ES2214484T3 - Proteinas inflamatorias de macrofagos mip-3, mip-4 y mip-1 gamma. - Google Patents

Abstract

SE EXPONEN POLIPEPTIDOS DE UNA PROTEINA-3 HUMANA MACROFAGA INFLAMATORIA, DE UNA PROTEINA-4 HUMANA MACROFAGA INFLAMATORIA Y DE UNA PROTEINA -1{SUB,{GM}} Y ADN (RNA) QUE CODIFICA TALES POLIPEPTIDOS. TAMBIEN SE PROPORCIONA UN PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR TALES POLIPEPTIDOS MEDIANTE TECNICAS RECOMBINANTES, Y PARA PRODUCIR ANTICUERPOS CONTRA DICHOS POLIPEPTIDOS. EN LA INVENCION, SE PROPORCIONAN TAMBIEN ANTAGONISTAS/INHIBIDORES CONTRA TALES POLIPEPTIDOS QUE INHIBEN EL FUNCIONAMIENTO DE TALES POLIPEPTIDOS. OTRO ASPECTO DE LA INVENCION PROPORCIONA UNA COMBINACION DE LOS POLIPEPTIDOS DE LA PRESENTE INVENCION, Y UN SOPORTE FARMACEUTICO ADECUADO PARA PROPORCIONAR UNA CANTIDAD TERAPEUTICAMENTE EFICAZ DE LOS POLIPEPTIDOS PARA EL TRATAMIENTO DE VARIAS ENFERMEDADES ASOCIADAS.

Description

Proteínas inflamatorias de macrófagos MIP-3, MIP-4 y MIP-1 \gamma.

Esta invención se refiere a polinucleótidos recién identificados, a polipéptidos codificados por tales polinucleótidos, al uso de tales polinucleótidos y polipéptidos, así como a la producción de tales polinucleótidos y polipéptidos. Más particularmente, los polipéptidos de la presente invención son proteína inflamatoria de macrófagos 3 (MIP-3), proteína inflamatoria de macrófagos 4 (MIP-4) y proteína inflamatoria de macrófagos 1 \gamma, de origen humano. Esta invención también se refiere a la inhibición de la acción de tales polipéptidos.

Las proteínas inflamatorias de macrófagos (MIP) son proteínas producidas por ciertas células de mamífero, por ejemplo, macrófagos y linfocitos, en respuesta a estímulos tales como bacterias gram negativas, lipopolisacáridos y concanavalina A. De esta forma, las moléculas de MIP pueden tener utilidad diagnóstica y terapéutica para detectar y tratar infecciones, cáncer, inflamación, disfunción mielopoyética y enfermedades autoinmunes. La MIP-1 murina es una proteína principal secretada por la línea RAW 264.7 estimulada por lipopolisacáridos, una línea de células tumorales de macrófagos murinos. Se ha purificado y se ha descubierto que consta de dos proteínas relacionadas, MIP-1\alpha y MIP-1\beta.

Varios grupos han clonado lo que probablemente son homólogos humanos de MIP-1\alpha y MIP-1\beta. En todos los casos, se aislaron ADNc a partir de bibliotecas preparadas contra ARN de células T activadas.

Se ha demostrado que las proteínas inflamatorias de macrófagos (MIP-1\alpha y MIP-1\beta) presentan propiedades proinflamatorias. MIP-1\alpha puede inducir la migración y la activación de eosinófilos y monocitos humanos e induce la quimiotaxis de los macrófagos. Además, la MIP-1\alpha murina tiene efectos supresores sobre la proliferación de células madre hematopoyéticas humanas, mientras que la MIP-1\beta murina puede anular el efecto inhibidor de la MIP-1\alpha. Finalmente, pueden detectarse proteínas MIP-1 en las primeras células inflamatorias de heridas y se ha demostrado que inducen la producción de IL-1 e IL-6 en fibroblastos de heridas.

Las MIP-1 forman parte de la familia de las quimioquinas, que tienen numerosas funciones relacionadas con la inflamación o la curación de heridas, con la inmunorregulación y desempeñan papeles activos en varios estados de enfermedad. Además, se ha descubierto que la MIP-1 tiene efectos potenciadores hematopoyéticos. Broxmeyer, H.E., et al., J. Exp. Med., 170:1583-94 (1989) y Broxmeyer, H.E., et al., Blood, 76:1110-6 (1990).

La definición de las bioactividades de MIP-1 se ha estudiado extensamente y ha utilizado MIP-1 nativa y MIP-1\alpha y MIP-1\beta recombinantes obtenidas muy recientemente. La MIP-1 nativa purificada (que comprende polipéptidos MIP-1, MIP-1\alpha y MIP-1\beta) produce una inflamación aguda cuando se inyecta por vía subcutánea en las almohadillas de las patas de ratones o por vía intracisternal en el líquido cefalorraquídeo de conejos (Wolpe y Cerami, 1989, FASEB J. 3:2565-73). Además de estas propiedades proinflamatorias de la MIP-1, que pueden ser directas o indirectas, se ha recuperado MIP-1 durante las primeras fases inflamatorias de la curación de heridas en un modelo experimental de ratón que emplea cámaras de heridas estériles (Fahey, et al., 1990, Cytokine, 2:92). Por ejemplo, la solicitud de Estados Unidos PCT 91/06489 (documento WO-A-9205198), presentada por Chiron Corporation, describe una molécula de ADN que es activa como una plantilla para producir proteínas inflamatorias de macrófagos (MIP) de mamíferos en levaduras.

Las MIP-1\alpha y MIP-1\beta murinas son citoquinas distintas pero muy relacionadas. Unas mezclas parcialmente purificadas de las dos proteínas afectan a la función de los neutrófilos y producen inflamación local y fiebre. Se han identificado propiedades particulares de MIP-1\alpha que son idénticas a las de un inhibidor del crecimiento de células madre hematopoyéticas. MIP-1\alpha se ha expresado en células de levadura y se ha purificado hasta la homogeneidad. El análisis estructural confirmó que MIP-1\alpha tiene una estructura secundaria y terciaria muy similar al factor plaquetario 4 y a la interleuquina 8, con los que comparte una homología de secuencias limitada. Se ha descubierto que MIP-1\alpha tiene propiedades inhibidoras de células madre in vitro. También se ha demostrado que la MIP-1\alpha es activa in vivo para proteger a las células madre de ratón de la posterior destrucción in vitro por timidina tritiada. También se demostró que la MIP-1\alpha mejora la proliferación de células formadoras de colonias de granulocitos-macrófagos progenitoras más comprometidas en respuesta al factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos. Clemens, J.M., et al., Cytokine, 4:76-82 (1992).

MIP-1\alpha es una proteína quimiotáctica de monocitos, neutrófilos y eosinófilos, inducible por lipopolisacáridos, de 6-8 kd. MIP-1\alpha también puede inducir la migración y la activación de granulocitos de eosinófilos humanos. MIP-1\alpha puede ser importante en la inflamación aguda y crónica. Se ha determinado la producción secuencial, la fuente y la contribución in vivo de la MIP-1\alpha murina en Schistosoma mansoni sincronizado durante la formación de granuloma pulmonar. Lukacs, N.W., et al., J. Exp. Med., 177:1551-9 (1993).

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporcionan nuevos polipéptidos maduros que son MIP-3, MIP-4 y MIP-1\gamma, así como análogos y derivados de los mismos. Las MIP-3, MIP-4 y MIP-1\gamma de la presente invención son de origen humano.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan polinucleótidos (ADN o ARN) que codifican tales polipéptidos.

De acuerdo con otro aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un proceso para producir tales polipéptidos por técnicas recombinantes.

De acuerdo con otro aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un proceso para utilizar tales polipéptidos, o polinucleótidos que codifican tales polipéptidos, para fines terapéuticos, por ejemplo, para inmunorregulación incluyendo actividad inflamatoria, hematopoyesis y tráfico de linfocitos, para la inhibición de la formación de colonias de células madre de médula ósea, para el tratamiento de la psoriasis o de tumores sólidos y para mejorar las defensas del hospedador contra una infección crónica resistente.

De acuerdo con otro aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un anticuerpo contra tales polipéptidos.

Estos y otros aspectos de la presente invención serán evidentes para los especialistas en la técnica a partir de las enseñanzas de este documento.

Los siguientes dibujos son ilustrativos de realizaciones de la invención y no pretenden limitar el alcance de la invención abarcada por las reivindicaciones.

La Fig. 1 presenta la secuencia de ADNc que codifica MIP-3 y la correspondiente secuencia de aminoácidos deducida. Los 45 aminoácidos iniciales representan la supuesta secuencia líder deducida.

La Fig. 2 presenta la secuencia de ADNc que codifica MIP-4 y la correspondiente secuencia de aminoácidos deducida. Los 19 aminoácidos iniciales representan una supuesta secuencia líder.

La Fig. 3 corresponde a una porción de la secuencia de aminoácidos deducida de MIP-3 en alineación con una porción de MIP-1\alpha. La secuencia superior es la secuencia de aminoácidos de la MIP-3 humana y la secuencia inferior es la MIP-1\alpha humana.

La Fig. 4 presenta dos secuencias de aminoácidos donde la secuencia superior es la secuencia de aminoácidos de la MIP-4 humana y la secuencia inferior es el precursor de la proteína LD78 Beta de linfocitos tonsilares humanos.

La Fig. 5 muestra las bandas proteicas que corresponden a la proteína MIP-4 después de la expresión en un sistema de expresión bacteriano de E. coli y de la purificación.

La Fig. 6 es un análisis de transferencia de northern de la MIP-4 que indica las células en las que se encuentra más comúnmente esta proteína. La Fig. 7 es una representación esquemática del vector pQE-9.

La Fig. 8 presenta la secuencia de ADNc que codifica MIP-1\gamma y la correspondiente secuencia de aminoácidos deducida. Los 24 aminoácidos iniciales representan la secuencia líder deducida.

La Fig. 9 presenta dos secuencias de aminoácidos parciales de proteínas MIP-1 humanas. La secuencia superior es MIP-1\gamma humana y la secuencia inferior es MIP-1\alpha humana [Precursor de la proteína LD78 Beta de linfocitos tonsilares humanos].

La Fig. 10 muestra las bandas proteicas en la calle 5 que corresponden a la proteína MIP-1\gamma después de la expresión en un sistema de expresión bacteriano y de la purificación.

La Fig. 11 muestra las bandas proteicas que corresponden a la expresión en COS de MIP-1\gamma.

La Fig. 12 es un análisis de transferencia de northern de la MIP-1\gamma que indica los tejidos en los que se encuentra más comúnmente esta proteína.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporcionan ácidos nucleicos aislados (polinucleótidos) que codifican para el polipéptido maduro que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de las Figuras 1, 2 y 8 o para el polipéptido MIP-3 maduro codificado por el ADNc del clon o de los clones depositados como Depósito de la ATCC Nº 75676 el 9 de febrero de 1994, para el polipéptido MIP-4 maduro codificado por el ADNc del clon depositado como Depósito de la ATCC Nº 75675 el 9 de febrero de 1994, y para el polipéptido MIP-1\gamma maduro codificado por el ADNc del clon depositado con el Nº de la ATCC 75572, depositado el 13 de octubre de 1993.

Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la presente invención están relacionados estructuralmente con el supergen proinflamatorio "intercrina" que está en la familia de las citoquinas o quimioquinas. Tanto MIP-3 como MIP-4 son homólogos de MIP-1 y son más homólogos a MIP-1\alpha que a MIP-1\beta. El polinucleótido que codifica para MIP-3 se obtuvo a partir de una biblioteca de ADNc de endotelio aórtico y contiene una fase de lectura abierta que codifica un polipéptido de 121 restos aminoacídicos, que presenta una homología significativa con varias quimioquinas. Presenta el mayor parecido con la proteína inflamatoria de macrófagos 1 alfa humana, mostrando una identidad de 36% y una similitud de 66% (figura 3).

El polinucleótido que codifica para MIP-4 se obtuvo a partir de una biblioteca de ADNc de pulmón adulto y contiene una fase de lectura abierta que codifica un polipéptido de 89 restos aminoacídicos, que presenta una homología significativa con varias quimioquinas. Presenta el mayor parecido con la proteína LD78 beta de linfocitos tonsilares humanos, mostrando una identidad de 60% y una similitud de 89% (figura 4). Además, en ambos clones se conservan los cuatro restos de cisteína que existen en todas las quimioquinas en un motivo característico. El hecho de que los dos primeros restos de cisteína en el gen de la presente invención estén en posiciones adyacentes, lo clasifica en la subfamilia de quimioquinas "C-C" o \beta. En otra subfamilia, la subfamilia "CXC" o \alpha, los dos primeros restos de cisteína están separados por un aminoácido.

El polinucleótido que codifica MIP-1\gamma contiene una fase de lectura abierta que codifica un polipéptido de 93 aminoácidos, que presenta una homología significativa con la proteína \alpha de primates y de macrófagos humanos, con una identidad de 48% y una similitud de 72% en un tramo de 80 aminoácidos y una similitud de 46% y 67% con la MIP-1\beta de ratón en una región de 82 aminoácidos. Además, se conservan los cuatro restos de cisteína que constituyen un motivo característico.

Los polinucleótidos de la presente invención pueden estar en forma de ARN o en forma de ADN, incluyendo el ADN ADNc, ADN genómico y ADN sintético. El ADN puede ser bicatenario o monocatenario, y si es monocatenario puede ser la cadena codificante o la no codificante (antisentido). La secuencia codificante que codifica los polipéptidos maduros puede ser idéntica a la secuencia codificante mostrada en la Figura 1 y 2 o a la del clon o clones depositados o puede ser una secuencia codificante diferente que, como resultado de la redundancia o degeneración del código genético, codifica los mismos polipéptidos maduros que el ADN de la Figura 1 y 2 o el ADNc depositado.

Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos maduros de las Figuras 1, 2 y 8 o los polipéptidos maduros codificados por el ADNc depositado pueden incluir: únicamente la secuencia codificante del polipéptido maduro; la secuencia codificante de los polipéptidos maduros y una secuencia codificante adicional tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia de proproteína; la secuencia codificante de los polipéptidos maduros (y opcionalmente una secuencia codificante adicional) y una secuencia no codificante, tal como intrones o una secuencia no codificante en posición 5' y/o 3' con respecto a la secuencia codificante de los polipéptidos maduros.

De esta forma, la expresión "polinucleótido que codifica un polipéptido" engloba un polinucleótido que incluye únicamente la secuencia codificante del polipéptido así como un polinucleótido que incluye secuencias codificantes y/o no codificantes adicionales.

La presente invención se refiere además a variantes de los polinucleótidos descritos anteriormente en este documento que codifican fragmentos, análogos y derivados del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de las Figuras 1, 2 y 8 o de los polipéptidos codificados por el ADNc del clon o de los clones depositados. Las variantes de los polinucleótidos pueden ser una variante alélica natural de los polinucleótidos o una variante no natural de los polinucleótidos.

De esta forma, la presente invención incluye polinucleótidos que codifican polipéptidos maduros iguales a los mostrados en las Figuras 1, 2 y 8 o los polipéptidos maduros iguales a los codificados por el ADNc del clon o de los clones depositados, así como variantes de tales polinucleótidos que codifican un fragmento, derivado o análogo de los polipéptidos de las Figuras 1, 2 y 8 o de los polipéptidos codificados por el ADNc del clon o de los clones depositados. Tales variantes de nucleótidos incluyen variantes de deleción, variantes de sustitución y variantes de adición o de inserción.

Como se ha indicado anteriormente en este documento, el polinucleótido puede tener una secuencia codificante que sea una variante alélica natural de la secuencia codificante mostrada en las Figuras 1, 2 y 8 o de la secuencia codificante del clon o de los clones depositados. Como se sabe en la técnica, una variante alélica es una forma alternativa de una secuencia polinucleotídica que puede tener una sustitución, deleción o adición de uno o más nucleótidos, que no altera sustancialmente la función de polipéptido codificado.

La presente invención también incluye polinucleótidos, donde la secuencia codificante para los polipéptidos maduros puede fusionarse en la misma fase de lectura a una secuencia polinucleotídica que ayuda a la expresión y secreción de un polipéptido desde una célula hospedadora, por ejemplo, una secuencia líder que funciona como secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido desde la célula. El polipéptido que tiene una secuencia líder es una preproteína y la célula hospedadora puede escindir la secuencia líder para formar la forma madura del polipéptido. Los polinucleótidos también pueden codificar una proproteína que sea la proteína madura más restos aminoacídicos 5' adicionales. Una proteína madura que tiene una prosecuencia es una proproteína y es una forma inactiva de la proteína. Una vez que se ha escindido la prosecuencia, queda la proteína madura activa.

De esta forma, por ejemplo, los polinucleótidos de la presente invención pueden codificar una proteína madura, una proteína que tenga una prosecuencia o una proteína que tenga tanto una prosecuencia como una presecuencia (secuencia líder).

Los polinucleótidos de la presente invención también pueden tener la secuencia codificante fusionada en fase a una secuencia marcadora que permite la purificación de los polipéptidos de la presente invención. La secuencia marcadora puede ser una señal de hexahistidina proporcionada por un vector pQE-9 para facilitar la purificación de los polipéptidos maduros fusionados al marcador en el caso de un hospedador bacteriano o, por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser una señal de hemaglutinina (HA) cuando se usa un hospedador mamífero, por ejemplo células COS-7. La señal de HA corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la influenza (Wilson, I., et al., Cell, 37:767 (1984)).

La presente invención se refiere a polinucleótidos que hibridan en condiciones rigurosas con los polinucleótidos descritos anteriormente en este documento. Como se usa en este documento, la expresión "condiciones rigurosas" significa que la hibridación tendrá lugar sólo si hay una identidad de al menos 95% y preferiblemente de al menos 97% entre las secuencias. Los polinucleótidos que hibridan con los polinucleótidos descritos anteriormente en este documento, en una realización preferida codifican polipéptidos que retienen sustancialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por el ADNc de la Figura 1 o por el ADNc depositado.

El depósito o los depósitos a los que se hace referencia en este documento se mantendrán bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en Materia de Patentes. Estos depósitos se proporcionan simplemente como ayuda para los especialistas en la técnica y no suponen el reconocimiento de que se requiere un depósito según 35 U.S.C \NAK112. Las secuencias de los polinucleótidos contenidos en los materiales depositados, así como las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos codificados por los mismos, se incorporan en este documento como referencia y sirven de control en caso de que haya cualquier conflicto con la descripción de las secuencias que se incluye en este documento. Puede requerirse una autorización para fabricar, usar o vender los materiales depositados, y no debe considerarse concedida tal autorización por el presente documento.

La presente invención se refiere además a polipéptidos MIP-3, MIP-4 y MIP-1\gamma que tienen la secuencia de aminoácidos deducida de las Figuras 1, 2 y 8 o que tienen la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc depositado, así como a fragmentos, análogos y derivados de tales polipéptidos.

Los términos "fragmento", "derivado" y "análogo", cuando hacen referencia a los polipéptidos de las Figuras 1, 2 y 8 o a los codificados por el ADNc depositado, se refieren a un polipéptido que retiene esencialmente la misma función o actividad biológica que tal polipéptido. De esta forma, un análogo incluye una proproteína que puede activarse por escisión de la porción de proproteína para producir un polipéptido maduro activo.

Los polipéptidos de la presente invención pueden ser un polipéptido recombinante, un polipéptido natural o un polipéptido sintético, preferiblemente un polipéptido recombinante.

El fragmento, derivado o análogo de los polipéptidos de las Figuras 1, 2 y 8 o de los codificados por el ADNc depositado puede ser (i) uno en el que uno o más de los restos aminoacídicos se han sustituido por un resto aminoacídico conservado, o (ii) uno en el que uno o más de los restos aminoacídicos incluyen un grupo sustituyente, o (iii) uno en el que los polipéptidos maduros están fusionados con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o (iv) uno en el que están fusionados aminoácidos adicionales a los polipéptidos maduros, tales como una secuencia líder o secretora, una secuencia que se emplea para la purificación de los polipéptidos maduros o una secuencia de proproteína. Tales fragmentos, derivados y análogos se consideran dentro del alcance de los especialistas en la técnica por las enseñanzas de este documento.

Los polipéptidos de la presente invención se proporcionan preferiblemente en una forma aislada, y preferiblemente se purifican hasta la homogeneidad.

El término "aislado" significa que el material se retira de su medio original (por ejemplo, el medio natural si existe de forma natural). Por ejemplo, los polinucleótidos o polipéptidos naturales presentes en un animal vivo no están aislados, pero los mismos polinucleótidos o ADN o polipéptidos, separado de alguno o de todos los materiales coexistentes en el sistema natural, están aislados. Tales polinucleótidos podrían formar parte de un vector y/o tales polinucleótidos o polipéptidos podrían formar parte de una composición y seguir estando aislados, ya que tal vector o composición no forma parte de su medio natural.

La presente invención también se refiere a vectores que incluyen polinucleótidos de la presente invención, a células hospedadoras que se modifican por ingeniería genética con vectores de la invención y a la producción de polipéptidos de la invención por técnicas recombinantes.

Las células hospedadoras se modifican por ingeniería genética (células transducidas o transformadas o transfectadas) con los vectores de esta invención que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc. Las células hospedadoras modificadas por ingeniería genética pueden cultivarse en medios nutrientes convencionales modificados cuando sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes de MIP-3, MIP-4 y MIP-1\gamma. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares, son las usadas previamente con la célula hospedadora seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el especialista habitual en la técnica.

Los polinucleótidos de la presente invención pueden emplearse para producir polipéptidos por técnicas recombinantes. De esta forma, por ejemplo, la secuencia polinucleotídica puede incluirse en una cualquiera de una diversidad de vehículos de expresión, en particular vectores o plásmidos para expresar un polipéptido. Tales vectores incluyen secuencias de ADN, cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, por ejemplo, derivados de SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fago; plásmidos de levadura; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, y ADN viral tal como de vaccinia, adenovirus, virus de la viruela de las aves de corral y seudorrabia. Sin embargo, puede usarse cualquier otro plásmido o vector siempre que pueda replicarse y sea viable en el hospedador.

La secuencia de ADN apropiada puede insertarse en el vector por una diversidad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN se inserta en uno o más sitios de endonucleasas de restricción apropiados por procedimientos conocidos en la técnica. Tales procedimientos y otros se consideran dentro del alcance de los especialistas en la
técnica.

La secuencia de ADN en el vector de expresión se une operativamente a una o más secuencias de control de la expresión apropiadas (promotores) para dirigir la síntesis de ARNm. Como ejemplos representativos de tales promotores, pueden mencionarse: el promotor de LTR o de SV40, el promotor de E. coli. lac o trp, el promotor P_{L} del fago lambda y otros promotores que se sabe que controlan la expresión de genes en células procariotas o eucariotas o sus virus. El vector de expresión también contiene un sitio de unión a ribosomas para el inicio de la traducción y un terminador de la transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión.

Además, los vectores de expresión contienen preferiblemente un gen para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de las células hospedadoras transformadas, tal como el gen de la dihidrofolato reductasa o de resistencia a neomicina para el cultivo de células eucariotas, o tal como un gen de resistencia a tetraciclina o a ampicilina en E. coli.

El vector que contiene la secuencia de ADN apropiada como se ha descrito anteriormente en este documento, así como un promotor o secuencia de control apropiada, puede emplearse para transformar un hospedador apropiado para permitir que el hospedador exprese la proteína.

Como ejemplos representativos de hospedadores apropiados pueden mencionarse: células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces, Salmonella Typhimurium; células fúngicas, tales como levaduras; células de insecto tales como Drosophila y Sf9; células animales tales como CHO, COS o melanoma de Bowes; células vegetales, etc. La selección de un hospedador apropiado se considera dentro del alcance de los especialistas en la técnica por las enseñanzas de este documento.

Más particularmente, la presente invención también incluye construcciones recombinantes que comprenden una o más de las secuencias descritas en sentido amplio anteriormente. Las construcciones comprenden un vector, tal como un vector plasmídico o viral, en el que se ha insertado una secuencia de la invención, en una orientación de avance o inversa. En un aspecto preferido de esta realización, la construcción comprende además secuencias reguladoras, incluyendo, por ejemplo, un promotor, unido operativamente a la secuencia. Los especialistas en la técnica conocen un gran número de vectores y promotores adecuados, y éstos están disponibles en el mercado. Los siguientes vectores se proporcionan a modo de ejemplo. Bacterianos: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eucarióticos: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Sin embargo, pueden usarse otros plásmidos o vectores siempre que puedan replicarse y sean viables en el hospedador.

Pueden seleccionarse regiones promotoras de cualquier gen deseado usando vectores CAT (cloranfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores selectivos. Son dos vectores apropiados PKK232-8 y PCM7. Los promotores bacterianos mencionados particulares incluyen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, P_{R} de lambda, P_{L} y trp. Los promotores eucarióticos incluyen el promotor temprano inmediato de CMV, el promotor de la timidina quinasa de HSV, los promotores inmediato y tardío de SV40, el promotor LTR de retrovirus y el promotor de metalotioneína-I de ratón. La selección del vector y del promotor apropiados está bien dentro del nivel de experiencia habitual en la técnica.

En otra realización, la presente invención se refiere a células hospedadoras que contienen la construcción descrita anteriormente. La célula hospedadora puede ser una célula eucariota superior, tal como una célula de mamífero, o una célula eucariota inferior, tal como una célula de levadura, o la célula hospedadora puede ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana. La introducción de la construcción en la célula hospedadora puede realizarse por transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-Dextrano, o electroporación. (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).

Las construcciones en células hospedadoras pueden usarse de una manera convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante. Como alternativa, los polipéptidos de la invención pueden producirse sintéticamente por sintetizadores de péptidos convencionales.

Pueden expresarse proteínas maduras en células de mamífero, levaduras, bacterias o en otras células bajo el control de promotores apropiados. También pueden emplearse sistemas de traducción sin células para producir tales proteínas usando ARN derivados de las construcciones de ADN de la presente invención. Se describen vectores de expresión y de clonación apropiados para uso con hospedadores procariotas y eucariotas por Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), cuya descripción se incorpora en este documento como referencia.

La transcripción del ADN que codifica los polipéptidos de la presente invención por eucariotas superiores se aumenta por medio de la inserción de una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN de actuación cis, normalmente de aproximadamente 10 a 300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación del pb 100 al 270, un potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus.

Generalmente, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de replicación y marcadores selectivos que permiten la transformación de la célula hospedadora, por ejemplo, el gen de resistencia a ampicilina del gen TRP1 de E. coli y S. cerevisiae, y un promotor obtenido a partir de un gen de alta expresión para dirigir la transcripción de una secuencia estructural cadena abajo. Tales promotores pueden proceder de operones que codifican enzimas glicolíticas tales como 3-fosfoglicerato quinasa (PGK), factor \alpha, fosfatasa ácida, o proteínas de choque térmico, entre otras. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en una fase apropiada con las secuencias y iniciación y terminación de la traducción y, preferiblemente, con una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida en el espacio periplásmico o el medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluya un péptido de identificación N-terminal que imparte características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado.

Los vectores de expresión útiles para uso en bacterias se construyen insertando una secuencia de ADN estructural que codifica una proteína deseada junto con señales de iniciación y terminación de la traducción adecuadas en una fase de lectura operable con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores selectivos fenotípicos y un origen de replicación para asegurar el mantenimiento del vector y, si se desea, para proporcionar una amplificación dentro del hospedador. Los hospedadores procariotas adecuados para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies de los géneros Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus, aunque también pueden emplearse otros como una cuestión de elección.

Como ejemplo representativo pero no limitante, los vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador selectivo y un origen de replicación bacteriano derivado de plásmidos disponibles en el mercado que comprenden elementos genéticos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017). Tales vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, Estados Unidos). Estas secciones de "cadena principal" pBR322 se combinan con un promotor apropiado y con la secuencia estructural a expresar. Después de la transformación de una cepa hospedadora adecuada y del crecimiento de la cepa hospedadora hasta una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado se induce por medios apropiados (por ejemplo, cambio de la temperatura o inducción química) y las células se cultivan durante un período adicional.

Las células típicamente se recogen por centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos, y el extracto bruto resultante se retiene para una purificación adicional.

Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden romperse por cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación y descongelación, sonicación, ruptura mecánica, o el uso de agentes que lisan células, siendo tales métodos bien conocidos para los especialistas en la técnica.

También pueden emplearse diversos sistemas de cultivo de células de mamíferos para expresar proteínas recombinantes. Los ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen las líneas celulares COS-7 de fibroblastos de riñón de mono descritas por Gluzman, Cell, 23:175 (1981), y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamífero comprenderán un origen de replicación, un promotor y potenciador adecuados, y además cualquier sitio de unión a ribosomas necesario, un sitio de poliadenilación, sitios donadores y aceptores de uniones, secuencias de terminación de la transcripción y secuencias no transcritas flanqueantes 5'. Las secuencias de ADN derivadas de la unión de SV40, y los sitios de poliadenilación pueden usarse para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos.

MIP-3, MIP-4 y MIP-1\gamma se recuperan y se purifican a partir de cultivos de células recombinantes por métodos que incluyen precipitación con sulfato amónico o con etanol, extracción con ácidos, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía en hidroxilapatita y cromatografía en lectina. Se prefiere que durante la purificación estén presentes bajas concentraciones (aproximadamente 0, 15-5 mM) de ion de calcio. (Price et al., J. Biol. Chem., 244:917 (1969)). Cuando sea necesario, pueden usarse etapas de replegamiento de proteínas para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, puede emplearse cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para las etapas de purificación finales.

Los polipéptidos de la presente invención pueden ser un producto purificado de forma natural o un producto de procedimientos de síntesis química, o pueden producirse por técnicas recombinantes a partir de un hospedador procariota o eucariota (por ejemplo, por células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de insectos y de mamíferos en cultivo). Dependiendo del hospedador empleado en el procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden glicosilarse con carbohidratos de mamífero u otros carbohidratos eucariotas o pueden estar no glicosilados. Los polipéptidos de la invención también pueden incluir un resto aminoacídico de metionina inicial.

Los polipéptidos de la presente invención pueden usarse en una diversidad de funciones inmunorreguladoras e inflamatorias y también en varios estados de enfermedad. MIP-3, MIP-4 y MIP-1\gamma pertenecen a la familia de las quimioquinas y, por lo tanto, son un quimioatrayente para los leucocitos (tales como monocitos, neutrófilos, linfocitos T, eosinófilos, basófilos, etc.). Por consiguiente, MIP-3, MIP-4 y MIP-1\gamma pueden usarse para facilitar la curación de heridas por medio del control de la infiltración de células inmunes diana en el área de la herida. De una forma similar, los polipéptidos de la presente invención pueden mejorar las defensas del hospedador contra infecciones crónicas, por ejemplo, micobacterianas, por medio de la atracción y activación de leucocitos microbicidas.

Además, los polipéptidos de la presente invención pueden ser útiles en terapias antitumorales, ya que existen indicios de que células que expresan quimioquinas inyectadas en tumores han ocasionado la regresión del tumor, por ejemplo, en el tratamiento del sarcoma de Kaposi. Además, MIP-3, MIP-4 y MIP-1\gamma estimulan la invasión y la activación de las células de defensa del hospedador (tumoricidas), por ejemplo, células T citotóxicas y macrófagos, y de esta forma también pueden usarse para tratar tumores sólidos.

Los polipéptidos también pueden ser útiles para inhibir la formación de colonias de células madre en la médula ósea en caso de leucemia y como tratamiento protector adyuvante de las células madre hematopoyéticas durante la quimioterapia en caso de cáncer.

Otro uso de los polipéptidos es la inhibición de la proliferación de células T mediante la inhibición de la biosíntesis de IL-2, por ejemplo, en enfermedades autoinmunes y en leucemia linfocítica.

MIP-3, MIP-4 y MIP-1\gamma también pueden ser útiles para inhibir la proliferación de queratinocitos epidérmicos, lo cual tiene utilidad en la psoriasis (hiperproliferación de queratinocitos), ya que se ha descubierto que las células de Langerhans en la piel producen MIP-1\alpha.

MIP-3, MIP-4 y MIP-1\gamma pueden usarse para prevenir la cicatrización durante la curación de heridas tanto por el reclutamiento de células inflamatorias limpiadoras de residuos y promotoras del tejido conjuntivo como por su posible control de un fibrosis excesiva mediada por TGF\beta, además, estos polipéptidos pueden usarse para tratar apoplejía, trombocitosis, embolias pulmonares y trastornos mieloproliferativos, ya que MIP-3, MIP-4 y MIP-1\gamma aumentan la permeabilidad vascular.

Los polipéptidos también pueden emplearse de acuerdo con la presente invención por medio de la expresión de tales polipéptidos in vivo, lo cual a menudo se denomina "terapia génica".

De esta forma, por ejemplo, pueden modificarse por ingeniería genética células de un paciente con un polinucleótido (ADN o ARN) que codifica un polipéptido ex vivo, proporcionándose después las células modificadas por ingeniería genética a un paciente a tratar con los polipéptidos. Tales métodos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células pueden modificarse por ingeniería genética por procedimientos conocidos en la técnica mediante el uso de una partícula retroviral que contiene ARN que codifica los polipéptidos de la presente invención.

Asimismo, las células pueden modificarse por ingeniería genética in vivo para la expresión de los polipéptidos in vivo mediante, por ejemplo, procedimientos conocidos en la técnica. Como se sabe en la técnica, a un paciente se le puede administrar una célula productora para la producción de una partícula retroviral que contiene ARN que codifica los polipéptidos de la presente invención, para modificar por ingeniería genética las células in vivo y para conseguir la expresión de los polipéptidos in vivo. Estos y otros métodos para administrar polipéptidos de la presente invención por tal método serán evidentes para los especialistas en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente invención. Por ejemplo, el vehículo de expresión para las células modificadas por ingeniería genética puede ser distinto de un retrovirus, por ejemplo, un adenovirus que puede usarse para modificar las células por ingeniería genética in vivo después de la combinación con un vehículo de liberación adecuado.

Los polipéptidos de la presente invención pueden emplearse en combinación con un vehículo farmacéutico adecuado. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tal vehículo incluye, pero sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulación debe adaptarse al modo de administración.

La invención también proporciona un envase o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes rellenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Asociado con tal o tales recipientes puede haber un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regule la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, que refleje la aprobación por parte de la agencia de la fabricación, el uso o la venta para administración humana. Además, los polipéptidos de la presente invención pueden emplearse junto con otros compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse de una manera conveniente, tal como por vía oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica. Las cantidades y los regímenes de dosificación de MIP-3, MIP-4 y MIP-1\gamma administrados a un sujeto dependerán de varios factores tales como el modo de administración, la naturaleza de la afección a tratar y el criterio del médico que los prescribe. En términos generales se suministran, por ejemplo, en dosis terapéuticamente eficaces de al menos aproximadamente 10 \mug/kg de peso corporal y en la mayoría de los casos se administrarán en una cantidad no superior a aproximadamente ... mg/kg de peso corporal al día y, preferiblemente, la dosificación es de aproximadamente 10 \mug/kg de peso corporal al día, teniendo en cuenta las vías de administración, los síntomas, etc.

Las secuencias de la presente invención también son valiosas para la identificación de cromosomas. La secuencia se dirige específicamente y puede hibridar con una localización particular en un cromosoma humano individual. Además, actualmente existe la necesidad de identificar sitios particulares en el cromosoma. Actualmente se dispone de algunos reactivos marcadores de cromosomas basados en datos reales de las secuencias (polimorfismos repetidos) para marcar localizaciones cromosómicas. El mapeo de ADN en cromosomas de acuerdo con la presente invención es una primera etapa importante para correlacionar estas secuencias con genes asociados con enfermedades.

En resumen, pueden mapearse secuencias en cromosomas preparando cebadores de PCR (preferiblemente de 15-25 pb) a partir del ADNc. Se usa un análisis por ordenador del ADNc para seleccionar rápidamente cebadores que no incluyan más de un exón en el ADN genómico, complicándose de esta manera el proceso de amplificación. Estos cebadores después se usan para la selección por PCR de híbridos de células somáticas que contengan cromosomas humanos individuales. Sólo los híbridos que contengan el gen humano correspondiente al cebador proporcionarán un fragmento amplificado.

El mapeo por PCR de híbridos de células somáticas es un procedimiento rápido para asignar un ADN particular a un cromosoma particular. Usando la presente invención con los mismos cebadores oligonucleotídicos, puede conseguirse una sublocalización con paneles de fragmentos de cromosomas específicos o conjuntos de grandes clones genómicos de una manera análoga. Otras estrategias de mapeo que pueden usarse de forma similar para localizar sitios específicos en un cromosoma incluyen hibridación in situ, preselección con cromosomas "flow-sorted" marcados y preselección por hibridación para la construcción de bibliotecas de ADN específicas de cromosomas.

Puede usarse hibridación in situ de fluorescencia (FISH) de un clon de ADNc para una extensión cromosómica en metafase para proporcionar una localización cromosómica precisa en una etapa. Esta técnica puede usarse con un ADNc de tan sólo 500 ó 600 bases; sin embargo, los clones superiores a 2.000 pb tienen una mayor probabilidad de unirse a una localización cromosómica única con suficiente intensidad de señal para una detección sencilla. La FISH requiere el uso de los clones a partir de los cuales se obtuvo el EST, y cuanto más largos sean mejor. Por ejemplo, es aceptable una longitud de 2.000 pb, es mejor una longitud de 4.000 y probablemente no se necesita una longitud mayor de 4.000 para obtener buenos resultados en un porcentaje razonable de tiempo. Como revisión de esta técnica, véase Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Nueva York
(1988).

Una vez que se ha mapeado una secuencia en una localización cromosómica precisa, la posición física de la secuencia en el cromosoma puede correlacionarse con los datos del mapa genético. Tales datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (disponible directamente a través de Johns Hopkins University Welch Medical Library). Después se identifica la relación entre los genes y las enfermedades que se han mapeado en la misma región cromosómica mediante análisis de unión (coherencia de genes físicamente adyacentes).

Después, es necesario determinar las diferencias en la secuencia genómica o de ADNc entre los individuos afectados y no afectados. Si se observa una mutación en algunos o en todos los individuos afectados pero no se observa en ningún individuo normal, entonces es probable que la mutación sea el agente causante de la enfermedad.

Con la resolución actual de las técnicas de mapeo físico y de mapeo genético, un ADNc localizado de forma precisa en una región cromosómica asociada con la enfermedad podría ser uno entre 50 y 500 genes causantes potenciales. (Esto supone una resolución de mapeo de 1 megabase y un gen por 20 kb).

La comparación de individuos afectados y no afectados generalmente implica observar primero las alteraciones estructurales en los cromosomas, tales como deleciones y translocaciones que sean visibles por extensiones de los cromosomas o que sean detectables usando una PCR basada en esa secuencia de ADNc. Finalmente, se requiere la secuenciación completa de genes de varios individuos para confirmar la presencia de una mutación así como para distinguir mutaciones de polimorfismos.

La presente invención además se refiere a la inhibición de MIP-3, MIP-4 y MIP-1\gamma in vivo mediante el uso de la tecnología antisentido. La tecnología antisentido puede usarse para controlar la expresión génica a través de la formación de triples hélices o ADN o ARN antisentido, basándose ambos métodos en la unión de un polinucleótido a ADN o ARN. Por ejemplo, la porción codificante 5' de la secuencia polinucleotídica, que codifica los polipéptidos de la presente invención, se usa para designar un oligonucleótido de ARN antisentido con una longitud de aproximadamente 10 a 40 pares de bases. Se diseña un oligonucleótido de ADN que sea complementario a una región del gen implicado en la transcripción (triple hélice -véase Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al, Science, 241:456 (1988); y Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)), previniendo de esta manera la transcripción y la producción de MIP-3, MIP-4 y MIP-1\gamma. El oligonucleótido de ARN antisentido hibrida con el ARNm in vivo y bloquea la traducción de la molécula de ARNm en MIP-3, MIP-4 y MIP-1\gamma (antisentido -Okano, J. Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxinucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988)).

Como alternativa, los oligonucleótidos descritos anteriormente pueden suministrarse a las células por procedimientos en la técnica de tal forma que el ARN o el ADN antisentido pueda expresarse in vivo para inhibir la producción de MIP-3, MIP-4 y MIP-1\gamma de la forma descrita anteriormente.

Por consiguiente, las construcciones antisentido para las MIP-3, MIP-4 y MIP-1\gamma pueden usarse para tratar trastornos que se inducen o potencian por MIP, por ejemplo, aterosclerosis, trastornos autoinmunes, por ejemplo, esclerosis múltiple y diabetes dependiente de insulina, y enfermedades infecciosas e inflamatorias crónicas, reacciones alérgicas mediadas por histamina, artritis reumatoide, silicosis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopática y otras enfermedades inflamatorias crónicas del pulmón, síndrome hipereosinofílico idiopático, choque endotóxico, reacciones alérgicas mediadas por histamina, fiebre independiente de prostaglandinas, anemia aplástica y otros casos de insuficiencia de médula ósea.

Los polipéptidos, sus fragmentos u otros derivados, o análogos de los mismos, o células que los expresan, pueden usarse como un inmunógeno para producir anticuerpos contra los mismos. Estos anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos monoclonales o policlonales. La presente invención también incluye anticuerpos quiméricos, monocatenarios y humanizados, así como fragmentos Fab, o el producto de una biblioteca de expresión de Fab. Pueden usarse diversos procedimientos conocidos en la técnica para la producción de tales anticuerpos y fragmentos.

Pueden obtenerse anticuerpos generados contra los polipéptidos correspondientes a una secuencia de la presente invención o su receptor in vivo por medio de la inyección directa de los polipéptidos en un animal o por medio de la administración de los polipéptidos a un animal, preferiblemente a un animal no humano. Después, el anticuerpo obtenido de esta forma se unirá a los propios polipéptidos. De esta manera, puede usarse incluso una secuencia que codifique únicamente un fragmento de los polipéptidos para generar anticuerpos que se unan al polipéptido nativo entero. Después, tales anticuerpos pueden usarse para aislar los polipéptidos a partir de tejidos que expresan ese polipéptido.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos de líneas celulares continuas. Los ejemplos incluyen la técnica de hibridoma (Kohler y Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), y la técnica de hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole, et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., páginas 77-96).

Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (Patente de Estados Unidos 4.946.778) pueden adaptarse para producir anticuerpos monocatenarios contra productos polipeptídicos inmunogénicos de esta invención.

La presente invención se describirá adicionalmente con referencia a los ejemplos que se muestran más adelante; sin embargo, se entenderá que la presente invención no se limita a tales ejemplos. Todas las partes o cantidades, a menos que se especifique otra cosa, son partes o cantidades en peso.

Para facilitar la comprensión de los ejemplos que se muestran más adelante, se describirán ciertos métodos y/o términos que aparecen con frecuencia.

Los "plásmidos" se designan por una p minúscula que los precede y/o seguida de letras mayúsculas y/o números. Los plásmidos de partida de este documento están disponibles en el mercado, están disponibles públicamente en una base no restringida o pueden construirse a partir de plásmidos disponibles de acuerdo con procedimientos publicados. Además, en la técnica se conocen plásmidos equivalentes a los descritos y serán evidentes para el especialista habitual.

"Digestión" de ADN se refiere a la escisión catalítica del ADN con una enzima de restricción que actúa únicamente en ciertas secuencias en el ADN. Las diversas enzimas de restricción usadas en esta invención están disponibles en el mercado y sus condiciones de reacción, cofactores y otros requisitos se usaron como es conocido para los especialistas habituales en la técnica. Para fines analíticos, típicamente se usa 1 \mug de plásmido o de fragmento de ADN con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente 2 \mul de solución tampón. Para aislar fragmentos de ADN para la construcción de plásmidos, típicamente se digieren de 5 a 50 \mug de ADN con 20 a 250 unidades de enzima en un volumen superior. El fabricante especifica los tampones y las cantidades de sustrato apropiadas para las enzimas de restricción particulares. Habitualmente se usan tiempos de incubación de aproximadamente 1 hora a 37ºC, pero pueden variar de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Después de la digestión, la reacción se somete a electroforesis directamente en un gel de poliacrilamida para aislar el fragmento deseado.

La separación por tamaños de los fragmentos escindidos se realiza usando gel de poliacrilamida al 8 por ciento descrito por Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980).

"Oligonucleótidos" se refiere a polidesoxinucleótidos monocatenarios o a dos cadenas de polidesoxinucleótidos complementarias que pueden sintetizarse químicamente. Tales oligonucleótidos sintéticos no tienen fosfato 5' y, de esta forma, no se unirán a otro oligonucleótido sin añadir un fosfato con un ATP en presencia de una quinasa. Un oligonucleótido sintético se unirá a un fragmento que no se haya desfosforilado.

"Unión" se refiere al proceso de formar enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico bicatenarios (Maniatis, T., et al., Id., página 146). A menos que se indique otra cosa, la unión puede realizarse usando tampones y condiciones conocidas con 10 unidades de ADN ligasa de T4 ("ligasa") por 0,5 \mug de cantidades aproximadamente equimolares de los fragmentos de ADN a unir.

A menos que se indique otra cosa, la transformación se realizó como se describe en el método de Graham, F. y Van der Eb, A., Virology, 52:456-457 (1973).

Ejemplo 1 Expresión bacteriana y purificación de MIP-3

La secuencia de ADN que codifica para MIP-3, ATCC Nº 75676, se amplifica inicialmente usando cebadores oligonucleotídicos de PCR correspondientes a las secuencias 5' de la proteína MIP-3 procesada (menos la secuencia del péptido señal) y las secuencias 3' del vector para el gen de MIP-3. A las secuencias 5' y 3' se les añadieron respectivamente nucleótidos adicionales correspondientes a Bam HI y XbaI. El cebador oligonucleotídico 5' tiene la secuencia 5'-TCAGGATCCGTCACAAAAGATGCAGA-3', contiene un sitio de enzima de restricción BamHI seguido de 18 nucleótidos de la secuencia codificante de MIP-3 desde el supuesto aminoácido terminal del codón de la proteína procesada. La secuencia 3', 3'-CGCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT-5' contiene secuencias complementarias al sitio XbaI y a una secuencia del vector pBluescript SK localizada en el extremo 3' con respecto al inserto de ADN de MIP-3. Los sitios de enzimas de restricción corresponden a los sitios de enzimas de restricción del vector de expresión bacteriano PQE-9 (Qiagen, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311). PQE-9 codifica resistencia a antibióticos (Amp^{r}), un origen de replicación bacteriano (ori), un promotor/operador regulable por IPTG (P/O), un sitio de unión a ribosomas (RBS), una señal 6-His y sitios de enzimas de restricción. Después, pQE-9 se digiere con BamHI y XbaI. Las secuencias amplificadas se unen a PQE-9 y se insertan en fase con la secuencia que codifica la señal de histidina y el RBS. La Figura 6 muestra una representación esquemática de esta disposición. Después, la mezcla de unión se usa para transformar la cepa de E. coli M15/rep4 disponible en Qiagen con el nombre comercial M15/rep 4. M15/rep4 contiene múltiples copias del plásmido pREP4, que expresa el represor lacI y también confiere resistencia a kanamicina (Kan^{r}). Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer en placas LB y se seleccionan las colonias resistentes a ampicilina/kanamicina. El ADN plasmídico se aísla y se confirma por análisis de restricción. Los clones que contienen las construcciones deseadas se cultivan durante una noche (O/N) en cultivo líquido en medio LB suplementado tanto con Amp (100 \mug/ml) como con Kan (25 \mug/ml). El cultivo O/N se usa para inocular un cultivo grande a una relación de 1:100 a 1:250. Las células crecen hasta una densidad óptica a 600 (O.D.^{600}) comprendida entre 0,4 y 0,6. Después se añade IPTG ("isopropil-B-D-tiogalactopiranósido") a una concentración final de 1 mM. El IPTG realiza la inducción por la inactivación del represor lacI, eliminando el P/O y conduciendo de esta manera a una mayor expresión génica. Las células se cultivan durante un período adicional de 3 a 4 horas. Después, las células se recogen por centrifugación. El sedimento celular se solubiliza en el agente caotrópico Guanidina HCl 6 molar. Después de la clarificación, la MIP-3 solubilizada se purifica a partir de esta solución por cromatografía en una columna de quelato de níquel en condiciones que permiten una unión fuerte por proteínas que contienen la señal 6-His. Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411:177-184 (1984). La MIP-3 (con una pureza de 95%) se eluye de la columna en guanidina HCl 6 molar, pH 5,0, y para la renaturalización se ajusta a guanidina HCl 3 molar, fosfato sódico 100 mM, glutatión (reducido) 10 mmolar y glutatión (oxidado) 2 mmolar. Después de la incubación en esta solución durante 12 horas, la proteína se dializa frente a fosfato sódico 10 mmolar. La presencia de una nueva proteína correspondiente a 14 Kd después de la inducción demostró la expresión de la MIP-3.

Ejemplo 2 Expresión bacteriana y purificación de MIP-4

La secuencia de ADN que codifica MIP-4, ATCC Nº 75675 se amplificó inicialmente usando cebadores oligonucleotídicos de PCR correspondientes a las secuencias 5' de la proteína MIP-4 procesada (menos la secuencia del péptido señal) y secuencias del vector pBSK 3' con respecto al gen de MIP-4. Se añadieron nucleótidos adicionales correspondientes a Bam HI y XbaI a las secuencias 5' y 3' respectivamente. El cebador oligonucleotídico 5' tiene la secuencia TCAGGATCCTGTGCACAAGTTGGTACC y contiene un sitio de enzimas de restricción BamHI seguido de 18 nucleótidos de la secuencia codificante de MIP-4 desde el supuesto aminoácido terminal del codón de la proteína procesada; la secuencia 3' CGCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT contiene secuencias complementarias al sitio XbaI y a una secuencia del vector pBluescript SK localizado en posición 3' con respecto al inserto de ADN de MIP-4. Los sitios de enzimas de restricción corresponden a los sitios de enzimas de restricción del vector de expresión bacteriano PQE-9 (Qiagen, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311). PQE-9 codifica resistencia a antibióticos (Amp^{r}), un origen de replicación bacteriano (ori), un promotor/operador regulable por IPTG (P/O), un sitio de unión a ribosomas (RBS), una señal 6-His y sitios de enzimas de restricción. Después, pQE-9 se digirió con BamHI y XbaI. Las secuencias amplificadas se unieron a pQE-9 y se insertaron en fase con la secuencia codificante de la señal de histidina y el RBS. La Figura 6 muestra una representación esquemática de esta disposición. Después, la mezcla de ligación se usó para transformar la cepa de E. coli disponible en Qiagen con el nombre comercial M15/rep 4. M15/rep4 contiene múltiples copias del plásmido pREP4, que expresa el represor lacI y que también confiere resistencia a kanamicina (Kan^{r}). Los transformantes se identificaron por su capacidad de crecer en placas LB y se seleccionaron las colonias resistentes a ampicilina/kanamicina. El ADN plasmídico se aisló y se confirmó por análisis de restricción. Los clones que contenían las construcciones deseadas se cultivaron durante una noche (O/N) en cultivo líquido en medio LB suplementado tanto con Amp (100 \mug/ml) como con Kan (25 \mug/ml). El cultivo O/N se usa para inocular un cultivo grande a una relación de 1:100 a 1:250. Las células se cultivaron hasta una densidad óptica a 600 (O.D.^{600}) comprendida entre 0,4 y 0,6. Después, se añadió IPTG ("isopropil-B-D-tiogalactopiranósido") a una concentración final de 1 mM. El IPTG realiza la inducción inactivando el represor lacI y eliminando el P/O, proporcionando de esta manera un aumento de la expresión génica. Las células se cultivaron durante un período adicional de 3 a 4 horas. Después, las células se recogieron por centrifugación. El sedimento celular se solubilizó en el agente caotrópico guanidina HCl 6 molar. Después de la clarificación, la MIP-4 solubilizada se purificó a partir de esta solución por cromatografía en una columna de quelato de níquel en condiciones que permitían una unión fuerte por proteínas que contenían la señal 6-His. Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411:177-184 (1984). La MIP-4 (con una pureza de 95%) se eluyó de la columna en guanidina HCl 6 molar, pH 5,0, y para la renaturalización, se ajustó a guanidina HCl 3 molar, fosfato sódico 100 mM, glutatión (reducido) 10 mmolar y glutatión (oxidado) 2 mmolar. Después de la incubación en esta solución durante 12 horas, la proteína se dializó frente a fosfato sódico 10 mmolar. La presencia de una nueva proteína correspondiente a 14 Kd después de la inducción demostró la expresión de la MIP-4. (Figura 5).

Ejemplo 3 Expresión de MIP-3 recombinante en células COS

La expresión del plásmido CMV-MIP-3 HA se realiza a partir de un vector pcDNAI/Amp (Invitrogen) que contiene: 1) un origen de replicación de SV40, 2) un gen de resistencia a ampicilina, 3) un origen de replicación de E. coli, 4) un promotor de CMV seguido de una región de polienlazador, un intrón de SV40 y un sitio de poliadenilación. En la región de polienlazador del vector se clona un fragmento de ADN que codifica el precursor de MIP-3 entero y una señal HA fusionada en fase a su extremo 3', por lo tanto, la expresión de la proteína recombinante se dirige bajo el promotor de CMV. La señal HA corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de influenza como se ha descrito previamente (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A Cherenson, M. Connolly, y R. Lerner, 1984, Cell 37, 767). La infusión de la señal HA a la proteína diana facilita la detección de la proteína recombinante con un anticuerpo que reconozca el epítopo de HA.

La estrategia para la construcción de plásmidos se describe como sigue:

La secuencia de ADN, ATCC Nº 75676, que codifica MIP-3, se construye por PCR en el EST original clonado usando dos cebadores: el cebador 5' (5' GGAAAGCTTATGAAGGTCTCCGTGGCT-3') contiene un sitio HindIII seguido de 18 nucleótidos de la secuencia codificante de MIP-3 que comienza a partir del codón de iniciación; la secuencia 3' (5'-CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGG GTAATTCTTCCTGGTCTTGATCC-3') contiene secuencias complementarias al sitio Xba I, un codón de interrupción de la traducción (stop), una señal HA y al menos 20 nucleótidos de la secuencia codificante de MIP-3 (sin incluir el codón stop). Por lo tanto, el producto de PCR contiene un sitio HindIII, una secuencia codificante de MIP-3 seguida de la señal HA fusionada en fase, un codón stop de terminación de traducción próximo a la señal HA, y un sitio XbaI. El fragmento de ADN amplificado por PCR y el vector, pcDNAI/Amp, se digieren con las enzimas de restricción HindIII y XbaI y se unen. La mezcla de unión se utiliza para transformar la cepa de E. coli SURE (disponible en Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037), el cultivo transformado se cultiva en placas sobre medios con ampicilina y se seleccionan las colonias resistentes. El ADN plasmídico se aísla a partir de los transformantes y se examina por análisis de restricción con respecto a la presencia del fragmento correcto. Para la expresión de la MIP-3 recombinante, se transfectan células COS con el vector de expresión por el método de DEAE-DEXTRANO. (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). La expresión de la proteína MIP-3-HA se detecta por el método de radiomarcaje e inmunoprecipitación. (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). Las células se marcan durante 8 horas con ^{35}S-cisteína dos días después de la transfección. Después, los medios de cultivo se recogen y las células se lisan con detergente (tampón RIPA (NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, SDS al 0,1%, NP-40 al 1%, DOC al 0,5%, Tris 50 mM, pH 7,5). (Wilson, I. et al., Id. 37:767 (1984)). Tanto el lisado celular como los medios de cultivo se precipitan con un anticuerpo monoclonal específico de HA. Las proteínas precipitadas se analizan en geles de SDS-PAGE al 15%.

Ejemplo 4 Expresión de MIP-4 recombinante en células COS

La expresión del plásmido CMV-MIP-3 HA se realiza a partir de un vector pcDNAI/Amp (Invitrogen) que contiene: 1) un origen de replicación de SV40, 2) un gen de resistencia a ampicilina, 3) un origen de replicación de E. coli, 4) un promotor de CMV seguido de una región de polienlazador, un intrón de SV40 y un sitio de poliadenilación. En la región de polienlazador del vector se clona un fragmento de ADN que codifica el precursor de MIP-4 entero y una señal HA fusionada en fase a su extremo 3', por lo tanto, la expresión de la proteína recombinante se dirige bajo el promotor de CMV. La señal HA corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de influenza como se ha descrito previamente (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A Cherenson, M. Connolly, y R. Lerner, 1984, Cell 37, 767). La infusión de la señal HA en la proteína diana facilita la detección de la proteína recombinante con un anticuerpo que reconoce el epítopo HA.

La estrategia para la construcción de plásmidos se describe como sigue:

La secuencia de ADN, ATCC Nº 75675, que codifica para MIP-4 se construye por PCR en el EST original clonado usando dos cebadores: el cebador 5' (5' GGAAAGCTTATGAAGGGCCTTGCAGCTGCC 3') contiene un sitio HindIII seguido de 20 nucleótidos de la secuencia codificante de MIP-4 que comienza a partir del codón de iniciación; la secuencia 3' (5' CGCTCTAGATCAABCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGGCATTCAGCTTCAGGTC 3') contiene secuencias complementarias al sitio Xba I, un codón stop de la traducción, una señal HA y al menos 19 nucleótidos de la secuencia codificante de MIP-4 (sin incluir el codón stop). Por lo tanto, el producto de PCR contiene un sitio HindIII, una secuencia codificante de MIP-4 seguida de la señal HA fusionada en fase, un codón stop de terminación de traducción próximo a la señal HA, y un sitio XbaI. El fragmento de ADN amplificado por PCR y el vector, pcDNAI/Amp, se digieren con las enzimas de restricción HindIII y XbaI y se unen. La mezcla de unión se utiliza para transformar la cepa de E. coli SURE (disponible en Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037), el cultivo transformado se cultiva en placas con medio con ampicilina y se seleccionan las colonias resistentes. El ADN plasmídico se aísla a partir de los transformantes y se examina por análisis de restricción con respecto a la presencia del fragmento correcto. Para la expresión de la MIP-4 recombinante, se transfectan células COS con el vector de expresión por el método de DEAE-DEXTRANO. (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). La expresión de la proteína MIP-4-HA se detecta por el método de radiomarcaje e inmunoprecipitación. (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). Las células se marcan durante 8 horas con ^{35}S-cisteína dos días después de la transfección. Después, los medios de cultivo se recogen y las células se lisan con detergente (tampón RIPA (NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, SDS al 0,1%, NP-40 al 1%, DOC al 0,5%, Tris 50 mM, pH 7,5). (Wilson, I. et al., Id. 37:767 (1984)). Tanto el lisado celular como los medios de cultivo se precipitan con un anticuerpo monoclonal específico de HA. Las proteínas precipitadas se analizan en geles de SDS-PAGE al 15%.

Ejemplo 5 Modelo de expresión de MIP-3 en tejido humano

Se realizó un análisis de transferencia de northern para examinar los niveles de expresión de MIP-3 en tejidos humanos. Se aislaron muestras de ARN celular total con el sistema RNAzol™ B (Biotecx Laboratories, Inc. 6023 South Loop East, Houston, TX 77033). Aproximadamente 10 \mug de ARN total aislado a partir de cada tejido humano especificado se separan en gel de agarosa al 1% y se transfieren a un filtro de nylon (Sambrook, Fritsch, y Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, (1989)). La reacción de marcaje se realiza de acuerdo con el kit Stratagene Prime-It con 50 ng de fragmento de ADN. El ADN marcado se purifica con una columna Select-G-50. (5 Prime-3 Prime, Inc. 5603 Arapahoe Road, Boulder, CO 80303). Después, el filtro se hibrida con gen de MIP- 3 de longitud completa marcado radiactivamente a 1.000.000 cpm/ml en NaPO_{4} 0,5 M, pH 7,4 y SDS al 7% durante una noche a 65ºC. Después de lavar dos veces a temperatura ambiente y dos veces a 60ºC con 0,5 x SSC y SDS al 0,1%, el filtro se expone a -70ºC durante una noche con una pantalla de intensificación.

Ejemplo 6 Modelo de expresión de MIP-4 en células humanas

Se realizó un análisis de transferencia de northern para examinar los niveles de expresión de MIP-4 en células humanas. Se aislaron muestras de ARN celular total con el sistema RNAzol™ B (Biotecx Laboratories, Inc. 6023 South Loop East, Houston, TX 77033). Aproximadamente 10 \mug de ARN total aislado a partir de cada tejido humano especificado se separaron en gel de agarosa al 1% y se transfirieron a un filtro de nylon. (Sambrook, Fritsch, y Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, (1989)). La reacción de marcaje se realizó de acuerdo con el kit Stratagene Prime-It con 50 ng de fragmento de ADN. El ADN marcado se purificó con una columna Select-G-50. (5 Prime-3 Prime, Inc. 5603 Arapahoe Road, Boulder, CO 80303). Después, el filtro se hibridó con el gen de MIP-4 de longitud completa marcado radiactivamente a 1.000.000 cpm/ml en NaPO_{4} 0,5 M, pH 7,4 y SDS al 7% durante una noche a 65ºC. Después de lavar dos veces a temperatura ambiente y dos veces a 60ºC con 0,5 x SSC y SDS al 0,1%, el filtro se expuso a -70ºC durante una noche con una pantalla de intensificación. Véase la Figura 6.

Ejemplo 7 Expresión bacteriana y purificación de MIP-1\gamma

La secuencia de ADN que codifica MIP-1\gamma, PBLSKMIP (ATCC Nº 75572) se amplificó inicialmente usando cebadores oligonucleotídicos de PCR correspondientes a las secuencias 5' y 3' de la proteína MIP-1\gamma procesada (menos la secuencia del péptido señal) y se añadieron nucleótidos adicionales correspondientes a Bam HI y a XbaI a las secuencias 5' y 3' respectivamente. El cebador oligonucleotídico 5' tiene la secuencia GCCCGCGGATCCTCCTCACGGGGACCTTAC, contiene un sitio de enzimas de restricción BamHI seguido de 15 nucleótidos de la secuencia codificante MIP-1\gamma desde el supuesto aminoácido terminal del codón de la proteína procesada; la secuencia 3' GCCTGCTCTAGATCAAAGCAGGGAAGCTCCAG contiene secuencias complementarias al sitio XbaI, un codón de interrupción de la traducción (stop) y los últimos 20 nucleótidos de la secuencia codificante de MIP-1\gamma. Los sitios de enzimas de restricción corresponden a los sitios de enzimas de restricción en el vector de expresión bacteriano PQE-9 (Qiagen, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311). PQE-9 codifica la resistencia a antibióticos (Amp^{r}), un origen de replicación bacteriano (ori), un promotor/operador regulable por IPTG (P/O), un sitio de unión a ribosomas (RBS), una señal 6-His y sitios de enzimas de restricción. Después, pQE-9 se digirió con BamHI y XbaI. Las secuencias amplificadas se unieron a PQE-9 y se insertaron en fase con la secuencia codificante de la señal de histidina y el RBS. La figura 6 muestra una representación esquemática de esta disposición. Después, la mezcla de unión se usó para transformar la cepa de E. coli disponible en Qiagen con la marca comercial M15/rep 4. M15/rep4 contiene múltiples copias del plásmido pREP4, que expresa el represor lacI y también confiere resistencia a kanamicina (Kan^{r}). Los transformantes se identificaron por su capacidad de crecer en placas LB y se seleccionaron las colonias resistentes a ampicilina/kanamicina. Se aisló ADN plasmídico y se confirmó por análisis de restricción. Los clones que contenían las construcciones deseadas se cultivaron durante una noche (O/N) en cultivo líquido en medio LB suplementado tanto con Amp (100 \mug/ml) como con Kan (25 \mug/ml). El cultivo O/N se usa para inocular un cultivo grande a una relación de 1:100 a 1:250. Las células se cultivaron a una densidad óptica a 600 (O.D.^{600}) comprendida entre 0,4 y 0,6. Después se añadió IPTG ("isopropil-B-D-tiogalactopiranósido") a una concentración final de 1 mM. El IPTG realiza la inducción inactivando el represor lacI y eliminando el P/O, obteniéndose un aumento en la expresión génica. Las células se cultivaron durante un período adicional de 3 a 4 horas. Después, las células se recogieron por centrifugación. El sedimento celular se solubilizó en el agente caotrópico Guanidina HCl 6 Molar. Después de la clarificación, se purificó la MIP-1\gamma solubilizada a partir de esta solución por cromatografía en una columna de Quelato de Níquel en condiciones que permitían una unión fuerte por proteínas que contenían la señal 6-His. Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411:177-184 (1984). La MIP-1\gamma (con una pureza de 95%) se eluyó de la columna en guanidina HCl 6 molar, pH 5,0 y para la renaturalización, se ajustó a guanidina HCl 3 molar, fosfato sódico 100 mM, glutatión (reducido) 10 mmolar y glutatión (oxidado) 2 mmolar. Después de la incubación en esta solución durante 12 horas, la proteína se dializó frente a fosfato sódico 10 mmolar. La presencia de una nueva proteína correspondiente a 14 Kd después de la inducción demostró la expresión de la MIP-1\gamma. (Figura 3).

Ejemplo 8 Expresión de MIP-1\gamma recombinante en células COS

La expresión del plásmido CMV-MIP-1 \gamma HA se realiza a partir de un vector pcDNAI/Amp (Invitrogen) que contiene: 1) un origen de replicación de SV40, 2) un gen de resistencia a ampicilina, 3) un origen de replicación de E. coli, 4) un promotor de CMV seguido de una región de polienlazador, un intrón de SV40 y un sitio de poliadenilación. En la región de polienlazador del vector se clonó un fragmento de ADN que codificaba el precursor de MIP-1\gamma entero y una señal HA fusionada en fase a su extremo 3', por lo tanto, la expresión de la proteína recombinante se dirige bajo el promotor de CMV. La señal HA corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de influenza como se ha descrito previamente (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A Cherenson, M. Connolly, y R. Lerner, 1984, Cell 37, 767). La infusión de la señal HA a la proteína diana facilita la detección de la proteína recombinante con un anticuerpo que reconozca el epítopo de HA.

La estrategia para la construcción de plásmidos se describe como sigue:

La secuencia de ADN, pBLSKMIP (ATCC Nº 75572), que codifica para MIP-1\gamma, se construyó por PCR en el EST original clonado usando dos cebadores: el cebador 5' (5' GGAAAGCTTATGAAGATTCCGTGGCTGC 3')
contiene un sitio HindIII seguido de 20 nucleótidos de la secuencia codificante de MIP-1\gamma desde el codón de iniciación; la secuencia 3'(5'-CGCTCTAGATCAAGOGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTTCTCCTTCATGTCCTTG-3') contiene secuencias complementarias al sitio Xba I, un codón de interrupción de la traducción (stop), una señal HA y al menos 19 nucleótidos de la secuencia codificante de MIP-1\gamma (sin incluir el codón stop). Por lo tanto, el producto de PCR contiene un sitio HindIII, una secuencia codificante de MIP-1\gamma seguida de la señal HA fusionada en fase, un codón stop de terminación de la traducción próximo a la señal HA, y un sitio XbaI. El fragmento de ADN amplificado por PCR y el vector, pcDNAI/Amp, se digirieron con las enzimas de restricción HindIII y XbaI y se unieron. La mezcla de unión se usó para transformar la cepa de E. coli SURE (disponible en Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037), el cultivo transformado se cultivó en placas con medio con ampicilina y se seleccionaron las colonias resistentes. El ADN plasmídico se aisló a partir de los transformantes y se examinó por análisis de restricción con respecto a la presencia del fragmento correcto. Para la expresión de la MIP-1\gamma recombinante, se transfectaron células COS con el vector de expresión por el método de DEAE-DEXTRANO. (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). La expresión de la proteína MIP-1\gamma-HA se detectó por el método de radiomarcaje e inmunoprecipitación. (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). Las células se marcaron durante 8 horas con ^{35}S-cisteína dos días después de la transfección. Después, los medios de cultivo se recogieron y las células se lisaron con detergente (tampón RIPA (NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, SDS al 0,1%, NP-40 al 1%, DOC al 0,5%, Tris 50 mM, pH 7,5). (Wilson, I. et al., Id. 37:767 (1984)). Tanto el lisado celular como los medios de cultivo se precipitaron con un anticuerpo monoclonal específico de HA. Las proteínas precipitadas se analizaron en geles de SDS-PAGE al 15%.

Ejemplo 9 Modelo de expresión de MIP-1\gamma en tejido humano

Se realizó un análisis de transferencia de northern para examinar los niveles de expresión de MIP-1\gamma en tejidos humanos. Se aislaron muestras de ARN celular total con el sistema RNAzol™ B (Biotecx Laboratories, Inc. 6023 South Loop East, Houston, TX 77033). Aproximadamente 10 \mug de ARN total aislado a partir de cada tejido humano especificado se separaron en gel de agarosa al 1% y se transfirieron a un filtro de nylon. (Sambrook, Fritsch, y Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, (1989)). La reacción de marcaje se realizó de acuerdo con el kit Stratagene Prime-It con 50 ng de fragmento de ADN. El ADN marcado se purificó con una columna Select-G-50. (5 Prime-3 Prime, Inc. 5603 Arapahoe Road, Boulder, CO 80303). Después, el filtro se hibridó con el gen de MIP-1\gamma de longitud completa marcado radiactivamente a 1.000.000 cpm/ml en NaPO_{4} 0,5 M, pH 7,4 y SDS al 7% durante una noche a 65ºC. Después de lavar dos veces a temperatura ambiente y dos veces a 60ºC con 0,5 x SSC y SDS al 0,1%, el filtro se expuso a -70ºC durante una noche con una pantalla de intensificación. El ARN mensajero para MIP-1\gamma es abundante en bazo, pulmón, hígado y es menos abundante en otros tejidos. (Figura 5).

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: LI, ET AL.

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteína -3, -4 y 1 gamma inflamatoria de macrófagos

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 6

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: CARELLA, BYRNE, BAIN, GILFILLAN, CECCHI, STEWART Y OLSTEIN

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: 6 BECKER FARM ROAD

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CIUDAD: ROSELAND

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

ESTADO: NEW JERSEY

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(E)

PAÍS: ESTADOS UNIDOS

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 07068

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: DISCO DE 3,5 PULGADAS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PS/2

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: WORD PERFECT 5.1

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.666000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/173.209

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 22 DE DICIEMBRE DE 1993

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(viii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/208.339

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 08 DE MARZO DE 1994

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: FERRARO, GREGORY D.

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 36.134

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 325800-163

\vskip0.666000\baselineskip

(x)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 201-994-1700

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 201-994-1744

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 474 PARES DE BASES

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: SENCILLA

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

1

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 93 AMINOÁCIDOS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 366 PARES DE BASES

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: SENCILLA

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(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

3

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 121 AMINOÁCIDOS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

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(C)

CADENA:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 270 PARES DE BASES

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(B)

TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: SENCILLA

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(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 89 AMINOÁCIDOS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

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(C)

CADENA:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

6

Claims (27)

1. Un polinucleótido que comprende un polinucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por

(a)

polinucleótidos que codifican al menos la forma madura del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida representada en las SEC ID Nº: 2 (Fig. 8), 4 (Fig. 1) ó 6 (Fig. 2);

(b)

polinucleótidos que tienen la secuencia codificante representada en las SEC ID Nº: 1 (Fig. 8), 3 (Fig. 1) ó 5 (Fig. 2) que codifica al menos la forma madura del polipéptido;

(c)

polinucleótidos que codifican el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de al menos la forma madura del polipéptido codificado por el ADNc contenido en ATCC 75572, ATCC 75676 o ATCC 75675;

(d)

polinucleótidos que tienen la secuencia codificante del ADNc contenido en ATCC 75572, ATCC 75676 o ATCC 75675 que codifica al menos la forma madura del polipéptido;

(e)

polinucleótidos que codifican un fragmento de un polipéptido codificado por un polinucleótido de una cualquiera de (a) a (d), donde dicho fragmento es un quimioatrayente para leucocitos, inhibe la formación de colonias de células madre en la médula ósea o protege a las células madre hematopoyéticas durante la quimioterapia para el tratamiento de un cáncer;

(f)

polinucleótidos que codifican un análogo o derivado de un polipéptido codificado por un polinucleótido de una cualquiera de (a) a (d), donde (i) uno o más de los restos aminoacídicos están sustituidos con un resto aminoacídico conservado, (ii) uno o más de los restos aminoacídicos incluyen un grupo sustituyente, o (iii) el polipéptido maduro está fusionado con otro compuesto y donde dicho análogo o derivado es quimioatrayente para leucocitos, inhibe la formación de colonias de células madre en la médula ósea o protege a las células madre hematopoyéticas durante la quimioterapia para el tratamiento de un cáncer;

(g)

polinucléotidos que tienen una identidad de al menos 70% con un polinucleótido como se define en una cualquiera de (a) a (d) y que codifican un polipéptido que es quimioatrayente para leucocitos, inhibe la formación de colonias de células madre en la médula ósea o protege a las células madre hematopoyéticas durante la quimioterapia para el tratamiento de un cáncer;

(h)

polinucléotidos que tienen una identidad de al menos 95% con un polinucleótido como se define en una cualquiera de (a) a (e) y que codifican un polipéptido que es quimioatrayente para leucocitos, inhibe la formación de colonias de células madre en la médula ósea o protege a las células madre hematopoyéticas durante la quimioterapia para el tratamiento de un cáncer; y

(i)

polinucléotidos que tienen una identidad de al menos 97% con un polinucleótido como se define en una cualquiera de (a) a (e) y que codifican un polipéptido que es quimioatrayente para leucocitos, inhibe la formación de colonias de células madre en la médula ósea o protege a las células madre hematopoyéticas durante la quimioterapia para el tratamiento de un cáncer;

o la cadena complementaria de tal polinucleótido.

2. El polinucleótido de la reivindicación 1, donde el polinucleótido codifica un resto aminoacídico de metionina inicial.

3. El polinucleótido de la reivindicación 1(g), donde los polinucleótidos tienen una identidad de al menos 95% con un polinucleótido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1(a) a (d).

4. El polinucleótido de la reivindicación 1(g), donde los polinucleótidos tienen una identidad de al menos 97% con un polinucleótido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1(a) a (d).

5. Un polinucleótido que comprende la secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia de restos aminoacídicos +1 a +76 deducida como se representa en la SEC ID Nº: 4.

6. El polinucleótido de la reivindicación 5, donde el polinucleótido codifica un resto aminoacídico de metionina inicial.

7. Un polinucleótido seleccionado entre el grupo compuesto por

(a)

polinucleótidos con una identidad de al menos 70% con el polinucleótido de la reivindicación 5 ó 6;

(b)

polinucleótidos con una identidad de al menos 95% con el polinucleótido de la reivindicación 5 ó 6;

(c)

polinucleótidos con una identidad de al menos 97% con el polinucleótido de la reivindicación 5 ó 6.

8. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el polipéptido codificado es quimioatrayente para leucocitos.

9. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el polipéptido codificado, análogo o derivado del mismo es quimioatrayente para monocitos, neutrófilos, linfocitos T, eosinófilos o basófilos.

10. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde el polipéptido codificado inhibe la formación de colonias de células madre en la médula ósea.

11. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde el polipéptido codificado protege a las células madre hematopoyéticas durante la quimioterapia para el tratamiento de un cáncer.

12. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que es ADN o ARN.

13. El ADN de la reivindicación 12 que es ADN genómico.

14. Un vector que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

15. El vector de la reivindicación 14, donde el polinucleótido está unido operativamente a secuencias reguladoras que permiten la transcripción en células procariotas o eucariotas.

16. Una célula hospedadora modificada por ingeniería genética con un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o un vector de la reivindicación 14 ó 15.

17. Un proceso para producir una proteína inflamatoria de macrófagos (MIP), que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 16 y recuperar la proteína del cultivo.

18. Un polipéptido codificado por un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o que se puede obtener por el proceso de la reivindicación 17.

19. Un anticuerpo contra el polipéptido de la reivindicación 18.

20. Una molécula de ácido nucleico que hibrida específicamente con un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

21. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la reivindicación 18, el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o un anticuerpo de la reivindicación 19 y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

22. Una composición de diagnóstico que comprende un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, el anticuerpo de la reivindicación 19 o la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 20.

23. Uso de un polipéptido de la reivindicación 18 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de infecciones crónicas, cáncer, leucemia, leucemia linfocítica, enfermedades inmunes, psoriasis, apoplejía, trombocitosis, embolia pulmonar, trastornos mieloproliferativos o para la aplicación en terapia contra tumores, curación de la herida, inmunorregulación o inhibición de la formación de colonias de células madre en la médula
ósea.

24. Uso de un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de aterosclerosis, enfermedades autoinmunes, esclerosis múltiple, enfermedades infecciosas, reacciones alérgicas mediadas por histamina, artritis reumatoide, silicosis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopática, enfermedades inflamatorias crónicas del pulmón, síndrome hipereosinofílico idiopático, choque endotóxico, fiebre independiente de prostaglandina o anemia aplástica.

25. Uso de un anticuerpo de la reivindicación 19 o la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 20 para la preparación de una preparación farmacéutica para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, inflamaciones crónicas, enfermedades infecciosas crónicas, silicosis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopática, síndrome hipereosinofílico idiopático, choque endotóxico, reacciones alérgicas mediadas por histamina, anemia aplástica y otras insuficiencias de la médula ósea.

26. Un método para identificar un antagonista contra un polipéptido de la reivindicación 18 que comprende:

(a)

poner en contacto un leucocito con un supuesto antagonista y el polipéptido de la reivindicación 18; y

(b)

determinar si la unión al antagonista previene la unión de un polipéptido de la reivindicación 18.

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27. Un método para identificar un inhibidor de un polipéptido de la reivindicación 18 que comprende:

(a)

poner en contacto el polipéptido con un supuesto inhibidor; y

(b)

determinar si la unión del inhibidor previene la actividad biológica del polipéptido.