ES2203618T3 - Procedimiento de purificacion de una solucion acuosa de albumina bruta. - Google Patents
Procedimiento de purificacion de una solucion acuosa de albumina bruta.Info
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Abstract
PROCESO DE PURIFICACION DE UNA SOLUCION ACUOSA DE ALBUMINA BRUTA EN LA QUE SE FIJAN PROTEINAS CONTAMINANTES POR CROMATOGRAFIA SOBRE UNA FASE ESTACIONARIA SOLIDA, PREFERENTEMENTE PARTICULAR, ESTANDO LA SOLUCION DE ALBUMINA PURIFICADA RECOGIDA COMO EFLUENTE, EN EL QUE SE UTILIZA COMO FASE ESTACIONARIA UNA FASE NEUTRA CARGADA CON AL MENOS UN COMPUESTO ELEGIDO EN EL GRUPO FORMADO POR LOS COMPUESTOS QUE COMPRENDE RADICALES ALKILO C3 A C8 Y LOS COMPUESTOS QUE COMPRENDE GRUPOS SULFATO.
Description
Procedimiento de purificación de una solución
acuosa de albúmina bruta.
El invento se refiere a un procedimiento de
purificación de una disolución acuosa de albúmina bruta.
La disolución puede ser cualquier disolución
acuosa de albúmina bruta. Más particularmente una disolución de
albúmina obtenida a partir del plasma sanguíneo de un mamífero tal
como bovino, caballo, cerdo, oveja o conejo, y, preferiblemente, una
disolución obtenida a partir del plasma humano.
Es bien conocido como separar a partir de la
sangre, mediante centrifugación, por una parte, los glóbulos y, por
otra parte, el plasma sanguíneo. Se sabe después de muchos años que
el plasma contiene, además de la albúmina que constituye la mayor
parte de las materias disueltas, toda una serie de otras moléculas,
en particular proteínas, cuya extracción es particularmente
interesante habida cuenta de sus utilizaciones terapéuticas. Se han
propuesto por tanto, procedimientos de precipitación fraccionada
mediante un agente de precipitación a pHs, fuerzas iónicas y
temperaturas variables. El método mas ampliamente utilizado en el
momento actual es el de Cohn (véase COHN J. y otros J. Am Chem.
Soc. 72,465-474/1950) o variantes de este método en
las que el agente de precipitación utilizado es etanol. Según dicho
método de Cohn, el plasma se enfría a -30ºC luego se recalienta a
+2ºC, de lo que resulta un crioprecipitado que contiene el factor
VIII antihemofílico, el fibrinógeno y la fibronectina. El
sobrenadante, llamado "sobrenadante I" se separa del
precipitado anteriormente mencionado; se disminuye su pH a 5,85
\pm 0,05 y se añade etanol hasta que la concentración etanólica
sea de 19% en volumen, la temperatura disminuye, a medida que se
añade etanol, hasta -5ºC. Se obtiene así un precipitado, llamado
"precipitado (II + III)", que contiene, en particular,
gammaglobulinas y un sobrenadante, llamado "sobrenadante
(II+III)" que contiene albúmina e impurezas. Se recoge el
sobrenadante obtenido de ese modo y se aumenta la tasa de alcohol
hasta obtener una concentración etanólica de 40% en volumen, la
temperatura disminuye hasta alrededor de -8ºC. Se obtiene de ese
modo un precipitado, llamado "precipitado IV", y un
sobrenadante, llamado "sobrenadante IV" que contiene albúmina
en un grado de pureza de alrededor de 94 a 97% en peso de
proteínas. El sobrenadante IV sirve de materialprima para las
disoluciones de albúmina deseadas, pero contiene una gran cantidad
de etanol; según una técnica previa se puede dializar directamente
el sobrenadante IV frente a suero fisiológico, pero hace falta
entonces utilizar una gran cantidad de agua y el procedimiento es
por tanto lento y costoso; según otra técnica, se disminuye el pH
del sobrenadante IV hasta 4,80 \pm 0,05 lo que hace precipitar la
albúmina: se separa este precipitado, llamado "precipitado V",
y se vuelve a poner en disolución en suero fisiológico, el resto
del etanol se extrae mediante diálisis.
Para completar la purificación de albúmina, se ha
propuesto utilizar técnicas cromatográficas, en particular de
intercambio de iones (véase en particular Curling J. M., Methods of
Plasma Protein Fractionation, ed. J. Curling, Acad. Press,
77-91 (1980); Tayot J.L. y otros, Methods of Plasma
Protein Fractionation, ed. J. Curling, Acad. Press,
149-160 (1980); Saint-Blancard J.,
Nouveaux échangeurs d'ions Trisacryl, Ann. Pharm. Fr. 39,
403-409 (1981)). El principio de estos métodos es
fijar la albúmina sobre un soporte específico, en función del pH y
de la fuerza iónica, y eliminar de ese modo en el efluente ciertas
impurezas que se encuentran en la disolución de albúmina tratada
mediante cromatografía. Desgraciadamente, aunque estas técnicas
permiten mejorar de manera sensible la calidad de las disoluciones
de albúmina obtenidas, por el contrario, son difíciles de poner en
marcha y costosas. En efecto, las disoluciones de albúmina tratadas
contienen aproximadamente 4% de diversas impurezas para extraer.
Dado que se fija la albúmina sobre el relleno de la columna de
cromatografía, hace falta fijar el 96% de la materia tratada y como
la fijación de albúmina por gramo de relleno es limitada, del orden
de tamaño de aproximadamente 10 mg, esto implica la puesta en marcha
de un volumen muy grande de lecho de relleno dentro de las
columnas. Dado que el relleno es muy voluminoso, la puesta en
marcha exige una gran cantidad de agua para asegurar por una parte,
el preequilibrado de la columna y por otra parte, el paso del
producto por la columna; además, la naturaleza de los rellenos
utilizados exigen generalmente, para el preequilibrado, la
utilización de tampones especiales. Por otra parte, cuando la
albúmina ha sido retenida en el lecho de relleno, hace falta, para
recuperarla, proceder a su elución de la columna por medio de
disoluciones tampón apropiadas, de modo que la albúmina se encuentre
enseguida mezclada en estos tampones y que convenga volver a
dializar las disoluciones de albúmina para hacer desaparecer las
sales de las disoluciones tampón y obtener finalmente un producto
inyectable.
Es igualmente conocido por ejemplo por el
documento de patente europea EP-A 0 367 220, el
separar las impurezas mediante el paso sobre una columna de
DEAE-SEPHADEX o sobre una columna de SEFAROSA 4B
activada mediante bromuro de cianógeno sobre la cual se fijan
anticuerpos específicos, las impurezas tales como la haptoglobina y
\alpha1-AGP se fijan sobre la columna y el
efluente está constituido por la albúmina purificada. Este tipo de
cromatografía es ventajosa ya que, en primer lugar, sólo las
impurezas deben quedar retenidas sobre la columna de cromatografía,
lo que permite utilizar lechos de relleno de volumen reducido; en
segundo lugar, el volumen del efluente que contiene la albúmina es
igualmente reducido, en efecto, es del orden del volumen de carga
inicial; en tercer lugar, el preequilibrado de las columnas no
necesita de ese modo mas que cantidades de líquido reducidas; en
cuarto lugar, no hay que lavar los lechos de relleno de modo
preventivo completo para la recuperación de la albúmina y en
quinto lugar, basta con regenerar las columnas de cromatografía por
un simple lavado, sin necesidad de grandes precauciones en lo que
respecta a los métodos de lavado. Pero la albúmina obtenida puede
formar aún, al calentarse cantidades muy importantes de
polímeros.
El presente invento tiene por objeto un
procedimiento de purificación en el cual se fijan las impurezas
mediante cromatografía, el efluente está constituido por una
disolución de albúmina que permite obtener una albúmina muy pura,
que no forma prácticamente polímeros al calentarse.
El presente invento se refiere a un procedimiento
de purificación de una disolución acuosa de albúmina bruta en el
que se fijan proteínas contaminantes mediante cromatografía sobre
una fase estacionaria
sólida, la disolución de albúmina purificada se recoge como efluente, caracterizado por el hecho de que se elige como fase estacionaria, una fase neutra o próxima a la neutralidad que contiene al menos un compuesto elegido del grupo formado por los compuestos que llevan radicales alquilo C3-C8 y los compuestos que llevan grupos sulfato.
sólida, la disolución de albúmina purificada se recoge como efluente, caracterizado por el hecho de que se elige como fase estacionaria, una fase neutra o próxima a la neutralidad que contiene al menos un compuesto elegido del grupo formado por los compuestos que llevan radicales alquilo C3-C8 y los compuestos que llevan grupos sulfato.
La fase estacionaria sólida puede estar bajo la
forma de fibras o de membranas; está, preferiblemente, constituida
por un material en partículas neutro, es decir, generalmente
considerado como neutro en cromatografía, cuyas partículas tienen
una dimensión media inferior a 2 mm, preferiblemente comprendida
entre 1 \mum y 2 mm. En este caso, la cromatografía se efectúa
sobre al menos una columna.
La disolución acuosa bruta de albúmina es,
preferiblemente, una disolución obtenida a partir de plasma
sanguíneo en particular humano mediante un método conocido de tipo
COHN, según el cual se fracciona dicho plasma mediante tratamientos
sucesivos por modificación de la temperatura y por acción de un
agente de precipitación para obtener, después de la separación al
menos parcial de los factores VIII y IX y
\gamma-globulinas, disoluciones de albúmina para
extraer el agente de precipitación y recoger la disolución de
albúmina bruta:
La disolución acuosa bruta de albúmina tiene,
ventajosamente, una concentración en albúmina bruta comprendida
entre 1 g y 300 g por litro y a un pH comprendido entre 6 y 8,
preferiblemente entre 6,9 y 7,1.
El compuesto que lleva los radicales alquilo
C3-C8, que carga la fase estacionaria, es
preferiblemente, un radical butilo. El lecho de relleno de
la(s) columna(s) de cromatografía está por tanto
constituido en particular por el producto comercializado por la
sociedad "MERCK" bajo la denominación comercial "FRACTOGEL
TSK-BUTYL-650".
El compuesto que lleva los grupos sulfato que
carga la fase estacionaria es, preferiblemente, un dextransulfato.
El lecho de relleno de la(s) columna(s) de
cromatografía está constituida en particular por el producto
comercializado bajo la denominación "DEXTRAN BEADS SULFATED"
por la sociedad "SIGMA".
Según el presente invento, se hace
preferiblemente, experimentar a la disolución acuosa bruta de
albúmina al menos dos cromatografías, siendo al menos una
cromatografía en fase estacionaria que contiene un compuesto que
lleva radicales alquilo C3-C8 y siendo al menos
otra una cromatografía en fase estacionara que contiene un
compuesto que lleva grupos sulfato.
De modo ventajoso, se somete a la disolución
acuosa bruta de albúmina a una cromatografía en fase estacionaria
que contiene un compuesto que lleva grupos sulfato, antes y después
de una cromatografía en fase estacionaria que contiene un compuesto
que lleva radicales alquilo C3-C8 o inversamente a
una cromatografía en fase estacionaria que contiene un compuesto
que lleva los radicales alquilo C3-C8 antes y
después de una cromatografía en fase estacionaria que contiene
grupos sulfato.
Se puede, ventajosamente, utilizar directamente
los efluentes de una primera cromatografía para alimentar la
cromatografía siguiente. La temperatura de la cromatografía es de 1
a 30ºC. El caudal de cromatografía en columnas está comprendido
generalmente entre 1 y 30 cm/hora.
Si fuera necesario, se ajusta el pH de la
disolución acuosa de albúmina obtenida como efluente final de
cromatografía a un valor comprendido entre 6,9 y 7,1, después se la
somete a una filtración esteril, para responder a las necesidades
reglamentarias de la Farmacopea europea.
Antes de someter una disolución acuosa de
albúmina a una cromatografía en fase estacionaria que contiene un
compuesto que lleva radicales alquilo C3-C8, se
equilibra(n) la (las) columna(s)
correspondiente(s) con una disolución acuosa salina que
tiene al menos 10 veces la fuerza iónica de la disolución acuosa de
albúmina. Del mismo modo, antes de someter a una disolución acuosa
de albúmina a una cromatografía en fase estacionaria que contiene
un compuestos que tiene grupo sulfato, se equilibra la (las)
columna(s) correspondiente(s) con una disolución
salina a lo sumo isotónica con respecto a la disolución de albúmina.
Preferiblemente, se utiliza para el equilibrado de las(s)
columna(s) de cromatografía una disolución de cloruro de
sodio o un tamón fosfato salino (PBS).
En el modo preferido de realización que conlleva
dos o tres cromatografías en serie, el procedimiento según el
invento no necesita ningún cambio de tampon en el transcurso de la
manipulación ni ningún cambio de pH, al efectuarse las diferentes
cromatografías en serie.
En el caso en que la disolución de albúmina
tratada es una disolución de albúmina plasmática humana preparada
mediante el procedimiento Cohn o un procedimiento derivado, la
disolución de albúmina obtenida es estable, y no forma
prácticamente polímeros al calentarse y no presenta más que una muy
ligera coloración, que corresponde a la desaparición de las trazas
de hemoglobina y del grupo hemo. Cuando se trata una disolución de
albúmina bovina por ejemplo a partir del producto "FLUKA nº
05480", la albúmina obtenida es bastante más estable que la
albúmina inicial. Por otro lado, es posible tratar las disoluciones
de albúmina inyectable descartadas (por ejemplo por turbidez o
partículas) para volverles a dar una buena estabilidad.
Para comprender mejor el objeto del invento, se
describe ahora, a título de ejemplo puramente ilustrativo y no
limitante, un modo de puesta en marcha, estando representadas las
características del producto obtenido en el dibujo anexo.
En este dibujo:
-la figura 1 representa los perfiles de
coloración después de electroforesis en acetato de celulosa para
una albúmina obtenida según el invento y una albúmina de la técnica
actual (según el método de Cohn);
-la figura 2 representa las curvas de absorción
de densidad óptica obtenidas mediante filtración en gel para una
albúmina obtenida según el invento y una albúmina de la técnica
actual (según el método de Cohn);
-la figura 3 representa el espectro de densidad
óptica obtenido para una albúmina obtenida según el invento y una
albúmina de la técnica actual (según el método de Cohn);
-la figura 4 representa la variación de la
turbidez en función del tiempo de calentamiento a 60ºC para una
albúmina obtenida según el invento y una albúmina de la técnica
actual (según el método de Cohn).
Se utiliza, como materia prima de partida, un
plasma humano fraccionado según el procedimiento
descrito por KISTLER y NITSCHMAN (Vox Sang. 7, 414-424 (1962)); este procedimiento retoma lo esencial del método de Cohn anteriormente descrito: las fracciones de partida que contienen la albúmina son, ya sea el sobrenadante IV, ya sea el precipitado V.
descrito por KISTLER y NITSCHMAN (Vox Sang. 7, 414-424 (1962)); este procedimiento retoma lo esencial del método de Cohn anteriormente descrito: las fracciones de partida que contienen la albúmina son, ya sea el sobrenadante IV, ya sea el precipitado V.
Cuando se parte del sobrenadante IV, que
comprende etanol 40% (en volumen) y a un pH de 5,85 \pm 0,05, se
diluye a la mitad el sobrenadante con una disolución de NaCl a 7
g/l. El pH se ajusta a 7,45 \pm 0,05 con una disolución de sosa
1N. Se preconcentra la albúmina hasta 90 g/l en un casete de
ultrafiltración de tipo "Omega"(Filtron) puesto en marcha en un
sistema de ultrafiltración " Minisette SS Cell NPT Cell"
(Filtron Tech. Corp.). Este casete tiene una superficie filtrante
de 0,07 m^{2} y un umbral de retención de 30 KDa. La circulación
está asegurada mediante una bomba peristáltica con una presión que
varía desde 2 x 10^{5} Pa al principio de la operación hasta
5x10^{5} Pa hacia el final. Cuando se ha logrado la concentración
de 90 g/l en albúmina, se añade a la disolución de albúmina una
disolución de NaCl a 9 g/l y se continua dializando un volumen
constante hasta obtener una tasa de etanol inferior a 0,1% en
volumen, cuando el etanol ha sido eliminado de ese modo, se
continua la diálisis para concentrar la disolución hasta 200 g de
albúmina por litro. Se ajusta el pH a 7,10 \pm 0,05 con una
disolución de ácido clorhídrico 1N.
Cuando se parte del precipitado V, se vuelve a
poner dicho precipitado en suspensión en un suero fisiológico
(disolución de NaCl a 9 g por litro) utilizando 4 litros de suero
fisiológico por kilogramo de precipitado. Se filtra para eliminar
los grumos del precipitado que no se vuelven a poner en
suspensión en el curso de la agitación; se ajusta el pH a 7,45
\pm0,05 con una disolución de sosa 1 N y se concentra la
disolución obtenida de ese modo hasta 90 g de proteína por litro
utilizando el mismo sistema de diálisis que se ha descrito
anteriormente para el sobrenadante IV. Se continúa entonces la
diálisis para concentrar la disolución hasta 200 g de proteína por
litro. Se ajusta el pH a 7,1 \pm 0,05 con una disolución de ácido
clorhídrico 1N.
La disolución de albúmina preparada de ese modo a
partir del sobrenadante IV o del precipitado V se filtra entonces
estérilmente (filtro "Millex-GS" de 0,2 micras
(Millipore)). Se obtiene de ese modo la disolución acuosa bruta de
albúmina que se tratara enseguida mediante el procedimiento según el
invento.
La disolución acuosa bruta de albúmina
experimenta primero una cromatografía en fase estacionaria que
contiene un compuesto que lleva grupos sulfato, dicha cromatografía
es en gel polisulfatado. Esta cromatografía se realiza en una
columna de 50 ml (2,5 cm x 10 cm) (Biorad), que contiene un material
en partículas vendido por la sociedad "SIGMA" bajo la
denominación comercial "DEXTRAN BEADS SULFATED". La columna se
equilibra previamente haciendo pasar en el lecho 3 volúmenes de
columna de suero fisiológico. La disolución de albúmina se envía
entonces sobre esta columna y el efluente se envía directamente
sobre una de las dos columnas de cromatografía en fase estacionaria
que contiene radicales en C3 a C8, dicha cromatografía es
hidrofóbica.
La cromatografía hidrofóbica se realiza en una
columna idéntica a la precedente, cuyo lecho de cromatografía está
constituido de un material en partículas vendido por la sociedad
MERCK bajo la denominación comercial "FRACTOGEL TSK
BUTYL-650". Antes de ser utilizada, esta columna
se equilibra haciendo pasar en el lecho de cromatografía 3 volúmenes
de columna de suero fisiológico. Cuando se ha equilibrado, la
columna de cromatografía hidrofóbica se empalma directamente en
serie sobre la salida de la columna de cromatografía en gel
polisulfatado. El equilibrado de las dos columnas puede efectuarse
igualmente en serie.
El desarrollo de la cromatografía va seguido de
la medida de la densidad óptica a 280 nm de las fracciones a la
salida de la columna. El efluente de las dos columnas de
cromatografía en serie se recupera y después se concentra mediante
diálisis a 200 g de albúmina por litro o se diluye, en suero
fisiológico, a 40 g de albúmina por litro según el uso al que se la
destine; el pH se ajusta a 7,00 \pm0,05 y el efluente se filtra
estérilmente sobre filtros "Millex-GS" de 0,2
micras (Millipore). El caudal en las dos columnas montadas en serie
es de 1 cm/hora; las cromatografías se efectúan a 20ºC. Al seguir
el desarrollo de la cromatografía, se constata que se puede cargar
hasta 400 de albúmina por litro de lecho de cromatografía en la
primera o en la segunda columna sin disminuir sensiblemente la
eficacia de la separación.
El lecho de la columna de cromatografía en gel
polisulfatado se regenera mediante un lavado con dos volúmenes de
columna de una disolución de cloruro de sodio a 2 moles por litro,
seguido por un lavado con dos volúmenes de columna de una
disolución de cloruro de sodio a 1 mol por litro, a pH 9. La
regeneración del relleno de la columna de cromatografía hidrófoba
se efectúa mediante el lavado con dos volúmenes de columna de una
disolución de sosa 0,1 N.
Se ha constatado que la capacidad de fijación de
los lechos de cromatografía no se afectaba por 40 ciclos sucesivos
de cromatografía/regeneración.
Se han evaluado ciertas características de la
albúmina obtenida mediante el procedimiento según el invento
descrito a continuación y se proporcionan a continuación los
resultados experimentales correspondientes. Se han comparado las
propiedades de la disolución acuosa de albúmina antes del paso sobre
las dos columnas de cromatografía en gel polisulfatado e
hidrofóbico y después del paso sobre estas dos columnas. La
disolución antes del paso es por tanto una albúmina de la técnica
actual y la disolución después del paso es una albúmina
cromatografiada según el invento.
Se prepara una muestra a partir de la albúmina de
la técnica actual y una muestra a partir de la albúmina preparada
según el invento. Se añade a estas muestras 10 mg de caprilato de
sodio por gramo de albúmina y se calienta la muestra a 60ºC durante
10 horas.
Se ha utilizado el método de GRABAR (Grabar P. y
otros, Biochem. Biophy. Acta, 17, 67-75 (1955)). El
antisuero total se ha preparado inmunizando un caballo con plasma
humano completo. Para la albúmina de la técnica actual, se constata
la presencia de una línea de precipitación alrededor del depósito de
los posos que corresponde a la presencia de "neoantígenos"
constituídos por proteínas desnaturalizadas; por el contrario, esta
línea de precipitación no existe para la albúmina cromatografiada
según el invento, lo que demuestra que el procedimiento según el
invento permite separar la albúmina de las proteínas contaminantes
que constituyen las impurezas.
Se han ensayado disoluciones al 5% en proteínas
como describe en el artículo ROELANDS J.F. y otros, Vox Sang., 26,
415-424 (1974). Las muestras han sido ensayadas
bajo 220 voltios durante 35 minutos con un tampón
"TRIS-VERONAL" a pH 9,2, a una fuerza iónica
de 0,05. Las membranas fueron reveladas con el colorante "PONCEAU
S" y la cuantificación fue hecha por densitometría. Las curvas
resultantes se proporcionan en la figura 1: sobre el gráfico marcado
A, se constata, al lado del pico principal P_{1} que corresponde
a la albúmina, un pico secundario P_{2} que corresponde a
impurezas, mientras que en la gráfica B que corresponde a la
albúmina según el invento, el pico P_{1} se encuentra en posición
idéntica pero el P_{2} ha desaparecido, lo que muestra la eficacia
del procedimiento de purificación según el invento.
Se utiliza una columna de "Biorad" (1,5 x 50
cm) con un relleno de "SHEPHACRYL S 400 HR" vendido por la
sociedad "PHARMACIA LKB BIOTECHNOLOGY". Esta columna se
equilibra previamente con un tampón fosfato a pH 7. Se pasan
enseguida 20 mg de albúmina de cada muestra sobre la columna
preparada; el caudal es de 1 ml por minuto. Se monitoriza la
absorción óptica a 280 nm sobre las fracciones cromatográficas (1,2
ml por fracción) por medio de un espectrofotómetro "Uvicon
810".
Las curvas experimentales obtenidas se
representan en la figura 2. La curva en trazo continuo corresponde
a la albúmina de la técnica actual y muestra, al lado del pico
P_{3} correspondiente a la albúmina, un pico P_{4}
correspondiente a impurezas contaminantes, de los polímeros. Al
contrario, la curva en trazos punteados corresponde a la albúmina
obtenida según el invento y, sobre esta curva, el pico P'_{3} muy
próximo al P_{3}, corresponde a la albúmina pero no hay pico
próximo lo que demuestra la ausencia de impurezas
contaminantes.
Se ha estudiado el espectro de densidad
óptica
entre 350 y 500 nm para una muestra de albúmina de la técnica actual y una muestra de albúmina obtenida según el invento (curvas 1 y 2 respectivamente de la figura 3). Se constata que, para la albúmina obtenida según el invento, hay una ausencia de absorción a 403 nm contrariamente a lo que pasa para la otra muestra. Se sabe que la hemoglobina absorbe a una longitud de onda lambda igual a 403 nm. Se constata por tanto que la albúmina de la técnica actual contiene trazas de hemoglobina, que no se encuentran en la albúmina obtenida según el invento; esta última tiene efectivamente un color menos intenso, aún después de calentamiento durante 10 horas a 60ºC con un aditivo de estabilización.
entre 350 y 500 nm para una muestra de albúmina de la técnica actual y una muestra de albúmina obtenida según el invento (curvas 1 y 2 respectivamente de la figura 3). Se constata que, para la albúmina obtenida según el invento, hay una ausencia de absorción a 403 nm contrariamente a lo que pasa para la otra muestra. Se sabe que la hemoglobina absorbe a una longitud de onda lambda igual a 403 nm. Se constata por tanto que la albúmina de la técnica actual contiene trazas de hemoglobina, que no se encuentran en la albúmina obtenida según el invento; esta última tiene efectivamente un color menos intenso, aún después de calentamiento durante 10 horas a 60ºC con un aditivo de estabilización.
Se ha estudiado la variación de la turbidez en
función del tiempo de calentamiento a 60ºC para la albúmina de la
técnica actual y la albúmina obtenida según el invento. Las dos
muestras han experimentado una adición del 1% en peso de caprilato
de sodio con respecto al peso de la albúmina.
La figura 4 muestra que la muestra de albúmina de
la técnica actual (curva C_{1}) tiene una turbidez, que
evoluciona lo suficientemente rápido en el transcurso del tiempo,
contrariamente a la muestra de albúmina según el procedimiento
(curva C_{2}). Esta variación de turbidez corresponde a la
formación de polímeros. Se constata por tanto que la eliminación de
los contaminantes de la albúmina conlleva la reducción de la
formación de los polímeros, que aparecen después del calentamiento
a 60ºC durante 10 horas y durante el almacenamiento prolongado de
las disoluciones de albúmina pese a la adición de los
estabilizantes tales como el caprilato de sodio. El procedimiento
de preparación según el invento conduce a una disolución de albúmina
que forma bastantes menos polímeros, lo que es particularmente
interesante en el plano
comercial.
comercial.
Claims (15)
1. Procedimiento de purificación de una
disolución acuosa de albúmina bruta en la que se fijan proteínas
contaminantes por cromatografía en fase estacionaria sólida,
recogiéndose la disolución de albúmina purificada como efluente,
caracterizado por el hecho de que se elige como fase
estacionaria una fase neutra o próxima a la neutralidad que
contiene al menos un compuesto elegido dentro del grupo formado por
los compuestos que llevan radicales alquilo C3-C8 y
los compuestos que llevan grupos sulfato.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que la fase estacionaria es un
material en particulas, neutro, cuyas partículas tienen una
dimensión media inferior a 2 mm, comprendida preferiblemente entre
1 \mum y 2 mm y que la cromatografía se efectúa empleando al
menos una columna.
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado por el hecho de que la
disolución acuosa bruta de albúmina se obtiene a partir del plasma
sanguíneo humano mediante un método conocido según el cual se
fracciona dicho plasma mediante tratamientos sucesivos por
modificación de la temperatura y por acción de un agente de
precipitación para dar como resultado, después de la separación al
menos parcial de los factores VIII y IX y las
\gamma-globulinas, disoluciones de albúmina que
contienen el agente de precipitación, que se dializan para extraer
el agente de precipitación y recoger la disolución de albúmina
bruta.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que la
disolución de albúmina que se ha de purificar tiene una
concentración de albúmina bruta comprendida entre 1 g y 300 g por
litro y tiene un pH comprendido entre 6 y 8, preferiblemente entre
6,9 y 7,1.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por el hecho de que el
compuesto que lleva radicales alquilo C3-C8 es un
compuesto que lleva radicales butilo.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por el hecho de que el
compuesto que lleva grupos sulfato es un dextran sulfato.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por el hecho de que se
somete la disolución acuosa de albúmina bruta al menos a dos
cromatografias, siendo una al menos una cromatografía en fase
estacionaria que contiene un compuesto que lleva radicales alquilo
C3-C8 y siendo al menos otra una cromatografía en
fase estacionaria que contiene un compuesto que lleva grupos
sulfato.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado por el hecho de que se somete la disolución de
albúmina bruta, primero a una (o varias) cromatografía(s) en
fase estacionaria que contienen un compuesto que lleva grupos
sulfato, y después a una (o varias) cromatografía(s) en fase
estacionaria que contiene radicales alquilo
C3-C8.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 7 u 8, caracterizada por el hecho de que se
somete la disolución acuosa bruta de albúmina a una cromatografía
en fase estacionara que contiene en compuestos que llevan radicales
alquilo C3-C8, antes y después de una cromatografía
en fase estacionaria que contiene compuestos que llevan grupos
sulfato o a la inversa.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 7 a 9, caracterizado por el hecho de que se
utiliza directamente el efluente de una primera cromatografía para
alimentar la cromatografía siguiente.
11. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por el hecho de que
el caudal de cromatografía está comprendido entre 1 y 30
cm/hora.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado por el hecho de que
la temperatura de cromatografía está comprendida entre 1 y
30ºC.
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 2 a 12, caracterizado por el hecho de que
antes de someter la disolución acuosa de albúmina bruta a una
cromatografía en fase estacionaria que contiene compuestos que
llevan radicales alquilo C3-C8, se equilibra
la(s) columna(s) correspondiente(s) con una
disolución acuosa salina que tiene a lo sumo 10 veces la fuerza
iónica de la disolución de albúmina que se ha de tratar.
14. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 2 a 12, caracterizado por el hecho de que
antes de someter la disolución acuosa de albúmina bruta a una
cromatografía en fase estacionaria que contiene un compuesto que
lleva grupos sulfato, se equlibra la(s) columna(s)
correspondiente(s) con una disolución salina a lo sumo
isotónica con respecto a la disolución de albúmina que se ha de
tratar.
15. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 13 ó 14, caracterizado por el hecho de que
se utiliza, para el equilibrado de la(s) columna(s),
una disolución de cloruro de sodio o un tampón fosfato.
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