ES2214541T3

ES2214541T3 - Muteina de cd40l.

Info

Publication number: ES2214541T3
Application number: ES96921405T
Authority: ES
Inventors: Richard J. Armitage; William C. Fanslow, Iii; Melanie K. Spriggs; Subhashini Srinivasan; Marylou G. Gibson
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 2004-09-16
Anticipated expiration: 2016-06-06
Also published as: MX9709447A; EP0832229B1; IL122174A; AU693713B2; DE69631331D1; EP0832229A2; ATE257858T1; JPH11504819A; NO975437D0; IL122174A0; NO317735B1; NO975437L; WO1996040918A2; PT832229E; AU6263896A; NZ311335A; KR19990022141A; KR100453314B1; WO1996040918A3; DE69631331T2

Abstract

SE PRESENTAN UN POLIPEPTIDO QUE ES UNA MUTEINA DE CD40L, SECUENCIAS DE DNA, VECTORES Y CELULAS HUESPEDES TRANSFORMADAS UTILES PARA LA OBTENCION DE TALES MUTEINAS DE CD40L.

Description

Muteína de CD40L.

Antecedentes de la invención

La proteína CD40 humana (CD40) es un péptido de 277 aminoácidos que tiene un peso molecular de 30.600 y un péptido señal de secreción de 19 aminoácidos que comprende predominantemente aminoácidos hidrofóbos (Stamenkovic y col., EMBO J. 8:1403, 1989). CD40 pertenece a una familia de receptores cuyos miembros incluyen dos formas del receptor de TNF (Smith y col., Science 248:1019, 1990; y Schall y col., cell 61:361, 1990), el receptor del factor de crecimiento de nervios (Johnson y col., Cell 47:545, 1986) el antígeno de células T OX40 (Mallett y col., EMBO J. 9:1063, 1990), el antígeno Fas humano (Itoh y col., Cell 66:233, 1991) y el receptor 4-1BB murino (Kwon y col., Cell. Immunol. 121:414, 1989 [Kwon y col. I] y Kwon y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1963, 1989 [Kwon y col. II]). El peso molecular (exclusivo de la glicosilación) de la proteína CD40 humana madura es de
28.300.

Las células T CD4+ activadas expresan altos niveles de un ligando para CD40 (CD40L). La CD40L humana, una glicoproteína unida a la membrana, se clonó a partir de células T de sangre periférica como se describe en Spriggs y col., J. Exp. Med. 176:1543 (1992), y en el documento WO 93/08207. La clonación de CD40L murina se describe en Armitage y col., Nature 357:80, 1992. CD40L induce la proliferación de células B en ausencia de cualquier coestímulo y también puede inducir la producción de inmunoglobulinas en presencia de citocinas. CD40L es un polipéptido de membrana de tipo II que tiene una región extra celular en su extremo C, una región transmembrana y una región intracelular en su extremo N. Las formas solubles de CD40L comprenden la región extracelular de CD40L o un fragmento de la misma. La actividad biológica de CD40L está mediada por la unión de la región extracelular de CD40L con CD40, e incluye la proliferación de células B y la inducción de la secreción de anticuerpos (incluyendo la secreción de IgE).

Antes de la presente invención, se desconocía un ligando para CD40 que presentara una mayor afinidad de unión para la CD40 humana que la de CD40L nativa. Por consiguiente, en la técnica existe la necesidad de identificar y caracterizar tal muteína ligando de CD40.

Sumario de la invención

Se aisló y caracterizó una nueva citocina, denominada en lo sucesivo "CD40L" como se describe en el documento WO 93/08207. La presente invención comprende moléculas de ADN aisladas que codifican nuevas muteínas de CD40L humanas, y sus complementos. Las moléculas de ADN aisladas se seleccionan entre el grupo compuesto por un ADN que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEC ID Nº: 2, donde la cisteína en el aminoácido 194 se reemplaza por triptófano, y ADN que codifica un polipéptido que es un fragmento de la muteína que comprende triptófano en el aminoácido 194.

Los ADN que codifican fragmentos de una muteína de CD40L se seleccionan entre el grupo compuesto por péptidos que comprenden los aminoácidos 1 a 261, 35 a 261, 34 a 225, 113 a 261, 113 a 225, 120 a 261 o 120 a 225 de la SEC ID Nº: 2, donde la cisteína en el aminoácido correspondiente al aminoácido 194 de la SEC ID Nº: 2 se reemplaza por triptófano. También pueden prepararse ADN que hibridan con cualquiera de los ADN anteriores en condiciones rigurosas (hibridación en 6 X SSC a 63ºC durante una noche; lavando en 3 X SSC a 55ºC), y que codifican un péptido que se une a CD40 y en el que la cisteína en el aminoácido correspondiente al aminoácido 194 de la SEC ID Nº: 2 se reemplaza por triptófano.

La invención también proporciona nuevas muteínas CD40L codificadas por las moléculas de ADN de la invención. Las nuevas muteínas difieren de la CD40L humana nativa en que tienen una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEC ID Nº: 2, donde la cisteína en el aminoácido 194 se reemplaza por triptófano. Las nuevas muteínas incluyen fragmentos del dominio extracelular de CD40L que se unen a CD40 e incluyen triptófano en el aminoácido 194. Preferiblemente, los fragmentos se seleccionan entre el grupo compuesto por péptidos que comprenden los aminoácidos 1 a 261, 35 a 261, 34 a 225, 113 a 261, 113 a 225, 120 a 261 ó 120 a 225 de la SEC ID Nº: 2, más preferiblemente que comprenden los aminoácidos 113 a 261, en los que la cisteína en el aminoácido correspondiente al aminoácido 194 de la SEC ID Nº: 2 se reemplaza por triptófano.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 presenta la unión de CD40L trimérica humana y murina y la CD40L dimérica humana y murina a C40/Fc como se determina en un ensayo de biosensor.

La Figura 2 ilustra la unión de CD40 humana trimérica (Figura 2A) y dos preparaciones de CD40L humana monomérica (Figura 2B) a C40/Fc en un ensayo de biosensor.

Descripción detallada de la invención

Se aislaron y se secuenciaron nuevos polipéptidos que pueden actuar como ligandos para la CD40 murina y humana como se describe en el documento WO 93/08207. La presente invención prorporciona moléculas de ADN que codifican nuevas muteínas de CD40L humanas y sus complementos. Las moléculas de ADN aisladas se seleccionan entre el grupo compuesto por un ADN que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEC ID Nº: 2, donde la cisteína en el aminoácido 194 de la SEC ID Nº: 2 se reemplaza por triptófano y ADN que codifican fragmentos del mismo que comprende dicho triptófano en la posición 194 de la SEC ID Nº: 2.

CD40L es un ligando para CD40, un receptor que es un miembro de la superfamilia de receptores de TNF. CD40L de longitud completa es un polipéptido unido a la membrana con una región extracelular en su extremo C, una región transmembrana y una región intracelular en su extremo N. Puede obtenerse una versión soluble de CD40L a partir de la región extracelular o de un fragmento de la misma. La región extracelular de CD40L humana se extiende desde el aminoácido 47 al aminoácido 261 de la SEC ID Nº 1. La actividad biológica de CD40L está mediada por la unión a CD40 y comprende la proliferación de células B y la inducción de la secreción de inmunoglobulinas a partir de células B activadas.

La nueva muteína de CD40L descrita en este documento se obtuvo por mutación de secuencias de nucleótidos que codificaban para un polipéptido CD40L. Una muteína o análogo de CD40L, como se denomina en este documento, es un polipéptido sustancialmente homólogo a una CD40L nativa pero que tiene una secuencia de aminoácidos diferente de la secuencia nativa del polipéptido CD40L debido a una o una pluralidad de deleciones, inserciones o sustituciones. Pueden sintetizarse análogos de CD40L a partir de construcciones de ADN preparadas por síntesis de oligonucleótidos y unión o por técnicas de mutagénesis de localización dirigida.

Los especialistas en la técnica reconocerán que podrían realizarse mutaciones adicionales en un ADN que codifique CD40L que tenga un triptófano en el aminoácido 194. Generalmente, las sustituciones deben realizarse de forma conservativa; es decir, los aminoácidos sustitutos más preferidos son los que no afectan a la capacidad de las proteínas de la invención para unirse a sus receptores de una manera sustancialmente equivalente a la de la CD40L nativa. Los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen sustitución de aminoácidos fuera del dominio o los dominios de unión, y sustitución de aminoácidos que no alteran la estructura secundaria y/o terciaria de CD40L. Otros ejemplos incluyen la sustitución de un resto alifático por otro, tal como Ile, Val, Leu o Ala entre sí, o sustituciones de un resto polar por otro, tales como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn. Son bien conocidas otras sustituciones conservativas semejantes, por ejemplo, sustituciones de regiones enteras que tienen características de hidrofobia
similares.

De forma similar, cuando se adopta una estrategia de deleción o inserción, debe considerarse el efecto potencial de la deleción o inserción sobre la actividad biológica. Pueden construirse subunidades de las proteínas de la invención eliminando restos terminales o internos o secuencias para formar fragmentos. Se proporciona otra directriz en cuanto a los tipos de mutaciones que pueden realizarse mediante una comparación de la secuencia de CD40L con las secuencias y estructuras de otros miembros de la familia del TNF.

La estructura de aminoácidos primaria de la muteína de CD40L de la invención puede modificarse para crear derivados de CD40L formando conjugados covalentes o de agregación con otros restos químicos, tales como grupos glicosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares, o creando mutantes de secuencia de aminoácidos. Se preparan derivados covalentes de CD40L por la unión de grupos funcionales particulares a cadenas laterales de aminoácidos de CD40L o en el extremo N o C de una muteína de CD40L o su dominio extracelular.

Otros derivados de CD40L dentro del alcance de esta invención incluyen conjugados covalentes o de agregación de CD40L o sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos, tales como por síntesis en cultivo recombinante como fusiones N-terminales o C-terminales. Por ejemplo, el conjugado puede comprender una secuencia polipeptídica señal o líder en la región N-terminal o en la región C-terminal de un polipéptido CD40L que dirige co-traduccionalmente o post-traduccionalmente la transferencia de conjugado desde su sitio de síntesis a un sitio dentro o fuera de la membrana celular o de la pared celular (por ejemplo, el líder del factor \alpha de Sacchromyces).

Las fusiones del polipéptido CD40L pueden comprender polipéptidos añadidos para facilitar la purificación e identificación de CD40L (por ejemplo poly-His), o fusiones con otras citocinas para proporcionar nuevas entidades polifuncionales. otras citocinas incluye, por ejemplo, cualquiera de las interleucinas 1 a 13, TNF (factor de necrosis tumoral), GM-CFS (factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos), G-CSF (factor estimulador de colonias de granulocitos), MGF (factor de crecimiento de mastocitos), EGF (factor de crecimiento epidérmico), PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas), NGF (factor de crecimiento de nervios, EPO (eritropoyetina), \gamma-IFN (interferón gama), 4-1BB-L (ligando 4-1BB) y otras citocinas que afectan al crecimiento, diferenciación o función de células inmunes.

La actividad biológica de CD40L puede determinarse, por ejemplo, por la competición de unión al dominio de unión a ligandos de CD40 (es decir, ensayos de unión competitiva). En este documento se describen varios ensayos de unión útiles. Los especialistas en la técnica pueden aplicar fácilmente experimentación rutinaria para desarrollar ensayos de unión, usando la proteína CD40 aislada (es decir CD40/Fc) o células que expresan CD40.

CD40L también puede ensayarse midiendo la actividad biológica en un ensayo de proliferación de células B. Pueden obtenerse células B humanas a partir de amígdalas humanas por purificación mediante selección negativa y sedimentación de densidad de Percoll, como se describe por Defrance y col., J. Immunol. 139:1135, 1987. Pueden usarse líneas de células de linfoma de Burkitt para medir la proliferación celular en respuesta a CD40L. Los ejemplos de líneas celulares de linfoma de Burkitt incluyen, por ejemplo, Raji (ATCC CCL 86), Daudi (ATCC CCL 213) y Namalwa (ATCC CRL 1432).

Otro ensayo para determinar la actividad biológica de CD40L es medir la inmunoglobulina producida por células B en respuesta a la activación por CD40L o un derivado o análogo de la misma. La secreción de inmunoglobulinas policlonales puede medirse, por ejemplo, por incubación con 5 X 10^{5} células B/ml en cultivo durante al menos siete días. La producción de inmunoglobulinas (Ig) puede medirse por un ensayo ELISA tal como el descrito en Maliszewski y col., J. Immunol. 144:3028, 1990 [Maliszewski y col. I] o Maliszewski y col., Eur. J. Immunol. 20:1735, 1990 [Maliszewski y col. II].

Los polipéptidos CD40L pueden existir como oligómeros, tales como dímeros o trímeros. Los oligómeros se unen por medio de enlaces disulfuro formados entre restos de cisteína en diferentes polipéptidos CD40L. Como alternativa, se pueden unir dos dominios de CD40L solubles con una secuencia de engarce tal como las descritas en la patente de Estados Unidos 5.073.627. También pueden crearse polipéptidos CD40L por expresión de una proteína de fusión que comprende CD40L soluble (dominio extracelular) y una región Fc de una inmonoglobulina (por ejemplo SEC ID Nº: 4) para formar CD40L divalente. Las proteínas de fusión obtenidas tanto con la cadena pesada como con la cadena ligera de un anticuerpo formarán un oligómero CD40L con cuatro regiones extracelulares de CD40L. CD40L trimérica se prepara expresando un ADN que codifica una proteína de fusión que comprende un péptido que forma un trímero en solución (por ejemplo, una muteína de un "zipper de leucina" GCN4 de levadura (SEQ ID Nº: 5), o el dominio de trimerización de la proteína D surfactante pulmonar (SPD) (SEC ID Nº: 6; Hoppe, y col., FEBS Letters 344:191, 1994) seguido de la región extracelular de CD40L.

Pueden prepararse proteínas de fusión usando técnicas convencionales de corte enzimático y unión de fragmentos procedentes de las secuencias deseadas. Pueden usarse técnicas de PCR que empleen oligonucleótidos sintéticos para preparar y/o amplificar los fragmentos deseados. También pueden usarse oligonucleótidos sintéticos solapantes que representen las secuencias deseadas para preparar construcciones de ADN que codifiquen proteínas de fusión. Las proteínas de fusión también pueden comprender CD40L y dos o más secuencias adicionales, incluyendo una secuencia líder (o péptido señal), región de oligomerización (es decir, región Fc, resto zipper de leucina o resto zipper adecuado), secuencia de engarce y secuencias que codifican restos muy antigénicos que proporcionan un medio para facilitar la purificación o acelerar la detección de una proteína de fusión.

Los péptidos señal facilitan la secreción de las proteínas desde las células. Un péptido señal ilustrativo es los aminoácidos -26 a -1 de la SEC ID Nº: 8. El octapéptido Flag® (Hopp y col., Biol Technology 6:1204, 1988) no altera la actividad biológica de las proteínas de fusión, es muy antigénico y proporciona un epítopo unido reversiblemente por un anticuerpo monoclonal específico, que permite la rápida detección y la fácil purificación de la proteína de fusión expresada. La secuencia Flagg® también se escinde específicamente por la enteroquinasa de la mucosa bovina en el resto que sigue inmediatamente al par Asp-Lys, las proteínas de fusión protegidas con este péptido también pueden ser resistentes a la degradación intracelular en E. coli. Se ha depositado un anticuerpo monoclonal murino que se une a la secuencia Flag® en la ATCC con el número de acceso HB9259; en la patente de Estados Unidos 5.011.912 se describen procedimientos para usar el anticuerpo en la purificación de proteínas de fusión que comprenden la secuencia
Flag®.

Las regiones Fc adecuadas se definen como regiones Fc que pueden unirse a la proteína A o a la proteína G o, como alternativa, se reconocen por un anticuerpo que puede usarse en la purificación o detección de una proteína de fusión que comprende la región Fc. Las regiones Fc preferibles incluyen la región Fc de la IgG_{1} humana o de la IgG_{1} murina. Un ejemplo es la región Fc de la IgG_{1} humana mostrada en la SEC ID Nº: 4. También pueden usarse fragmentos de una región Fc adecuada, por ejemplo una región Fc de la IgG_{1} humana a partir de la cual se ha delecionado una secuencia de aminoácidos responsable de la unión a la proteína A, de tal forma que el fragmento se una a la proteína G pero no a la proteína A.

También puede usarse una secuencia de engarce que separe la región extracelular de CD40L del resto de oligomerización a una distancia suficiente para asegurar que la CD40L se pliega de forma apropiada en sus estructuras secundaria y terciaria. Las secuencias de engarce adecuadas (1) adoptarán una conformación extendida flexible, (2) no presentarán una tendencia a desarrollar una estructura secundaria ordenada que podría interaccionar con los dominios funcionales de las proteínas de fusión y (3) tendrán un carácter hidrófobo o cargado mínimo que podría promover la interacción con los dominios de la proteína funcional. Los aminoácidos superficiales típicos en las regiones proteicas flexibles incluyen Gly, Asn y Ser. Sería de esperar que prácticamente cualquier permutación de secuencias de aminoácidos que contienen Gly, Adn y Ser cumplieran los criterios anteriores para una secuencia de engarce. En las secuencias de engarce también pueden usarse otros aminoácidos casi neutros tales como Thr y Ala. La longitud de la secuencia de engarce puede variar sin afectar significativamente a la actividad biológica de la proteína de fusión. Las secuencias de engarce son innecesarias cuando las proteínas a fusionar tienen regiones de aminoácidos N o C terminales no esenciales que pueden usarse para separar los dominios funcionales y prevenir la interferencia
estérica.

Pueden prepararse construcciones de ADN que codifiquen diversas adiciones o sustituciones de restos o secuencias de aminoácidos, o deleciones de restos o secuencias terminales o internas no necesarias para la actividad biológica o la unión. Por ejemplo, el sitio de N-glicosilación extracelular de CD40L puede modificarse para impedir la glicosilación mientras que permite la expresión de un análogo de carbohidrato reducido homogéneo usando sistemas de expresión de levadura. Los sitios de N-glicosilación en los polipéptidos eucarióticos se caracterizan por un triplete de aminoácidos Asn-X-Y, donde X es cualquier aminoácido excepto Pro e Y es Ser o Thr. Las modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica este triplete darán como resultado sustituciones, adiciones o deleciones que prevengan la unión de restos de carbohidrato en la cadena lateral de Asn.

Otras estrategias para la mutagénesis implican la modificación de secuencias que codifican restos aminoacídicos dibásicos para potenciar la expresión en sistemas de levadura en los que está presente la actividad proteasa KEX2. Pueden construirse subunidades de un polipéptido CD40L delecionando secuencias que codifiquen restos o secuencias terminales o internas. Además, pueden realizarse otros análisis para ayudar al especialista en la técnica a seleccionar sitios de mutagénesis. Por ejemplo, el documento WO93/08207 describe procedimientos para seleccionar agonistas y antagonistas de ligandos.

La secuencia de ADNc de CD40L murina se obtuvo por técnicas de expresión directa; la secuencia de CD40L humana se obtuvo por técnicas de hibridación de especies cruzadas usando el ADNc de CD40L murina como sonda. Ambas técnicas se describen en el documento WO 93/08207. En resumen, la región extracelular de CD40 humana (el receptor; SEC ID Nº: 3) se clonó por técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores basados en una secuencia publicada en Stamenkovic y col. Se obtuvo una proteína de fusión CD40/Fc por técnicas de PCR fusionando ADN que codificaba el dominio extracelular de CD40 con ADN que codificaba el dominio Fc de la IgG 1 humana (SEC ID Nº: 4). Las proteínas CD40 solubles purificadas pudieron antagonizar las actividades biológicas mediadas por CD40L.

Se preparó una biblioteca de ADNc a partir de una línea de células EL4 clasificada por FACS (clasificación de células activada por fluorescencia) basándose en la unión de un proteína de fusión CD40/Fc biotinilada. Las células se clasificaron cinco veces hasta que hubo un cambio significativo en la intensidad de fluorescencia basándose en la expresión de un ligando para CD40 por las células L-4 clasificadas. En resumen, se sintetizó ADNc, se insertó en un vector pDC406 vacío y se utilizó para transformar E. coli. Los transformantes se reunieron y el ADN de los grupos se aisló y se utilizó para transfectar células CV1-EBNA para crear una biblioteca de clonación de expresión. Las células CV1-EBNA transfectadas se cultivaron en portaobjetos para permitir la expresión transitoria de CD40L. Los portaobjetos se seleccionaron con CD40-Fc radioyodado, y se examinaron para identificar las células que expresaban CD40L determinando la presencia de granos de plata autoradiográficos frente a un ligero efecto de fondo.

Se aisló y se secuenció un solo clon por técnicas convencionales, para proporcionar la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos deducida de CD40L murina. El ADNc de CD40L homólogo humano se encontró por técnicas de hibridación de especies cruzadas. En resumen, se obtuvo una biblioteca de ADNc de linfocitos de sangre periférica humana (PBL) a partir de linfocitos de sangre periférica activados. Se construyó una sonda murina que correspondía a la región codificante de CD40L murina desde el nucleótido 13 al nucleótido 793 de CD40L murina. Usando técnicas convencionales para hibridaciones de especies cruzadas, se usó la sonda para identificar un clon que expresaba CD40L humana. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de CD40L humana se muestran en la SEC ID Nº: 1 y 2.

Los vectores de expresión recombinantes para la expresión de CD40L por técnicas de ADN recombinante incluyen una secuencia de ADN de CD40L que comprende un fragmento de ADN sintético o derivado de ADNc que codifica un polipéptido CD40L, unido operativamente a una secuencia de nucleótidos reguladora de la trascripción o la traducción adecuada, tal como la derivada de un gen de mamífero, microbiano, vírico o de insecto. Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen secuencias que tienen un papel regulador en la expresión génica (por ejemplo, un promotor o potenciador de la trascripción), opcionalmente una secuencia operadora para controlar la trascripción, una secuencia que codifica un sitio de unión a ribosomas de ARNm, y secuencias apropiadas que controlan el inicio y la terminación de la trascripción y la traducción.

Las secuencias de nucleótidos están unidas operativamente cuando la secuencia reguladora está relacionada funcionalmente con la secuencia de ADN de CD40L. De esta manera, una secuencia de nucleótidos promotora está unida operativamente a una secuencia de ADN de CD40L si la secuencia de nucleótidos del promotor controla la trascripción de la secuencia de ADN de CD40L. Además, un sitio de unión a ribosomas puede estar unido operativamente a una secuencia para un polipéptido CD40L si el sitio de unión a ribosomas está colocado dentro del vector para inducir la traducción. Además, pueden incorporarse secuencias que codifican péptido señal en vectores de expresión. Por ejemplo, una secuencia de ADN para un péptido señal (líder secretor) puede estar unida operativamente a una secuencia de ADN de CD40L.

Las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos CD40L incluyen procariotas, levaduras o células eucarióticas superirores. Los procariotas incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, E. coli o bacili. Las células huésped procarióticas adecuadas para la transformación incluyen, por ejemplo, e. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y diversas especies distintas dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus. Las células eucarióticas superirores incluyen líneas de células de mamífero establecidas. También puede emplearse sistemas de traducción sin células para producir polipéptidos CD40L usando ARN derivados de construcciones de ADN descritas en este documento. En Pouwels y col. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, (1985) se describen vectores de clonación y expresión apropiados para uso con huéspedes celulares bacterianos, fúngicos, de levadura y de mamífero.

Los vectores de expresión que llevan la secuencia de ADN de CD40L recombinante se utilizan para transfectar o transformar un cultivo sustancialmente homogéneo de un microorganismo huésped adecuado o una línea de células de mamífero. Las células huésped transformadas son células que se han transformado o transfectado en secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos CD40L y expresan polipéptidos CD40L. Los polipéptidos CD40L expresados se localizarán dentro de la célula huésped y/o se secretarán al fluido sobrenadante de cultivo, dependiendo de la naturaleza de la célula huésped y de la construcción génica insertada en la célula huésped.

Los vectores de expresión transfectados en células huésped procarióticas generalmente comprenden uno o más marcadores selectivos fenotípicos. Un marcador selectivo fenotípico es, por ejemplo, un gen que codifica una proteína que confiere resistencia a antibióticos o que proporciona un requisito autotrófico, de un origen de replicación reconocido por el huésped para asegurar la amplificación dentro del huésped. Otros vectores de expresión útiles para las células huésped procarióticas incluyen un marcador selectivo de origen bacteriano derivado de plásmidos disponibles en el mercado. Este marcador selectivo puede comprender elementos genéticos del vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). pBR322 contiene genes para resistencia a ampicilina y tretraciclina y, de esta manera, proporciona una forma sencilla para identificar células transformadas. Las secciones de "esqueleto" de pBR322 se combinan con un promotor apropiado y una secuencia de ADN de CD40L. Otros vectores disponibles en el mercado incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, Estados Unidos).

Normalmente se usan secuencias promotoras para vectores de expresión de células huésped procarióticas recombinantes. Las secuencias promotoras comunes incluyen \beta-lactamasa (penicilinasa), sistema promotor de lactosa (Change y col., Nature 275:615, 1978; y Goeddel y col., Nature 281:544, 1979), sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel y col., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; y EP-A-36776) y promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982). Un sistema de expresión de células huésped procarióticas particularmente útil emplea un promotor P_{L} del fago \lambda y una secuencia represora termolábil cI857ts. Los vectores plasmídicos disponibles en la American Type Culture Collection que incorporan derivados del promotor \lambda P_{L} incluyen el plásmido pHUB2 (residente en la cepa de E. coli JMB9 (ATCC 37092)) y pPLc28 (residente en E. coli RR1 (ATCC 53082)).

CD40L puede expresarse en células huésped de levadura, preferiblemente del género Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae). También pueden emplearse otros géneros de levadura, tales como Pichia o Kluyveromyces. Los vectores de levadura a menudo contendrán una secuencia de origen de replicación de un plásmido de levadura 2\mu, una secuencia de replicación autónoma (ARS), una región promotora, secuencias para la poliadenilazión, y secuencias para la terminación de la trascripción. Preferiblemente, los vectores de levadura incluyen un origen de una secuencia de replicación y un marcador selectivo. Las secuencias promotoras adecuadas para vectores de levadura incluyen promotores para metalotioneina, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y col., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; y Holland y col., Biochem. 17:4900, 1978), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa. En Hitzeman, EPA-73,657 también se describen otros vectores y promotores adecuados para uso en la expresión de levaduras.

También podrían emplearse sistemas de cultivo de células huésped de mamífero e insecto para expresar polipéptidos CD40L recombinantes. Los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero adecuadas incluyen la línea COS-7 de células renales de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman y col., Cell 23:175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, y líneas de células BHK (ATCC CRL 10). Los vectores de expresión de mamífero adecuados incluyen elementos no transcritos tales como un origen de replicación, una secuencia promotora, un potenciador asociado al gen estructural, otras secuencias flanqueantes 5' o 3' no transcritas, tales como sitios de unión a ribosomas, un sitio de poliadenilación, sitios donadores y aceptores de ayuste, y secuencias de terminación de la trascripción.

Las secuencias de control de la trascripción y la traducción para vectores de expresión de células huésped de mamífero pueden escindirse a partir de genomas virales. Por ejemplo, secuencias promotoras de células de mamífero y secuencias potenciadoras usadas comúnmente proceden del virus de polioma, adenovirus 2, virus de simio 40 (SV40) y citomegalovirus humano. Pueden usarse secuencias de ADN procedentes del genoma viral de SV40, por ejemplo, el origen de SV40, el promotor temprano y tardío, potenciador, ayuste y sitios de poliadenilación, para proporcionar los otros elementos genéticos requeridos para la expresión de una secuencia de un gen estructural en una célula huésped de mamífero. Los promotores virales tempranos y tardíos son particularmente útiles porque se obtienen fácilmente a partir de un genoma viral como un fragmento que también puede contener un origen de replicación viral (Fiers y col., Nature 273:113, 1978). También pueden usarse fragmentos de SV40 más pequeños o más grandes, siempre que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio HindIII hacia el sitio BgI localizada en el origen de replicación viral de SV40.

Pueden construirse vectores de expresión de mamífero ilustrativos como se describe por Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3.280, 1983). Un vector de expresión útil, PMLSV N1/N4, descrito por Cosman y col., Nature 312:768, 1984 se ha depositado como ATCC 39890. En el documento EP-A-0367566 y en la solicitud de patente de Estados Unidos con el número de serie 07/701.415, presentada el 16 de mayo de 1991 se describen otros vectores de expresión de mamífero útiles. Para la expresión de una región extracelular de proteína de tipo II, tal como CD40L, debe añadirse una secuencia señal heteróloga, tal como la secuencia señal para la interleucina-7 (IL-7) descrita en la patente de Estados Unidos 4.965.195, o la secuencia señal para el receptor de interleucina-2 descrita en la solicitud de patente de Estados Unidos 06/626.667 presentada el 2 de julio de 1984.

Purificación de polipéptidos CD40L recombinantes

Pueden prepararse polipéptidos CD40L cultivando células huésped transformadas en condiciones de cultivo necesarias para expresar los polipéptidos CD40L. Después, los polipéptidos expresados resultantes pueden purificarse a partir del medio de cultivo o los extractos celulares. Si se desea, puede concentrarse un polipéptido CD40L usando un filtro de concentración de proteínas disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Millipore Pellicon o Amicon. Después de la etapa de concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación tal como un medio de filtración en gel. Como alternativa, puede emplearse una resina de intercambio aniónico por ejemplo, una matriz o sustrato que tenga grupos dietilaminoetilo (DEAE) colgantes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos empleados comúnmente en la purificación de proteínas. Como alternativa, puede emplearse una etapa de intercambio de cationes. Los intercambiadores de cationes adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren los grupos
sulfopropilo.

Finalmente, pueden emplearse una o más etapas de cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) empleando medios de RP-HPLC hidrófobos (por ejemplo, gel de sílice que tiene grupos metilo u otros grupos alifáticos colgantes) para purificar adicionalmente CD40L. También pueden emplearse algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones, para proporcionar una proteína recombinante sustancialmente homogénea.

También es posible utilizar una columna de afinidad que comprenda un dominio de unión a un ligando de CD40 para purificar por afinidad polipéptidos CD40L expresados. Los polipéptidos CD40L pueden retirarse de la columna de afinidad en un tampón de elución de alto contenido de sal y después dializarse en un tampón de menor contenido de sal para uso.

La proteína recombinante producida en el cultivo bacteriano normalmente se aísla por una ruptura inicial de las células huésped, centrifugación, extracción a partir de los sedimentos celulares si es un polipéptido insoluble, o a partir del fluido sobrenadante si es un polipéptido soluble, seguido de una o más etapas de concentración, desplazamiento salino, intercambio iónico, purificación por afinidad o cromatografía de exclusión molecular. Finalmente, puede emplearse RP-HPLC para las etapas de purificación finales. Las células microbianas pueden romperse por cualquier procedimiento conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, ruptura mecánica o uso de agentes de lisado de células.

Preferiblemente se emplean células huésped de levadura transformadas para expresar CD40L como un polipéptido secretado. Esto simplifica la purificación. El polipéptido recombinante secretado a partir de una fermentación de células huésped de levadura puede purificarse por procedimientos análogos a los descritos por Urdal y col. (J. Cromatog. 296:171, 1984). Urdal y col. describe dos etapas de HPLC de fase inversa secuenciales para la purificación de IL-2 humana recombinante en una columna de HPLC preparativa.

Administración de composiciones de CD40L

La presente invención proporciona composiciones terapéuticas que comprenden una cantidad eficaz de la muteína de CD40L en un diluyente o vehículo adecuado y procedimientos para tratar mamíferos usando las composiciones. Para uso terapéutico, la muteína de CD40L purificada se administra a un paciente, preferiblemente un ser humano, para tratamiento de una manera apropiada a la indicación. De esta manera, por ejemplo, las composiciones farmacéuticas de muteína de CD40L (por ejemplo, en forma de una muteína de CD40L soluble que comprende un triptófano en el aminoácido 194) que se administra para conseguir un efecto terapéutico deseado puede administrarse por inyección en embolada, infusión continua, liberación sostenida desde implantes u otra técnica
adecuada.

Típicamente, un agente terapéutico de muteína de CD40L se administrará en forma de una composición farmacéutica que comprende muteína de CD40L purificada junto con vehículos, excipientes o diluyentes fisiológicamente aceptables. Tales vehículos no serán tóxicos para los pacientes a las dosificaciones y concentraciones empleadas. Habitualmente, la preparación de tales composiciones incluye la combinación de una muteína de CD40L con tampones, antioxidantes tales como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 restos), proteínas, aminoácidos, carbohidratos incluyendo glucosa, sacarosa o dextranos, agentes quelantes tales como EDTA, glutation y otros estabilizadores y excipientes. Son diluyentes apropiados ilustrativos solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con albúmina de suero no específico.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar realizaciones particulares y no limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1

Este ejemplo describe dos ensayos de unión en fase sólida, el primero de los cuales (a) puede usarse para evaluar la capacidad de CD40L trimérico para unirse a CD40, y el segundo de los cuales, (b), se usa para detectar la presencia de CD40L.

(a) ELISA de CD40L cuantitativo

Se prepara CD40/Fc y se purifica como se describe en el documento WO 93/08207, y se usa para recubrir placas de 96 pocillos (placas ELISA Coming EasyWash, Corning, NY, Estados Unidos). Las placas se recubren con 2,5 \mug/pocillo de CD40/Fc en PBS durante una noche a 4ºC y se bloquean con leche desnatada al 1% en PBS durante una hora a temperatura ambiente. Las muestras a ensayar se diluyen en suero de cabra normal al 10% en PBS, y se añaden 50 \mul por pocillo. Se realiza por duplicado una titulación de muestras desconocidas, y también se realiza una titulación del patrón de referencia de CD40L para generar una curva patrón. Las placas se incuban con las muestras y los controles durante 45 minutos a temperatura ambiente, y después se lavan cuatro veces con PBS. Se añade reactivo de segunda etapa, anti-zipper de oligomerización de conejo, (50 \mul/pocillo, concentración de aproximadamente 2,5 \mug/ml) y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 45 minutos. Las placas se lavan de nuevo como se ha descrito previamente y se añade F(ab')2 de cabra anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (Tago, Burlingame, CA, Estados Unidos). Las placas se incuban durante 45 minutos a temperatura ambiente, se lavan como se describe, y la presencia de CD40L se detecta por la adición de cromógeno, tetrametilbencileno (TMB; 100 \mul/pocillo) durante 15 minutos a temperatura ambiente. La reacción cromogénica se detiene por la adición de 100 \mul/pocillo de H_{2}SO_{4} 2 N, y se determina la DO_{450}-DO_{562} de los pocillos. La cantidad de CD40L trimérica puede determinarse comparando los valores de DO obtenidos con las muestras desconocidas con los valores generados para la curva patrón. Los valores se expresan como el número de unidades de unión por ml. Una unidad de unión es aproximadamente un ng de proteína estimado usando una proteína de fusión Fc purificada del ligando como patrón. De esta manera, se ha determinado la concentración y actividad específica de varios lotes diferentes de CD40L trimérica.

(b) Transferencia por puntos cualitativa

Se adsorbe trímero CD40L (1 \mul de sobrenadante bruto o de fracciones de columna) en membranas de nitrocelulosa BA85/21 secas (Schleicher y Schuell, Keene, NH) y se deja secar. Las membranas se incuban en placas de cultivo de tejido durante una hora en solución salina (0,15 M) tamponada con Tris (0,05 M), pH 7,5, que contenía BSA al 1% p/v para bloquear los sitios de unión no específicos. Después de este período de tiempo, las membranas se lavan tres veces en PBS y se añade anticuerpo de conejo anti-zipper de oligomerización a una concentración aproximada de 10 \mug/ml en PBS que contenía BSA al 1%, después de lo cual las membranas se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas se lavan de nuevo como se describe y se añade un anticuerpo marcado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (tal como IgG de cabra anti-conejo; Southern Biotech, Brirmingham, AL) a una dilución aproximada de 1:1000 en PBS que contenía BSA al 1%. Después de incubar durante una hora a temperatura ambiente, las membranas se lavan y se añade cromógeno (es decir reactivo de 4-cloronaftol, Kirkegard y Perry, Gaithersburg, MD). Se deja desarrollar el color durante 10 minutos a temperatura ambiente y la reacción se detiene aclarando las membranas con agua. Las membranas se lavan y la presencia de CD40L se determina analizando la presencia de un color azul oscuro. Este ensayo se usó para determinar la presencia o ausencia de CD40L trimérica en fluidos de sobrenadante de cultivo y en fracciones de columnas de purificación. El ensayo también proporciona un procedimiento semicuantitativo para determinar cantidades relativas de CD40L trimérica comparando la intensidad del color en muestras desconocidas con la intensidad de cantidades conocidas de controles.

Ejemplo 2

Este ejemplo describe la construcción de una construcción de ADN de CD40L humana para expresar CD40L trimérica en células de ovario de hámster chino (CHO). CD40L trimérica contiene una secuencia líder, una secuencia de 33 aminoácidos denominada zipper de oligomerización (SEC ID Nº: 5), seguida de la región extracelular de CD40L humana desde el aminoácido 51 al aminoácido 261 (SEC ID Nº: 1). La construcción se preparó cortando el ADN apropiado de un plásmido que contenía CD40L humana y uniendo el ADN al vector de expresión pCAVDHFR. La construcción resultante se denominó CAV/DHFR-CD40LT. pCAVDHFR. pCAVDHFR incluye secuencias reguladoras procedentes de citomegalovirus, y adenovirus 2, junto con el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR), y permite la integración aleatoria de un gen deseado en cromosomas de la célula huésped. La expresión de DHFR permite que las células huésped DHFR- crezcan en medio que carece de glicina, hipoxantina y timidina (GHT). También se obtuvo una construcción similar para la expresión del trímero CD40L murino en células CHO. Además de las secuencias líder y zipper de oligomerización, la construcción murina también contenía una secuencia que codificaba el octapéptido denominado Flag® (descrito previamente) entre el dominio de trimerización ("zipper de leucina" o zipper de oligomerización) y la región extracelular de CD40L murina. La secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de los ADN que codifican CD40L humana se muestran en la SEC ID Nº: 7 y 8 respectivamente. Pueden prepararse construcciones adicionales usando procedimientos convencionales. Por ejemplo, para preparar construcciones para la expresión de CD40L en células CHO también son útiles vectores que incorporan promotores duales tales como los descritos en la patente de Estados Unidos 4.656.134 o vectores que emplean secuencias potenciadoras tales como las descritas en la patente de Estados Unidos 4.937.190 o en Kaufman y col., Nucl. Acids Res.
19:4485, 1991.

El producto de unión resultante se utilizó para transfectar células CHO usando el reactivo Lipofectin® o el reactivo Lipofectamine™(Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Ambos son reactivos disponibles en el mercado usados para formar complejos de lípido-ácido nucleico o liposomas que, cuando se aplican a las células cultivadas, facilitan la absorción del ácido nucleico en las células. Las células que se transfectaron con la construcción pCAVDHFR-CD40LT se seleccionaron en medio DMEM:F12 en ausencia de GHT. Las células que pudieron crecer en ausencia de GHT se ensayaron con respecto a la producción de CD40L usando un ensayo de unión en fase sólida como el descrito en el ejemplo 16. Los resultados indicaron que en este sistema de transfección, el reactivo Lipofectamine™ proporcionó mayores proporciones de transfección satisfactoria.

Se seleccionaron aproximadamente 160 clones y se identificaron dos clones positivos y se expandieron para un estudio adicional. Las células se pasaron en medio DMEM:F12 sin GHT y se controló su estabilidad evaluando la producción de CD40L trimérico en el ensayo de unión en fase sólida descrito anteriormente. Basándose en
estos resultados, se eligió un clon que parecía estar transfectado de forma estable con el ADN de CD40L, y que producía y secretaba aproximadamente 1\mug/10^{6} células/día de trímero de CD40L. Pueden usarse otras construcciones que comprenden otros vectores y todo o parte de las secuencias de ADN descritas en este ejemplo para
preparar líneas de células transfectadas de forma estable adicionales, sustancialmente como se describe en este
documento.

Una vez identificadas las células transfectadas de forma estable, se dejaron crecer cultivos a gran escala de células transfectadas para acumular el sobrenadante que contenía CD40L trimérico. Las condiciones de cultivo a gran escala adecuadas incluyen el uso de bio-reactores. Se siguieron procedimientos similares para producir líneas de células CHO que secretaban una CD40L murina trimérica a aproximadamente 0,05 \mug/10^{6} células/día. Las células CHO transfectadas de forma estable con la construcción de CD40L humana o murina, que tienen adquirido un gen DHFR del plásmido pCAVDHFR, son resistentes a metotrexato. El metotrexato puede añadirse al medio de cultivo para amplificar varias copias del ADN del trímero de CD40L para aumentar la producción del trímero
de CD40L.

Ejemplo 3

Este ejemplo ilustra las afinidades de unión de varias construcciones de CD40L diferentes. Se realizaron experimentos de afinidad por análisis de interacción bioespecífica (BIA) usando un biosensor, un instrumento que combina un mecanismo de reconocimiento biológico con un dispositivo de detección o transductor. Un biosensor ilustrativo es BIAcore™, de Pharmacia Biosensor AB (Uppsala, Suecia; véase Fägerstam L.G., Techniques in Protein Chemistry II, ed. J.J. Villafranca, Acad. Press, NY, 1991). BIAcore™ usa la resonancia de plasmón de superficie de fenómeno óptica (Kretschmann y Raether, Z Naturforschung, Teil. A 23:2135, 1968) para controlar la interacción de dos moléculas biológicas. Los pares de moléculas que tienen constantes de afinidad en el intervalo de 10^{5} a 10^{10} M^{-1} y constantes de la velocidad de asociación en el intervalo de 10^{3} a 10^{6} M^{-1}s^{-1} son adecuados para la caracterización con
BIAcore™.

Los chips biosensores se recubrieron con Fc de cabra anti-IgG_{1} humana, que se usó para unir CD40/Fc al chip. Después se añadieron las diferentes construcciones de CD40L a concentraciones crecientes; el chip se regeneró entre las diferentes construcciones por la adición de hidróxido sódico. Se realizaron dos experimentos distintos. En el primero, se compararon la unión de una CD40L dimérica humana (CD40/Fc), CD40L trimérica humana (CD40L/"zipper de leucina") y CD40L dimérica y trimérica murina (preparadas sustancialmente como se describe para la CD40 humana). En el segundo experimento, la unión de la CD40L trimérica humana se comparó con la unión de dos preparaciones diferentes de CD40L monomérica humana (que comprendía únicamente la porción del dominio extracelular más homóloga al TNF). Los datos resultantes se analizaron para determinar las constantes de afinidad y de velocidad de asociación de las diferentes construcciones de CD40L. Los resultados se muestran en la Tabla 1 presentada a continuación y en las Figuras 1 y 2.

TABLA 1

:Unión de CD40L a CD40L/Fc
	Sitio 1 (mol/mol	K_{1}(M^{-1})	Sitio 2 (mol/mol	K_{2}(M^{-1})
	CD40/Fc)		CD40/Fc)
Trímero
Humano	0,04\pm0,02	5\pm3 x 10^{9}	0,68\pm0,07	7,5\pm2,5 x 10^{7}
Dímero
Humano	0,013\pm0,002	1,6\pm0,7 x 10^{11}	0,049\pm0,004	7,0\pm2,1 x 10^{8}
Trímero
Murino	0,02\pm0,003	6\pm3 x 10^{10}	0,44\pm0,02	1,6\pm0,2 x 10^{8}

TABLA 1 (continuación)

:Unión de CD40L a CD40L/Fc
	Sitio 1 (mol/mol	K_{1}(M^{-1})	Sitio 2 (mol/mol	K_{2}(M^{-1})
	CD40/Fc)		CD40/Fc)
Dímero
Murino	0,05\pm0,02	7\pm4 x 10^{9}	0,14\pm0,23	4,0\pm1,0 x 10^{7}
Trímero
Humano	0,26	6,6 x 10^{8}	0,41	2,6 x 10^{7}
Monómero		No
Nº 1	No detectado	detectado	1,20	4,6 x 10^{7}
Monómero		No
Nº 2	No detectado	detectado	1,27	1,1 x 10^{7}

El análisis de los datos indicó que un monómero de CD40L que comprendía únicamente la porción del dominio extracelular más homóloga a TNF era capaz de unirse a CD40L, aunque con una afinidad algo menor que la CD40L oligomérica. Un análisis de la relación de unión en el segundo experimento demostró que hay dos veces más unidades monoméricas de CD40L unidas por molécula de CD40/Fc que unidades triméricas de CD40L, confirmando que dos monómeros de CD40L se unen a un dímero de CD40/Fc y una CD40L trimérica se une a un dímero de CD40/Fc.

Ejemplo 4

Este ejemplo ilustra la preparación de varias muteínas de una proteína de fusión de ligando de CD40/dominio zipper. Se generaron mutaciones para construcciones a expresar en levaduras (mutantes 14, 18, 32, 41, 43, 10PP y 18PP) por una incorporación errónea por PCR (Mulrad y col Yeast 8:79, 1992) y se seleccionaron basándose en el aparente aumento de secreción como mutantes de secreción mejorada. Los mutantes 14, 18, 32, 41 y 43 se aislaron en S. cerevisiae. Los mutantes 10PP y 18PP se aislaron en P. pastoris. También se prepararon mutaciones para construcciones a expresar en células de mamífero (FL194.W, 194.W, LZ12V, 215.T, 255.F y 194.S) usando PCR y fueron el resultado de la mutagénesis de localización dirigida o fueron el producto aleatorio de PCR. En la Tabla 2 presentada a continuación se muestran los tipos de mutaciones obtenidas y su efecto sobre la actividad (capacidad de unir CD40 en un ensayo de unión en fase sólida sustancialmente como se describe en el Ejemplo 1).

TABLA 2

2

3

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}[t]{140mm}a: Las mutaciones se proporcionan
como el resto presente en el péptido nativo, el número del resto y
el resto presente en la muteína. Los números de restos para las
mutaciones del dominio zipper se refieren a la SEC ID Nº:
5.\end{minipage} \cr  b: Los números de restos para las
mutaciones en el dominio de CD40L son con respecto a la SEC ID Nº:
1.\cr   \begin{minipage}[t]{140mm}c: El mutante 10PP también
contenía mutaciones en regiones distintas del dominio de CD40L o el
dominio zipper (T-4S, D-2P, con
respecto a la SEC ID Nº: 7).\end{minipage} \cr  d: No
aplicable.\cr  e: No
realizado\cr}

El mutante 18PP sólo tenía una mutación en la molécula, que fue suficiente para afectar a la secreción en levadura. El mutante 41 tenía dos mutaciones, siendo las dos en los restos de isoleucina del domino zipper. Las mutaciones en el zipper mejoran la secreción desde levadura sin un efecto aparente sobre la actividad. El mutante 194.W se expresó en células de levadura y se purificó por una combinación de etapas de cromatografía de intercambio iónico (194.W (c)) o por cromatografía de afinidad (194.W (a)) usando un anticuerpo monoclonal que se une al resto del zipper de oligomerización. El mutante expresado en levaduras (194.W) presentó una mayor afinidad por CD40 en un ensayo de biosensor realizado sustancialmente como se describe en el Ejemplo 3 y presentó una mayor actividad biológica que la proteína de fusión del ligando CD40 de tipo silvestre/dominio zipper (WT) expresada en levadura, en un ensayo de proliferación de células B. Estos resultados se muestran en la Tabla 3.

TABLA 3

4

\hskip0,5cm a: Una unidad (U) es la concentración que induce la proliferación semimáxima.

\hskip0,5cm b: Promedio de dos preparaciones independientes.

\hskip0,5cm c: No realizado

\hskip0,5cm d: Promedio de dos ensayos.

Además, FL194W expresado en células de mamífero también demostró una mayor unión que WT CD40L en un análisis de transferencia de western semicuantitativo.

Se prepararon construcciones adicionales sustituyendo el dominio de trimerización de la proteína D tensioactivo pulmonar (SPD) (SEC ID Nº: 6; Hoppe, y col., FEBS Letters 344:191, 1994) en lugar del zipper formador del trímero de la SEC ID Nº: 5. Esta construcción se expresa en S. cerevlsiae y en células de mamífero a bajos niveles. La actividad se determina como se ha descrito previamente; también pueden prepararse diversos mutantes basados en tales construcciones para optimizar la secreción u otras características del producto como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 5

Este ejemplo ilustra las afinidades de unión de varias construcciones de CD40L diferentes. Se realizaron experimentos de afinidad por análisis de interacción bioespecífica (BIA), sustancialmente como se describe en el Ejemplo 3, usando dos de las construcciones descritas en el Ejemplo 4. Los resultados presentados en la Tabla 4 representan los valores medio obtenidos para dos preparaciones diferentes de CD40LT de tipo silvestre (WT), y tres preparaciones diferentes de muteína (194.W). Los resultados se muestran a continuación.

TABLA 4

5

Estos resultados confirman que CD40LT 194.W tiene una mayor afinidad por CD40/Fc que CD40LT de tipo silvestre.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: IMMUNEX CORPORATION

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NUEVA MUTEÍNA DE CD40L

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 8

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: IMMUNEX CORPORATION

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CALLE: 51 UNIVERSITY STREET

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CIUDAD: SEATTLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): ESTADO: WASHINGTON

\vskip0.333000\baselineskip

(E): PAÍS: ESTADOS UNIDOS

\vskip0.333000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 98101

\vskip0.666000\baselineskip

(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.333000\baselineskip

(B): ORDENADOR: Apple Macintosh

\vskip0.333000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: Sistema operativo Apple 7.5.3

\vskip0.333000\baselineskip

(D): SOFTWARE: Microsoft Word para Apple, versión 6.0.1a

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 06 de junio de 1996

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: USSN 08/477,733

\vskip0.333000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 07 de junio de 1995

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: USSN 08/484,624

\vskip0.333000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 07 de junio de 1995

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.666000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE: Perkins, Patricia Anne

\vskip0.333000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 34.693

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 2802-DWO

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TELÉFONO: 2065870430

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TELEFAX: 2062330644

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 840 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: CD40L

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 46..831

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 261 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: amino ácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

8

80

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 519 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: HUMANO

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: REGIÓN EXTRECELULAR CD40

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 740 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: HUMANO

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: Fc IgG1

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile}

\sac{Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu}

\sac{Arg}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: no relevante

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Asp Val Ala Ser Leu Arg Gln Gln Val Glu Ala Leu Gln Gly Gln}

\sac{Val Gln His Leu Gln Ala Ala Phe Ser Gln Tyr}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 929 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: trímero del CD40L humana

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sig_péptido

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 65..142

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 65..886

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: mat_péptido

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 143..886

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGAGCGAGTC CGCATCGACG GATCGAAAA CCTCTCCGAG GTACCTATCC CGGGGATCCC

\hfill

60

11

12

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 273 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

Claims

1. Un ADN aislado que codifica una muteína de CD40L, seleccionado entre el grupo compuesto por:

(a) un ADN que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como la presentada en la SEC ID Nº: 2 donde una cisteína en el aminoácido 194 se ha reemplazado por triptófano y

(b) un ADN que codifica un polipéptido que es un fragmento de la muteína (a) que comprende triptófano en el aminoácido 194, uniéndose dicho polipéptido a CD40.

2. El ADN aislado de la reivindicación 1 que codifica un polipéptido seleccionado entre el grupo compuesto por polipéptidos que comprenden los aminoácidos 1 a 261, 35 a 261, 34 a 225, 113 a 261, 113 a 225, 120 a 261, o 120 a 225 de la SEC ID Nº: 2.

3. El ADN aislado de acuerdo con la reivindicación 2 que comprende además un ADN que codifica un zipper de oligomerización que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 5.

4. El ADN aislado de la reivindicación 3, donde el ADN codifica una proteína de fusión que comprende el zipper de oligomerización fusionado al extremo aminoproximal de un fragmento del dominio extracelular de CD40L que consta de los aminoácidos 113 a 261 de la SEC ID Nº: 2.

5. Un vector de expresión recombinante que comprende un ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Un procedimiento para preparar un polipéptido CD40L, que comprende cultivar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 6 en condiciones que promueven la expresión y recuperación del polipéptido CD40L del cultivo.

8. Un polipéptido CD40L codificado por un ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

9. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de la reivindicación 8 junto con un vehículo, excipiente o diluyente.

10. Un polipéptido CD40L de acuerdo con la reivindicación 8 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9 para uso en la inducción de secreción de inmunoglobulina.

11. Un polipéptido CD40L de acuerdo con la reivindicación 8 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9 para uso en la inducción de la proliferación de células B.