DE69433666T2 - ENTZÜNDUNGSPROTEINE AUS MAKROPHAGEN MIP-3, MIP-4 UND MIP-1Gamma - Google Patents

ENTZÜNDUNGSPROTEINE AUS MAKROPHAGEN MIP-3, MIP-4 UND MIP-1Gamma Download PDF

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Description

  • Diese Erfindung betrifft neu identifizierte Polynucleotide, durch solche Polynucleotide codierte Polypeptide, die Verwendung solcher Polynucleotide und Polypeptide ebenso wie die Herstellung solcher Polynucleotide und Polypeptide. Im Besonderen sind die Polypeptide der vorliegenden Erfindung das menschliche Entzündungsprotein 3 aus Makrophagen (MIP-3), das Entzündungsprotein 4 aus Makrophagen (MIP-4) und das Entzündungsprotein 1γ aus Makrophagen. Die Erfindung betrifft ebenfalls die Hemmung der Wirkung solcher Polypeptide.
  • Entzündungsproteine aus Makrophagen (MIPs) sind Proteine, die durch bestimmte Säugerzellen, zum Beispiel Makrophagen und Lymphocyten, als Antwort auf einen Stimulus wie Gram-negative Bakterien, Lipopolysaccharide und Concanavalin A produziert werden. Somit können MIP-Moleküle einen diagnostischen und therapeutischen Nutzen bei der Detektion und Behandlung von Infektionen, Krebs, Entzündungen, myelopoietischen Fehlfunktionen und Autoimmunerkrankungen aufweisen. Murines MIP-1 ist ein wichtiges ausgeschiedenes Protein von durch Lipopolysaccharide stimulierter RAW 264.7, einer murinen Makrophagen-Tumorzelllinie. Es ist gereinigt worden und es wurde herausgefunden, dass es aus zwei verwandten Proteinen, MIP-1α und MIP-1β, besteht.
  • Verschiedene Gruppen haben die mutmaßlichen, menschlichen Homologe von MIP-1α und MIP-1β χloniert. In allen Fällen wurden cDNAs aus Genbanken isoliert, die aus RNA von aktivierten T-Zellen hergestellt wurden.
  • Es wurde gezeigt, dass die Entzündungsproteine aus Makrophagen (MIP-1α und MIP-1β) entzündungsfördernde Eigenschaften aufweisen. MIP-1α kann die Wanderung und Aktivierung von menschlichen eosinophilen Zellen und Monocyten induzieren und induziert die Chemotaxis von Makrophagen. Darüber hinaus hat das murine MIP-1α eine supprimierende Wirkung auf die Proliferation menschlicher hematopoietischer Stammzellen, während das murine MIP-1β die hemmende Wirkung von MIP-1α außer Kraft setzen kann. Letztlich können MIP-1-Proteine in früh auftretenden Zellen der Wundentzündung festgestellt werden und es wurde gezeigt, dass sie die Produktion von IL-1 und IL-6 durch Wund-Fibroblastenzellen induzieren.
  • MIP-1-Proteine sind Teil der Familie der Chemokine, die zahlreiche Funktionen im Zusammenhang mit Entzündung, Wundheilung oder Immunregulation ausüben und eine aktive Rolle in einer Vielzahl von Krankheitszuständen spielen. Weiterhin wurde gefunden, dass MIP-1 hematopoietische, verstärkende Wirkungen ausübt. Broxmeyer, H.E., et al., J. Exp. Med., 170 :1583-94 (1989) und Broxmeyer, H.E., et al., Blood, 76 :1110-6 (1990).
  • Die Bestimmung der biologischen Aktivitäten von MIP-1 ist sehr ausführlich untersucht worden und hat natives MIP-1 und seit sehr kurzer Zeit rekombinantes MIP-1α und MIP1β verwendet. Gereinigtes natives MIP-1 (bestehend aus MIP-1-, MIP-1α- und MIP-1β-Polypeptiden) verursacht akute Entzündungen, wenn es entweder subkutan in die Fußballen der Mäuse oder intrazisternal in die zerebrospinale Flüssigkeit von Kaninchen injiziert wurde (Wolpe und Cerami, 1989, FASEB J. 3:2565-73). Zusätzlich zu diesen entzündungsfördernden Eigenschaften von MIP-1, welche direkt oder indirekt sein können, ist MIP-1 während der frühen Entzündungsphase der Wundheilung in einem experimentellen Mausmodell unter der Verwendung von sterilen Wundkammern gewonnen worden (Fahey, et al., 1990, Cytokine, 2:92). Zum Beispiel offenbart die PCT-Anmeldung US 91/06489 (WO-A-9205198), die von Chiron Corporation angemeldet wurde, ein DNA-Molekül, das als eine Matrize zur Herstellung von Entzündungsproteinen von Makrophagen (MIPs) aus Säugern in Hefe aktiv ist.
  • Das murine MIP-1α und MIP-1β sind unterschiedliche, aber eng verwandte Cytokine. Teilweise gereinigte Gemische der zwei Proteine beeinflussen die Funktion von neutrophilen Zellen und verursachen lokale Entzündungen und Fieber. Es wurde festgestellt, dass die besonderen Eigenschaften von MIP-1α identisch zu denen eines Wachstumshemmstoffs von hematopoietischen Stammzellen sind. MIP-1α ist in Hefezellen exprimiert und bis zur Homogenität gereinigt worden. Eine Analyse der Struktur hat bestätigt, dass MIP-1α eine sehr ähnliche Sekundär- und Tertiärstruktur zu dem Plättchen-Faktor 4 und Interleukin 8 aufweist, mit welchen es eine begrenzte Sequenzhomologie gemeinsam hat. Es ist gefunden worden, dass MIP-1α in vitro Stammzellen hemmende Eigenschaften aufweist. Es ist ebenfalls gezeigt worden, dass MIP-1α in vivo in der Lage ist, Maus-Stammzellen vor der nachfolgenden Abtötung in vitro durch Tritium markiertes Thymidin zu schützen. Es ist ebenfalls gezeigt worden, dass MIP-1α die Proliferation von stärker determinierten Granulocyten-Makrophagenkolonie bildenden Vorläufer-Zellen als Antwort auf den Granulocyten- Makrophagenkolonie stimulierenden Faktor verstärkt. Clemens, J.M., et al., Cytokine, 4 :76-82 (1992).
  • MIP-1α ist ein 6–8 kD großes, durch Lipopolysaccharide induzierbares, für Monocyten, neutrophile und eosinophile Zellen chemotaktisches Protein. MIP-1α kann auch die Wanderung und Aktivierung von menschlichen eosinophilen Granulocyten induzieren. MIP-1α kann bei akuten und chronischen Entzündungen von Wichtigkeit sein. Die nachfolgende Produktion, Quelle und der Beitrag von murinem MIP-1α in vivo in synchronisierten Schistosoma mansoni-Zellen während der Bildung von Lungen-Granulomas ist festgestellt worden. Lukacs, N.W. et al., J. Exp. Med., 177 :1551-9 (1993).
  • Einem Aspekt der vorliegenden Erfindung entsprechend werden neue, reife Polypeptide, welche MIP-3, MIP-4 und MIP-1γ sind, ebenso wie Analoga und Derivate davon bereitgestellt. Das MIP-3, MIP-4 und MIP-1γ der vorliegenden Erfindung sind menschlichen Ursprungs.
  • Einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung entsprechend werden Polynucleotide (DNA oder RNA), die solche Polypeptide codieren, bereitgestellt.
  • Einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung entsprechend wird ein Verfahren zur Herstellung solcher Polypeptide durch rekombinante Techniken bereitgestellt.
  • Einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung entsprechend wird ein Verfahren zur Verwendung solcher Polypeptide oder Polynucleotide, die solche Polypeptide codieren, für therapeutische Zwecke bereitgestellt, zum Beispiel für Immunregulation, einschließlich Entzündungsaktivität, Hematopoiese und Lymphocytenwanderung, Hemmung der Bildung von Knochenmark-Stammzellen-Kolonien, Behandlung von Psoriasis, soliden Tumoren und Erhöhung der Wirtsabwehr gegen resistente, chronische Infektionen.
  • Einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung entsprechend wird ein Antikörper gegen solche Polypeptide bereitgestellt.
  • Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung sollten Fachleuten aus den hier enthaltenen Lehren offensichtlich sein.
  • Die nachfolgenden Abbildungen sind für Ausführungsformen der Erfindung beispielhaft und sind nicht beabsichtigt, den Umfang der Erfindung, der durch die Ansprüche umfasst wird, einzuschränken.
  • 1 zeigt die MIP-3 codierende cDNA-Sequenz und die entsprechende abgeleitete Aminosäuresequenz. Die 45 Aminosäuren am Anfang stellen die abgeleitete mutmaßliche Leader-Sequenz dar.
  • 2 zeigt die MIP-4 codierende cDNA-Sequenz und die entsprechende abgeleitete Aminosäuresequenz. Die 19 Aminosäuren am Anfang stellen eine mutmaßliche Leader-Sequenz dar.
  • 3 entspricht einem Teil der abgeleiteten Aminosäuresequenz von MIP-3 in Ausrichtung mit einem Teil von MIP-1α. Die obere Sequenz ist die Aminosäuresequenz von menschlichem MIP-3 und die untere Sequenz ist menschliches MIP-1α.
  • 4 zeigt zwei Aminosäuresequenzen, wobei die obere Sequenz die Aminosäuresequenz von menschlichem MIP-4 und die untere Sequenz von dem Vorläufer des menschlichen Mandel-Lymphocyten-LD78-Beta-Proteins ist.
  • 5 zeigt die dem MIP-4-Protein entsprechenden Proteinbanden nach der Expression in einem bakteriellen E. coli- Expressionssystem und einer Reinigung.
  • 6 ist eine Northern-Blot-Analyse von MIP-4, welche die Zellen anzeigt, in denen dieses Protein am häufigsten gefunden wird.
  • 7 ist eine schematische Darstellung des pQE-9-Vektors.
  • 8 zeigt die MIP-1γ codierende cDNA-Sequenz und die entsprechende abgeleitete Aminosäuresequenz. Die 24 Aminosäuren am Anfang stellen die mutmaßliche Leader-Sequenz dar.
  • 9 zeigt zwei partielle Aminosäuresequenzen von menschlichen MIP-1-Proteinen. Die obere Sequenz ist menschliches MIP-1γ und die untere Sequenz ist menschliches MIP-1α (Vorläufer des menschlichen Mandel-Lymphocyten-LD78-Beta-Proteins).
  • 10 zeigt in Spur 5 die dem MIP-1γ-Protein entsprechenden Proteinbanden nach der Expression in einem bakteriellen Expressionssystem und einer Reinigung.
  • 11 zeigt die der COS-Expression von MIP-1γ entsprechenden Proteinbanden.
  • 12 ist eine Northern-Blot-Analyse von MIP-1γ, die die Gewebe anzeigt, in denen dieses Protein am häufigsten gefunden wird.
  • Einem Aspekt der vorliegenden Erfindung entsprechend werden isolierte Nucleinsäuren (Polynucleotide) bereitgestellt, die das reife Polypeptid mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz der 1, 2 und 8 oder das reife MIP-3-Polypeptid, das durch die cDNA des Clons, der am 9. Februar 1994 mit der ATCC-Eingangs-Nr. 75676 hinterlegt wurde, codiert wird, und das reife MIP-4-Polypeptid, das durch die cDNA des Clons, der am 9. Februar 1994 mit der ATCC-Eingangs-Nr. 75675 hinterlegt wurde, codiert wird, und das reife MIP-1γ-Polypeptid, das durch die cDNA des Clons, der am 13. Oktober 1993 mit der ATCC-Nr. 75572 hinterlegt wurde, codiert wird, codieren.
  • Polynucleotide, die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codieren, sind strukturell mit dem entzündungsfördernden Supergen „Interkrin" verwandt, das zu der Cytokin- oder Chemokin-Familie gehört. Sowohl MIP-3 als auch MIP-4 sind Homologe von MIP-1 und sind mehr homolog zu MIP-1α als zu MIP-1β. Das MIP-3 codierende Polynucleotid stammte von einer cDNA-Bank von Aorta-Endothel und enthält einen offenen Leserahmen, der ein Polypeptid mit einer Länge von 121 Aminosäureresten codiert, das eine deutliche Homologie zu einer Anzahl von Chemokinen zeigt. Der beste Treffer betrifft das menschliche Entzündungsprotein 1 alpha aus Makrophagen mit einer Identität von 36% und einer Ähnlichkeit von 66% (3).
  • Das MIP-4 codierende Polynucleotid stammte von einer cDNA-Bank einer Lunge eines Erwachsenen und enthält einen offenen Leserahmen, der ein Polypeptid mit einer Länge von 89 Aminosäureresten codiert, das eine deutliche Homologie zu einer Anzahl von Chemokinen zeigt. Der beste Treffer betrifft das menschliche Mandel-Lymphozyten-LD78-Beta-Protein mit einer Identität von 60% und einer Ähnlichkeit von 89% (4). Darüber hinaus sind die vier Cysteinreste, die in allen Chemokinen in einem charakteristischen Motiv vorhanden sind, in beiden Clonen konserviert. Die Tatsache, dass sich die ersten zwei Cysteinreste in unserem Gen in benachbarten Positionen befinden, klassifiziert es in die „C-C"- oder β-Unterfamilie der Chemokine. In der anderen Unterfamilie, der „CXC"- oder α-Unterfamilie, sind die ersten zwei Cysteinreste durch eine Aminosäure voneinander getrennt.
  • Das MIP-1γ codierende Polynucleotid enthält einen offenen Leserahmen, der ein Polypeptid von 93 Aminosäuren codiert, welches über einen Bereich von 80 Aminosäuren mit 48% Identität und 72% Ähnlichkeit eine signifikante Homologie zu dem Protein-α von menschlichen Makrophagen und von Primaten und über einen Bereich von 82 Aminosäuren mit 46% Identität und 67% Ähnlichkeit zu dem MIP-1β von Maus zeigt. Weiterhin sind die vier Cysteinreste, die ein charakteristisches Motiv umfassen, konserivert.
  • Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können in der Form von RNA oder in der Form von DNA, welche cDNA, genomische DNA und synthetische DNA einschließt, vorliegen. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein und kann, wenn sie einzelsträngig ist, der codierende Strang oder der nicht-codierende (Antisense) Strang sein. Die codierende Sequenz, die das reife Polypeptid codiert, kann zu der in 1 und 2 gezeigten codierenden Sequenz oder zu derjenigen des/der hinterlegten Clons/Clone identisch sein oder kann eine unterschiedliche codierende Sequenz sein, die als Ergebnis der Redundanz oder Degeneration des genetische Codes die gleichen reifen Polypeptide wie die DNA von 1 und 2 oder die hinterlegte cDNA codiert.
  • Die Polynucleotide, die die reifen Polypeptide der 1, 2 und 8 oder die durch die hinterlegte cDNA codierten, reifen Polypeptide codieren, können einschließen: nur die codierende Sequenz für das reife Polypeptid; die codierende Sequenz für das reife Polypeptid und eine zusätzliche codierende Sequenz wie für eine Leader- oder Sekretions-Sequenz oder eine Proprotein-Sequenz; die codierende Sequenz für die reifen Polypeptide (und gegebenenfalls eine zusätzliche codierende Sequenz) und eine nicht-codierende Sequenz wie Introns oder nicht-codierende Sequenz 5' und/oder 3' der codierenden Sequenz für die reifen Polypeptide.
  • Daher umfasst der Ausdruck „ein Polypeptid codierendes Polynucleotid" ein Polynucleotid, das nur die für das Polypeptid codierende Sequenz einschließt, ebenso wie ein Polynucleotid, das eine zusätzliche codierende und/oder nicht-codierende Sequenz einschließt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Varianten der vorstehend beschriebenen Polynucleotide, die Fragmente, Analoga und Derivate des Polypeptides mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz der 1, 2 und 8 oder die durch die cDNA des/der hinterlegten Clons/Clone codierten Polypeptide codieren. Die Varianten des Polynucleotides können eine natürlich vorkommende, allelische Variante des Polynucleotides oder eine nicht natürlich vorkommende Variante des Polynucleotides sein.
  • Somit schließt die vorliegende Erfindung Polynucleotide, die die gleichen reifen Polypeptide, wie in den 1, 2 und 8 gezeigt, oder die gleichen, durch die cDNA des/der hinterlegten Clons/Clone codierten, reifen Polypeptide codieren, ebenso wie Varianten solcher Polynucleotide ein, welche ein Fragment, Derivat oder Analogon des Polypeptides der 1, 2 und 8 oder des durch die cDNA des/der hinterlegten Clons/Clone codierten Polypeptides codieren. Solche Nucleotidvarianten schließen Deleionsvarianten, Substitutionsvarianten und Additions- oder Insertionsvarianten ein.
  • Wie hier vorstehend angezeigt, kann das Polynucleotid eine codierende Sequenz aufweisen, die eine natürlich vorkommende Variante der in den 1, 2 und 8 gezeigten codierenden Sequenz oder der codierenden Sequenzdes/der hinterlegten Clons/Clone ist. Wie im Fachgebiet bekannt ist, ist eine allelische Variante eine alternative Form einer Polynucleotid-Sequenz, die eine Substitution, Deletion oder Addition eines oder mehrerer Nucleotide aufweist, welche die Funktion des codierten Polypeptides nicht wesentlich verändert.
  • Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls Polynucleotide ein, wobei die das reife Polypeptid codierende Sequenz in dem gleichen Leserahmen mit einer Polynucleotid-Sequenz verknüpft sein kann, die die Expression und Sekretion eines Polypeptides von einer Wirtszelle unterstützt, zum Beispiel eine Leader-Sequenz, die als sekretorische Sequenz zur Kontrolle des Transports eines Polypeptides aus der Zelle fungiert. Das Polypeptid mit einer Leader-Sequenz ist ein Pröprotein und die Leader-Sequenz kann durch die Wirtszelle abgeschnitten werden, um die reife Form des Polypeptides zu erzeugen. Die Polynucleotide können auch ein Proprotein codieren, das das reife Protein plus zusätzlicher Aminosäurereste am 5'-Ende ist. Ein reifes Protein mit einer Prosequenz ist ein Proprotein und stellt eine inaktive Form des Proteins dar. Wenn die Prosequenz abgeschnitten wird, verbleibt ein aktives, reifes Protein.
  • Daher können die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung zum Beispiel ein reifes Protein codieren oder ein Protein mit einer Prosequenz oder ein Protein mit sowohl einer Prosequenz als auch einer Prässequenz (Leader-Sequenz).
  • Es kann auch vorkommen, dass die codierende Sequenz der Polynucleotide der vorliegenden Erfindung im Leserraster mit einer Marker-Sequenz verknüpft ist, was die Reinigung der Polypeptide der vorliegenden Erfindung zulässt. Die Marker-Sequenz kann ein hexa-Histidin-Anhang, der durch einen pQE-9-Vektor bereitgestellt wird, sein, um im Falle eines bakteriellen Wirtes für die Reinigung der mit dem Marker verknüpften reifen Polypeptide zu sorgen, oder, wenn ein Säugerwirt, z.B. COS-7-Zellen, als Wirt verwendet wird, kann die Marker-Sequenz zum Beispiel ein Hämagglutinin (HA)-Anhang sein. Der HA-Anhang entspricht einem von dem Influenza-Hämagglutinin-Protein stammenden Epitop (Wilson, I., et al., Cell, 37:767 (1984)).
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Polynucleotide, die unter stringenten Bedingungen mit den vorstehend beschriebenen Polynucleotiden hybridisieren. Wie er hier verwendet wird, bedeutet der Ausdruck „stringente Bedingungen", dass eine Hybridisierung nur stattfinden wird, wenn mindestens 95% und vorzugsweise mindestens 97% Identität zwischen den Sequenzen vorliegt. Die Polynucleotide, die in einer bevorzugten Ausführungsform mit den vorstehend beschriebenen Polynucleotiden hybridisieren, codieren Polypeptide, die im Wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder Aktivität wie das durch die cDNA von 1 oder durch die hinterlegte cDNA codierte, reife Polypeptid beibehalten.
  • Die Hinterlegung(en), auf die hier Bezug genommen wird, wird/werden gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrages über die Internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck von Patentverfahren aufbewahrt werden. Die Hinterlegungen werden lediglich zur einfachen Nutzung für Fachleute bereitgestellt und sind kein Eingeständnis, dass eine Hinterlegung nach 35 U.S.C §112 erforderlich ist. Die in den hinterlegten Materialien enthaltene Sequenz der Polynucleotide und ebenso die dadurch codierte Aminosäuresequenz der Polypeptide sind hier durch Bezugnahme eingschlossen und sind für den Fall jeglichen Widerspruchs mit der hier enthaltenen Beschreibung der Sequenzen maßgebend. Um die hinterlegten Materialien herzustellen, zu gebrauchen oder zu verkaufen, wird eine Lizenz benötigt und hiermit wird keine solche Lizenz gewährt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin MIP-3-, MIP-4- und MIP-1γ-Polypeptide, die die abgeleitete Aminosäuresequenz der 1, 2 und 8 oder die durch die hinterlegte cDNA codierte Aminosäuresequenz aufweisen, ebenso wie Fragmente, Analoga und Derivate solcher Polypeptide.
  • Die Ausdrücke „Fragment", „Derivat" und „Analogon", wenn sie sich auf die Polypeptide der 1, 2 und 8 oder das durch die hinterlegte cDNA codierte beziehen, bedeuten ein Polypeptid, das im Wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder Aktivität wie ein solches Polypeptid beibehält. Somit schließt ein Analogon ein Proprotein ein, das durch das Abschneiden des Proprotein-Anteils aktiviert werden kann, um ein aktives, reifes Polypeptid zu ergeben.
  • Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können ein rekombinantes Polypeptid, ein natürliches Polypeptid oder ein synthetisches Polypeptid sein, vorzugsweise ein rekombinantes Polypeptid.
  • Das Fragment, Derivat oder Analogon der Polypeptide der 1, 2 und 8 oder das durch die hinterlegte cDNA codierte Polypeptid kann eines sein, in dem (i) ein oder mehrere Aminosäurereste durch einen konservierten Aminosäurerest substituiert wurden, oder (ii) ein oder mehrere Aminosäurereste eine Substituenten-Gruppe einschließen, oder (iii) die reifen Polypeptide an eine andere Verbindung wie zum Beispiel eine Verbindung, um die Halbwertszeit des Polypeptids zu erhöhen (zum Beispiel Polyethylenglykol), verknüpft sind, oder (iv) zusätzliche Aminosäuren mit dem reifen Polypeptid verknüpft sind, wie ein Leader oder eine sekretorische Sequenz oder eine Sequenz, die für die Reinigung des reifen Polypeptides angewandt wird, oder eine Proprotein-Sequenz. Solche Fragmente, Derivate und Analoga werden von Fachleuten nach den hier enthaltenen Lehren als innerhalb des Rahmens der Erfindung erachtet.
  • Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise in einer isolierten Form bereitgestellt und werden vorzugsweise bis zur Homogenität gereinigt.
  • Der Ausdruck „isoliert" bedeutet, dass das Material aus seiner ursprünglichen Umgebung entfernt wurde (z.B. die natürliche Umgebung, wenn es natürlich vorkommt). Zum Beispiel sind natürlich vorkommende Polynucleotide und Polypeptide, die in einem lebenden Tier vorliegen, nicht isoliert, aber die gleichen Polynucleotide oder DNA oder Polypeptide sind isoliert, wenn sie von einigen oder allen der in dem natürlichen System gleichzeitig vorhandenen Materialien getrennt wurden. Solche Polynucleotide können Teil eines Vektors sein und/oder solche Polynucleotide oder Polypeptide können Teil einer Zusammensetzung sein und können immer noch dahingehend isoliert sein, als ein solcher Vektor oder eine solche Zusammensetzung nicht Teil der natürlichen Umgebung ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren, die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung einschließen, Wirtszellen, die mittels erfindungsgemäßer Vektoren gentechnisch verändert wurden, und die Herstellung von erfindungsgemäßen Polypeptiden durch rekombinante Techniken.
  • Wirtszellen werden mit den Vektoren dieser Erfindung, welche zum Beispiel ein Clonierungsvektor oder ein Expressionsvektor sein können, gentechnisch verändert (transduziert oder transformiert oder transfiziert). Der Vektor kann zum Beispiel in der Form eines Plasmides, eines Viruspartikels, eines Phagen usw. vorliegen. Die veränderten Wirtszellen können in herkömmlichen Nährmedien, die modifiziert wurden, für die Aktivierung von Promotoren, Selektion von Transformanten oder Amplifikation der MIP-3-, MIP-4- und MIP-1γ-Gene geeignet zu sein, kultiviert werden. Die Kultivierungsbedingungen wie Temperatur, pH-Wert und ähnliches sind diejenigen, die vorher für die zur Expression ausgewählten Wirtszellen verwendet wurden, und sind für Durchschnittsfachleute offensichtlich.
  • Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können für die Herstellung von Polypeptiden durch rekombinante Techniken eingesetzt werden. Somit kann die Polynucleotidsequenz zum Beispiel in jedem einer Vielzahl von Expressionsvehikel, besonders Vektoren oder Plasmide zur Expression eines Polypeptides, enthalten sein. Solche Vektoren schließen chromosomale, nicht-chromosomale und synthetische DNA-Sequenzen ein, z.B. Derivate von SV40; bakterielle Plasmide; Phagen-DNA; Hefeplasmide; aus der Kombination von Plasmiden und Phagen-DNA stammende Vektoren, virale DNA wie von Vaccinia, Adenovirus, Geflügelpocken-Virus und Pseudorabiesvirus. Jedoch kann jedes andere Plasmid oder jeder andere Vektor verwendet werden, so lange sie in dem Wirt replizierbar und lebensfähig sind.
  • Die geeignete DNA-Sequenz kann in den Vektor durch eine Vielzahl von Verfahren inseriert werden. Im Allgemeinen wird die DNA-Sequenz durch im Fachgebiet bekannte Verfahren in (eine) geeignete Stelle(n) für eine Restriktionsendonuclease inseriert. Solche Verfahren und andere werden von Fachleuten als innerhalb des Rahmens der Erfindung erachtet.
  • Die DNA-Sequenz in dem Expressionsvektor ist mit (einer) geeigneten Sequenzen) zur Kontrolle der Expression (Promotoren) funktionell verknüpft, um die mRNA-Synthese zu steuern. Als typische Beispiele solcher Promotoren werden erwähnt: LTR- oder SV40-Promotor, der lac- oder trp-Promotor von E. coli, der Lambda-Phagen-PL-Promotor und andere Promotoren, die dafür bekannt sind, die Expression von Genen in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen oder ihrer Viren zu kontrollieren.
  • Der Expressionsvektor enthält ebenfalls eine Ribosomen-Bindungsstelle zur Initiation der Translation und einen Transkriptionsterminator. Der Vektor kann auch geeignete Sequenzen zur Verstärkung der Expression einschließen.
  • Darüber hinaus enthalten die Expressionsvektoren vorzugsweise ein Gen, um eine phänotypische Eigenschaft zur Selektion von transformierten Wirtszellen, wie Dihydrofolat-Reduktase oder Neomycin-Resistenz für eukaryontische Zellkulturen oder wie Tetracyclin- oder Ampicillin-Resistenz in E. coli, bereitzustellen.
  • Der Vektor, der wie vorstehend beschrieben die geeignete DNA-Sequenz enthält, ebenso wie ein geeigneter Promotor oder eine Kontrollsequenz können verwendet werden, um einen geeigneten Wirt zu transformieren, um die Expression des Proteins durch den Wirt zu erlauben.
  • Als typische Beispiele für geeignete Wirte werden erwähnt: bakterielle Zellen wie E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; Pilzzellen wie Hefe; Insektenzellen wie Drosophila und Sf9; tierische Zellen wie CHO, COS oder Bowes-Melanoma; Pflanzenzellen usw. Die Auswahl eines geeigneten Wirtes wird von einem Fachmann basierend auf den hier offenbarten Lehren als innerhalb des Rahmens der Erfindung erachtet.
  • Insbesondere schließt die vorliegende Erfindung auch rekombinante Konstrukte ein, die aus einer oder mehreren der vorstehend ausführlich beschriebenen Sequenzen bestehen.
  • Die Konstrukte umfassen einen Vektor wie einen Plasmid- oder viralen Vektor, in den eine erfindungsgemäße Sequenz in vorwärts oder rückwärts gerichteter Orientierung inseriert wurde. In einem bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform umfasst das Konstrukt weiterhin regulatorische Sequenzen, einschließlich zum Beispiel eines Promotors, der funktionell mit der Sequenz verknüpft ist. Eine große Anzahl von geeigneten Vektoren und Promotoren ist Fachleuten bekannt und im Handel zu erwerben. Die folgenden Vektoren werden beispielhaft angeführt: Bakteriell: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pD10, Phagescript, psiX174, pBluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eukaryontisch: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Jedoch können andere Plasmide oder Vektoren verwendet werden, so lange sie im Wirt replizierbar und lebensfähig sind.
  • Promotorregionen können aus jedem gewünschten Gen unter der Verwendung von CAT (Chloramphenicol-Transferase)-Vektoren oder anderen Vektoren mit selektierbaren Markern ausgewählt werden. Zwei geeignete Vektoren sind pKK232-8 und pCM7. Besonders erwähnte bakterielle Promotoren schließen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, PL und trp ein. Eukaryontische Promotoren schließen den sehr frühen CMV-, HSV-Thymidin-Kinase-, frühen und späten SV40-Promotor, LTRs von Retrovirus und den Maus-Methallothionein-I-Promotor ein. Die Auswahl eines geeigneten Vektors und Promotors ist innerhalb der Fähigkeit von Durchschnittsfachleuten.
  • In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die das vorstehend beschriebene Konstrukt enthalten. Die Wirtszelle kann eine höhere eukaryontische Zelle wie eine Säugerzelle oder eine niedrigere eukaryontische Zelle wie eine Hefezelle sein, oder die Wirtszelle kann eine prokaryontische Zelle wie eine bakterielle Zelle sein. Die Einbringung des Konstruktes in die Wirtszelle kann durch Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran vermittelte Transfektion oder Elektroporation bewirkt werden. (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).
  • Die Konstrukte in den Wirtszellen können auf herkömmliche Art und Weise verwendet werden, um das durch die rekombinante Sequenz codierte Genprodukt herzustellen. In einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Polypeptide durch herkömmliche Peptid-Synthesegeräte synthetisch hergestellt werden.
  • Reife Proteine können in Säuger-Zellen, Hefe, Bakterien oder anderen Zellen unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors exprimiert werden. Zellfreie Translationssysteme können ebenfalls verwendet werden, um solche Proteine unter der Verwendung von RNAs, die von den DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung stammen, herzustellen. Geeignete Clonierungs- und Expressions-Vektoren für den Gebrauch bei prokaryontischen und eukaryontischen Wirten werden beschrieben durch Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), dessen Offenlegung hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
  • Die Transkription der die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codierenden DNA durch höhere Eukaryonten wird durch das Inserieren einer Enhancer-Sequenz in den Vektor verstärkt. Enhancer sind cis-wirksame DNA-Elemente, normalerweise zwischen 10 und 300 bp lang, die auf einen Promotor wirken, um dessen Transkription zu verstärken. Beispiele schließen ein den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs zwischen Basenpaar 100 und 270, einen Enhancer des frühen Promotors des Cytomegalievirus, den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer.
  • Im Allgemeinen werden rekombinante Expressionsvektoren einen Replikationsursprung und selektierbare Marker einschließen, die eine Transformation der Wirtszelle erlauben, z.B. das Ampicillin-Resistenz-Gen von E. coli und das TRP1-Gen von S. cerevisiae, und einen von einem stark exprimierten Gen stammenden Promotor, um die Transkription einer stromabwärts gelegenen strukturellen Sequenz zu steuern. Solche Promotoren können von Operons stammen, die glycolytische Enzyme wie 3-Phosphoglycerat-Kinase (PGK), α-Faktor, saure Phosphatase oder Hitzeschock-Proteine und andere codieren. Die heterologe strukturelle Sequenz wird in passender Phase mit Translations-Initiations- und -Terminations-Sequenzen zusammengesetzt und vorzugsweise mit einer Leader-Sequenz, die die Sekretion des translatierten Proteins in den periplasmatischen Raum oder in das extrazelluläre Medium steuern kann. Gegebenenfalls kann die heterologe Sequenz ein Fusionsprotein einschließlich eines N-terminalen Identifikationspeptides codieren, das erwünschte Merkmale wie zum Beispiel die Stabilisierung oder die vereinfachte Reinigung des exprimierten rekombinanten Produktes vermittelt.
  • Nützliche Expressionsvektoren für den Gebrauch in Bakterien werden konstruiert, indem eine strukturelle DNA-Sequenz, die ein gewünschtes Protein codiert, zusammen mit geeigneten Translations-Initiations- und -Terminations-Signalen in ein durchgängiges Leseraster mit einem funktionellen Promotor inseriert wird. Der Vektor wird einen oder mehrere phänotypisch selektierbare Marker und einen Replikationsursprung umfassen, um die Erhaltung des Vektors sicherzustellen und um, falls erwünscht, für eine Vermehrung innerhalb des Wirtes zu sorgen. Geeignete prokaryontische Wirte für die Transformation schließen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Arten innerhalb der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus ein, obwohl auch andere wahlweise eingesetzt werden können.
  • Als typisches, aber nicht-einschränkendes Beispiel können nützliche Expressionsvektoren für den Gebrauch in Bakterien einen selektierbaren Marker und einen bakteriellen Replikationsursprung umfassen, die von im Handel erwerblichen Plasmiden stammen, die genetische Elemente des bekannten Clonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017) enthalten. Solche kommerziellen Vektoren schließen zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) ein. Diese Abschnitte aus dem pBR322-„Rückgrat" werden mit einem geeigneten Promotor und der zu exprimierenden strukturellen Sequenz kombiniert. Nach der Transformation eines geeigneten Wirtsstammes und der Züchtung des Wirtsstammes bis zu einer geeigneten Zelldichte, wird der ausgewählte Promotor durch geeignete Maßnahmen (z.B. Temperaturänderung oder chemische Induktion) induziert und die Zellen werden für einen weiteren Zeitraum kultiviert.
  • Typischerweise werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, mit Hilfe physikalischer oder chemischer Mittel aufgebrochen, und der resultierende Rohextrakt wird für die weitere Reinigung zurückbehalten.
  • Bei der Expression von Proteinen verwendete mikrobielle Zellen können durch jedes geeignete Verfahren, einschließlich Gefrier-Auftau-Zyklen, Ultraschall, mechanisches Aufbrechen oder die Anwendung lysierender Mittel aufgebrochen werden, Verfahren, die Fachleuten gut bekannt sind.
  • Verschiedene Säuger-Zellkultur-Systeme können ebenfalls eingesetzt werden, um rekombinante Proteine zu exprimieren. Beispiele für Säuger-Expressionsysteme schließen die COS-7-Linien von Affennieren-Fibroblasten, beschrieben durch Gluzman, Cell, 23:175 (1981), und andere zur Expression eines kompatiblen Vektors befähigte Zelllinien ein, zum Beispiel die C27-, 3T3-, CHO-, HeLa- und BHK-Zelllinien. Säuger-Expressionsvektoren werden einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und Enhancer umfassen, und auch notwendige Ribosomenbindestellen, Polyadenylierungsstellen, Spleiß-Donor- und -Akzeptorstellen, transkriptionelle Terminationssequenzen und 5'-flankierende, nicht-transkribierte Sequenzen. Von SV40-Spleiß- und -Polyadenylierungsstellen stammende DNA-Sequenzen können verwendet werden, um die benötigten, nicht-transkribierten genetischen Elemente bereitzustellen.
  • MIP-3, MIP-4 und MIP-1γ werden aus rekombinanten Zellkulturen durch Verfahren einschließlich Ammoniumsulfat- oder Ethanol-Fällung, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauscher-Chromatographie, Phosphocellulose-Chromatographie, hydrophobe Interaktions-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie, Hydroxylapatit-Chromatographie und Lektin-Chromatographie gewonnen und gereinigt. Es wird bevorzugt, dass während der Reinigung niedrige Konzentrationen (ungefähr 0,15–5 mM) von Calcium-Ionen vorhanden sind (Price et al., J. Biol. Chem., 244:917 (1969)). Schritte zur Zurückfaltung des Proteins können gegebenenfalls verwendet werden, um die Konfiguration des reifen Proteins wieder herzustellen. Abschließend kann für die letzten Reinigungsschritte eine Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) angewendet werden.
  • Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können ein natürlich gereinigtes Produkt oder ein Produkt chemischer, synthetischer Verfahren oder durch rekombinante Techniken aus einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt (zum Beispiel durch bakterielle, Hefe, höhere Pflanzen-, Insekten- und Säuger-Zellen in Kultur) hergestellt sein. Abhängig von dem in einem rekombinanten Produktionsverfahren verwendeten Wirt können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung durch Kohlenhydrate von Säugern oder anderer Eukaryonten glycosyliert oder nicht-glycosyliert sein. Erfindungsgemäße Polypeptide können auch einen Methionin-Aminosäurerest am Anfang beinhalten.
  • Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können in einer Vielzahl von Funktionen innerhalb der Immunregulation und Entzündung und auch in einer großen Zahl von Krankheitszuständen eingesetzt werden. MIP-3, MIP-4 und MIP-1γ sind Teil der Chemokin-Familie und sind daher chemische Lockstoffe für Leukocyten (wie Monocyten, Neutrophile, T-Lymphocyten, Eosinophile, Basophile usw.). Dementsprechend können MIP-3, MIP-4 und MIP-1γ verwendet werden, um durch die Kontrolle der Infiltration von Ziel-Immunzellen in den Wundbereich die Wundheilung zu ermöglichen. Auf ähnliche An und Weise können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung die Wirtsabwehr gegen chronische, z.B. mycobakterielle, Infektionen über das Anlocken und Aktivieren von Mikroben abtötenden Leukocyten verstärken.
  • Weiterhin können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung in der anti-Tumor-Therapie von Nutzen sein, da es Anhaltspunkte dafür gibt, dass Chemokin exprimierende Zellen, die in Tumore injiziert wurden, eine rückwärtige Entwicklung des Tumors, zum Beispiel bei der Behandlung von einem Kaposi-Sarkom, verursacht haben. Außerdem stimulieren MIP-3, MIP-4 und MIP-1γ die Invasion und die Aktivierung von (Tumor abtötenden) Wirtsabwehrzellen, z.B. cytotoxischen T-Zellen und Makrophagen, und können auf diesem Weg ebenfalls verwendet werden, um solide Tumore zu behandeln.
  • Die Polypeptide können ebenfalls nützlich sein bei der Hemmung der Koloniebildung von Knochenmarkstammzellen bei Leukämie und als zusätzliche Behandlung zum Schutz von hämatopoietischen Stammzellen während einer Krebs-Chemotherapie.
  • Eine weitere Anwendung der Polypeptide ist die Hemmung der Proliferation von T-Zellen über die Hemmung der Biosynthese von IL-2, zum Beispiel bei Autoimmunkrankheiten und lymphocytischer Leukämie.
  • MIP-3, MIP-4 und MIP-1γ können auch bei der Hemmung der Proliferation von epidermalen Keratinocyten nützlich sein, was bei Psoriasis (Keratinocyten-Hyperproliferation) von Nutzen ist, da gefunden wurde, dass Langerhans-Zellen in der Haut MIP-1 α produzieren.
  • MIP-3, MIP-4 und MIP-1γ können verwendet werden, um während der Wundheilung Narbenbildung zu verhindern, sowohl durch das Rekrutieren von Entzündungszellen, die Bruchteile beseitigen und die Entstehung von Bindegewebe fördern, als auch durch ihre mögliche Kontrolle von übermäßiger, TGFβ-vermittelter Fibrose. Darüber hinaus können diese Peptide verwendet werden, um Schlaganfall, Thrombocytose, Lungenembolie und myeloproliferative Erkrankungen zu behandeln, da MIP-3, MIP-4 und MIP-1γ die vaskuläre Durchlässigkeit erhöhen.
  • Die Polypeptide können der vorliegenden Erfindung entsprechend auch durch die Expression solcher Polypeptide in vivo angewendet werden, was oft als „Gentherapie" bezeichnet wird.
  • Somit können zum Beispiel Zellen eines Patienten ex vivo durch ein ein Polypeptid codierendes Polynucleotid (DNA oder RNA) modifiziert werden, wobei dann die modifizierten Zellen einem Patienten, der mit den Polypeptiden behandelt werden soll, verabreicht werden. Solche Verfahren sind im Fachgebiet gut bekannt. Zum Beispiel können Zellen durch im Fachgebiet bekannte Verfahren durch die Verwendung eines retroviralen Partikels, das die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codierende RNA enthält, modifiziert werden.
  • In ähnlicher Weise können Zellen in vivo zur Expression eines Polypeptides in vivo zum Beispiel durch im Fachgebiet bekannte Verfahren modifiziert werden. Wie im Fachgebiet bekannt, kann eine Produktionszelle zur Produktion eines retroviralen Partikels, das die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codierende RNA enthält, einem Patienten verabreicht werden, um die Zellen in vivo zu modifizieren und die Polypeptide in vivo zu exprimieren. Diese und andere Verfahren zur Verabreichung von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung durch ein solches Verfahren sollte Fachleuten aus den Lehren der vorliegenden Erfindung offensichtlich sein. Zum Beispiel kann das Expressionsvehikel für die Modifizierung der Zellen ein anderes als ein Retrovirus, zum Beispiel ein Adenovirus sein, welches verwendet werden kann, um nach der Kombination mit einem geeigneten Abgabevehikel Zellen in vivo zu modifizieren.
  • Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können in Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger verwendet werden. Solche Zusammensetzungen bestehen aus einer therapeutisch wirksamen Menge des Proteins und einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Exzipienten. Ein solcher Träger schließt ein, ist aber nicht beschränkt auf Salzlösung, gepufferte Salzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen davon. Die Formulierung sollte der Verabreichungsart entsprechen.
  • Die Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Packung oder einen Kit bereit, die oder der einen oder mehrere Behälter umfasst, die mit einem oder mehreren Bestandteilen der erfindungsgemäßen Arzneimittel gefüllt sind. Zusammen mit solchen Behältern kann ein Beipackzettel in der Form vorliegen, die von einer Regierungsbehörde vorgeschrieben ist, die die Herstellung, den Gebrauch oder den Verkauf von pharmazeutischen oder biologischen Produkten reguliert, wobei der Beipackzettel die Anerkennung der Herstellung, Verwendung oder des Verkaufs für die Verabreichung an Menschen durch die Behörde wiedergibt. Darüber hinaus können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung zusammen mit anderen therapeutischen Verbindungen angewendet werden.
  • Die Arzneimittel können auf geeignete Art und Weise, zum Beispiel auf oralem, intravenösem, intraperitonealem, intramuskulärem, subkutanem, intranasalem oder intradermalem Weg verabreicht werden. Die Mengen und die Dosierungsschemata von MIP-3, MIP-4 und MIP-1γ, die einer Person verabreicht werden, hängen von einer Anzahl an Faktoren wie dem Verabreichungsweg, der Natur des behandelten Zustandes und der Bewertung durch den verschreibenden Arzt ab. Allgemein gesprochen, werden sie zum Beispiel in therapeutisch wirksamen Dosen von mindestens etwa 10 μg/kg Körpergewicht gegeben und in den meisten Fällen werden sie in einer Menge, die etwa mg/kg Körpergewicht pro Tag nicht übersteigt, verabreicht und vorzugsweise ist die Dosierung etwa 10 μg/kg Körpergewicht täglich, wobei die Verabreichungswege, Symptome usw. in Betracht gezogen werden.
  • Die Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls von Wert für die Chromosomen-Identifizierung. Die Sequenz ist spezifisch gerichtet gegen und kann hybridisieren mit einem bestimmten Bereich auf einem einzelnen menschlichen Chromosom. Darüber hinaus besteht zurzeit die Notwendigkeit für die Identifikation bestimmter Stellen auf dem Chromosom. Gegenwärtig sind nur wenige Chromosomen markierende Reagentien, die auf aktuellen Sequenzdaten beruhen (Wiederholungspolymorphismen), für die Markierung von chromosomalen Bereichen verfügbar. Das Kartieren von DNA auf Chromosomen entsprechend der vorliegenden Erfindung ist ein wichtiger erster Schritt, um diese Sequenzen mit Genen, die mit einer Krankheit verbunden sind, in Beziehung zu setzen.
  • In Kürze beschrieben, können Sequenzen auf Chromosomen kartiert werden, indem PCR-Primer (vorzugsweise 15–25 bp) aus der cDNA hergestellt werden. Computeranalysen der cDNA werden verwendet, um auf schnellem Wege Primer auszusuchen, die nicht mehr als ein Exon der genomischen DNA überspannen, was zu einer Erschwerung des Amplifikations-Prozesses führen würde. Diese Primer werden dann für ein PCR-Screening von somatischen Zellhybriden, die einzelne menschliche Chromosomen enthalten, verwendet. Nur diejenigen Hybride, die das dem Primer entsprechende, menschliche Gen enthalten, werden ein amplifiziertes Fragment ergeben.
  • Die PCR-Kartierung von somatischen Zellhybriden ist ein schnelles Verfahren, um eine bestimmte DNA einem bestimmten Chromosom zuzuordnen. Entsprechend der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung der gleichen Oligonucleotid-Primer mit einer Reihe von Fragmenten spezifischer Chromosomen oder Pools von großen, genomischen Clonen auf analoge Art und Weise eine Sublokalisierung erreicht werden. Andere Kartierungsstrategien, die in ähnlicher Weise verwendet werden können, um ein Chromosom zu kartieren, schließen in situ-Hybridisierung, Vorscreening mit markierten, durchfluss sortierten Chromosomen und Vorselektion durch Hybridisierung, um Chromosomenspezifische cDNA-Banken zu konstruieren, ein.
  • Eine Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) von cDNA-Klonen auf ausgebreitete Metaphase-Chromosomen kann verwendet werden, um in einem Schritt eine genaue chromosomale Position zu bestimmen. Für diese Technik können cDNAs, die 500 bis 600 Basen kurz sind, verwendet werden; jedoch besitzen Clone, die größer als 2000 bp sind, eine höhere Wahrscheinlichkeit, mit einer für eine einfache Detektion ausreichenden Intensität des Signals an eine einzigartige, chromosomale Position zu binden. FISH benötigt die Verwendung von Clonen, von denen die ESTs stammen und die umso besser sind, je länger sie sind. Zum Beispiel sind 2000 bp gut, 4000 sind besser und mehr als 4000 ist wahrscheinlich nicht notwendig, um in einem vernünftigen Zeitraum gute Ergebnisse zu erhalten. Für einen Überblick über diese Technik siehe Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988).
  • Wenn eine Sequenz einmal auf eine genaue chromosomale Position kartiert worden ist, kann die physikalische Position der Sequenz auf dem Chromosom mit den Daten der genetischen Karte in Beziehung gesetzt werden. Solche Daten kann man zum Beispiel in V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (online erhältlich über Johns Hopkins University Welch Medical Library) finden. Die Beziehung zwischen Genen und Krankheiten, die auf die gleiche chromosomale Region kartiert wurden, werden dann über Kopplungsanalysen (gemeinsame Vererbung von physikalisch nebeneinander liegenden Genen) identifiziert.
  • Als Nächstes ist es notwendig, die Unterschiede in der cDNA oder der genomischen Sequenz zwischen betroffenen und nicht-betroffenen Individuen zu bestimmen. Wenn eine Mutation in einigen oder allen betroffenen Individuen, aber nicht in einem normalen Individuum beobachtet wird, dann ist es wahrscheinlich, dass die Mutation die Ursache für die Krankheit ist.
  • Bei der gegenwärtigen Auflösung der physikalischen und genetischen Kartierungstechniken könnte eine cDNA, die genau auf einen chromosomalen Bereich, der mit der Krankheit assoziiert ist, lokalisiert wurde, eines von 50 bis 500 möglichen, ursächlichen Genen sein. (Unter der Annahme einer Kartierungsauflösung von 1 Megabase und von einem Gen pro 20 kb).
  • Im Allgemeinen beinhaltet der Vergleich von betroffenen und nicht-betroffenen Individuen zunächst die Suche nach strukturellen Veränderungen der Chromosomen wie Deletionen oder Translokationen, die von Chromosomenspreizungen ablesbar sind oder unter der Verwendung einer auf dieser cDNA beruhenden PCR feststellbar sind. Letztlich ist die vollständige Sequenzierung von Genen von verschiedenen Individuen notwendig, um die Anwesenheit einer Mutation zu bestätigen und Mutationen von Polymorphismen zu unterscheiden.
  • Die vorliegende Erfindung zielt überdies darauf ab, MIP-3, MIP-4 und MIP-1γ in vivo durch die Verwendung von Antisense-Technologie zu hemmen. Antisense-Technologie kann verwendet werden, um Genexpression durch Erzeugung einer Tripel-Helix oder durch Antisense-DNA oder -RNA zu kontrollieren, wobei beide Verfahren auf der Bindung eines Polynucleotids an DNA oder RNA beruhen. Zum Beispiel wird der codierende 5'-Bereich der Polynucleotidsequenz, die die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codiert, verwendet, um ein Antisense-RNA-Oligonucleotid mit einer Länge von etwa 10 bis 40 Basenpaaren zu entwerfen. Ein DNA-Oligonucleotid wird entworfen, um komplementär zu einer Region des in die Transkription involvierten Gens zu sein (Tripel-Helix siehe Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241:456 (1988); und Dervan et al., Science, 251 :1360 (1991)), wodurch die Transkription und die Produktion von MIP-3, MIP-4 und MIP-1γ verhindert wird. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid hybridisiert in vivo an die mRNA und blockiert die Translation des mRNA-Moleküls in MIP-3, MIP-4 und MIP-1γ (Antisense – Okano, J. Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)).
  • In einer anderen Ausführungsform können die vorstehend beschriebenen Oligonucleotide durch im Fachgebiet bekannte Verfahren so an Zellen abgegeben werden, dass die Antisense-DNA oder -RNA in vivo exprimiert werden kann, um die Produktion von MIP-3, MIP-4 und MIP-1γ auf die vorstehend beschriebene Art und Weise zu hemmen.
  • Dementsprechend können Antisense-Konstrukte gegen MIP-3, MIP-4 und MIP-1γ verwendet werden, um Krankheiten zu behandeln, die entweder durch MIP induziert oder verstärkt werden, wie zum Beispiel Atherosklerose, Autoimmunkrankheiten, z.B. multiple Sklerose und Insulin-abhängiger Diabetes, und chronische Entzündungs- und Infektionskrankheiten, Histamin vermittelte allergische Reaktionen, rheumatoide Arthritis, Silikose, Sarkoidose, idiopathische Lungenfibrose und andere chronische Entzündungskrankheiten der Lunge, idiopathisches hypereosinophiles Snydrom, endotoxischer Schock, Histamin vermittelte allergische Reaktionen, Prostaglandin unabhängiges Fieber und aplastische Anämie und andere Fälle von Knochenmarkserkrankungen.
  • Die Polypeptide, ihre Fragmente oder andere Derivate oder Analoga davon oder diese exprimierende Zellen können als Immunogen verwendet werden, um gegen sie gerichtete Antikörper zu produzieren. Diese Antikörper können zum Beispiel polyclonale oder monoclonale Antikörper sein. Die vorliegende Erfindung schließt auch Chimäre, Einzelketten- und humanisierte Antikörper ein, ebenso wie Fab-Fragmente oder das Produkt einer Fab-Expressionsbank. Verschiedene im Fachgebiet bekannte Verfahren können für die Produktion solcher Antikörper und Fragment verwendet werden.
  • Antikörper, die gegen die Polypeptide, die einer Sequenz der vorliegenden Erfindung entsprechen, oder gegen deren in vivo-Rezeptor gerichtet sind, können durch direkte Injektion der Polypeptide in ein Tier oder indem die Polypeptide einem Tier, vorzugsweise nicht einem Menschen, verabreicht werden, erhalten werden. Der so erhaltenen Antikörper wird dann das Polypeptid selbst binden. Auf diese Art und Weise kann sogar eine Sequenz, die nur ein Fragment der Polypeptide codiert, verwendet werden, um Antikörper, die die gesamten nativen Polypeptide binden, zu erzeugen. Solche Antikörper können dann verwendet werden, um die Polypeptide aus Geweben, die dieses Polypeptid exprimieren, zu isolieren.
  • Für die Herstellung von monoclonalen Antikörpern kann jede Technik, die durch kontinuierliche Zelllinien-Kulturen produzierte Antikörper zur Verfügung stellt, verwendet werden. Beispiele schließen die Hybridom-Technik (Köhler und Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), die Triom-Technik, die menschliche B-Zellen-Hybridom-Technik (Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) und die EBV-Hybridom-Technik zur Produktion von menschlichen monoclonalen Antikörpern ein (Cole, et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. S. 77-96).
  • Für die Produktion von Einzelketten-Antikörpern beschriebene Techniken (US-Patent 4,946,778) können angepasst werden, um Einzelketten-Antikörper gegen erfindungsgemäße immunogene Polypeptid-Produkte herzustellen.
  • Die vorliegende Erfindung wird im Weiteren mit Bezug auf die nachfolgenden Beispiele beschrieben werden; es sollte jedoch klar sein, dass die vorliegende Erfindung nicht auf solche Beispiele beschränkt ist. Alle Anteile oder Mengen beziehen sich, wenn nicht anders angegeben, auf das Gewicht.
  • Um das Verständnis der nachfolgenden Beispiele zu vereinfachen, werden bestimmte, häufig vorkommende Verfahren und/oder Ausdrücke beschrieben.
  • „Plasmide" werden durch ein kleines p bezeichnet, dem Großbuchstaben und/oder Zahlen vorangehen oder folgen. Die hier verwendeten Ausgangs-Plasmide sind entweder im Handel erhältlich, auf einer uneingeschränkten Basis öffentlich erhältlich oder können in Übereinstimmung mit veröffentlichten Verfahren aus erhältlichen Plasmiden konstruiert werden. Darüber hinaus sind zu den beschriebenen gleichwertige Plasmide im Fachgebiet bekannt und sind Durchschnittsfachleuten offensichtlich.
  • „Spaltung" der DNA bezeichnet die katalytische Trennung der DNA mit einem Restriktionsenzym, das nur an bestimmten Sequenzen in der DNA wirkt. Die verschiedenen, hier verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich und ihre Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und andere Erfordernisse wurden so verwendet, wie es einem Durchschnittsfachmann bekannt ist. Für analytische Zwecke wird typischerweise 1 μg Plasmid oder DNA-Fragment mit etwa 2 Einheiten Enzym in etwa 20 μl Pufferlösung verwendet. Zum Zweck der Isolierung von DNA-Fragmenten für die Konstruktion von Plasmiden werden typischerweise 5 bis 50 μg DNA mit 20 bis 250 Einheiten Enzym in einem größeren Volumen gespalten. Geeignete Puffer und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme werden durch den Hersteller angegeben. Normalerweise werden Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37°C angesetzt, können aber in Übereinstimmung mit den Angaben des Herstellers variieren. Nach der Spaltung wird der Reaktionsansatz direkt auf einem Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt, um das gewünschte Fragment zu isolieren.
  • Eine Größenauftrennung der gespaltenen Fragmente wird unter der Verwendung eines 8% Polyacrylamidgels, wie durch Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980) beschrieben, durchgeführt.
  • „Oligonucleotide" bezeichnen entweder ein einzelsträngiges Polydesoxynucleotid oder zwei komplementäre Polydesoxynucleotidstränge, die chemisch synthetisiert sein können. Solche synthetischen Olignucleotide besitzen kein 5'-Phosphat und werden daher ohne die Zugabe eines Phosphates mittels eines ATP in der Anwesenheit einer Kinase nicht mit einem anderen Oligonucleotid ligieren. Ein synthetisches Oligonucleotid wird mit einem Fragment ligieren, das nicht dephosphoryliert wurde.
  • „Ligierung" bezeichnet den Prozess des Erzeugens von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelsträngigen Nucleinsäurefragmenten (Maniatis, T., et al., id., S. 146). Wenn nicht auf andere Weise angeben eine Ligierung unter der Verwendung bekannter Puffer und Bedingungen mit 10 Einheiten T4-DNA-Ligase („Ligase") pro 0,5 μg ungefähr äquimolarer Mengen von zu ligierenden DNA-Fragmenten bewerkstelligt werden.
  • Wenn nicht anders angegeben, wurde die Transformation durchgeführt, wie in dem Verfahren von Graham, F. und Van den Eb, A., Virology, 52:456-457 (1973) beschrieben.
  • Beispiel 1
  • Bakterielle Expression und Reinigung von MIP-3
  • Die MIP-3 codierende DNA-Sequenz ATCC #75676 wird zunächst unter der Verwendung von PCR-Oligonucleotid-Primern amplifiziert, die den 5'-Sequenzen des prozessierten MIP-3-Proteins (ohne die Signalpeptid-Sequenz) und den Vektorsequenzen 3' vom MIP-3-Gen entsprechen. Zusätzliche Nucleotide, die BamHI und XbaI entsprechen, werden an die 5'- bzw. 3'-Sequenzen angefügt. Der 5'-Oligonucleotid-Primer hat die Sequenz 5'-TCAGGATCCGTCACAAAAGATGCAGA-3', enthält eine BamHI-Restriktionsschnittstelle, gefolgt durch 18 Nucleotide von der MIP-3 codierenden Sequenz, beginnend von der mutmaßlich letzten Aminosäure des prozessierten Protein-Codons. Die 3'-Sequenz 3'-CGCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT-5' enthält komplementäre Sequenzen zu der XbaI-Stelle und zu einer pBluescript SK-Vektorsequenz, die sich 3' der MIP-3-DNA-Insertion befindet. Die Restriktionsschnittstellen entsprechen den Restriktionsschnittstellen auf dem bakteriellen Expressionsvektor pQE-9 (Qiagen, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311). pQE-9 codiert eine Antibiotikum-Resistenz (Ampr), einen bakteriellen Replikationsursprung (ori), einen durch IPTG regulierbaren Promotor-Operator (P/O), eine Ribosomenbindestelle (RBS), ein 6-His-Anhang und Restriktionsschnittstellen. pQE-9 wird dann mit BamHI und XbaI gespalten. Die amplifizierten Sequenzen werden in pQE-9 ligiert und im Leserahmen mit der den Histidin-Anhang und die RBS codierenden Sequenz inseriert. 6 zeigt eine schematische Darstellung dieser Anordnung. Das Ligierungsgemisch wird anschließend verwendet, um den E. coli-Stamm M15/rep4, von Qiagen unter dem Warenzeichen M15/rep4 erhältlich, zu transformieren. M15/rep4 enthält vielfache Kopien des Plasmides pREP4, das den lacI-Repressor exprimiert und auch eine Kanamycin-Resistenz (Kanr) vermittelt. Transformanten werden durch ihre Fähigkeit identifiziert, auf LB-Platten zu wachsen, und Ampicillin/Kanamycin-resistente Kolonien werden ausgewählt. Plasmid-DNA wird isoliert und durch Restriktionsanalyse bestätigt. Clone, die das gewünschte Konstrukt enthalten, werden über Nacht (O/N) in Flüssigkultur in LB-Medium, das sowohl mit Amp (100 μg/ml), als auch mit Kan (25 μg/ml) ergänzt wurde, wachsen gelassen. Die O/N-Kultur wird verwendet, um eine große Kultur in einem Verhältnis von 1:100 bis 1:250 zu beimpfen. Die Zellen werden bis zu einer optischen Dichte 600 (OD600) von 0,4 bis 0,6 wachsen gelassen. IPTG („Isopropyl-B-D-thiogalactopyranosid") wird dann bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben. IPTG induziert durch die Inaktivierung des lacI-Repressors die Freilegung des P/O, was zu einer erhöhten Genexpression führt. Die Zellen werden weitere 3 bis 4 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen werden dann durch Zentrifugation geerntet. Der Zellniederschlag wird in dem chaotropen Mittel 6 molares Guanidin-HCl solubilisiert. Nach dem Klarwerden wird das solubilisierte MIP-3 aus dieser Lösung durch Chromatographie auf einer Nickel-Chelat-Säule unter Bedingungen gereinigt, die eine feste Bindung von Proteinen, die einen 6-His-Anhang enthalten, erlauben. Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411:177-184 (1984). MIP-3 (95% rein) wird von der Säule in 6 molar Guanidin-HCl, pH 5,0 eluiert und zum Zweck der Renaturierung auf 3 molar Guanidin-HCl, 100 mM Natriumphosphat, 10 mmolar Glutathion (reduziert) und 2 mmolar Glutathion (oxidiert) eingestellt. Nach einer Inkubation in dieser Lösung für 12 Stunden wird das Protein gegen 10 mmolar Natriumphosphat dialysiert. Die Anwesenheit eines neuen, 14 kD entsprechenden Proteins nach Induktion zeigt die Expression von MIP-3.
  • Beispiel 2
  • Bakterielle Expression und Reinigung von MIP-4
  • Die MIP-4 codierende DNA-Sequenz ATCC #75675 wird zunächst unter der Verwendung von PCR-Oligonucleotid-Primern amplifiziert, die den 5'-Sequenzen des prozessierten MIP-4-Proteins (ohne die Signalpeptid-Sequenz) und 3' vom MIP-4-Gen gelegenen Sequenzen in dem pBSK-Vektor entsprechen. Zusätzliche Nucleotide, die BamHI und XbaI entsprechen, werden an die 5'- bzw. 3'-Sequenzen angefügt. Der 5'-Oligonucleotid-Primer hat die Sequenz TCAGGATCCTGTGCACAAGTTGGTACC, enthält eine BamHI-Restriktionsschnittstelle, gefolgt durch 18 Nucleotide von der MIP-4 codierenden Sequenz, beginnend von der mutmaßlich letzten Aminosäure des prozessierten Protein-Codons; Die 3'-Sequenz CGCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT enthält komplementäre Sequenzen zu der XbaI-Stelle und zu einer pBluescript SK-Vektorsequenz, die sich 3' der MIP-4-DNA-Insertion befindet. Die Restriktionsschnittstellen entsprechen den Restriktionsschnittstellen auf dem bakteriellen Expressionsvektor pQE-9 (Qiagen, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311). pQE-9 codiert eine Antibiotikum-Resistenz (Ampr), einen bakteriellen Replikationsursprung (ori), einen durch IPTG regulierbaren Promotor-Operator (P/O), eine Ribosomenbindestelle (RBS), ein 6-His-Anhang und Restriktionsschnittstellen. pQE-9 wird dann mit BamHI und XbaI gespalten. Die amplifizierten Sequenzen werden in pQE-9 ligiert und im Leserahmen mit der für den Histidin-Anhang und die RBS codierenden Sequenz inseriert. 6 zeigt eine schematische Darstellung dieser Anordnung. Das Ligierungsgemisch wird anschließend verwendet, um den E. coli-Stamm, von Qiagen unter dem Warenzeichen M15/rep4 erhältlich, zu transformieren. M15/rep4 enthält vielfache Kopien des Plasmides pREP4, das den lacI-Repressor exprimiert und auch eine Kanamycin-Resistenz (Kanr) vermittelt. Transformanten werden durch ihre Fähigkeit identifiziert, auf LB-Platten zu wachsen, und Ampicillin/Kanamycin-resistente Kolonien werden ausgewählt.
  • Plasmid-DNA wird isoliert und durch Restriktionsanalyse bestätigt. Clone, die das gewünschte Konstrukt enthalten, werden über Nacht (O/N) in Flüssigkultur in LB-Medium, das sowohl mit Amp (100 μg/ml) als auch mit Kan (25 μg/ml) ergänzt wurde, wachsen gelassen. Die O/N-Kultur wird verwendet, um eine große Kultur in einem Verhältnis von 1:100 bis 1:250 zu beimpfen. Die Zellen werden bis zu einer optischen Dichte 600 (OD600) von 0,4 bis 0,6 wachsen gelassen. IPTG („Isopropyl-B-D-thiogalactopyranosid") wurde dann bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben. IPTG induziert durch die Inaktivierung des lacI-Repressors die Freilegung des P/O, was zu einer erhöhten Genexpression führt. Die Zellen werden weitere 3 bis 4 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen werden dann durch Zentrifugation geerntet. Der Zellniederschlag wird in dem chaotropen Mittel 6 molar Guanidin-HCl solubilisiert. Nach dem Klarwerden wird das solubilisierte MIP-4 aus dieser Lösung durch Chromatographie auf einer Nickel-Chelat-Säule unter Bedingungen gereinigt, die eine feste Bindung von Proteinen, die einen 6-His-Anhang enthalten, erlauben. Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411:177-184 (1984). MIP-4 (95% rein) wird von der Säule in 6 molar l, pH 5,0 eluiert und zum Zweck der Renaturierung auf 3 molar Guanidin-HCl, 100 mM Natriumphosphat, 10 mmolar Glutathion (reduziert) und 2 mmolar Glutathion (oxidiert) eingestellt. Nach einer Inkubation in dieser Lösung für 12 Stunden wird das Protein gegen 10 mmolar Natriumphosphat dialysiert. Die Anwesenheit eines neuen, 14 kD entsprechenden Proteins nach Induktion zeigt die Expression von MIP-4. (5).
  • Beispiel 3
  • Expression von rekombinantem MIP-3 in COS-Zellen
  • Das Plasmid CMV-MIP-3 HA stammt von dem Vektor pcDNAI/Amp (Invitrogen), enthaltend: 1) Replikationsursprung von SV40, 2) Ampicillin-Resistenz-Gen, 3) Replikationsursprung von E. coli, 4) CMV-Promotor, gefolgt durch eine Polylinker-Region, ein SV40-Intron und eine Polyadenylierungsstelle. Ein DNA-Fragment, das den gesamten MIP-3-Vorläufer und einen HA-Anhang, der im Leserahmen an sein 3'-Ende fusioniert ist, codiert, wird in die Polylinker-Region des Vektors cloniert, wodurch die Expression des rekombinanten Proteins vom CMV-Promotor gesteuert wird. Der HA-Anhang entspricht einem Epitop, das von dem Influenza-Hämagglutinin-Protein stammt, wie bereits beschrieben (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A. Cherenson, M. Connolly und R. Lehner, 1984, Cell 37:767). Die Aufnahme des HA-Anhangs in unser Ziel-Protein erlaubt einen einfachen Nachweis des rekombinanten Proteins mit einem Antikörper, der das HA-Epitop erkennt.
  • Die Strategie der Plasmid-Konstruktion wird wie folgt beschrieben: Die MIP-3 codierende DNA-Sequenz ATCC #75676, wird durch PCR auf dem ursprünglich clonierten EST unter der Verwendung von zwei Primern konstruiert: der 5'-Primer (5'GGAAAGCTTATGAAGGTCTCCGTGGCT-3') enthält eine HindIII-Stelle, gefolgt durch 18 Nucleotide MIP-3 codierende Sequenz, beginnend mit dem Initiations-Codon; die 3'-Sequenz (5'-CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTAT GGGTAATTCTTCCTGGTCTTGATCC-3') enthält komplementäre Sequenzen zu der XbaI-Stelle, dem Translations-Stopp-Codon, dem HA-Anhang und den letzten 20 Nucleotiden der MIP-3 codierenden Sequenz (ausschließlich des Stopp-Codons). Daher enthält das PCR-Produkt eine HindIII-Stelle, MIP-3 codierende Sequenz, gefolgt durch einen im Leserahmen fusionierten HA-Anhang, ein Translations-Terminations-Stopp-Codon neben dem HA-Anhang und eine XbaI-Stelle. Das durch PCR amplifizierte DNA-Fragment und der Vektor pcDNAI/Amp werden mit den Restriktionsenzymen HindIII und XbaI gespalten und ligiert. Das Ligierungsgemisch wird in den E. coli-Stamm SURE (erhältlich von Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037) transformiert, die transformierte Kultur wird auf Ampicillin-Medium-Platten plattiert und resistente Kolonien werden ausgewählt. Plasmid-DNA wird von den Transformanten isoliert und durch Restriktionsanalyse auf die Anwesenheit des richtigen Fragmentes untersucht. Zur Expression des rekombinanten MIP-3 werden COS-Zellen über das DEAE-DEXTRAN-Verfahren mit dem Expressionsvektor transfiziert. (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). Die Expression des MIP-3-HA-Proteins wird durch Verfahren der radioaktiven Markierung und der Immunpräzipitation nachgewiesen. (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). Die Zellen werden zwei Tage nach der Transfektion für 8 Stunden mit 35S-Cystein markiert. Das Kulturmedium wird anschließend gesammelt, und die Zellen werden mit Detergenz lysiert (RIPA-Puffer (150 mM NaCl, 1% NP–40, 0,1% SDS, 1% NP-40, 0,5% DOC, 50 mM Tris, pH 7,5)). (Wilson, I. et al., id. 37 :767 (1984)). Sowohl das Zelllysat als auch das Kulturmedium werden mit HA-spezifischen monoclonalen Antikörpern gefällt. Die gefällten Proteine werden auf 15%-igen SDS-PAGE-Gelen analysiert.
  • Beispiel 4
  • Expression von rekombinantem MIP-4 in COS-Zellen
  • Das Plasmid CMV-MIP-4 HA stammt von einem Vektor pcDNAI/Amp (Invitrogen), enthaltend: 1) Replikationsursprung von SV40, 2) Ampicillin-Resistenz-Gen, 3) Replikationsursprung von E. coli, 4) CMV-Promotor, gefolgt durch eine Polylinker-Region, ein SV40-Intron und eine Polyadenylierungsstelle. Ein DNA-Fragment, das den gesamten MIP-4-Vorläufer und einen HA-Anhang, der im Leserahmen an sein 3'-Ende fusioniert ist, codiert, wird in die Polylinker-Region des Vektors cloniert, wodurch die Expression des rekombinanten Proteins vom CMV-Promotor gesteuert wird. Der HA-Anhang entspricht einem Epitop, das von dem Influenza-Hämagglutinin-Protein stammt, wie bereits beschrieben (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A. Cherenson, M. Connolly und R. Lerner, 1984, Cell 37:767). Die Aufnahme des HA-Anhangs in unser Ziel-Protein erlaubt einen einfachen Nachweis des rekombinanten Proteins mit einem Antikörper, der das HA-Epitop erkennt.
  • Die Strategie der Plasmid-Konstruktion wird wie folgt beschrieben: Die MIP-4 codierende DNA-Sequenz ATCC #75675 wird durch PCR auf dem ursprünglich clonierten EST unter der Verwendung von zwei Primern konstruiert: der 5'-Primer (5'GGAAAGCTTATGAAGGGCCTTGCAGCTGCC-3') enthält eine HindIII-Stelle, gefolgt durch 20 Nucleotide MIP-4 codierende Sequenz, beginnend mit dem Initiations-Codon; die 3'-Sequenz (5'-CGCTCTAGATCAABCGTAGTCTGGGACGTCGTAT GGGTAGGCATTCAGCTTCAGGTC-3') enthält komplementäre Sequenzen zu der XbaI-Stelle, dem Translations-Stopp-Codon, dem HA-Anhang und den letzten 19 Nucleotiden der MIP-4 codierenden Sequenz (ausschließlich des Stopp-Codons). Daher enthält das PCR-Produkt eine HindIII-Stelle, MIP-4 codierende Sequenz, gefolgt durch einen im Leserahmen fusionierten HA-Anhang, ein Translations-Terminations-Stopp-Codon neben dem HA-Anhang und eine XbaI-Stelle. Das durch PCR amplifizierte DNA-Fragment und der Vektor pcDNAI/Amp werden mit den Restriktionsenzymen HindIII und XbaI gespalten und ligiert. Das Ligierungsgemisch wird in den E. coli-Stamm SURE (erhältlich von Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037) transformiert, die transformierte Kultur wird auf Ampicillin-Medium-Platten plattiert, und resistente Kolonien werden ausgewählt. Plasmid-DNA wird von den Transformanten isoliert und durch Restriktionsanalyse auf die Anwesenheit des richtigen Fragmentes untersucht. Zur Expression des rekombinanten MIP-4 werden COS-Zellen über das DEAE-DEXTRAN-Verfahren mit dem Expressionsvektor transfiziert. (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). Die Expression des MIP-4-HA-Proteins wird durch Verfahren der radioaktiven Markierung und der Immunpräzipitation nachgewiesen. (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). Die Zellen werden zwei Tage nach der Transfektion für 8 Stunden mit 35S-Cystein markiert. Das Kulturmedium wird anschließend gesammelt, und die Zellen werden mit Detergenz lysiert (RIPA-Puffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 1% NP-40, 0,5% DOC, 50 mM Tris, pH 7,5)). (Wilson, I. et al., id. 37 :767 (1984)). Sowohl das Zelllysat als auch das Kulturmedium werden mit HA-spezifischen monoclonalen Antikörpern gefällt. Die gefällten Proteine werden auf 15%-igen SDS-PAGE-Gelen analysiert.
  • Beispiel 5
  • Expressionsmuster von MIP-3 in menschlichem Gewebe
  • Eine Northern-Blot-Analyse wird durchgeführt, um die Expressionsstärke von MIP-3 in menschlichem Gewebe zu untersuchen. Gesamte zelluläre RNA-Proben werden mit Hilfe des RNAzolTM B-Systems isoliert (Biotecx Laboratories, In. 6023 South Loop East, Houston, TX 77033). Etwa 10 μg Gesamt-RNA, die von jedem aufgeführten, menschlichen Gewebe isoliert wurde, werden auf 1%-igem Agarosegel aufgetrennt und auf einen Nylonfilter geblottet. (Sambrook, Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, (1989)). Die Markierungsreaktion wird gemäß dem Stratagene Prime-It-Kit mit 50 ng DNA-Fragment durchgeführt. Die markierte DNA wird über eine Select-G-50-Säule gereinigt. (5 Prime – 3 Prime, Inc. 5603 Arapahoe Road, Boulder, CO 80303). Der Filter wird anschließend mit dem radioaktiv markierten MIP-3-Gen voller Länge bei 1,000,000 CpM/ml in 0,5 M NaPO4, pH 7,4 und 7% SDS über Nacht bei 65°C hybridisiert. Nach zweimaligem Waschen bei Raumtemperatur und zweimal bei 60°C mit 0,5 × SSC, 0,1% SDS wird der Filter dann bei –70°C über Nacht mit einer Verstärkerfolie exponiert.
  • Beispiel 6
  • Expressionsmuster von MIP-4 in menschlichen Zellen
  • Eine Northern-Blot-Analyse wird durchgeführt, um die Expressionsstärke von MIP-4 in menschlichen Zellen zu untersuchen. Gesamte zelluläre RNA-Proben werden mit Hilfe des RNAzolTM B-Systems isoliert (Biotecx Laboratories, In. 6023 South Loop East, Houston, TX 77033). Etwa 10 μg Gesamt-RNA, die von jedem aufgeführten, menschlichen Gewebe isoliert wurde, werden auf einem 1 %-igem Agarosegel aufgetrennt und auf einen Nylonfilter geblottet. (Sambrook, Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, (1989)). Die Markierungsreaktion wird gemäß dem Stratagene Prime-It-Kit mit 50 ng DNA-Fragment durchgeführt. Die markierte DNA wird über eine Select-G-50-Säule gereinigt. (5 Prime – 3 Prime, Inc. 5603 Arapahoe Road, Boulder, CO 80303). Der Filter wird anschließend mit dem radioaktiv markierten MIP-4-Gen voller Länge bei 1,000,000 CpM/ml in 0,5 M NaPO4, pH 7,4 und 7% SDS über Nacht bei 65°C hybridisiert. Nach zweimaligem Waschen bei Raumtemperatur und zweimal bei 60°C mit 0,5 × SSC, 0,1% SDS wird der Filter dann bei –70°C über Nacht mit einer Verstärkerfolie exponiert. Siehe 6.
  • Beispiel 7
  • Bakterielle Expression und Reinigung von MIP-1γ
  • Die MIP-1γ codierende DNA-Sequenz PBLSKMIP (ATCC # 75572) wird zunächst unter der Verwendung von PCR-Oligonucleotid-Primern amplifiziert, die den 5'- und 3'-Sequenzen des prozessierten MIP-1γ-Proteins (ohne die Signalpeptid-Sequenz) entsprechen, und zusätzliche Nucleotide, die BamHI und XbaI entsprechen, werden an die 5'- bzw. 3'-Sequenzen angefügt. Der 5'-Oligonucleotid-Primer hat die Sequenz GCCCGCGGATCCTCCTCACGGGGACCTTAC enthält eine BamHI-Restriktionsschnittstelle, gefolgt durch 15 Nucleotide von der MIP-1γ codierenden Sequenz, beginnend von der mutmaßlich letzten Aminosäure des prozessierten Protein-Codons; Die 3'-Sequenz GCCTGCTCTAGATCAAAGCAGGGAAGCTCCAG enthält komplementäre Sequenzen zu der XbaI-Stelle, dem Translations-Stopp-Codon und den letzten 20 Nucleotiden der MIP-1γ codierenden Sequenz. Die Restriktionsschnittstellen entsprechen den Restriktionsschnittstellen auf dem bakteriellen Expressionsvektor pQE-9 (Qiagen, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311). pQE-9 codiert eine Antibiotikum-Resistenz (Ampr), einen bakteriellen Replikationsursprung (ori), einen durch IPTG regulierbaren Promotor-Operator (P/O), eine Ribosomenbindestelle (RBS), einen 6-His-Anhang und Restriktionsschnittstellen. pQE-9 wurde dann mit BamHI und XbaI gespalten. Die amplifizierten Sequenzen werden in pQE-9 ligiert und im Leserahmen mit der den Histidin-Anhang und die RBS codierende Sequenz inseriert. 6 zeigt eine schematische Darstellung dieser Anordnung. Das Ligierungsgemisch wird anschließend verwendet, um den E. coli-Stamm, von Qiagen unter dem Warenzeichen M15/rep4 erhältlich, zu transformieren. M15/rep4 enthält vielfache Kopien des Plasmides pREP4, das den lacI-Repressor exprimiert und auch eine Kanamycin- Resistenz (Kanr) vermittelt. Transformanten werden durch ihre Fähigkeit identifiziert, auf LB-Platten zu wachsen, und Ampicillin/Kanamycin-resistente Kolonien werden ausgewählt. Plasmid-DNA wird isoliert und durch Restriktionsanalyse bestätigt. Clone, die das gewünschte Konstrukt enthalten, werden über Nacht (O/N) in Flüssigkultur in LB-Medium, das sowohl mit Amp (100 μg/ml) als auch mit Kan (25 μg/ml) ergänzt wurde, wachsen gelassen. Die O/N-Kultur wird verwendet, um eine große Kultur in einem Verhältnis von 1:100 bis 1:250 zu beimpfen. Die Zellen werden bis zu einer optischen Dichte 600 (OD600) von 0,4 bis 0,6 wachsen gelassen. IPTG („Isopropyl-B-D-thiogalactopyranosid") wurde dann bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben. IPTG induziert durch die Inaktivierung des lacI-Repressors die Freilegung des P/O, was zu einer erhöhten Genexpression führt. Die Zellen wurden weitere 3 bis 4 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen werden dann durch Zentrifugation geerntet. Der Zellniederschlag wurde in dem chaotropen Mittel 6 molar Guanidin-HCl solubilisiert. Nach dem Klarwerden wird das solubilisierte MIP-1γ aus dieser Lösung durch Chromatographie auf einer Nickel-Chelat-Säule unter Bedingungen gereinigt, die eine feste Bindung von Proteinen, die einen 6-His-Anhang enthalten, erlauben. Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411:177-184 (1984). MIP-1γ (95% rein) wurde von der Säule in 6 molar Guanidin-HCl pH 5,0 eluiert und zum Zweck der Renaturierung auf 3 molar Guanidin HCl, 100 mM Natriumphosphat, 10 mmolar Glutathion (reduziert) und 2 mmolar Glutathion (oxidiert) eingestellt. Nach einer Inkubation in dieser Lösung für 12 Stunden wurde das Protein gegen 10 mmolar Natriumphosphat dialysiert. Die Anwesenheit eines neuen, 14 kD entsprechenden Proteins nach Induktion zeigt die Expression von MIP-1γ. (3).
  • Beispiel 8
  • Expression von rekombinantem MIP-1γ in COS-Zellen
  • Das Plasmid CMV-MIP-1γ HA stammt von einem Vektor pcDNAI/Amp (Invitrogen), enthaltend: 1) Replikationsursprung von SV40, 2) Ampicillin-Resistenz-Gen, 3) Replikationsursprung von E. coli, 4) CMV-Promotor, gefolgt durch eine Polylinker-Region, ein SV40-Intron und eine Polyadenylierungsstelle. Ein DNA-Fragment, das den gesamten MIP-1γ-Vorläufer und einen HA-Anhang, der im Leserahmen an sein 3'-Ende fusioniert ist, codiert, wird in die Polylinker-Region des Vektors cloniert, wodurch die Expression des rekombinanten Proteins vom CMV-Promotor gesteuert wird. Der HA-Anhang entspricht einem Epitop, das von dem Influenza-Hämagglutinin-Protein stammt, wie bereits beschrieben (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A. Cherenson, M. Connolly und R. Lehner, 1984, Cell 37:767). Die Aufnahme des HA-Anhangs in unser Ziel-Protein erlaubt einen einfachen Nachweis des rekombinanten Proteins mit einem Antikörper, der das HA-Epitop erkennt.
  • Die Strategie der Plasmid-Konstruktion wird wie folgt beschrieben: Die MIP-1γ codierende DNA-Sequenz, pBLSKMIP (ATCC #75572), wird durch PCR auf dem ursprünglich clonierten EST unter der Verwendung von zwei Primern konstruiert: der 5'-Primer (5'GGAAAGCTTATGAAGATTCCGTGGCTGC-3') enthält eine HindIII-Stelle, gefolgt durch 20 Nucleotide MIP-1γ codierende Sequenz, beginnend mit dem Initiations-Codon; die 3'-Sequenz (5'-CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTTCTCCTTCATGTCCTTG-3') enthält komplementäre Sequenzen zu der XbaI-Stelle, dem Translations-Stopp-Codon, dem HA-Anhang und den letzten 19 Nucleotiden der MIP-1γ codierenden Sequenz (ausschließlich des Stopp-Codons). Daher enthält das PCR-Produkt eine HindIII-Stelle, MIP-1γ codierende Sequenz, gefolgt durch einen im Leserahmen fusionierten HA-Anhang, ein Translations-Terminations-Stopp-Codon neben dem HA-Anhang und eine XbaI-Stelle. Das durch PCR amplifizierte DNA-Fragment und der Vektor pcDNAI/Amp wurden mit den Restriktionsenzymen HindIII und XbaI gespalten und ligiert. Das Ligierungsgemisch wird in den E. coli-Stamm SURE (erhältlich von Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037) transformiert, die transformierte Kultur wird auf Ampicillin-Medium-Platten plattiert und resistente Kolonien werden ausgewählt. Plasmid-DNA wurde von den Transformanten isoliert und durch Restriktionsanalyse auf die Anwesenheit des richtigen Fragmentes untersucht. Zur Expression des rekombinanten MIP-1γ werden COS-Zellen über das DEAE-DEXTRAN-Verfahren mit dem Expressionsvektor transfiziert. (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). Die Expression des MIP-1γ-HA-Proteins wird durch Verfahren der radioaktiven Markierung und der Immunpräzipitation nachgewiesen. (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). Die Zellen werden zwei Tage nach der Transfektion für 8 Stunden mit 35S-Cystein markiert. Das Kulturmedium wird anschließend gesammelt, und die Zellen werden mit Detergenz lysiert (RIPA-Puffer (150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0,1 % SDS, 1 % NP-40, 0,5% DOC, 50 mM Tris, pH 7,5)). (Wilson, I. et al., id. 37 :767 (1984)). Sowohl das Zelllysat als auch das Kulturmedium werden mit HA-spezifischen monoclonalen Antikörpern gefällt. Die gefällten Proteine wurden auf 15%-igen SDS-PAGE-Gelen analysiert.
  • Beispiel 9
  • Expressionsmuster von MIP-1γ in menschlichem Gewebe
  • Eine Northern-Blot-Analyse wird durchgeführt, um die Expressionsstärke von MIP-1γ in menschlichen Geweben zu untersuchen. Gesamte zelluläre RNA-Proben wurden mit Hilfe des RNAzolTM B-Systems isoliert (Biotecx Laboratories, In. 6023 South Loop East, Houston, TX 77033). Etwa 10 μg Gesamt-RNA, die von jedem aufgeführten, menschlichen Gewebe isoliert wurde, werden auf einem 1%-Agarosegel aufgetrennt und auf einen Nylonfilter geblottet. (Sambrook, Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, (1989)). Die Markierungsreaktion wird gemäß dem Stratagene Prime-It-Kit mit 50 ng DNA-Fragment durchgeführt. Die markierte DNA wird über eine Select-G-50-Säule gereinigt. (5 Prime – 3 Prime, Inc. 5603 Arapahoe Road, Boulder, CO 80303). Der Filter wird anschließend mit dem radioaktiv markierten MIP-1γ-Gen voller Länge bei 1,000,000 CpM/ml in 0,5 M NaPO4, pH 7,4 und 7% SDS über Nacht bei 65°C hybridisiert. Nach zweimaligem Waschen bei Raumtemperatur und zweimal bei 60°C mit 0,5 × SSC, 0,1% SDS wird der Filter dann bei –70°C über Nacht mit einer Verstärkerfolie exponiert. Die Boten-RNA von MIP-1γ ist in der Milz, der Lunge und der Leber reichlich und in anderen Geweben weniger häufig vorhanden. (5).
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00320001
  • Figure 00330001
  • Figure 00340001
  • Figure 00350001
  • Figure 00360001
  • Figure 00370001

Claims (27)

  1. Polynucleotid, umfassend ein Polynucleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) Polynucleotiden, die mindestens die reife Form des Polypeptids codieren, das die abgeleitete Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NR: 2 (8), 4 (1) oder 6 (2) aufweist; (b) Polynucleotiden mit der codierenden Sequenz wie in SEQ ID NR: 1 (8), 3 (1), oder 5 (2), die mindestens die reife Form des Polypeptids codiert; (c) Polynucleotiden, die das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von mindestens der reifen Form des Polypeptids, codiert durch die cDNA, die in ATCC 75572, ATCC 75676 oder ATCC 75675 enthalten ist, codieren; (d) Polynucleotiden mit der codierenden Sequenz der cDNA, die in ATCC 75572, ATCC 75676 oder ATCC 75675 enthalten ist, die mindestens die reife Form des Polypeptids codiert; (e) Polynucleotiden, die ein Fragment des Polypeptids codieren, das von einem Polynucleotid von einem von (a) bis (d) codiert wird, wobei das Fragment ein Chemolockstoff für Leukocyten ist, die Koloniebildung von Knochenmarkstammzellen inhibiert oder hematopoietische Stammzellen während der Krebs-Chemotherapie schützt; (f) Polynucleotiden, die ein Analogon oder Derivat eines Polypeptids codieren, das von einem Polynucleotid von einem von (a) bis (d) codiert wird, bei dem (i) einer oder mehrere der Aminosäurereste durch einen konservierten Aminosäurerest substituiert sind, (ii) einer oder mehrere der Aminosäurereste eine Substituentengruppe einschließen, oder (iii) das reife Polypeptid an eine andere Verbindung fusioniert ist und wobei das Analogon oder Derivat ein Chemolockstoff für Leukocyten ist, die Koloniebildung von Knochenmarkstammzellen inhibiert oder hematopoietische Stammzellen während der Krebs-Chemotherapie schützt; (g) Polynucleotiden, die mindestens zu 70% identisch sind mit einem Polynucleotid wie in einem von (a) bis (d) definiert, und die ein Polypeptid codieren, das ein Chemolockstoff für Leukocyten ist, die Koloniebildung von Knochenmarkstammzellen inhibiert oder hematopoietische Stammzellen während der Krebs-Chemotherapie schützt; (h) Polynucleotiden, die mindestens zu 95% identisch sind mit einem Polynucleotid wie in einem von (a) bis (e) definiert, und die ein Polypeptid codieren, das ein Chemolockstoff für Leukocyten ist, die Koloniebildung von Knochenmarkstammzellen inhibiert oder hematopoietische Stammzellen während der Krebs-Chemotherapie schützt; und (i) Polynucleotiden, die mindestens 97% identisch sind mit einem Polynucleotid wie in einem von (a) bis (e) definiert, und die ein Polypeptid codieren, das ein Chemolockstoff für Leukocyten ist, die Koloniebildung von Knochenmarkstammzellen inhibiert oder hematopoietische Stammzellen während der Krebs-Chemotherapie schützt; oder der komplementäre Strang eines solchen Polynucleotids.
  2. Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei das Polynucleotid einen Start-Methionin-Aminosäurerest codiert.
  3. Polynucleotid nach Anspruch 1(g), wobei die Polynucleotide mindestens zu 95% identisch mit einem Polynucleotid sind, wie in einem der Ansprüche 1(a) bis 1(d) definiert.
  4. Polynucleotid nach Anspruch 1(g), wobei die Polynucleotide mindestens zu 97% identisch mit einem Polynucleotid sind, wie in einem der Ansprüche 1(a) bis 1(d) definiert.
  5. Polynucleotid umfassend die Polynucleotidsequenz, die die abgeleitete Sequenz der Aminosäurereste +1 bis +76, wie in SEQ ID NR: 4 gezeigt, codiert.
  6. Polynucleotid nach Anspruch 5, wobei das Polynucleotid einen Start-Methionin-Aminosäurerest codiert.
  7. Polynucleotid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) Polynucleotiden, die mindestens zu 70% identisch mit dem Polynucleotid nach Anspruch 5 oder 6 sind; (b) Polynucleotiden, die mindestens zu 95% identisch mit dem Polynucleotid nach Anspruch 5 oder 6 sind; (c) Polynucleotiden, die mindestens zu 97% identisch mit dem Polynucleotid nach Anspruch 5 oder 6 sind.
  8. Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das codierte Polypeptid ein Chemolockstoff für Leukocyten ist.
  9. Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das codierte Polypeptid, Analogon oder Derivat davon ein Chemolockstoff für Monocyten, Neutrophile, T-Lymphocyten, Eosinophile oder Basophile ist.
  10. Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das codierte Polypeptid die Koloniebildung von Knochenmarkstammzellen inhibiert.
  11. Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das codierte Polypeptid hematopoietische Stammzellen während der Krebs-Chemotherapie schützt.
  12. Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 11, welches DNA oder RNA ist.
  13. DNA nach Anspruch 12, welche genomische DNA ist.
  14. Vektor umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 13.
  15. Vektor nach Anspruch 14, wobei das Polynucleotid funktionell verknüpft ist mit den regulatorischen Sequenzen, die die Transkription in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen ermöglichen.
  16. Wirtszelle, gentechnisch verändert mit einem Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 13 oder einem Vektor nach Anspruch 14 oder 15.
  17. Verfahren zur Herstellung eines Makrophagen-inflammatorischen Proteins, umfassend das Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 16 und Gewinnen des Proteins aus der Kultur.
  18. Polypeptid, codiert durch ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 13 oder erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 17.
  19. Antikörper gegen das Polypeptid nach Anspruch 18.
  20. Nucleinsäuremolekül, das spezifisch mit einem Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 13 hybridisiert.
  21. Arzneimittel, umfassend das Polypeptid nach Anspruch 18, das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 13 oder einen Antikörper nach Anspruch 19 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
  22. Diagnostische Zusammensetzung, umfassend ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 13, den Antikörper nach Anspruch 15 oder das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 20.
  23. Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 18 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von chronischen Infektionen, Krebs, Leukärnie, lymphozytische Leukämie, Immunerkrankungen, Psoriasis, Schlaganfall, Thrombocytose, Lungenembolie, myeloproliferativen Erkrankungen, oder zur Anwendung bei einer Anti-Tumortherapie, Wundheilung, Immunregulation oder Hemmung der Koloniebildung von Knochenmarkstammzellen.
  24. Verwendung eines Polynucleotids nach einem der Ansprüchen 1 bis 13 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Atherosklerose, Autoimmunkrankheiten, multipler Sklerose, infektiösen Erkrankungen, Histaminvermittelten allergischen Reaktionen, rheumatoider Arthritis, Silikose, Sarkoidose, idiopathischer Lungenfibrose, chronisch-entzündlichen Erkrankungen der Lunge, idiopathischem hypereosinophilem Syndrom, endotoxischem Schock, Prostaglandinunabhängigem Fieber oder aplastischer Anämie.
  25. Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 19 oder des Nucleinsäuremoleküls nach Anspruch 20 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, chronischen Entzündungen, chronischen infektiösen Erkrankungen, Silikose, Sarkoidose, idiophathischer Lungenfibrose, idiopathischem hypereosinophilem Syndrom, endotoxischem Schock, Histamin-vermittelten allergischen Reaktionen, aplastischer Anämie oder anderen Knochenmarkserkrankungen.
  26. Verfahren zur Identifizierung eines Antagonisten gegen das Polypeptid von Anspruch 18 umfassend: (a) Inkontaktbringen eines Leukocyten mit einem vermeintlichen Antagonisten und dem Polypeptid nach Anspruch 18; und (b) Bestimmen, ob das Binden an den Antagonisten das Binden eines Polypeptids nach Anspruch 18 verhindert.
  27. Verfahren zur Identifizierung eines Inhibitoren eines Polypeptids nach Anspruch 18, umfassend: (a) Inkontaktbringen des Polypeptids mit dem vermeintlichen Inhibitor; und (b) Bestimmen, ob die Bindung des Inhibitors die biologische Aktivität des Peptids verhindert.
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