo monoclonal utilizado en la invención. Preferentemente, se utilizan los anticuerpos 12A7 y 4B4.
En una realización, el tampón de lisis es capaz de liberar Mcm5 a partir de las células de una muestra fresca. La expresión "muestra fresca" se refiere a una muestra que no se ha congelado. Preferentemente, la "muestra fresca" se ha obtenido de un paciente menos de 10 días, menos de 5 días, menos de 2 días o menos de 1 día antes de su uso en los métodos de la invención. En una realización, las células se exponen al tampón de lisis y después se congelan antes del tratamiento adicional. Por ejemplo, la muestra de orina se puede concentrar por centrifugación seguido del descarte del sobrenadante y a continuación se puede añadir el tampón de lisis a las células concentradas. Preferentemente, la muestra congelada se descongela antes de una etapa de realización de un ensayo para determinar la concentración del al menos un biomarcador en la muestra de orina. Preferentemente, la muestra se congela durante al menos 1 hora, al menos 1 día, al menos 5 días o al menos 10 días antes de una etapa de realización de un ensayo para determinar la concentración del al menos un biomarcador en la muestra de orina. Preferentemente, la muestra se congela durante entre 1 hora y 1 año, entre 1 hora y 6 meses, entre 1 día y 3 meses o alrededor de una semana antes de una etapa de realización de un ensayo para determinar la concentración del al menos un biomarcador en la muestra de orina.
El tampón de lisis descrito en el presente documento puede ser el reactivo de extracción de proteínas Cytobuster™.
En una realización, el tampón de lisis no comprende azida de sodio. En una realización, el tampón de lisis no es PBS que contiene desoxicolato de sodio al 0,4 % y azida de sodio al 0,02 %.
El tampón de lisis utilizado en la presente invención comprende un detergente (también denominado tensioactivo). El tampón de lisis utilizado en la presente invención comprende un detergente que comprende triton X-100. En general, los detergentes son compuestos que se sabe que rompen las paredes celulares. Los detergentes son anfifílicos que tienen regiones hidrófobas e hidrófilas. Los detergentes adecuados son bien conocidos por el experto en la materia. De manera adecuada, el detergente es un detergente aniónico, un detergente catiónico, un detergente no iónico o un detergente zwitteriónico. De manera adecuada, el detergente se selecciona del grupo que consiste en desoxicolato de sodio, 3-[(3-Colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato (CHAPS), alquilbencenosulfonatos, dodecilbencenosulfonato de sodio, un detergente Tween (tal como polioxietileno (2b), monooleato de sorbitán o Tween-20) y un detergente Triton (tal como polietilenglicol p-(1, 1, 3, 3,-tetrametilbutil)-fenil éter o Triton X-100). De manera adecuada, el detergente comprende desoxicolato de sodio. De manera adecuada, el detergente comprende CHAPS. De manera adecuada, el detergente comprende desoxicolato de sodio y CHAPS. De manera adecuada, el tampón de lisis comprende desoxicolato de sodio a una concentración de entre el 0,01 % y el 0,15 %, entre el 0,03 % y el 0,10 %, entre el 0,05 % y el 0,09 %, o aproximadamente el 0,08 %. De manera adecuada, el tampón de lisis comprende CHAPS a una concentración de entre el 0,01 % y el 0,15 %, entre el 0,03 % y el 0,10 %, entre el 0,05 % y el 0,09 %, o aproximadamente el 0,08 %. De manera adecuada, el detergente comprende X-100. Preferentemente, el detergente comprende tritón X-100 a una concentración de entre el 0,01 % y el 25 %, entre el 0,01 % y el 10 %, entre el 0,05 % y el 5 %, entre el 0,05 % y el 1 %, entre el 0,05 % y el 0,5 %, entre 0,075 % y el 0,125 % o alrededor del 0,1 %. De manera adecuada, el detergente consiste en tritón X-100. Preferentemente, el detergente consiste en tritón X-100 a una concentración de entre el 0,01 % y el 25 %, entre el 0,01 % y el 10 %, entre el 0,05 % y el 5 %, entre el 0,05 % y el 1 %, entre el 0,05 % y el 0,5 %, entre 0,075 % y el 0,125 % o alrededor del 0,1 %. De manera adecuada, el detergente comprende polisorbato, preferentemente polisorbato 20 (también conocido como Tween 20). De manera adecuada, el detergente comprende polisorbato a una concentración de entre el 0,01 % y el 5 %, entre el 0,02 % y el 1 %, entre 0,03 % y el 0,07 % o alrededor del 0,05 %. De manera adecuada, el detergente comprende desoxicolato de sodio o dodecilsulfato de sodio. Por ejemplo, el detergente puede comprender desoxicolato de sodio o dodecilsulfato de sodio a una concentración de entre el 0,1 % y el 20 %, entre el 0,5 % y el 10 %, entre el 0,5 % y el 5 %, entre 0,75 % y el 1,25 % o alrededor del 1 %.
En una realización adicional, el tampón de lisis comprende un agente quelante. En una realización adicional, el tampón de lisis no comprende un agente quelante. Los agentes quelantes son ligandos multidentados que pueden coordinar iones metálicos. De manera adecuada, el agente quelante es EDTA (ácido etilendiaminotetraacético). Opcionalmente, el tampón de lisis comprende EDTA a una concentración de entre 0,5 mM y 10 mM, entre 1 mM y 5 mM, entre 1,5 mM
y 3 mM, o alrededor de 2 mM.
En una realización adicional, el tampón de lisis comprende un componente tampón. Se puede considerar que un componente tampón es cualquier componente que mantiene el pH del tampón de lisis a un pH que varía en menos de 2,0 unidades de pH, 1,5 unidades de pH o 1,0 unidades de pH. Los expertos en la materia conocen bien ejemplos de tampones que son adecuados para este fin. En una realización, el componente tampón es un tampón seleccionado del grupo que consiste en TAPS (ácido 3-{[tris(hidroximetil)metil]amino}propanosulfónico), Bicina (N,N-bis(2-hidroxietil)glicina), Tris (tris(hidroximetil)metilamina), Tricina (N-tris(hidroximetil(metilglicina), TAPSO (ácido 3-[N-Tris(hidroximetil)metilamino]-2-hidroxipropanosulfónico, HEPES (ácido 4-2-hidroxietil-1-piperazinetanosulfónico) y MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico. De manera adecuada, el componente tampón comprende tampón T ris, solución salina tamponada con fosfato (PBS), MOPS, bicarbonato o HEPES. De manera adecuada, el componente tampón comprende Tris, tampón PBS, MOPS o de bicarbonato. De manera adecuada, el componente tampón comprende Tris, tampón PBS o de bicarbonato. En una realización, el componente tampón es tampón Tris o Trizma. En una realización, el componente tampón comprende o consiste en tampón o Tris Trizma. Trizma puede referirse a cristales de Trizma® preajustados a pH 7,6' (Sigma-Aldrich N.° de Cat. T7943). En una realización adicional, el componente tampón mantiene el pH del tampón a un pH entre pH 4 y pH 9, entre pH 5 y pH 8, entre pH 6 y pH 8, o a alrededor de pH 7,6. Opcionalmente, el componente tampón es tampón Tris o Trizma, y el componente tampón mantiene el pH del tampón de lisis entre pH 4 y pH 9, entre pH 5 y pH 8, entre pH 6 y pH 8, o a alrededor de pH 7,6. Opcionalmente, el componente tampón comprende o consiste en tampón Tris o Trizma y el componente tampón mantiene el pH del tampón de lisis entre pH 4 y pH 9, entre pH 5 y pH 8, entre pH 6 y pH 8, o a alrededor de pH 7,6.
Preferentemente, el componente tampón comprende tampón tris, por ejemplo, a una concentración mayor de 5 mM, entre 5 mM y 350 mM, entre 200 mM y 300 mM, entre 225 mM y 275 mM entre 10 mM y 25 mM, entre 8 mM y 12 mM, alrededor de 10 mM o alrededor de 250 mM. Preferentemente, el componente tampón consiste en tampón tris, por ejemplo, a una concentración mayor de 5 mM, entre 5 mM y 350 mM, entre 200 mM y 300 mM, entre 225 mM y 275 mM, entre 10 mM y 25 mM, entre 8 mM y 12 mM, alrededor de 10 mM o alrededor de 250 mM. De manera adecuada, el componente tampón comprende solución salina tamponada con fosfato, por ejemplo, a una concentración de entre 5 mM y 250 mM, entre 50 mM y 250 mM, o alrededor de 100 mM.
En una realización, el tampón de lisis comprende desoxicolato de sodio a una concentración de entre el 0,01 % y el 0,15 %, CHAPS a una concentración de entre el 0,01 % y el 0,15 %, EDTA a una concentración de entre 0,5 mM y 10 mM, y tampón Tris o Trizma, en donde el Trizma o el tampón Tris mantiene el pH del tampón de lisis entre pH 4 y pH 9. En una realización adicional, el tampón de lisis comprende desoxicolato de sodio a una concentración de entre el 0,05 % y el 0,09 %, CHAPS a una concentración de entre el 0,05 % y el 0,09 %, EDTA a una concentración de entre 1,5 mM y 3 mM, y tampón Tris o Trizma, en donde el Trizma o el tampón Tris mantiene el pH del tampón de lisis entre pH 6 y pH 8. En una realización adicional, el tampón de lisis comprende desoxicolato de sodio a una concentración de aproximadamente el 0,08 %, CHAPS a una concentración de aproximadamente el 0,08 %, EDTA a una concentración de aproximadamente 2 mM, y tampón Tris o Trizma, en donde el Trizma tampón Tris mantiene el pH del tampón de lisis en alrededor de pH 7,6.
En una realización, el tampón de lisis comprende una sal seleccionada del grupo que consiste en cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, sulfato de sodio, sulfato de potasio, sulfato de magnesio, acetato de sodio, acetato de potasio, acetato de magnesio, fosfato de sodio, fosfato de potasio o fosfato de magnesio. Preferentemente, la sal es una sal de sodio o una sal de potasio. De manera adecuada, la sal es cloruro de sodio o cloruro de potasio. De manera adecuada, la sal comprende o consiste en cloruro de sodio o cloruro de potasio. De manera adecuada, la sal está a una concentración de entre 20 mM y 300 mM, entre 150 mM y 300 mM, entre 100 mM y 200 mM, entre 150 mM y 250 mM, entre 175 mM y 275 mM, o alrededor de 200 mM. Preferentemente la sal es cloruro de sodio, por ejemplo, a una concentración de entre 20 mM y 300 mM, entre 150 mM y 300 mM, entre 100 mM y 200 mM, o alrededor de 200 mM. Preferentemente, la sal comprende o consiste en cloruro de sodio, por ejemplo, a una concentración de entre 20 mM y 300 mM, entre 150 mM y 300 mM, entre 100 mM y 200 mM, o alrededor de 200 mM.
En una realización, el tampón de lisis tiene una fuerza iónica de entre 1 mM y 500 mM, entre 50 mM y 450 mM, entre 100 mM y 250 mM, entre 100 mM y 175 mM, o entre 125 mM y 175 mM. Diversos componentes tampón pueden contribuir a esta fuerza iónica. Por ejemplo, el tampón de lisis puede comprender un componente tampón (tal como T ris) y un componente de sal adicional (tal como cloruro de sodio), y ambos componentes pueden contribuir a la fuerza iónica del tampón de lisis.
En una realización, el tampón de lisis comprende un estabilizador. Un "estabilizador' es un componente que reduce la degradación de las proteínas. Por ejemplo, un estabilizador reduce la degradación de Mcm5. Se puede analizar si un componente tampón estabiliza a Mcm5 utilizando un ensayo de ELISA tipo sándwich, tal como el ensayo descrito en el Ejemplo 4. Por ejemplo, una muestra puede exponerse a un tampón de lisis que comprenda el posible estabilizador y una muestra de control puede exponerse a un tampón de lisis que carezca del posible estabilizador. El nivel de Mcm5 que se puede detectar después de la exposición se mide utilizando ELISA tipo sándwich. Si el nivel de Mcm5 en la muestra que tiene el tampón que comprende el posible estabilizador es mayor que el nivel de Mcm5 en la muestra que tiene el tampón que no comprende el posible estabilizador, entonces el posible estabilizador es un estabilizador. Un estabilizador puede impedir la degradación de Mcm5, de modo que el 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 20% o
25% más de Mcm5 esté presente después del almacenamiento en un tampón que comprenda un estabilizador durante 1 día, 3 días, 5 días, 1 semana o 2 semanas (en comparación con un tampón que no comprende el estabilizador).
El estabilizador puede ser un estabilizador seleccionado del grupo que consiste en seroalbúmina bovina (BSA), suero fetal bovino (SFB) y un inhibidor de proteasas. Por ejemplo, los inhibidores de proteasas incluyen clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencensulfonilo (Petrabloc SC o AEBSF), un cóctel de inhibidores de proteasas (tal como P8340 de Sigma) que comprende AEBSF, aprotinina, clorhidrato de bestatina, N-(trans-epoxisuccinil)-L-leucina 4-guanidinobutilamida (E-64), sal de hemisulfato de leupeptina y pepstatina A, e inhibidor de proteasa complete de Roche. Preferentemente, el estabilizador es BSA, por ejemplo, a una concentración de entre el 0,1 % y el 20 %, entre el 0,1 % y el 10 %, entre el 0,1 % y el 5 %, entre el 1 % y el 3 %, entre 2,2 % y el 2,7 % o alrededor del 2,5 %. Preferentemente, el estabilizador comprende o consiste en BSA, por ejemplo, a una concentración de entre el 0,1 % y el 20 %, entre el 0,1 % y el 10 %, entre el 0,1 % y el 5 %, entre el 1 % y el 3 %, entre 2,2 % y el 2,7 % o alrededor del 2,5 %.
El tampón de lisis puede comprender un agente antimicrobiano. Un componente es un "agente antimicrobiano" si reduce la replicación de microbios, por ejemplo bacterias, virus u hongos. En una realización, el agente antimicrobiano es azida de sodio o una isotiazolona. En una realización, el agente antimicrobiano comprende o consiste en azida de sodio o una isotiazolona. La isotiazolona puede ser 2-metil-4-isotiazolin-3-ona y/o 5-cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-ona. Preferentemente, el agente antimicrobiano comprende azida de sodio, por ejemplo, a una concentración de entre el 0,01 % y el 5 %, entre el 0,02 % y el 1,5 %, entre 0,07 % y el 0,12 % o alrededor del 0,09 %. Preferentemente, el agente antimicrobiano consiste en azida de sodio, por ejemplo, a una concentración de entre el 0,01 % y el 5 %, entre el 0,02 % y el 1,5 %, entre 0,07 % y el 0,12 % o alrededor del 0,09 %.
El tampón de lisis puede comprender:
(i) Tris entre 1 mM y 500 mM;
(ii) cloruro de sodio entre 5 mM y 500 mM;
(iii) BSA entre el 0,1 % y el 20 %;
(iv) Tritón X-100 entre el 0,001 % y el 10 %; y
(v) azida de sodio entre el 0,001 % y el 1 %.
Como alternativa, el tampón de lisis puede comprender:
(i) Tris entre 1 mM y 150 mM;
(ii) cloruro de sodio entre 50 mM y 400 mM;
(iii) BSA entre el 0,5 % y el 10 %;
(iv) Tritón X-100 entre el 0,01 % y el 5 %; y
(v) azida de sodio entre el 0,01 % y el 0,5 %.
Como alternativa, el tampón de lisis puede comprender:
(i) Tris entre 1 mM y 100 mM;
(ii) cloruro de sodio entre 100 mM y 300 mM;
(iii) BSA entre el 1 % y el 5 %;
(iv) Tritón X-100 entre el 0,01 % y el 1 %; y
(v) azida de sodio entre el 0,01 % y el 0,1 %.
El tampón de lisis puede comprender:
(i) Tris a alrededor de 10 mM;
(ii) cloruro de sodio a alrededor de 200 mM;
(iii) BSA a alrededor del 2,5 %;
(iv) T ritón X-100 a alrededor del 0,1 %; y
(v) azida de sodio a alrededor del 0,09 %.
El tampón de lisis puede consistir en:
(i) Tris entre 1 mM y 500 mM;
(ii) cloruro de sodio entre 5 mM y 500 mM;
(iii) BSA entre el 0,1 % y el 20 %;
(iv) Tritón X-100 entre el 0,001 % y el 10 %; y
(v) azida de sodio entre el 0,001 % y el 1 %.
Como alternativa, el tampón de lisis puede consistir en:
(i) Tris entre 1 mM y 150 mM;
(ii) cloruro de sodio entre 50 mM y 400 mM;
(iii) BSA entre el 0,5 % y el 10 %;
(iv) Tritón X-100 entre el 0,01 % y el 5 %; y
(v) azida de sodio entre el 0,01 % y el 0,5 %.
Como alternativa, el tampón de lisis puede consistir en:
(i) Tris entre 1 mM y 100 mM;
(ii) cloruro de sodio entre 100 mM y 300 mM;
(iii) BSA entre el 1 % y el 5 %;
(iv) Tritón X-100 entre el 0,01 % y el 1 %; y
(v) azida de sodio entre el 0,01 % y el 0,1 %.
El tampón de lisis puede consistir en:
(i) Tris a alrededor de 10 mM;
(ii) cloruro de sodio a alrededor de 200 mM;
(iii) BSA a alrededor del 2,5 %;
(iv) T ritón X-100 a alrededor del 0,1 %; y
(v) azida de sodio a alrededor del 0,09 %.
En una realización, el tampón de lisis utilizado en la invención se utiliza para liberar al menos un biomarcador de las células en una muestra de orina, en donde el al menos un biomarcador es Mcm5.
El tampón de lisis puede ser tampón RIPA.
Realización de un ensayo para determinar la concentración de Mcm5
En una realización de la invención, la expresión "detectar la presencia de Mcm5' puede considerarse como sustituible por la expresión "realizar un ensayo para determinar la concentración" de Mcm5. En tales realizaciones, la presencia de Mcm5 puede considerarse detectada, cuando su concentración es más alta que un nivel de valor de corte definido. Por ejemplo, el valor de corte puede ser una concentración de Mcm5 mayor que el valor medio de pacientes sanos más un múltiplo de la desviación típica mostrada por los valores obtenidos de sujetos sanos.
No existe un requisito particular de que la concentración de, por ejemplo, el polipéptido Mcm5 de longitud completa sea puntuada. De hecho, es posible que la detección tenga lugar sometiendo a ensayo fragmentos particulares de Mcm5 que estén presentes y que, así, se considera que indican la presencia del polipéptido biomarcador total en la muestra. Esto es especialmente cierto si las muestras se analizan, por ejemplo, mediante espectrometría de masas. Por lo tanto, la invención abarca la detección de fragmentos de biomarcadores Mcm5. De manera adecuada, el fragmento es lo suficientemente largo como para permitir su identificación exclusiva mediante métodos de espectrometría de masas o inmunológicos. Dicho fragmento es adecuadamente de al menos 6 aminoácidos de longitud, de manera adecuada, de al menos 7 aminoácidos de longitud, de manera adecuada, de al menos 8 aminoácidos de longitud, de manera adecuada, de al menos 9 aminoácidos de longitud, de manera adecuada, de al menos 10 aminoácidos de longitud, de manera adecuada, de al menos 15 aminoácidos, de manera adecuada, de al menos 25 aminoácidos, de manera adecuada, de al menos 50 aminoácidos, convenientemente de al menos 100 aminoácidos, o convenientemente es la mayor parte de Mcm5. De manera adecuada, un fragmento comprende un pequeño fragmento de Mcm5, mientras que lo suficientemente largo como para conservar una secuencia o masa de aminoácidos identificable.
Anticuerpos
El ensayo para determinar la concentración de Mcm5 se realiza exponiendo la muestra a un primer anticuerpo monoclonal y/o un segundo anticuerpo monoclonal. Preferentemente, el ensayo comprende exponer la muestra tanto a un primer anticuerpo monoclonal como a un segundo anticuerpo monoclonal. Los kits de la invención comprenden un primer anticuerpo monoclonal y un segundo anticuerpo monoclonal.
El término 'anticuerpo' puede referirse a formas de origen natural o a anticuerpos recombinantes, tales como los anticuerpos monocatenarios, anticuerpos quiméricos o anticuerpos humanizados. Puede considerarse que los términos 'anticuerpo' y 'anticuerpos' también abarcan fragmentos de anticuerpos que pueden unirse a una proteína diana, tal como una proteína Mcm como Mcm5. Dichos fragmentos pueden incluir un Fab'2, F(ab)2, un Fv, anticuerpos monocatenarios o diacuerpos. En una realización preferente, los anticuerpos utilizados en la invención son de origen natural, anticuerpos de longitud completa (en lugar de fragmentos). En una realización preferente, el anticuerpo es un anticuerpo de ratón (es decir, obtenido originalmente de células de bazo de ratón).
En general, los anticuerpos están formados por dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Cada cadena pesada está compuesta por una región constante de la cadena pesada (CH) y una región variable de la cadena pesada (VH).
De forma similar, cada cadena ligera está compuesta por una región constante de la cadena ligera (CL) y una región variable de la cadena ligera (VL). Las regiones VH y VL comprenden regiones que definen la complementariedad (CDR). Las CDR son, principalmente, responsable de la unión específica a la proteína diana.
Un anticuerpo utilizado en la invención puede ser un anticuerpo de cualquier clase, en particular una IgG, IgM o IgA. En una realización preferente, el anticuerpo es un anticuerpo IgG.
La expresión "anticuerpo monoclonal" pretende referirse a un anticuerpo que se obtiene a partir de una población de anticuerpos sustancialmente similares, es decir, a partir de una población de anticuerpos que son idénticos, excepto por una minoría de variantes naturales. Una población de anticuerpos monoclonales se unirá al mismo epítopo. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse mediante una diversidad de técnicas bien conocidas por el experto en la materia y que incluyen los métodos divulgados en "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) y en "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Application", SG Hurrell (CRC Press, 1982).
Diana del anticuerpo
El primer anticuerpo monoclonal y/o el segundo anticuerpo monoclonal se unen específicamente a Mcm5. El primer anticuerpo monoclonal se une a la SEQ ID NO: 1. El segundo anticuerpo monoclonal se une a la SEQ ID NO: 2.
El primer anticuerpo monoclonal o el segundo anticuerpo monoclonal se unirá a un epítopo (fragmento) de Mcm5 (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2). Por lo tanto, la expresión "anticuerpo que se une a Mcm5' se refiere a un anticuerpo que se une a un único epítopo de Mcm5, tal como la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2.
Para los fines de la presente invención, la expresión 'afinidad de unión' se refiere a la capacidad de un anticuerpo de unirse a su diana. Para los fines de la presente invención, la expresión 'se une específicamente' se refiere a un anticuerpo que se une a una diana, tal como Mcm5, con una afinidad de unión que es al menos 2 veces, 10 veces, 50 veces o 100 veces mayor que su afinidad de unión por la unión a otra molécula no diana. En una realización, la molécula no diana es una proteína Mcm, distinta de Mcm5, tal como Mcm2. Preferentemente, un anticuerpo utilizado en la invención es capaz de unirse a Mcm5, con una afinidad de unión que es al menos 2 veces, 10 veces, 50 veces o 100 veces mayor que su afinidad de unión por la unión a otra molécula no diana. Incluso más preferentemente, un anticuerpo utilizado en la invención se une a la SEQ ID NO: 1 (tal como el primer anticuerpo monoclonal) o la SEQ ID NO: 2 (tal como el segundo anticuerpo monoclonal) con una afinidad de unión de al menos 2 veces, 10 veces, 50 veces o 100 veces mayor que su afinidad de unión por la unión a otra molécula no diana.
Un método preferente para la evaluación de la afinidad de unión para Mcm5 es mediante ELISA. Preferentemente, el primer anticuerpo monoclonal y/o el segundo anticuerpo monoclonal tienen afinidad por Mcm5 (medida como una CE50 o una concentración de unión máxima del 50 %, como se describe en el Ejemplo 2) de 2500 ng/ml o menor, 1500 ng/ml o menor, 1000 ng/ml o menor, 600 ng/ml o menor, 50 ng/ml o menor, 30 ng/ml o menor, 20 ng/ml o menos, o 10 ng/ml o menor. La CE50 normalmente será superior a 1 ng/ml y, por lo tanto, la CE50 puede estar entre 1 ng/ml y cualquiera de los límites superiores especificados en la oración precedente. Se conocen en la técnica otros ensayos convencionales para evaluar la capacidad de unión de ligandos, tales como anticuerpos para con sus dianas, incluyendo, por ejemplo, transferencia de Western, los RIA y los análisis por citometría de flujo. La cinética de unión (por ejemplo, la afinidad de unión) del anticuerpo también se puede evaluar mediante ensayos convencionales conocidos en la técnica, tal como mediante análisis de resonancia de plasmón superficial (RPS) (por ejemplo, sistema Biacore ™). La constante de afinidad (KD) para la unión a Mcm5 está preferentemente en el intervalo de 1-10000 nM, 1-1 000 nM, 1-500 nM, 1-100 nM, 1-50 nM o 1-10 nM. La constante de asociación (ka) está preferentemente en el intervalo de 0,4-3,4 x 1061/M. La constante de disociación (kd) está preferentemente en el intervalo de 1-10 x 10‘31/s. Normalmente, estos valores pueden determinarse por RPS (resonancia de plasmón superficial).
Regiones determinantes de complementariedad (las CDR)
En el presente documento se describen anticuerpos que comprenden preferentemente al menos una de las CDR de los anticuerpos 12A7 o 4B4, es decir, una CDR seleccionada del grupo que consiste en:
a. la CDRH1 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 9 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 9 en 1, 2 o 3 sustituciones de aminoácidos;
b. la CDRH2 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 11 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 11 en 1,2 o 3 sustituciones de aminoácidos;
c. la CDRH3 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 13 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 13 en 1,2 o 3 sustituciones de aminoácidos;
d. la CDRL1 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 3 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 3 en 1, 2 o 3 sustituciones de aminoácidos;
e. la CDRL2 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 5 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 5 en 1, 2 o 3 sustituciones de aminoácidos;
f. la CDRL3 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 7 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 7 en 1, 2 o 3 sustituciones de aminoácidos;
g. la CDRH1 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 21 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 21 en 1,2 o 3 sustituciones de aminoácidos;
h. la CDRH2 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 23 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 23 en 1, 2 o 3 sustituciones de aminoácidos;
i. la CDRH3 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 25 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 25 en 1,2 o 3 sustituciones de aminoácidos
j. la CDRL1 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 15 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 15 en 1,2 o 3 sustituciones de aminoácidos;
k. la CDRL2 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 17 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 17 en 1,2 o 3 sustituciones de aminoácidos; y
1. la CDRL3 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 19 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 19 en 1, 2 o 3 sustituciones de aminoácidos.
Los anticuerpos que tienen las mismas CDR que los anticuerpos 4B4 y 12A7 pueden diferir sustancialmente de las secuencias de 4B4 y 12A7 en otras regiones. Dichos anticuerpos pueden, por ejemplo, ser fragmentos de anticuerpos.
La expresión "secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 3 por una única sustitución de aminoácido" se refiere a la posibilidad de reemplazar un aminoácido definido en la SEQ ID NO: 3 por un aminoácido distinto. Preferentemente, tal reemplazo es una sustitución conservativa de aminoácidos. Los siguientes ocho grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones normalmente conservativas entre sí:
1) Alanina, Glicina;
2) Ácido aspártico, Acido glutámico;
3) Asparagina, Glutamina;
4) Arginina, Lisina;
5) Isoleucina, Leucina, Metionina, Valina;
6) Fenilalanina, Tirosina, Triptófano;
7) Serina, Treonina; y
8) Cisteína, Metionina.
El primer anticuerpo monoclonal puede comprender al menos una CDR de la cadena pesada de 12A7 (la CDRH1 de 12A7, la CDRH2 de 12A7 o la CDRH3 de 12A7), así como al menos una CDR de la cadena ligera de 12A7 (la CDRL1 de 12A7, la CDRL2 de 12A7 o la CDRL3 de 12A7). El primer anticuerpo monoclonal puede comprender al menos dos CDR de la cadena pesada de 12A7 y al menos dos c Dr de la cadena ligera de 12A7. En una realización preferente, el primer anticuerpo monoclonal comprende las tres CDR de la cadena pesada de 12A7 y/o las tres CDR de la cadena ligera de 12A7. El primer anticuerpo monoclonal puede comprender la CDRL1 de 12A7 y la CDRL2 de 12A7, la CDRL1 de 12A7 y la CDRL3 de 12A7, la CDRL1 de 12A7 y la CDRH1 de 12A7, la CDRL1 de 12A7 y la CDRH2 de 12A7, la CDRL1 de 12A7 y la CDRH3 de 12A7, la CDRL2 de 12A7 y la CDRL3 de 12A7, la CDRL2 de 12A7 y la CDRH1 de 12A7, la CDRL2 de 12A7 y la CDRH2 de 12A7, la CDRL2 de 12A7 y la CDRH3 de 12A7, la CDRL3 de 12A7 y la CDRH1 de 12A7, la CDRL3 de 12A7 y la CDRH2 de 12A7, la CDRL3 de 12A7 y la CDRH3 de 12A7, la CDRH1 de 12A7 y la CDRH2 de 12A7, la CDRH1 de 12A7 y la CDRH3 de 12A7, o la CDRH2 de 12A7 y la CDRH3 de 12A7.
El segundo anticuerpo monoclonal puede comprender al menos una CDR de la cadena pesada de 4B4 (la CDRH1 de 4B4, la CDRH2 de 4B4 o la CDRH3 de 4B4), así como al menos una CDR de la cadena ligera de 4B4 (la CDRL1 de 4B4, la CDRL2 de 4B4 o la CDRL3 de 4B4). El segundo anticuerpo monoclonal puede comprender al menos dos CDR de la cadena pesada de 4B4 y al menos dos CDR de la cadena ligera de 4B4. En una realización preferente, el segundo anticuerpo monoclonal comprende las tres CDR de la cadena pesada de 4B4 y/o las tres CDR de la cadena ligera de 4B4. El segundo anticuerpo monoclonal puede comprender la CDRL1 de 4B4 y la CDRL2 de 4B4, la CDRL1 de 4B4 y la CDRL3 de 4B4, la CDRL1 de 4B4 y la CDRH1 de 4B4, la CDRL1 de 4B4 y la CDRH2 de 4B4, la CDRL1 de 4B4 y la CDRH3 de 4B4, la CDRL2 de 4B4 y la CDRL3 de 4B4, la CDRL2 de 4B4 y la CDRH1 de 4B4, la CDRL2 de 4B4 y la CDRH2 de 4B4, la CDRL2 de 4B4 y la CDRH3 de 4B4, la CDRL3 de 4B4 y la CDRH1 de 4B4, la CDRL3 de 4B4 y la CDRH2 de 4B4, la CDRL3 de 4B4 y la CDRH3 de 4B4, la CDRH1 de 4B4 y la CDRH2 de 4B4, la CDRH1 de 4B4 y la CDRH3 de 4B4, o la CDRH2 de 4B4 y la CDRH3 de 4B4.
Un anticuerpo puede comprender al menos una CDR que tiene una secuencia idéntica a la descrita en una cualquiera de las SEQ ID NO: 3 (CDRL1 de 12A7), SEQ ID NO: 5 (CDRL2 de 12A7), SEQ ID NO: 7 (CDRL3 de 12A7), SEQ ID NO: 9 (CDRH1 de 12A7), SEQ ID NO: 11 (CDRH2 de 12A7), SEQ ID NO: 13 ( CDR H3 de 12A7), SEQ ID NO: 15 (CDRL1 de 4B4), SEQ ID NO: 17 (CDRL2 de 4B4), SEQ ID NO: 19 (CDRL3 de 4B4), SEQ ID NO: 21 (CDRH1 de 4B4), SEQ ID NO: 23 (CDRH2 de 4B4) o SEQ ID NO: 25 (CDRH3 de 4B4). En una realización donde el primer anticuerpo monoclonal comprende la CDRL2 de 12A7, la CDRL2 de 12A7 tiene la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 5. En una realización adicional donde el primer anticuerpo monoclonal comprende la CDRL1 de 12A7, la CDRL1 de 12A7 tiene la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 3. En una realización adicional donde el primer anticuerpo monoclonal comprende la CDRL3 de 12A7, la CDRL3 de 12A7 tiene la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 7. En una realización adicional donde el primer anticuerpo monoclonal comprende la CDRH1 de 12A7, la CDRH1 de 12A7 tiene la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 9. En una realización adicional donde el primer anticuerpo monoclonal
comprende la CDRH2 de 12A7, la CDRH2 de 12A7 tiene la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 11. En una realización adicional donde el primer anticuerpo monoclonal comprende la CDRH3 de 12A7, la CDRH3 de 12A7 tiene la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 13. En una realización adicional donde el segundo anticuerpo monoclonal comprende la CDRL1 de 4B4, la CDRL1 de 4B4 tiene la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 15. En una realización adicional donde el segundo anticuerpo monoclonal comprende la CDRL2 de 4B4, la CDRL2 de 4B4 tiene la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 17. En una realización adicional donde el segundo anticuerpo monoclonal comprende la CDRL3 de 4B4, la CDRL3 de 4B4 tiene la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 19. En una realización adicional donde el segundo anticuerpo monoclonal comprende la CDRH1 de 4B4, la CDRH1 de 4B4 tiene la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 21. En una realización adicional donde el segundo anticuerpo monoclonal comprende la CDRH2 de 4B4, la CDRH2 de 4B4 tiene la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 23. En una realización adicional donde el segundo anticuerpo monoclonal comprende la CDRH3 de 4B4, la CDRH3 de 4B4 tiene la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 25.
Preferentemente, un anticuerpo que comprende al menos una de las CDR de 12A7 o de 4B4 se une (de forma opcional se une específicamente) a Mcm5. Aún más preferentemente, un anticuerpo que comprende al menos una de las CDR de 12A7 o de 4B4 se une (de forma opcional se une específicamente) a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2.
Secuencias de la región variable de las cadenas pesada y ligera
El primer anticuerpo monoclonal comprende preferentemente una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 29. El primer anticuerpo monoclonal comprende preferentemente una secuencia de la región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 27. El segundo anticuerpo monoclonal comprende preferentemente una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 33. El segundo anticuerpo monoclonal comprende preferentemente una secuencia de la región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 31. Dichos anticuerpos pueden denominarse "anticuerpos variantes".
El primer anticuerpo monoclonal puede comprender una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 29. El primer anticuerpo monoclonal puede comprender una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 98 % idéntica a la SEQ ID NO: 29. El primer anticuerpo monoclonal puede comprender una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 27. El primer anticuerpo monoclonal puede comprender una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 98 % idéntica a la SEQ ID NO: 27. El primer anticuerpo monoclonal puede comprender una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 27 y una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 29. El primer anticuerpo monoclonal puede comprender una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 98 % idéntica a la SEQ ID NO: 29 y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 98 % idéntica a la SEQ ID NO: 27.
El segundo anticuerpo monoclonal puede comprender una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 33. El segundo anticuerpo monoclonal puede comprender una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 98 % idéntica a la SEQ ID NO: 33. El segundo anticuerpo monoclonal puede comprender una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 31. El segundo anticuerpo monoclonal puede comprender una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 98 % idéntica a la SEQ ID NO: 31. El segundo anticuerpo monoclonal puede tener una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 95 % idéntica a la SEQ Id NO: 33 y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 31. El segundo anticuerpo monoclonal puede tener una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 98 % idéntica a la SEQ ID NO: 33 y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 98 % idéntica a la SEQ ID NO: 31.
Como saben los expertos en la materia, los anticuerpos contienen múltiples regiones, que incluyen las regiones marco conservadas. Es poco probable que la deleción o adición de aminoácidos en las regiones marco conservadas afecte la capacidad del anticuerpo para unirse a su diana. Por otro lado, es considerablemente más probable que las mutaciones en las CDR afecten la capacidad de un anticuerpo de unirse a una diana. Por lo tanto, en determinadas realizaciones de la invención, los anticuerpos variantes se unen a un epítopo que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o 2 y tienen CDR que son idénticas a las CDR de los anticuerpos 12A7 o 4B4, o tienen CDR que varían en una única sustitución de aminoácido (preferentemente una sustitución de aminoácidos conservativa). El primer anticuerpo monoclonal y/o el segundo anticuerpo monoclonal pueden tener regiones marco conservadas cuya secuencia difiere bastante significativamente de las descritas en la SEQ ID NO: 27, 29, 31 o 33.
De forma opcional, donde el primer anticuerpo monoclonal comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 29, el anticuerpo comprende además al menos uno de la CDRH1 de 12A7, la CDRH2 de 12A7 o la CDRH3 de 12A7. Un experto en la materia entiende que, dado que la especificidad de unión a la diana está determinada por las CDR, un anticuerpo que
comprende las CDR de 12A7 aún puede unirse a Mcm5 incluso si el resto de la secuencia del anticuerpo es bastante variable. Por esta razón, cuando el primer anticuerpo monoclonal comprende al menos uno de la CDRH1 de 12A7, la CDRH2 de 12A7 o la CDRH3 de 12A7, el primer anticuerpo monoclonal comprende preferentemente una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 29. En una realización más preferente, el primer anticuerpo monoclonal utilizado en la invención comprende la CDRH1 de 12A7, la CDRH2 de 12A7 y la CDRH3 de 12A7, y comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 29.
De forma opcional, donde el segundo anticuerpo monoclonal comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 33, el segundo anticuerpo monoclonal comprende además al menos uno de la CDRH1 de 4B4, la CDRH2 de 4B4 o la CDRH3 de 4B4. Un experto en la materia entiende que, dado que la especificidad de unión a la diana está determinada por las CDR, un anticuerpo que comprende las CDR de 4B4 aún puede unirse a Mcm5 incluso si el resto de la secuencia del anticuerpo es bastante variable. Por esta razón, cuando el segundo anticuerpo monoclonal comprende al menos uno de la CDRH1 de 4B4, la CDRH2 de 4B4 o la CDRH3 de 4B4, el segundo anticuerpo monoclonal comprende preferentemente una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 33. En una realización más preferente, el segundo anticuerpo monoclonal comprende la CDRH1 de 4B4, la CDRH2 de 4B4 y la CDRH3 de 4B4, y comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 33.
De forma opcional, donde el primer anticuerpo monoclonal comprende una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 27, el primer anticuerpo monoclonal comprende además al menos uno de la CDRL1 de 12A7, la CDRL2 de 12A7 o la CDRL3 de 12A7. Un experto en la materia entiende que, dado que la especificidad de unión a la diana está determinada por las CDR, un anticuerpo que comprende las CDR de 12A7 aún puede unirse a Mcm5 incluso si el resto de la secuencia del anticuerpo es bastante variable. Por esta razón, cuando el primer anticuerpo monoclonal comprende al menos uno de la CDRL1 de 12A7, la CDRL2 de 12A7 o la CDRL3 de 12A7, el primer anticuerpo monoclonal comprende preferentemente una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 27. En una realización más preferente, el primer anticuerpo monoclonal comprende la CDRL1 de 12A7, la CDRL2 de 12A7 y la CDRL3 de 12A7, y comprende una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 27.
De forma opcional, donde el segundo anticuerpo monoclonal utilizado en la invención comprende una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 31, el segundo anticuerpo monoclonal comprende además al menos uno de la CDRL1 de 4B4, la CDRL2 de 4B4 o la CDRL3 de 4B4. Un experto en la materia entiende que, dado que la especificidad de unión a la diana está determinada por las CDR, un anticuerpo que comprende las CDR de 4B4 aún puede unirse a Mcm5 incluso si el resto de la secuencia del anticuerpo es bastante variable. Por esta razón, cuando el segundo anticuerpo monoclonal comprende al menos uno de la CDRL1 de 4B4, la CDRL2 de 4B4 o la CDRL3 de 4B4, el segundo anticuerpo monoclonal comprende preferentemente una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 31. En una realización más preferente, el segundo anticuerpo monoclonal comprende la CDRL1 de 4B4, la CDRL2 de 4B4 y la CDRL3 de 4B4, y comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 31.
En una realización adicional de la invención, el primer anticuerpo monoclonal comprende:
(i) la CDRH1 de 12A7, la CDRH2 de 12A7 y la CDRH3 de 12A7;
(ii) una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 29;
(iii) la CDRL1 de 12A7, la CDRL2 de 12A7 y la CDRL3 de 12A7; y
(iv) una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia al menos el 95 % idéntica a la SEQ ID NO 27.
En una realización adicional, el segundo anticuerpo monoclonal comprende:
(i) la CDRH1 de 4B4, la CDRH2 de 4B4 y la CDRH3 de 4B4;
(ii) una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 33;
(iii) la CDRL1 de 4B4, la CDRL2 de 4B4 y la CDRL3 de 4B4; y
(iv) una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 31.
Un anticuerpo que tiene una secuencia variable de la cadena pesada idéntica a la SEQ ID NO: 29 y una secuencia variable de la cadena ligera idéntica a la SEQ ID NO: 27 puede denominarse anticuerpo 12A7. Un anticuerpo que tiene una secuencia variable de la cadena pesada idéntica a la SEQ ID NO: 33 y una secuencia variable de la cadena ligera idéntica a la SEQ ID NO: 31 puede denominarse un anticuerpo 4B4.
En algunas realizaciones, el primer anticuerpo monoclonal competirá por la unión a Mcm5 con el anticuerpo 12A7. De manera similar, en algunas realizaciones de la invención el segundo anticuerpo monoclonal competirá por la unión a Mcm5 con el anticuerpo 4B4.
Para los fines de la presente invención, un anticuerpo es 'al menos el 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico' a un segundo anticuerpo si las secuencias tienen al menos el 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad cuando se evalúan utilizando ClustalW (Thompson et al., 1994) con los siguientes parámetros:
Parámetros de alineación por pares -Método: preciso, Matriz: PAM, Penalización de apertura de hueco: 10,00, Penalización de extensión de hueco: 0,10;
Parámetros de alineación múltiple -Matriz: PAM, Penalización de apertura de hueco: 10,00, identidad % para retraso: 30, Penalizar huecos finales: en funcionamiento, Distancia de separación de huecos: 0, Matriz negativa: no, Penalización de extensión de hueco: 0,20, Penalizaciones de huecos específicas de restos: en funcionamiento, Penalizaciones de huecos hidrófilos: en funcionamiento, Restos hidrófilos: GPSNDQEKR.
Es parte del conocimiento de la persona experta en la materia cómo fabricar anticuerpos variantes que se unen a Mcm5. Dichos anticuerpos variantes pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50 o 100 mutaciones de sustitución o deleción, en comparación con las SEQ ID NO: 27, 29, 31 o 33. Los anticuerpos variantes de 'deleción' pueden comprender la deleción de 1, 2, 3, 4, 5 o más aminoácidos o, en algunos casos, la deleción de regiones completas de las SEQ ID NO: 27, 29, 31 o 33. Las variantes de 'sustitución' pueden comprender el reemplazo de 1, 2, 3, 4, 5 o más aminoácidos por el mismo número de aminoácidos nuevos.
Preferentemente, los anticuerpos variantes utilizados en la invención comprenden secuencias que difieren de las SEQ ID NO: 27, 29, 31 o 33 en sustituciones de aminoácidos conservativas (de forma opcional solo en sustituciones de aminoácidos conservativas). El experto en la materia es consciente de que es poco probable que tales sustituciones conservativas modifiquen las propiedades de unión de un anticuerpo.
Anticuerpos que compiten con los anticuerpos utilizados en la invención
En el presente documento se describe además un primer anticuerpo monoclonal que compite con un anticuerpo que:
(i) se une a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1;
(ii) comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR) seleccionada del grupo que consiste en:
(a) la CDRH1 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 9 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 9 en una única sustitución de aminoácidos;
(b) la CDRH2 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 11 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 11 en una única sustitución de aminoácidos;
(c) la CDRH3 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 13 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 13 en una única sustitución de aminoácidos;
(d) la CDRL1 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 3 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 3 en una única sustitución de aminoácidos;
(e) la CDRL2 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 5 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 5 en una única sustitución de aminoácidos; y
(f) la CDRL3 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 7 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 7 en una única sustitución de aminoácidos;
(iii) comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 29; o
(iv) comprende una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 27.
Además, en el presente documento se describe un segundo anticuerpo monoclonal que compite con un anticuerpo que:
(i) se une a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2;
(ii) comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR) seleccionada del grupo que consiste en:
(a) la CDRH1 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 21 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 21 en una única sustitución de aminoácidos;
(b) la CDRH2 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 23 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 23 en una única sustitución de aminoácidos; y
(c) la CDRH3 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 25 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 25 en una única sustitución de aminoácidos;
(d) la CDRL1 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 15 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 15 en una única sustitución de aminoácidos;
(e) la CDRL2 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 17 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 17 en una única sustitución de aminoácidos; y
(f) la CDRL3 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 19 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 19 en una única sustitución de aminoácidos;
(iii) comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 33; o
(iv) comprende una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 31.
Preferentemente, el primer anticuerpo monoclonal es un anticuerpo que compite con un anticuerpo que comprende la CDRH1 de 12A7, la CDRH2 de 12A7, la CDRH3 de 12A7, la CDRL1 de 12A7, la CDRL2 de 12A7 y la CDRL3 de 12A7. Preferentemente, el segundo anticuerpo monoclonal es un anticuerpo que compite con un anticuerpo que comprende la CDRH1 de 4B4, la CDRH2 de 4B4, la CDRH3 de 4B4, la CDRL1 de 4B4, la CDRL2 de 4B4 y la CDRL3 de 4B4. Más preferentemente, el primer anticuerpo monoclonal es un anticuerpo que compite con un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia idéntica a la SEQ ID NO: 29 y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia idéntica a la SEQ ID NO: 27. Más preferentemente, el segundo anticuerpo monoclonal es un anticuerpo que compite con un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia idéntica a la SEQ ID NO: 33 y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia idéntica a la SEQ ID NO: 31.
Está dentro de las competencias de los expertos en la materia determinar si un anticuerpo compite con otro anticuerpo utilizado en la invención.
Por ejemplo, se puede realizar un ensayo de ELISA inmovilizando el anticuerpo de referencia, tal como un anticuerpo 4B4 o 12A7, en una placa ELISA. Después, la placa se bloquea con un agente bloqueante adecuado. Se añade un exceso de un segundo anticuerpo (el segundo anticuerpo es el anticuerpo cuya capacidad de competir con el anticuerpo 4B4 o 12A7 debe evaluarse, por ejemplo, un primer anticuerpo monoclonal o un segundo anticuerpo monoclonal que compite con el 4B4 o el 12A7). Se añade Mcm5. Después de un período de incubación adecuado, la placa ELISA se lava y se añade un agente de detección de Mcm5 para medir la cantidad de Mcm5 unida al anticuerpo de referencia inmovilizado. Si esta prueba se va a utilizar para detectar si un anticuerpo compite con 4B4, un reactivo de detección adecuado es un anticuerpo 12A7 marcado. De forma similar, si esta prueba se va a utilizar para detectar si un anticuerpo compite con 12A7, un reactivo de detección adecuado es un anticuerpo 4B4 marcado. La concentración a la que se produce el 50 % de inhibición se conoce como Ki. Un anticuerpo que compite con 12A7 o 4B4 puede unirse con una Ki 2 veces, 5 veces, 10 veces, 50 veces o 100 veces más baja que un anticuerpo que no se une a Mcm5.
Un anticuerpo que compite con un anticuerpo en particular puede unirse al mismo epítopo que ese anticuerpo en particular (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2). Es posible determinar a qué epítopo se une un anticuerpo realizando un experimento en que la proteína diana, tal como Mcm5, se digiere para dar fragmentos (por ejemplo, ver el Ejemplo 3 a continuación). Después puede determinarse la afinidad con la que los anticuerpos 12A7 y 4B4 se unen a cada uno de los fragmentos. Una vez que se ha determinado el fragmento (que representa el epítopo) al que el primer anticuerpo se une con una afinidad razonable, el epítopo puede sintetizarse. Después, es posible determinar si un segundo anticuerpo tiene la capacidad de unirse al mismo epítopo midiendo la afinidad de unión de ese segundo anticuerpo al fragmento.
Producción de anticuerpos
El primer anticuerpo monoclonal o el segundo anticuerpo monoclonal pueden producirse a partir de un polinucleótido que lo codifique y sea capaz de expresarlo. Cuando el anticuerpo comprende dos o más cadenas, un polinucleótido puede codificar una cadena ligera de anticuerpo y una cadena pesada de anticuerpo, o ambas. Se pueden proporcionar dos polinucleótidos, uno de los cuales codifica una cadena ligera de anticuerpo y el otro codifica la cadena pesada de anticuerpo correspondiente. Dicho polinucleótido o pareja de polinucleótidos puede expresarse conjuntamente de forma que se genera un anticuerpo utilizado en la invención. El polinucleótido puede ser parte de un vector que normalmente comprende además secuencias de control unidas operativamente a la secuencia insertada, permitiendo así la expresión del anticuerpo utilizado en la invención in vivo. Preferentemente, el vector comprende además iniciadores, promotores, potenciadores y otros elementos apropiados que pueden ser necesarios y que están colocados en la orientación correcta, para permitir la expresión de un polipéptido.
Los polinucleótidos pueden sintetizarse de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica, como se describe a modo de ejemplo en Sambrook et al (1989, Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press).
Los polinucleótidos o vectores pueden expresarse en una célula hospedadora. Dichas células hospedadoras pueden ser células eucariotas o células procariotas. Por ejemplo, las células hospedadoras pueden ser células de mamífero,
células de insecto o células bacterianas. Los ejemplos particulares de células hospedadoras que pueden modificarse mediante la inserción de vectores o ácidos nucleicos incluyen a las células de mamífero HEK293T, CHO, HeLa, NS0 y COS. Como alternativa, pueden usarse células bacterianas tales como E. coli.
Dichas células hospedadoras pueden cultivarse utilizando los métodos de rutina para producir un anticuerpo utilizado en la invención.
El primer anticuerpo monoclonal o el segundo anticuerpo monoclonal también pueden producirse a partir de un hibridoma. Está dentro de las competencias del experto en la materia desarrollar un hibridoma que exprese un anticuerpo utilizado en la invención. Esto se puede realizar inmunizando a un mamífero, tal como un ratón, conejo o cobaya, con un antígeno (por ejemplo, Mcm5). Puede ser beneficioso incluir un adyuvante, tal como el adyuvante completo de Freund. Se extraen las células del bazo del mamífero inmunizado y se fusionan con células de mieloma para formar líneas de hibridoma que sean inmortales en las condiciones adecuadas y que secretan anticuerpos. Los hibridomas se separan en clones individuales y los anticuerpos secretados por cada clon se evalúan en cuanto a su capacidad de unión a la proteína Mcm5.
El primer anticuerpo monoclonal o el segundo anticuerpo monoclonal pueden producirse utilizando cualquier método. En una realización, los anticuerpos se producen directamente a partir de una línea celular de hibridoma. En una realización adicional de la invención, los anticuerpos se producen de forma recombinante.
Para producir un anticuerpo a partir de una línea celular de hibridoma, la línea celular puede cultivarse in vitro, por ejemplo, en un recipiente tal como un matraz de cultivo celular o un fermentador, y el anticuerpo se puede aislar del recipiente usando técnicas convencionales conocidas en la técnica. Para los fines de la presente invención, se considerará que un anticuerpo se ha "producido mediante una línea celular de hibridoma" si el anticuerpo se obtiene de un anticuerpo que se produjo mediante la línea celular de hibridoma. Por ejemplo, está dentro de las competencias del experto en la materia obtener un anticuerpo de una línea celular de hibridoma, secuenciar la secuencia de aminoácidos del anticuerpo, y transfectar células tales como células CHO o células de E. coli con vectores que codifican la secuencia de aminoácidos del anticuerpo. Puede considerarse que tales anticuerpos se han "obtenido" a partir de un anticuerpo que se produjo mediante la línea celular de hibridoma. En una realización particular, los anticuerpos utilizados en la invención se producen directamente a partir de la propia línea celular de hibridoma.
Como alternativa, los anticuerpos utilizados en la invención pueden producirse mediante técnicas recombinantes. La secuencia de un anticuerpo utilizado en la invención puede utilizarse para transfectar una línea celular hospedadora de la invención. Las líneas celulares pueden cultivarse en un matraz o un fermentador, y el anticuerpo expresado por las células puede aislarse y purificarse usando técnicas convencionales (tales como cromatografía de afinidad).
Una vez purificados, los anticuerpos pueden conjugarse entonces con un radiomarcador o inmovilizarse en un soporte sólido. Un ejemplo de un soporte sólido adecuado es una placa de ELISA.
Exposición de la muestra al primer anticuerpo monoclonal y/o al segundo anticuerpo monoclonal y medición de la cantidad de Mcm5 que se une al primer anticuerpo monoclonal y/o al segundo anticuerpo monoclonal
El método de la invención comprende exponer la muestra al primer anticuerpo monoclonal y/o al segundo anticuerpo monoclonal y la medición de la cantidad de Mcm5 que se une al primer anticuerpo monoclonal y/o al segundo anticuerpo monoclonal. Esta etapa puede llevarse a cabo utilizando un ensayo tal como un ensayo tipo sándwich. Esta etapa puede llevarse a cabo utilizando un ensayo de ELISA. De acuerdo con el método de la invención, esta etapa se lleva a cabo utilizando un ensayo de ELISA tipo sándwich. Esta etapa no comprende un ensayo inmunofluorométrico.
Por ejemplo, esta etapa puede comprender etapas de captura de la Mcm5 utilizando un "anticuerpo de captura" ya unido a la placa, y detectando cuánto antígeno se ha capturado utilizando un "anticuerpo de detección". El anticuerpo de detección se ha preconjugado a un marcador tal como la enzima HRP (peroxidasa de rábano picante). Después, la placa de ELISA con el anticuerpo de detección marcado se lava para eliminar cualquier exceso de anticuerpo de detección no unido. Después, la placa lavada se expone a un agente cuyas propiedades son cambiadas por la etiqueta de manera medible. La concentración del anticuerpo de detección puede entonces determinarse. Por ejemplo, si el anticuerpo de detección está conjugado con (marcado con) peroxidasa de rábano picante, la placa de ELISA puede exponerse al sustrato TMB. La concentración del anticuerpo de detección y, por lo tanto, la concentración de Mcm5 en la muestra original, puede determinarse entonces cuantificando el cambio de color correspondiente a la conversión del TMB en un producto coloreado. En tal ensayo, el primer anticuerpo monoclonal puede ser el anticuerpo de captura y el segundo anticuerpo monoclonal puede ser el anticuerpo de detección. Como alternativa, el primer anticuerpo monoclonal puede ser el anticuerpo de detección y el segundo anticuerpo monoclonal puede ser el anticuerpo de captura.
Anticuerpos de detección
El método de la invención puede comprender exponer Mcm5 a un anticuerpo de detección. Además, en kits de la invención, el primer anticuerpo monoclonal o el segundo anticuerpo monoclonal pueden ser un anticuerpo de
detección. El anticuerpo de detección puede conjugarse con cualquier marcador adecuado (por ejemplo, Europio3+ o peroxidasa de rábano picante). El marcador puede estar unido directamente o puede estar unido a través de un enlazador (tal como ácido adípico dihidrazida (ADH, forma siglada de adipic acid dihydrazide)).
El marcador se puede unir por conjugación química. Se conocen en la técnica métodos de conjugación de marcadores con anticuerpos. Por ejemplo, la conjugación de carbodiimida (Bauminger y Wilchek (1980) Methods Enzymol. 70, 151-159) se pueden usar para conjugar marcadores a anticuerpos. Además, se pueden usar otros métodos para conjugar un marcador con un anticuerpo. Por ejemplo, se puede usar la oxidación con peryodato de sodio seguida de alquilación reductora de reactivos apropiados, al igual que la reticulación con glutaraldehído. Sin embargo, se reconoce que, independientemente de qué método de producción de un conjugado utilizado en la invención se seleccione, debe hacerse una determinación de que el anticuerpo de detección conjugado mantiene su capacidad de direccionamiento y de que el marcador conjugado mantiene su función.
En una realización preferente, el anticuerpo de detección está marcado mediante conjugación con peroxidasa de rábano picante.
Kits
En el presente documento se describe un kit que comprende un tampón de lisis que es capaz de liberar Mcm5 de las células en una muestra de orina, un primer anticuerpo monoclonal y un segundo anticuerpo monoclonal en donde el primer anticuerpo monoclonal es un anticuerpo que:
(i) se une a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1;
(ii) comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR) seleccionada del grupo que consiste en:
(a) la CDRH1 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 9 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 9 en una única sustitución de aminoácidos;
(b) la CDRH2 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 11 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 11 en una única sustitución de aminoácidos;
(c) la CDRH3 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 13 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 13 en una única sustitución de aminoácidos;
(d) la CDRL1 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 3 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 3 en una única sustitución de aminoácidos;
(e) la CDRL2 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 5 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 5 en una única sustitución de aminoácidos; y
(f) la CDRL3 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 7 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 7 en una única sustitución de aminoácidos;
(iii) comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 29;
(iv) comprende una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 27; o
(v) compite con el anticuerpo de (i), (ii), (iii) o (iv);
y el segundo anticuerpo monoclonal es un anticuerpo que:
(i) se une a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2;
(ii) comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR) seleccionada del grupo que consiste en:
(a) la CDRH1 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 21 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 21 en una única sustitución de aminoácidos;
(b) la CDRH2 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 23 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 23 en una única sustitución de aminoácidos; y
(c) la CDRH3 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 25 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 25 en una única sustitución de aminoácidos;
(d) la CDRL1 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 15 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 15 en una única sustitución de aminoácidos;
(e) la CDRL2 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 17 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 17 en una única sustitución de aminoácidos; y
(f) la CDRL3 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 19 o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 19 en una única sustitución de aminoácidos;
(iii) comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 33;
(iv) comprende una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 31; o
(v) compite con el anticuerpo de (i), (ii), (iii) o (iv).
De manera adecuada, un kit de la invención es adecuado para realizar el método de la invención.
En algunas realizaciones, el primer anticuerpo monoclonal y/o el segundo anticuerpo monoclonal están presentes en el kit como parte de una composición. En algunas realizaciones, el kit comprende un vial u otro recipiente adecuado que contiene una composición que comprende el primer anticuerpo monoclonal (que está opcionalmente conjugado con un marcador) y que comprende opcionalmente componentes adicionales. En algunas realizaciones, el kit comprende un vial u otro recipiente adecuado que contiene una composición que comprende el segundo anticuerpo monoclonal (que está opcionalmente conjugado con un marcador) y que comprende opcionalmente componentes adicionales. Dichas composiciones pueden comprender adicionalmente agentes estabilizadores adecuados que tengan la capacidad de estabilizar el anticuerpo en solución. Por ejemplo, la composición puede comprender un tampón seleccionado del grupo que consiste en TAPS (ácido 3-{[tris(hidroximetil)metil]amino} propanosulfónico), Bicina (N,N-bis(2-hidroxietil)glicina), Tris (tris(hidroximetil)metilamina), Tricina (N-tris(hidroximetil(metilglicina), TAPSO (3-[ácido N-Tris(ácido hidroximetil)metilamino]-2-hidroxipropanosulfónico), HEPES (ácido 4-2-hidroxietil-1-piperazinetanosulfónico), solución salina tamponada con fosfato y MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico. En una realización preferente, la composición comprende solución salina tamponada con fosfato con pH 7,6. En una realización preferente adicional, la composición comprende solución salina tamponada con fosfato con azida de sodio entre el 0,01 % y el 0,09 %. Preferentemente, la composición comprende agentes adecuados para almacenar los anticuerpos utilizados en la invención a temperatura ambiente o a una temperatura inferior o igual a 15 °C, 10 °C, 7 °C, 5 °C, 0 °C, -10 °C o -25 °C. En una realización preferente, la composición comprende agentes adecuados para almacenar los anticuerpos utilizados en la invención a una temperatura de entre 2 °C y 8 °C. En una realización adicional, la composición comprende un agente estabilizador tal como un azúcar, por ejemplo lactosa o trehalosa.
En algunas realizaciones, el primer anticuerpo monoclonal y/o el segundo anticuerpo monoclonal presente en el kit es un "anticuerpo de detección". Si el anticuerpo utilizado en la invención está conjugado, por ejemplo, a un marcador de Europio, es ventajoso incluir en la composición un estabilizador de BSA purificada al 7,5 %.
En algunas realizaciones, el primer anticuerpo monoclonal y/o el segundo anticuerpo monoclonal están presentes en el kit unidos a un soporte sólido tal como una placa ELISA. En tales realizaciones, un anticuerpo unido a un soporte sólido puede denominarse "anticuerpo de captura".
En una realización, el kit comprende un calibrador. El "calibrador' es una preparación de una o más concentraciones conocidas de Mcm5.
En una realización, el kit comprende un reactivo de sustrato. Se puede utilizar un reactivo de sustrato para detectar el anticuerpo de detección. Por ejemplo, cuando un "anticuerpo de detección" está conjugado con peroxidasa de rábano picante, el reactivo de sustrato puede comprender TMB (3, 3', 5,5'-tetrametilbencidina), DAB (3,3'-diaminobencidina) o ABTS (ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico). En una realización preferente, el reactivo de sustrato comprende TMB. En una realización más preferente, el reactivo de sustrato es peróxido y TMB.
En una realización, el kit comprende además una solución de lavado y/o una solución de parada. El kit de la presente invención es adecuado para realizar un ELISA tipo sándwich.
Comparación de la concentración de Mcm5 determinada en la etapa (b) con valores de referencia
El método de la invención comprende además una etapa de comparación de la concentración de Mcm5 determinada con valores de referencia. Un kit de la invención puede comprender un patrón de referencia. Patrón de referencia normalmente se refiere a una muestra de un individuo sano, es decir, uno que no ha padecido un cáncer urológico.
El patrón de referencia puede ser una muestra real analizada en paralelo. Como alternativa, el patrón de referencia puede ser uno o más valores obtenidos previamente de una muestra comparativa, por ejemplo, una muestra de un sujeto sano (por ejemplo, un sujeto del que se sabe que no padece un cáncer urológico). En tales realizaciones, se puede hacer una mera comparación numérica comparando el valor determinado para la muestra del sujeto con el valor numérico de una muestra de referencia analizada previamente. La ventaja de esto es no tener que duplicar el análisis al determinar las concentraciones en muestras de referencia individuales en paralelo cada vez que se analiza una muestra de un sujeto.
De manera adecuada, el patrón de referencia coincide con el sujeto analizada, por ejemplo, en género, por ejemplo, en edad, por ejemplo, en origen étnico u otros criterios de este tipo que son bien conocidos en la técnica. El patrón de referencia puede ser un número tal como una concentración absoluta determinada por uno o más estudios anteriores.
Los patrones de referencia pueden coincidir de manera adecuada a subgrupos específicos de pacientes, por ejemplo, ancianos, o los que tienen antecedentes importantes anteriores, tales como una predisposición al cáncer urológico.
De manera adecuada, el patrón de referencia coincide con el tipo de muestra analizada. Por ejemplo, la concentración del polipéptido biomarcador (o polipéptidos biomarcadores) analizado puede variar del tipo o la naturaleza de la muestra (por ejemplo, muestra de orina convencional frente a una muestra del primer chorro después de un masaje prostético). Será inmediatamente obvio para el experto en la materia que el valor de concentración (o valores de concentración) para el patrón de referencia deben ser para la misma muestra o una muestra comparable a la analizada en el método (o métodos) de la invención. Por ejemplo, si la muestra sometida a ensayo es orina del primer chorro, entonces el valor del patrón de referencia debe ser para la orina del primer chorro, para garantizar que se pueda realizar una comparación cruzada significativa. En particular, se debe tener extremo cuidado si se intentan inferencias por la comparación entre las concentraciones determinadas para un sujeto de interés y las concentraciones determinadas para los patrones de referencia, donde la naturaleza de la muestra no es idéntica entre las dos. De manera adecuada, el tipo de muestra para el patrón de referencia y el tipo de muestra para el sujeto de interés son los mismos.
Cabe señalar que, para algunas realizaciones de la invención, las concentraciones de proteína determinadas pueden compararse con una muestra anterior del mismo sujeto. Esto puede ser beneficioso para controlar la posibilidad de recaída en un sujeto. Esto puede ser beneficioso para controlar el curso y/o eficacia de un tratamiento de un sujeto. En esta realización, el método puede comprender una etapa (o etapas) adicional de comparación del valor (o valores) determinado para la muestra de interés con uno o más valores determinados para el mismo biomarcador (o biomarcadores) de distintas muestras, tales como muestras tomadas en distintos puntos de tiempo para el mismo sujeto. Al hacer tal comparación, se puede recopilar información sobre si un marcador en particular está aumentando o disminuyendo en un sujeto en particular. Esta información puede ser útil para diagnosticar o predecir cambios a lo largo del tiempo, o los cambios inhibidos o estimulados por un tratamiento particular o un régimen de terapia, o cualquier otra variable de interés.
De esta manera, los métodos se pueden utilizar para determinar si, por ejemplo, después del tratamiento del paciente con un fármaco o fármaco candidato, o mediante resección de un tumor, la enfermedad ha progresado o no, o que la tasa de progresión de la enfermedad se ha modificado. El resultado puede informar sobre el curso del tratamiento adicional.
En algunas realizaciones, un valor anómalo (por ejemplo, un valor que es estadísticamente distinto al valor de referencia) indica una probabilidad aumentada de un cáncer urológico en el sujeto. Preferentemente, al paciente se le diagnostica como que tiene un cáncer urológico cuando la concentración de la Mcm5 determinada en la etapa (b) es mayor que el valor medio de pacientes sanos más un múltiplo de la desviación típica mostrada por los valores obtenidos de sujetos sanos.
Cánceres urológicos
La invención también proporciona métodos para la detección de un cáncer urológico. Dichos métodos ofrecen una ventaja significativa ya que detectarán cualquier tumor que esté en contacto íntimo con el flujo o la orina en el aparato urinario (es decir, riñones, uréteres, vejiga y uretra) del paciente que se analiza.
El cáncer urológico incluye todos los tipos de carcinoma de células de transición que pueden surgir en el aparato urinario. Un ejemplo de carcinoma de células de transición es el cáncer de vejiga. Sin embargo, las células de transición están presentes en todo el aparato urinario, incluido el revestimiento de la pelvis renal, los uréteres que conducen la orina desde los riñones hasta la vejiga y la uretra, así como la pared de la vejiga misma. El carcinoma de células de transición puede surgir en cualquiera de estos lugares.
Cabe señalar que existe una variedad de distintos subtipos de cáncer de vejiga, es decir, hay otros tipos de cáncer de vejiga además del carcinoma de células de transición, aunque este (carcinoma de células de transición) es el tipo más común de cáncer de vejiga.
Una ventaja de los métodos de la invención es que también se pueden detectar otros cánceres primarios tales como el cáncer de pene, por ejemplo, si afectan al tracto uretral a medida que pasa a través del pene.
Además, determinados tumores urológicos pueden detectarse aunque no estén en contacto directo con el flujo de orina. Un ejemplo es un tumor de próstata que normalmente no está en contacto con el flujo de orina, pero del que se desprenden y exudan células hacia la uretra.
Los métodos de la invención también ofrecen la ventaja de ser capaces de detectar cánceres metastásicos, por ejemplo, metástasis de un cáncer primario distinto cuya metástasis se ha establecido en el aparato urinario. En esta realización, los métodos de la invención son capaces de detectar cualquier cáncer que haya crecido en el aparato urinario (por ejemplo, un cáncer de colon que puede haber invadido localmente) o cualquier cáncer que haya invadido a través de una metástasis (por ejemplo, un cáncer primario distante, que ha dado lugar a uno o más tumores metastásicos dentro del aparato urinario del sujeto).
En una realización, los métodos de la invención también pueden aplicarse ventajosamente a la detección del cáncer de próstata. En una realización, la invención se aplica ventajosamente a la detección del cáncer de vejiga. En una realización, la invención se aplica a la detección del cáncer de próstata y de vejiga.
Homología/identidad de secuencia
Aunque la homología de secuencia también puede considerarse en términos de similitud funcional (es decir, restos de aminoácido que tienen propiedades/funciones químicas similares), en el contexto del presente documento, se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencia. Las comparaciones de secuencias se pueden realizar a simple vista o, más habitualmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas informáticos disponibles pública y comercialmente pueden calcular el porcentaje de homología (tal como el porcentaje de identidad) entre dos o más secuencias.
El porcentaje de identidad se puede calcular sobre secuencias contiguas, es decir, una secuencia se alinea con la otra secuencia y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente con el correspondiente aminoácido en la otra secuencia, un resto cada vez. Esto se llama un alineamiento "sin huecos". Normalmente, tales alineamientos sin huecos se realizan solo en un número relativamente corto de restos (por ejemplo, menos de 50 aminoácidos contiguos). Para comparar sobre secuencias más largas, la puntuación de huecos se utiliza para producir un alineamiento óptimo para reflejar con precisión los niveles de identidad en secuencias relacionadas que tienen una inserción (o inserciones) o una eliminación (o eliminaciones) una con respecto a la otra. Un programa informático adecuado para llevar a cabo tal alineamiento es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, EE. UU.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Los ejemplos de otros programas informáticos que pueden realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero sin limitación, el paquete BLAST, FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410) y el paquete de herramientas de comparación GENEWORKS.
En el contexto del presente documento, se considera que una secuencia de aminoácidos homóloga incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos el 40, 50, 60, 70, 80 o 90 % idéntica. De forma muy adecuada, un polipéptido que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con el biomarcador de interés se tomará como indicativo de la presencia de ese biomarcador; de manera más adecuada, se tomará que un polipéptido que es el 95 % o de forma más adecuada el 98 % idéntico al nivel de aminoácidos indica la presencia de ese biomarcador. De manera adecuada, dicha comparación se realiza sobre al menos la longitud del polipéptido o fragmento que se está sometiendo a ensayo para determinar la presencia o ausencia del biomarcador de interés. De forma muy adecuada, la comparación se realiza a lo largo de la longitud completa del polipéptido de interés.
Definiciones
El término "comprende" significa "incluye". Por lo tanto, la palabra "comprende" y las variaciones tales como "comprenden" y "que comprende" se entenderá que implican la inclusión de un compuesto o composición o etapa establecido, o un grupo de compuestos o etapas, pero no la exclusión de algún otro compuesto, composición, etapas o grupos de los mismos.
Debe entenderse también que el término "consiste en" tiene su significado normal en la técnica, es decir, que se incluye la característica o grupo de características indicadas, con exclusión de otras características. Por ejemplo, un tampón de lisis que consiste en un detergente contiene detergente y no otros componentes. Por otro lado, un tampón de lisis que comprende un detergente que consiste en polisorbato 80 puede comprender componentes distintos de detergentes, pero el único detergente en el tampón de lisis es polisorbato 80.
Tabla 1: Secuencias
continuación
Ejemplos
Clonación de Mcm5
Estadio I: Estrategia de clonación
1. Se obtuvo un clon verificado por IMAGE que contenía el ADNc de MCM5 humano y que se usó como molde de PCR para amplificar un fragmento de ADN de 648 pb. El cebador de PCR directo codificaba el codón de iniciación, así como una etiqueta de polihistidina sin patentar modificada (HQ)4.
2. El fragmento de PCR se clonó en el vector de expresión inducible de E. coli pTRC99a, utilizando una estrategia
de doble sitio de restricción. Este vector permite la expresión inducible dirigida por el promotor híbrido trp/lac "trc". Cadena abajo hay un sitio de unión al ribosoma (SUR) de lacZ que está situado a una distancia optimizada de un codón de iniciación ATG, que se suministra mediante el sitio de clonación NcoI.
Estadio IIA: Expresión y purificación (a pequeña escala -10 ml)
3. El plásmido recombinante que contenía el fragmento Mcm5 se transformó en E. coli BL21 (no ADE3 para garantizar altos rendimientos de proteína expresada.
4. Se indujeron varios cultivos de E. coli de pequeño volumen con IPTG. Las células se lisarán en tampón de carga de SDS y la proteína total se separará por SDS-PAGE. Los clones de alta expresión se identificarán mediante transferencia de Western usando un anticuerpo monoclonal de ratón suministrado por Urosens. Estadio IIB: Expresión y purificación (a gran escala - 500 ml)
5. El clon identificado con altos niveles de proteína recombinante se cultivó en la escala de 0,5 l y se indujo con IPTG. Las células se sedimentaron y almacenaron a -70 °C. Las células se rompieron en un tampón de lisis desnaturalizante descrito por Stoeber et al. J Natl Cancer Inst 2002941071-9.
6. La proteína recombinante etiquetada con His se purificó por afinidad en condiciones desnaturalizantes en una columna de cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC). La proteína se eluyó usando un tampón ácido y se dializó frente a tampón de conservación (PBS que contenía SDS 0,3)
7. La proteína eluida se analizó y se cuantificó mediante SDS-PAGE y transferencia de western usando un anticuerpo monoclonal de ratón suministrado por Urosens.
Ejemplo 1 - ELISA de exploración de Acm
Los Acm purificados por Proteína A se obtuvieron del Institute for Cancer and Developmental Biology Welcome/CRUK. Estos anticuerpos se analizaron en cuanto a su capacidad para unirse a Mcm5.
Se realizó un ELISA de Mcm5 recombinante etiquetada con 6 His usando pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos recubierta con His-Sorb Ni-NTA (Qiagen). Las placas recubiertas con Ni-NTA, prebloqueadas con BSA, garantizan una presentación orientada de la Mcm etiquetada con 6 His a través de la unión de afinidad del níquel al espaciador, en comparación con la presentación aleatoria de la Mcm5 en el pocillo que se lograría mediante el recubrimiento por adsorción pasiva de la placa. La Mcm5, a una concentración de 625 ng/ml, se inmovilizó por afinidad con níquel en la superficie de Ni-NTA His-Sorb (Qiagen) de una placa de 96 pocillos, a 200 pl/pocillo, dando como resultado 125 ng de hsMcm5/pocillo. Esto se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante para aplicar una proteína o péptido etiquetado con 6 His a los pocillos de la placa, con un título >100 ng/pocillo. Esto se hizo para garantizar que la proteína o péptido no sea limitante para la detección del Ac. El análisis de los Acm para el desarrollo de un IFMA (sigla de immunofluorometric assay, ensayo inmunofluorométrico) para Mcm5 se realizó con un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de Mcm5. Para analizar los Acm, los sobrenadantes de los cultivos de hibridoma que expresaban los Acm se incubaron en los pocillos de microtitulación a TA durante 3 h y después se retiraron con una lavadora automática de placas de 96 pocillos. Los complejos de Ag Mcm5-Ac de los Acm se detectaron mediante un ELISA colorimétrico que usaba IgG de cabra anti ratón conjugada con HRP, reactivo TMB y solución de parada de ensayo de H2SO4 1 M, para la medición de la absorbancia de luz a 450 nanómetros (Abs a 450 nm). Se excluyó la ausencia de unión no específica (UNE) del anti ratón de cabra conjugado con HRP a la superficie de Ni-NTA His-Sorb y Mcm5 realizando el ELISA en pocillos sin los Acm. El grado de UNE a los pocillos de poliestireno recubiertos con Ni-NTA de los Acm de ratón analizados se estableció realizando el ELISA en pocillos con la omisión de pocillos de Mcm5, en paralelo a la realización del ELISA en pocillos con la inmovilización a los pocillos de microtitulación por afinidad con Níquel de Mcm5.
El rendimiento en el ELISA colorimétrico de un Acm de ratón en las muestras de medios tomadas de los hibridomas (Tabla 2) se usó para la selección de los clones destacados, 12A7 y 4B4. Los hibridomas de los Acm seleccionados se cultivaron para producir IgG para la purificación a partir del sobrenadante de cultivo, usando separación por proteína A en fase sólida, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham Pharmacia Biotech Little Chalfont Buckinghamshire, RU). El Acm 12A7 dio lugar a la mayor respuesta frente a la Mcm5.
Tabla 2: resultados de Abs a 450-650 del ELISA de análisis de Acm de hibridomas
Afinidades relativas de los Acm
Las afinidades relativas de los Acm purificados por proteína A se determinaron mediante la normalización de las concentraciones de Ac y la aplicación de los Acm al ensayo de análisis colorimétrico en condiciones limitantes de Ag. Las condiciones limitantes de Ag se determinaron mediante titulación de la Mcm5 en los pocillos de la placa de microtitulación His-Sorb de Ni-NTA. Una Abs a 450 nm máximo observado de <3,000 es indicativa de condiciones limitantes de Ag, debido a que la lectura máxima de Abs a 450 que se puede obtener cuando el Ag no es limitante es 4,000. La titulación del Ag se realizó usando Acp (anticuerpo policlonal) de conejo frente a Mcm5 (101) y cabra anti conejo HRP para medir la respuesta de ELISA. Una concentración que proporcionó 25 ng de Mcm5 disponible para la unión a cada pocillo de Ni-NTA estaba limitando la respuesta de Abs a 450 del ELISA del Acp. El Acp de conejo se escogió para determinar las condiciones limitantes de Ag para la investigación de los Acm de ratón, dado que el Acp se une a la serie completa de epítopos de Mcm5. Esto garantizó que los Acm pudieran investigarse en estudios de incubación combinados para determinar el grado de competencia epitópica.
La concentración de IgG en las soluciones de Acm purificadas por proteína A se determinó por medición en un espectrofotómetro de la Abs a 280 nm y las concentraciones de Acm se normalizaron mediante dilución en PBS. Después, se determinó el 50 % de la concentración de unión máxima mediante una dilución lineal de los Acm aplicada a un ELISA de pocillos con Mcm5 con afinidad al níquel en condiciones limitantes de Ag Mcm5. Para demostrar la meseta de la señal de unión a 25 ng/pocillo/hsMcm5rf en la placa, el Acm 7A3 se procesó en el ELISA a un mayor intervalo de concentración. El 50 % de respuesta de unión máxima para 12A7 se obtuvo a una concentración de 20 ng/pocillo. 12A7 se muestra por su 50 % de concentración de unión máxima para demostrar la mayor afinidad relativa a hsMcm5. (Tabla 3).
Tabla 3: Titulaciones de Acm contra antí eno limitante 25 n / ocillo aco lado a Ni-NTA
Ejemplo 2 - Competición de los anticuerpos por los epítopos
Para un ensayo inmunométrico de dos sitios, se precisan dos Acm que estén dirigidos a epítopos distintos. En condiciones limitantes de Ag, un pareja de Acm que compiten por el mismo epítopo proporcionarán una medición de Abs a 450 nm en ELISA igual a la señal de Abs a 450 nm del Ac de afinidad relativa más alta, cuando se incuba en ausencia del Acm competidor, sin embargo, la incubación de una pareja de Acm dirigidos a epítopos distintos proporcionará una medición de Abs a 450 igual a la suma de las respuestas de Abs a 450 nm individuales de los Acm al Ag limitado disponible, siempre que haya una ausencia de impedimento estérico. Los Acm 12A7 y 4B4 se normalizaron con respecto al 50 % de la concentración de unión máxima de 20 ng/pocillo del Acm 12A7 de mayor afinidad relativa. Los Acm a la concentración normalizada se sometieron a un ELISA usando incubaciones de Ab individuales y emparejados en la placa de Ni-NTA de Ag Mcm5 limitante 25 ng/pocillo. La señal más alta de Abs a 450 nm medida a partir de una incubación combinada de una pareja de Acm sería indicativa de los Acm más adecuados para su uso en una IFMA de dos sitios.
Resultados de la competición de los anticuerpos por los epítopos
Los resultados del estudio de ELISA de competición de los Ac por epítopos del Ag (Tabla 4) muestran que el Acm 4B4 está dirigido a un epítopo distinto, lo que es compatible para la unión a dos sitios con el 12A7. Se demuestra que el epítopo que es el objetivo 4B4 es distinto ya que la respuesta de Abs a 450 es igual a la suma de ambos Acm uniéndose al Ag limitante, cuando se incubó 4B4 en paralelo a los otros Acm.
T l 4: R l l i ELI A m i i n l A r í l A
Los Acm se incubaron a una concentración normalizada de 20 ng/pocillo, el 50 % de la concentración de unión máxima del Acm 12A7 con la mayor afinidad relativa. Los Acm óptimos para el desarrollo de un inmunoensayo de dos sitios se destacan en azul y sus respuestas de Abs a 450 en ELISA se destacan en amarillo.
Ejemplo 3 - Mapeo epitópico
Materiales usados:
La pretinción de una de las micromatrices de péptidos se realizó con el anticuerpo secundario anti IgG de ratón (H+L) de cabra DyLight680 a una dilución de 1:5000, para investigar las interacciones de fondo con los péptidos procedentes del antígeno que podrían interferir con los ensayos principales. La incubación posterior de las micromatrices de péptidos con los anticuerpos IgG monoclonales de ratón l2A7 y 4B4 a, concentraciones de 1 pg/ml y 10 pg/ml en tampón de incubación, se siguió de la tinción con el anticuerpo secundario y la lectura a una intensidad de barrido de 5 (rojo). Los péptidos de control HA y Flag que enmarcaban las matrices de péptidos se tiñeron finalmente como un control de calidad interno, para confirmar la calidad del ensayo y la integridad de la micromatriz de péptidos (intensidades de barrido rojo/verde: 5/7).
La cuantificación de las intensidades de los puntos y la anotación de los péptidos se realizaron con el analizador PepSlide®. Un algoritmo de programa informático descompone las intensidades de fluorescencia de cada punto para dar las señales sin procesar, la de primer plano y la de fondo, y calcula la desviación típica de las medianas de las intensidades de primer plano. Basándose en las medianas de las intensidades de primer plano promediadas, se generaron mapas de intensidad y se destacaron las interacciones en los mapas de péptidos mediante un código de intensidad de color, con rojo para alto y blanco para intensidades de punto bajas.
Los inventores representaron adicionalmente las intensidades de los puntos promediadas de todos los ensayos con las muestras de anticuerpos frente a la secuencia del antígeno desde el extremo N hasta el extremo C, para visualizar las intensidades globales de los puntos y las proporciones de la señal con respecto al ruido. Los gráficos de intensidad se correlacionaron con mapas de péptidos e intensidad, así como con la inspección visual de los barridos de las micromatrices, para identificar los péptidos y epítopos que fueron reconocidos por las muestras de anticuerpos. En caso de que no fuese claro si un determinado aminoácido contribuía a la unión del anticuerpo.
Después de 15 min de prehinchamiento en tampón de lavado y 30 min en tampón de bloqueo, una de las micromatrices de péptidos se incubó inicialmente con el anticuerpo secundario de cabra anti IgG de ratón (H+L) DyLight680 a una dilución de 1:5000 durante 30 min, a temperatura ambiente, para analizar las interacciones de fondo con los péptidos procedentes del antígeno. A una intensidad de escaneo de 5, los inventores no observaron ningún fondo debido a la unión no específica del anticuerpo secundario. La cuantificación de los datos con el analizador PepSlide® no fue posible ni necesaria, dado que la ausencia de un patrón de puntos obstaculizó la alineación de la rejilla de la micromatriz.
Las micromatrices peptídicas se incubaron con el anticuerpo monoclonal de ratón 12A7 a concentraciones de 1 pg/ml y 10 pg/ml (parte superior derecha). Después de cada incubación, la tinción con el anticuerpo secundario de cabra
anti IgG de ratón (H+L) DyLight680 se siguió de la lectura a una intensidad de barrido de 5. Los inventores observaron un patrón de puntos de tipo epítopo fuerte y bien definido, formado por una fila de péptidos adyacentes con un motivo consenso con excelentes proporciones de la señal con respecto al ruido.
La tinción final de los péptidos de control de HA y Flag que enmarcaban la micromatriz de péptidos dio lugar al patrón de puntos esperado y bien definido, y validó la integridad global de la micromatriz de péptidos.
La cuantificación de los datos se siguió de la generación de mapas de péptidos y de intensidad, así como de gráficos de intensidad para los ensayos con el anticuerpo monoclonal de ratón 12A7 a concentraciones de 1 pg/ml y 10 pg/ml; el gráfico de intensidad de este último se niveló para proporcionar una visión de conjunto más clara de los datos. Las señales se basaron en el patrón de puntos de tipo epítopo observado en el barrido de la micromatriz y se atribuyeron a péptidos con el motivo consenso WDETKGE.
Las micromatrices de péptidos se incubaron con el anticuerpo monoclonal de ratón 4B4 a concentraciones de 1 pg/ml) y 10 pg/ml. Después de cada incubación, la tinción con el anticuerpo secundario de cabra anti IgG de ratón (H+L) DyLight680 se siguió de la lectura a una intensidad de barrido de 5. Los inventores observaron dos patrones de puntos de tipo epítopo fuertes y bien definidos, formados por una fila de péptidos adyacentes con motivos consenso con excelentes proporciones de la señal con respecto al ruido. A una concentración de anticuerpo de 10 pg/ml, las intensidades sin procesar del patrón de puntos de tipo epítopo fueron similares, pero las interacciones de fondo aumentaron ligeramente indicando una saturación de señal del anticuerpo en el intervalo de concentración de 1 10 pg/ml. La tinción final de los péptidos de control de HA y Flag que enmarcaban la micromatriz de péptidos dio lugar al patrón de puntos esperado y bien definido, y validó la integridad global de la micromatriz de péptidos.
La cuantificación de los datos se siguió de la generación de mapas de péptidos y de intensidad, así como de gráficos de intensidad para los ensayos con el anticuerpo monoclonal de ratón 4B4 a concentraciones de 1 pg/ml y 10 pg/ml; el gráfico de intensidad de este último se niveló para proporcionar una visión de conjunto más clara de los datos. A una concentración de anticuerpo de 10 pg/ml, las intensidades sin procesar del patrón de puntos de tipo epítopo fueron similares, pero las interacciones de fondo aumentaron ligeramente, conduciendo intensidades de señal normalizadas reducidas. Las señales se basaron en los patrones de puntos de tipo epítopo observados en el barrido de la micromatriz y se atribuyeron a péptidos con los motivos consenso DDRVAIH y WDETKGE.
Ejemplo 4
Materiales
Se obtuvieron muestras de ensayo de orina de una única micción de pacientes que asistían a una consulta de hematuria en el Hospital Heatherwood (Heatherwood and Wexham Park Hospitals n Hs Foundation Trust), habiendo obtenido la aprobación ética del Comité de ética de investigación local. Se llevó a cabo un análisis de orina utilizando tiras reactivas Multistix 10 SG (Siemens) en muestras frescas y la orina restante se dispensó en tubos Falcon de 1 ml o de 15 ml, que se colocaron en hielo seco para el transporte al laboratorio.
Mcm5
Una realización de la invención es una prueba de ELISA simple para Mcm5, que reemplaza de manera útil la prueba especializada y compleja DELFIA® para Mcm5 (véase Stoeber et al 2002 (Journal of the National Cancer Institute, 94, 1071-1079; 2002), por lo que la prueba podría llevarse a cabo en un laboratorio de química clínica típico. La prueba es un inmunoensayo ligado a enzimas de tipo sándwich de doble anticuerpo monoclonal directo. Ambos anticuerpos tienen alta afinidad y especificidad por el antígeno Mcm5. Cualquier Mcm5 en la muestra bajo prueba es capturado por un anticuerpo monoclonal específico unido a la superficie de la placa de microtitulación. A continuación, se añade el anticuerpo detector, que se une a un sitio distinto en el antígeno y que está unido a la enzima peroxidasa de rábano picante (HRP). La presencia y la cantidad de HRP retenida en los pocillos de la placa se evalúa midiendo la intensidad del color que se desarrolla después de la adición de tetrametilbencidina (TMB), que es un sustrato cromogénico de la HRP. La densidad óptica es proporcional a la concentración de Mcm5 en la muestra, dentro de los límites definidos. Analizando un intervalo de concentraciones de Mcm5, puede generarse una curva de respuesta a la dosis a partir de la cual puede determinarse la concentración de antígeno de un desconocido (véanse las Figuras 2 y 3).
En el ensayo se utilizan dos anticuerpos monoclonales (los Acm), 12A7 y 4B4. Los anticuerpos se obtuvieron de Cancer Research Technology Ltd (c Rt ) en virtud de un acuerdo de licencia no exclusivo con el solicitante. Para pruebas de ELISA, se utilizó el mAb 12A7 para el recubrimiento de la placa y el Acm 4B4 para la detección.
Recogida y preparación de las muestras de ensayo: La prueba se puede realizar en orina humana. Las muestras deben recogerse en, por ejemplo, frascos de plástico de 150 ml con tapón de rosca, que deben estar limpios pero no necesariamente estériles. El frasco de recolección no debe contener ningún conservante e, idealmente, debe tener un volumen mayor que 100 ml. Las muestras pueden almacenarse hasta 4 horas a 2 - 8 °C antes de su uso. Para preparar las muestras de ensayo de orina para el ensayo, se transfieren 30 ml de la muestra a un tubo de centrífuga de plástico de 50 ml con tapón de rosca. Después de la centrifugación durante 5 min a 1.500 g, el sobrenadante se decanta
cuidadosamente y se trata como desecho de acuerdo con las directrices locales sobre salud y seguridad. Los tubos se colocan invertidos sobre papel absorbente y se deja que drene el exceso de líquido. Se añaden 250 j l de tampón de lisis/muestra al sedimento; el sedimento se resuspende utilizando una pipeta ajustable con punta desechable.
Reactivos: Los componentes de prueba se describen en la presente en forma de un kit (véase la Tabla 1). Cada kit contiene materiales suficientes para una sola microplaca de 96 pocillos, u 80 determinaciones en pocillos duplicados si se utiliza toda la placa.
Tabla 1:
Además de los componentes enumerados en la Tabla 1, los siguientes materiales adicionales son útiles y pueden proporcionarse opcionalmente en un kit de la invención. Estos materiales deben considerarse como divulgados por separado y, por lo tanto, pueden añadirse de forma individual al kit de la invención. Un pipeta (o pipetas) capaces de suministrar volúmenes de 50 j l y 100 j l con una precisión mejor que el 1,5 %; un dispensador (i dispensadores) para suministros repetitivos de volúmenes de 100 j l y 300 j l con una precisión mejor que el 1,5 %; un lavador de microplacas o una botella exprimible (opcional); un lector de microplacas con capacidades de absorbancia de longitud de onda de 450 nm y 620 nm, papel absorbente para secar los pocillos de la microplaca y envolturas de plástico o cubiertas de microplacas para las etapas de incubación más un temporizador.
Procedimiento de ensayo: Antes de proceder con el ensayo, todos los reactivos deben llevarse a temperatura ambiente (20 - 27 °C) durante 30 minutos. Los reactivos no utilizados se almacenan a 2-8 °C después del uso. Se retiran suficientes tiras de microplacas para cada muestra a analizar, incluyendo una serie de diluciones de calibradores y de muestras de control de calidad, a someter a ensayo por duplicado.
Se pipetean 100 j l del calibrador o muestra de ensayo apropiada en el pocillo asignado, lo que se incuba a temperatura ambiente (20 - 27 °C) durante treinta (30) minutos en un agitador rotativo de placas de microtitulación a 700 rpm. Los contenidos se descartan y los pocillos se lavan con seis cambios de 300 j l de tampón de lavado. A continuación, se añaden 100 j l del reactivo/conjugado de anticuerpo anti Mcm5 HRP a cada pocillo. Después de mezclar, los pocillos se incuban inmóviles durante 30 minutos a temperatura ambiente (20-27 °C). A continuación, los contenidos de la microplaca se descartan por decantación o aspiración. Si se decantan, se golpear y seca la placa con papel absorbente y a continuación se lavan los pocillos como se describe anteriormente. A continuación, se añaden 100 ul de reactivo de sustrato a todos los pocillos y se incuba a temperatura ambiente (20-27 °C) durante treinta 30 minutos. La reacción se detiene mediante la adición de 100 ul de solución de parada a cada pocillo. Se lee a 450 nm la absorbancia en cada pocillo (utilizando una longitud de onda de referencia de 620-630 nm para minimizar las imperfecciones del pocillo) en un lector de microplacas. Los resultados deben leerse dentro de los 30 minutos posteriores a la adición de la solución de parada.
Se proporcionan muestras de calibrador. Estas se preparan utilizando una dilución en serie en el momento del ensayo y se descartan después de su uso (véase la Figura 2).
Para interpretar los resultados, se utiliza una curva de respuesta a la dosis para determinar la concentración de Mcm5 en las muestras de ensayo desconocidas. Esto se puede construir manual o automáticamente utilizando un programa informático. Para el cálculo manual, se registra la absorbancia obtenida de la impresión del lector de microplacas. Se representa la absorbancia para cada dilución por duplicado frente a la concentración de Mcm5 correspondiente en ng/ml en papel para gráfico lineal y después se dibuja la curva de mejor ajuste a través de los puntos representados. Para determinar la concentración de Mcm5 para un desconocido, se sitúa la absorbancia promedio de los duplicados para cada desconocido en el eje vertical del gráfico, se encuentra el punto de intersección en la curva y se lee la concentración (en ng/ml) en el eje horizontal del gráfico.
La Tabla 2 ilustra los resultados de un experimento típico.
Tabla 2.
El procedimiento para Mcm5 tiene un límite de detección analítica de < 7 pg/ml.
Ejemplo 5 - Estudio clínico de Mcm5 en 116 sujetos investigados en cuanto a cáncer de vejiga.
Se obtuvieron muestras de ensayo de orina de 116 pacientes, la mayoría de los cuales se examinaron posteriormente por cistoscopia flexible y exploración por TAC o ecografía. Si se obtenían resultados anómalos, los pacientes derivaban para la realización de una biopsia. Cuando estuvieron disponible, los resultados de estas investigaciones se recopilaron y añadieron al conjunto de datos. Los niveles de Mcm5 se midieron en cada sujeto utilizando la técnica de ELISA descrita anteriormente (Ejemplo 4). Se confirmaron clínicamente ocho casos de cáncer de vejiga, de los cuales cinco se calificaron como positivos en el ensayo de Mcm5.
Tabla: En la tabla, "+" indica que el resultado del ensayo de Mcm5 superó la media de los negativos conocidos 3 DT (DO media negativa 0,05, Dt 0,0593). Por lo tanto, el punto de corte se estableció arbitrariamente en una DO de
023
Además, hubo cuatro casos en los que se produjo un resultado de ELISA positivo en ausencia de un diagnóstico
confirmado de malignidad: el Paciente 13 (se observaron lesiones papilares en la vejiga; el resultado de la biopsia no se registró. Próstata oclusiva); el Paciente 30 (ninguna otra patología registrada); el Paciente 65 (nefrectomía registrada); el Paciente 101 (próstata agrandada con calcificación). Se sabe que la presencia de cálculos puede provocar resultados positivos falsos debido al efecto abrasivo del material sobre la membrana basal de la epidermis, lo que conduce a la liberación de células MCM+, pero la tasa de tales casos es demasiado pequeña para afectar el presente ensayo.
Estadísticas del ensayo
Se calcularon las estadísticas convencionales del ensayo para los datos de ensayo de Mcm5. Aunque el verdadero criterio clínico no estaba disponible para todos los pacientes del estudio, el experto apreciará que este modesto panel ha arrojado resultados convincentes. En particular, el estudio ha proporcionado una estimación realista de especificidad del 96 % (104/108).
Ejemplo 6 - comparación de diversos tampones
Se lisaron en cada tampón cantidades conocidas de células de carcinoma urotelial T24, y los lisados se analizaron en ELISA para Mcm5. Los resultados demuestran una notable diferencia en la eficacia de lisis en este ensayo. El tampón que contiene SDS es típico de los descritos en la bibliografía, pero es significativamente menos eficaz que Cytobuster o 'Urosens TL' (desoxicolato de sodio al 0,08 %, CHAPS al 0,08 %, EDTA 2 mM, Trizma 150 mM pH 7,6). Los resultados se presentan en la Figura 3.
Ejemplo 7
La lisis de las células en CytoBuster se comparó con las células en tampón TBS Tritón (TBST) y tampón RIPA, con un control de sedimentos celulares reconstituidos en DMEM (medio de cultivo celular). Los resultados se describen en la Figura 5.
Se analizó la potencia de Mcm5 en las muestras lisadas después de la aplicación de tampón a las células. Algunas muestras se congelaron después de la exposición al tampón y antes del análisis. De manera ideal, sería útil un búfer universal que se utilizaría en ambas situaciones.
Los resultados del control demostraron que, cuando se analizaron muestras frescas, las células permanecían intactas cuando no se añadía agente de lisis, pero después de congelar-descongelar (CD), las células estallan por destrucción mecánica de la membrana celular, liberando así Mcm5. Este experimento mostró que, cuando se utilizan lisados frescos, el tampón TBST es aproximadamente equivalente al CytoBuster.
Sin embargo, después de haber congelado las muestras, los lisados de CytoBuster experimentan una pérdida drástica de potencia, mientras que el TBST no se ve tan fuertemente afectado. El tampón de lisados con RIPA, aunque menor cuando se obtienen de una muestra fresca, conservan toda la potencia posterior a la CD.
Ejemplo 8
Se añadieron componentes adicionales al TBT para tratar de mejorar la estabilidad de los lisados de TBST. Se analizó la potencia de Mcm5 en las muestras lisadas después de la aplicación de tampón a las células tanto frescas como congeladas. Los resultados de este experimento se presentan en la Figura 6.
Estos datos (descritos en la Figura 6) demostraron que los componentes estabilizadores del tampón RIPA son el desoxicolato de sodio (SDC) y el dodecilsulfato de sodio (SDS), pero desafortunadamente la incorporación de estos elementos en el tampón TBST más simple provoca una pérdida dramática de la señal. Se realizó una prueba complementaria para eliminar elementos del tampón RIPA uno por uno, para observar si la eliminación de algún elemento podría mejorar la señal del RIPA al mismo nivel que el TBST, mientras se conserva la estabilidad. Los resultados se describen en la Figura 7.
Ejemplo 9
Se compararon diversos tampones que comprendían concentraciones de Tris y Tritón x-100 que diferían. Se analizó la potencia de Mcm5 en las muestras lisadas después de la aplicación de tampón a las células tanto frescas como congeladas. Los resultados se presentan en la Figura 8.
Los datos mostraron que el aumento de la concentración de Tris provocó una mejora de los niveles de Mcm5 del lisado celular, aunque el aumento de la concentración de Tritón X-100 no tuvo efecto.
Para garantizar que se utilice la base óptima para el tampón de lisis antes de continuar, se analizaron varios compuestos en diversos intervalos de pH y tipos de tampón. Varios de estos tampones dieron buenos resultados, pero se demostró que el TBS tenía la señal más alta. Estos resultados se describen en la Figura 9.
Ejemplo 10
Se realizó una titulación adicional de Tris para observar si la señal aún aumentaría si se usara una concentración de tampón más alta, y para observar dónde se estabilizaba la mejora. Los resultados se presentan en la Figura 10.
El nivel de Mcm5 comienza a estabilizarse a Tris 225 mM, con solo el Tris de 250 mM siendo más alto, y luego la señal es estable hasta 325 mM, después de lo cual observa una disminución. Para evitar posibles problemas con la fabricación y la variación, una concentración en una zona estable de la meseta sería la opción óptima, tal como 300 mM.
Ejemplo 11
Se planteó la hipótesis de que la modificación de la concentración de Tris podía ser eficaz debido al aumento de la fuerza iónica. Dado que esto se puede lograr igualmente añadiendo NaCl, se analizaron composiciones que tenían distintas concentraciones de NaCl. Los resultados se presentan en la Figura 11.
Los datos muestran que el aumento de la concentración de NaCI en los tampones TBST (TBS Tween 20) con niveles más bajos de Tris mejora la señal, pero el mismo efecto no se observa en el tampón RIPA, independientemente de la concentración de Tris. El aumento de la concentración de Tris no parece tener ninguna mejora sustancial en la señal del tampón RIPA convencional (Tris 25 mM y NaCI 150 mM), incluso si el nivel de NaCI se reduce en compensación. El TBST con Tris 10 mM NaCI 150 mM tiene la señal más alta obtenida en el conjunto de datos (aproximadamente el doble que la de CytoBuster), por lo que este tampón se optimizó en términos de concentración de NaCl y se evaluó por separado en cuanto a los componentes estabilizadores.
Ejemplo 12
Los datos presentados en el Ejemplo 8 sugieren que los tampones que tienen tris alrededor 10 mM son los más eficaces, por lo que se investigaron tampones que tenían tris 10 mM y distintas concentraciones de NaCl. Los resultados se presentan en la Figura 12.
La titulación del NaCl muestra que el mejor candidato es Tris 10 mM con NaCl 200 mM. Los datos también parecen mostrar que cuando la fuerza iónica alcanza cierto punto, la precisión está comprometida. La formulación elegida del tampón a partir de este punto fue Tris 10 mM, NaCl 200 mM y Triton X-100 al 0,1 %, a lo que luego se añadieron compuestos estabilizadores para encontrar una formulación final adecuada.
Ejemplo 13
Se analizaron diversos estabilizadores para probar su eficacia en la estabilización de las muestras de Mcm5 cuando se combinaron con TBS-T.
En términos de posibles candidatos, el SFB (suero bovino fetal) al 1 %, la BSA (seroalbúmina bovina) al 2,5 %, Pefabloc SC 0,25 mM, Pefabloc SC 0,1 mM, el cóctel de inhibidores de proteasas P8340 de Sigma al 0,5 % y el cóctel de inhibidores de proteasas cOmplete de Roche 0,25x tuvieron datos alentadores sin comprometer el fondo o la señal de las muestras positivas en comparación con el tampón sin aditivos de estabilidad. Estos resultados se presentan en las Figuras 13A y 13B.
Estos compuestos se analizaron con diversas temperaturas de almacenamiento después de 6 días para observar cómo se comparaban con el TBST sin aditivos y el CytoBuster. Estos resultados se presentan en la Figura 14.
Todos los estabilizadores fueron eficaces para estabilizar las composiciones. Los cócteles inhibidores de proteasas producidos comercialmente (Pefabloc, P3840 de Sigma y cOmplete de Roche) fueron estables, pero redujeron la señal de Mcm5. La BSA al 2,5 % funcionó mejor que el SFB al 1 % a -20 °C. El rendimiento a 4 °C y fresco fue equivalente para SFB al 1 % y BSA al 2,5 %, y ambos parecen aumentar la comparación de la señal con respecto al tampón TBST convencional. Como hubo una pérdida a -20 °C para la BSA, se realizó un experimento repetido utilizando líneas celulares adicionales para confirmar la mejora de la estabilidad.
Ejemplo 14
Se comparó una composición de TBSTr BSA al 2,5 % con TBSTr y CytoBuster. Los resultados se presentan en las Figuras 15A, 15B y 15C.
Con todas las líneas celulares, el TBST BSA al 2,5 % ha demostrado ser estable (concentración dentro del 10 % de lisado fresco) y tener la señal más alta después de 1 ciclo CD en comparación con CytoBuster y TBST. Hablando en términos generales, CytoBuster parece proporcionar resultados muy variables con lisados frescos, pero siempre hay una pronunciada pérdida de potencia cuando se realiza la congelación-descongelación.
Claims (10)
1. Un método para la detección de la presencia del componente del complejo de mantenimiento de minicromosomas 5 (Mcm5) en un sujeto, comprendiendo el método:
(a) preparar una muestra de orina de dicho sujeto, en donde la preparación de la muestra de orina comprende exponer la muestra de orina a un tampón de lisis capaz de liberar Mcm5 de las células en la muestra de orina liberando de este modo Mcm5 de las células en la muestra de orina, y en donde el tampón de lisis comprende un detergente que comprende triton X-100;
(b) realizar un ensayo para determinar la concentración de Mcm5 liberada de las células en la muestra de orina exponiendo la muestra de orina a un primer anticuerpo monoclonal y un segundo anticuerpo monoclonal, y midiendo la cantidad de Mcm5 que se une al primer anticuerpo monoclonal y al segundo anticuerpo monoclonal, en donde el ensayo es un ensayo de ELISA tipo sándwich que comprende capturar Mcm5 utilizando un anticuerpo de captura y detectar la concentración de Mcm5 utilizando un anticuerpo de detección, y en donde el anticuerpo de captura es el primer anticuerpo monoclonal y el anticuerpo de detección es el segundo anticuerpo monoclonal, o el anticuerpo de captura es el segundo anticuerpo monoclonal y el anticuerpo de detección es el primer anticuerpo monoclonal; y
(c) comparar la concentración de Mcm5 determinada en la etapa (b) con un valor de referencia obtenido previamente de una muestra de un sujeto sano;
en donde el primer anticuerpo monoclonal y el segundo anticuerpo monoclonal se unen a Mcm5, y en donde el primer anticuerpo monoclonal se une a un epítopo que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, y el segundo anticuerpo monoclonal se une a un epítopo que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el primer anticuerpo monoclonal es un anticuerpo que:
(i) comprende una CDRH1 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 9; una CDRH2 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 11; una CDRH3 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 13; una CDRL1 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 3; una CDRL2 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 5; y una CDRL3 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 7; o
(ii) comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia idéntica a la SEQ ID NO: 29 y una secuencia de región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia idéntica a la SEQ ID NO: 27; y/o
el segundo anticuerpo monoclonal es un anticuerpo que:
(i) comprende una CDRH1 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 21; una CDRH2 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 23; una CDRH3 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 25; una CDRL1 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 15; una CDRL2 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 17; y una CDRL3 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 19; o
(ii) comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia idéntica a la SEQ ID NO: 33 y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia idéntica a la SEQ ID NO: 31.
3. Un kit que comprende:
un tampón de lisis que es capaz de liberar Mcm5 de las células en una muestra de orina, en donde el tampón de lisis comprende un detergente que comprende triton X-100; y
un primer anticuerpo monoclonal y un segundo anticuerpo monoclonal en donde el primer anticuerpo monoclonal es un anticuerpo que:
(i) se une a un epítopo que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1;
(ii) comprende una CDRH1 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 9; una CDRH2 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 11; una CDRH3 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 13; una CDRL1 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 3; una CDRL2 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 5; y una CDRL3 de 12A7 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 7; o
(iii) comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia idéntica a la SEQ ID NO: 29 y una secuencia de región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia idéntica a la SEQ ID NO: 27;
y el segundo anticuerpo monoclonal es un anticuerpo que:
(i) se une a un epítopo que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2;
(ii) comprende una CDRH1 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 21; una CDRH2 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 23; una CDRH3 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 25; una CDRL1 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 15; una CDRL2 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 17; y una CDRL3 de 4B4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 19; o
(iii) comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia idéntica a la SEQ ID NO: 33 y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia idéntica a la SEQ ID NO: 31.
4. El método o kit de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el primer anticuerpo monoclonal y/o el segundo anticuerpo monoclonal es un Fab'2, un F'(ab)2, un Fv, un anticuerpo monocatenario o un diacuerpo.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4, en donde
(a) un valor para la concentración de Mcm5 que sea mayor que el valor de referencia indica una probabilidad aumentada de un cáncer urológico en dicho sujeto;
(b) el anticuerpo de captura está inmovilizado en una placa de ELISA, opcionalmente, en donde el anticuerpo de detección está conjugado con peroxidasa de rábano picante;
(c) el método comprende además diagnosticar a un paciente como que tiene el cáncer urológico cuando la concentración de la Mcm5 determinada en la etapa (b) es mayor que el valor medio de pacientes sanos más un múltiplo de la desviación típica mostrada por los valores obtenidos de sujetos sanos;
(d) la muestra de orina comprende sedimento urinario;
(e) la muestra de orina comprende sedimento urinario obtenido de la orina del primer chorro recogida después de un masaje prostático;
(f) un valor para la concentración de Mcm5 que sea mayor que el valor de referencia indica una probabilidad aumentada de un cáncer urológico en dicho sujeto y dicho cáncer urológico comprende carcinoma de células de transición, opcionalmente en donde dicho carcinoma de células de transición comprende:
(i) cáncer de vejiga;
(ii) cáncer de próstata; o
(iii) cáncer de la pelvis o del riñón;
(g) el tampón de lisis no es PBS que contiene desoxicolato de sodio al 0,4 % y azida de sodio al 0,02 %;
(h) el método no comprende:
(i) incubación de la muestra de orina a una temperatura mayor que 95 °C durante 45 minutos;
(ii) rotura de los ácidos nucleicos pasando la muestra de orina a través de una aguja de 0,813 mm de diámetro; (iii) digestión de los ácidos nucleicos exponiendo la muestra de orina a ADNasa I o ARNasa A; y/o
(iv) centrifugación de la muestra de orina a 15.000 g durante 10 minutos;
(i) la preparación de la muestra de orina comprende una etapa de concentración de células en la muestra de orina; y/o
(j) la muestra de orina comprende células y la preparación de la muestra de orina consiste en las siguientes etapas:
(i) centrifugación de la muestra de orina; y
(ii) resuspensión de las células sedimentadas de la muestra de orina en el tampón de lisis.
6. El método o kit de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde
(a) el anticuerpo de captura está unido a una placa de ELISA; y/o
(b) el anticuerpo de detección está conjugado con peroxidasa de rábano picante.
7. El método o kit de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde
(a) el tampón de lisis no desnaturaliza sustancialmente la proteína Mcm5;
(b) el tampón de lisis no desnaturaliza un anticuerpo;
(c) el detergente comprende o consiste en tritón X-100 a una concentración de entre el 0,01 % y el 25 %, entre el 0,01 % y el 10 %, entre el 0,05 % y el 5 %, entre el 0,05 % y el 1 %, entre el 0,05 % y el 0,5 % o el 0,1 %;
(d) el detergente comprende desoxicolato de sodio o dodecilsulfato de sodio;
(e) el detergente comprende desoxicolato de sodio o dodecil sulfato de sodio a una concentración de entre el 0,1 % y el 20 %, entre el 0,5 % y el 10 %, entre el 0,5 % y el 5 % o el 1 %;
(f) el tampón de lisis comprende un componente tampón;
(g) el tampón de lisis comprende un componente tampón y el componente tampón es, comprende o consiste en tampón Tris o Trizma;
(h) el tampón de lisis comprende un componente tampón y el componente tampón comprende o consiste en tampón Tris a una concentración mayor que 5 mM, entre 5 mM y 350 mM, entre 200 mM y 300 mM, entre 10 mM y 25 mM, 10 mM o 250 mM;
(i) el tampón de lisis comprende un componente tampón y el componente tampón mantiene el pH del tampón entre pH 4 y pH 9, entre pH 5 y pH 8, entre pH 6 y pH 8, o a pH 7,6;
(j) el tampón de lisis comprende cloruro de sodio a una concentración de entre 20 mM y 300 mM, entre 150 mM y 300 mM, entre 100 mM y 200 mM o 200 mM; y/o
(k) el tampón de lisis tiene una fuerza iónica de entre 1 mM y 500 mM, entre 50 mM y 450 mM, entre 100 mM y 250 mM, o entre 100 mM y 175 mM.
8. El método o kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el detergente consiste en tritón X-100.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde
(a) el método no comprende la incubación de la muestra de orina a una temperatura mayor que 50 °C, mayor que 60 °C, mayor que 70 °C, mayor que 80 °C, mayor que 90 °C, entre 50 °C y 120 °C, entre 6o °C y 110 °C, entre 70 °C y 100 °C, o entre 80 °C y 100 °C;
(b) el método no comprende la incubación de la muestra de orina a una temperatura mayor que 50 °C, mayor que 60 °C, mayor que 70 °C, mayor que 80 °C, mayor que 90 °C, entre 50 °C y 120 °C, entre 60 °C y 110 °C, entre 70 °C y 100 °C, o entre 80 °C y 100 °C durante más de 30 minutos, más de 35 minutos, más de 40 minutos, más de 45 minutos, entre 30 minutos y 2 horas, entre 35 minutos y 2 horas, o entre 40 minutos y 2 horas;
(c) el método no comprende la rotura de ácidos nucleicos en la muestra de orina mediante rotura mecánica; (d) el método no comprende la exposición de la muestra de orina a enzimas que digieren ácidos nucleicos; y/o (e) el método no comprende la centrifugación de la muestra de orina a 15.000 g durante 10 minutos.
10. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 6-8, que comprende además
(a) un calibrador, opcionalmente en donde el calibrador es una solución de Mcm5 de una concentración conocida; (b) un reactivo de sustrato que puede utilizarse para detectar la concentración del anticuerpo de detección, opcionalmente en donde el reactivo de sustrato es peróxido y TMB; y/o
(c) una solución de lavado y/o una solución de parada.
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