DE69725749T2

DE69725749T2 - Substanz in form eines wässrigen extrakts von pflanzenrohmaterial zur behandlung onkologischer krankheiten sowie verfahren zu deren herstellung

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Publication number: DE69725749T2
Application number: DE69725749T
Authority: DE
Inventors: Georgy Nikolaevich Vorozhtsov; Elena Jurievna Vinokurova; Olga Alexeevna Gavriljuk; Natalya Ivanovna Moskovskaya obl. Dzerzhinsk KAZACHKINA; Jury Mikhailovich Luzhkov; Elena Romanovna Nemtsova; Genrikh Alexandrovich Tolstikov; Valery Ivanovich Chissov; Elvira Eduardovna Shults; Raisa Ivanovna Yakubovskaya
Original assignee: CORTEY PIERRE ET AL; G NAUCHNY TS ROSSIISKOI FEDERA; GOSUDARSTVENNY NAUCHNY TSENTR ROSSIISKOI FEDERATSII "NIOPIK" (GNTS RF "NIOPIK"); MO NI ONKOLOGICHES INST; Moskovsky Nauchno-Issledovatelsky Onkologichesky Institut Imeni Pa Gertsena; NOVOSIB I ORCH KHIM NOVOSIB; Novosibirsky Institut Organicheskoi Khimii Sibirskogo Otdelenia
Current assignee: Fgup Gnts "niopik" Moskau/moskva Ru; MOSKOVSKY NAUCHNO-ISSLEDOVATELSKY ONKOLOGICHESKY I; Novosibirsky Institut Organicheskoi Khimii Sibirskogo Otdelenia
Priority date: 1996-12-04
Filing date: 1997-12-03
Publication date: 2004-07-29
Anticipated expiration: 2017-12-04
Also published as: EP0934746A1; EP0934746A4; EP0934746B1; ATE252390T1; DE69725749D1; WO1998024458A1; RU2118166C1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Medizin, genauer auf Phytotherapie und noch genauer auf ein Mittel zur Behandlung onkologischer Krankheiten, wobei das besagte Mittel einen wässrigen Extrakt von pflanzlichem Ausgangsmaterial umfasst, und bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung desselben.
Im Stand der Technik ist ein Antikrebspräparat bekannt, das als eine seiner Komponenten einen Extrakt einer Pflanze der Gattung Geranium umfasst. Die Rezeptur dieses Präparates umfasst außerdem Schwefelsäure, Borsäure, einen Alkohol und Glycerol [1].
Ein Nachteil dieses Mittels ist, dass es nur für externe Anwendungen empfohlen werden kann.
Es ist eine Zusammensetzung bekannt, die als Hilfsmittel empfohlen wird, welches die Antitumoraktivität steigert, deren Rezeptur Extrakte von Astragalis, Pasonia, und Angelika (lat. Angelica) umfasst [2], neben anderen wässrigen oder wässrig-organischen Extrakten von Pflanzen.
Im Stand der Technik ist auch eine Mehrkomponentenzusammensetzung zur Antitumorbehandlung bekannt, die Pflanzen der Gattungen Palantago und Angelika als Komponenten umfasst.
Diese Zusammensetzungen sind nachteilig, da sie Multikomponentenzusammensetzungen sind.
Die vorliegende Erfindung war auf die Bereitstellung eines Mittels gerichtet zur Behandlung onkologischer Krankheiten in der Form von wässrigen Extrakten von pflanzlichem Ausgangsmaterial, wobei das besagte Ausgangsmaterial eine hinreichend einfache Zusammensetzung aufweist, und auf die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung desselben.
Zum Lösen des gestellten Problems wird ein Mittel umfassend wässrige Extrakte von Pflanzen der Gattungen Geranium, Plantago, und einer Pflanze der Gattung Calendula officinalis vorgeschlagen, welches, mit den folgenden Verhältnissen von Wasser und Pflanzen hergestellt wird, g:

Geranium 300–360 frisch oder 10–60 trocken

Plantago 10–60 trocken

Calendula officinalis 10–60 trocken

Wasser 3000

und Pentaphylloides fruticosa in eine Menge von 10–60 g (trocken). Außer Pentaphylloides fruticosa kann eine Pflanze der Gattung Angelika in einer Menge von 10–60 g (trocken) hinzugesetzt werden. Die Verwendung von einzelnen Komponenten des vorgeschlagenen Mittels in Mengen, die kleiner als die unteren Werte der besagten Bereiche sind, senkt den therapeutischen Effekt, wogegen die oberen Werte der besagten Bereiche durch das Volumen des Wassers begrenzt werden, dass für das Herstellen der besagten wässrigen Extrakte benötigt wird.
In der vorgeschlagenen Zusammensetzung kann die Pflanze der Gattung Geranium durch die Arten sibiricum, pratense und robertianum vertreten werden; Plantago kann durch die Arten lanceolata und media vertreten werden; Angelika kann durch die Arten sylvestris und decurrens vertreten werden.
Es ist ein Verfahren zur Herstellung eines wässrigen Extraktes von Pflanzen bekannt, bei welchem sie mit Wasser oder einem wässrig-organischen Lösungsmittel behandelt werden [4].
Es ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines Mittels von pflanzlicher Herkunft bekannt welches die Extraktion von kleingeschnittenem (engl. comminuted) Gras mit Wasser durch Mazeration gefolgt von Filtration und Re-Mazeration des pflanzlichen Ausgangsmaterials umfasst [5]. Dieses Verfahren scheint technisch kompliziert zu sein, da es eine Zweistufen-Mazeration einschließt.
Es ist ein Gegenstand der vorgeschlagenen Erfindung, ein einfaches Verfahren zur Herstellung eines wässrigen Extraktes von Pflanzen zur Behandlung onkologischer Krankheiten bereitzustellen. Zur Lösung dieses Problems wird vorgeschlagen, Pflanzen (Gras, Blätter oder Wurzeln) in Wasser zu mazerieren, mit nachfolgendem Filtern und Zentrifugation.
Die biologische Aktivität der Pflanzenextrakte wurde durch Bestimmen der antioxidativen und zytotoxischen Aktivität in vitro untersucht, genauso wie die Toxizität und Antitumoraktivität in vivo.
Die antioxidative Aktivität der Extrakte wurde aus der Fähigkeit der Probe, die Fettsäure Peroxidationsvorgänge (lipid peroxidation processes, LPP) in Mäuseleberhomogenaten [6] zu inhibieren bestimmt.
Die zytotoxische Aktivität der Extrakte wurde in vitro mit Hilfe eines biologischen Tests bestimmt, der auf der Inhibierung der Vermehrung der inokulierten Zellkultur des humanen Lungen-Adenokarzinoms A-549 basiert [7].
Die Antitumoraktivität der Extrakte wurde an Mäusen BDF₁ bestimmt, die an Leukämie litten, wobei unterschiedliche Dosen der Extrakte verwendet wurden. Die Bestimmungskriterien waren die Hemmung des Tumorwachstums und eine Zunahme in der Lebensdauer der Tiere.
Zusätzlich wurde der Effekt der Extrakte auf die therapeutische Aktivität des zytstatischen cis-Diamindichloroplatin (DDP) [8] abgeschätzt.
Die vorgeschlagene Erfindung wird durch die unten dargestellten Beispiele illustriert.
Vergleichsbeispiel 1
360 g kleingeschnittenes frisches Gras von Geranium sibiricum, 25 g trockene Blätter von Plantago lanceolata, und 25 g trockene Blätter von Calendula officinalis werden in 3000 g Wasser bei 25°C für 8 Tage durchnässt. Mit Abschluss der Mazerationsprozedur wird der Extrakt gefiltert und unter Standartbedingungen zentrifugiert (20°C, 3000 rpm, 40 min). Das Präzipitat wird verworfen und der Extrakt wird verwendet.
Vergleichsbeispiele 1a–1e
Extrakte der Pflanzen werden gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellt, aber die Menge der Komponenten der Mischung und die Mazerationsbedingungen werden variiert. Die Rezepturen sind in Tabelle 1 angegeben.
Beispiele 2–2h
Extrakte der Pflanzen werden gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellt, aber geschnittene trockene Sprossen der Pflanze Pentaphylloides fruticosa werden der Rezeptur der Mischung, die durchnässt wird, zugesetzt. Die Rezepturen des pflanzlichen Ausgangsmaterials und die Mazerationsbedingungen sind in Tabelle 1 dargestellt.
Beispiele 3-3f
Extrakte der Pflanzen werden gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellt, aber es werden zusätzlich zu Pentaphylloides fruticosa kleingeschnittene unterirdische Organe der Pflanze Angelika (Arten sylvestris und decurrens) in die Rezeptur der Mischung, die durchnässt wird, eingebracht. Die Rezepturen des pflanzlichen Ausgangsmaterials und der Mazerationsbedingungen sind in Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1
Bestimmung der antioxidativen Aktivität von pflanzlichen Extrakten
Die antioxidative Aktivität wurde unter Verwendung einer Methode untersucht, die auf der Fähigkeit der untersuchten Probe basiert, die LPP-Prozesse in Mäuseleberhomogenaten zu inhibieren [6]. Die Leber von BDF-1 unbestimmten (engl. nondescript) Mäusen wurde in einem Glas Homogenisator homogenisiert und zentrifugiert. Das Leberhomogenat wurde in einer Menge von 5–6 mg Protein pro Test eingebracht. Das Volumen des Testes wurde mit einer Lösung der Probe, die auf ihre antioxidative Aktivität getestet wurde, auf 0,5 ml eingestellt. Die Tests wurden für 3 h bei 37°C inkubiert.
Die Konzentration der LPP Produkte wurde aus einer Farbreaktion mit Thiobarbitursäure bestimmt. Die Menge des Antioxidants, die für eine fünfzigprozentige Inhibierung des LPP benötigt wurde, wurde als bestimmungsgemäße (engl. conventional) Einheit für die untersuchte Probe festgesetzt.
Die Resultate sind in den Tabellen 2 und 2a dargestellt.
Tabelle 2 Vergleich der antioxidativen Aktivität von Proben von pflanzlichen Extrakten mit der Aktivität von antioxidativen Präparaten des Standes der Technik
Tabelle 2a Vergleich der antioxidativen Aktivität von Proben von pflanzlichen Extrakten bei Lagerung
Wie aus Tabelle 2 ersehen werden kann, haben die Extrakte 1, 2, und 3 eine hohe antioxidative Aktivität in dem Test in vitro, die die antioxidative Aktivität von bekannten antioxidativen Vitaminen nennenswert überschreitet: A, C und β-Carotin (4, 28 bzw. 55-Fach). Bei Lagerung der pflanzlichen Extrakte (Tabelle 2a) für 16–30 Tage, wird ihre Aktivität um einen Faktor von 1,5–2 niedriger aufgrund der Bildung eines Präzipitats, in welches auch aktive Komponenten eingebunden sind. Nichtsdestoweniger bleibt die antioxidative Aktivität nennenswert höher als die Aktivität von Vitaminpräparaten.
Bestimmung der zytotoxischen Aktivität von Extraktproben in vitro
Bei Durchführung des zytotoxischen biologischen Tests in vitro wurde jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit flachem Boden und 96 Vertiefungen (Sarstedt, USA) mit 10 μl einer Suspension von A549-Linien Zellen in einer Konzentration von 1 × 10⁵ Zellen/ml beladen; 24 h später wurden Serienverdünnungen von den pflanzlichen Präparaten in der im Bereich von 1 : 4–1 : 64 hinzugefügt, welches 3,0–0,1 mg/ml in dem Volumen von 100 μl/Vertiefung entspricht. Die zytotoxische Aktivität der Extrakte und DDP wurde colorimetrisch bestimmt [7]. Die Ergebnisse wurden als Prozent der Inhibition der Vermehrung der A-549 Testkultur ausgedrückt. Die zytotoxische Aktivität der Probe wurde als der maximale Titer der Probe festgesetzt, bei welcher der biologisch signifikante (50%) Wert an Inhibition der Vermehrung der A-549 Testkultur beobachtet wurde.
Die Resultate sind in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3 Zytotoxische Aktivität von Proben von pflanzlichen Extrakten ausgedrückt als Inhibition der Vermehrung einer Zellkultur des humanen Lungenadenokarzinoms A-549
Wie aus Tabelle 3 ersehen werden kann, haben die untersuchten Proben der pflanzlichen Extrakte eine zytisch-toxische Aktivität in den Experimenten in vitro. Die maximale Fähigkeit, die Proliferation der Zellkultur A-549 zu inhibieren, wurde in Probe 2 beobachtet (66–80% bei der Konzentration von 0,1 mg/ml), aber sie war ein Zehntel von derjenigen von DDP (68% bei der Konzentration von 0,01 mg/ml), d. h. von dem Präparat, das üblicherweise als Kontrolle für induzierte Zytotoxitität verwendet wird.
Untersuchung der Verträglichkeit gegenüber Proben von pflanzlichen Extrakten
Die Verträglichkeit gegenüber den Proben und die Harmlosigkeit der Proben wurde an Tieren, die mit L-1210 subcutan inokuliert waren, untersucht. Proben der Extrakte wurden viele Male während der Lebenszeit der Tiere durch eine Sonde verabreicht, beginnend mit dem ersten Tag des Tumorwachstums, in einzelnen Dosen von 5,4 und 10,8 ml/kg in einem Volumen von 0,2 ml oder interaperitoneal in einem Volumen von 1 ml. Kontroll-Mäusen wurde eine 0,9% NaCL-Lösung statt der pflanzlichen Extrakte verabreicht.
Der toxische Effekt wurde anhand der Änderung des Körpergewichtes der Mäuse und aus ihrer äußerlichen Erscheinung (Verhalten, die Erscheinung der Behaarung, ihre Bewegungsaktivität) abgeschätzt. Für eine quantitative Abschätzung der Veränderungen in der Bewegungsaktivität wurde eine Integralkenngröße (engl. integral characteristic) eingesetzt: (a/b) × 100%, worin a die Gesamtzahl der Mäuse mit einer erniedrigten Bewegungsaktivität vom 1. bis 6. Tag des Tumorwachstums ist, und b die Gesamtzahl der Beobachtungen vom 1. bis 6. Tag des Tumorwachstums ist (eine Beobachtung – eine lebende Maus pro Tag).
Die Ergebnisse der Experimente zeigten, dass die pflanzlichen Extrakte in einer einzelnen Dosis von 5,4 ml/kg das Körpergewicht, Verhalten, die äußere Erscheinung der Behaarung oder die Bewegung der Mäuse nicht beeinflussen. Die Verabreichung von einigen pflanzlichen Extrakten der Serie in einer einzelnen Dosis von 10,8 ml/kg führten zu einem schwachen toxischen Effekt, der sich einer Reduktion der Motoraktivität der Testtiere in 5– 10% der Beobachtungen manifestierte (1).
Eine Steigerung der einzelnen Dosis der pflanzlichen Extrakte auf 1 ml (maximal mögliches Volumen) im Falle einer einzelnen intraperitonealen Verabreichung der Präparate der Serien b, c, d führte nicht zu einer Entwicklung von sichtbaren Störungen im Verhalten und äußeren Erscheinungsbild der Tiere oder verursachte ihren Tod. Dies deutet darauf hin, dass die LD₁₀-, LD₅₀- und LD₁₀₀-Werte für diese speziellen pflanzlichen Extrakte nicht bestimmt werden können.
Bestimmung der Antitumoraktivität der Proben von pflanzlichen Extrakten
Lymphoide Leukämie L1210 wurde BDF₁ männlichen Tieren in einer sterilen physiologischen Salzlösung inokuliert, wobei 3 × 10⁶ Zellen in 0,2 ml Volumen waren. Der Tag der Inokulation wurde als der Tag Null des Tumorwachstums betrachtet. Die Extraktproben und DDP wurden in den Dosen und unter den Bedingungen, die in Tabellen 4 und 5 angegeben sind, verabreicht.
Die Behandlung der Tiere wurde 24 Stunden nach der Tumor-Inokulation begonnen, Kontrolltieren wurde eine physiologische Salzlösung statt der pflanzlichen Extrakte verabreicht. Die Antitumor-Effekte wurden von der Tumorwachstumsinhibition (tumor growth inhibition, TGI) bestimmt, die aus der folgenden Formel errechnet wurde:
TGI = [(Vcontrol – Vexperiment)/Vcontrol] × 100%; die mittlere Lebensdauer (mean lifetime, ML) und die Zunahme der Lebensdauer (lifetime increase, LI) wurden aus der Formel errechnet:
LI = [(MLexperiment – MLcontrol)/MLcontrol] × 100%. TGI > 50%, LI > 50% wurden als biologisch signifikante Effekte angesehen.
Die gewonnenen Daten wurden gemäß dem Fisher-Student-Verfahren unter Verwendung statistischer Programme verarbeitet. Die Unterschiede wurden bei p < 0,05 als sicher angesehen.
Die Ergebnisse des Einflusses der pflanzlichen Extrakte sind in Tabelle 4 dargestellt, woraus ersichtlich ist, dass die Präparate 2 und 3 in der Lage sind, das Wachstum L1210 in vivo zu inhibieren.
Die Ergebnisse der Aktivität der pflanzlichen Extrakte auf die heilende Wirkung von DDP sind in Tabelle 5 dargestellt. Wie aus Tabelle 5 ersehen werden kann, erhöhen die Präparate 2 und 3 den therapeutischen Effekt des Zytostatikums, wobei sie eine Erhöhung des TGI-Wertes am 6. und 8. Tag des Tumorwachstums bewirken.
Tabelle 4 Einfluss der Proben von pflanzlichen Extrakten auf das L1210-Wachstum
Tabelle 5 Einfluss der Proben von pflanzlichen Extrakten auf die heilende Wirkung von DDP
Wie aus Tabellen 4 und 5 ersehen werden kann, reduzieren die Präparate 2 und 3 nicht den therapeutischen Effekt von DDP, und unter definierten Verabreichungsbedingungen verstärken sie ihn sogar. Die Präparation 3 hat ihren eigenen schwach ausgeprägten Antitumor-Effekt, wobei sie eine biologisch signifikante Inhibierung des Tumorwachstums in den frühen Phasen der Tumorentwicklung bewirkt.
Daher sind die pflanzlichen Extrakte für die Verwendung in der onkologischen Praxis vielversprechend, wenn sie in Antitumor-Therapieverfahren eingebunden werden.

Claims

Zusammensetzung zur Behandlung von onkologischen Krankheiten in der Form eines wässerigen Extrakts von pflanzlichem Ausgangsmaterial, dadurch gekennzeichnet, dass sie Extrakte von Pflanzen der Gattungen Geranium, Plantago und einer Pflanze der Spezies Calendula officinalis sowie einer Pflanze der Spezies Pentaphylloides fruticosia umfasst, hergestellt mit dem nachfolgenden Anteil an Pflanzen und Wasser in g: Geranium 10–60 trocken oder 300–360 frisch Plantago 10–60 trocken Calendula officinalis 10–60 trocken Pentaphylloides fruticosa 10–60 trocken Wasser 3000
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich einen Extrakt einer Pflanze der Spezies Angelika umfasst, hergestellt aus 10–60 g der besagten trockenen Pflanze
Verfahren zur Herstellung eines wässerigen Extrakts aus pflanzlichem Ausgangsmaterial zur Behandlung onkologischer Krankheiten, dadurch gekennzeichnet, dass Pflanzen der Gattungen Geranium, Plantago und eine Pflanze der Spezies Calendula officinalis und eine Pflanze der Spezies Pentaphylloides fruticosa in Wasser mazeriert werden, mit nachfolgendem Filtrieren und Zentrifugation.
Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze Angelika zusätzlich in die Zusammensetzung des pflanzlichen Ausgangsmaterials zur Mazeration eingebracht wird.