ES2297209T3 - Metodo para diferenciar metaplasias de lesiones neoplasicas o preneoplasicas. - Google Patents
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Abstract
Un método para diferenciar las metaplasias con sobreexpresión de p16 INK4a de las lesiones neoplásicas o preneoplásicas con sobreexpresión de p16 INK4a en muestras biológicas durante pruebas citológicas que incluyan: a. determinación de la presencia o ausencia de células con sobreexpresión de p16 INK4a en dichas muestras biológicas; b. determinación de la presencia o ausencia de células que expresen productos génicos de E7 del VPH de alto riesgo en dichas muestras biológicas; c. valoración de la presencia simultánea de células que expresen productos génicos de E7 del VPH de alto riesgo con células que sobreexpresen p16 INK4a o la presencia de células con sobreexpresión sólo de p16 INK4a ; d. en el que, la presencia simultánea de células que expresan productos génicos de E7 del VPH de alto riesgo y de células que sobreexpresan p16 INK4a es un indicativo de lesión neoplásica o preneoplásica.
Description
Método para diferenciar metaplasias de lesiones
neoplásicas o preneoplásicas.
La presente invención expone un método para
diferenciar las metaplasias que presentan sobreexpresión de
p16^{INK4a} de las lesiones neoplásicas o preneoplásicas que
presentan sobreexpresión de p16^{INK4a} mediante la determinación
del nivel de productos génicos codificados de VPH de alto riesgo
como, por ejemplo, las moléculas E7 de VPH encontradas en muestras
biológicas durante la realización de citologías. De este modo, el
método nos permite reducir los falsos positivos en la detección por
citología de lesiones anogenitales basadas en la sobreexpresiónde
p16^{INK4a}.
La detección de la sobreexpresión de
p16^{INK4a} en muestras biológicas ha demostrado ser un valioso
indicador para la detección de lesiones anogenitales como el
carcinoma de cuello uterino (véase W000/01845; Klaes et al.,
Int. J. Cancer: 92, 276-284 (2001)). El método
basado en la tinción inmunoquímica específica de p16^{INK4a}
permite una identificación específica y sensible de las células
displásicas en la sección del tejido y en muestras citológicas.
En exámenes inmunohistoquímicos de tejidos, las
células neoplásicas pueden marcarse mediante un procedimiento de
tinción mediado por anticuerpos específicos de p16^{INK4a}. Por
tanto, el diagnóstico histológico de las lesiones neoplásicas puede
apoyarse en una tinción basada en un marcador molecular
característico de la transformación de células en lesiones
anogenitales. En estos procedimientos, independientemente de si las
células son o no neoplásicas, el diagnóstico no sólo se basa en la
tinción específica de p16^{INK4a}, sino que también depende de la
información histológica.
Esto se debe al hecho de que, aproximadamente en
un 30% de las muestras, las células metaplásicas presentan cierta
inmunorreactividad con anticuerpos específicos de p16^{INK4a} y,
en consecuencia, se tiñen durante el transcurso de los
procedimientos. Sin embargo, el patrón de tinción resultante de
estas células metaplásicas difiere del producido por las lesiones
neoplásicas. Las células metaplásicas producen un patrón de tinción
irregular o focal, mientras que las lesiones neoplásicas producen
un patrón de tinción difuso. Por otra parte, las intensidades de
tinción de las células metaplásicas suelen ser menores que las de
las células neoplásicas.
En las pruebas de cribado para la detección
precoz de neoplasias, los métodos más comunes no utilizan pruebas
basadas en la histología, más bien se fundamentan en pruebas
citológicas. Sobre todo en casos en los que no se dispone de
información histológica acerca de la arquitectura de los tejidos
como, por ejemplo, en exámenes citológicos, realizar pruebas para la
sobreexpresión de p16^{INK4a} puede provocar falsos positivos.
Esto se debe a la posibilidad de que las células metaplásicas que
expresan p16^{INK4a} en niveles elevados de detección no se puedan
diferenciar mediante patrones de tinción histológica.
El porcentaje de las células que muestran
sobreexpresión de p16^{INK4a} aumenta durante la aparición de
displasias. Por tanto, en las etapas de neoplasia o preneoplasia,
cuando sólo aparece una población restringida de células
neoplásicas o preneoplásicas en las muestras, la inmunorreactividad
de p16^{INK4a} puede ser débil. Esta inmunorreactividad débil
puede situarse alrededor del nivel producido por las células
metaplásicas. En etapas posteriores de las displasias, la
inmunorreactividad general de p16^{INK4a} es más intensa y, por
tanto, las lesiones neoplásicas se pueden distinguir más fácilmente
de las metaplasias, incluso en un formato de prueba citológica.
Esto puede provocar casos en los que la presencia de células
metaplásicas que expresan p16^{INK4a} se confunda con la de
células neoplásicas y, en consecuencia, producir un falso
positivo.
Este problema se convierte en un gran
inconveniente sobre todo en pruebas de cribado, en las que se
persigue la detección de neoplasias en sus primeras etapas. Esto es
especialmente cierto, ya que el diagnóstico basado en p16^{INK4a}
ha demostrado ser una herramienta valiosa en los exámenes
histológicos, y su aplicación en procedimientos de pruebas de
cribado basadas en citologías podría mejorar estos procedimientos ya
establecidos.
Para reducir los falsos positivos en formatos de
pruebas citológicas y mejorar aún más la fidelidad de los
diagnósticos de lesiones anogenitales mediante p16^{INK4a}, sería
muy conveniente contar con un método para diferenciar las
metaplasias de lesiones neoplásicas y displásicas. El problema de
esta técnica se encuentra especialmente en las primeras etapas de
las neoplasias, cuando el porcentaje de células que muestran
sobreexpresión de p16^{INK4a} todavía están a un nivel que podría
confundirse con los niveles normales de sobreexpresión de
p16^{INK4a} de las células metaplásicas proliferantes. Por estos
motivos, los medios más útiles para solucionar este problema deben
incluir parámetros que identifiquen las primeras etapas de las
neoplasias en el tracto anogenital.
Con respecto a la técnica anterior, varias
publicaciones describen la detección de p16 y la detección de E7
del VPH en especímenes histológicos de tejido tumoral.
En Milde Langosch et al., Virchows Arch
(2001) 439:55-61, se describen estudios sobre
secciones histológicas de adenocarcinomas cervicales. La tinción
inmunohistoquímica se realiza, entre otras razones, para la
detección de la expresión del p16. Se describen más análisis de
especímenes histológicos mediante la tinción de hibridación in
situ para detectar la expresión del ácido nucleico E6/E7 del
VPH. En el estudio no se aportan conclusiones relativas a la
utilidad de una cotinción con p16 y E7 del VPH con objetivos de
diagnóstico.
\newpage
En Riethdorf et al., Virchows Archiv
(2001) 439:338, se describe la detección in situ de p16 y
Ki67 en especímenes histológicos fijados con formalina e incluidos
en parafina de adenocarcinoma cervical. La detección de la
transcripción de E7 del VPH se utiliza en este contexto como el
patrón de oro para la detección de la neoplasia glandular
relacionada con el VPH. En este contexto, la información sobre el
VPH y la información sobre la expresión de p16 se manejan como
descubrimientos independientes, y ninguna decisión se basa en la
detección conjunta del VPH y de p16 en una muestra. Contrariamente,
se declara que el p16 y el Ki67 pueden utilizarse para diferenciar
el ACIS (adenocarcinoma in situ) de lesiones benignas. De
este modo, el ACIS puede diferenciarse de las lesiones benignas
mediante la detección del p16 aislado.
Doorbar, John et al. en WO0208764
describe un método de diagnóstico que implica la codetección de un
marcador de proliferación y de un producto de expresión del VPH. Los
autores sugieren que el uso concomitante del E4 del VPH y el p16
puede ser útil para el diagnóstico de la neoplasia cervical. No se
dan pistas respecto al uso de otros genes de VPH en conjunción con
el p16 ni con aplicaciones específicas en citología.
En la presente invención se proporciona un
método para diferenciar metaplasias de lesiones neoplásicas y
preneoplásicas mediante las aplicaciones que se argumentan según la
presente invención.
Para ayudar a diferenciar metaplasias de
lesiones neoplásicas en pruebas basadas en la sobreexpresión de
p16^{INK4a}, se necesita una molécula marcadora que se exprese en
las células neoplásicas y/o preneoplásicas así como en tejidos, y
que no se exprese en células metaplásicas.
Ahora, los inventores han descubierto que, en
los procedimientos de las pruebas citológicas, las células que
expresan productos génicos del VPH de alto riesgo, como el E7 del
VPH, pueden servir para diferenciar lesiones neoplásicas o
displásicas tempranas que se detectan por la tinción inmunoquímica
específica de p16^{INK4a} de las metaplasias, y que también pueden
comprender células inmunorreactivas con p16^{INK4a}.
Las células que expresan otros productos génicos
codificados de VPH, que son detectables con un nivel de expresión
como el ARNm o el polipéptido en las etapas neoplásicas o
preneoplásicas, también pueden servir para diferenciar las lesiones
neoplásicas y/o preneoplásicas de las metaplasias con
sobreexpresión de p16^{INK4a}, según la presente invención.
Algunos ejemplos de dichos productos génicos codificados del VPH
son las proteínas E7 del VPH o el ARNm.
La presente invención expone un método para
diferenciar lesiones neoplásicas, preneoplásicas y/o displásicas de
las metaplasias que incluyen células con sobreexpresión de
p16^{INK4a}. Esta diferenciación debe darse en muestras
biológicas durante un procedimiento de prueba citológica basada en
la detección de la presencia o ausencia de células que expresen
productos génicos del VPH de alto riesgo. Los productos génicos del
VPH útiles para el método que se revela en este documento se
expresan en alto grado sobre todo en las etapas tempranas de las
lesiones neoplásicas y preneoplásicas. En una aplicación de la
invención, la proteína E7 del VPH o el ARNm puede servir como
marcador para diferenciar las metaplasias de las lesiones
neoplásicas o preneoplásicas en las muestras.
El concepto de diferenciación tal y como se
utiliza en el contexto de la presente invención incluye la
valoración de una muestra para clasificarla de una manera u otra. En
una aplicación preferente de la invención, la diferenciación
concierne a la valoración de un tejido o de sus componentes para
saber si son neoplásicos o metaplásicos. De este modo, la
diferenciación, tal y como se utiliza en este contexto, es un
dictamen sobre las propiedades de crecimiento de las células en una
muestra.
La diferenciación, según la presente invención,
se basa en la presencia o ausencia de células que expresen un
producto génico del VPH de alto riesgo y en la presencia o ausencia
de células que sobreexpresen p16^{INK4a} en dicha muestra. Las
células que expresen productos génicos del VPH de alto riesgo, como
la E7, no necesariamente tienen que ser las mismas que las que
sobreexpresan p16^{INK4a}, aunque la expresión de ambas moléculas
marcadoras pueda producirse en las mismas células.
De este modo, según la presente invención, la
presencia de células que expresan productos génicos de E7 en una
muestra de manera simultánea a la presencia de células que
sobreexpresan p16^{INK4a} (otras células o las mismas células que
expresen conjuntamente ambos marcadores) sirven para discriminar
las lesiones neoplásicas o preneoplásicas de las metaplasias.
Los productos génicos codificados del VPH, tal y
como se utilizan en el contexto de la presente invención, son
cualquier ARNm transcrito de un gen del genoma del VPH o cualquier
polipéptido traducido de dicho ARNm. Los productos génicos del VPH
adecuados para el método, según la presente invención, son
productos génicos codificados por el gen E7.
En este documento, VPH significa virus del
papiloma humano. En este documento, el concepto de VPH comprende
cualquier subtipo de alto riesgo del VPH. En una aplicación
preferente de la presente invención, el subtipo de VPH es un
subtipo de VPH relacionado con el cáncer como, por ejemplo: VPH 16,
18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 y 58. En una aplicación
especialmente preferente, los subtipos de alto riesgo del VPH son
VPH 16, 18, 39 o VPH 45. La subtipificación del VPH comprende
cualquier método apropiado para la determinación del subtipo de VPH
concreto presente en una muestra biológica.
Según la presente invención, el método para la
detección del nivel de los productos génicos codificados del VPH es
cualquier método apropiado para detectar pequeñas cantidades de
moléculas biológicas específicas en muestras biológicas. La reacción
de detección es, según la presente invención, una detección en el
nivel de ácidos nucleicos o en el nivel de polipéptidos.
Los productos génicos del VPH pueden detectarse
utilizando reactivos que reconozcan específicamente esas moléculas.
La reacción de detección para los productos génicos del VPH puede
comprender una o más reacciones con los agentes de detección, que
reconozcan las moléculas marcadoras iniciales, o que reconozcan las
moléculas anteriores utilizadas para reconocer otras moléculas.
Asimismo, la reacción de detección puede
comprender una reacción indicativa que señalice la presencia o
ausencia y/o el nivel de los productos génicos del VPH. La reacción
indicativa puede ser, por ejemplo, una reacción que produzca un
compuesto de color, una reacción bioluminiscente, una reacción
fluorescente, generalmente una reacción que emita radiaciones,
etc.
En una aplicación preferente, las diferentes
moléculas marcadoras pueden ser reconocidas por agentes que
producen diferentes señales indicativas, para que las señales que se
refieren a moléculas que actúan como marcadores se puedan
distinguir. En una aplicación preferente de la invención, la
detección de la expresión de productos génicos del VPH de alto
riesgo se realiza de manera simultánea con la detección de la
sobreexpresión de p16^{INK4a}. En este caso, la reacción
indicativa puede, por ejemplo, emplear diferentes etiquetas
fluorescentes para las diferentes moléculas detectadas.
Los formatos aplicables para la reacción de
detección, según la presente invención, pueden ser: técnicas de
inmunotransferencia ligada a enzimas, como el
Western-blot, Southern-blot,
Northern-blot. Quienes utilicen habitualmente este
tipo de técnicas estarán familiarizados con las técnicas de
inmunotransferencia. Pueden aplicarse, por ejemplo, como
electrotransferencias, transferencias-; semisecas, transferencias
de vacío o transferencias por puntos. También puede aplicarse una
reacción de amplificación para la detección de, por ejemplo,
moléculas de ácido nucleico.
En una aplicación preferente de la invención, la
detección del nivel de productos génicos del VPH se realiza
mediante la detección del respectivo ARNm o de sus fragmentos
presentes en la muestra. Quienes utilicen habitualmente esta
técnica estarán familiarizados con los medios para la detección de
moléculas de ácido nucleico. El procedimiento para la detección de
ácidos nucleicos puede realizarse, por ejemplo, con una reacción de
unión de la molécula que se desea detectar con sondas de ácido
nucleico complementarias, proteínas con especificidades enlazantes
con los ácidos nucleicos, o cualquier otra entidad que reconozca
específicamente y que se una a dichos ácidos nucleicos.
Este método puede realizarse también in
vitro y directamente in situ, por ejemplo, en el
transcurso de la detección de una reacción de tinción. Otra forma
de detectar los ARNm del VPH en una muestra realizada con un método
acorde con la presente invención, es una reacción de amplificación
de los ácidos nucleicos. Puede realizarse de manera cuantitativa,
como por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa. En una
aplicación preferente de la presente invención, la RT PCR
(transcripción inversa - reacción en cadena de la polimerasa) puede
utilizarse para cuantificar el nivel de ARNm del VPH en muestras de
tumores.
En otra aplicación preferente de esta invención,
la detección del nivel de productos génicos del VPH se realiza
determinando el nivel de expresión de una proteína. La determinación
del producto génico del VPH en el nivel de proteína puede
realizarse, por ejemplo, en una reacción que incluya un agente de
enlace específico para la detección del polipéptido específico del
VPH.
Los agentes de enlace se pueden utilizar en
técnicas de detección muy distintas, por ejemplo, en el
Western-blot, ELISA o la inmunoprecipitación. Por lo
general, la detección basada en agentes enlazantes de polipéptidos
puede realizarse tanto in vitro como directamente in
situ, por ejemplo, durante una reacción de tinción
inmunohistoquímica. Según la presente invención, se puede utilizar
cualquier otro método para la determinación de la cantidad de
polipéptidos específicos en muestras biológicas.
En el contexto de la presente invención, los
agentes enlazantes para la detección del nivel tanto de
polipéptidos del VPH como de polipéptidos de p16^{INK4a} pueden
incluir anticuerpos y fragmentos antígenos enlazantes, anticuerpos
híbridos bifuncionales, peptidomiméticos que contengan epítopos
antígenos enlazantes mínimos, etc.
Se dice que un anticuerpo o agente antígeno
enlazante reacciona de manera específica si reacciona a una nivel
detectable con una proteína indicada en este documento y no
reacciona de forma significativa con otras proteínas. Según la
presente invención, los anticuerpos pueden ser monoclonales o
policlonales. Según se utiliza en este documento, el término
anticuerpo o anticuerpo monoclonal incluye tanto a moléculas
intactas como a fragmentos de anticuerpos. Además, los anticuerpos
de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, de cadena
sencilla y humanizados.
Según la presente invención, los agentes
enlazantes pueden utilizarse de manera aislada o en combinación con
otros. Mediante la combinación se puede conseguir un mayor grado de
sensibilidad. Preferiblemente, el término anticuerpo se refiere a
anticuerpos que se componen básicamente de anticuerpos monoclonales
combinados con diferentes especificidades epitópicas, así como
distintos preparados de anticuerpos monoclonales.
Los anticuerpos monoclonales se componen de un
antígeno que contiene fragmentos del polipéptido mencionado en esta
invención, utilizando cualquiera de las diferentes técnicas que
conocerán aquellos que realicen este tipo de procedimientos
habitualmente; véase, por ejemplo: Harlow and Lane, Antibodies: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En esta
técnica, se comienza inyectando un inmunógeno que comprende el
polipéptido antigénico o una parte sintética del mismo a una amplia
variedad de mamíferos (como ratones, ratas, conejos, ovejas 1 y
cabras). En este paso, los polipéptidos de esta invención pueden
servir como inmunógenos sin modificación. Por otro lado,
especialmente en el caso de los polipéptidos relativamente cortos,
se puede provocar una respuesta inmune superior si el polipéptido
se une a una proteína portadora, como albúmina de suero bovino o
hemocianina de lapa (KLH). El inmunógeno se inyecta en el animal
anfitrión, preferiblemente en función a un programa predeterminado
que incorpore una o más dosis de inmunización de refuerzo, y
periódicamente se sacará muestras de sangre al mismo. Los
anticuerpos policlonales específicos para el polipéptido pueden
purificarse con tales antisueros mediante, por ejemplo,
cromatografía afín utilizando el polipéptido asociado a un soporte
sólido adecuado.
Según la presente invención, los métodos que se
utilizan para la detección de la presencia o ausencia de
sobreexpresión de p16^{INK4a}, son los mismos métodos que los
mencionados anteriormente para la detección de productos génicos
del VPH.
Según la presente invención, los productos
génicos del VPH pueden detectarse simultáneamente con la presencia
o ausencia de la sobreexpresión de p16^{INK4a}. En este contexto,
"simultáneamente" significa literalmente "en el mismo
instante" o "en el mismo proceso de pruebas", de modo que
las etapas de detección se suceden consecutivamente.
Una muestra acorde con el método de esta
invención puede comprender cualquier muestra que incluya células de
origen anogenital. Las muestras pueden comprender, por ejemplo:
secreciones, frotis cervicales, fluidos corporales y muestras de
células.
En una aplicación de esta invención, las
muestras comprenden células del cuello uterino. En una aplicación
preferente de la presente invención, la muestra de las células
cervicales puede prepararse según la prueba clásica de Papanicolau.
En otra aplicación preferente de esta invención, la muestra puede
prepararse como una monocapa o preparación de capa fina de una
muestra citológica.
La preparación de una muestra puede comprender,
por ejemplo, la obtención de una muestra de un tejido, un fluido
corporal, o células de una paciente. Según esta invención, la
preparación de la muestra también puede comprender varios pasos
adicionales para preparar la muestra como, por ejemplo, la
preparación de disecciones, el esparcimiento y la aplicación de las
células para que se examinen en portaobjetos, la preparación de
matrices de tejido, el aislamiento de polipéptidos o ácidos
nucleicos, la preparación de péptidos fijados de fase sólida o
ácidos nucleicos, o la preparación de cadenas, membranas o
portaobjetos con los que las moléculas que se deben determinar se
enlacen de forma covalente o no covalente.
Las lesiones neoplásicas a las que se puede
aplicar el método indicado en esta invención incluyen cualquier
lesión anogenital que se caracterice por la sobreexpresión de
p16^{INK4a}, que además muestre la expresión de los productos
génicos del VPH. En una aplicación preferente de esta invención, la
lesión anogenital es una lesión del cuello uterino.
Otro aspecto de la presente invención es un kit
de pruebas para la aplicación del método según la presente
invención. El kit puede ser, por ejemplo, un kit de diagnóstico o un
kit de investigación.
Según la presente invención, un kit incluye,
como mínimo, un agente adecuado para la detección de productos
génicos del VPH y un agente adecuado para la detección de la
presencia o ausencia de la sobreexpresión de p16^{INK4a}.
Por tanto, un kit acorde con la presente
invención puede incluir:
a) reactivos para la detección de los productos
génicos del VPH
b) reactivos para la detección de la
sobreexpresión de p16^{INK4a}
c) reactivos y tampones utilizados normalmente
para obtener la reacción de detección como, por ejemplo, tampones,
marcadores de detección, sustancias portadoras y otros
d) una muestra de p16^{INK4a} para realizar
una reacción de control positivo
e) una muestra de producto génico del VPH para
realizar una reacción de control positivo
Los reactivos para la detección de productos
génicos del VPH y/o p16^{INK4a} pueden incluir cualquier agente
capaz de enlazarse a productos génicos del VPH y/o a una molécula
p16^{INK4a}. Dichos reactivos pueden incluir proteínas,
polipéptidos, ácidos nucleicos, ácidos nucleicos péptidos,
glicoproteínas, proteoglicanos, polisacáridos o lípidos.
El producto génico del VPH y/o la muestra
p16^{INK4a} para realizar un control positivo puede comprender,
por ejemplo, ácidos nucleicos en su forma aplicable, como una
solución o sal, péptidos en su forma aplicable, muestras de sección
de tejido o células positivas.
En una aplicación preferente de la invención, la
detección de los productos génicos del VPH y/o p16^{INK4a} se
realiza a nivel de los polipéptidos. En esta aplicación, los agentes
enlazantes pueden ser, por ejemplo, anticuerpos específicos para
productos génicos del VPH o p16^{INK4a}, o fragmentos de los
mismos.
En otra aplicación del kit de prueba, la
detección de productos génicos del VPH y/o p16^{INK4a} se
realiza a nivel del ácido nucleico. En esta aplicación de la
invención, el reactivo para la detección puede ser, por ejemplo,
una sonda de ácido nucleico o un cebador inverso complementario a
dichos productos génicos y/o ácidos nucleicos de p16^{INK4a}.
La presente invención proporciona un método para
diferenciar una lesión anogenital neoplásica o preneoplásica
identificable mediante la valoración de la sobreexpresión de
p16^{INK4a} en células metaplásicas, que expresan p16^{INK4a}
de una manera detectable durante la citología. El método se basa en
la detección de la expresión de los productos génicos del VPH de
alto riesgo. Se comprobó que los productos génicos del VPH de alto
riesgo expresados en niveles altos en las primeras etapas de
neoplasias y preneoplasias son adecuados para esta diferenciación.
Esto se debe al hecho de que el porcentaje de células en una
muestra biológica en las primeras etapas de neoplasias que
sobreexpresan p16^{INK4a} produce un nivel de moléculas
p16^{INK4a} que hace que exista la posibilidad de que el nivel
vuelva a producirse en células metaplásicas en lugar de en las
neoplásicas. Por consiguiente, el problema a resolver consistía en
proporcionar un método para la diferenciación entre células
neoplásicas y metaplásicas, especialmente en las primeras etapas de
las neoplasias, cuando los métodos de diagnóstico citológico basados
en la sobreexpresión de p16^{INK4a} requieren más información
para la identificación de células metaplásicas.
Asimismo, la presente invención proporciona un
kit para la aplicación del método según la presente invención.
Imagen
1
Células metaplásicas con tinción
inmunoquímica con un anticuerpo específico para p16^{INK4a};
en el Ejemplo 1 pueden observarse los detalles experimentales; las
células reaccionan claramente con los anticuerpos contra
p16^{INK4a}
Imagen
2
Células metaplásicas con tinción
inmunoquímica con un anticuerpo específico para E7 del VPH; en
el Ejemplo 1 pueden observarse los detalles experimentales; las
células no muestran inmunorreactividad con los anticuerpos
monoclonales dirigidos contra la proteína E7 del VPH
Imagen
3
Células displásicas con tinción inmunoquímica
con un anticuerpo específico para p16^{INK4a}; en el Ejemplo
1 pueden observarse los detalles experimentales; las células
reaccionan claramente ante los anticuerpos contra p16^{INK4a}
Imagen
4
Células displásicas con tinción inmunoquímica
con un anticuerpo específico para E7 de VPH; en el Ejemplo 1
pueden observarse los detalles experimentales; las células
reaccionan claramente con los anticuerpos contra la proteína E7 del
VPH
Imagen
5
Células displásicas con doble tinción
inmunoquímica con anticuerpos específicos para E7 del VPH y
anticuerpos específicos para p16^{INK4a}; en el Ejemplo 1
pueden observarse los detalles experimentales; las células
reaccionan claramente con los anticuerpos contra las proteínas E7
del VPH y p16^{INK4a}
Los siguientes ejemplos sólo se proporcionan con
fines ilustrativos y no pretenden limitar el ámbito de la invención
del presente documento.
Las capas finas de ThinPrep® del frotis de
cuello uterino se tintaron inmunocitoquímicamente utilizando
anticuerpos específicos para p16^{INK4a} y anticuerpos
monoclonales específicos para la proteína E7 del VPH.
Para la rehidratación, los frotis fijados con
pulverización preparados en portaobjetos se incubaron en etanol
fresco del 50% en un dispositivo de balanceo. La capa de polietilén
glicol (PEG) producida por el proceso de fijación se eliminó con un
aclarado intenso. Posteriormente, los frotis se enjuagaron en agua
doblemente destilada. La recuperación del antígeno se realizó con un
tampón de citrato de 10mM (pH 6.0). Los portaobjetos se calentaron
al baño María durante 40 minutos a 95-98ºC, se
enfriaron a temperatura ambiente en 20 minutos, se transfirieron a
un tampón de lavado (Dakocytomation, S3006) y, finalmente, se
cercaron con un lápiz lípido.
Para la inactivación de la peroxidasa endógena,
las muestras se incubaron con un H_{2}O_{2} del 3%
(Dakocytomation; S2023) durante 5 minutos a temperatura ambiente y,
a continuación, se lavaron en un tampón de lavado (Dakocytomation,
S3006) durante 5 minutos; luego siguió una incubación con un
anticuerpo primario específico de p16^{INK4a} o anticuerpos
monoclonales dirigidos contra la proteína de alto riesgo E7
(VPH16). Las muestras se incubaron durante 30 minutos a temperatura
ambiente, se lavaron en un tampón de lavado durante 5 minutos y, a
continuación, se incubaron con el sistema EnVision (Dakocytomation,
K4001), que consta de anticuerpos de cabra
anti-ratón conjugados con un polímero de dextrano y
encimas de peroxidasa, durante 30 minutos a temperatura ambiente y
lavados en el tampón de lavado durante 5 minutos (tres veces).
La detección de la señal se realizó con un
complejo de sustrato-cromógeno (DAB+,
Dakocytomation, K3468) por incubación durante 10 minutos a
temperatura ambiente. A continuación, la reacción se detuvo en agua
destilada. Finalmente, se realizó una contratinción con
hematoxilina de Mayers y los portaobjetos se montaron con Faramount
(DakoCytomation, S3025).
El examen microscópico de los portaobjetos
reveló que las células inmunorreactivas con el anticuerpo
p16^{INK4a} junto con las células inmunorreactivas con el
anticuerpo de la proteína E7 del VPH sólo se pueden encontrar en
muestras que se identificaron microscópicamente como muestras de
lesiones neoplásicas. Las células tintadas por la reacción
específica de p16^{INK4a}, que se originaban en las metaplasias,
no se tiñeron con la reacción específica para la proteína E7 del
VPH.
Para validar los resultados que se proporcionan
en este documento, se realizó una doble tinción de especímenes
citológicos utilizando el anticuerpo E7 del VPH etiquetado como FITC
(anticuerpo como se indicó anteriormente) en combinación con el
anticuerpo de p16^{INK4a} utilizado anteriormente. La tinción se
realizó como se ha indicado anteriormente, y se adaptó para un
procedimiento de doble tinción. Quienes tengan cierta experiencia
en esta técnica conocerán las variaciones necesarias.
En especímenes de doble tinción no se
encontraron células metaplásicas con doble tinción; por otro lado,
las células displásicas muestran una doble tinción para las
proteínas p16^{INK4a} y E7 del VPH. Los resultados muestran que la
tinción con reactivos específicos para E7 del VPH permite
diferenciar las metaplasias que sobreexpresan p16^{INK4a} de las
displasias.
Claims (22)
1. Un método para diferenciar las metaplasias
con sobreexpresión de p16^{INK4a} de las lesiones neoplásicas o
preneoplásicas con sobreexpresión de p16^{INK4a} en muestras
biológicas durante pruebas citológicas que incluyan:
- a.
- determinación de la presencia o ausencia de células con sobreexpresión de p16^{INK4a} en dichas muestras biológicas;
- b.
- determinación de la presencia o ausencia de células que expresen productos génicos de E7 del VPH de alto riesgo en dichas muestras biológicas;
- c.
- valoración de la presencia simultánea de células que expresen productos génicos de E7 del VPH de alto riesgo con células que sobreexpresen p16^{INK4a}o la presencia de células con sobreexpresión sólo de p16^{INK4a};
- d.
- en el que, la presencia simultánea de células que expresan productos génicos de E7 del VPH de alto riesgo y de células que sobreexpresan p16^{INK4a} es un indicativo de lesión neoplásica o preneoplásica.
2. Un método según la reivindicación 1, en el
que el producto génico de E7 del VPH es un polipéptido o una
molécula de ARN.
3. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que las lesiones neoplásicas o
preneoplásicas son lesiones del tracto anogenital.
4. El método según la reivindicación 3, en el
que la lesión del tracto anogenital es una lesión del cuello
uterino.
5. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la muestra biológica es una
muestra que contiene células de origen anogenital.
6. Un método según la reivindicación 5, en el
que las células se originan a partir del cuello uterino.
7. Un método según la reivindicación 5, en el
que la muestra biológica es una prueba de Papanicolau o una
preparación citológica del cuello uterino.
8. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la detección de los
productos génicos de E7 del VPH y las moléculas de p16^{INK4a} se
realiza con, como mínimo, una sonda específica para detectar las
moléculas.
9. Un método según la reivindicación 8, en el
que se etiqueta la sonda para que sea fácilmente detectable.
10. Un método según la reivindicación 9, en el
que la etiqueta se selecciona de un grupo que se compone de un
radioisótopo, un compuesto bioluminiscente, un compuesto
quimioluminiscente, un compuesto fluorescente, un metal quilatado o
una enzima.
11. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 8 al 10, en el que la sonda es una proteína y/o un
ácido nucleico.
12. Un método según la reivindicación 11, en el
que al menos una sonda es un anticuerpo dirigido contra un producto
génico codificado de E7 del VPH de alto riesgo o de
p16^{INK4a}.
13. El método según la reivindicación 12, que
incluye un procedimiento de tinción inmunocitoquímica.
14. El método según la reivindicación 11, en el
que, al menos, una sonda es un ácido nucleico que se hibrida
específicamente a un producto génico del VPH de alto riesgo.
15. El método según la reivindicación 14, que
incluye una reacción de hibridación in situ.
16. El método según la reivindicación 14, que
incluye una reacción de amplificación del ácido nucleico.
17. El método según la reivindicación 16, en el
que la reacción de amplificación del ácido nucleico es PCR o
LCR.
18. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que las reacciones de detección
con sondas de ácido nucleico y sondas de polipéptido se llevan a
cabo simultáneamente.
19. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que los productos génicos del
VPH de alto riesgo son productos génicos de los subtipos VPH 16, 18,
31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 y 58, relacionados con el
cáncer.
20. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que se determina la
sobreexpresión de p16^{INK4a} de manera simultánea a la expresión
de, al menos, un producto génico de E7 del VPH de alto riesgo en,
al menos, una célula sencilla.
21. Un kit para aplicar el método según una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es un kit de
diagnóstico o de investigación, que incluye:
- a.
- sondas para la detección de la presencia o ausencia de sobreexpresión de p16^{INK4a} en muestras biológicas
- b.
- una o más sondas para la detección de la presencia o ausencia de expresión de uno o más productos génicos de E7 del VPH en muestras biológicas
- c.
- reactivos y tampones para llevar a cabo la reacción de detección.
22. Un kit según la reivindicación 21 que además
incluye:
- a.
- una muestra de p16^{INK4a} para realizar una reacción de control positivo
- b.
- una o más muestras de productos génicos de E7 del VPH para realizar reacciones de control positivo.
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