ES2326347T3 - Metodo para regular la produccion de oxido nitrico. - Google Patents
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Abstract
ESTA INVENCION SE REFIERE A UNOS PROCEDIMIENTOS PARA REGULAR NIVELES DE MONOXIDO DE NITROGENO. ESTOS PROCEDIMIENTOS UTILIZAN RECEPTORES IL - 17, QUE SE PUEDEN UTILIZAR CONJUNTAMENTE CON INHIBIDORES DE IL - 1 Y/O TNF.
Description
Método para regular la producción de óxido
nítrico.
La presente invención se refiere de forma
general a la modulación de niveles de óxido nítrico, particularmente
en la osteoartritis.
Las citocinas son moléculas similares a las
hormonas que regulan varios aspectos de una respuesta inmune o
inflamatoria; ejercen sus efectos enlazándose específicamente a
receptores presentes en las células y transduciendo una señal a las
células. Además de tener efectos beneficiosos (es decir, desarrollo
de una respuesta inmune eficaz y control de la enfermedad
infecciosa), las citocinas también han sido implicadas en varios
estados autoinmunes e inflamatorios.
Varias células asociadas con el cartílago (es
decir, condrocitos, células del recubrimiento sinovial, células
endoteliales, fibrobastos sinoviales y células mononucleares que
están presentes en una articulación) pueden liberar óxido nítrico
(NO). Este radical libre sirve como un agente antimicrobiano de
primera línea y también tiene efectos antitumorales. Sin embargo,
el NO también ha sido implicado en varios estados perjudiciales,
incluyendo enfermedades autoinmunes e inflamatorias y en la
destrucción del hueso que se produce en la osteoartritis, que no se
considera típicamente como un estado inflamatorio.
Rouvier et al. (J. Inmunol. 150: 5445,
1993) informaron de un nuevo ADNc al que denominaron
CTLA-8 y que desde entonces se ha conocido como
interleucina-17 (IL-17). La
IL-17 es 57% homóloga con la secuencia de
aminoácidos predicha de un marco de lectura abierto (ORF) presente
en el herpesvirus saimiri (HVS) denominado HVS13 (Nicholas et
al., Virol. 179: 1 89, 1990; Albrecht et al., J. Virol.
66: 5047, 1992).
Se ha clonado un nuevo receptor que se enlaza a
la IL-17 y a su homólogo vírico HVS13 y han sido
descritos en el documento USSN 08/620.694, presentado el 21 de
marzo de 1996. El receptor es una proteína transmembranal de tipo
I; el receptor de ratón tiene 864 restos aminoácidos, el receptor
humano tiene 866 restos aminoácidos. Se ha encontrado que una forma
soluble del receptor inhibe varias actividades mediadas por la
IL-17.
El óxido nítrico (NO) es un radical libre que
está implicado en muchos fenómenos, incluyendo los estados
patofisiológicos de la artritis reumatoide (RA) y la osteoartritis
(OA). La IL-17 estimula la producción de NO por el
cartílago en individuos que padecen OA. Se ha encontrado que una
forma soluble del IL-17R inhibe varias actividades
mediadas por la IL-17. Consecuentemente, el
IL-17R será útil para regular los niveles de NO en
un entorno clínico.
La presente invención proporciona el uso del
receptor de la IL-17 soluble en la elaboración de un
medicamento para el tratamiento de la osteoartritis. Los modos de
realización preferidos de la invención se definen en las
reivindicaciones adjuntas.
El óxido nítrico es una molécula de señalización
intracelular que está implicada en muchos fenómenos fisiológicos,
incluyendo la relajación dependiente del endotelio, las respuestas
inmunes mediadas por neurotransmisión y por las células. Como
agente antimicrobiano, el NO es eficaz frente a bacterias, virus,
helmintos y parásitos; también es útil para matar las células
tumorales. En las enfermedades inflamatorias (es decir, artritis,
colitis ulcerativa, diabetes, enfermedad de Crohn) se producen
niveles aumentados de NO y se han usado inhibidores de la NO
sintetasa (NOS) en modelos experimentales de la enfermedad
inflamatoria con efectos variados (revisados por A. O. Vladutiu en
Clinical Immunology and Immunopathology 76:
1-11; 1995).
La osteoartritis (OA) se ha considerado
típicamente como una enfermedad no inflamatoria, sin embargo Amin
et al. (J. Exp. Med. 182: 2097, 1995) han informado
recientemente de que los niveles de NOS están aumentados en el
cartílago de los pacientes con OA. La incubación del cartílago
afectado por OA en medio sin suero produjo una liberación
espontánea de cantidades sustanciales de NO. La
interleucina-1\beta (IL-1\beta),
el factor a de necrosis tumoral (TNF-\alpha) y el
lipopolisacárido (LPS) aumentaron la liberación de nitrito en el
cartílago afectado por OA. Resultados similares fueron observados
por Sakurai et al. (J. Clin. Invest. 96: 2357, 1995)
en pacientes con artritis reumatoide.
La IL-17 también aumenta la
liberación en el cartílago afectado por OA. Además, los inhibidores
de la IL-1\beta y el TNF-\alpha
no inhiben la liberación de NO aumentada por la
IL-17. Consecuentemente, los inhibidores de la
IL-17 serán útiles para regular los niveles de NO.
Dichos inhibidores encontrarán aplicaciones terapéuticas en la
mejora de los efectos del NO en la OA, así como en otros estados de
enfermedad en los que este radical libre tenga un papel (es decir,
enfermedad autoinmune e inflamatoria).
Una forma particularmente preferida de inhibidor
de la IL-17 es el IL-17R soluble que
se describe en detalle en la patente estadounidense Nº 5.869.286.
Los inhibidores de la IL-17 pueden usarse en
conjunción (es decir, de forma simultánea, separada o secuencial)
con inhibidores de la IL-1 y el TNF. Ejemplos de
inhibidores de la IL-1 incluyen los receptores de
la IL-1 solubles, tales como los descritos en las
patentes estadounidenses 5.319.071, 5.180.812 y 5.350.683 así como
una proteína conocida como antagonista del receptor de la
IL-1 (IL-1RA; Eisenberg et al.,
Nature 343: 341, 1990) e inhibidores de una enzima que escinde
la IL-1 en su forma biológicamente activa, como se
describe en la patente estadounidense 5.416.013.
Los ejemplos de inhibidores del TNF incluyen las
formas solubles de los receptores del TNF, como se describen por
ejemplo en la patente estadounidense 5.395.760 y las proteínas de
fusión al receptor del TNF, tales como las descritas en la patente
estadounidense 6.541.610. Además, se sabe que algunas proteínas
codificadas por virus se enlazan al TNF y actúan como antagonistas
del TNF, como se describe en las patentes estadounidenses 5.359.039
o 5.464.938; y también se conocen inhibidores de una enzima que
escinde el TNF en su forma biológicamente activa (véanse las
patentes estadounidenses 5.629.285 y 5.230.742).
La CTLA-8 se refiere a un ADNc
clonado a partir de un clon de hibridoma de células T activadas
(Rouvier et al. J. Inmunol. 150: 5445, 1993). Los análisis
por transferencia de Northern indicaron que la transcripción de la
CTLA-8 fue muy específica del tejido. Se encontró
que el gen de la CTLA-8 mapea en un sitio
cromosómico 1a en ratones y en uno 2q31 en humanos. Aunque Rouvier
et al. nunca identificaron una proteína codificada por el
gen de la CTLA-8, se encontró que la secuencia de
aminoácidos predicha para la CTLA-8 era homóloga
al 57% con la secuencia de aminoácidos predicha para un ORF presente
en el herpesvirus saimiri HVS13. La proteína CTLA-8
se denomina en la presente memoria interleucina-17
(IL-17).
Se ha publicado la secuencia nucleotídica
completa del genoma del HVS (Albrecht et al., J. Virol. 66:
5047, 1992). Se han descrito estudios adicionales sobre uno de los
marcos de lectura abiertos (ORF) del HVS, HVS13, en Nicholas et
al., Virol., 179: 189, 1990. El HVS13 es un gen tardío que está
presente en el fragmento HindIII-G del HVS. Se cree
que los antisueros desarrollados contra los péptidos derivados del
HVS13 reaccionan con la proteína tardía (Nicholas et al.,
supra).
La proteína CTLA-8 murina de
longitud completa y una proteína de fusión CTLA-8/Fc
han sido expresadas y analizadas y se ha encontrado que actúan como
un co-estímulo para la proliferación de las células
T. La IL-17 humana (CTLA-8) se
identificó analizando una biblioteca de células T humanas usando un
fragmento de ADN obtenido por PCR de secuencias degeneradas; se
espera que también existan homólogos de la IL-17
(CTLA-8) en otras especies. También se ha expresado
una proteína HVS13 de longitud completa, así como una proteína de
fusión HVS13/Fc, y se encontró que actúa de forma similar a la
proteína IL-17 (CTLA-8). Además,
también es probable que otras especies de virus del herpes
codifiquen proteínas homólogas a las codificadas por el HVS13.
La patente estadounidense 5.869.286 describe el
IL-17R y sus homólogos aislados que presentan una
actividad inmunorreguladora. Dichas proteínas están esencialmente
libres de materiales endógenos contaminantes y, opcionalmente, sin
glicosilación asociada de patrón natural. Los derivados del
IL-17R dentro del alcance de la invención también
incluyen varias formas estructurales de la proteína primaria que
conservan su actividad biológica. Debido a la presencia de grupos
amino y carboxilo ionizables, por ejemplo, una proteína
IL-17 puede estar en forma de sales ácidas o
básicas o puede estar en forma neutra. Los restos aminoácidos
individuales también se pueden modificar por oxidación o
reducción.
La estructura primaria de aminoácidos puede
modificarse formando conjugados covalentes o agregativos con otros
restos químicos, tales como grupos glicosilo, lípidos, fosfato,
grupos acetilo y similares, o creando mutantes de secuencia de
aminoácidos. Los derivados covalentes se preparan uniendo grupos
funcionales particulares con cadenas de aminoácidos laterales o en
los extremos N- o C-terminales.
Las formas solubles del IL-17R
están dentro del alcance de la invención. El nucleótido y la
secuencia de aminoácidos predicha del IL-17R murino
se muestra en las SEQ. ID. Nº 1 y 2. Los análisis por ordenador
indicaron que la proteína tiene un péptido señal
N-terminal con un sitio de escisión entre los
aminoácidos 31 y 32. Los expertos en la técnica reconocerán que el
sitio de escisión real puede ser diferente del predicho por el
análisis por ordenador. Así, se espera que el aminoácido
N-terminal del péptido escindido esté entre
aproximadamente cinco aminoácidos a cada lado del sitio de escisión
predicho. El péptido señal es seguido por un domino extracelular de
291 aminoácidos, un dominio transmembranal de 21 aminoácidos y una
cola citoplasmática de 521 aminoácidos. El IL-17R
soluble comprende el péptido señal y el dominio extracelular (restos
1 a 322 de la SEQ. ID. Nº 1) o uno de sus fragmentos.
Alternativamente, un péptido señal diferente puede estar sustituido
por los restos 1 a 31 de la SEQ. ID. Nº 1.
El nucleótido y la secuencia de aminoácidos
predicha del IL-17R humanos se muestran en las SEQ.
ID. Nº 3 y 4. Comparte muchas características con el
IL-17R murino. El análisis por ordenador indicó que
la proteína tiene un péptido señal N-terminal con
un sitio de escisión entre los aminoácidos 27 y 28. Los expertos en
la técnica reconocerán que el sitio de escisión real puede ser
diferente que el predicho por el análisis por ordenador. Así, se
espera que el aminoácido N-terminal del péptido
escindido esté entre aproximadamente cinco aminoácidos a cada lado
del sitio de escisión predicho. El péptido señal es seguido por un
domino extracelular de 293 aminoácidos, un dominio transmembranal
de 21 aminoácidos y una cola citoplasmática de 525 aminoácidos. El
IL-17R soluble comprende el péptido señal y el
dominio extracelular (restos 1 a 320 de la SEQ. ID. Nº 1) o uno de
sus fragmentos. Alternativamente, un péptido señal diferente puede
estar sustituido por el péptido señal natural.
Otros derivados de la proteína
IL-17R y sus homólogos dentro del alcance de la
invención incluyen los conjugados covalentes o agregativos de la
proteína o de sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos, tal
como por síntesis en cultivos recombinantes como fusiones
N-terminales o C-terminales. Por
ejemplo, el péptido conjugado puede ser una secuencia polipeptídica
señal (o líder) en la región N-terminal de la
proteína que, de forma simultánea o posterior a la traducción,
dirige la transferencia de la proteína de su sitio de síntesis a su
sitio de función dentro o fuera de la membrana o de la pared celular
(por ejemplo el líder del factor \alpha en levaduras).
Las fusiones de proteínas pueden comprender
péptidos añadidos para facilitar la purificación o identificación
de las proteínas IL-17R y sus homólogos (por
ejemplo, poli-His). La secuencia de aminoácidos de
las proteínas de la invención también puede unirse a un péptido de
identificación tal como el descrito por Hopp et al.,
BioTechnology 6: 1204 (1988). Dicho péptido altamente antigénico
proporciona un epítope enlazado reversiblemente por un anticuerpo
monoclonal específico, permitiendo un ensayo rápido y una fácil
purificación de la proteína recombinante expresada. La secuencia de
Hopp et al. también es escindida específicamente por una
enterocinasa de mucosa bovina permitiendo la eliminación del
péptido de la proteína purificada. Las proteínas de fusión con
dichos péptidos en los extremos también pueden ser resistentes a la
degradación intracelular en E. coli.
Las formas solubles de algunas proteínas
transmembranales han sido expresadas como proteínas de fusión en
las que un dominio extracelular de una proteína de membrana (región
de enlace cognado) se une a un dominio de inmunoglobulina constante
de cadena pesada (Fc). Dichas proteínas de fusión son útiles como
reactivos para detectar sus proteínas cognadas. También son útiles
como agentes terapéuticos en el tratamiento de la enfermedad. Sin
embargo, los receptores de los dominios Fc están presentes en muchos
tipos de células. Así, cuando se forma una proteína de fusión a
partir de un dominio Fc y una región de enlace cognada, el enlace a
una célula puede ocurrir bien mediante el enlace de la región de
enlace cognada con su proteína cognada o bien mediante el enlace
del dominio Fc a un receptor del Fc (FcR). Dicho enlace del dominio
Fc a los receptores del Fc puede evitar cualquier enlace de la
región de enlace cognada a su cognado. Además, el enlace de los
dominios Fc a los receptores del Fc induce la secreción de varias
citocinas que están implicadas en el aumento de varios aspectos de
una respuesta inmune o inflamatoria; dicho aumento ha sido implicado
en algunos de los efectos adversos de la administración terapéutica
de algunos anticuerpos (Krutman et al., J. Immunol. 145:
1337, 1990; Thislewaite et al., Am. J. Kidney Dis. 11: 112,
1988).
Jefferis et al. (Mol. Immunol. 27:
1237, 1990) han informado de que una región de un anticuerpo
denominada región bisagra (y específicamente los restos
234-237 en esta región) determina el reconocimiento
del anticuerpo por los receptores del Fc humanos Fc\gammaRI,
Fc\gammaRII y Fc\gammaRIII. Leu_{(234)} y Leu_{(235)}
fueron críticos en el enlace de alta afinidad de la IgG_{3} al
Fc\gammaRI presente en las células U937 (Canfield y Morrison,
J. Exp. Med. 173: 1483, 1991). Resultados similares fueron
obtenidos por Lund et al. (J. Immunol. 147: 2657, 1991;
Molecular Immunol. 29: 53, 1991). Estos autores observaron
una disminución de 10-100 veces en la afinidad de la
IgG por el FcR cuando se sustituyó un único aminoácido en un resto
crítico.
Se encontró que la sustitución de un único
aminoácido en el dominio Fc de un anticuerpo monoclonal
anti-CD3 (leucina por ácido glutámico en la
posición 235) producía una activación de las células T
significativamente menor que con el anticuerpo no mutado,
manteniendo a la vez las propiedades inmunosupresoras (Alegre et
al., J. Immunol. 148: 3461, 1992). Wawrzynczak et al.
encontraron que los anticuerpos monoclonales murinos que contenían
una sustitución de un único aminoácido en el resto 235 tenían la
misma semivida en suero que los anticuerpos naturales (Mol.
Immunol. 29: 221, 1992). Los dominios Fc con afinidad reducida
por los receptores del Fc son útiles en la preparación de proteínas
de fusión del Fc.
Los cierres de leucina se identificaron
originalmente en varias proteínas de enlace de ADN (Landschulz et
al. Science 240: 1759, 1988). El dominio de cierre de leucina es
un término utilizado para denominar un dominio peptídico conservado
presente en estas (y otras) proteínas que es el responsable de la
dimerización de las proteínas. El dominio de cierre de leucina
(también denominado en la presente memoria como dominio de
oligomerización o formador de oligómeros) comprende una repetición
de grupos de siete unidades repetitivos, con cuatro o cinco restos
leucina dispersos con otros aminoácidos. Ejemplos de dominios de
cierre de leucina son los encontrados en el factor de transcripción
GCN4 de levaduras y una proteína de enlace de ADN térmicamente
estable encontrada en el hígado de rata (C/EBP, Landschulz et
al., Science 243: 1681, 1989). Dos proteínas de transformación
nuclear, fos y jun, también presentan dominios de
cierre de leucina, al igual que el producto génico del
proto-oncogén murino c-myc
(Landschulz et al. Science 240: 1759, 1988). Los productos
de los oncogenes nucleares fos y jun que comprenden
dominios de cierre de leucina forman preferentemente un
heterodímero (O'Shea et al. Science 245: 646, 1989; Turner y
Tjian, Science 243: 1689, 1989). El dominio de cierre de
leucina es necesario para la actividad biológica (unión al ADN) de
estas proteínas.
Las proteínas fusogénicas de varios virus
diferentes, incluyendo paramixovirus, virus corona, virus del
sarampión y muchos retrovirus, también presentan dominios de cierre
de leucina (Auckland y Wild, Nature 338: 547, 1989; Britton,
Nature 353: 394, 1991; Delwart y Mosialos, AIDS Research
and Human Retroviruses 6: 703, 1990). Los dominios de cierre de
leucina en estas proteínas fusogénicas víricas están cerca de la
región transmembranal de las proteínas; se ha sugerido que los
dominios de cierre de leucina podrían contribuir a la estructura
oligomérica de las proteínas fusogénicas. La oligomerización de las
proteínas fusogénicas víricas está implicada en la formación del
poro de fusión (Spruce et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
88: 3523, 1991). Recientemente se ha publicado que los dominios de
cierre de leucina tienen un papel en la oligomerización de los
factores de transcripción del choque térmico (Rabindran et al.
Science 259: 230, 1993).
Los dominios de cierre de leucina se pliegan en
dobles hélices cortas, paralelas (O'Shea et al. Science 254:
539, 1991). La arquitectura general de la doble hélice paralela ha
sido bien caracterizado con un empaquetamiento del tipo
"knobs-into-holes"
("protuberancias en agujeros") como propuso Crick en 1953
(Acta Crystallogr. 6: 689). El dímero formado por un dominio
de cierre de leucina está estabilizado por la repetición del grupo
de siete restos denominado (abcdefg)_{n} según la notación
de McLachlan y Stewart (J. Mol. Biol. 98: 293, 1975), donde
los restos a y d son generalmente restos hidrófobos,
siendo d una leucina, que se alinea en la misma cara de una
hélice. En las posiciones g y e generalmente se
encuentran restos con carga opuesta. Por lo tanto, en una doble
hélice paralela formada por dos dominios de cierre de leucina, las
"protuberancias" (knobs) formados por las cadenas
laterales hidrófobas de la primera hélice están empaquetados en los
"agujeros" (holes) formados entre las cadenas laterales
de la segunda hélice.
Los restos leucina en la posición d
aportan energías de estabilización hidrófóbica grandes y son
importantes para la formación del dímero (Krystek et al. Int. J.
Peptide Res. 38: 229, 1991). Lovejoy et al. publicaron
recientemente la síntesis de un paquete de hélice \alpha de tripe
cadena en el que las hélices van
arriba-arriba-abajo (Science
259: 1288, 1993). Sus estudios confirmaron que la energía de
estabilización hidrofóbica proporciona la principal fuerza
impulsora para la formación de las dobles hélices a partir de
monómeros helicoidales. Estos estudios también indicaron que las
interacciones electrostáticas contribuyen a la estequiometría y la
geometría de las dobles hélices.
Varios estudios han indicado que los aminoácidos
conservativos pueden ser sustituidos por restos leucina individuales
con una disminución mínima de la capacidad de dimerización; sin
embargo, múltiples cambios producirán generalmente una pérdida de
esta capacidad (Landschulz et al. Science, 243: 1681, 1989;
Turner y Tijan, Science 243: 1689, 1989; Hu et al. Science
250: 1400, 1990). van Heekeren et al. han publicado que se
pueden sustituir varios restos amino diferentes por restos leucina
en el dominio de cierre de leucina de la GCN4 y además han
descubierto que algunas proteínas GCN4 que contiene dos
sustituciones de leucina eran débilmente activas (Nucl. Acids
Res. 20: 3721, 1992). La mutación de la primera y segunda
leucinas del grupo de siete restos del dominio de cierre de leucina
de la proteína de fusión del virus del sarampión (MVF) no afectó a
la formación del sincitio (una medida de la fusión celular inducida
por virus); sin embargo, la mutación de los cuatro restos leucina
evitó completamente la fusión (Buckland et al., J. Gen.
Virol. 73: 1703, 1992). Ninguna de las mutaciones afectó a la
capacidad de la MVF para formar un tetrámero.
Recientemente, se ha encontrado que las
sustituciones de aminoácidos en los restos a y d de un
péptido sintético que representa el dominio de cierre de leucina de
la GCN4 cambian las propiedades de oligomerización del dominio de
cierre de leucina (Alber, Sixth Symposium of the Protein
Society, San Diego, CA). Cuando todos los restos en la posición
a se cambian por isoleucina, el cierre de leucina todavía
forma un dímero paralelo. Cuando, además de este cambio, todos los
restos leucina en la posición d también se cambian por
isoleucina, el péptido resultante forma espontáneamente una doble
hélice trimérica paralela en disolución. Sustituyendo todos los
aminoácidos en la posición d con isoleucina y en la posición
a con leucina se obtiene un péptido que tetrameriza. Los
péptidos que contienen estas sustituciones todavía se denominan
dominio de cierre de leucina ya que se cree que el mecanismo de
formación del oligómero es el mismo que en los dominios de cierre
de leucina tradicionales tales como los descritos
anteriormente.
anteriormente.
Los derivados del IL-17R también
pueden ser utilizados como inmunógenos, reactivos en ensayos in
vitro o como agentes de enlace en procedimientos de
purificación por afinidad. Dichos derivados también se pueden
obtener mediante agentes de entrecruzamiento, tales como el éster
M-maleimidobenzoilsuccinimida y la
N-hidroxisuccinimida, en los restos cisteina y
lisina. Las proteínas de la invención también pueden enlazarse
covalentemente mediante grupos laterales reactivos con varios
sustratos insolubles, tales como en estructuras de agarosa activadas
con bromuro de cianógeno, activadas con bisoxirano, activadas con
carbonildiimidazol o activadas con tosilo, o adsorbiéndose en
superficies poliolefínicas (con o sin entrecruzamiento con
glutaraldehído). Una vez enlazado a un sustrato, las proteínas se
pueden usar para enlazarse selectivamente (con el propósito de
ensayo o purificación) con anticuerpos cultivados frente al
IL-17R o frente a otras proteínas que son similares
al IL-17R, así como con otras proteínas que se
enlazan al IL-17R o sus proteínas homólogas.
La presente invención también se refiere al
IL-17R con o sin glicosilación asociada de patrón
natural. Las proteínas expresadas en levaduras o sistemas de
expresión de mamíferos, por ejemplo células COS-7,
pueden ser similares o ligeramente diferentes en peso molecular y
patrón de glicosilación que las moléculas naturales, dependiendo
del sistema de expresión. La expresión de los ADN que codifican las
proteínas de la invención en bacterias tal como la E. coli
proporcionan moléculas no glicosiladas. Los análogos mutantes
funcionales de la proteína del IL-17R o sus
homólogos que tienen sitios de N-glicosilación
desactivados se pueden producir por síntesis del oligonucleótido y
ligadura o mediante técnicas de mutagénesis de sitio específico.
Estas proteínas análogas se pueden producir en forma homogénea de
carbohidrato reducido con un buen rendimiento usando sistemas de
expresión en levaduras. Los sitios de
N-glicosilación en las proteínas eucarióticas se
caracterizan por el triplete de aminoácidos
Asn-A_{1}-Z en el que A_{1} es
cualquier aminoácido excepto Pro y Z es Ser o Thr. En esta
secuencia la aspargina proporciona un grupo amino de cadena lateral
para la unión covalente de hidrocarburo. Dicho sitio se puede
eliminar sustituyendo otro aminoácido por el Asn o por el resto Z,
por deleción de Asn o Z o insertando un aminoácido distinto de Z
entre A_{1} y Z o un aminoácido distinto de Asn entre Asn y
A_{1}.
Los derivados de la proteína
IL-17R también se pueden obtener por mutaciones del
IL-17R natural o sus subunidades. Una proteína
IL-17R mutada, como se denomina en la presente
memoria, es un polipéptido homólogo de una proteína
IL-17R pero que tienen una secuencia de aminoácidos
diferente del IL-17R nativo por una o varias
deleciones, inserciones o sustituciones. El efecto de cualquier
mutación hecha en un ADN que codifica el péptido
IL-17R se puede determinar fácilmente analizando la
capacidad del péptido IL-17R mutado para inhibir la
coestimulación de las células T o B por el IL-17R
(CTLA-8) o sus proteínas homólogas, o para enlazarse
a proteínas que se enlazan específicamente al
IL-17R (por ejemplo, anticuerpos o proteínas
codificadas por el ADNc de la CTLA-8 o el ORF del
HVS13). Además, la actividad de los análogos, muteinas o derivados
del IL-17R se puede determinar por cualquiera de
los métodos de ensayo descritos en la presente memoria. Se pueden
realizar mutaciones similares en los homólogos del
IL-17R y se pueden analizar de una forma
similar.
Se pueden construir análogos bioequivalentes de
las proteínas de la invención, por ejemplo, haciendo varias
sustituciones de restos o secuencias o deleciones de restos o
secuencias terminales internas no necesarias para la actividad
biológica. Por ejemplo, los restos cisteina pueden sufrir una
deleción o ser reemplazados por otros aminoácidos para evitar la
formación de enlaces de disulfuro intramoleculares incorrectos
durante la renaturalización. Otras aproximaciones a la mutagénesis
implican la modificación de restos aminoácidos dibásicos adyacentes
para aumentar la expresión en sistemas de levaduras en los que está
presente la actividad proteasa KEX2.
De forma general, las sustituciones se deben
realizar de forma conservativa, es decir, los aminoácidos sustitutos
más preferidos son aquellos que no afectan la capacidad de las
proteínas de la invención para enlazar sus ligandos de una forma
esencialmente equivalente a la de la mIL-17R o
hIL-17R naturales. Ejemplos de sustituciones
conservativas incluyen la sustitución de aminoácidos fuera del (de
los) dominio(s) de enlace y la sustitución de aminoácidos
que no alteran la estructura secundaria y/o terciaria del
IL-17R y sus homólogos. Ejemplos adicionales
incluyen la sustitución de un resto alifático por otro, tal como
Ile, Val, Leu o Al por otro, o sustituciones de un resto polar por
otro, tal como entre Lys y Arg, Glu y Asp o Gln y Asn. Otras de
estas sustituciones conservativas, por ejemplo sustituciones de
regiones completas que tienen características de hidrofobicidad
similares son bien conocidas.
De forma similar, cuando se adopta una
estrategia de deleción o inserción, se debe considerar el efecto
potencial de la deleción o la inserción sobre la actividad
biológica. Las subunidades de las proteínas de la invención se
pueden construir mediante la deleción de restos o secuencias
terminales o internos. Los fragmentos del IL-17R
que se enlazan a la IL-17 se pueden preparar
fácilmente (por ejemplo, usando enzimas de restricción para la
deleción de porciones de ADN) y se puede analizar su capacidad para
enlazarse a la IL-17. Una guía adicional para los
tipos de mutaciones que se pueden hacer es proporcionada por una
comparación de la secuencia del IL-17R con las
proteínas que tienen estructuras similares, así como por la
realización de análisis estructurales de las proteínas de la
invención.
Las mutaciones en las secuencias de nucleótidos
construidas por la expresión de análogos del IL-17R
deben, por supuesto, preservar la fase del marco de lectura de las
secuencias codificantes y preferiblemente no crearán regiones
complementarias que puedan hibridarse para producir estructuras
secundarias de ARNm tales como bucles o estructuras en horquilla
que puedan afectar adversamente a la traducción de ARNm receptor.
Aunque se pueda predeterminar un sitio de mutación, no es necesario
que se determine la naturaleza de la mutación per se. Por
ejemplo, con el fin de elegir las características óptimas de los
mutantes en un sitio dado, se puede realizar mutagénesis aleatoria
en el codón diana y analizar la actividad deseada en las proteínas
víricas mutadas.
No todas la mutaciones en la secuencia de
nucleótidos que codifica la proteína IL-17R o sus
homólogos se expresarán en el producto final, por ejemplo se pueden
hacer sustituciones de nucleótidos para aumentar la expresión,
fundamentalmente para evitar bucles de estructura secundaria en el
ARNm transcrito (véase el documento EPA 75.444A, incorporando en la
presente memoria como referencia) o para proporcionar codones que
sean traducidos más fácilmente por el huésped elegido, por ejemplo
la bien conocida preferencia de los codones de la E. coli por
la expresión de la E. coli.
Se pueden introducir mutaciones en un sitio
particular sintetizando los oligonucleótidos que contengan una
secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que permitan
la ligadura de fragmentos de la secuencia natural. Después de la
ligadura, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo
que tiene la inserción, sustitución o deleción de aminoácidos
deseada.
Alternativamente, se pueden emplear
procedimientos de mutagénesis de sitio específico dirigida a un
oligonucleótido para proporcionar un gen modificado que tenga
codones particulares modificados según la sustitución, deleción o
inserción necesaria. Los ejemplos de métodos para realizar las
alteraciones detalladas anteriormente se describen en Walter et
al. (Gene 42: 133, 1986); Bauer et al. (Gene 37: 73,
1985); Craik (BioTechniques, enero de 1985,
12-19); Smith et al. (Genetic Engineering:
Principles and Methods, Plenum Press, 1981); y las patentes
estadounidenses Nº 4.518.584 y 4.737.462 describen técnicas
adecuadas y se incorporan como referencia en la presente
memoria.
Debido a la degeneración del código, puede haber
una considerable variación en las secuencias de nucleótidos que
codifican la misma secuencia de aminoácidos. Otros modos de
realización incluyen las secuencias capaces de hibridarse en
condiciones moderadamente severas (disolución de prelavado de 5 x
SSC, 0,5% de SDS, EDTA 1,0mM (pH 8,0) y condiciones de hibridación
de 50ºC, 5 x SSC, durante la noche) las secuencias de ADN que
codifican el IL-17R y otras secuencias que están
degeneradas con las que codifican el IL-17R. En un
modo de realización preferido, los análogos del
IL-17R tienen una secuencia de aminoácidos idéntica
en al menos aproximadamente 70% a la secuencia de aminoácidos de
las proteínas IL-17R como se detallan en las SEQ.
ID. Nº 1 o SEQ. ID. Nº 3. De forma similar, los análogos de los
homólogos del IL-17R tienen una secuencia de
aminoácidos idéntica en al menos 70% a la secuencia de aminoácidos
de las proteínas homólogas naturales. En un modo de realización más
preferido, los análogos del IL-17R o sus homólogos
tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos
aproximadamente 80% a la forma natural de las proteínas de la
invención; en el modo de realización más preferido, los análogos
del IL-17R o sus homólogos tiene una secuencia de
aminoácidos idéntica en al menos aproximadamente 90% a la forma
natural de las proteínas de la invención
El porcentaje de identidad se puede determinar
usando un programa de ordenador, por ejemplo el programa de
ordenador GAP descrito por Devereux et al. (Nucl. Acids Res.
12: 387, 1984) y disponible en el Grupo de Genética Computacional
de la Universidad de Wisconsin (UWGCG por sus iniciales en inglés:
University of Wisconsin Genetics Computer Group). Para los
fragmentos derivados de la proteína IL-17R, la
identidad se calcula en función de la porción de proteína
IL-17R que está presente en el fragmento. Se pueden
usar métodos similares para analizar los homólogos del
IL-17R.
La capacidad de los análogos del
IL-17R para enlazarse a la CTLA-8 se
puede determinar analizando la capacidad de los análogos para
inhibir la proliferación de células T inducida por la
IL-17 (CTLA-8). Alternativamente,
se pueden usar ensayos adecuados, por ejemplo un inmunoensayo
enzimático o un ensayo de transferencia puntual (dot blot),
empleando CTLA-8 o HSV13 (o uno de sus homólogos que
se enlaza con el IL-17R natural) para evaluar la
capacidad de los análogos del IL-17R para enlazarse
con la CTLA-8. Dichos métodos son bien conocidos en
la técnica.
Las proteínas de la presente invención se
producen preferiblemente por métodos de ADN recombinante insertando
una secuencia de ADN que codifica la proteína IL-17R
o uno de sus homólogos en un vector de expresión recombinante y
expresando la secuencia de ADN en un sistema de expresión
recombinante microbiano en condiciones que favorecen la expresión.
Las secuencias de ADN que codifican las proteínas proporcionadas por
esta invención se pueden ensamblar a partir de fragmentos de ADNc y
conectores cortos de oligonucleótidos, o a partir de series de
oligonucleótidos, para proporcionar un gen sintético que sea capaz
de insertarse en un vector de expresión recombinante y expresarse en
una unidad de transcripción recombinante.
Los vectores de expresión recombinante incluyen
fragmentos de ADN sintéticos o derivados del ADNc que codifican al
IL-17R, homólogos o análogos bioequivalentes, unidos
de forma operativa con elementos reguladores de la transcripción o
la traducción adecuados obtenidos a partir de genes de mamíferos,
microbianos, víricos o de insectos. Dichos elementos reguladores
incluyen un promotor de transcripción, una secuencia operadora
opcional para controlar la transcripción, una secuencia que
codifica los sitios de enlace del ARNm ribosómico adecuados y
secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la
traducción, como se describe con detalle a continuación.
Adicionalmente se pueden incorporar la capacidad para replicarse en
un huésped, generalmente conferida por un origen de replicación, y
un gen de selección para facilitar el reconocimiento de los
transformantes.
Las regiones del ADN están unidas de forma
operativa cuando están relacionadas funcionalmente unas con otras.
Por ejemplo, el ADN de un péptido señal (líder de secreción) está
unido de forma operativa con el ADN de un polipéptido si se expresa
como un precursor que participa en la secreción del polipéptido; un
promotor está unido de forma operativa para una secuencia
codificante si controla la transcripción de la secuencia; o un
sitio de enlace ribosómico está unido de forma operativa con una
secuencia codificante si está colocado de forma que permite la
traducción. Generalmente, unido de forma operativa significa
contiguo y, en el caso de los líderes de secreción, contiguo y en
el marco de lectura. Las secuencias de ADN que codifican al
IL-17R o sus homólogos que deben ser expresados en
un microorganismo preferiblemente no contendrá intrones que puedan
terminar prematuramente la transcripción del ADN en ARNm.
Los vectores de expresión útiles para su uso
bacteriano pueden comprender un marcador elegible y un origen de
replicación bacteriano derivado de plásmidos disponibles
comercialmente que comprenden elementos genéticos del vector de
clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017). Dichos vectores
comerciales incluyen, por ejemplo, el pKK223-3
(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promega Bostec,
Madison, WI, USA). Estas secciones "vertebrales" del pBR322 se
combinan con un promotor adecuado y la secuencia estructural que se
debe expresar. La E. Coli se transforma típicamente usando
derivados del pBR322, un plásmido obtenido a partir de una especie
de E. Coli (Bolivar et al., Gene 2: 95, 1977). El
pBR322 contiene genes para la resistencia a la ampicilina y la
tetraciclina y por lo tanto proporciona un medio sencillo para
identificar las células transformadas.
Los promotores usados generalmente en los
vectores de expresión recombinantes microbianos incluyen la
\beta-lactamasa (penicilinasa) y el sistema
promotor de la lactosa (Chang et al., Nature 275: 615, 1978;
y Goeddel et al., Nature 281: 544, 1979), el sistema promotor
del triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:
4057, 1980; y EPA 36.776) y un promotor del tac (Maniatis,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, pág. 412, 1982). Un sistema de expresión particularmente
útil emplea el promotor de fago \lambda P_{L} y el represor
termolábil cI857ts. Los vectores del plásmido disponibles en la
colección de la American Type Culture Collection que incorpora
derivados del promotor del \lambda P_{L} incluyen el plásmido
pHUB2, residente en la cepa de E. Coli JMB9 (ATCC 37092) y el
pPLc28 residente en la E. Coli RR1 (ATCC 53082).
Las secuencias promotoras adecuadas en vectores
de levaduras incluyen los promotores para la metalotioneina,
3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman et al., J.
Biol. Chem. 255: 2073, 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess
et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; y Holland et
al., Biochem. 17: 4900, 1978), tales como enolasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa,
fosfofructocinasa,
glucosa-6-fosfato isomerasa,
3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa,
triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa. Los
vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión de
levaduras se describen adicionalmente en R. Hitzeman et al.,
EPA 73.657.
Los vectores preferidos en levaduras se pueden
ensamblar usando secuencias de ADN del pBR322 para la selección y
replicación en E. Coli (gen Amp^{r} y origen de
replicación) y secuencias de ADN de levaduras incluyendo un
promotor ADH2 reprimible con glucosa y un líder de secreción del
factor \alpha. El promotor ADH2 ha sido descrito por Russell
et al. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) y Beier et
al. (Nature 300: 724, 1982). El líder del factor
\alpha en levaduras, que dirige la secreción de proteínas
heterólogas, se puede insertar entre el promotor y el gen
estructural que debe ser expresado. Véase, por ejemplo, Kurjan et
al., Cell 30: 933, 1982; y Bitter et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 81: 5330, 1984. La secuencia líder se puede modificar
para que contenga, cerca de su extremo 3', uno o más sitios de
restricción útiles para facilitar la fusión de la secuencia líder
con los genes extraños.
Las secuencias de control de la transcripción y
la traducción en los vectores de expresión que se deben usar para
transformar las células de vertebrados pueden ser proporcionadas por
fuentes víricas. Por ejemplo, los promotores y potenciadores
comúnmente usados se derivan de polioma, adenovirus 2, virus 40 de
simios (SV40) y citomegalovirus humano. Las secuencias de ADN
derivadas del genoma vírico del SV40 por ejemplo el origen,
promotor temprano y tardío, potenciador, sitio de empalme y sitio de
poliadenilación del SV40 se pueden usar para proporcionar los otros
elementos genéticos necesarios para la expresión de una secuencia de
ADN heteróloga. Los promotores temprano y tardío son
particularmente útiles porque ambos se obtienen fácilmente a partir
del virus como un fragmento que también contiene el origen de
replicación vírico del SV40 (Fiers et al., Nature 273: 113,
1978). También se pueden usar fragmentos de SV40 mayores o menores,
con la condición de que se incluya la secuencia de aproximadamente
250 bp que se extiende desde el sitio HindIII hasta el sitio
BglI situados en el origen de replicación vírico. Además, se
pueden usar el promotor genómico vírico, secuencias de control y/o
señal, con la condición de que dichas secuencias de control sean
compatibles con la célula huésped elegida. Los vectores ejemplo se
pueden construir como ha sido descrito por Okayama y Berg (Mol.
Cell Biol. 3: 280, 1983).
Un sistema útil para la expresión estable de
alto nivel de los ADNc receptores de mamíferos en células
epiteliales mamarias C127 murinas se puede construir esencialmente
como ha sido descrito por Cosman et al. (Mol. Immunol. 23:
935, 1986). Un vector eucariótico preferido para la expresión del
ADN del IL-17R se denomina pDC406 (McMaham et
al., EMBO J. 10: 2821, 1991) e incluye secuencias de regulación
obtenidas a partir del SV40, virus de inmunodeficiencia humano
(VIH) y virus de Epstein-Barr (EBV). Otros vectores
preferidos incluyen el pDC409 y pDC410 que se obtienen a partir del
pDC406. El pDC410 se obtuvo a partir del pDC406 sustituyendo del
origen de replicación del EBV con secuencias que codifican el
antígeno T grande del SV40. El pDC409 se diferencia del pDC406 en
que se ha realizado la deleción de un sitio de restricción
BglII fuera del sitio de clonación múltiple, haciendo único
el sitio Bgl II en el sitio de clonación múltiple.
Las células huésped transformadas son células
que han sido transformadas o transfectadas con vectores de expresión
construidos usando técnicas de ADN recombinante y que contienen
secuencias que codifican las proteínas de la presente invención.
Las células huésped transformadas pueden expresar la proteína
deseada (IL-17R o sus homólogos), pero las células
huésped transformadas con el objetivo de clonar o amplificar el ADN
de la invención no necesitan expresar la proteína. Las proteínas
expresadas serán secretadas preferiblemente en el sobrenadante del
cultivo, dependiendo del ADN elegido, pero se pueden depositar en la
membrana celular.
Las células huésped adecuadas para la expresión
de las proteínas víricas incluyen las células procariotas, de
levaduras o eucarióticas superiores bajo el control de los
promotores adecuados. Las procariotas incluyen los organismos gram
positivo o gram negativo, por ejemplo E. Coli o Bacillus
spp. Las células eucarióticas superiores incluyen líneas
celulares establecidas de origen mamífero como se describen a
continuación. También se pueden emplear sistemas de traducción sin
células para producir proteínas víricas usando los ARN obtenidos a
partir de los constructos de ADN descritos en la presente memoria.
Los vectores de clonación y expresión apropiados para su uso con
huéspedes celulares bacterianos, fúngicos, de levaduras y de
mamíferos han sido descritos por Pouwels et al. (Cloning
Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, 1985), cuya
descripción pertinente se incorpora como referencia en la presente
memoria.
Los huéspedes de expresión procarióticos se
pueden usar para la expresión del IL-17R u homólogos
que no requieren procedimientos proteolíticos ni con bisulfito
extensos. Los vectores de expresión procarióticos comprenden
generalmente uno o más marcadores fenotípicos elegibles, por ejemplo
un gen que codifica las proteínas que confieren resistencia a los
antibióticos o que proporcionan un requisito autotrófico, y un
origen de replicación reconocido por el huésped para asegurar la
amplificación en el huésped. Los huéspedes procarióticos adecuados
para la transformación incluyen E. Coli, Bacillus subtilis,
Salmonella Typhimurium y varias especies de los géneros
Pseudomonas, Streptomices y Staphylococcus, aunque
también se pueden emplear otros como material de elección.
El IL-17R recombinante también
puede ser expresado en una levadura huésped, preferiblemente de la
especie Saccharomyces, tal como la S. Cerevisiae.
También se pueden emplear levaduras de otros géneros, tales como
Pichia o Kluyveromyces. Los vectores de levaduras
generalmente contendrán un origen de replicación del plásmido
2\mu de levadura o una secuencia de replicación autónoma (ARS),
promotor, ADN que codifica la proteína vírica, secuencias para la
poliadenilación y terminación de la transcripción y un gen de
selección. Preferiblemente, los vectores de levaduras incluirán un
origen de replicación y un marcador elegible que permitan la
transformación tanto de la levadura como de la E. Coli, por
ejemplo el gen de la resistencia a la ampicilina de la E.
Coli y el gen trp 1 de la S. cerevisae, que
proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de
levadura a la que le falta la capacidad para crecer en triptófano, y
un promotor obtenido a partir de un gen de levadura altamente
expresado para inducir la transcripción de una secuencia estructural
en la dirección 3'. La presencia de la lesión trp 1 en el
genoma de la célula huésped de levadura proporciona entonces un
medio eficaz para detectar la transformación mediante el crecimiento
en ausencia de triptófano.
Los protocolos de transformación de levaduras
adecuados son conocidos por los expertos en la técnica; un ejemplo
de técnica ha sido descrito por Hinnen et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 75: 1929, 1978, eligiendo los transformantes Trp+ en
un medio de selección que consiste en 0,67% de base nitrogenada de
levadura, 0,5% de ácidos casamino, 2% de glucosa, 10 \mug/mL de
adenina y 20 \mug/mL de uracilo. Las cepas huésped transformadas
por vectores que comprenden el promotor ADH2 se pueden hacer crecer
por expresión en un medio rico que consiste en 1% de extracto de
levadura, 2% de peptona y 1% de glucosa suplementada con 80 mg/mL de
adenina y 80 mg/mL de uracilo. La desrepresión de promotor ADH2 se
produce por agotamiento de la glucosa del medio. Los sobrenadantes
de levadura brutos se cultivan por filtración y se mantienen a 4ºC
antes de purificación adicional.
Varios sistemas de cultivos celulares de
insectos o mamíferos se pueden emplear para expresar la proteína
recombinante. Los sistemas de baculovirus para la producción de
proteínas heterólogas en células de insectos se revisan en Luckow y
Summers, Bio/Technology 6: 47 (1998). Ejemplos de líneas
celulares huésped de mamíferos adecuadas incluyen las líneas
COS-7 de células de riñón de mono, descritas por
Gluzman (Cell 23: 175, 1981) y otras líneas celulares
capaces de expresar un vector apropiado, incluyendo por ejemplo las
líneas celulares CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478),
células L, C127, 3T3, ovario de hámster chino (CHO), HeLa y BHK. Los
vectores de expresión en mamíferos pueden comprender elementos no
transcritos, tales como un origen de replicación, un promotor
adecuado y un potenciador unido al gen que debe ser expresado y
otras secuencias no transcritas en los extremos 5' o 3', y
secuencias no traducidas en 5' o 3', tales como los sitios de enlace
ribosómicos necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios
donantes y aceptores de empalme y secuencias de terminación de la
transcripción.
Los homólogos o análogos del
IL-17R purificados se preparan cultivando sistemas
huésped/vector adecuados para expresar los productos de traducción
recombinante de los ADN de la presente invención, que entonces se
purifican del medio de cultivo o de los extractos celulares. Por
ejemplo, los sobrenadantes de los sistemas que segregan la proteína
recombinante en el medio de cultivo pueden concentrarse primero
usando un filtro de concentración de la proteína disponible
comercialmente, por ejemplo una unidad de ultrafiltración Amicon o
Millipore Pellicon.
Después de la etapa de concentración, se puede
aplicar el concentrado a una matriz de purificación adecuada. Por
ejemplo, una matriz de afinidad adecuada puede comprender una
proteína de estructura homóloga o lectina o una molécula de
anticuerpo enlazada a un soporte adecuado. Alternativamente, se
puede emplear una resina de intercambio aniónico, por ejemplo una
matriz o sustancia que tiene grupos dietilaminoetilo (DEAE)
laterales. Las matrices pueden ser de acrilamida, agarosa,
dextrano, celulosa u otros tipos empleados comúnmente en la
purificación de proteínas. Alternativamente, se puede usar una etapa
de intercambio catiónico. Los intercambiadores de cationes
adecuados incluyen varias matrices insolubles que comprenden grupos
sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren los grupos sulfopropilo.
La cromatografía por filtración en gel también proporciona un medio
para purificar las proteínas de la invención.
La cromatografía de afinidad es un método
particularmente preferido para purificar el IL-17R y
sus homólogos. Por ejemplo, un IL-17R expresado
como una proteína de fusión que comprende una región de
inmunoglobulina Fc puede purificarse usando cromatografía de
afinidad de Proteína A o Proteína G. Además, una proteína
IL-17R que comprende un dominio de cierre de
oligomerización puede purificarse sobre una resina que comprende un
anticuerpo específico del dominio de cierre de oligomerización. Los
anticuerpos monoclonales frente a la proteína
IL-17R también pueden ser útiles en la purificación
por cromatografía de afinidad usando métodos que son bien conocidos
en la técnica. También se puede usar un ligando (es decir,
IL-17R o HVS-13) para preparar una
matriz de afinidad para la purificación por afinidad del
IL-17R.
Finalmente, se pueden usar una o más etapas de
cromatografía líquida de altas prestaciones en fase inversa
(RP-HPLC) empleando un medio hidrófobo de
RP-HPLC, por ejemplo gel de sílice que tiene grupos
metilo u otros grupos alifáticos laterales para proporcionar una
proteína recombinante homogénea.
\newpage
La proteína recombinante producida en un cultivo
bacteriano se aísla generalmente por extracción inicial a partir
de precipitados celulares, seguido por una o más etapas de
concentración, salificación, intercambio iónico acuoso o
cromatografía de exclusión de tamaño. Finalmente, se puede usar
cromatografía líquida de altas prestaciones (HPLC) para las etapas
de purificación finales. Las células microbianas empleadas en la
expresión de la proteína vírica recombinante pueden romperse por
cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de
congelación-descongelación, ultrasonidos, ruptura
mecánica o la utilización de agentes de lisis celular.
La fermentación de las levaduras que expresan la
proteína de la invención como una proteína secretada simplifica de
forma importante la purificación. La proteína recombinante secretada
que resulta de la fermentación a gran escala se puede purificar por
métodos análogos a los descritos por Urdal et al. (J.
Chromatog. 296: 171, 1984). Esta referencia describe dos etapas
secuenciales de HPLC en fase inversa para la purificación del
GM-CSF recombinante humano en una columna de HPLC
preparativa.
La proteína sintetizada en un cultivo
recombinante se caracteriza por la presencia de componentes
celulares, incluyendo proteínas, en cantidades y de un carácter que
dependen de las etapas de purificación realizadas para recuperar la
proteína de la invención del cultivo. Estos componentes serán
generalmente de origen de levaduras, procariotas o eucariotas
superiores no humanas y preferiblemente están presentes en
cantidades contaminantes inocuas, del orden de menos de
aproximadamente 1 por ciento en peso. Además, el cultivo celular
recombinante permite la producción de las proteínas de la invención
sin otras proteínas que normalmente pueden estar asociadas con las
proteínas como se encuentran en la naturaleza en la especie de
origen.
La presente invención proporciona el uso de
composiciones terapéuticas que comprenden una cantidad eficaz de
una proteína y un diluyente y vehículo adecuados en el tratamiento
de la osteoartritis. También está previsto el uso del
IL-17R o sus homólogos junto con receptores solubles
de la citocina o citocinas u otras moléculas inmunorreguladoras.
Dichas moléculas se pueden administrar separadamente,
secuencialmente o simultáneamente con las composiciones de
IL-17R. Particularmente, las moléculas
inmunorreguladoras preferidas son receptores solubles de la
IL-1, receptores solubles del TNF y sus proteínas de
fusión.
Para uso terapéutico, la proteína purificada se
administra a un paciente, preferiblemente un humano, para el
tratamiento de forma apropiada para la indicación. Así, por ejemplo,
las composiciones de proteína IL-17R se pueden dar
mediante inyección de un bolo, infusión continua, liberación
prolongada para implantes u otra técnica adecuada. Típicamente, se
administrará un agente terapéutico en forma de una composición que
comprende IL-17R purificado junto con vehículos,
excipientes o diluyentes fisiológicamente aceptables. Dichos
vehículos serán no tóxicos para los receptores a las dosis y
concentraciones empleadas.
Generalmente, la preparación de dichas
composiciones de proteína supone combinar la proteína de la
invención con disoluciones amortiguadoras de pH, antioxidantes
tales como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular
(menos de aproximadamente 10 restos), proteínas, aminoácidos,
carbohidratos incluyendo glucosa, sacarosa o dextrinas, agentes
quelantes tales como EDTA, glutatión y otros estabilizantes y
excipientes. La disolución salina tamponada neutra o disolución
salina mezclada con albúmina de suero coespecífico son diluyentes
apropiados que sirven de ejemplo. Preferiblemente, el producto se
formula como un liofilizado usando disoluciones de excipientes
apropiados (por ejemplo, sacarosa) como diluyentes. Las dosis
apropiadas se pueden determinar en ensayos. La cantidad y
frecuencia de administración dependerá, por supuesto, de factores
tales como la naturaleza y la severidad del trastorno que se va a
tratar, la respuesta deseada, la condición del paciente, etc.
Los receptores del IL-17R
(CTLA-8) se pueden administrar con el objetivo de
regular los niveles de NO. Es probable por lo tanto que el
IL-17R sea útil para el tratamiento de la
osteoartritis.
Los siguientes ejemplos se ofrecen como
ilustración y no como limitación. Los expertos en la técnica
reconocerán que se pueden hacer variaciones de los modos de
realización de la invención presentados en los ejemplos,
especialmente a la luz de las enseñanzas de las distintas
referencias citadas en la presente memoria, cuyas descripciones se
incorporan como referencia.
Este ejemplo ilustra la capacidad del
IL-17R para inhibir la respuesta proliferativa de
las células T a los mitógenos. Los órganos linfoides se cultivaron
asépticamente y se obtuvo una suspensión celular. Las células T
esplénicas y de los nodos linfáticos se aislaron de la suspensión
celular. La pureza de las preparaciones de células T esplénicas
resultantes fueron generalmente >95% CD3^{+} y <1%
sIgM^{+}. Se cultivaron células T esplénicas murinas purificadas
(2 x 10^{5}/pozo) bien con 1% de PHA o bien con 1 mg/mL de Con A,
y se valoró en el ensayo un IL-17R soluble (una
forma soluble del IL-17R que comprende la región
extracelular del IL-17R fundida con la región Fc de
la IgG1). La proliferación se determinó después de 3 días con la
adición de 1 \muCi [3H]timidina. La secreción de las
citocinas (interleucina-2) se determinó para células
T murinas cultivadas durante 24 horas con 1 \mug/mL de Con A en
presencia o ausencia de 10 \mug/mL de IL-17R.Fc o
en presencia de una proteína Fc de control. La producción de
IL-2 se midió por ELISA y los resultados se
expresaron como ng/mL de IL-2 producidos.
La IL-7R/Fc inhibió de forma
significativa la proliferación inducida por el mitógeno de las
células T esplénicas murinas purificadas de forma dependiente de la
dosis, mientras que el Fc de control no tuvo ningún efecto sobre la
proliferación de células T murinas. Se observó una inhibición
completa de la proliferación inducida por el mitógeno para una
concentración de IL-17R.Fc soluble de 10 \mug/mL.
Los análisis de producción de IL-2 por las células
T esplénicas activadas con Con A en presencia o en ausencia de
IL-17R-Fc en el cultivo mostró que
la adición de IL-17R.Fc al cultivo de células T
inhibió la producción de IL-2 a niveles
8-9 veces inferiores a los observados en cultivos
que contienen el medio solo o el medio más una proteína Fc de
control. Se observaron resultados similares cuando se usaron células
T humanas.
Este ejemplo muestra la capacidad del
IL-17R para inhibir la producción de NO por las
células asociadas al cartílago. El cartílago articular se obtiene
de pacientes afectados por OA o controles normales esencialmente
como ha sido descrito por Amin et al. supra. El cartílago se
corta en discos pequeños (aproximadamente 3 mm) que se colocan en
un cultivo de órganos en presencia o en ausencia de
IL-17R.Fc o en presencia de una proteína Fc de
control. La producción de óxido nítrico se analiza determinando el
nivel de nitrito en el medio a diferentes intervalos de tiempo, por
ejemplo usando una reacción de Griess modificada (Anal.
Biochem. 12b: 12299; 1982). Ding et al. (J. Immunol.
141: 2407, 1988) también describen un método útil para medir el NO
en cultivos de órganos ex vivo de células asociadas a la
sinovia y al cartílago. El IL-17R.Fc se valora para
determinar una concentración eficaz para inhibir la producción de
NO. También se usan otras formas solubles del IL-17R
para regular los niveles de NO de esta forma.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Immunex Corporation
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DOMICILIO DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Immunex Corporation
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 51 University Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Seattle
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Washington
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: ESTADOS UNIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 98101
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- COMPUTADORA: Apple PowerMacintosh
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: Systema Operativo Apple 7,5,5
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: Microsoft Word para PowerMacintosh, Versión 6,0,1
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:-pendiente de asignar-
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: USSN 60/052.525
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 27 NOVIEMBRE 1996
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL REPRESENTANTE/AGENTE LEGAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Perkins, Patricia Anne
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 34,693
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 2623-WO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN::
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (206)587-0430
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (206)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3288 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Ratón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: receptor de IL-17
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 121..2712
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 864 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3223 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Humano
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: IL-17R
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 93..2690
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 866 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (3)
1. El uso de un receptor soluble de la
IL-17 para la elaboración de un medicamento para el
tratamiento de la osteoartritis.
2. El uso según la reivindicación 1 en el que el
receptor soluble de la IL-17 se elige entre el grupo
que consiste en:
- (a)
- una proteína que comprende los aminoácidos 1 a 322 de la SEQ. ID. Nº 2;
- (b)
- una proteína que comprende los aminoácidos 1 a 320 de la SEQ. ID. Nº 4;
- (c)
- una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos aproximadamente 70% a las secuencias de aminoácidos de las proteína (a) o (b) y que se enlaza al IL-17R; y
- (d)
- fragmentos de las proteínas (a), (b) o (c) que se enlazan a la IL-17.
3. El uso según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2 en el que el medicamento se administra simultánea,
secuencial o separadamente con una molécula inmunorreguladora
elegida entre el grupo que consiste en una receptor soluble de la
IL-1 de tipo I, un receptor soluble de la
IL-1 de tipo II, un antagonista de un receptor de la
IL-1, un receptor soluble del TNF, una proteína de
fusión que comprende una receptor de la IL-1 y un
receptor del TNF y sus combinaciones.
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