【発明の詳細な説明】
インターロイキン-１β変換酵素様アポトーシスプロテアーゼ-１および２
本発明は、新たに同定したポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドに
よりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドの使用、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生成に関
する。より特定すると、本発明のポリペプチドは、インターロイキン−１β変換
酵素様アポトーシスプロテアーゼ−１およびインターロイキン−１β変換酵素様
アポトーシスプロテアーゼ−２であり、本明細書中以後、しばしば集合的に「IC
E-LAP-1および2」と呼ばれる。本発明はまた、このようなポリペプチドの作用を
阻害することに関する。
インターロイキン−１β変換酵素(ICE)は、pro-IL-1βを、成熟かつ活性型のI
L-1βへ切断することに関与し、そしてまた生物体が望まない細胞を除去するプ
ロセスであるプログラムされた細胞死(またはアポトーシス)に関与することが最
近発見された。本発明は、構造的にICEと関係のあるICE-LAP-1および2に関する
。
線虫caenorhabditis elegans において、プログラムされた細胞死の遺伝的経
路が確認された(Ellis、R.E.ら、Annu.Rev.Cell Biol.、7:663-698(1991))。２
個の遺伝子(ced-3およびced-4)は、C.elegansにおいてプログラムされた細胞死
を経る細胞にとって不可欠なものである。(Ellis,H.M.、およびHorvitz,H.R.、C
ell、44:817-829(1986))。これらの２個の遺伝子の機能を除去する劣性変異体は
、C.elegansの発生の間、正常なプログラムされた細胞死を妨げる。ced-3タンパ
ク質に対する公知の脊椎動物の対応物は、ICEである。ced-3とICEとの間の全体
にわたるアミノ酸の同一性は、28％であり、115個のアミノ酸の領域(ced-3の残
基246-360およびICEの残基164-278)で最も高い同一性(43％)を示す。この領域は
、保存されたペンタペプチドQACRG(ced-3の残基356-360)を含み、このペプチド
はICE機能にとって不可欠であると知られているシステインを含む。本発明のICE
-LAP-1および2ポリペプチドはまた、同じ保存されたペンタペプチドおよびICE機
能にとって不可欠なシステイン残基を有する。
ced-3とICEとの間の類似性は、ced-3がシステインプロテアーゼとして機能し
得ることだけでなく、ICEが脊椎動物のプログラムされた細胞死の遺伝子として
作用し得ることも示唆する。ced-3および脊椎動物の対応物（ICE）は、胚発生の
間、プログラムされた細胞死を制御する(Gagliarnini、V.ら、Science、263:826
:828(1994)。
ICE mRNAは種々の組織で検出され、そのような組織として、末梢血液単球、末
梢血液リンパ球、末梢血液好中球、休止または活性化された末梢血液Ｔリンパ球
、胎盤、Ｂリンパ芽球株CB23、および単球白血病細胞株THP-1細胞(Cerreti、D.P
.、ら、Science、256:97-100(1992))が挙げられる。このことは、ICEがpro-IL-1
βに加えてさらなる基質を有し得ることを示唆する。ICEが作用し、細胞死を起
こす基質は、現在未知である。一つの可能性は、それが、C.elegansの細胞死遺
伝子ced-4の脊椎動物ホモログであり得ることである。あるいは、ICEは、細胞生
存に不可欠なタンパク質をタンパク質分解的に切断することにより、直接的に細
胞死を起こし得る。
哺乳動物遺伝子bcl-2により、細胞自己不活化からリンパ球と呼ばれる免疫細
胞を保護することが発見された。また、crmA(牛痘ウイルス遺伝子産生物)は、IC
Eのタンパク質分割能を阻害する。
本発明の１局面によれば、ICE-LAP-1および2、ならびにそのフラグメント、ア
ナログ、およびそれらの誘導体である新規の成熟ポリペプチドが提供される。本
発明のポリペプチドは、ヒト起源のものである。
本発明の別の局面によれば、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチド（DNAまたはRNA）が提供される。
本発明のさらなる局面によれば、このようなポリペプチドを組換え技術により
生成するためのプロセスが提供される。
本発明のさらなる局面によれば、このようなポリペプチド、またはこのような
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、治療目的（例えば、抗ウイルス
剤、抗腫瘍剤、ならびに胚発生および組織恒常性(homeostasis)を調節すること
として）のために利用するためのプロセスが提供される。
本発明のさらなる局面によれば、このようなポリペプチドに対する抗体が提供
される。
本発明のさらに他の局面によれば、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン
病、慢性関節リウマチ、敗血症性ショックおよび頭部傷害の処置において、この
ようなポリペプチドの作用を阻害するために用いられ得るこのようなポリペプチ
ドに対するアンタゴニスト／インヒビターが提供される。
本発明のこれらの局面および他の局面は、本明細書中の教示から当業者には明
らかであるべきである。
以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、請求の範囲に含まれる本発明
の範囲を限定することを意図しない。
図１は、ICE-LAP-1のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。示さ
れるアミノ酸配列によりコードされるポリペプチドは、ポリペプチドの推定の成
熟形態(最初のメチオニン残基を除く)であり、そしてアミノ酸に対して、標準的
な１文字略記が用いられる。
図２は、ICE-LAP-2のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。示さ
れるアミノ酸配列によりコードされるポリペプチドは、ポリペプチドの推定の成
熟形態(最初のメチオニン残基を除く)である。
図３は、ICE-LAP-1とICEとのアミノ酸配列の比較を示す。
図４は、種々のヒト組織における濃度を示すICE-LAP-1のノーザンブロット分
析を行った後のゲルを図示する。
本発明の局面によれば、図１および図２の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリ
ペプチドをコードし、またはATCC寄託番号75772および75819として寄託されたク
ローンのcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドの単離された核酸（ポリヌク
レオチド）が提供される。ATCC寄託番号75772は、ICE-LAP-1についてコードする
cDNAを包含し、およびATCC寄託番号75819は、ICE-LAP-2についてコードするcDNA
を包含する。
ICE-LAP-1をコードするポリヌクレオチドが、ヒト胎児肝臓由来のcDNAライブ
ラリーにおいて発見された。このことは、インターロイキン−１β変換酵素ファ
ミリーに、構造的に関係する。これは、約377個のアミノ酸残基のタンパク質を
コードするオープンリーディングフレームを含む。このタンパク質は、ヒトイン
ターロイキン−1β変換酵素に、アミノ酸配列全体にわたって68％の類似性およ
び53％の同一性で最も高い程度の相同性を示す。ペンタペプチドQACRGが、保存
され、アミノ酸位256-260に位置することを示す。
ICE-LAP-2をコードするポリヌクレオチドが、ヒトJurkat細胞由来のcDNAライ
ブラリーにおいて発見された。このことは、ICEファミリーに構造的に関係する
。これは、約435個のアミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディ
ングフレームを含む。このタンパク質は、マウスNedd-2タンパク質に、128個の
アミノ酸の範囲にわたって91％の同一性および94％の類似性で最も高い程度の相
同性を示す。タンパク質全体は、C.elegansの細胞死タンパク質ced-3に、400個
のアミノ酸残基にわたって約40％の同一性および60％の類似性で最も高い程度の
相同性を示す。ペンタペプチドQACRGは、保存され、アミノ位301-305に位置する
こともまた重要てある。
本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態、または、DNAの形態であり得る。DN
Aの形態は、cDNA、ゲノムDNAおよび合成DNAを包含する。DNAは二本鎖または一本
鎖であり得る。そして、一本鎖の場合、コード鎖または非コード（アンチセンス
）鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１および図２
に示すコード配列と同一であり得るか、寄託したクローンのコード配列と同一で
あり得る。あるいは、コード配列が、遺伝コードの重複または縮重の結果として
、同じ成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配列、ならびに図１および図
２のDNAまたは寄託したcDNAとして、その誘導体であり得る。
図１および図２の成熟ポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされる成
熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは；成熟ポリペプチドのコード配
列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列および付加的なコード配列（例えば、リ
ーダー配列もしくは分泌配列またはプロタンパク質配列；成熟ポリペプチドのコ
ード配列（および必要に応じて付加的なコード配列）および非コード配列（例え
ば、イントロンまたは成熟ポリペプチドのコード配列の５’および／または３’
の非コード配列）を包含し得る。
従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチ
ドのコード配列のみを含むポリヌクレオチドならびにさらなるコード配列および
/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
本発明はさらに、図１または図２の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドま
たは寄託したクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドの、フラグメント
、アナログ、および誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチドの変
異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在す
る対立遺伝子変異体またはポリヌクレオチドの非天然に存在する変異体であり得
る。
従って、本発明は、図１または図２に示すものと同じ成熟ポリペプチドまたは
その寄託したクローンのcDNAによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドの変異体を包含す
る。これらの変異体は、図１および図２のポリペプチドまたは寄託したクローン
のcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナロ
グをコードする。このようなヌクレオチド変異体は、欠失変異体、置換変異体、
および付加または挿入変異体を包含する。
本明細書中上記で示したように、ポリヌクレオチドは、図１または図２に示す
コード配列または寄託したクローンのコード配列の天然に存在する対立遺伝子変
異体であるコード配列を有し得る。当該分野で公知であるように、対立遺伝子変
異体は、ヌクレオチドの置換、欠失、または付加を有し得るポリヌクレオチド配
列の別の形態であり、これはコードされるポリペプチドの機能を実質的には変化
させない。ポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質およびさらなる5'アミノ酸
残基であるプロタンパク質をコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質は
プロタンパク質であり、そしてそれは不活性型のタンパク質である。一旦プロ配
列が切断されると、活性な成熟タンパク質が残る。
従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、またはプロ
配列を有するタンパク質もしくはプロ配列およびプレ配列（リーダー配列）の両
方を有するタンパク質をコードし得る。
本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にする
配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列は、細菌
宿主の場合にマーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製に備えるpQE-9ベク
ターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。または、例えば、マー
カー配列は、哺乳動物宿主（例えば、COS-7細胞）が使用される場合、ヘマグル
チニン（HA）タグであり得る。HAタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパ
ク質由来のエピトープに対応する（Wilson，I.ら、Cell、37:767(1984)）。
本発明はさらに、配列間に少なくとも50％および好ましくは70％の同一性が存
在する場合、本明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関
する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな
条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられ
る用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションが、配列間に少
なくとも95％および好ましくは少なくとも97％の同一性が存在する場合のみに生
じることをいう。好ましい実施態様において本明細書中上記のポリヌクレオチド
にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１および図２のcDNAまたは寄託し
たcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または
生物学的活性を保持するポリペプチドをコードする。
本明細書中でいう寄託物（１つまたは複数）は、特許手続きの目的のための微
生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項下に維持される。これら
の寄託物は、当業者に便宜上のみ提供され、そして米国特許法第112条の下で寄
託が必要とされることを容認するものではない。寄託物に含まれるポリヌクレオ
チドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、
本明細書中に参考として援用されており、そして本明細書中の配列の記載とのい
かなる矛盾の場合も制御されている。寄託物を製造し、使用し、または販売する
ためには実施許諾が必要とされ得、そしてこのような実施許諾はこれによって与
えられるわけではない。
本発明はさらに、図１および図２の推定アミノ酸配列を有する、または寄託し
たcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有するICE-LAP-1およびICE-LAP-2ポリ
ペプチド、ならびにこのようなポリペプチドのフラグメント、アナログ、および
誘導体に関する。
用語「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」は、図１および図２
のポリペプチド、または寄託したcDNAによりコードされるポリペプチドをいう場
合は、このようなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または生物学的活性
を保持するポリペプチドを意味する。そして、この場合、誘導体は増強したまた
低減した生物学的機能を有するポリペプチドを包含する。アナログは、プロタン
パク質部分の切断により活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生成し得るプロ
タンパク質を包含する。
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチド、または
合成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。
図１および図２のポリペプチド、または寄託したcDNAによりコードされるポリ
ペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログは、(i)その中で１以上のア
ミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で
置換され、そしてこのような置換されるアミノ酸残基が、遺伝コードによりコー
ドされるアミノ酸残基であり得るかまたはあり得ないフラグメント、誘導体、ま
たはアナログ、または(ii)その中で１以上のアミノ酸残基が置換基を含有するフ
ラグメント、誘導体、またはアナログ、または(iii)その中で成熟ポリペプチド
がポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール
）のような別の化合物に融合されているフラグメント、誘導体、またはアナログ
、または(iv)その中でリーダー配列または分泌配列あるいは成熟ポリペプチドま
たはプロタンパク質配列の精製に用いられる配列のようなさらなるアミノ酸が成
熟ポリペプチドに融合されるフラグメント、誘導体、またはアナログであり得る
。このようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示から
、当業者の範囲内にあると考えられる。
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態
で提供され、そして好ましくは均質に精製される。用語「単離された」は、物質
がその本来の環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）から取り出さ
れていることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然のポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然系において共存する物質
の幾らかまたは全部から分離された同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチド
は、単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、
および／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一
部であり得、そしてさらにこのようなベクターまたは組成物がその天然の環境の
一部ではないため単離され得る。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクター
を用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術によって本発明のポリペ
プチドを生成することに関する。
宿主細胞は、本発明のベクター（これは例えば、クローニングベクターまたは
発現ベクターであり得る）を用いて遺伝子操作（形質導入または形質転換または
トランスフェクト）される。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、
ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化
し、形質転換体を選択し、またはICE-LAP-1遺伝子を増幅するために適切に改変
された従来の栄養培地中で培養され得る。培養条件（例えば、温度、pHなど）は
、発現のために選択される宿主細胞で以前に使用された条件であり、そして当業
者には明らかである。
本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを生成するため
に用いられ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現す
るための種々の発現ベクターのいずれか１つ内に含まれ得る。このようなベクタ
ーは、染色体、非染色体、および合成DNA配列を包含し、例えば、SV40の誘導体
；細菌性プラスミド；ファージDNA；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラ
スミドおよびファージDNAの組み合わせに由来するベクター、ワクシニア、アデ
ノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病のようなウイルスDNAである。し
かし、宿主において複製可能で、そして存続可能である限り、任意の他のベクタ
ーが使用され得る。
適切なDNA配列は、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般に、DNA配
列は当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入され
る。このような手順および他の手順は、当業者に公知の範囲内であると考えられ
る。
発現ベクター中のDNA配列は、適切な発現制御配列（１つまたは複数）（プロ
モーター）に作動可能に連結され、mRNAの合成を指示する。このようなプロモー
ターの代表的な例としては、以下が挙げられ得る：レトロウイルス(例えば、RSV
、HIV、HTLVI、CMV、またはSV40プロモーター)由来のLTR、E.coli lacまたはtrp
、
λファージPLプロモーター、および原核細胞または真核細胞あるいはそれらのウ
イルス内で遺伝子の発現を制御することが公知である他のプロモーター。しかし
、細胞シグナル（例えばヒト-β-アクチンプロモーター）もまた、用いられ得る
。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミ
ネーターを含有し得る。ベクターはまた、遺伝子のコピー数を増幅するための適
切な配列を含み得る。
さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のため
の表現型特性（例えば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼま
たはネオマイシン耐性、またはE ．coliにおけるテトラサイクリン耐性またはア
ンピシリン耐性）を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有する。
本明細書中上記のような適切なDNA配列ならびに適切なプロモーター配列また
は制御配列を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質
を発現させるために用いられ得る。
適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る：細菌細胞（例えば、E ．coli
、Bacillus subtilis 、Streptomyces、Salmonella typhimurium）；真菌
細胞（例えば酵母）；昆虫細胞（例えば、DrosophilaおよびSf9）；動物細胞（
例えば、CHO、COS、HEK 293またはBowes黒色腫）；植物細胞など。適切な宿主の
選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると考えられる。
さらに詳細には、本発明はまた、上記で広範に記載した１つ以上の配列を含む
組換え構築物を包含する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクターま
たはウイルスベクター）を包含し、このベクターの中には本発明の配列が正方向
または逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面によれば、構築物
はさらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターを包含
する）を含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であ
り、そして購入可能である。以下のベクターが例として提供される。細菌性：pQ
E70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript
SK、pbsks、pNH8a、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3
、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核性：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pX
T1、pSG(Stratagene)；pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかし、宿
主において複製可能で、そして存続可能である限り、任意の他のプラスミドまた
はベクターも使用され得る。
プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベク
ターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子
から選択され得る。２つの適切なベクターは、pKK232-8およびpCM7である。特に
よく知られた細菌プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、-gpt、λPR、PL、およ
びtrpを含む。真核プロモーターは、CMV即時初期型、HSVチミジンキナーゼ、初
期SV40および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネ
インＩを包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者
のレベルの範囲内にある。
さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。
宿主細胞は、高等真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核細胞（例え
ば、酵母細胞）であり得るか、または宿主細胞は原核細胞（例えば、細菌細胞）
であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクシ
ョン、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションまたは
エレクトロポレーションにより達成され得る(Davis，L.、Dibner，M.、Battey,I
.、Basic Methods in Molecular Biology、1986)。
宿主細胞中の構築物は、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生する
ために、従来の方法で使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来
のペプチド合成機により合成的に生成され得る。
成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で適切なプ
ロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、このようなタンパク
質を生成するために、本発明のDNA構築物に由来するRNAを使用して用いられ得る
。原核宿主および真核宿主で使用される適切なクローニングベクターおよび発現
ベクターは、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第２版（
Cold Spring Harbor、N.Y.、1989）（この開示は、本明細書中に参考として援用
されている）に記載されている。
本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクタ
ーにエンハンサー配列を挿入することにより増大される。エンハンサーはDNAの
シス作用因子であり、通常は約10〜約300bpであり、これはプロモーターに作用
してその転写を増大させる。例としては、複製起点bp100〜270の後期側のSV40エ
ンハンサー、サイトメガロウイルスの早期プロモーターエンハンサー、複製起点
の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを包含
する。
一般に、組換え発現ベクターは、複製起点および宿主細胞の形質転換を可能と
する選択マーカー（例えば、E ．coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS ．cerevi siae
のTRP1遺伝子）および下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子に由来
するプロモーターを含有する。このようなプロモーターは、特に解糖酵素（例え
ば、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、α因子、酸性ホスファターゼ、また
は熱ショックタンパク質など）をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配
列は、翻訳開始配列および翻訳終止配列、および好ましくは翻訳されたタンパク
質を細胞周辺腔または細胞外培地へ分泌することを指示し得るリーダー配列と適
切な相内で組立てられる。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴（例えば、発
現された組換え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ末端同定ペプ
チドを含む融合タンパク質をコードし得る。
細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターと作動可能な読み
とり相で、所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を適切な翻訳開始シグナ
ルおよび翻訳終止シグナルと共に挿入することにより構築される。ベクターは、
１以上の表現型選択マーカー、ならびに、ベクターの維持を保証するため、およ
び所望により宿主内での増幅を提供するために複製起点を含有する。形質転換の
ために適切な原核宿主は、E ．coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimuri um
、ならびにPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属の種々
の種を包含するが、他の種もまた選択対象として用いられ得る。
代表的な、しかし限定しない例として、細菌の使用に有用な発現ベクターは、
周知のクローニングベクターpBR322（ATCC 37017）の遺伝エレメントを含む市販
のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌の複製起点を含有し得る。この
ような市販のベクターは、例えば、pKK223-3（Pharmacia Fine Chemicals、Upps
ala、Sweden）およびGEM1(Promega Biotec、Madison、WI、USA)を包含する。こ
れらのpBR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配
列と組み合わされる。
適切な宿主系統の形質転換および適切な細胞密度への宿主系統の増殖に続いて
、選択されたプロモーターは、適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘
導）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。
細胞は、代表的には遠心分離により収集され、物理的手段または化学的手段に
より破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。
タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音
波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方法によ
り破砕され得、このような方法は、当業者に周知である。
種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用い
られ得る。哺乳動物発現系の例は、Gluzman、Cell、23: 175(1981)に記載されて
いるサル腎臓繊維芽細胞のCOS-7株、および適合性のベクターを発現し得る他の
細胞株（例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株）を包含する。哺乳
動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ポリ
アデニル化部位、、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、
転写終止配列、および５’フランキング非転写配列を含有し得る。SV40スプライ
スおよびポリアデニル化部位に由来するDNA配列は、必要な非転写遺伝エレメン
トを提供するために使用され得る。
ICE-LAP-1およびICE-LAP-2ポリペプチドは、以下に挙げる方法により組換え細
胞培養物から回収され、そして精製され得る。これらの方法には、硫安沈殿また
はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、
リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー
、およびレクチンクロマトグラフィーが包含される。必要に応じて、タンパク質
の再折りたたみ（refolding）工程が、成熟タンパク質の配置を完全にするため
に使用され得る。最終的に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)が、最終的な精
製工程に用いられ得る。
本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物、または化学合成手順の産物
であり得るか、あるいは原核宿主または真核宿主（例えば、培養物中の細菌、酵
母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞により）から組換え技術により生成さ
れ得る。組換え産生手順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは
、グリコシル化され得るか、あるいはグリコシル化され得ない。本発明のポリペ
プチドはまた、開始メチオニンアミノ酸残基を含み得る。
ICE-LAP-1およびICE-LAP-2ポリペプチドは、異常に制御されたプログラム細胞
死を処置するために用いられ得る。異常に制御されたプログラム細胞死は、細胞
成長の異常な量によるガンの基礎的な原因であり得る。それゆえ、ICE-LAP遺伝
子は、プログラムされた細胞死に関係するので、望まれない細胞(例えば、ガン
細胞)を標的するのに用いられ得る。ICE-LAP-1およびICE-LAP-2はまた、脊椎動
物の成長および組織の恒常性(そのアポトーシス能による)を制御するのに用いら
れる。
また、プログラム細胞死は、細胞の主要な抗ウイルス防衛メカニズムの一つで
あり得るので、ICE-LAP-1およびICE-LAP-2ポリペプチドは、抑制されたプログラ
ム細胞死に打ち勝つことで、多くのウイルス感染に打ち勝つために用いられ得る
。
ICE-LAP-1およびICE-LAP-2はまた、細胞死に対するウイルス感染細胞を標的す
ることにより免疫抑制に関連する異常(例えば、AIDS)を処置するのに用いられ得
る。
本発明のポリペプチドはまた、同様の生物学的活性を有する他の分子を同定す
るために用いられ得る。これに対するスクリーニングの例は、オリゴヌクレオチ
ドプロープを合成するために公知のDNA配列を用いることによる、ICE-LAP遺伝子
のコード領域の単離を包含する。本発明の遺伝子との配列相補を有する標識オリ
ゴヌクレオチドは、ヒトcDNA、ゲノムDNA、またはmRNAのライブラリーのスクリ
ーニングに用いられ、ライブラリーの内のどのメンバーとプロープがハイブリダ
イズするかを決定する。
このポリペプチドはまた、本発明に従って、インビボでのこのようなポリペプ
チドの発現により使用され得る。これはしばしば「遺伝子治療」と呼ばれる。
従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド(DNAまたはRNA)を用いてエキソビボで操作され得、次いで、操作された細
胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。このような方法は当
該分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNA
を含有するレトロウイルス粒子の使用により、当該分野で公知の手順によって操
作され得る。
同様に、細胞は、インビボでのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分
野で公知の手順によりインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発
明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子を産生するた
めの産生細胞は、インビボで細胞を操作するためおよびインビボでのポリペプチ
ドの発現のために患者に投与され得る。このような方法により本発明のポリペプ
チドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者
には明らかである。例えば、細胞を操作するための発現ベヒクル(vehicle)は、
レトロウイルス以外のもの（例えば、アデノウイルス）であり得る。これは、適
切な送達ベヒクルと組み合わせた後インビボで細胞を操作するために使用され得
る。
本発明のポリペプチドは、適切な薬学的キャリアと組み合わせて用いられ得る
。このような組成物は、治療有効量のポリペプチド、および薬学的に受容可能な
キャリアまたは賦形剤を包含する。このようなキャリアとしては、生理食塩液、
緩衝化生理食塩液、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそ
れらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。処方は、投与の態様
に合わせるべきである。
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分で満たされた１つ以上
の容器を含有する薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器は、薬
剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関により規定
された形式の通知と関連し得、この通知はヒトへの投与についての製造、使用、
または販売における政府機関による認可を反映する。さらに、本発明のポリペプ
チドは、他の治療用化合物と併用して用いられ得る。
薬学的組成物は、静脈内、腹腔内、筋内、皮下、鼻腔内または皮内経路による
ような、都合の良い方法で投与され得る。ICE-LAP-1およびICE-LAP-2は、特異的
な症候の処置および／または予防に対して有効である量で投与される。一般に、
ICE-LAP-1およびICE-LAP-2は、例えば少なくとも約10μg/kg体重の量で投与され
、そしてほとんどの場合、１日当たり８mg/kg体重を超過しない量で投与される
。ほとんどの場合、投与経路、症状などを考慮して、用量は毎日約10μg/kg体重
〜約１mg/kg体重である。
本発明の配列はまた、染色体の同定に有益であり得る。この配列は、個々のヒ
ト染色体上の特定の位置を特異的に標的化し、そしてその位置でハイブリダイズ
し得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要がある。現在、染
色***置の標識に利用可能な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標
識試薬はほとんどない。本発明によるDNAの染色体へのDNAのマッピングは、これ
らの配列と疾患に関する遺伝子との相関において重要な、第１歩である。
簡略に述べれば、配列は、cDNAからPCRプライマー（好ましくは15〜25bp）を
調製することにより染色体にマップされ得る。cDNAのコンピューター解析が、ゲ
ノムDNA内で１つより多いエキソンにまたがらず、従って増幅プロセスを複雑化
しないプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライ
マーは、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニング
に使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが
増幅フラグメントを生じる。
体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の染色体に特定のDNAを割り当て
るための迅速な手順である。本発明を同じオリゴヌクレオチドプライマーと共に
使用して、特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは類似の様式の大きな
ゲノムクローンのプールを用いて部分的位置決め(sublocalization)が達成され
得る。染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピング戦略は、イ
ンサイチュハイブリダイゼーション、標識したフローサイトメトリーで選別した
（flow-sorted）染色体を用いるプレスクリーニング、および染色体特異的cDNA
ライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレ選択を包含す
る。
cDNAクローンの中期染色体展開物への蛍光インサイチュハイブリダイゼーショ
ン(FISH)は、１工程で正確な染色***置を提供するために使用され得る。この技
術は、500または600塩基ほどの短いcDNAで使用され得る；しかし、2,000bpより
も大きいクローンの方が、簡便な検出に十分なシグナル強度で独特の染色***置
に結合しやすい。FISHは、ESTが由来するクローンの使用を必要とし、そしてこ
のクローンは長いほど好ましい。例えば、2,000bpが良好であり、4,000bpはより
良好であり、そして4,000bpを超える長さは、合理的な割合の時間で（a resonab
le percentage of the time）良好な結果を得るためにおそらく必ずしも必要で
ない。この技術の総説としては、Vermaら、Human Chromosomes: ａ Manual of B
asic Techniques，Pergamon Press、New York(1988)を参照のこと。
一旦配列が正確な染色***置にマップされると、染色体上での配列の物理的な
位置を遺伝的地図のデータと相関させ得る。このようなデータは、例えば、V．M
cKusick、Mendelian Inheritance in Man に見出される(Johns Hopkins Univers
ity Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能である)。次いで、同一の
染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物理的に隣
接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。
次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNAまたはゲノム配列の差異を決定する
必要がある。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが正常な個体
には観察されない場合、この変異は疾患の原因因子であると思われる。
物理的マッピングおよび遺伝的マッピング技術の現在の解像度では、疾患に関
する染色体領域に正確に位置決めされたcDNAは、50と500との間の潜在的原因遺
伝子の１つであり得る。（これは、１メガ塩基のマッピング解像度で、そして20
kbあたり１遺伝子と仮定する。）
このポリペプチド、そのフラグメントまたは他の誘導体、またはそれらのアナ
ログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を生成させるため
の免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体およ
びヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの産物を
包含する。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメント
の生成のために使用され得る。
本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、動物へのポ
リペプチドの直接注射により、または動物へのポリペプチドの投与により得られ
得る。この動物は、好ましくはヒトではない。次いで、このようにして得られた
抗体は、ポリペプチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグ
メントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体に結合する抗体
を生成するために使用され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチド
を発現する組織からそのポリペプチドを単離するために使用され得る。
モノクローナル抗体の調製のために、連続的な細胞株培養により産生される抗
体を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術（Ko
hlerおよびMilstein、1975、Nature、256: 495-497）、トリオーマ技術、ヒトＢ
細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら、1983、Immunology Today 4:72）、および
ヒトモノクローナル抗体を生成するためのEBVハイブリドーマ技術（Coleら、198
5、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R．Liss，Inc.、77-96頁
）が挙げられる。
単鎖抗体を生成するために記載された技術（米国特許第4,946,778号）を、本
発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するために適合させ得
る。
本発明はまた、宿主から得られたサンプル（例えば、血液、尿、または血清サ
ンプル）中の、ICE-LAP-1およびICE-LAP-2のレベルを検出する診断アッセイに関
する。ICE-LAP-1およびICE-LAP-2のレベルは、例えば、当該分野で公知の手順に
よるイムノアッセイ技術により検出され得る。このようなアッセイの例は、ICE-
LAP-1およびICE-LAP-2抗原に特異の二つの抗体、好ましくは、抗体の一つが、標
識される（例えば、指示酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）のような
適切な標識を結合させることにより）モノクローナル抗体を利用するサンドイッ
チアッセイであり、非標識抗体は、好ましくは固体支持体上にある。抗原が存在
する場合、抗原は、両方の抗体に結合する。ペルオキシダーゼ結合抗体の抗原へ
の結合の後、ペルオキシダーゼは、測定可能で、その濃度がサンプル中の抗原の
量に関係する着色産生物を生成させるために用いられ得る。酵素の触媒性質によ
り、系はシグナルを非常に増幅する。ICE-LAP-1およびICE-LAP-2の変化したレベ
ルは、上記の特定の疾患を指示する。
本発明はまた、本発明のポリペプチドのアンタゴニスト/インヒビターに関す
る。アンタゴニスト/インヒビターは、ポリペプチドの機能を減少または排除す
るために使用され得る。
アンタゴニストの例は、抗体であり、またはいくつかの場合では、ICE-LAP-1
およびICE-LAP-2ポリペプチドに結合するオリゴヌクレオチドである。インヒビ
ターの例は小分子であり、この小分子は、ポリペプチドの触媒部位に結合してこ
れを塞ぎ、それにより触媒部位を基質に接近不能にし、その結果正常な生物学的
活性が妨害される。小分子の例は、小ペプチドまたはペプチド様分子を包含する
が、それらに限定されない。
インビボでの、ICE-LAP-1およびICE-LAP-2のレベルは、アンチセンス技術の使
用による、インビボでのICE-LAP-1およびICE-LAP-2の産生を阻害するアンチセン
ス構築物の投与により減少し得る。アンチセンス技術は、３重ヘリックスの形成
あるいはアンチセンスDNAまたはアンチセンスRNAを介して遺伝子発現を制御する
ために使用され得る。これらの方法は両方とも、DNAまたはRNAへのポリヌクレオ
チドの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌク
レオチド配列の５'コード部分が、約10塩基対〜40塩基対の長さのアンチセンスR
NAオリゴヌクレオチドを設計するために使用される。DNAオリゴヌクレオチドは
、転写に関わる遺伝子の領域に相補的であるように設計され（３重ヘリックス−
Leeら、Nucl．Acids Res.、6:3073(1979)；Cooneyら、Science、241:456(1988)
；およびDervanら、Science、251:1360(1991)を参照のこと）、その結果ICE-LAP
-1およびICE-LAP-2ポリペプチドの転写および生成を防ぐ。アンチセンスRNAオリ
ゴヌクレオチドは、インビボでmRNAにハイブリダイズし、そしてICE-LAP-1およ
びICE-LAP-2ポリペプチドへのmRNA分子の翻訳をブロックする（アンチセンス−O
kano、J．Neurochem.、56:560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense In
hibitors of Gene Expression、CRC Press、Boca Raton、FL(1988)を参照のこと
）。
アンタゴニスト／インヒビターは、心血管症、卒中、外傷、および他の退行性
疾患（ICE-LAP-1およびICE-LAP-2の異常な調制が、病理的細胞死、例えば、免疫
抑制関係疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、慢性関節リウマチを起こし
得る場合）に関係する非プログラム壊死性細胞死を処置するのに用いられ得る。
アンタゴニスト／インヒビターはまた、肺および気管、中枢神経系、目およ
び耳、関節、骨、心血管系、ならびに胃腸系および泌尿系の免疫に基づく疾患を
処置するのに用いられ得る。アンタゴニスト／インヒビターは、薬学的に受容可
能なキャリア（例えば、本明細書中上記）との組成物において用いられ得る。
本発明は、さらに、本発明のICE-LAP-1およびICE-LAP-2ポリペプチドのアンタ
ゴニスト／インヒビターまたはアゴニストを同定するための分子をスクリーニン
グするプロセスに関する。アゴニストは、ICE-LAP-1およびICE-LAP-2の本来の生
物学的機能を増加させるが、一方、アンタゴニストは、このような機能を減少さ
せまた除去する。このようなアッセイの例は、基質への作用を可能にし、そして
これらの化合物が、ICE-LAP-1およびICE-LAP-2が基質を切断することを妨げるか
、または切断を促進するかどうかを決定する条件下で、ICE-LAP-1およびICE-LAP
-2、ならびに潜在的なアンタゴニスト化合物またはアゴニスト化合物とそれらの
自然基質との組み合わせを包含する。
本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載する；しかし、本発明はこのよ
うな実施例に限定されないことを理解されたい。すべての部または量は、他に明
記しない限り重量基準である。
以下の実施例の理解を容易にするために、現れる頻度の高い特定の方法および
／または用語を記載する。
「プラスミド」は、小文字のｐの前および／または後の大文字および／または
数字により示される。本明細書中の出発プラスミドは、市販であるか、制限基準
なく公的に入手可能であるか、または公表された手順に従って入手可能なプラス
ミドから構築され得るかのいずれかである。さらに、記載されるプラスミドと等
価なプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者には明らかである。
DNAの「消化」は、DNA中の特定の配列でのみ作用する制限酵素でそのDNAを触
媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、市
販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者
に公知のものが使用された。分析目的には、代表的には１μgのプラスミドまた
はDNAフラグメントを、約２単位の酵素とともに約20μlの緩衝溶液中で使用する
。プラスミド構築のためのDNAフラグメントを単離する目的のために、代表的に
は
５〜50μgのDNAを20〜250単位の酵素で、より大きな容量中で消化する。特定の
制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。37℃
での約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、これは供給者の説
明書に従って変化し得る。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気
泳動して所望のフラグメントを単離する。
切断されたフラグメントのサイズ分離は、Goeddel，D.ら、Nucleic Acids Res
.、8:4057(1980)により記載された８％ポリアクリルアミドゲル、またはアガロ
ースゲル（0.5〜1.5％）を使用して行われる。
「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相
補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成さ
れ得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、５'リン酸を有さず、従ってキ
ナーゼの存在下でリン酸とATPとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドに連
結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに
連結する。
「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形
成するプロセスをいう(Maniatis，T.ら、前出、146頁)。他に提供しない限り、
連結は、ほぼ等モル量の連結されるべきDNAフラグメント0.5μgあたり10単位のT
4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）とともに、公知の緩衝液および条件を用いて達
成され得る。
他に記載しない限り、形質転換はGraham，F.およびVan der Eb，A.、Virology
、52:456-457(1973)の方法に記載されるように行った。
実施例１ COS 細胞における組み換えICE-LAP-1の発現
発現プラスミド（ICE-LAP-1 HA）は、以下を含むベクターpcDNAI/Amp（Invitr
ogen）に由来する：１)SV40複製開始点、２)アンピシリン耐性遺伝子、３)E.col
i複製開始点、４)CMVプロモーター、それに続くポリリンカー領域、SV40イント
ロンおよびポリアデニル化部位。全ICE-LAP-1前駆体およびその３'末端にインフ
レームに融合したHAタグをコードするDNAフラグメントを、ベクターのポリリン
カー領域にクローン化した。従って、組み換えタンパク質発現は、CMVプロモー
ター下の支配を受ける。HAタグは、前記のインフルエンザヘマグルチニンタンパ
ク質由来のエピトープに対応する（I．Wilson、H．Niman、R．Heighten、A．Che
renson、M．Connolly、およびR．Lerner、1984、Cell 37、767）。本発明者の標
的タンパク質に対するHAタグの融合は、HAエピトープを認識する抗体と共に、組
換えタンパク質の容易な検出を可能にする。
プラスミド構成方法は、以下の通りである：
ICE-LAP-1（ATCC # 75772）をコードするDNA配列を２つのプライマーを用いて
、全長のICE-LAP-1上のPCRにより構築した：５'プライマ-配列（5'-GTTCACTATGG
CAGAAGGCAAGGACAG-3'）は、ICE-LAP-1翻訳開始部位ATG、続いて開始コドンから
始まるICE-LAP-1コード配列の17ヌクレオチドを含有する；３'配列5'-AATCAAGCG
TAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAATTGCCAGGAAAGAGGTAGAAA-3'は、翻訳停止コドン、HAタ
グおよびICE-LAP-1コード配列の最後の28ヌクレオチド（停止コドンを含まない
）を含有する。従って、PCR産物は、インフレームに融合したHAタグを伴うICE-L
AP-1コード配列、およびHAタグに隣接する翻訳終了停止コドンを含有する。PCR
増幅DNAフラグメントを、平滑端連結によりpcDNAI/Ampと連結した。連結混合物
を、E.coli株SURE（Stratagene Cloning Systems、11099 North Torrey Pines R
oad、La Jolla、CA 92037から入手可能）に形質転換した。形質転換培養物をア
ンピシリン培地プレート上に塗布して、そして耐性コロニーを選択した。プラス
ミドDNAを、形質転換体から単離し、そして正しいフラグメントの存在に対する
制限分析により試験した。組換えICE-LAP-1の発現のために、COS細胞を、DEAEデ
キストラン法により発現ベクターを用いてトランスフェクトした（J．Sambrook
、E．Fritsch、T．Maniatis、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold
Spring Laboratory Press、(1988)）。ICE-LAP-1 HAタンパク質の発現を、放射
性標識法および免疫沈降法により検出した（E．Harlow、D．Lane、Antibodies：
A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、(1989)）。細胞
質を、トランスフェクションの２日後に35S-システインで８時間標識した。次い
で培養培地を採集し、そして細胞を界面活性剤で溶解した（RIPA緩衝液（150mM
NaCl、１％ NP-40、0.1％ SDS、１％ NP-40、0.5％ DOC、50mM Tris、pH 7.5）
）。
（Wilson,I.ら、前出37：767(1984)）。細胞溶解産物および培養培地の両方を、
HA特異的モノクローナル抗体で沈澱させた。沈澱したタンパク質を、15％SDS-PA
GEゲルで分析した。
実施例２ COS 細胞における組み換えICE-LAP-2の発現
発現プラスミド（ICE-LAP-2 HA）は、以下を含むベクターpcDNAI/Amp（Invitr
ogen）に由来する：１)SV40複製開始点、２)アンピシリン耐性遺伝子、３)E.col
i複製開始点、４)CMVプロモーター、それに続くポリリンカー領域、SV40イント
ロンおよびポリアデニル化部位。全ICE-LAP-2前駆体およびその３'末端にインフ
レームに融合したHAタグをコードするDNAフラグメントを、ベクターのポリリン
カー領域にクローン化した。従って、組み換えタンパク質発現は、CMVプロモー
ター下の支配を受ける。HAタグは、前記のインフルエンザヘマグルチニンタンパ
ク質由来のエピトープに対応する（I．Wilson、H．Niman、R．Heighten、A．Che
renson、M．Connolly、およびR．Lerner、1984、Cell 37、767）。本発明者の標
的タンパク質に対するHAタグの融合は、HAエピトープを認識する抗体と共に、組
換えタンパク質の容易な検出を可能にする。
プラスミド構成方法は、以下の通りである：
ICE-LAP-2(ATCC # 75819)をコードするDNA配列を、２つのプライマーを用いて
、全長のICE-LAP-2上のPCRにより構築した：５'プライマー（5'-AGCTGATGGCCGCT
GACAGGGG-3'）は、ICE-LAP-2翻訳開始部位(ATG)、続いて開始コドンから始まるI
CE-LAP-2コード配列の14ヌクレオチドを含有する；３'配列（5’AATCAAGCGTAGTC
TGGGACGTCGTATGGGTATGTGGGAGGGTGTCCTGGGA 3'）は、翻訳停止コドン、HAタグお
よびICE-LAP-2コード配列の最後の20ヌクレオチド（停止コドンを含まない）を
含有する。従って、PCR産物は、インフレームに融合したHAタグを伴うICE-LAP-2
コード配列、HAタグに隣接する翻訳終了停止コドンを含有する。PCR増幅DNAフラ
グメントを、平滑端連結によるpcDNAI/Ampと連結した。連結混合物を、E.coli株
SURE（Stratagene Cloning Systems、11099 North Torrey Pines Road、La Joll
a、CA 92037から入手可能）に形質転換した。形質転換培養物をアンピシリン培
地プ
レート上に塗布し、そして耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを、形質転
換体から単離し、そして正しいフラグメントの存在に対する制限分析により試験
した。組換えICE-LAP-2の発現のために、COS細胞を、DEAEデキストラン法により
発現ベクターを用いてトランスフェクトした（J．Sambrook、E．Fritsch、T．Ma
niatis、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Laboratory P
ress、(1989)）。ICE-LAP-2 HAタンパク質の発現を、放財性標識法および免疫沈
降法により検出した（E．Harlow、D．Lane、Antibodies：A Laboratory Manual
、Cold Spring Harbor Laboratory Press、(1988)）。細胞を、トランスフェク
ションの２日後に35S-システインで８時間標識した。次いで培養培地を採集し、
そして細胞を界面活性剤で溶解した（RIPA緩衝液（150mM NaCl、１％ NP-40、0.
1％ SDS、１％ NP-40、0.5％ DOC、50mM Tris、pH 7.5））。(Wilson,I.ら、前
出 37：767(1984)）。細胞溶解物および培養培地の両方を、HA特異的モノクロー
ナル抗体で沈澱させた。沈澱したタンパク質を、15％SDS-PAGEゲルで分析した。
実施例３ ヒト組織におけるICE-LAP-1の発現パターン
ノーザンブロット分析を行い、ヒト組織におけるICE-LAP-1の発現レベルを試
験した。細胞の全RNAサンプルを、RNAzolTMBシステム（Biotecx Laboratories,I
nc.6023 South Loop East、Houston、TX 77033）で単離した。指示された各ヒト
組織から単離された、約10μgの全RNAを１％アガロースゲルで分離し、そしてナ
イロンフィルター上でブロットした。（Sambrook、Fritsch、およびManiatis、M
olecular Cloning、Cold Spring Harbor Press、(1989)）。標識反応を、50ngの
DNAフラグメントを用いてStratagene Prime-Itキットに従って行った。標識され
たDNAを、Select-G-50カラムで精製した。（5Prime−3Prime,Inc．5603 Arapaho
e Road、Boulder、CO 80303）。次いで、フィルターを、放射能標識された全長
のICE-LAP-1遺伝子を用いて、0.5M NaPO4(pH7.4)および７％SDS中、1,000,000cp
m/mlで一晩65℃で、ハイブリダイズした。0.5×SSCで、0.1％SDSを用いて、室温
で２回、そして60℃で２回洗浄した後、次いでフィルターを、-70℃で増強スク
リーン(intensifying screen)とともに一晩曝した。ICE-LAP-1に対するメッセ
ージRNAは、肝臓において多量である。（図５）。
実施例４ ヒト組織におけるICE-LAP-2の発現パターン
ノーザンブロット分析を行い、ヒト組織におけるICE-LAP-2の発現レベルを試
験した。細胞の全RNAサンプルを、RNAzolTMBシステム（Biotecx Laboratories,I
nc.6023 South Loop EaSt、Houston、TX 77033）で単離した。指示された各ヒト
組織から単離された、約10μgの全RNAを１％アガロースゲルで分離し、そしてナ
イロンフィルター上でブロットした。（Sambrook、Fritsch、およびManiatis、M
olecular Cloning、Cold Spring Harbor Press、(1989)）。標識反応を、50ngの
DNAフラグメントを用いてStratagene Prime-Itキットに従って行った。標識され
たDNAを、Select-G-50カラムで精製した。（5Prime−3Prime,Inc．5603 Arapaho
e Road、Boulder、CO 80303）。次いで、フィルターを、放射能標識された全長
のICE-LAP-2遺伝子を用いて、0.5M NaPO4(pH7.4)および７％SDS中、1,000,000cp
m/mlで一晩65℃で、ハイブリダイズした。0.5×SSCで、0.1％SDSを用いて、室温
で２回、そして60℃で２回洗浄した後、次いでフィルターを、-70℃で増強スク
リーンとともに一晩曝した。
本発明の多くの改変および変化は、上記の教示に照らして、可能であり、従っ
て、添付の請求の範囲内で、本発明は、具体的に記載される以外にも実施し得る
。
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(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
// Ｃ１２Ｐ 21/08 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ
Ｃ１２Ｑ 1/68 9735−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
(Ｃ１２Ｎ 9/64
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(72)発明者 ローゼン， クレイグ エイ.
アメリカ合衆国 メリーランド 20882,
レイトンズビル，ローリング ヒル ロ
ード 22400
(72)発明者 ハスティングス， グレッグ エイ.
アメリカ合衆国 メリーランド 20850,
ロックビル，ゲイブル リッジ テラス
9913， アパートメント エイチ
(72)発明者 ハドソン， ピーター エル.
アメリカ合衆国 メリーランド 20874,
ジャーマンタウン，ハイストリーム ド
ライブ 19041
(72)発明者 カークネス， エウェン エフ.
アメリカ合衆国 ワシントン ディーシー
20008，キャセドラル アベニュー
2301， アパートメント 406