EP3829612A1 - Gänseblümchenextrakt - Google Patents

Gänseblümchenextrakt

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Publication number
EP3829612A1
EP3829612A1 EP18752122.4A EP18752122A EP3829612A1 EP 3829612 A1 EP3829612 A1 EP 3829612A1 EP 18752122 A EP18752122 A EP 18752122A EP 3829612 A1 EP3829612 A1 EP 3829612A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
extract
extracted
guava
extraction
composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP18752122.4A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Rolf Sorg
Bettina SCHWARZINGER
Julian Weghuber
Tobias KÜHNE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
PM International AG
Original Assignee
PM International AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by PM International AG filed Critical PM International AG
Publication of EP3829612A1 publication Critical patent/EP3829612A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/28—Asteraceae or Compositae (Aster or Sunflower family), e.g. chamomile, feverfew, yarrow or echinacea
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9783—Angiosperms [Magnoliophyta]
    • A61K8/9789—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/06—Preparations for care of the skin for countering cellulitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/333—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using mixed solvents, e.g. 70% EtOH

Definitions

  • the present invention relates to a process for producing an extract from daisies (Bellis perennis) and an extract obtainable by this process. Furthermore, the invention relates to a composition containing the extract according to the invention and the use of
  • composition according to the invention as a dietary supplement and / or medicament.
  • the invention also relates to the production of a composition according to the invention, in particular a food supplement.
  • Diabetes mellitus is a group of metabolic diseases that lead to hyperglycemia. People with type 2 diabetes mellitus (T2DM) represent the main group of patients with diabetes (90%) worldwide. The global prevalence of diabetes has increased significantly in 2014 with more than 400 million people affected in 2014. Diabetes caused 1.5 million deaths in 2012 and another 2.2 million
  • T2DM The main features of T2DM are hyperglycemia, insulin resistance and
  • T2DM is also associated with hyperlipidemia and high blood pressure. This combination is called a metabolic syndrome, which is a high risk factor for cardiovascular diseases. For this reason, there is a great demand for approaches to prevent and treat the health problems associated with T2DM.
  • the previously known glucose lowering pharmaceuticals include
  • Insulin sensitizers such as glitazone, inhibitors of hepatic gluconeogenesis such as metformin, or kidney sodium glucose co-transporters (SGLT1 / 2) inhibitors such as dapagliflozin.
  • SGLT1 / 2 kidney sodium glucose co-transporters
  • dapagliflozin a kidney sodium glucose co-transporters
  • the object of the present invention is to provide a method for producing an extract from daisies (Bellis perennis), since it has surprisingly been found that extracts from daisies
  • Another object of the invention is to provide the extract obtainable by the method and a composition comprising the extract. It is also an object of the invention to use the composition as
  • composition according to the invention in particular one
  • the material to be extracted is the flowers, optionally including the stems, and / or the leaves of daisies.
  • the material to be extracted, made from daisies comprises the flowers of daisies.
  • the material to be extracted made from daisies, consists of the flowers of daisies.
  • the material to be extracted is dried before the extraction.
  • This drying can be carried out by merely drying at room temperature (about 20 ° C.), preferably drying at room temperature for 2 to 7 days. However, it is also possible to dry the material to be extracted, made from daisies, at a slightly elevated temperature of 30 to 50 ° C for a period of 10 to 24 hours.
  • the material to be extracted is preferably dried to a residual water content of 8 to 10% by weight before the extraction.
  • the material to be extracted is extracted with a suitable mill, for example one, before extraction
  • the at least one alcohol preferably comprises ethanol.
  • the aqueous solvent preferably comprises a mixture of water and at least one alcohol, preferably ethanol, in a volume ratio of 10 to 1 to 1 to 1.
  • Pure water or pure alcohol can also be used as solvents in the process according to the invention.
  • the weight ratio of material to be extracted, produced from daisies, to aqueous solvent is preferably from 1: 1 to 1:20, particularly preferably 1: 9.
  • the method according to the invention is also preferably thereby
  • the extraction of the material to be extracted, made from daisies is carried out for about 5 to 120 minutes, preferably for 15 to 45 minutes.
  • the method according to the invention is also preferably thereby
  • the treatment with ultrasound is preferably carried out over a period of 5 to 120 minutes, preferably about 20 minutes.
  • the method according to the invention is also preferably thereby
  • the solid and insoluble constituents are removed by centrifugation, preferably at 2500 to 3000 g, and / or filtration, preferably with a filter with a mesh size / pore size of 4 to 7.
  • the method according to the invention is also preferably thereby
  • aqueous solvent is removed after extraction of the material to be extracted, made from daisies to get dry extract.
  • the aqueous solvent can preferably be removed by blowing in nitrogen.
  • the method according to the invention is also preferably thereby
  • the extract obtained contains the compounds neochlorogenic acid, chloric acid, caffeic acid, rutin, hyperoside, isoquercitrin, guaijaverine,
  • Avicularin, quercitrin, kaempferol, luteolinapigenin-7-glucoside, apigenin-7-glucuronide and / or apigenin preferably in a concentration of 0.001 to 5 mg / ml.
  • the present invention further relates to an extract obtainable by the method described above.
  • the present invention also relates to a composition comprising the extract obtainable by the process according to the invention.
  • composition according to the invention containing the extract of daisies obtainable by the method according to the invention, also contains an extract from the fruits of the real guava
  • This extract from the fruits of the real guava is preferably obtainable by a process comprising the steps
  • fruit or fruit denotes pulp, optionally with skin or skin.
  • the term fruit or fruits preferably does not include the seeds, kernels and / or leaves or parts thereof.
  • Carbon dioxide is preferably used as the distraction agent for the process according to the invention. Instead of carbon dioxide, in a method according to the invention, for example, ethene, propane, ammonia, nitrous oxide, nitrous oxide and / or can also be used as the removal agent
  • Chlorotrifluoromethane can be used.
  • the high-pressure extraction system comprises at least one extractor.
  • the carbon dioxide is present in the supercritical state in the extractor and extracts the material to be extracted.
  • the high-pressure extraction system comprises at least one separator. There is a lower one in the separator
  • Destraction is preferably carried out by feeding carbon dioxide to an extractor and guiding carbon dioxide loaded with extract from the extractor into a separator in which extract from the carbon dioxide separates.
  • the extraction is preferably carried out in a continuous mode in which pure carbon dioxide is continuously fed to the extractor and carbon dioxide loaded with extract is continuously fed from the extractor to the separator in which extract from the carbon dioxide separates.
  • the material to be extracted comprises a puree from guava fruits or a solid obtained from
  • the material to be extracted comprises at least 60% by weight of puree from guava fruit or a solid obtained by drying puree from fruit of real guava.
  • the material to be extracted is a pulp from real guava fruit or a solid obtained by drying a pulp from real guava fruit.
  • the material to be extracted preferably contains no seeds, kernels and / or leaves of the real guava or parts thereof.
  • the musts from the real guava fruit or the solid obtained by drying a muse from the fruits of the real guava contains no seeds, kernels and / or leaves of the real guava or parts thereof.
  • the material to be extracted is preferably dried to a water content of from 3% by weight to 50% by weight, preferably from 5% by weight to 35% by weight, particularly preferably from 7% by weight to 30% by weight.
  • the material to be extracted is dried before removal to a solid with a water content of 7% by weight to 30% by weight.
  • the material to be extracted is dried by means of a drying cabinet or vacuum chamber before the extraction.
  • the material to be extracted is dried at 30 ° C. to 75 ° C., preferably at 35 ° C. to 65 ° C., for a period of 20 hours to 120 hours, preferably from 40 hours to 80 hours, before the extraction ,
  • the material to be extracted is dried in a vacuum chamber at 30 ° C. to 50 ° C. before the extraction.
  • the material to be extracted is a solid, obtained by drying a musts from the real guava fruit, or comprises this solid
  • the solid is preferably comminuted before the extraction.
  • the solid is preferably comminuted to a powder, preferably at least 80% by weight of the
  • Powder components have a diameter between 0.05 mm and 30 mm, preferably between 0.1 mm and 10 mm.
  • Water is preferably added as a cosolvent to the extraction material for the extraction, preferably 1% by weight to 30% by weight of water, particularly preferably 8% by weight to 20% by weight of water, based on the dry mass of the extract material. With water as the cosolvent, the yield of the extraction can be increased.
  • the pressure in an extractor is preferably
  • High pressure extraction system during the extraction 100 bar to 500 bar, preferably 200 bar to 400 bar, very particularly preferably 250 bar to 350 bar.
  • the temperature in an extractor is preferably
  • High pressure extraction system during the extraction 31 ° C to 80 ° C, preferably 31 ° C to 50 ° C.
  • the extraction takes place over 1 h to 8 h, preferably 2 h to 4 h.
  • the high-pressure extraction system comprises an extractor and a separator and the extractor is flowed through during the extraction by a continuous flow of carbon dioxide of 2 to 20, preferably 5 to 12, kg of carbon dioxide per hour per kg of material to be extracted, the continuous flow of carbon dioxide is fed to the separator.
  • the amount of carbon dioxide relates to the dry mass of the material to be extracted.
  • the water content of the is
  • % preferably set to 7% by weight to 30% by weight.
  • an extract obtained is dried after the extraction, the drying preferably taking place by means of a drying cabinet or vacuum chamber, and the water content after drying preferably being ⁇ 10% by weight.
  • the composition of the extract obtained in particular with regard to polyphenols, differs greatly from the composition of extracts of the real guava, obtainable by processes not according to the invention.
  • Polyphenols are preferably identified using an HPLC method mentioned in the examples.
  • Polyphenols are preferably identified using an HPLC method mentioned in the examples, and the polyphenols phloridzin, phloretin, quercetin, quercitrin, isoquercitrin, hyperoside, avicularin, guaijaverin, procyanidin B1 and B2, (+) - catechin, (-) - catechin , (-) - epicatechin, gallocatechin, epicatechin gallate, gallic acid and ellagic acid include or are.
  • Hyperoside avicularin, guaijaverin, procyanidin B1 and B2, (+) -catechin, (-) - catechin, (-) - epicatechin, gallocatechin, epicatechin gallate, gallic acid and ellagic acid each less than 0.8% by weight, preferably less than 0.3% by weight, based on the dry weight of the extract.
  • the composition of the extract obtained differs greatly from the composition of extracts of the real guava, obtainable by processes not according to the invention.
  • none of the polyphenols which are identified in extracts of the real guava, obtainable by alternative methods is identified in the extract obtained, the polyphenols preferably being identified using an HPLC method mentioned in the examples.
  • none of the polyphenols which are identified in extracts of the real guava, obtainable by alternative methods is identified in the extract obtained, the polyphenols preferably being identified by an HPLC method mentioned in the examples, and the polyphenols being phloridzin , Phloretin, Quercetin, Quercitrin, Isoquercitrin, Hyperosid, Avicularin, Guaijaverin, Procyanidin Bl and B2, (+) - Catechin, (-) - Catechin, (-) - Epicatechin, Gallocatechin, Epicatechingallat,
  • Gallic acid and ellagic acid include or are.
  • Hyperoside avicularin, guaijaverin, procyanidin B1 and B2, (+) - catechin, (-) - catechin, (-) - epicatechin, gallocatechin, epicatechin gallate, gallic acid and ellagic acid each less than 0.8% by weight, preferably less than 0.3% by weight, based on the dry weight of the extract.
  • the present invention further relates to compositions as described above for use as a dietary supplement and / or
  • composition for use to reduce blood sugar peaks and / or to inhibit intestinal glucose absorption and / or to reduce weight is to be specified.
  • compositions for use in the treatment or prevention of diabetes mellitus and / or hyperglycemia and / or obesity is also based on the idea of a method for producing a composition according to the invention, in particular one
  • composition according to the invention Dietary supplement containing the extract according to the invention, the extract being obtainable by the method according to the invention.
  • the process for producing a composition according to the invention comprises:
  • the extract is preferably applied in the form of a solution of the extract in aqueous ethanol or propanol.
  • the extract is preferably applied by spraying a solution of the extract onto a carrier substance, such as, for example, gum arabic.
  • the extract-containing carrier substance is preferred after the application of the
  • the carrier substance is preferably mixed during application.
  • the process ensures a particularly even distribution of
  • Extract in the composition Extract in the composition.
  • Water content 100 x mass (water) / mass (water +
  • Chlorogenic acid, neochlorogenic acid and caffeic acid were obtained from Sigma-Aldrich (Schnelldorf, Germany). Guaijaverin and Avicularin came from Glentham Life Sciences (Corsham, United Kingdom). Rutin, hyperoside, isoquercitrin and quercitrin were obtained from extra synthesis (Genay Cedex, France). For the production of stock solutions, the vegetable
  • a library with 2,300 water-soluble herbal extracts was provided by Frank Döring (Christian-Albrechts-University Kiel, Germany).
  • NovoRapid from Novo Nordisk was provided by Daniel Weghuber
  • CHO-Kl cells that stably express the human insulin receptor (hIR) and GLUT4-myc-GFP were developed by Manoj K. Bhat (National Center for Cell Science,
  • the cells were in Ham's F12 culture medium supplemented with 100 pg / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin, 1%
  • G418 and 10% fetal bovine serum (FBS) were maintained and cultured in a humidified atmosphere at 37 ° C and 5% C0 2 .
  • Fresh daisy plants were collected and dried at room temperature for 1 week. The dried material was in a
  • CHO-Kl hIR / GLUT4-myc-GFP cells were placed in 96-well plates (35,000
  • the cells were treated with insulin or in KRPFI buffer
  • the scanning of larger areas was supported by a laser-controlled automatic focus hold system (ZDC2).
  • ZDC2 laser-controlled automatic focus hold system
  • the 488 nm emission of the diode laser (Toptica Photonics, Kunststoff, Germany) was used to image the GFP fluorescence. After appropriate filtering that was
  • Fluorescence signal via an Orca-R2 CCD camera (Hamamatsu Photonics,
  • Haselgrubler R. et al. PloS one (2017) and Haselgrubler, R. et al. Journal of visualized experiments (2018).
  • the eggs were at 38 ° C with an average
  • the eggs were turned over automatically and continuously, checked for fertilization by fluoroscopy and the area of the air bubble marked.
  • the eggshell was pointed with a
  • the extracts were diluted with HBSS or water to a final concentration of ⁇ 300 mg / L, which was finally introduced into the air compartment of the egg using a syringe. After the incubation, the eggshell above the air bubble was carefully removed and the eggshell membrane was leveled with PBS. In the next step, the eggshell membrane was removed and the
  • Thermo Scientific Dionex Ultimate 3000 consisting of an LPG-3400SD pump with built-in degasser, a WPS-3000 U (T) SL cooled
  • the analyte was separated on an Accucore C18 column (150 mm x 3.0 mm inner diameter, 2.6 ⁇ m particle size; Thermo Scientific). The column temperature was set to 40 ° C and the injection volume was 1 ml.
  • the analytes were separated by gradient elution with mobile phase A with 0.1% formic acid (FA) in water and mobile phase B with 0.1% FA in acetonitrile at a flow rate of 0.5 mL / min.
  • the starting conditions of the elution gradient were 95% A and 5% B. After an equilibration time of 5 min, the proportion of B was increased to 20% at 8 min and to 40% at 12 min, followed by 60% B at 15 min and 80% B at 17 min for 3 min. B was reduced to 5% at 20 min to 25 min.
  • Polyphenols have been quantified against known standards, provided they are available at concentrations in a linear range of 1-1,000 mg / L.
  • the first image recordings were supported by the Olympus Xcellence RT software. For the calculation of the fluorescence intensity in individual cells and a quick comparison of the fluorescence signal in numerous cells in
  • the Spotty framework was used at different intervals.
  • Process according to the invention produced (homemade).
  • Fig. 1A shows the effect of the three extracts tested after 10 min incubation.
  • the ethanolic extracts 4404 and 4407 only led to a moderate increase in the GFP signal of ⁇ 8% and ⁇ 5%, respectively. 17
  • the effectiveness of the two PECKISH library extracts 4404 and 4407 was quantified by testing different concentrations from 0.1 mg / L to 10 mg / L.
  • the homemade extract and the two PECKISH extracts were dissolved in HBSS buffer (300 mg / L).
  • NovoRapid a fast-acting human insulin analog, was used as a positive control (3.3 U / ml) to demonstrate insulin sensitivity. After incubation with the extracts for 1 or 2 h, the blood sugar values were checked over a week
  • Caffeic acid (hydroxycinnamic acids).
  • kaempferol and luteolin were identified by HPLC-MS analysis, but due to the lack thereof
  • FIG. 3 A representative HPLC-DAD chromatogram giving retention times and maximum wavelengths of each compound is shown in Fig. 3.
  • Table 1 summarizes the content of identified polyphenols. The best known hydroxycinnamic acid was chlorogenic acid (2.69 mg / L), apigenin -7-glucoside and apigenin-7-glucuronide (overlapping retention times) were found to be very common flavones (0.42 mg / L), while quercitrin was found as

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Extraktes aus Gänseblümchen (Bellis perennis), umfassend : a) Bereitstellen eines zu extrahierenden Materials, hergestellt aus Gänseblümchen; b) Extraktion des zu extrahierenden Materials mit einem wässrigen Lösungsmittel, um einen Extrakt zu erhalten, einen Extrakt erhältlich durch dieses Verfahren, eine Zusammenfassung umfassend einen Extrakt erhältlich durch dieses Verfahren und die Verwendung dieses Extraktes als Nahrungsergänzungs- und/oder Arzneimittel, insbesondere zur Reduzierung von Blutzuckerspitzen und/oder zur Hemmung intestinaler Glukose-Resorption und/oder zur Gewichtsreduktion, sowie zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention von Diabetes mellitus und/oder Hyperglykämie und/oder Adipositas.

Description

Gänseblümchenextrakt
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Extraktes aus Gänseblümchen (Bellis perennis) und einen Extrakt erhältlich durch dieses Verfahren. Ferner bezieht sich die Erfindung auf eine Zusammensetzung, enthaltend den erfindungsgemäßen Extrakt, sowie die Verwendung der
erfindungsgemäßen Zusammensetzung als Nahrungsergänzungsmittel und/oder Arzneimittel. Die Erfindung betrifft auch die Herstellung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, insbesondere eines Nahrungsergänzungsmittels.
Als Diabetes mellitus wird eine Gruppe von Stoffwechselerkrankungen bezeichnet, die zu Hyperglykämie führen. Menschen mit Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM) stellen weltweit die Hauptgruppe der Patienten mit Diabetes (90%) dar. Die globale Prävalenz von Diabetes hat in den letzten Jahrzehnten mit mehr als 400 Millionen Betroffenen im Jahr 2014 deutlich zugenommen. Dabei verursachte Diabetes im Jahr 2012 1,5 Millionen Todesfälle und weitere 2,2 Millionen
Todesfälle durch erhöhte Risiken für Herz-Kreislauf- und andere Krankheiten. Abgesehen von Gesundheitsproblemen bedroht Diabetes die Volkswirtschaften aller Nationen. Die absoluten globalen Kosten für Diabetes und seine Folgen sind hoch und werden bis 2030 deutlich steigen. Der Anteil der Kosten am globalen Bruttoinlandsprodukt ist damit enorm.
Die Hauptmerkmale von T2DM sind Hyperglykämie, Insulinresistenz und
Adipositas. Darüber hinaus ist T2DM auch mit Hyperlipidämie und Bluthochdruck verbunden. Diese Kombination wird als metabolisches Syndrom bezeichnet, das ein hoher Risikofaktor für Herz-Kreislauf-Erkrankungen ist. Aus diesem Grund existiert es eine große Nachfrage nach Ansätzen zur Prävention und Behandlung der mit T2DM verbundenen Gesundheitsprobleme.
Die bisher bekannten glukosesenkenden Pharmazeutika umfassen
Insulinsensibilisatoren wie Glitazon, Inhibitoren der hepatischen Glukoneogenese wie Metformin, oder Nieren-Natrium-Glukose-Co-Transporter (SGLT1/2)- Inhibitoren wie Dapagliflozin. Die Anwendung dieser Medikamente ist jedoch mit schweren Nebenwirkungen wie Durchfall, Übelkeit, Bauchschmerzen, Ödemen, kongestiver Herzinsuffizienz, Glykosurie gefolgt von Harnwegsinfektionen und möglicherweise Blasenkrebs verbunden.
Es besteht daher Bedarf weitere Mittel bereitzustellen, die den Blutglukoselevel senken und dabei nicht die Nachteile der aus dem Stand der Technik bekannten Pharmazeutika aufweisen.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren zur Herstellung eines Extraktes aus Gänseblümchen (Bellis perennis) bereitzustellen, da sich überraschend gezeigt hat, dass Extrakte aus Gänseblümchen
vielversprechende Wirkstoffmischungen darstellen, die den Blutzuckerspiegel effektiv senken . Dies geschieht höchstwahrscheinlich durch Induktion der GLUT4- Translokation, die zu einer erhöhten Glukoseaufnahme in Muskel- und Fettgewebe aus dem Blutkreislauf führt.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, den durch das Verfahren erhältlichen Extrakt und eine Zusammensetzung, umfassend den Extrakt, anzugeben. Ebenso ist es Aufgabe der Erfindung, die Verwendung der Zusammensetzung als
Nahrungsergänzungsmittel und/oder Arzneimittel und ein Verfahren zur
Herstellung der Zusammensetzung, insbesondere eines
Nahrungsergänzungsmittels, anzugeben.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren nach Anspruch 1 gelöst. Mit Blick auf den Extrakt, erhältlich durch das erfindungsgemäße
Verfahren, und die Zusammensetzung, umfassend den erfindungsgemäßen Extrakt, wird diese Aufgabe durch den Anspruch 9 gelöst. Bezüglich der
Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung wird diese Aufgabe durch Anspruch 12 gelöst. Bezüglich des Verfahrens zur Herstellung der
erfindungsgemäßen Zusammensetzung, insbesondere eines
Nahrungsergänzungsmittels, wird diese Aufgabe durch Anspruch 15 gelöst.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
Im Folgenden kann der Begriff „umfassen" auch„bestehend aus" bedeuten.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Extraktes aus
Gänseblümchen (Bellis perennis), umfasst dabei die Schritte: a) Bereitstellen eines zu extrahierenden Materials, hergestellt aus Gänseblümchen;
b) Extraktion des zu extrahierenden Materials mit einem wässrigen Lösungsmittel, um einen Extrakt zu erhalten .
Vorzugsweise handelt es sich dabei bei dem zu extrahierenden Material , hergestellt aus Gänseblümchen, um die Blüten, wahlweise inklusive der Stängel, und/oder die Blätter von Gänseblümchen.
Besonders bevorzugt umfasst das zu extrahierende Material, hergestellt aus Gänseblümchen, die Blüten von Gänseblümchen.
Ganz besonders bevorzugt, besteht das zu extrahierende Material, hergestellt aus Gänseblümchen, aus den Blüten von Gänseblümchen.
Es ist ferner bevorzugt, wenn das zu extrahierenden Materials, hergestellt aus Gänseblümchen, vor der Extraktion getrocknet wird.
Diese Trocknung kann durch bloßes Trocknen bei Raumtemperatur (etwa 20°C) erfolgen, wobei vorzugsweise 2 bis 7 Tage bei Raumtemperatur getrocknet wird. Es ist jedoch auch möglich das das zu extrahierenden Materials, hergestellt aus Gänseblümchen, bei einer leicht erhöhter Temperatur von 30 bis 50 °C über einen Zeitraum von 10 bis 24h zu trocknen.
Unabhängig von dem Trocknungsverfahren ist es bevorzugt, dass das zu extrahierende Material, hergestellt aus Gänseblümchen, vor der Extraktion vorzugsweise auf einen Restwassergehalt von 8 bis 10 Gew.-% getrocknet wird.
Vorzugsweise wird das zu extrahierende Material, hergestellt aus Gänseblümchen, vor der Extraktion mit einer geeigneten Mühle, beispielsweise einer
handelsüblichen Kaffeemühle, gemahlen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist ferner dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel, mit dem das zu extrahierende Material, hergestellt aus
Gänseblümchen, extrahiert wird, ein wässriges Lösungsmittel umfasst. Als wässriges Lösungsmittel sind insbesondere Mischungen, umfassend
mindestens Wasser und einen Alkohol, geeignet. Der mindestens eine Alkohol umfasst dabei vorzugsweise Ethanol.
Vorzugsweise umfasst das wässrige Lösungsmittel eine Mischung aus Wasser und mindestens einem Alkohol, vorzugsweise Ethanol, in einem Volumenverhältnis von 10 zu 1 bis 1 zu 1 umfasst.
Ferner können in dem erfindungsgemäßen Verfahren auch reines Wasser oder reiner Alkohol als Lösungsmittel eingesetzt werden.
Vorzugsweise beträgt das Gewichtsverhältnis von zu extrahierendem Material, hergestellt aus Gänseblümchen, zu wässrigem Lösungsmittel von 1 : 1 bis 1 :20, besonders bevorzugt 1 : 9.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist ferner vorzugsweise dadurch
gekennzeichnet, dass die Extraktion des zu extrahierenden Material s, hergestellt aus Gänseblümchen, für etwa 5 bis 120 min, vorzugsweise für 15 bis 45 min, durchgeführt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist außerdem vorzugsweise dadurch
gekennzeichnet, dass das Verfahren ferner den Schritt c) Behandlung der
Mischung aus dem zu extrahierenden Material, hergestellt aus Gänseblümchen, und dem wässrigen Lösungsmittel aus Schritt b) mit Ultraschall, umfasst.
Die Behandlung mit Ultraschall wird dabei vorzugsweise über eine Zeit von 5 bis 120 min, vorzugsweise etwa 20 min, durchgeführt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist außerdem vorzugsweise dadurch
gekennzeichnet, dass nach der Extraktion die festen und unlöslichen Bestandteile durch Zentrifugation, vorzugweise bei 2500 bis 3000 g, und/oder Filtration, vorzugsweise mit einem Filter einer Maschenweite/Porengröße von 4 bis 7 entfernt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist außerdem vorzugsweise dadurch
gekennzeichnet, dass das wässrige Lösungsmittel nach der Extraktion des zu extrahierenden Material, hergestellt aus Gänseblümchen, entfernt wird, um einen trockenen Extrakt zu erhalten. Die Entfernung des wässrigen Lösungsmittels kann dabei vorzugsweise durch Einblasen von Stickstoff erfolgen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist ferner vorzugsweise dadurch
gekennzeichnet, dass der erhaltene Extrakt die Verbindungen Neochlorogensäure, Chlorgensäure, Kaffeesäure, Rutin, Hyperosid, Isoquercitrin, Guaijaverin,
Avicularin, Quercitrin, Kaempferol, Luteolinapigenin-7-glucosid, Apigenin-7- glucuronid und/oder Apigenin, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,001 bis 5 mg/mL, umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Extrakt erhältlich durch das vorstehend beschriebene Verfahren.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, enthaltend den durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlichen Extrakt.
Es ist ferner bevorzugt, wenn die erfindungsgemäße Zusammensetzung, enthaltend den durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlichen Extrakt von Gänseblümchen, ferner einen Extrakt aus den Früchten der Echten Guave
(Psidium Guajava) umfasst.
Dieser Extrakt aus den Früchten der Echten Guave ist dabei vorzugsweise erhältlich durch ein Verfahren umfassend die Schritte
al) Bereitstellen eines zu extrahierenden Materiales, hergestellt aus Früchten der Echten Guave;
bl) Destraktion des zu extrahierenden Materiales mit Kohlenstoffdioxid als Destraktionsmittel in einer Hochdruckextraktionsanlage, um einen Extrakt zu erhalten.
Nachfolgend werden bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens zur
Herstellung eines Extraktes aus den Früchten der Echten Guave beschrieben.
In bevorzugten Ausführungsformen bezeichnet der Begriff Frucht bzw. Früchte Fruchtfleisch, optional mit Haut oder Schale.
Vorzugsweise umfasst der Begriff Frucht bzw. Früchte nicht die Samen, Kerne und/oder Blätter oder Teile davon. Als Destraktionsmittel für das erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugt Kohlenstoffdioxid verwendet. Anstelle von Kohlenstoffdioxid kann in einem erfindungsgemäßen Verfahren als Destraktionsmittel beispielsweise auch Ethen, Propan, Ammoniak, Distickstoffdioxid, Distickstoffmonoxid und/oder
Chlortrifluormethan eingesetzt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Hochdruckextraktionsanlage mindestens einen Extraktor. In dem Extraktor liegt das Kohlenstoffdioxid in überkritischem Zustand vor und extrahiert das zu extrahierende Material.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Hochdruckextraktionsanlage mindestens einen Abscheider. In dem Abscheider herrscht eine niedrigere
Temperatur und ein geringerer Druck als in dem Extraktor, wodurch sich aus Kohlenstoffdioxid, welches aus dem Extraktor in den Abscheider überführt wird, ein Extrakt abscheidet.
Bevorzugt erfolgt die Destraktion, indem einem Extraktor Kohlenstoffdioxid zugeführt wird und mit Extrakt beladenes Kohlenstoffdioxid aus dem Extraktor in einen Abscheider geführt wird, in welchem sich Extrakt aus dem Kohlenstoffdioxid abscheidet.
Bevorzugt erfolgt die Destraktion in einem kontinuierlichen Modus, in welchem dem Extraktor kontinuierlich reines Kohlenstoffdioxid zugeführt wird und kontinuierlich mit Extrakt beladenes Kohlenstoffdioxid aus dem Extraktor in den Abscheider geführt wird, in welchem sich Extrakt aus dem Kohle nstoffdioxid abscheidet.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das zu extrahierende Material ein Mus aus Früchten der Echten Guave oder einen Feststoff, erhalten durch
Trocknung von Mus aus Früchten der Echten Guave.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das zu extrahierende Material zu mindestens 60 Gew.-% ein Mus aus Früchten der Echten Guave oder einen Feststoff, erhalten durch Trocknung von Mus aus Früchten der Echten Guave.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das zu extrahierende Material ein Mus aus Früchten der Echten Guave oder ein Feststoff, erhalten durch Trocknung eines Muses aus Früchten der Echten Guave. Vorzugsweise enthält das zu extrahierende Material keine Samen, Kerne und/oder Blätter der Echten Guave oder Teile davon.
Vorzugsweise enthält das Mus aus Früchten der Echten Guave oder der Feststoff, erhalten durch Trocknung eines Muses aus Früchten der Echten Guave, keine Samen, Kerne und/oder Blätter der Echten Guave oder Teile davon.
Vorzugsweise wird das zu extrahierende Material vor der Destraktion auf einen Wassergehalt von 3 Gew. % bis 50 Gew. %, bevorzugt von 5 Gew. % bis 35 Gew. %, besonders bevorzugt von 7 Gew. % bis 30 Gew. %, getrocknet.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das zu extrahierende Material vor der Destraktion zu einem Feststoff mit einem Wassergehalt von 7 Gew. % bis 30 Gew. % getrocknet.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das zu extrahierende Material vor der Destraktion mittels Trockenschrank oder Vakuumkammer getrocknet.
In einer möglichen Ausführungsform wird das zu extrahierende Material vor der Destraktion bei 30 °C bis 75 °C, bevorzugt bei 35 °C bis 65 °C, über eine Dauer von 20 h bis 120 h, bevorzugt von 40 h bis 80 h, getrocknet.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das zu extrahierende Material vor der Destraktion bei 30 °C bis 50 °C in einer Vakuumkammer getrocknet.
Falls das zu extrahierende Material ein Feststoff, erhalten durch Trocknung eines Muses aus Früchten der Echten Guave, ist oder diesen Feststoff umfasst, wird der Feststoff vor der Destraktion bevorzugt zerkleinert. Bevorzugt wird der Feststoff zu einem Pulver zerkleinert, wobei bevorzugt mindestens 80 Gew.-% der
Pulverbestandteile einen Durchmesser zwischen 0,05 mm und 30 mm, bevorzugt zwischen 0,1 mm und 10 mm, aufweisen.
Vorzugsweise wird dem zu extrahierenden Material für die Destraktion Wasser als Cosolvens zugesetzt, bevorzugt 1 Gew.-% bis 30 Gew.-% Wasser, besonders bevorzugt 8 Gew.-% bis 20 Gew.-% Wasser, bezogen auf die Trockenmasse des zu extrahierenden Materiales. Durch Wasser als Cosolvens lässt sich die Ausbeute der Destraktion steigern. Vorzugsweise beträgt der Druck in einem Extraktor der
Hochdruckextraktionsanlage während der Destraktion 100 bar bis 500 ba r, bevorzugt 200 bar bis 400 bar, ganz besonders bevorzugt 250 bar bis 350 bar.
Vorzugsweise beträgt die Temperatur in einem Extraktor der
Hochdruckextraktionsanlage während der Destraktion 31 °C bis 80 °C, bevorzugt 31 °C bis 50 °C.
In einer möglichen Ausführungsform erfolgt die Destraktion über 1 h bis 8 h, bevorzugt 2 h bis 4 h.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Hochdruckextraktionsanlage einen Extraktor und einen Abscheider und der Extraktor wird während der Destraktion durch einen kontinuierlichen Fluss an Kohlenstoffdioxid von 2 bis 20, bevorzugt von 5 bis 12, Kilogramm Kohlenstoffdioxid pro Stunde pro Kilogramm zu extrahierenden Materiales, durchströmt, wobei der kontinuierliche Fluss an Kohlenstoffdioxid dem Abscheider zugeführt wird. Die Menge an Kohlenstoffdioxid bezieht sich auf die Trockenmasse des zu extrahierenden Materiales.
Vorzugsweise liegt in einem Abscheider der Hochdruckextraktionsanlage während der Destraktion eine Temperatur von 10 °C bis 40 °C, bevorzugt von 15 °C bis 35 °C, vor.
Vorzugsweise liegt in einem Abscheider der Hochdruckextraktionsanlage während der Destraktion ein Druck von 15 bar bis 55 bar, bevorzugt von 30 bar bis 50 bar, vor.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Wassergehalt des zu
extrahierenden Materiales zu Beginn der Destraktion auf 3 Gew. % bis 50 Gew.
%, bevorzugt auf 7 Gew. % bis 30 Gew. %, eingestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein erhaltener Extrakt nach der Destraktion getrocknet, wobei die Trocknung bevorzugt mittels Trockenschrank oder Vakuumkammer erfolgt und wobei der Wassergehalt nach der Trocknung bevorzugt < 10 Gew.-% beträgt. In einer bevorzugten Ausführungsform unterscheidet sich die Zusammensetzung des erhaltenen Extraktes, insbesondere in Bezug auf Polyphenole, stark von der Zusammensetzung von Extrakten der Echten Guave, erhältlich durch nicht erfindungsgemäße Verfahren.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird in dem erhaltenen Extrakt keines jener Polyphenole identifiziert, welche in Extrakten der Echten Guave, erhältlich durch nicht erfindungsgemäße Verfahren, identifiziert werden, wobei die
Polyphenole bevorzugt mit einer in den Beispielen genannten HPLC-Methode identifiziert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird in dem erhaltenen Extrakt keines jener Polyphenole identifiziert, welche in Extrakten der Echten Guave, erhältlich durch nicht erfindungsgemäße Verfahren, identifiziert werden, wobei die
Polyphenole bevorzugt mit einer in den Beispielen genannten HPLC-Methode identifiziert werden, und wobei die Polyphenole Phloridzin, Phloretin, Quercetin, Quercitrin, Isoquercitrin, Hyperosid, Avicularin, Guaijaverin, Procyanidin Bl und B2, (+)-Catechin, (-)-Catechin, (-)-Epicatechin, Gallocatechin, Epicatechingallat, Gallussäure und Ellagsäure umfassen oder sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der erhaltene Extrakt von den Verbindungen Phloridzin, Phloretin, Quercetin, Quercitrin, Isoquercitrin,
Hyperosid, Avicularin, Guaijaverin, Procyanidin Bl und B2, (+) -Catechin, (-)- Catechin, (-)-Epicatechin, Gallocatechin, Epicatechingallat, Gallussäure und Ellagsäure jeweils weniger als 0,8 Gew.-%, bevorzugt jeweils weniger als 0,3 Gew.-%, bezogen auf die Trockenmasse des Extraktes.
In einer bevorzugten Ausführungsform unterscheidet sich die Zusammensetzung des erhaltenen Extraktes, insbesondere in Bezug auf Polyphenole, stark von der Zusammensetzung von Extrakten der Echten Guave, erhältlich durch nicht erfindungsgemäße Verfahren.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird in dem erhaltenen Extrakt keines jener Polyphenole identifiziert, welche in Extrakten der Echten Guave, erhältlich durch alternative Verfahren, identifiziert werden, wobei die Polyphenole bevorzugt mit einer in den Beispielen genannten HPLC-Methode identifiziert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird in dem erhaltenen Extrakt keines jener Polyphenole identifiziert, welche in Extrakten der Echten Guave, erhältlich durch alternative Verfahren, identifiziert werden, wobei die Polyphenole bevorzugt mit einer in den Beispielen genannten HPLC-Methode identifiziert werden, und wobei die Polyphenole Phloridzin, Phloretin, Quercetin, Quercitrin, Isoquercitrin, Hyperosid, Avicularin, Guaijaverin, Procyanidin Bl und B2, (+)- Catechin, (-)-Catechin, (-)-Epicatechin, Gallocatechin, Epicatechingallat,
Gallussäure und Ellagsäure umfassen oder sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der erhaltene Extrakt von den Verbindungen Phloridzin, Phloretin, Quercetin, Quercitrin, Isoquercitrin,
Hyperosid, Avicularin, Guaijaverin, Procyanidin Bl und B2, (+)-Catechin, (-)- Catechin, (-)-Epicatechin, Gallocatechin, Epicatechingallat, Gallussäure und Ellagsäure jeweils weniger als 0,8 Gew.-%, bevorzugt jeweils weniger als 0,3 Gew.-%, bezogen auf die Trockenmasse des Extraktes.
Überraschenderweise wurden in dem Extrakt erhältlich gemäß dem
obenstehenden Verfahren keines der Polyphenole oder Flavonoide nachgewiesen, die in herkömmlichen Extrakten der Echten Guave, beispielsweise einem ethanolischen Extrakt aus Früchten der Echten Guave oder einem Extrakt aus Blättern der Echten Guave, Vorkommen. Dies ist insbesondere überraschend, da der beschriebene Extrakt eine viel stärkere Hemmung des Glukosetransportes, eine ausgeprägtere Reduzierung von Blutzuckerspitzen und eine stärkere
Hemmung intestinaler-Resorption aufweist, als herkömmliche Vergleichsextrakte.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Zusammensetzungen, wie vorstehend beschrieben zur Verwendung als Nahrungsergänzungsmittel und/oder
Arzneimittel.
Insbesondere soll eine Zusammensetzung zur Verwendung zur Reduzierung von Blutzuckerspitzen und/oder zur Hemmung intestinaler Glukose-Resorption und/oder zur Gewichtsreduktion angegeben werden.
In bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich um eine Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention von Diabetes mellitus und/oder Hyperglykämie und/oder Adipositas. Die Erfindung beruht auch auf dem Gedanken, ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, insbesondere eines
Nahrungsergänzungsmittels, enthaltend den erfindungsgemäßen Extrakt, anzugeben, wobei der Extrakt durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich ist. Das Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung umfasst:
a) Bereitstellen eines Gänseblümchenextraktes, erhältlich durch das Verfahren gemäß vorstehend beschriebene Verfahren und gegebenenfalls eines Extraktes aus Früchten der Echten Guave (Psidium Guajava), vorzugsweise erhältlich durch das vorstehend beschriebene Verfahren;
b) Aufträgen des Extraktes bzw. der Extrakte auf eine Trägersubstanz,
insbesondere durch Aufsprühen einer Lösung des Extraktes bzw. der Extrakte auf eine Trägersubstanz, um eine extrakthaltige Trägersubstanz zu erhalten;
c) Mischen der extrakthaltigen Trägersubstanz mit weiteren Bestandteilen der Zusammensetzung, insbesondere des Nahrungsergänzungsmittels.
Bevorzugt erfolgt das Aufträgen des Extraktes in Form einer Lösung des Extraktes in wässrigem Ethanol oder Propanol.
Bevorzugt erfolgt das Aufträgen des Extraktes durch Aufsprühen einer Lösung des Extraktes auf eine Trägersubstanz, wie beispielsweise Gummi arabicum .
Bevorzugt wird die extrakthaltige Trägersubstanz nach dem Aufträgen des
Extraktes getrocknet, um Wasser und Alkohol zu entfernen.
Bevorzugt wird die Trägersubstanz während des Auftragens durchmischt.
Das Verfahren gewährleistet eine besonders gleichmäßige Verteilung des
Extraktes in der Zusammensetzung.
Falls nichts anderes angegeben ist, wird der Wassergehalt in der
Patentanmeldung jeweils nach folgender Formel berechnet:
Wassergehalt (Gew.-%) = 100 x Masse (Wasser) / Masse (Wasser +
Trockenmasse).
Beschreibung der Figuren Fig. 1 Effekte von Extrakten aus Bell is perennis auf die GLUT4- Translokation (Fehlerbalken basierend auf dem SEM, n>30, gemessen an 3 verschiedenen Tagen)
Fig. 2 Einfluss von Extrakten aus Bel lis perennis auf den Blutzuckerspiegel in ovo (Fehlerbalken basieren auf dem SEM. P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 und ****P<0,0001).
Fig. 3 HPLC-DAD-Chromatogramm von Bellis Perennis Extrakt,
aufgenommen bei 260 nm. Die Verbindungen, die den jeweiligen Peaks entsprechen sind in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt.
12 14 34 Apigenin 269 0444 0 0055
12a
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von nicht beschränkenden
Ausführungsbeispielen unter Bezug auf die beigefügten schematischen
Zeichnungen näher erläutert.
Beispiele
1. Material und Methoden
1.1 Materialien
Humaninsulin, CaCI2, NaCI, KCl, MgS04, KH2P04 Phosphatgepufferte
Kochsalzlösung (PBS), Hank's balanced salt solution (HBSS), Quercetin,
Chlorogensäure, Neochlorogensäure und Kaffeesäure wurden von Sigma-Aldrich (Schnelldorf, Deutschland) bezogen. Guaijaverin und Avicularin kamen von Glentham Life Sciences (Corsham, Vereinigtes Königreich). Rutin, Hyperosid, Isoquercitrin und Quercitrin wurden aus Extrasynthese (Genay Cedex, Frankreich) gewonnen. Zur Herstellung von Stammlösungen wurden die pflanzlichen
Verbindungen in Krebs Ringer Phosphat HEPES Puffer (KRPH; 20 mM HEPES, 1 mM CaCI2, 136 mM NaCI, 4,7 mM KCl, 1 mM MgS04 und 5 mM KH2P04) gelöst.
Eine Bibliothek mit 2.300 wasserlöslichen Kräuterextrakten (PECKISH) wurde von Frank Döring (Christian-Albrechts-Universität Kiel, Deutschland) bereitgestellt. NovoRapid von Novo Nordisk wurde von Daniel Weghuber bereitgestellt
(Paracelsus Medical University, Salzburg, Österreich).
1.2 Zellkultur und Transfektion
CHO-Kl-Zellen, die den menschlichen Insulinrezeptor (hIR) und GLUT4-myc-GFP stabil exprimieren, wurden von Manoj K. Bhat (National Centre for Cell Science,
13
University of Pune, Indien) bereitgestellt. Die Zellen wurden in Ham's F12- Kulturmedium, ergänzt mit 100 pg/ml Penicillin, 100 pg/ml Streptomycin, 1%
G418 und 10% fötales Rinderserum (FBS) (Life Technologies, Carlsbad, CA) gehalten und in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37 °C und 5% C02 kultiviert.
1.3 Herstellung der Extrakte
Frische Gänseblümchenpflanzen wurden gesammelt und 1 Woche lang bei Raumtemperatur getrocknet. Das getrocknete Material wurde in einer
Kaffeemühle 30 Sekunden lang gemahlen. Für die Extraktvorbereitung wurden 3 g des Pulvers mit 30 mL EtOH (50%) gelöst. Die Lösung wurde 20 min mit
Ultraschall behandelt, zentrifugiert und mit einem Haushaltsfilter gefiltert. Das EtOH wurde mit N2 abgeblasen und die Rückstände wieder mit Wasser verdünnt. Die Proben wurden bei -20 °C gelagert.
1.4 TIRF-Mikroskopie
CHO-Kl hIR/GLUT4-myc-GFP-Zellen wurden in 96-Well-Platten (35.000
Zellen/Well; Mobitec, Göttingen, Deutschland) wie bei La n zerstörter, P. et al. British journal of pharmacology (2014), bzw. Stadlbauer, V. et al. PloS one (2016) beschrieben, über Nacht kultiviert. Zellkulturmedium wurde abgesaugt und nach Waschen der Zellen mit PBS (VWR, Wien, Österreich) durch HBSS (Thermo Fisher, Waltham, MA), ergänzt mit 0,1% BSA (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Deutschland), für 3 Stunden ersetzt.
Die Zellen wurden mit in KRPFI-Puffer gelösten Insulin- oder
Gänseblümchenextrakten inkubiert und auf einem inversen Olympus IX-81
Mikroskop in objektiver TIR-Konfiguration über ein Olympus 60x NA = 1,49 Plan- Apochromat-Objektiv. 96-well-Platten wurden auf einem x-y-Tisch platziert (CMR- STG-MHIX2-motorisierter Tisch; Märzhäuser, Wetzlar, Deutschland).
Das Scannen größerer Bereiche wurde durch ein lasergesteuertes automatisches Fokushaltesystem (ZDC2) unterstützt. Die 488 nm Emission des Diodenlasers (Toptica Photonics, München, Deutschland) wurde zur Abbildung der GFP- Fluoreszenz verwendet. Nach entsprechender Filterung wurde das
Fluoreszenzsignal über eine Orca-R2 CCD-Kamera (Hamamatsu Photonics,
Herrsching, Deutschland) aufgenommen.
1.5 Hühnerei-Test fHET- 14
Der HET-CAM-Test wurde wie bereits bei Haselgrubler, R. et al. PloS one (2017) bzw. Haselgrubler, R. et al. Journal of visualized experiments (2018) beschrieben, durchgeführt.
Kurz gesagt, die Eier wurden bei 38 °C mit einer durchschnittlichen
Luftfeuchtigkeit von 40±60% für 11 Tage bebrütet. Die Eier wurden automatisch und ständig gewendet, durch Durchleuchtung auf Befruchtung kontrolliert und der Bereich der Luftblase markiert. Die Eierschale wurde mit einer spitzen
Pinzette in diesem Bereich leicht gepickt und 300 pL einer Pufferlösung (HBSS oder Wasser) mit der mutmaßlichen blutzuckersenkenden Substanz zugesetzt. Es wurden 3 verschiedene Pflanzenextrakte von Gänseblümchen (bellis perennis) getestet.
Zwei Extrakte wurden dabei von der Extraktbibliothek PECKISH eingesetzt
(Extrakte 4404 und 4407). Bei diesen Extrakten handelt es sich um rein
ethanolische Extrakte. Zudem wurde ein Extrakt, der gemäß dem
erfindungsgemäßen Verfahren („homemade") hergestellt wurde, eingesetzt.
Mit HBSS oder Wasser wurden die Extrakte auf eine Endkonzentration von ~300 mg/L verdünnt, die schließlich mit einer Spritze in das Luftfach des Eies eingebracht wurde. Nach der Inkubation wurde die Eierscha le über der Luftblase vorsichtig entfernt und die Eierschalenmembran mit PBS ausgeglichen. Im nächsten Schritt wurde die Eierschalenmembran entfernt und die
Chorioallantoismembran mit einer Mikroschere vorsichtig geschnitten. Ein geeignetes Blutgefäß wurde sorgfältig auf einen pH-Streifen aus Kunststoff gelegt, der vor dem Schneiden des Gefäßes mit Filterpapier trocken geklopft und das austretende Blut aufgefangen wird. Die Blutzuckerwerte wurden mit einem Blutzuckermessgerät (Accu-Check Performa, Roche Diabetes Care GmbH,
Mannheim, Deutschland) ermittelt. Für jeden Zeitpunkt wurden mindestens 10 befruchtete Eier verwendet. Jedes Experiment wurde mindestens dreimal wiederholt.
1.6 HPLC-Analvse
Die Analyse der Extrakte erfolgte mittels Umkehrphasenchromatographie mit einer Thermo Scientific Dionex Ultimate 3000, bestehend aus einer LPG-3400SD- Pumpe mit eingebautem Entgaser, einem WPS-3000 U(T)SL gekühlten
Autosampler, einem temperaturgesteuerten Säulenfach und einem FLD-34000RS Diodenarray-Detektor (DAD) mit Chromeleon-Software wie in Müller, U. et al. 15
Molecular nutrition & food research (2018) beschrieben. Die Analyt-Trennung erfolgte an einer Accucore C18-Säule (150 mm x 3,0 mm Innendurchmesser, 2,6 pm Partikelgröße; Thermo Scientific). Die Säulentemperatur wurde auf 40 °C eingestellt und das Injektionsvolumen betrug 1 mI_. Die Analyten wurden durch Gradientenelution mit mobiler Phase A mit 0, 1% Ameisensäure (FA) in Wasser und mobiler Phase B mit 0, 1% FA in Acetonitril bei einer Flussrate von 0,5 mL/min getrennt. Die Startbedingungen des Elutionsgradienten lagen bei 95% A und 5% B. Nach 5 min Äquilibrierungszeit wurde der Anteil von B auf 20% bei 8 min und auf 40% bei 12 min erhöht, gefolgt von 60% B bei 15 min und 80% B bei 17 min für 3 min. B wurde auf 5% bei 20 min bis 25 min reduziert.
Hochauflösende Massenspektren wurden mit einer Thermo Fisher Scientific LTQ Orbitrap XL mit einer Ion Max API Elektrosprayquelle im negativen
Ionisationsmodus gewonnen. Kapillartemperatur 350 °C, Mantelgasstrom 45, Hilfsgasstrom 15, Quellenspannung 3,5 kV, Kapillarspannung -25 V, Tubuslinse - 90 V. Die Trennung erfolgte mit einer Accucore C18-Säule (150 mm x 3,0 mm Innendurchmesser, 2,6 pm Partikelgröße; Thermo Scientific unter den oben beschriebenen Bedingungen.
Polyphenole wurden gegen bekannte Standards quantifiziert, sofern sie mit Konzentrationen in einem linearen Bereich von 1-1.000 mg/L verfügbar sind.
16
1.7 Datenanalvse
Erste Bildaufnahmen wurden von der Olympus Xcellence RT Software unterstützt. Für die Berechnung der Fluoreszenzintensität in einzelnen Zellen und einen schnellen Vergleich des Fluoreszenzsignals in zahlreichen Zellen in
unterschiedlichen Zeitabständen wurde mit dem Spotty-Framework eine
eingehende Analyse durchgeführt. Spotty ist online abrufbar unter
http://bioinformatics.fh-hagenberg.at/projects/microprot/. Die statistische
Auswertung erfolgte mit der 2-Wege Annova in Graphpad Prism (Version 6.02).
2. Ergebnisse
2.1 Induktion der GLUT4-Translokation durch Gänseblümchenextrakte
Im Folgenden wird die Wirksamkeit verschiedener Gänseblümchenextrakte bei der Induktion der Translokation von GLUT4 aus zytosolischen
Speicherkompartimenten in die Plasmamembran beschrieben. Zunächst wurden zwei rein ethanolische Extrakte aus der PECKISH-Extraktbibliothek getestet.
Ein Extrakt war eine Mischung aus Blüten und Blättern (4404), der zweite wurde nur aus Blüten hergestellt (4407).
Drittens wurde ein Extrakt aus Gänseblümchenblüten gemäß dem
erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt (homemade).
Für die Messungen wurden hungernde CHO-Kl-Zellen, die den menschlichen Insulinrezeptor und ein GLUT4-myc-GFP-Fusionsprotein stabil exprimieren mit dem ausgewählten Extrakt in niedrigen Konzentrationen (1 mg/L) inkubiert.
Anschließend wurde der Anstieg des GFP-Signals im evaneszenten Feld, das mit der Konzentration der GLUT4-Proteine in der Plasmamembran korreliert, bestimmt.
Abb. 1A zeigt die Wirkung der drei getesteten Extrakte nach 10 min Inkubation. Die ethanolischen Extrakte 4404 und 4407 führten nur zu einem moderaten Anstieg des GFP-Signals von ~8% bzw. ~5%. 17
Der erfindungsgemäße (homemade) Extrakt führte jedoch zu einem starken Anstieg des GFP-Signals (~35%).
Um die Testdurchführung zu gewährleisten, wurden die Zellen auch mit 100 nM Humaninsulin behandelt. Dies führte zu einem Anstieg von ~26%, was mit den zuvor durchgeführten Studien publiziert von Stadlbauer, V. et al. PloS one (2016), übereinstimmt.
Basierend auf diesen Ergebnissen, wurde die Wirksamkeit der beiden PECKISH- Bibliotheksextrakte 4404 und 4407 durch Tests verschiedener Konzentrationen von 0, 1 mg/L bis 10 mg/L quantifiziert.
Wie in Abb. 1B und C gezeigt, fanden wir eine klare Dosis-Wirkungs-Beziehung beider Extrakte, wobei 4404 etwas effizienter war als 4407: Während 4407 bei 0,25 mg/L keinen Effekt hatte, führte die Zugabe von 4404 bei gleicher
Konzentration bereits zu einem Anstieg von ~4%. Zusammengenommen sind Extrakte aus Be/iis perennis wirksame Induktoren der GLUT4-Translokation in Abwesenheit von Insulin.
2.2 Senkung des Blutzuckerspiegels durch Gänseblümchenextrakt in ovo
Basierend auf den Ergebnissen des CHO-Kl-basierten in p/iro-Systems wurde die Wirksamkeit von Bellis-Perennis-Extrakten in ovo getestet. Zu diesem Zweck wurde der kürzlich etablierte und in Haselgrubler, R. et al. PloS one (2017), bzw. Haselgrubler, R. et al. Journal of visualized experiments (2018) beschriebene Hühnerei-Test (HET-CAM) eingesetzt.
Mit diesem Ansatz ist es möglich zu testen, ob die Anwendung einer
ausgewählten Verbindung oder eines Extrakts den Blutzuckerspiegel in einem lebenden Organismus reduziert. Deshalb wurden der hausgemachte Extrakt sowie die beiden PECKISH-Extrakte in HBSS-Puffer (300 mg/L) gelöst. NovoRapid, ein schnell wirkendes Humaninsulinanalogon, wurde als Positivkontrolle (3,3 U/ml) zum Nachweis der Insulinempfindlichkeit eingesetzt. Nach der Inkubation mit den Extrakten für 1 bzw. 2 h wurden die Blutzuckerwerte über ei n
Blutzuckermessgerät gemessen.
Wie in Abb. 3A dargestellt, führten alle drei Extrakte zu einem vergleichbaren Rückgang des Blutzuckerspiegels (~20% nach 1 h bzw. 30% nach 2 h), der nach 18
2 h Inkubationszeit statistisch signifikant war, wobei der homemade Extrakt die besten Ergebnisse zeigte.
Die Behandlung mit NovoRapid führte zu einer Reduktion von ~16% nach 1 h und zu einem signifikanten Effekt von ~33% nach 2 h.
Es wurde kürzlich von Haselgrubler, R. et al. PloS one (2017) gezeigt, dass HBSS- Puffer allein auch zu einer gewissen Senkung des Blutzuckerspiegels führt und dass sich ddH20 als besseres Lösungsmittel für die Testdurchführung erwiesen hat.
Deshalb wurden die zuvor beschriebenen Experimente unter diesen Bedingungen wiederholt.
Wie in Abb. 2B gezeigt, führte ddH20 allein nur zu einer nicht signifikanten Reduktion von ~3%, was seine bevorzugte Anwendbarkeit bestätigt. Darüber hinaus konnten die Extrakte den Blutzuckerspiegel zu beiden Zeitpunkten signifikant senken (~12% nach 1 bzw. 2 h), wobei hier der homemade Extrakt langfristig die besten Ergebnisse zeigte.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die erfindungsgemäßen
Gänseblümchenextrakte sowohl in vitro als auch in vivo den Blutzuckerspiegel senken.
2.3 Identifizierung und Quantifizierung von Polvphenolen in
Gänseblümchenextrakt
Es wurde der Polyphenolgehalt des erfindungsgemäßen homemade
Gänseblümchenextraktes mittels HPLC-MS angewendet wurde. Zunächst wurden Verbindungen mittels Massenspektrometrie und UV-Spektren identifiziert und anschließend mittels Kalibrierkurven der relevanten Standards quantitativ bestimmt. 13 polyphenolische Verbindungen wurden identifiziert und quantifiziert: Rutin, Hyperosid, Isoquercitrin, Guaijaverin, Avicularin, Quercitrin, Quercetin (Flavonole), Apigenin-7-Glucosid (auch bekannt als Apegetrin), Apigenin-7- Glucuronid, Apigenin (Flavone), Neochlorogensäure, Chlorogensäure und
Kaffeesäure (Hydroxycinnamsäuren). Darüber hinaus wurden Kaempferol und Luteolin mittels HPLC-MS-Analyse identifiziert, jedoch aufgrund fehlender
Standards und überlappender Retentionszeiten nicht quantitativ bestimmt. 19
Ein repräsentatives HPLC-DAD-Chromatogramm, das Retentionszeiten und maximale Wellenlängen jeder Verbindung angibt, ist in Abb. 3 dargestellt. Tabelle 1 fasst den Gehalt an identifizierten Polyphenolen zusammen. Die bekannteste Hydroxycinnaminsäure war Chlorogensäure (2,69 mg/L), Apigenin -7-Glucosid und Apigenin-7-Glucuronid (überlappende Retentionszeiten) wurden als sehr häufig vorkommende Flavone (0,42 mg/L) gefunden, während Quercitrin als
Hauptflavonol (0, 1 mg/L) nachgewiesen wurde. Alle anderen Polyphenole wurden nur in niedrigeren Konzentrationen nachgewiesen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass polyphenolische Verbindungen reichlich in Gänseblümchenextrakt enthalten sind und zur Senkung des Blutzuckerspiegels beitragen können.

Claims

20 Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung eines Extraktes aus Gänseblümchen (Bellis
perennis), umfassend:
a) Bereitstellen eines zu extrahierenden Materials, hergestellt aus
Gänseblümchen;
b) Extraktion des zu extrahierenden Materials mit einem wässrigen
Lösungsmittel, um einen Extrakt zu erhalten.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das zu extrahierende Material die Blüten und/oder Blätter von Gänseblümchen umfasst.
3. Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das zu extrahierende Material die Blüten von Gänseblümchen umfasst.
4. Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das zu extrahierende Material vor der Extraktion zu einem Feststoff mit einem Wassergehalt von 8 Gew. % bis 10 Gew. % getrocknet wird.
5. Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das wässrige Lösungsmittel eine Mischung aus Wasser und mindestens einen Alkohol, vorzugsweise Ethanol, in einem Volumenverhältnis von 10 zu 1 bis 1 zu 1 umfasst.
6. Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren ferner den Schritt
c) Behandlung der Mischung aus dem zu extrahierenden Material, hergestellt aus Gänseblümchen, und dem wässrigen Lösungsmittel aus Schritt b) mit Ultraschall,
umfasst.
7. Verfahren gemäß irgendeinem der vorherigen Ansprüche, wobei der
erhaltene Extrakt die Verbindungen Neochlorogensäure, Chlorgensäure, Kaffeesäure, Rutin, Hyperosid, Isoquercitrin, Guaijaverin, Avicularin, Quercitrin, Kaempferol, Luteolinapigenin-7-glucosid, Apigenin-7-glucuronid und/oder Apigenin, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,001 bis 5 mg/mL, umfasst. 21
8. Extrakt erhältlich durch das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7.
9. Zusammensetzung, umfassend den Extrakt nach Anspruch 8.
10. Zusammensetzung gemäß Anspruch 9, ferner umfassend einen Extrakt aus den Früchten der Echten Guave (Psidium Guajava).
11. Zusammensetzung gemäß Anspruch 10, wobei der eine Extrakt aus
Früchten der Echten Guave (Psidium Guajava) erhältlich ist durch ein Verfahren umfassend die Schritte
a l) Bereitstellen eines zu extrahierenden Materiales, hergestellt aus Früchten der Echten Guave;
bl) Destraktion des zu extrahierenden Materiales mit Kohlenstoffdioxid als Destraktionsmittel in einer Hochdruckextraktionsanlage, um einen Extrakt zu erhalten.
12. Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 9 bis 11, zur
Verwendung als Nahrungsergänzungsmittel und/oder Arzneimittel .
13. Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 9 bis 11, zur
Verwendung zur Reduzierung von Blutzuckerspitzen und/oder zur
Hemmung intestinaler Glukose-Resorption und/oder zur Gewichtsreduktion.
14. Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 9 bis 11, zur
Verwendung bei der Behandlung oder Prävention von Diabetes mellitus und/oder Hyperglykämie und/oder Adipositas.
15. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 9 bis 11, insbesondere eines Nahrungsergänzungsmittels, umfassend :
a) Bereitstellen eines Gänseblümchenextraktes, erhältlich durch das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 und gegebenenfalls eines Extraktes aus Früchten der Echten Guave (Psidium Guajava), vorzugsweise erhältlich durch das Verfahren gemäß Anspruch 11;
b) Aufträgen des Extraktes bzw. der Extrakte auf eine Trägersubstanz, insbesondere durch Aufsprühen einer Lösung des Extraktes bzw. der 22
Extrakte auf eine Trägersubstanz, um eine extrakthaltige Trägersubstanz zu erhalten;
c) Mischen der extrakthaltigen Trägersubstanz mit weiteren Bestandteilen der Zusammensetzung, insbesondere des Nahrungsergänzungsmittels.
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