MXPA97009447A - Nueva muteina cd4ol - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un DNA que codifica una muteína CD40L, seleccionado del grupo que consiste de:(a un DNA que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO2, en donde una cisteína en el aminoácido 14 se reemplaza con triptófano y (b) un DNA que codifica un polipéptido que es un fragmento de la muteína (a) que comprende triptófano en el aminoácido 14, y cuyo polipéptido liga CD40.

Description

NUEVA MUTEtNA CD40L ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La proteína CD40 humana (CD40) es un péptido de 277 aminoácidos que tiene un peso molecular de 30,600, y un póptido de señal de secreción de 19 aminoácidos que comprende predominantemente aminoácidos hidrofóbicos (Stamenkovic et al., EMBO J. 8: 1403, 1989). La CD40 pertenece a una familia de receptores cuyos miembros incluyen dos formas de receptor TNF (Smith et al. , Science 248: 1019, 1990; y Schall et al., Cell 61 :361 , 1990), un receptor de factor de crecimiento nervioso (Johnson et al. , Cell 47:545, 1986), un antígeno OX40 de células T (Mallett et al. , EMBO J. 9: 1063, 1990), antígeno Fas humano (Itoh et al., Cell 66:233, 1991 ) y un receptor 4-1 BB de murino (Kwon et al. , Cell. Immunol. 121 :414, 19889 [Kwon et al. I] y Kwon et al. , Proc. Nati. Acad. Sci EU 86: 1963, 1989 [Kwon et al. II]). El peso molecular (exclusivo de glicosilación) de la proteína CD40 humana madura es 28,300. Las células T CD4+ activadas expresan altos niveles de un ligando para CD40 (CD40L). La CD40L humana, una glicoproteína unida por membrana, se clonó de células T de sangre periféricas como se describe en Spriggs et al., J. Exp. Med 176: 1543 (1992), y WO 93/08207. La clonación de CD40L de murino se describió en Armitage et al., Nature 357:80, 1992. La CD40L induce ia proliferación de células B en ia ausencia de cualquier co-estímulo, y también induce la producción de inmunoglubilinas en la presencia de citocinas. La CD40L es un polipéptido de membrana tipo II que tiene una región extracelular en su límite C, una región de transmembrana y una región intracelular en su límite N. Las formas solubles de CD40L comprenden la región extracelular de CD40L o un fragmento de la misma. La actividad biológica de CD40L es mediada mediante la unión de la región extracelular de la CD40L con CD40, e incluye la proliferación de células B y la inducción de una secreción de anticuerpos (incluyendo la secreción de IgE). Antes de la presente invención, se desconocía un ligando para CD40 que exhibiera mayor afinidad de ligadura para la CD40 humana que el de la CD40L natural. De acuerdo a esto, existe una necesidad en la técnica para identificar y caracterizar tal muteína de ligando CD40.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN Una citocina novedosa, referida de aquí en adelante como "CD40L", se aisló y caracterizó como se describe en WO 93/08207. La presente invención comprende moléculas de DNA aisladas que codifican nuevas muteínas CD40L humanas y sus complementos. Las moléculas de DNA aisladas se seleccionan del grupo que consiste de un DNA que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO:2, en donde la cisteína en el aminoácido 194 se reemplaza con triptófano, y los DNA que codifican un polipéptido que es un fragmento de la muteína que comprende triptófano en el aminoácido 194. Los DNA que codifican fragmentos de una muteína CD40L se seleccionan del grupo que consiste de péptidos, que contienen aminoácidos 1 a 261 ,35 a 261 , 34 a 225, 113 a 261 , 113 a 225, 120 a 261 o 120 a 225 de la SEQ ID NO:2, en la cual se reemplaza con triptófano ia cisteína en ei aminoácido que corresponde al aminoácido 194 de la SEQ ID NO:2. También se pueden preparar los DNA que generan híbridos para cualquiera de los DNA anteriores bajo condiciones estrictas (hibridación en 6 X SSC a 63°C durante la noche; lavado en 3 X SSC a 55°C), y que codifican un péptido que liga a CD40 y en el cual la cisteína en el aminoácido que corresponde al aminoácido 194 de la SEQ ID NO:2 se reemplaza con triptófano. Además, la invención proporciona nuevas muteínas CD40L codificadas por las moléculas de DNA inventivas. Las nuevas muteínas difieren de la CD40L humana natural al tener una secuencia de aminoácido como se expone en SEQ ID NO:2, en donde la cisteína en el aminoácido 194 se reemplaza con triptófano. Las nuevas muteínas incluyen fragmentos de un dominio extracelular de CD40L, que ligan CD40 y que incluyen triptófano en el aminoácido 194. De preferencia, los fragmentos se seleccionan del grupo que consiste de péptidos que comprenden aminoácidos 1 a 261 , 35 a 261 , 34 a 225, 1 13 a 261 , 113 a 225, 120 a 261 o 120 a 225 de SEQ ID NO:2, muy preferiblemente comprendiendo amino 113 a 261 , en el cual la cisteína en el aminoácido correspondiente al aminoácido 194 de SEQ ID NO:2 se reemplaza con triptófano.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 presenta la ligadura de la CD40L de murino y humana trimérica y CD40L de murino y humana dimérica a C40/Fc como se determinó en un ensayo de sensor biológico. La figura 2 ilustra la ligadura de la CD40L humana trimérica (Figura 2A) y dos preparaciones de CD40L humana monoméríca (Figura 2B) a C40/Fc en un ensayo de sensor biológico.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los nuevos polipéptidos que pueden actuar como ligandos para CD40 de murino y humana, fueron aislados y ordenados en serie como se describe en WO 93/08207. La presente invención proporciona moléculas de DNA que codifican nuevas muteínas CD40L humanas y sus complementos. Las moléculas de DNA aisladas se seleccionaron del grupo que consiste de un DNA que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido como se expone en SEQ ID NO:2, en donde la cisteína en el aminoácido 194 de SEQ ID NO:2 se substituye con un aminoácido diferente a fa cisteína, y los DNA que codifican fragmentos del mismo. De preferencia, el aminoácido que se substituye por el residuo de área CYS 194 es triptófano.

La CD40L es un ligando para CD40, un receptor que es un miembro de la superfamilia de receptores TNF. La CD40L de longitud completa es un polipéptido de membrana ligada con una región extracelular en su extremo C, una región transmembrana y una región intracelular en su extremo N. Se puede hacer una versión soluble de CD40L de la región extracelular o un fragmento de la misma. La región extracelular de la CD40L humana se extiende desde ei aminoácido 47 hasta el aminoácido 261 de SEQ ID NO:1. La actividad biológica de la CD40L es mediada al ligar a CD40 y comprende la proliferación de células B y la inducción de secreción de inmunoglobulinas de las células B activadas. La nueva muteína CD40L aquí descrita se obtuvo mediante la mutación de secuencias de nucleótidos cifrados para un polipéptido CD40L. Una muteína CD40L o análogo, como es referido aquí, es un polipéptido substancialmente homólogo a una CD40L natural, pero el cual tiene una secuencia de aminoácidos diferente del polipéptido CD40L de secuencia natural debido a una o a una pluralidad de supresiones, inserciones o substituciones. Los análogos de la CD40L pueden ser sintetizados a partir de constructos de DNA preparados mediante ligadura y síntesis de oligonucleótidos o mediante técnicas de mutagénesis de sitios específicos. Aquéllos expertos en la técnica reconocerán que pueden hacerse mutaciones adicionales al DNA que codifica CD40L que tiene un triptófano en el aminoácido 194. Generalmente, las substituciones deben hacerse de manera conservadora; es decir, los aminoácidos substitutos más preferidos son aquéllos que no afectan la capacidad de las proteínas inventivas para ligar sus receptores en una manera substancialmente equivalente a aquella de la CD40L natural. Los ejemplos de substituciones conservadoras incluyen la substitución de aminoácidos por fuera de el(los) dominio(s) de ligadura, y la substitución de aminoácidos que no alteran la estructura secundaria y/o terciaria de la CD40L. Ejemplos adicionales incluyen la substitución de un residuo alifático por otro, tal como He, Val, Leu o Ala por otro, o substituciones de un residuo polar por otro, tal como entre Lis y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn. Otras de esas substituciones conservadoras, por ejemplo, substituciones de regiones enteras que tienen características hidrofóbicas similares, son bien conocidas. De manera similar, cuando se adopta una estrategia de inserción o supresión, debe considerarse el efecto potencial de la supresión o inserción en la actividad biológica. La subunidades de las proteínas inventivas pueden construirse al suprimir secuencias o residuos internos o terminales para formar fragmentos. La guía adicional en cuanto a los tipos de mutaciones que pueden hacerse se proporciona mediante una comparación de ia secuencia de CD40L para las secuencias y estructuras de otros miembros de la familia TNF. La estructura de aminoácido primaria de la muteína CD40L inventiva puede modificarse para crear derivados de CD40L al formar conjugados agregados o covalentes con otras porciones químicas, tales como grupos glicosilo, iípidos, fosfato, grupos acetilo y similares, o al crear mutantes de secuencia de aminoácidos. Los derivados covalentes de la CD40L se preparan al enlazar grupos funcionales particulares a las cadenas laterales de aminoácidos de CD40L o en el extremo N o extremo C de una muteína CD40L o el dominio extracelular de la misma. Otros derivados de la CD40L dentro del alcance de esta invención incluyen conjugados agregados o covalentes de la CD40L o sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos, tal como por síntesis en cultivos recombinantes como fusiones de terminal C o terminal N. Por ejemplo, el conjugado puede comprender una secuencia de polipéptidos líder o de señal en la región terminal N o en la región terminal C de un polipéptido CD40L, que dirige de manera co-traslacional o post-traslacional ia transferencia del conjugado desde su sitio de síntesis a un sitio dentro o fuera de la membrana celular o pared celular (por ejemplo el líder de factor a de Saccharomyces) . Las fusiones de polipéptido CD40L pueden comprender polipéptidos adicionados para facilitar la purificación e identificación de CD40L (por ejemplo, poli-His), o fusiones con otras citocinas para proporcionar nuevas entidades polifuncionales. Otras citocinas incluyen, por ejemplo, cualquiera de las interleucinas 1 a 13, TNF (factor de necrosis de tumor), GM-CSF (factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos), G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos), MGF (factor de crecimiento de células mast), EGF (factor de crecimiento epidérmico), PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas), NGF (factor de crecimiento nervioso), EPO (erithropoietina), ?-IFN (interferon gamma), 4-1BB-L (ligando 4-1 BB) y otras citocinas que afectan la función, diferenciación o crecimiento de células inmunes. La actividad biológica de la CD40L puede determinarse, por ejemplo, mediante la competencia para ligar al dominio de ligadura del ligando de la CD40 (es decir, ensayos de ligadura competitiva). En la presente se describen diversos ensayos de ligadura útiles. Aquellos expertos en la técnica pueden aplicar rápidamente experimentación de rutina para desarrollar ensayos de ligadura, usando ya sea la proteína CD40 aislada (es decir CD40/Fc) o las células que expresan CD40. La CD40L también puede ser probada al medir la actividad biológica en el ensayo de proliferación de células B. Las células B humanas pueden obtenerse de amígdalas humanas mediante la purificación por la selección negativa y sedimentación de densidad de Percoll, como se describió por Defrance et al., J. Immunol. 139:1135, 1987. Se pueden usar líneas de célula de linfoma de Burkitt para medir la proliferación de células en respuesta a la CD40L. Ejemplos de líneas de célula de linforma de Burkitt incluyen, por ejemplo, Raji (ATCC CCL 86), Daudi (ATCC CCL 213) y Namalwa (ATCC CRL 1423). Todavía otro ensayo para determinar la actividad biológica de la CD40L es medir la inmunoglobulina producida por células B en respuesta a la activación por CD40L o un derivado o análogo de la misma. La secreción de inmunoglobulina poiiclonal puede medirse, por ejemplo, mediante la incubación con 5 x 105 de células B/ml en un cultivo durante por lo menos siete días. La producción de inmunoglobulina (Ig) puede medirse mediante un ensayo ELISA, tal como el descrito en Maliszewski et al., J. Immunol. 144:3028, 1990 ÍMaliszewski et al. IJ o Maliszewski et al., Eur J. Immunol. 20: 1735, 1990 [Maliszewski et al. II]. Los polipéptidos pueden existir como oligómeros, tales como dímeros o trímeros. Los oligómeros se enlazan mediante enlaces de disulfuro formados entre residuos de cisteína en diferentes polipéptidos de CD40L. De manera alternativa, uno puede enlazar dos dominios de CD40L solubles con una secuencia de enlace tal como aquellas descritas en la Patentes estadounidenses 5,073,627, la cual se incorpora en la presente por referencia. Los polipéptidos CD40L también pueden crearse mediantes expresión de una proteína de fusión que comprende CD40L soluble (dominio extracelular) y una región Fe de una inmunoglobulina (por ejemplo, SEQ ID NO:4) para formar una CD40L divalente. Las proteínas de fusión hechas tanto con cadenas ligeras como pesadas de un anticuerpo, formarán un oligómero de CD40L con tantas como cuatro regiones extracelulares de CD40L. La CD40L trimérica se prepara al expresar un DNA que codifica una proteína de fusión que comprende un péptido que forma un trímero en solución (por ejemplo, una muteína de levadura GCN4 "cierre de leucmß" (SEQ ID NO:5), o el dominio de trimerización de proteína surfactante de pulmón D (SPD) (SEQ ID NO:6; Hoppe, et al., FEBS Lettßrs 344: 191 , 1994) seguido por una región extracelular de ia CD40L. Las proteínas de fusión pueden prepararse usando técnicas convencionales de corte de enzimas y ligación de fragmentos de secuencias deseadas. Las técnicas PCR que emplean oligonucleótidos sintéticos pueden usarse para preparar y/o amplificar los fragmentos deseados. Los oligonucleótidos sintéticos superpuestos que representan las secuencias deseadas, también pueden ser usados para preparar constructos de DNA que codifican proteínas de fusión. Las proteínas de fusión también pueden comprender CD40L y dos o más secuencias adicionales, incluyendo una secuencia líder (o péptido de señal), región de oligomerización (es decir, región Fe, porción de cierre de leucina o porción de cierre adecuada), secuencia de enlace, y secuencias que codifican porciones altamente antigénicas que proporcionan un medio para la fácil purificación o rápida detección de una proteína de fusión. Los péptidos de señal facilitan la secreción de proteínas de las células. Un péptido de señal ejemplar son los aminoácidos - 26 a -1 de la SEQ ID NO:8. El octapéptido de FlagR (Hopp et al. , Bio/Technology 6: 1204, 1988) no altera la actividad biológica de las proteínas de fusión, es altamente antigénico y proporciona un epitope reversiblemente ligado por un anticuerpo monoclonal específico, que permite la rápida detección y fácil purificación de la proteína de fusión expresada. La secuencia FlagR también se corta específicamente por una enterocinasa de mucosa de bovino en el residuo que sigue inmediatamente el par Asp-Lis, las proteínas de fusión cubiertas con este péptido también pueden ser resistentes a degradación intracelular en E. coli. Un anticuerpo monoclonal de murino que liga la secuencia FlagR ha sido depositado con ATCC bajo el número de acceso HB 9259; los métodos de usar el anticuerpo en la purificación de proteínas de fusión que comprende la secuencia FlagR se describen en la Patente estadounidense 5,011 ,912, la cual se incorpora a la presente por referencia. Las regiones Fe adecuadas se definen como regiones Fe que pueden ligar a la proteína A o la proteína G, o de manera alternativa, se reconocen mediante un anticuerpo que puede usarse en la purificación o detección de una proteína de fusión que comprende la región Fe. Las regiones Fe preferidas incluyen la región Fe de la IgGi humana o IgGi de murino. Un ejemplo es la región Fe de la Igd mostrada en la SEQ ID NO:4. Fragmentos de una región Fe adecuada también pueden usarse, por ejemplo, una región Fe de Igd humana de la cual se ha suprimido una secuencia de aminoácidos responsables para ligar a la proteína A, de manera que el fragmento liga a la proteína G pero no a la proteína A. También puede usarse una secuencia de enlace que separa ia región extracelular de la CD40L de la porción de oligomerización mediante una distancia suficiente para asegurar que la CD40L se doble adecuadamente en sus estructuras secundaria y terciaria. Las secuencias de enlace adecuadas (1 ) adoptarán una conformación extendida flexible, (2) no exhibirán una propensión para desarrollar una estructura secundaria ordenada que pudiera interactuar con los dominios funcionales de las proteínas de fusión, y (3) tendrán mínimo carácter cargado o hidrofóbico, que pudiera promover la interacción con los dominios de proteína funcionales. Los aminoácidos de superficie típicos en las regiones de proteína flexibles incluyen Gli, Asn y Ser. Virtualmente se esperaría que cualquier permutación de secuencias de aminoácidos que contienen Gli, Asn y Ser satisfaciera el criterio anterior para una secuencia de enlace. Otros aminoácios casi neutrales, tales como Thr y Ala, también pueden usarse en la secuencia de enlace. La longitud de la secuencia de enlace puede variar sin afectar de manera significativa la actividad biológica de la proteína de fusión. Las secuencias de enlace son innecesarias donde las proteínas que se fusionan no tienen regiones de aminoácidos de terminal C o N, que pueden usarse para separar los dominios funcionales y prevenir la interferencia espacial. Se pueden preparar constructos de DNA que codifican varias adiciones o substituciones de secuencias o residuos de aminoácidos, o supresiones de residuos internos o terminales o secuencias no necesarias para la actividad biológica o ligadura. Por ejemplo, el sitio de glicosilación N de CD40L extracelular puede modificarse para evitar la glicosilación, al tiempo que permite la expresión de un análogo de carbohidrato reducido, homogéneo, usando sistemas de expresión de levadura. Los sitios de glicosilación N en polipéptido eucarióticos se caracterizan por una terna de aminoácidos Asn-X-Y, en donde X es cualquier aminoácido excepto Pro y Y es Ser o Thr.

Las modificaciones apropiadas para la secuencia de nucleótidos que codifican esta terna resultarán en substituciones, adiciones o supresiones que previenen la unión de residuos de carbohidrato a la cadena lateral de Asn. Otras aproximaciones a la mutagénesis involucran la modificación de secuencias que codifican residuos de aminoácidos dibásicos para intensificar la expresión en sistemas de levadura, en los cuales está presente la actividad de la proteasa KEX2. Las sub-unidades de un polipéptido CD40L pueden construirse al suprimir secuencias que codifican secuencias o residuos internos o terminales. Más aún, pueden realizarse otros análisis para ayudar al técnico experto a seleccionar sitios para mutagénesis. Por ejemplo, WO 93/08207 (cuya descripción se incorpora en la presente por referencia) discute métodos para seleccionar antagonistas y agonistas de ligandos. La secuencia de cDNA de CD40L de murino se obtuvo mediante técnicas de expresión directa; la secuencia de CD40L humana se obtuvo por técnicas de hibridación de cruzamiento entre especies usando el cDNA de CD40L de muríno como una sonda. Ambas se describen en WO 93/08207. Brevemente, la región extracelular de la CD40 humana (el receptor; SEQ ID NO:3) se clonó mediante técnicas de reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando primarios basados sobre una secuencia publicada en Stamenkovic et ai. Se obtuvo una proteína de fusión CD40/Fc mediante técnicas PCR al fusionar DNA que codifica el dominio extracelular de CD40 con DNA que codifica el dominio Fe de la lgG1 humana (SEQ ID NO:4). Las proteínas CD40 solubles purificadas eran capaces de antagonizar actividades biológicas mediadas de CD40L. Se preparó una genoteca de cDNA a partir de una línea de células EL4 elegida aleatoriamente por FACS (elección aleatoria de células activadas por fluorescencia) en la base de ligadura de una proteína de fusión CD40/Fc biotinilada. Las células se eligieron aleatoriamente cinco veces hasta que hubo un cambio importante en la intensidad de la fluorescencia basado sobre la expresión de un ligando para CD40 por las células EL-4 elegidas. Brevemente, se sintetizó el cDNA, se insertó en un vector pDC406 vacío y se transformó en E. coli. Se agruparon los transformados, y el DNA de las agrupaciones se aisló y t ransf ectó en células CV1 -EBNA para crear una genoteca de clonación de expresión. Las células CV1 -EBNA transfectadas se cultivaron en portaobjetos para permitir la expresión transiente de CD40L. Los portaobjetos se cubrieron con CD40/Fc radioyodinada, y se examinaron para identificar células que expresen CD40L al averiguar la presencia de granos de plata autoradiográficos contra un fondo de luz. Se aisló un clon simple y se ordenó en serie mediante técnicas estándar, para proporcionar la secuencia de cDNA y se dedujo la secuencia de aminoácidos de la CD40L de murino. Se encontró el cDNA de la CD40L homologa humana mediante técnicas de hibridaciónde cruzamiento entre especies. Brevemente, se hizo una genoteca de cDNA de linfocito de sangre periférica (PBL) humana a partir de tinfocitos de sangre periférica activados. Una sonda de murino se construyó correspondiente a la región de ciframiento de la CD40L de murino a partir del nucleótido 13 al nucleótido 793 de la CD40L murino. Usando técnicas estándar para ia hibridación de cruzamiento entre especies, la sonda se utilizó para identificar un clon que expresara CD40L humana. Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de la CD40L humana se muestran en las SEQ ID NO's 1 y 2. Los vectores de expresión recombinante para la expresión de CD40L por técnicas de DNA recombinante, incluyen una secuencia de DNA de CD40L que comprenden un fragmento de DNA derivado de cDNA o sintético que codifica un polipéptido de CD40L, operablemente enlazado a una secuencia de nucleótidos reguladora traslacional o transcripcional adecuada, tal como una derivada de un gene de insecto, viral, microbiano o mamífero. Ejemplos de secuencias reguladoras incluyen secuencias que tienen un papel regulador en la expresión de genes (por ejemplo, un intensificador o promotor transcripcional), de manera opcional una secuencia de operador para controlar la transcripción, una secuencia que codifica un sitio de ligadura ribosomal de mRNA, y secuencias apropiadas con que controlan la terminación e iniciación de traslación y transcripción.

Las secuencias de nucieótidos se enlazan operablemente cuando la secuencia reguladora se relaciona funcionalmente con la secuencia de DNA de CD40L. Así, una secuencia de nucleótidos promotora se enlaza operablemente con una secuencia de DNA de CD40L si la secuencia de nucleótidos promotora controla la transcripción de la secuencia de DNA de CD40L. Más aún, un sitio de ligadura de ribosoma puede ser enlazado a una secuencia para un polipéptido de CD40L, si el sitio de ligadura de ribosoma se coloca dentro del vector para estimular la traslación. Además, se pueden incorporar secuencias que codifican péptidos de señal en vectores de expresión. Por ejemplo, una secuencia de DNA para un péptido de señal (líder de secreción) puede enlazarse operablemente a una secuencia de DNA de CD40L. Las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos de CD40L incluyen procariotes, levadura o células eucarióticas mayores. Los procariotes incluyen organismos gram positivos y gram negativos, por ejemplo, E. coli o Bacilli. Las células huésped procarióticas adecuadas para la transformación incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimu um, y otras diversas especies dentro del género Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus. Las células eucarióticas mayores incluyen líneas de células establecidas de origen mamífero. Los sistemas de traslación libre de células también pueden emplearse para producir polipéptidos CD40L usando RNAs derivados de constructos de DNA descritos en la presente. Se describen vectores de expresión y clonación apropiados para usarse con células huésped bacterianas, fúngales, de levadura y mamíferas, por ejemplo en Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, (1985).

Los vectores de expresión que portan la secuencia de DNA de CD40L recombinante se transfectan o transforman en un cultivo substancialmente homogéneo de una línea de células mamíferas o de microorganismo huésped adecuado. Las células huésped transformadas son células que han sido transformadas o transfectadas con secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos de CD40L y expresan polipéptidos de CD40L. Los polipéptidos de CD40L expresados serán ubicados dentro de la célula huésped y/o secretados en un fluido sobrenadante de cultivo, dependiendo de la naturaleza de la célula huésped y el constructo de gene insertado en la célula huésped. Los vectores de expresión transfectados en células huésped procarióticas generalmente comprenden uno o más marcadores seleccionabies de fenotipo. Un marcador seleccionable de fenotipo es, por ejemplo, un gene que codifica una proteína que confiere resistencia antibiótica o que suministra un requerimiento autotrófico, y un origen de replicación reconocido por el huésped para asegurar la amplificación dentro del huésped. Otros vectores de expresión útiles para células huésped procarióticas incluyen un marcador seleccionable de origen bacteriano derivado de plásmidos comercialmente disponibles. Este marcador sefeccionable puede comprender elementos genéticos del vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). El pBR322 contiene genes para resistencia de tetraciclilna y ampicilina, y de esta manera proporciona medios simples para identificar células transformadas. Las secciones de "esqueleto" del pBR322 se combinan con un promotor apropiado y una secuencia de DNA de CD40L. Otros vectores comercialmente disponibles incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promega Biotec, Madison, Wl, EU). Las secuencias promotoras se usan comúnmente para vectores de expresión de células huésped procarióticas recombinantes. Las secuencias promotoras comunes incluyen ß-lactamasa (penicilinasa), sistema promotor de lactosa (Chang et al., Nature 275:615, 1978; y Goeddel et al., Nature 281 :544, 1979), sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucí. Acids Res. 8:4057, 1980; y EP-A-36776) y un promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982). Un sistema de expresión de célula huésped procariótica particularmente útil emplea un promotor de fagos ? P y una secuencia represora termolábil cl857ts. Los vectores de plásmido disponibles de American Type Culture Collection que incorporan derivados del promotor ? PL, incluyen plásmidos pHUB2 (residente en la cepa de E. coii JMB9 (ATCC 37092)) y pPLc28 (residente en E. coli RR1 (ATCC 53082)). La CD40L puede expresarse en células huésped de levadura, de preferencia del género Saccharomyces (por ejemplo., S. cerevisiae). También se puede emplear otro género de levadura, tal como Pichia o Kluyveromyces. Los vectores de levadura también contienen frecuentemente un origen de secuencia de replicación de un plásmido 1 de levadura de 2µ, una secuencia de replicación de manera autónoma (ARS), una región promotora, secuencias para poliadenilación y secuencias para terminación de transcripción. De preferencia, los vectores de levadura incluyen un origen de secuencia de replicación y un marcador seleccionable. Las secuencias promotoras adecuadas para los vectores de levadura incluyen promotores para metalotioneína, 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; y Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978), tal como enolasa, gliceraldehide-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa. Otros vectores adecuados y promotores para usarse en la expresión de levadura se describen adicionalmente en Hitzeman, EPA-73,657. Los sistemas de cultivos de células huésped de insectos o mamíferos también pueden ser empleados para expresar polipéptidos de CD40L recombinantes. Ejemplos de líneas de células huésped de mamíferos adecuadas incluyen la línea COS-7 de células de riñon de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al. , Cell 23: 175, 1981 ), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, y líneas de células BHK (ATCC CRL 10). Los vectores de expresión de mamífero adecuados incluyen elementos no transcritos tales como un origen de replicación, una secuencia promotora, un intensificador enlazado al gene estructural, otras secuencias no transcritas de flanqueo 3' o 5', tales como sitios de ligadura de ribosoma, un sitio de poliadenilación, sitios de aceptor y donador de empalme, y secuencias de terminación transcripcional. Las secuencias de control traslacional y transcripcional para vectores de expresión de células huésped mamíferas pueden extirparse de genomas virales. Por ejemplo, las secuencias intensificadoras y las secuencias promotoras de células mamíferas comúnmente usadas se derivan de virus Polioma, Adenovirus 2, Virus Simian 40 (SV40) y citomegalovirus humano. Las secuencias de DNA derivadas del genoma viral SV40, por ejemplo, origen SV40, promotor tardío y temprano, intensificador, empalme y sitios de poliadenilación pueden usarse para proporcionar los otros elementos genéticos requeridos para la expresión de una secuencia de gene estructural en una célula huésped mamífera. Los promotores tempranos y tardíos virales son particularmente útiles porque ambos se obtienen fácilmente de un genoma viral como un fragmento, el cual también puede contener un origen viral de replicación (Fiers et al., Nature 273: 1 13, 1978). También se pueden usar fragmentos de SV40 más pequeños o más grandes, siempre que esté incluida la secuencia de aproximadamente 250 bp que se extiende desde el sitio Hind lll hacia el sitio Bgl i ubicado en el origen viral SV40 del sitio de replicación. Vectores de expresión de mamíferos ejemplares pueden construirse como se describió por Okayama y Berg {Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983). Un vector de alta expresión útil el PMLSV N1/N4, descrito por Cosman et al., Nature 312:768, 1984 ha sido depositado como ATCC 39890. Adicionales vectores de expresión de mamíferos útiles se describen en EP-A-0367566, y en la Patente estadounidense con No. de serie de la Solicitud 07/701 ,415, presentada el 16 de mayo de 1991 , incorporada en la presente por referencia. Para la expresión de una región extracelular de proteína tipo II, tal como la CD40L, se debe añadir una secuencia de señal heteróloga, tal como la secuencia de señal para interleucin-7 (IL-7) descrita en la Patente estadounidense 4,965, 195, o la secuencia de señal para el receptor de interleucin-2 descrito en la Solicitud de Patente estadounidense 06/626,667 presentada el 2 de julio de 1984.

Purificación de polipéptidos CD40L recombinantes Los polipéptidos CD40L pueden prepararse cultivando células huésped transformadas bajo condiciones de cultivo necesarias para expresar polipéptidos CD40L. Los poiipéptídos expresados resultantes pueden purificarse entonces del medio de cultivo o extractos de células. Un polipéptido CD40L, si se desea, puede concentrarse usando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Pellicon Millipor o Amicon. Siguiendo el paso de concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación tal como un medio de filtración de gel. De manera alternativa, puede usarse una resina de intercambio de aniones, por ejemplo, una matriz o substrato que tiene grupos dietilaminoetílo (DEAE) pendientes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente empleados en la purificación de proteínas. De manera alternativa se puede emplear una etapa de intercambio de cationes. Los intercambiadores de cationes adecuados incluyen varias matrices insolubles que comprenden grupos carboximetilo o sulfopropilo. Se prefieren los grupos sulfopropito. Finalmente, uno o más pasos de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase reversa (RP-HPLC) que emplea medios RP-HPLC, (por ejemplo sílica gel que tiene metilo o otros grupos alifáticos pendientes) puede emplearse para purificar adicionalmente la CD40L. Alguno o todos los pasos de purificación anteriores, en varias combinaciones, también pueden emplearse para proporcionar una proteína recombinante substancialmente homogénea. También es posible utilizar una columna de afinidad que comprende un dominio de ligadura de ligando CD40 para polipéptidos CD40L expresados de afinidad-purificación. Los polipéptidos CD40L pueden removerse desde una columna de afinidad en un amortiguador de levigación de sales altas y entonces dializarse en un amortiguador de sal menor para usarse. La proteína recombinante producida en un cultivo bacteriano generalmente se aisla mediante disolución inicial de las células huésped, centrifugación, extracción de pellas de células de un polipéptido insoluble, o del fluido sobrenadante si un polipéptido soluble, seguido por uno o más pasos de concentración, precipitación por medio de sal, intercambio de iones, purificación de afinidad o cromatografía de exclusión de tamaños. Finalmente, la RP-HPLC puede emplearse para etapas de purificación finales. Las células microbianas pueden disolverse por cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, disolución mecánica, o uso de agentes de lisis de células. Las células huésped de levadura transformadas se emplean de preferencia para expresar CD40L como un polipéptido secretado. Esto simplifica la purificación. El polipéptido recombinante secretado de una fermentación de célula huésped de levadura puede purificarse por métodos análogos a aquéllos descritos por Urdal et al. (J. Chromatog. 296: 171 , 1984). Urdal et al. describe dos pasos de HPLC de fase reversa, secuenciales, para la purificación de IL-2 humano recombinante en una columna de HPLC preparativa.

Administración de Composiciones de CD40L La presente invención proporciona composiciones terapéuticas que comprenden una cantidad efectiva de la muteína CD40L en un portador o diluyente adecuado y métodos para tratar mamíferos usando las composiciones. Para el uso terapéutico, la muteína CD40L purificada se administra a un paciente, de preferencia un humano, para tratamiento en una manera apropiada a la indicación. Así, por ejemplo, las composiciones farmacéuticas de muteína CD40L (por ejemplo, en la forma de una muteína CD40L soluble que comprende el triptófano en el aminoácido 194), que se administran para alcanzar un efecto terapéutico deseado, pueden darse mediante inyección de bolo, infusión continua, liberación sostenida de injertos u otra técnica adecuada. Normalmente, un agente terapéutico de muteína CD40L será administrado en la forma de una composición farmacéutica que comprende muteína CD40L purificada en conjunción con diluyentes, exhipientes o portadores fisiológicamente aceptables. Tales portadores serán no tóxicos para los pacientes en las dosis y concentraciones empleadas. De manera ordinaria, la preparación de tales composiciones acarrea combinar una muteína CD40L con amortiguadores, antioxidantes tales como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos), proteínas, aminoácidos, carbohidratos que incluyen glucosa, sucrosa o dextranos, agentes quelantes tales como EDTA, glutationa y otros estabilizadores y excipientes. Las soluciones salinas amortiguadas neutrales o soluciones salinas mezcladas con albúmina de suero de la misma especie son ejemplares de diluyentes apropiados. Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar modalidades particulares y no limitar el alcance de la invención. Las divulgaciones relevantes de todas las publicaciones citadas en la presente se incorporan específicamente por referencia.

EJEMPLO 1 Este ejemplo describe dos ensayos de ligadura de fase sólida, el primero de los cuales, (a) puede usarse para valorar la capacidad de la CD40L trimérica para ligar CD40, y el segundo de los cuales, (b) se usa para detectar la presencia de CD40L. (a) ELISA de CD40L cuantitativa Se prepara y purifica la CD40/Fc como se describió en WO 93/08207, y se usó para cubrir 96 placas de cavidad (placas Corning EasyWash ELISA, Corning, NY, EU). Las placas se cubren con 2.5 µg/cavidad de CD40/Fc en PBS durante la noche a 4°C, y se bloquean con 1 % de leche sin grasa en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Las muestras a ser evaluadas se diluyen en 10% de suero de cabra normal en PBS y se agregan 50 µl por cavidad. Una titulación de muestras desconocidas se corre por duplicado y una titulación de estándar de referencia de CD40L se corre para generar una curva estándar. Las placas se incuban con las muestras y controles por 45 minutos a temperatura ambiente, después se lavan cuatro veces con PBS. En la segunda etapa, se agrega cierre de anti-oligomerización de conejo reactivo (50 µl/cavidad, concentración aproximadamente de 2.5 µg/ml), y lacas se incuban a temperatura ambiente durante 45 minutos. Las placas se lavan nuevamente como se describió antes, y se añade IgG anti-conejo F(ab')2 de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (Tago, Burlingame, CA, EU). Las placas se incuban durante 45 minutos a temperatura ambiente, se lavan como se describió, y la presencia de CD40L se detecta mediante la adición de tetrametil bencideno cromógeno (TMB; 100 µl/cavidad) durante 15 minutos a temperatura ambiente. La reacción cromogénica se para mediante la adición de 100 µl/cavidad de H2SO4 2N, y se determinan los OD45o-OD5ß2 de las cavidades. La cantidad de CD40L trimérica puede determinarse al comparar los valores OD obtenidos con las muestras desconocidas con los valores generados por la curva estándar. Los valores se expresan como el número de unidades de ligadura por mi. Una unidad de ligadura es aproximadamente un ng de proteína como se estimó usando una proteína de fusión Fe purificada del ligando como un estándar. En esta manera, se ha determinado la concentración y actividad específica de diversos lotes diferentes de CD40L trimérica. (b) Mancha de Punto cualitativa El trímero CD40L (1 µl de sobrenadante crudo o fracciones de columna) se adsorbe para secar membranas de nitrocelulosa BA85/21 (Schleicher y Schuell, Keene, NH) y se permitió que secara. Las membranas se incuban en platos de cultivo de tejido durante una hora en una solución salina amortiguada (0.15 M) de Tris (0.05 M) de pH 7.5 que contiene 1 % peso/volumen de BSA para bloquear sitios de ligadura no específicos. Al final de este tiempo, las membranas se lavaron tres veces en PBS, y se añadió anticuerpo de cierre de anti-oligomerización de conejo en una concentración aproximada de 10 µg/ml en PBS que contenía 1 % de BSA, después de lo cual se incubaron las membranas durante una hora temperatura ambiente. Las membranas se lavaron nuevamente como se describió, y se adicionó un anticuerpo etiquetado-(HRP) de peroxidasa de rábano picante (tal como la Ig de anti-conejo de cabra; Southern Biotech, Brimingham, AL) en una dilución aproximada de 1 :1000 en PBS que contenía 1 % de BSA. Después de la incubación por una hora a temperatura ambiente, las membranas se lavaron y se añadió el cromógeno (es decir, reactivo 4-cloronaphtol, Kirkegard y Perry, Gaithersburg, MD). Se permite que se desarrolle el color por diez minutos a temperatura ambiente, y la reacción se para al enjuagar las membranas con agua. Las membranas se lavan y la presencia de CD40L se determina analizando la presencia de un color negro-azul. Este ensayo se usó para determinanr la presencia o ausencia de la CD40L trimérica en los fluidos sobrenadantes del cultivo de células y en fracciones de columna de purificación. El ensayo proporcionó además un método semi-cuantitativo para determinar cantidades relativas de CD40L trimérica al comparar la intensidad del color en las muestras desconocidas con la intensidad de las cantidades conocidas de los controles.

EJEMPLO 2 Este ejemplo describe la construcción de un constructo de DNA de CD40L para expresar la CD40L trimérica en células de ovario de hámster chino (CHO). La CD40L trimérica contiene una secuencia líder, y una secuencia de 33 aminoácidos referida como un cierre de oligomerización (SEQ ID NO:5), seguido por la región extracelular de la CD40L humana desde el aminoácido 51 al aminoácido 261 (SEQ ID NO:1). El constructo se preparó cortando el DNA apropiado de un plásmido que contiene CD40L humana, y ligando ei DNA en el vector de expresión pCAVDHFR. El constructo resultante fue referido como CAV/DHFR-CD40LT. El pCAVDHFR incluye secuencias reguladoras derivadas de citomegalovirus, SV40 y Adenovirus 2, junto con el gene para la dihidrofolato reductasa (DHFR), y permite la integración aleatoria de un gene deseado en chromosomas de células huésped. La expresión de DHFR permite a las células huésped DHFR" crecer en medio con falta de glicina, hipoxantina y timidina (GHT). Un constructo similar también se hizo para la expresión de trímero CD40L de murino en células CHO. Además de las secuencias de cierre de oligomerización y líder, el constructo de murino también contenía una secuencia que codificaba el octapéptido referido como FlagR (descrito previamente) entre el dominio de trimerización ("cierre de leucina" o cierre de oligomerización) y la región extracelular de CD40L de murino. La secuencia de nucleótidos y aminoácidos de los DNA que codifican CD40L humana se muestran en las SEQ ID NO's 7 y 8 respectivamente. Se pueden preparar constructos adicionales usando métodos estándar. Por ejemplo, los vectores que incorporan promotores duales tales como aquéllos descritos en la Patente estadounidense 4,937, 190 o en Kaufman et al., Nucí. Acids Res. 19:4485, 1991 , también son útiles en preparar constructos para expresión de CD40L en células CHO. El producto de ligación resultante se transfectó en células CHO usando ya sea reactivo LipofectinR o reactivo Lipofectamine R (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Ambos reactivos son reactivos comercialmente disponibles usados para formar complejos de ácidos lípido-nucléicos (o liposomas) los cuales, cuando se aplican a células cultivadas, facilitan la captación del ácido nucleico en las células. Las células que se transfectan con el constructo pCAVDHFR-CD40LT se seleccionaron en un medio DMEM:F12 en la ausencia de GHT. Las células que fueron capaces de crecer en la ausencia de GHT se probaron para la producción de CD40L usando un ensayo de ligadura de fase sólida como se describió en el Ejemplo 16. Los resultados indicaron que en este sistema de transfección el reactivo Lipofectamine R obtuvo mayores proporciones de transfección exitosa. Aproximadamente se examinaron 160 clones y se identificaron dos clones positivos y se expandieron para estudio adicional. Las células se pasaron en un medio DMEM:F12 libre de GHT, y se revisaron para estabilidad mediante la valoración de produción de CD40L trimérica en el ensayo de ligadura de fase sólida descrito antes. Basado en estos resultados, se eligió un clon que parecía estar transfectado establemente con el DNA de CD40L, y que produjo y secretó aproximadamente 1 µg/10€ células/día de trímero de CD40L. Constructos adicionales que comprenden otros vectores y todas o una porción de las secuencias de DNA descritas en este ejemplo pueden usarse para preparar líneas de células transfectadas establemente adicionales, substancialmente como se describió en la presente. Una vez que se identificaron tales células transfectadas establemente, se hicieron crecer cultivos a gran escala de las células transfectadas para acumular sobrenadante que contiene CD40L trimérica. Las condiciones de cultivo a gran escala adecuadas incluyen el uso de reactores biológicos. Se siguieron procedimientos similares para producir líneas de células CHO que secretaron una CD40L de murino trimérica a aproximadamente 0.05 µg/106 células/día. Las células CHO trasfectadas establemente con ya sea el constructo de CD40L de murino o humana, habiendo adquirido un gene DHFR del plásmido pCAVDHFR son resistentes al metotrexato. El metotrexato puede añadirse al medio de cultivo para amplificar el número de copias del DNA de trímero de CD40L con el fin de incrementar la producción del trímero de CD40L.

EJEMPLO 3 Este ejemplo ilustra las afinidades de ligadura de diversos constructos de CD40L diferentes. Se condujeron experimentos de afinidad mediante análisis de interacción bioespecífica (BIA) usando un sensor biológico, un instrumento que combina un mecanismo de reconocimiento biológico con un transductor o dispositivo sensor. Un sensor biológico ejemplar es BIAcoreM , de Pharmacia Biosensor AB (Uppsala, Suecia; ver Fágerstam L.G., Techniques in Protein Chemistry ll, ed. J.J. Villafranca, Acad. Press, NY, 1991 ). El BIAcoreMR usa la resonancia de plasmon de superficie de fenómeno óptico (Kretschmann y Raether, Z. Naturforschung, Teil. A 23:2135, 1968) para revisar la interacción de dos moléculas biológicas. Los pares de moléculas que tienen constantes de afinidad en el rango de 105 a 1010 M"\ y las constantes de velocidad de asociación en el rango de 103 a 106 M~1s"\ son adecuados para la caracterización con BIAcoreMR. Los chips del sensor biológico se cubrieron con IgGi Fe antihumana de cabra, que se usó para bind CD40/Fc al chip. Los diferentes constructos de CD40L se añadieron entonces a concentraciones en aumento; el chip se regeneró entre los diferentes constructos mediante la adición de hidróxido de sodio. Se realizaron dos experimentos por separado. En el primero, se comparó la ligadura de una CD40L humana dimérica (CD40L/Fc), CD40L humana trimérica (CD40L/"cierre de leucina"), y CD40L de murino dimérico y trimérico (preparado substancialmente como se describió para la CD40L humana). En el segundo experimento, la ligadura de la CD40L humana trimérica se comparó a la ligadura de dos diferentes preparaciones de CD40L humana monomérica (comprendiendo solamente la porción del dominio extracelular más homólogo a TNF) Los datos resultantes se analizaron para determinar las constantes de velocidad de asociación y afinidad de los diferentes constructos CD40L. Los resultados se muestran en ia Tabla 1 a continuación, y en las Figuras 1 y 2.

Tabla 1 : Ligadura de CD40L a CD40/Fc El análisis de los datos indicaron que un monómero de CD40L que comprende únicamente la porción del dominio extracelular más homólogo a TNF fue capaz de ligar CD40, aunque con una afinidad un tanto menor que la CD40L oligomérica. Un análisis de la proporción de ligadura en el segundo experimento demostró que hay el doble de las unidades de monómero CD40L ligadas por molécula de CD40/Fc como CD40L trimérico, confirmando que dos monómeros de CD40L ligan un dímero CD40/Fc y una CD40L trimérica liga un dímero CD40/FC.

EJEMPLO 4 Este ejemplo ilustra la preparación de un número de muteínas de una proteína de fusión de dominio de cierre/ligando CD40. Las mutaciones para constructos para expresarse en levadura (mutantes ) 14, 18, 32, 41 , 43, 10PP y 18PP) se generaron mediante misincorporación PCR (Mulrad et al Yeast 8:79, 1992), y se seleccionaron basados en un aparente incremento en la secreción como mutantes de secreción mejorada. Los mutantes 14, 18, 32, 41 y 43 se aislaron en S. cerevisiae. Los mutantes 10PP y 18PP se aisalron en P. pastoris. Las mutaciones para constructos a expresarse en células mamíferas (FL194W, 194. W, LZ12V, 215. T, 255. F, y 194.S) también se prepararon usando PCR, y fueron ya sea el resultado de mutagénesis de sitio dirigida o fueron el producto aleatorio de PCR. Los tipos de mutaciones obtenidas y su efecto en actividad (capacidad para ligar CD40 en un ensayo de ligadura de fase sólida substancialmente como se describió en el Ejemplo 1) se muestran en la Tabla 2 a continuación. Tabla 2: Mutaciones presentes en la proteína de fusión de dominio de cierre/li ando CD40 a: Las mutaciones están dadas como el residuo presente en el péptido natural, el número de residuo y el residuo presente en la muteína. Los números de residuo para mutaciones de dominio de cierre están relacionados con la SEQ ID NO:5. b: Los números de residuo para ias mutaciones en el dominio de CD40L están relacionados con la SEQ ID NO: 1. c: El mutante 10PP también contiene mutaciones en regiones diferentes al dominio de CD40L o al dominio de cierre (T-4S, D-2P, relativos a la SEQ ID NO: 7). d: No aplicaple e: No realizado El mutante 18PP solo tuvo una mutación sencilla en la molécula, la cual fue suficiente para afectar la secreción en la levadura. El mutante 41 tuvo dos mutaciones, de las cuales ambas estuvieron en los residuos de isoleucina del dominio de cierre. Las mutaciones en el cierre mejoran la secreción de la levadura sin efecto aparente en la actividad. El mutante 194. W se expresó en las células de levadura y se purificaron ya sea mediante una combinación de etapas de cromatografía de intercambio de iones (194.W (c)) o mediante cromatografía de afinidad (194.W (a)), usando un anticuerpo monoclonal que liga la porción de cierrre de oligomerización. El mutante expresado de levadura (194.W) exhibió mayor afinidad por CD40 en un ensayo de sensor biológico realizado substancialmente como se describió en el Ejemplo 3, y exhibió mayor actividad biológica que la proteína de fusión de dominio de cierre/ligando CD40 de tipo no cultivado (WT) expresada en levadura, en un ensayo de proliferación de células B. Estos resultados se muestran en la Tabla 3. Tabla 3: Comparación de WT y 194.W para Li adura de rece tor roliferación de células B a: Una unidad (U) es la concentración que induce la mitad del máximo de proliferación b: Promedio de las dos preparaciones independientes c: No realizado d: Promedio de los dos ensayos Más aún, el FL194W expressado en células de mamíferos también demostraron mayor ligadura que la WT CD40L en un análisis de manchas occidental semi-cuantitativo. 3 Se prepararon constructos adicionales al substituir el dominio de trimerización de proteína surfactante de pulmón (SPD) (SEQ ID NO;6; Hoppe, et al., FEBS Letters 344:191 , 1994) en lugar del cierre de formación de trímeros de la SEQ ID NO:5. Este constructo se expresó en S. cerevisiae y en células de mamíferos a niveles bajos. La actividad se determinó como se describió previamente; también se pueden preparar varios mutantes basados en tales constructos para optimizar la secreción u otras características de producto, como se describió antes.

EJEMPLO 5 Este ejemplo ilustra las afinidades de ligadura de varios constructos CD40L diferentes. Los experimentos de afinidad se condujeron mediante análisis de interacción bioespecífica (BIA), substancialmente como se describió en el Ejemplo 3, usando dos de los constructos descritos en el Ejemplo 4. Los resultados presentados en la Tabla 4 representan los valores promedio obtenidos para dos diferentes preparaciones de la CD40LT (WT) de tipo no cultivado, y tres diferentes preparaciones de muteína (194.W). Los resultados se muestran a continuación. Tabla 4: Ligadura de CD40LT a CD40/Fc Estos resultados confirman que CD40LT 194. W tiene una mayor afinidad para CD40/Fc que la CD40LT de tipo no cultivado.

LISTADOS DE SECUENCIA (1 ) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: IMMUNEX CORPORATION (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: NUEVA MUTEINA CD40L (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 8 (iv) DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINARIO: IMMUNEX CORPORATION (B) CALLE: 51 UNIVERSITY STREET (C) CIUDAD: SEATTLE (D) PAÍS: EU (E) CÓDIGO POSTAL: 98101 (v) FORMA LEGIBLE DE COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: DISCO FLEXIBLE (B) COMPUTADORA: Apple Macintosh (C) SISTEMA OPERATIVO: Sistema operativo Apple 7.5.3 (D) PAQUETERÍA: Microsoft Word para Apple, versión 6.0.1a (vi) DATOS DE SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 6 DE JUNIO DE 1996 (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: USSN 08/477,733 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 7 DE JUNIO DE 1995 (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: USSN 08/484,624 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 7 DE JUNIO DE 1995 (C) CLASIFICACIÓN: (viii) INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE: (A) NOMBRE: Perkins, Patricia Anne (B) NUMERO DE REGISTRO: 34,693 (C) NUMERO DE REFERENCIA/CASO: 2802-DWO (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES: (A) TELEFONO: 2065870430 (B) TELEFAX: 2062330644 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 840 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTOS: sencillo (D) TOPOLOGÍA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (vii) FUENTE INMEDIATA: (B) CLON: CD40L (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 46..831 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:1 TGCCACCTTC TCTGCCAGAA GATACCATTT CAACTTTAAC ACAGC ATG ATC GAA 54 Met He Glu 1 ACA TAC AAC CAÁ ACT TCT CCC CGA TCT GCG GCC ACT GGA CTG CCC ATC 102 Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly Leu Pro He 5 10 15 AGC ATG AAA ATT TTT ATG TAT TTA CTT ACT GTT TTT CTT ATC ACC CAG 150 Ser Met Lys He Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu He Thr Gln 20 25 30 35 ATG ATT GGG TCA GCA CTT TTT GCT GTG TAT CTT CAT AGA AGG TTG GAC 198 Met He Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg Arg Leu Asp 40 45 50 AAG ATA GAA GAT GAA AGG AAT CTT CAT GAA GAT TTT GTA TTC ATG AAA 246 Lys He Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val Phe Met Lys 55 60 " 65 ACG ATA CAG AGA TGC AAC ACA GGA GAA AGA TCC TTA TCC TTA CTG AAC 294 Thr He Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser Leu Leu Asn 70 75 80 TGT GAG GAG ATT AAA AGC CAG TTT GAA GGC TTT GTG AAG GAT ATA ATG 342 Cye Glu Glu He Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys Asp He Met 85 90 95 TTA AAC AAA GAG GAG ACG AAG AAA GAA AAC AGC TTT GAA ATG CAÁ AAA 390 Leu Asn Lye Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met Gln Lys 100 105 110 115 GGT GAT CAG AAT CCT CAÁ ATT GCG GCA CAT GTC ATA AGT GAG GCC AGC 438 Gly Asp Gln Asn Pro Gln He Ala Ala His Val He Ser Glu Ala Ser 120 125 130 AGT AAA ACA ACA TCT GTG TTA CAG TGG GCT GAA AAA GGA TAC TAC ACC 486 Ser Lye Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr 135 140 145 ATG AGC AAC AAC TTG GTA ACC CTG GAA AAT GGG AAA CAG CTG ACC GTT 534 Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val 150 155 160 AAA AGA CAÁ GGA CTC TAT TAT ATC TAT GCC CAÁ GTC ACC TTC TGT TCC 582 Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr He Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser 165 170 175 AAT CGG GAA GCT TCG AGT CAÁ GCT CCA TTT ATA GCC AGC CTC TGC CTA 630 Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe He Ala Ser Leu Cys Leu 180 185 190 195 AAG TCC CCC GGT AGA TTC GAG AGA ATC TTA CTC AGA GCT GCA AAT ACC 678 Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg He Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr 200 205 210 CAC AGT TCC GCC AAA CCT TGC GGG CAÁ CAÁ TCC ATT CAC TTG GGA GGA 726 His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser He His Leu Gly Gly 215 220 225 GTA TTT GAA TTG CAÁ CCA GGT GCT TCG GTG TTT GTC AAT GTG ACT GAT 774 Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp 230 235 240 CCA AGC CAÁ GTG AGC CAT GGC ACT GGC TTC ACG TCC TTT GGC TTA CTC 822 Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu 245 250 255 AAA CTC TGAACAGTGT CA 840 Lys Leu 260 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 261 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (¡x) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:2: Met He Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Leu Pro He Ser Met Lys He Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu 20 25 30 He Thr Gln Met He Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg 35 40 45 Arg Leu Asp Lys He Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val 50 55 60 Phe Met Lys Thr He Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser 65 70 75 80 Leu Leu Asn Cys Glu Glu He Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys 85 90 95 Asp He Met Leu Asn Lye Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu 100 105 110 Met Gln Lye Gly Asp Gln Asn Pro Gln He Ala Ala His Val He Ser 115 120 125 Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly 130 135 140 Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln 145 150 155 160 Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr He Tyr Ala Gln Val Thr 165 170 175 Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe He Ala Ser 180 185 190 Leu Cye Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg He Leu Leu Arg Ala 195 200 205 Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser He His 210 215 220 Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn 225 230 235 240 Val Thr Aep Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe 245 250 255 Gly Leu Leu Lys Leu 260 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 519 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTOS: sencillo (D) TOPOLOGÍA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HUMANO (vii) FUENTE INMEDIATA: (B) CLON: REGIÓN EXTRACELULAR CD40 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:3: CAGAACCACC CACTGCATGC AGAGAAAAAC AGTACCTAAT AAACAGTCAG TGCTGTTCTT 60 TGTGCCAGCC AGGACAGAAA CTGGTGAGTG ACTGCACAGA GTTCACTGAA ACGGAATGCC 120 TTCCTTGCGG TGAAAGCGAA TTCCTAGACA CCTGGAACAG AGAGACACAC TGCCACCAGC 180 ACAAATACTG CGACCCCAAC CTAGGGCTTC GGGTCCAGCA GAAGGGCACC TCAGAAACAG 240 ACACCATCTG CACCTGTGAA GAAGGCTGGC ACTGTACGAG TGAGGCCTGT GAGAGCTGTG 300 TCCTGCACCG CTCATGCTCG CCCGGCTTTG GGGTCAAGCA GATTGCTACA GGGGTTTCTG 360 ATACCATCTG CGAGCCCTGC CCAGTCGGCT TCTTCTCCAA TGTGTCATCT GCTTTCGAAA 420 AATGTCACCC TTGGACAAGC TGTGAGACCA AAGACCTGGT TGTGCAACAG GCAGGCACAA 480 ACAAGACTGA TGTTGTCTGT GGTCCCCAGG ATCGGCTGA 519 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 740 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTOS: sencillo (D) TOPOLOGÍA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HUMANO (vii) FUENTE INMEDIATA: (B) CLON: lgG1 Fe (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:4: CGGTACCGCT AGCGTCGACA GGCCTAGGAT ATCGATACGT AGAGCCCAGA TCTTGTGACA 60 AAACTCACAC ATGCCCACCG TGCCCAGCAC CTGAACTCCT GGGGGGACCG TCAGTCTTCC 120 TCTTCCCCCC AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACATGCG 180 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCTG AGGTCAAGTT CAACTGGTAC GTGGACGGCG 240 TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA GTACAACAGC ACGTACCGGG 300 TGGTCAGCGT CCTCACCGTC CTGCACCAGG ACTGGCTGAA TGGCAAGGAC TACAAGTGCA 360 AGGTCTCCAA CAAAGCCCTC CCAGCCCCCA TGCAGAAAAC CATCTCCAAA GCCAAAGGGC 420 AGCCCCGAGA ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGATGAGCTG ACCAAGAACC 480 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTATCCCAG GCACATCGCC GTGGAGTGGG 540 AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC TCCCGTGCTG GACTCCGACG 600 GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG 660 TCTTCTCATG CTCCGTGATG CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT 720 CCCTGTCTCC GGGTAAATGA 740 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:5: Arg Met Lys Gln He Glu Asp Lys He Glu Glu He Leu Ser Lye He 1 5 10 15 Tyr His He Glu Asn Glu He Ala Arg He Lys Lys Leu He Gly Glu 20 25 30 Arg (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTOS: no relevante (D) TOPOLOGÍA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:6: Pro Asp Val Ala Ser Leu Arg Gln Gln Val Glu Ala Leu Gln Gly Gln 1 5 10 15 Val Gln His Leu Gln Ala Ala Phe Ser Gln Tyr 20 25 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 929 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTOS: sencillo (D) TOPOLOGÍA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: trímero CD40L humano (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: sig_péptido (B) UBICACIÓN: 65..142 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 65..886 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_péptido (B) UBICACIÓN: 143..886 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:7: TGAGCGAGTC CGCATCGACG GATCGGAAAA CCTCTCCGAG GTACCTATCC CGGGGATCCC 60 CACC ATG TTC CAT GTT TCT TTT AGA TAT ATC TTT GGA ATT CCT CCA CTG 109 Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr He Phe Gly He Pro Pro Leu -26 -25 -20 -15 ATC CTT GTT CTG CTG CCT GTC ACT AGT TCT GAC CGT ATG AAA CAG ATA 157 He Leu Val Leu Leu Pro Val Thr Ser Ser Asp Arg Met Lys Gln He -10 -5 1 5 GAG GAT AAG ATC GAA GAG ATC CTA AGT AAG ATT TAT CAT ATA GAG AAT 205 Glu Asp Lys He Glu Glu He Leu Ser Lys He Tyr His He Glu Asn 10 15 20 GAA ATC GCC CGT ATC AAA AAG CTG ATT GGC GAG CGG ACT AGT TCT GAC 253 Glu He Ala Arg He Lys Lys Leu He Gly Glu Arg Thr Ser Ser Asp 25 30 35 AAG ATA GAA GAT GAA AGG AAT CTT CAT GAA GAT TTT GTA TTC ATG AAA 301 Lys He Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val Phe Met Lys 40 45 50 ACG ATA CAG AGA TGC AAC ACA GGA GAA AGA TCC TTA TCC TTA CTG AAC 349 Thr He Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser Leu Leu Asn 55 60 65 TGT GAG GAG ATT AAA AGC CAG TTT GAA GGC TTT GTG AAG GAT ATA ATG 397 Cys Glu Glu He Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys Asp He Met 70 75 80 85 TTA AAC AAA GAG GAG ACG AAG AAA GAA AAC AGC TTT GAA ATG CAÁ AAA 445 Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met Gln Lys 90 95 100 GGT GAT CAG AAT CCT CAÁ ATT GCG GCA CAT GTC ATA AGT GAG GCC AGC 493 Gly Asp Gln Asn Pro Gln He Ala Ala His Val He Ser Glu Ala Ser 105 110 115 AGT AAA ACA ACA TCT GTG TTA CAG TGG GCT GAA AAA GGA TAC TAC ACC 541 Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr 120 125 130 ATG AGC AAC AAC TTG GTA ACC CTG GAA AAT GGG AAA CAG CTG ACC GTT 589 Met Ser Asn Aen Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val 135 140 145 AAA AGA CAÁ GGA CTC TAT TAT ATC TAT GCC CA GTC ACC TTC TGT TCC 637 Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr He Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser 150 155 160 165 AAT CGG GAA GCT TCG AGT CAÁ GCT CCA TTT ATA GCC AGC CTC TGC CTA 685 Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe He Ala Ser Leu Cys Leu 170 175 180 AAG TCC CCC GGT AGA TTC GAG AGA ATC TTA CTC AGA GCT GCA AAT ACC 733 Lye Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg He Leu Leu Arg Ala Ala Aen Thr 185 " 190 195 CAC AGT TCC GCC AAA CCT TGC GGG CAÁ CAÁ TCC ATT CAC TTG GGA GGA 781 Kis Ser Ser Ala Lye Pro Cys Gly Gln Gln Ser He Hie Leu Gly Gly 200 205 210 GTA TTT GAA TTG CAÁ CCA GGT GCT TCG GTG TTT GTC AAT GTG ACT GAT 829 Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp 215 220 225 CCA AGC CAÁ GTG AGC CAT GGC ACT GGC TTC ACG TCC TTT GGC TTA CTC 877 Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu 230 235 240 245 AAA CTC TGAGCGGCCG CTACAGATGA ATAATAAGCA TGTTTGGATT CCTCAA 929 Lys Leu (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 273 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA. SEQ ID NO:8: Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr He Phe Gly He Pro Pro Leu He -26 -25 -20 -15 Leu Val Leu Leu Pro Val Thr Ser Ser Asp Arg Met Lys Gln He Glu -10 -5 1 5 Asp Lys He Glu Glu He Leu Ser Lys He Tyr His He Glu Asn Glu 10 15 20 He Ala Arg He Lys Lys Leu He Gly Glu Arg Thr Ser Ser Asp Lys 25 30 35 He Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val Phe Met Lys Thr 40 45 50 He Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser Leu Leu Asn Cye 55 60 65 70 Glu Glu He Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys Asp He Met Leu 75 80 85 Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lye Glu Aen Ser Phe Glu Met Gln Lye Gly 90 95 100 Asp Gln Asn Pro Gln He Ala Ala His Val He Ser Glu Ala Ser Ser 105 110 115 Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met 120 125 130 Ser Asn Aen Leu Val Thr Leu Glu Aen Gly Lye Gln Leu Thr Val Lye 135 140 145 150 Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr He Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cye Ser Asn 155 160 165 Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe He Ala Ser Leu Cys Leu Lye 170 175 180 Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg He Leu Leu Arg Ala Ala Aen Thr His 185 190 195 Ser Ser Ala Lye Pro Cye Gly Gln Gln Ser He Hie Leu Gly Gly Val 200 205 210 Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Aen Val Thr Asp Pro 215 220 225 230 Ser Gln Val Ser Hie Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lye 235 240 245 Leu

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un DNA aislado que codifica una muteína CD40L, seleccionado del grupo que consiste de: (a) un DNA que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO:2, en donde una cisteína en el aminoácido 194 se reemplaza con triptófano y (b) un DNA que codifica un polipéptido que es un fragmento de la muteína (a) que comprende triptófano en el aminoácido 194, y cuyo polipéptido liga CD40. 2. El DNA aislado de la reivindicación 1 , que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de polipéptidos que comprenden aminoácidos 1 a 261 , 35 a 261 , 34 a 225, 113 a 261 , 1 13 a 225, 120 a 261 , o 120 a 225 de la SEQ ID NO:

2.

3. El DNA aislado de acuerdo a la reivindicación 2, el cual comprende además un DNA que codifica un cierre de oligomerización teniendo una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO:5.

4. El DNA aislado de la reivindicación 3, en donde el DNA codifica una proteína de fusión que comprende el cierre de oligomerización fusionado al extremo amino-proximal de un fragmento del dominio extracelular de CD40L, que consiste de aminoácidos 1 13 a 261 de la SEQ ID NO:2.

5. Un vector de expresión recombinante que comprende un DNA de acuerdo a la reivindicación 4.

6. Una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante de acuerdo a la reivindicación 5.

7. Un proceso para preparar un polipéptido CD40L, comprendiendo cultivar una célula huésped de acuerdo a la reivindicación 6 bajo condiciones que promueven la expresión y recuperación de polipéptido CD40L del cultivo.

8. Un polipéptido CD40L codificado por un DNA de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.