EP1877069A2 - Neue verwendung von spiegelmeren - Google Patents

Neue verwendung von spiegelmeren

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Publication number
EP1877069A2
EP1877069A2 EP06742799A EP06742799A EP1877069A2 EP 1877069 A2 EP1877069 A2 EP 1877069A2 EP 06742799 A EP06742799 A EP 06742799A EP 06742799 A EP06742799 A EP 06742799A EP 1877069 A2 EP1877069 A2 EP 1877069A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
helix
nucleic acid
section
hmga
nucleotides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
EP06742799A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Florian Jarosch
Christian Maasch
Sven Klussmann
Axel Vater
Dirk Eulberg
Werner Purschke
Klaus Buchner
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
TME Pharma AG
Original Assignee
Noxxon Pharma AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Noxxon Pharma AG filed Critical Noxxon Pharma AG
Priority to EP09016125A priority Critical patent/EP2206501A3/de
Publication of EP1877069A2 publication Critical patent/EP1877069A2/de
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Definitions

  • the present invention relates in one aspect to a new use of aptmers.
  • the present invention relates to HMG protein binding aptmers.
  • the target molecules can basically be divided into two groups.
  • the first group comprises target molecules which are present extracellularly and thus in principle be brought into contact with it by administering an active substance into a body fluid or a body cavity containing the target molecule.
  • the first group of target molecules are also referred to herein as extracellular target molecules.
  • the second group of target molecules includes target molecules that are present in cells, which cells are related to the disease to be treated or the disposition for the disease. It is not necessary that the target molecule is directly responsible for the disease state or is directly related to the disposition for the disease.
  • the second group of target molecules are also referred to herein as intracellular target molecules.
  • target molecule ie, extracellular or intracellular target molecule
  • target molecule basically determines the class of compounds that can be used to provide the therapeutic or preventive effect necessary interaction between the drug, typically the pharmaceutical agent, and the target molecule.
  • small molecules can be used almost ubiquitously, ie chemical compounds with a molecular weight of typically 1000 or less daltons. These molecules can interact directly with extracellular but also with intracellular target molecules as desired.
  • new classes of drugs have been developed by the biotechnology industry, such as antibodies, in particular monoclonal antibodies, antisense molecules, siRNA molecules, aptamers and aptmers.
  • aptamers and spiegelmers d. H. functional nucleic acids with a defined three-dimensional structure, which allows the specific interaction with the respective target molecules.
  • the use of aptamers to target intracellular target molecules uses genetic engineering methods, more specifically, gene therapy.
  • the aptamers directed against an intracellular target molecule, also called intramers are introduced into the respective target cells by means of genetic engineering methods.
  • intracellular expression of intracellular expression of an intracellular nucleic acid coding for the respective aptamer is in principle closed to the Spiegelmers since no biological system exists, which Spiegelmers, d. H. L-nucleotide aptamers would be able to build up.
  • the object is achieved in a first aspect by the use of an L-nucleic acid as intracellular active agent.
  • the L-nucleic acid is a spiegelmer.
  • the L-nucleic acid interacts with an intracellular receptor.
  • the intracellular receptor is selected from the group comprising molecular receptors, enzymes, chaperone molecules, signal peptides, intracellular structures and metabolic intermediates.
  • the intracellular receptor is selected from the group comprising polypeptides, carbohydrates, nucleic acids, lipids and combinations thereof.
  • the L-nucleic acid interacts with an intracellular receptor within a cell.
  • the intracellular receptor is selected from the group comprising transcription factors and an AT hook-binding DNA-binding protein.
  • the intracellular receptor is selected from the group comprising the HMG proteins, preferably from the group comprising HMGA1, HMGA1a, HMGA1b, and HMGA2.
  • the object is achieved in a second aspect by a method for binding an intracellular receptor comprising:
  • the incubation is carried out under conditions such that the L-nucleic acid binds to the intracellular receptor in the cell.
  • the L-nucleic acid is a spiegelmer.
  • a binding, in particular an intracellular binding, of the L-nucleic acid takes place at the intracellular receptor is determined after incubation of the cell with the L-nucleic acid, whether a binding, in particular an intracellular binding, of the L-nucleic acid takes place at the intracellular receptor is.
  • the intracellular receptor is selected from the group comprising molecular receptors, metabolic intermediates and enzymes.
  • the intracellular receptor is selected from the group comprising polypeptides, carbohydrates, nucleic acid, lipids and combinations thereof.
  • the intracellular receptor is selected from the group comprising transcription factors and an AT hook-binding DNA-binding protein.
  • the intracellular receptor is selected from the group comprising HMG proteins, preferably selected from the group comprising HMGA1, HMGA1a, HMGA1b and HMGA2.
  • the object is achieved in a third aspect by the use of an L-nucleic acid for the production of a medicament for the treatment and / or prevention of a disease, wherein the target molecule of the medicament is an intracellular target molecule.
  • the intracellular receptor is selected from the group comprising molecular receptors, enzymes, chaperone molecules, signal peptides, intracellular structures and metabolic intermediates.
  • the intracellular receptor is selected from the group comprising polypeptides, carbohydrates, nucleic acids, lipids, and combinations thereof.
  • the target molecule is selected from the group comprising transcription factors and an AT hook-binding DNA-binding protein.
  • the target molecule is selected from the group comprising HMG proteins, preferably selected from the group comprising HMGA1, HMGA1a, HMGA1b and HMGA2.
  • the disease is selected from the group comprising tumor diseases, viral infections and arteriosclerosis.
  • the tumor disease is selected from the group comprising mesenchymal tumors, epithelial tumors, benign tumors, malignant tumors and metastatic tumors.
  • the target molecule HMGA and the disease are selected from the group comprising carcinomas of the prostate, pancreas, thyroid, cervix, stomach, breast, colon / Rectum, ovaries; neuroblastomas; Lymphomas, uterine leiomyomas; lipomas; endometrial polyps; chondroid hamartomas of the lung; pleomorphic adenomas of the salivary glands; Hämangiopericytome; chondromatous tumors; aggressive angiomyomas; diffuse astrocytomas; osteoclastomas; Skin cancer; Burkitts lymphoma; Lewis lung cancer; Leukemia; non-small cell lung carcinoma; and in each case metastases and / or metastatic forms thereof.
  • arteriosclerosis is triggered or caused by HMGA1, HMGA1a, HMGIb and / or HMGA2 mediated formation of atherosclerotic plaques.
  • the intracellular target molecule is intracellular.
  • the object is achieved in a fourth aspect by the use of an L-nucleic acid for the production of a diagnostic agent for diagnosis, wherein the target molecule of the diagnostic agent is an intracellular target molecule.
  • the intracellular receptor is selected from the group comprising molecular receptors, enzymes, chaperone molecules, signal peptides, intracellular structures and metabolic intermediates.
  • the intracellular receptor is selected from the group comprising polypeptides, carbohydrates, nucleic acids, lipids and combinations thereof.
  • the target molecule is selected from the group comprising transcription factors and AT hook-binding DNA-binding proteins.
  • the target molecule is selected from the group comprising HMG proteins, preferably selected from the group comprising HMGA, HMGAIa, HMGAIb and HMGA2.
  • the disease is selected from the group comprising tumor diseases, viral infections and arteriosclerosis.
  • the tumor disease is selected from the group comprising mesenchymal tumors, epithelial tumors, benign tumors, malignant tumors, and metastatic tumors.
  • the target molecule is HMGA and the disease is selected from the group comprising carcinomas of the prostate, pancreas, thyroid, cervix, stomach, breast, Colon / rectum, ovaries; neuroblastomas; Lymphomas, uterine leiomyomas; lipomas; endometrial polyps; chondroid hamartomas of the lung; pleomorphic adenomas of the salivary glands; Hämangiopericytome; chondromatous tumors; aggressive angiomyomas; diffuse astrocytomas; osteoclastomas; Skin cancer; Burkitts lymphoma; Lewis lung cancer; Leukemia; non-small cell lung carcinoma; and in each case metastases and / or metastatic forms thereof.
  • arteriosclerosis is triggered by HMGA1, HMGA1a
  • the intracellular target molecule is intracellular.
  • the object is achieved in a fifth aspect by a composition comprising an L-nucleic acid binding to an intracellular target molecule and a delivery vehicle.
  • the delivery vehicle is a delivery vehicle suitable for intracellular delivery of the L-nucleic acid.
  • the delivery vehicle is selected from the group comprising vehicles, conjugates and physical measures.
  • the delivery vehicle is a vehicle, wherein the vehicle is selected from the group comprising liposomes, nanoparticles, microparticles, cyclodextrins or dendrimers, or a vesicle consisting of Polypeptides, polyethylenimine and / or amphipathic molecules.
  • the delivery vehicle is a conjugate, wherein the conjugate is a receptor-mediated endocytosis conjugate, a fusogenic peptide conjugate, a signal peptide conjugate, a conjugate with a nucleic acid, preferably a conjugate with a aptmer or a lipophilic conjugate.
  • the conjugate is a receptor-mediated endocytosis conjugate, a fusogenic peptide conjugate, a signal peptide conjugate, a conjugate with a nucleic acid, preferably a conjugate with a aptmer or a lipophilic conjugate.
  • the delivery vehicle is a physical measure, wherein the dimensional preferably is selected from the group comprising electroporation, iontophoresis, pressure, ultrasound and shock waves.
  • the delivery vehicle comprises polyethyleneimine.
  • the polyethyleneimine is a branched polyethyleneimine having a molecular weight of about 25 kDa.
  • the polyethyleneimine forms a micelle or a micelle-like structure.
  • the L-nucleic acid is a spiegelmer.
  • the aptmer carries a modification, wherein the modification is selected from the group comprising PEG residues.
  • the PEG moiety has a molecular weight of about 1,000 to 10,000 Da, preferably a molecular weight of about 1,500 to 2,500 Da, and most preferably a molecular weight of about 2,000 Da ,
  • the modification is bound to the 5 'terminus or the 3' terminus of the L-nucleic acid.
  • the ratio of the total number of the nitrogen groups of the polyethyleneimine and the total number of the phosphate groups of the nucleic acid contained in the composition is about 1 to 20, before- usually about 1.5 to 10, more preferably about 2 to 5, and most preferably about 2 to 3.
  • the composition provides the L-nucleic acid intracellularly.
  • the object is achieved in a sixth aspect by the pharmaceutical composition
  • the pharmaceutical composition comprising a composition according to the fifth aspect, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the L-nucleic acid is a composition according to the fifth aspect.
  • the L-nucleic acid is a composition according to the fifth aspect.
  • the L-nucleic acid is a composition according to the fifth aspect.
  • the L-nucleic acid is a composition according to the fifth aspect.
  • an HMGA-binding nucleic acid characterized in that the nucleic acid comprises a section box Al and a section box A2, wherein the section box Al and the section box A2 are interconnected by an intermediate section and wherein Box Al and Box A2 are individually and independently selected from the group comprising GGGCG, GGGUG and GGGAG.
  • the intermediate section consists either of an intermediate section Z1 comprising six or seven nucleotides or of an intermediate section Z2 comprising 12 to 25 nucleotides.
  • the nucleic acid at the 5 'end of the section Box Al has a first portion and at the 3' end of the portion Box A2 a second portion, preferably both Sections independently comprise four to eight nucleotides each.
  • the two sections are at least partially or completely hybridized with each other, wherein the hybridization extends over four to eight nucleotide pairs.
  • the nucleic acid has a section Helix A1 at the 5 'end of the section Box Al and a section Helix A2 at the 3' end of the section Box A2 , wherein preferably the portion Helix Al comprises four to eight nucleotides, and preferably the portion Helix A2 comprises four to eight nucleotides, and wherein preferably the portion helix Al represents the first portion at the 5 'end of the portion box Al or a part thereof, and wherein preferably the section Helix A2 represents the second section at the 3 'end of the section Box A2 or a part thereof, wherein the length of the section Helix Al is independent of the length of the section Helix A2.
  • the sections Helix Al and Helix A2 are at least partially or completely hybridized with each other, the hybridization extending over four to eight nucleotide pairs.
  • a section Helix B2 is arranged, wherein preferably the length of the section Helix Bl and Helix B2 individually and independently comprises a length of four to eight nucleotides.
  • the sections Helix Bl and Helix B2 are at least partially or hybridized completely to each other, wherein the hybridization extends over four to eight nucleotide pairs.
  • nucleotides are arranged between the 3 'end of the section Helix Al and the 5' end of the section Helix Bl.
  • nucleotides are located between the 3 'end of the Helix Al section and the 5' end of the Helix Bl section.
  • nucleotides are arranged between the 3 'end of the section Helix B2 and the 5' end of the section Helix A2.
  • a nucleotide is between the 3 'end of the helix B2 portion and the 5' end of the helix A2 portion arranged.
  • the sum of nucleotides of section Helix A1 and section Helix Bl is 10 to 12 nucleotides and the sum of nucleotides from section Helix A2 and from section Helix B2 10 to 12 nucleotides.
  • the sum of the hybridized nucleotides resulting from the hybridization of section Helix A1 with section Helix A2 and section Helix Bl with section Helix B2 is 10 to 12 nucleotide pairs.
  • the nucleic acid does not comprise a section Helix Al and Helix A2, which at the 5 'end of the nucleic acid portion Helix Bl and at the 3' end the helix B2 is arranged, wherein preferably the length of the section Helix Bl and Helix B2 each individually and independently comprises a length of four to eight nucleotides.
  • the sections Helix Bl and Helix B2 are at least partially or completely hybridized with each other, wherein the hybridization extends over four to eight nucleotide pairs.
  • between the 3 'end of the section Helix Al and the 5' end of the section Box Al are one to five nucleotides and between the 3 ' End of the section box A2 and the 5 'end of the section Helix A2 one to three nucleotides arranged.
  • a seventeenth embodiment of the seventh aspect which is also an embodiment of the sixth, seventh, eighth, ninth, tenth, eleventh, twelfth, thirteenth, fourteenth and fifteenth embodiment, are between the 3 'end of the section Helix Bl and the 5' - End of the section box Al two nucleotides and arranged between the 3 'end of the section box A2 and the 5' end of the section helix B2 one to seven nucleotides.
  • an eighteenth embodiment of the seventh aspect which is also an embodiment of the first, second, third, fourth, fifth, sixth, seventh, eighth and tenth embodiments insofar as it is an embodiment of the sixth, seventh and eighth embodiments, the twelfth and thirteenth embodiments Embodiment, as far as these embodiments of the sixth, seventh, eighth and tenth embodiments, the fourteenth and fifteenth embodiment, as far as these embodiments of the sixth, seventh, eighth, tenth, twelfth and thirteenth embodiment, or the seventeenth embodiment, as far as these embodiments of the sixth , eighth, tenth, twelfth, thirteenth and fifteenth embodiments, each within the scope limited herein, includes the intermediate section Zl six or seven nucleotides.
  • the intermediate portion Zl has the sequence NiN 2 GNgN 3 N 4 Ns, wherein
  • the nucleic acid comprises a section Box Al and a section Box A2, with the 3 'end of the section Box Al directly connected to the 5' end of the intermediate section Zl is connected, and the 3 'end of the intermediate portion Zl is connected directly to the 5' end of the section box A2.
  • the nucleic acid comprises a section Helix Bl and a section Helix B2.
  • the sections Helix Bl and Helix B2 each individually and independently of each other comprise four to eight nucleotides, which are preferably fully or partially hybridized with each other.
  • helix is provided between the 3 'end of the section box A2 and the 5' end of the section B2 no nucleotide, or arranged in the 5'-3 'direction, the nucleotide sequence GN y , wherein N y comprises zero to six nucleotides, preferably 0 or 6 nucleotides.
  • the nucleic acid comprises a section Helix A1 and Helix A2.
  • the sections Helix A1 and Helix A2 each independently and independently of each other comprise four to eight nucleotides, and preferably the sections Helix A1 and Helix A2 are completely or partially hybridized with each other.
  • a nucleotide sequence N x is disposed between the 3 'end of the section Helix Al and the 5' end of the section Helix Bl, where N x zero to five nucleotides.
  • a nucleotide sequence N z is disposed between the 3 'end of the helix B2 portion and the 5' end of the helix A2 portion N 2 zero to six nucleotides.
  • a twenty-ninth embodiment of the seventh aspect which is also an embodiment of the twenty-first, twenty-second, twenty-third, twenty-fourth, twenty-fifth, twenty-sixth, twenty-seventh and twenty-eighth embodiments, the sum of the hybridized nucleotides from the hybridization of section Helix A1 with section Helix A2 and of Section Helix Bl with section Helix B2 10 to 12 nucleotide pairs.
  • a thirtieth embodiment of the seventh aspect which is also an embodiment of the twenty-fourth, twenty-fifth, twenty-sixth, twenty-seventh, twenty-eighth and twenty-ninth embodiments, between the 3 'end of the section Box A2 and the 5' end of the section helix B2 in FIG '-3' direction the nucleus nucleotide GN y , where N y comprises zero to six nucleotides, preferably 0 or 6 nucleotides.
  • the HMGA-binding nucleic acid has the following structure
  • N 1 U, C, A or G;
  • N 2 G or U
  • N 3 U or C
  • N 4 U or A
  • N 5 G or A
  • N 6 G, A or U
  • N 7 G or U
  • N 8 U or no nucleotide
  • N x zero to five nucleotides
  • N 2 zero to six nucleotides
  • section Box Al and section box A2 are each individually and independently selected from the group of nucleotide sequences comprising GGGCG, GGGUG and GGGAG;
  • section Helix A1 and the section Helix A2 each individually and independently comprise four to eight nucleotides, wherein preferably the sections Helix Al and Helix A2 are completely or partially hybridized with each other, and
  • the sections Helix Bl and Helix B2 each individually and independently comprise four to eight nucleotides, wherein preferably the sections Helix Bl and Helix B2 are completely or partially hybridized with each other and the hybridizing region four to eight Nucleotides, and wherein the sum of the hybridized nucleotides from the hybridization of section Helix Al with section Helix A2 and of section Helix Bl with section Helix B2 is 10 to 12 nucleotide pairs.
  • the HMGA-binding nucleic acid comprises a sequence selected from the group comprising SEQ. ID. No. 1, SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 3, SEQ. ID. No. 5, SEQ. ID. No. 6, SEQ. ID. No. 7 and SEQ. ID. No. 13th
  • the 3 'end of the section Box A2 immediately adjoins the 5' end of the section Helix B2 ,
  • the HMGA-binding nucleic acid has the following structure
  • N 2 G or U
  • N 3 U or C
  • N 4 U or A
  • N 5 G or A
  • N 6 G, A or U
  • N 7 G or U
  • Ng U or no nucleotide
  • N x zero to five nucleotides
  • N z zero to six nucleotides;
  • the section Box Al and section box A2 are each individually and independently selected from the group of nucleotide sequences comprising GGGCG, GGGUG and GGGAG;
  • section Helix A1 and the section Helix A2 each individually and independently comprise four to eight nucleotides, wherein preferably the sections Helix Al and Helix A2 are completely or partially hybridized with each other, and
  • the sections Helix Bl and Helix B2 each individually and independently comprise four to eight nucleotides, wherein preferably the sections Helix Bl and Helix B2 are fully or partially hybridized with each other and the hybridizing region comprises four to eight nucleotides, and wherein the sum of the hybridized nucleotides from the hybridization of section Helix Al with section Helix A2 and section Helix Bl with section Helix B2 is 10 to 12 nucleotide pairs.
  • the HMGA-binding nucleic acid comprises a sequence comprising SEQ. ID. No. Third
  • the HMGA-binding nucleic acid has the following structure
  • the HMGA-binding nucleic acid has the following structure
  • the HMGA comprises binding nucleic acid a sequence selected from the group comprising SEQ. ID. No. 15 and SEQ. ID. No. 16th
  • the HGMA-binding nucleic acid comprises an intermediate section Z 2 of 12 to 25 nucleotides.
  • the HGMA binding nucleic acid comprises an intermediate portion Z2, a portion Helix C1, and a portion Helix C2.
  • a central portion N c is disposed between the helix Cl portion and the helix C2 portion of the HMGA-binding nucleic acid.
  • the length of the helix C1 and helix C2 portion of the HGMA-binding nucleic acid is the same length.
  • the length of the helix Cl and helix C2 portion of the HGMA-binding nucleic acid is individually and independently three to six nucleotides.
  • helix Cl and helix C2 portions of the HMGA-binding nucleic acid are fully or partially hybridized with each other.
  • the central portion N c of the HMGA-binding nucleic acid comprises three to five nucleotides.
  • the HMGA-binding nucleic acid comprises a section Box Al and a section box A2, wherein between the 3 ' End of the section Box Al and the 5 'end of the section Helix Cl is a nucleotide sequence N b is arranged and comprises three nucleotides.
  • the HMGA-binding nucleic acid comprises a section Box Al and a section box A2, wherein between the 3'-end of the section Helix C2 and the 5 'end of the section Box A2 a nucleotide sequence N d is arranged and comprises two to five nucleotides.
  • the HMGA-binding nucleic acid comprises a section Helix A1 and a section Helix A2.
  • the sections Helix A1 and Helix A2 of the HMGA-binding nucleic acid each individually and independently of each other comprise five to six nucleotides, preferably the section Helix A1 and the section Helix A2 completely or partially hybridized with each other.
  • a nucleotide sequence N a is arranged between the 3 'end of the section Helix Al and the 5' end of the section Box Al of the HMGA-binding nucleic acid, wherein N 3 comprises one to five nucleotides.
  • a nucleotide sequence GN e between the 3 'end of the box A2 section and the 5' end of the helix A2 section of the HMGA binding nucleic acid in FIG '-3' direction a nucleotide sequence GN e , where N e comprises one to two nucleotides, preferably A or UU.
  • the helix Cl and helix C2 portions of the HMGA-binding nucleic acid are each independently and independently of one another five or six nucleotides in length , wherein preferably the sections Helix Cl and Helix C2 are completely or partially hybridized with each other.
  • the HMGA-binding nucleic acid has the following structure:
  • N 3 one to five nucleotides
  • N b three nucleotides
  • N c three to five nucleotides
  • N d two to five nucleotides
  • N e one to two nucleotides, preferably A or UU;
  • section Box Al and the section box A2 are each individually and independently selected from the group comprising GGGCG, GGGUG and GGGAG,
  • the sections Helix A1 and Helix A2 each individually and independently comprise five or six nucleotides, and ⁇
  • the sections helix Cl and helix C2 each comprise five or six nucleotides, which are preferably fully or partially hybridized with each other.
  • the HMGA-binding nucleic acid comprises a sequence selected from the group comprising SEQ. ID. No. 8, SEQ. ID. No. 9, SEQ. ID. No. 10, SEQ. ID. No. 11, SEQ. ID. No. 14, SEQ. ED. No. 22 and SEQ. ID. No. 24th
  • the nucleic acid comprises a portion of box Al and a portion of helix Cl of the HMGA-binding nucleic acid, wherein between the 3 ' End of the section box Al and the 5 'end of the section Helix Cl is a nucleotide A.
  • the HMGA-binding nucleic acid comprises a section helix C2 and a section box A2, wherein between the 3 'end of the section helix C2 and the 5' end of the Section box A2 a nucleotide G is arranged.
  • the central portion N c of the HMGA-binding nucleic acid comprises four nucleotides, wherein N c is preferably GAUG.
  • the HMGA-binding nucleic acid comprises a section Helix Bl and a section Helix B2.
  • the sections Helix Bl and Helix B2 of the HMGA-binding nucleic acid individually and independently each five Nucleotides, wherein preferably the section Helix Bl is hybridized with the section Helix B2.
  • a sixtieth embodiment of the seventh aspect which is also an embodiment of the fifty-eighth or fifty-ninth embodiment, between the 3 'end of section Helix Bl and the 5' end of section Box Al of the HMGA-binding nucleic acid is a nucleotide sequence comprising two nucleotides N j , where N j is preferably AG.
  • a nucleotide G is located between the 3 'end of the box A2 section and the 5' end of helix B2 of the HMGA binding nucleic acid.
  • the HGMA-binding nucleic acid comprises a section Helix A1 and a section Helix A2.
  • the sections Helix A1 and Helix A2 of the HMGA-binding nucleic acid individually and independently each six nucleotides and are preferably the section Helix Al and the section Helix A2 hybridized with each other ,
  • a nucleotide sequence comprising two nucleotides Nj is located between the 3 'end of section Helix Al and the 5' end of section Helix Bl, where Nj preferably CA is.
  • a nucleotide A is located between the 3 'end of the helix B2 section and the 5' end of the helix A2 section.
  • the sections helix Cl and helix C2 each comprise three nucleotides, wherein preferably the sections helix Cl and helix C2 are hybridized with each other.
  • the HMGA-binding nucleic acid has the following structure:
  • the sections Box Al and Box A2 are each individually and independently selected from the group comprising the sequences GGGCG, GGGUG and GGGAG;
  • the sections Helix A1 and Helix A2 each individually and independently comprise six nucleotides, which are preferably hybridized with each other;
  • the sections Helix Bl and Helix B2 individually and independently comprise five nucleotides, whereby preferably the section Helix Bl and the section Helix B2 are hybridized with each other;
  • the sections helix Cl and helix C2 each individually and independently comprise three nucleotides, wherein preferably the sections helix Cl and helix C2 are hybridized with each other.
  • the HMGA-binding nucleic acid comprises a sequence selected from the group comprising SEQ. ID. No. 12th
  • the nucleic acid is one which binds to transcription factors, particularly transcription factors having an AT-hook.
  • the object is achieved in an eighth aspect by a nucleic acid which binds to a transcription factor comprising an AT hook, wherein the nucleic acid comprises a construction according to the seventh aspect.
  • the L-nucleic acid is a nucleic acid according to the seventh aspect.
  • the L-nucleic acid is a nucleic acid according to the seventh aspect.
  • the L-nucleic acid is a nucleic acid according to the seventh aspect.
  • the L-nucleic acid is a nucleic acid according to the seventh aspect.
  • the L-nucleic acid is a nucleic acid according to the seventh aspect.
  • the object is achieved in a ninth aspect by a method for screening an HMGA antagonist or HMGA agonist comprising the following steps:
  • the object is achieved in a tenth aspect by a method for screening an HMGA agonist and / or an HMGA antagonist comprising the following steps:
  • HMGA immobilized on one phase preferably a solid phase
  • nucleic acid according to the seventh aspect preferably a nucleic acid according to the seventh aspect, which is labeled
  • the determination is made to test whether the nucleic acid is being replaced by the candidate HMGA agonist or by the candidate HMGA antagonist.
  • the object is achieved in an eleventh aspect by a kit for the detection of HMGA comprising a nucleic acid according to the seventh aspect.
  • the object is achieved in a twelfth aspect by an HMGA antagonist obtainable by a method according to the tenth aspect.
  • the object is achieved in a thirteenth aspect by a HMGA agonist obtainable by a method according to the tenth aspect.
  • the object is achieved in a fourteenth aspect by a complex comprising an HMGA protein and a nucleic acid according to the seventh aspect.
  • the present invention is based on the surprising finding that contrary to the prior art it is possible to use L-nucleic acids and in particular aptmers to address intracellular target molecules.
  • the intracellular target molecules are preferably target molecules present in a cell. It allows the functional L-nucleic acids by their structure of L-nucleotides inherent properties such as high specificity of the interaction with their target molecules with high stability and lack of toxic or immunologically active degradation products when applied in biological systems and in particular in the animal and human body not to use the cellular mechanisms to encode, as in the case of intramers, L-nucleic acids from a plasmid or, more generally, a vector and thus to provide the actual functional nucleic acid through the intracellular process of transcription.
  • Functional L-nucleic acids and in particular aptmers can be transported while maintaining their specificity with respect to their binding to their target molecule and their activity via a cytoplasmic membrane.
  • This patency of the functional L-nucleic acids is inherent in the Spiegelmers and may be exacerbated by the use of delivery vehicles or delivery techniques.
  • the present inventors assume that functional L-nucleic acids per se can overcome the cytoplasmic membrane or, in the case of involvement of endosomal transport mechanisms in overcoming the cytoplasmic membrane, they can become involved forming vesicle structures capable of releasing a two- or three-dimensional structure that allows the specific interaction of the functional nucleic acid with its target molecule.
  • the present teachings deliberately turn away from the aptamer-based principle of utilizing intracellular transcription mechanisms to produce aptamers in the cell and, for the first time, provide means for the application of functional L-nucleic acids, and in particular aptmers, to cells.
  • functional nucleic acids refers to those nucleic acids other than structural, especially naturally occurring, structural nucleic acids such as rRNAs or coding nucleic acids such as mRNAs.
  • functional nucleic acids are nucleic acids which, due to their two- and / or three-dimensional structure, are capable of binding to target molecules.
  • binding to the target molecule is not by hybridization or base pairing based on Watson-Crick base pairings or Hoogsteen base pairing.
  • Particularly preferred functional nucleic acids are aptamers and aptmers.
  • an L-nucleic acid is a nucleic acid which is completely, substantially or partially constructed of L-nucleotides. It is particularly preferred if the L-nucleic acid consists entirely of L-nucleotides.
  • the term "essentially” designates an embodiment in which that part of the L-nucleic acid which is responsible for the interaction with the target molecule or the part which mediates the binding to the target molecule consists of L-nucleotides or these is constructed.
  • a functional L-nucleic acid is a functional nucleic acid that is wholly, substantially or partially constructed of L-nucleotides.
  • L-nucleic acids The synthesis of L-nucleic acids is known to those skilled in the art and described, for example, in Nolte et al., Nat. Biotech, 14, 1116-1119, 1996; and Klussmann et al, Nat. Biotechnol, 14, 1112-1115, 1996.
  • aptamers consisting of L nucleotides rather than D nucleotides.
  • an intracellularly active agent is a chemical compound capable of binding to a molecule in a cell. It is particularly preferred if the cell is a cell isolated in a tissue or organ, but more preferably not in a human or animal body. If the intracellularly active agent is a aptmer, then it is preferably an intracellularly active agent if it is capable of binding to an intracellular target molecule.
  • the aptmer is an intracellularly active agent if it is capable of binding to its target molecule under conditions such as are present in a cell.
  • Assays to determine these properties are known to those of skill in the art and include, for example, equilibrium binding assays under buffer conditions as they are intracellular (ionic strength and parent compound, pH, temperature) as disclosed in Example 1.
  • the target molecule of the L-nucleic acid, in particular of the functional L-nucleic acid is an intracellular receptor.
  • An intracellular receptor as used herein is preferably a chemical compound or a chemical structure, or a portion thereof, with which the functional L-nucleic acid interacts, and preferably one to which the functional L-nucleic acid binds the intracellular receptor, ie the chemical compound or the chemical structure or a part thereof, intracellular, d. H. is present in a cell, as it is preferably described in the preceding paragraph, is present. It is within the scope of the present invention that the intracellular receptor is the target molecule in the production of the functional nucleic acid, in particular of the functional L-nucleic acid.
  • the term receptor refers to any interaction partner, preferably a specifically binding interaction partner of the functional nucleic acid, ie an interaction partner interacting with the functional nucleic acid, which have a specific spatial structure, charge distribution, hydrophobicity distribution, etc.
  • the interaction partner corresponds to the target molecule of the functional nucleic acid as used in the production of the functional nucleic acid. It is within the scope of the present invention that a receptor can also be different from the target molecule used in the production of the functional nucleic acid, but the specific interaction by a Cross-reactivity of the functional nucleic acid between the interaction partner and the target molecule used in the production of the functional nucleic acid is caused.
  • the term "intracellular receptor” refers to a receptor that is present in a cell, or a receptor that may be present in a cell, naturally occurring in a cell, or present among such in a cell
  • the term "intracellular receptor” also refers to a receptor that is in conditions such as they are in a cell.
  • the term cell refers to a cell selected from the group comprising prokaryotic and eukaryotic cells.
  • the eukaryotic cell is selected from the group comprising fungal cells, plant cells, animal cells and human cells.
  • the term cell herein generally refers to a compartment bounded by a phospholipid double membrane, which in a preferred embodiment corresponds to a cytoplasmic membrane, which is separated from the environment by the membrane. The separation from the environment is not a complete separation, but allows an energy exchange and a mass transfer between the cell and the environment. Preferably, the mass transfer is limited.
  • the restriction of mass transfer is defined in the case of delimitation of the cell from the environment by a cytoplasmic membrane or by a membrane similar to a cytoplasmic membrane by the transport properties of the membrane.
  • the term "cell” herein thus also encompasses vesicles and / or compartments of a prokaryotic or eukaryotic cell as defined herein, which in turn may be present or present within a prokaryotic or eukaryotic cell as well as outside such a prokaryotic or eukaryotic cell
  • a vesicle or parts of a prokaryotic or eukaryotic cell surrounded by a cytoplasmic membrane which in one embodiment may be in a body fluid.
  • the conditions within such a cell substantially correspond to those which are present in a prokaryotic or eukaryotic cell, in particular the factors which affect the binding of the functional nucleic acid to it Influence the target molecule.
  • the body fluid is selected from the group consisting of blood, urine, cerebrospinal fluid, lymphatic fluid, serum, plasma, vaginal secretions, saliva and semen.
  • the receptor is defined by its function in a cell. Accordingly, the receptor may be selected from the group consisting of molecular receptors, enzymes, metabolic intermediates, signal peptides, chaperone molecules, and intracellular structures such as ribosomes, mitochondria, cytoskeletal elements such as cytoskeletal cells. Tubulin and actin filaments, endosomal particles, lysosomes, other intracellular structures such as vesicles, in particular intracellular vesicles comprises.
  • the term molecular receptor refers to a molecule that receives and propagates information within a cell, tissue, organ, or organism. The information is typically mediated by a molecule that interacts with the molecular receptor.
  • the molecular receptor is able to produce a signal.
  • a signal may be due to or manifest in the change in conformation and / or activity of the receptor.
  • the signal itself is able to relay the recorded or represented information in a different form.
  • the signal may preferably be a chemical, biochemical or electrical signal.
  • the molecular receptor is part of a reaction cascade, more preferably a signal cascade.
  • the information transmitted by a molecular receptor may be quantitative and / or qualitative information, for example regarding the presence of a compound and / or its concentration.
  • metabolite intermediates refers to all those compounds which occur as a component of catabolism as well as anabolism through metabolic activities in a cell.
  • the receptor is defined by its chemical nature.
  • the receptor is selected from the group comprising polypeptides, carbohydrates, nucleic acid, lipids, and combinations thereof.
  • polypeptide preferably refers to any polymer of two or more amino acids.
  • the amino acids are L-amino acids, but also D-amino acids can be used in the context of the embodiment.
  • nucleic acids preferably refers to a polymer of two or more nucleotides or nucleotide analogs known to those skilled in the art, which are either D nucleotides or L nucleotides or mixtures thereof.
  • Preferred combinations include glycosylated polypeptides and glycosylated lipids
  • a particular group of intracellular receptors are transcription factors and DNA-binding proteins that bind to an AT hook.
  • Exemplary transcription factors are given in the following Table 1:
  • AhR Arnt AML3b ATBF 1 -A
  • ER-alpha ER-beta EZH 1 FOXJ2 (long isoform)
  • FXR RXR-alpha GLI3 HEB1-p94
  • IA-1 IRF-1 C / EBPbeta KLF15 iASPP IRF-2 KLF7 iASPP-RAI IRF-3 Kox1
  • LXR-alpha RXR-alpha MEF-2C / delta8.32 MTF-1
  • Nrf1 MafG p160MBP Pax-4a
  • Nrf1 MafK p28 Modulator Pax-5
  • Nrf2 MafG p38erg Pax-6 / Pd-5a
  • Nrf2 MafK p40x; HTLV-I, T-cell Pax-7
  • Nrf3 MafK p49erg Pax-8c
  • Pbx1A HoxA5 PITX2A: Nkx2.5 POU3F4
  • Pbx1a Hoxb8 PITX2B: Nkx2.5 POU4F1 (s)
  • Pbx1A HoxC8 PITX2C: Nkx2.5 POU4F3
  • Pbx1A HoxD4 PITX3 POU5F1
  • Pbx1 a IPF1 PKN0X1 POU5F1A
  • Pbx1 B HoxA5 PLAGL1 POU5F1C
  • Pbx1 B HoxB7 PLAGL2 POU6F1
  • Pbx1B HoxB8 PLZF PPAR-alpha
  • Pbx1B HoxC8 PML PPAR-alpha: RXR-
  • Pbx1 B HoxD4 PML-3 alpha
  • Pbx1b PKN0X1 Pmx2a PPAR-beta
  • RAR-alpha RXR-alpha RORalphal Six-3
  • RAR-alpha RXR-beta RORalpha2 Six-4
  • RAR-alpha RXR-RORalpha3 Six-5 gamma RORbeta Six-6
  • RAR-beta RXR-alpha RPF1 Smad2
  • Sox14 STAT1 STAT3 TAF (II) 31
  • Sox7 STAT5B STAT5B TaMbeta Tal-2 TCF-1D TFIID
  • TCF-1 E TFIIE did; HIV-1, immunode- TCF-1F TFIIE-alpha efficiency virus type 1 TCF-1G TFIIE-beta
  • TR2-5 VITF VITF
  • Intracellular target molecules Another group of intracellular receptors are the intracellular target molecules shown in Table 2 below. Table 2: Intracellular target molecules
  • Acetyl-CoA-carboxylase amyloid ⁇ I A4-protein catalase Catechol dihydrouracil glycerol phosphate
  • Hemoglobin M Iwate Hydroxysteroid N-Acetylglucuronidase Hemoglobin M Saskatoon Dehydrogenase NAD-dependent Sterol-4 Hemoglobin Nancy Hypoxanthine Guanine Carboxylase Hemoglobin Philly Phosphoribosyltransferase NADase Hemoglobin Quong Sze IMP Dehydrogenase NADPH-dependent 3-Hemoglobin Raleigh Indollyase Oxosteroid Reductase Hemoglobin Ranier Inositol Phosphate Nexin Hemoglobin S Phosphatase N-ras Oncogene protein Hemoglobin Sealy int-1 Oncogene protein Nuclear protein B23 Hemoglobin Seattle isocitrate lyase Nucleoside diphosphate hemoglobin St.
  • HMGA proteins preferably denotes, in summary, the following proteins: HMGA1, HMGA1a, HMGA1b, and HMGA2.
  • HMGA proteins are modular and each have three DNA-binding domains, called “AT-hooks” or “AT-hooks”, represented as DBD1 to DBD3 in Figure 2, and a very acidic C- terminal area. It is obvious to those skilled in the art that antagonists that bind to one of the "AT-hooks” not only recognize the HMGA1 proteins and thereby the two splice variants HMGAIa and HMGAIb (see FIG. 2), but also cross-reactivity with similar ones In addition to HMGA2, many other proteins have sequences similar to "AT-hooks" and are in any case other receptors. Such proteins include those listed in Table 3:
  • the present invention also relates to L-nucleic acids and in particular Spiegelmers which are directed against any of the target molecules mentioned in Tables 1 to 3.
  • L-nucleic acid as an intracellularly active agent, particularly within a cell, to bind to an intracellular receptor, intracellularly various forms of interactions between the intracellular receptor and its interaction partners are influenced.
  • the intracellular use of L-nucleic acids thus makes it possible to influence interactions of proteins, nucleic acids, lipids, carbohydrates or combinations of proteins, nucleic acids, lipids, carbohydrates with one another and with one another.
  • an L-nucleic acid in particular a Spiegeimers
  • an intracellular agent or the method for binding an intracellular receptor is noteworthy that it is preferably an in vitro application or an in vitro method.
  • the target molecule is an intracellular target molecule.
  • the intracellular target molecule is one which is causally or non-causally involved in the disease or disease to be prevented, treated or diagnosed, but in each case results in its binding to an L-nucleic acid specifically binding thereto; that in the case of a drug, the disease is alleviated, prevented, or cured and / or in the case of a diagnostic agent, the disease or a disposition can be detected or diagnosed.
  • diagnosis includes a first diagnosis as well as subsequent diagnoses, particularly diagnoses or examinations, to, for example, track or determine the course of the disease or the stages of the disease.
  • the target molecule is an intracellular receptor as described herein, in particular a transcription factor, an intracellular target molecule or an HMG protein. It is very particularly preferred in the context of the present invention that the target molecule is present intracellularly, ie within a cell and the interaction influencing the disease and / or diagnosis between the L-nucleic acid and in particular the spiegelmer and the target molecule, ie the receptor, intracellularly.
  • the target molecule is outside of a cell and the interaction between the L- Nucleic acid and especially the Spiegeimer and the target molecule, ie the receptor, extracellular takes place.
  • HMGA proteins are known to be associated with carcinomas (including the breast, lung, skin, thyroid), as well as leukemias and lymphomas, as well as other malignant tumors such as the like.
  • Sarcomas rhabdomyosarcoma, osteosarcoma
  • mesenchymal tumors i.a.
  • HMGA Hamartomas (breast and lung), adipose tissue tumors (lipomas), pleomorphic adenomas of the salivary glands, uterine leiomyomas, angiomyxomas, breast fibroadenomas, polyps of the endometrium, and atherosclerotic plaques.
  • HMGA is an interesting therapeutic target.
  • Blockade of HMGA may be a suitable starting point for the control of cancer and prevent its metastatic spread.
  • L-nucleic acids directed against HMGA proteins are also useful for the diagnosis and / or therapy of viral diseases and arteriosclerosis due to the involvement of the HMGA proteins in the regulation of transcription of a variety of viral genes or the high expression of HMGA and in particular HMGA1 in the atherosclerosis affected tissue associated with neointimal vascular smooth muscle cells, macrophages and new blood vessels
  • nucleic acids preferably L-nucleic acids and preferably spiegelmers are capable of penetrating as such a phospholipid double membrane as a cytoplasmic membrane and then being intracellularly functional in the sense of - specific - interaction with the intracellular receptor
  • the efficacy of the introduction of L-nucleic acid can be influenced and in particular increased by the use of different techniques. These techniques include the use of chemical compounds or molecules as well as the use of physical measures. Whatever the nature, these techniques are generally referred to herein as delivery vehicles.
  • aptamers also have this property and, like the aptamers thus also together with the erfmdungsge- According to the composition can be used or used for the basically same purposes, applications and uses.
  • nucleic acid When using chemical compounds or molecules, it is further possible to distinguish whether the nucleic acid has to be modified for delivery or whether it does not have to be modified.
  • Modification for purposes of using a delivery vehicle is typically not required when the delivery vehicle is or comprises a vesicle, such as in liposomes, polypeptide vehicles, cyclodextrins, dendrimers, nano- and microparticles, and polyethyleneimine.
  • modification for purposes of using a delivery vehicle is typically required when the delivery vehicle uses receptor-mediated endocytosis, fusogenic peptides, signal peptides, or biopsy conjugates.
  • the group of physical techniques includes in particular electroporation and iontophoresis.
  • a phospholipid double membrane such as a cytoplasmic membrane
  • a functional nucleic acid such as an aptamer and / or a gelator
  • Liposomes consist of artificial cationic lipids such as N- [1- (2,3-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA) and N- [1- (2,3-dioleoyloxy) propyl] - N, N, N-trimethylammonium sulfate (DOTAP), in which the cationic groups interact with the negatively charged nucleic acids and neutralize their anionic charge. Transport is via endocytosis (PNAS, 93: 11493-11498, 1996).
  • DOTMA N- [1- (2,3-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride
  • DOTAP N- [1- (2,3-dioleoyloxy) propyl] - N, N, N-trimethylammonium sulfate
  • Transport is via endocytosis (PNAS, 93:
  • cationic liposomes are cytotoxic, especially at higher concentrations, limiting their use in vitro and in vivo (Biochem Biophys Res Commun, 197: 818, 1993, Biochem Biophys Res Commun, 1372: 55-68, 1998).
  • a non-toxic formulation is the amphiphilic pyridinium-based lipid SAINT-2 (Nucleic Acids Res, 29: 2079-2087, 2001).
  • An alternative are also pH-sensitive liposomes consisting of amphipatic molecules such as cholesteryl hemisuccinate (CHEMS) and dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) (J Pharmacol Exp Ther, 297: 1129-1136, 2001).
  • CHEMS cholesteryl hemisuccinate
  • DOPE dioleoylphosphatidylethanolamine
  • Receptor-mediated endocytosis utilizes transport mechanisms that are already present in the cell membrane.
  • the nucleic acid is covalently linked to a transporter protein ("carrier" protein) via a poly-L-lysine (PPL) linker, the selection of the transporter protein being dependent on the ability to particular receptors of the cell membrane
  • PPL poly-L-lysine
  • Cell-specific transport can be achieved, for example, by targeting an antisense phosphorothioate directed against c-myc into M-14 human melanoma cells (Anticancer Res, 17: 29-35
  • effective delivery by RME depends not only on the affinity of the receptor for the ligand but also on the limitation of the receptor selected on the cells, especially in vivo, and the inactivated or amplified ligand must be obtained be on the therapeutic result to avoid possible toxicity of the transport vehicle.
  • Fusogenic peptides have been used to allow peptide-oligonucleotide conjugates to fuse with the cell membrane and thus to facilitate transport into the cell (Bioconjug Chem., 9: 466-475, 1998; Bioconjug Chem., 6: 43-53 , Nucleic Acids Research, 25: 2730-2736, 1997).
  • NLS nuclear localization signals
  • IP signal import peptides
  • Blocks of polypeptides allow vesicles to be formed analogously to viral capsids that serve as potential delivery vehicles for intracellular transport (Nat Materials, 3 (4): 244-8, 2004).
  • lipophilic conjugates provide a way to increase the ability of oligonucleotides to bind to lipoproteins and thereby improve intracellular delivery.
  • the best studied conjugate is cholesterol (Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 12: 103-128, 2002).
  • Cyclodextrins are cyclic oligosaccharides that have a central hydrophobic cavity and multiple hydroxyl groups on the outer surface. Cyclodextrins have thus already been used for the transport of antisense oligonucleotides into human T cell lines (Antisense Res Dev, 5: 185-192, 1995) and also in vivo for intracellular transport or intracellular delivery or delivery of immunogenic CpG sequences (Biochem Pharmacol, 52: 1537-1544, 1996). Various formulations of cyclodextrins can be found in the review by Davis and Brewster (Nature Reviews Drug Discovery 3: 1023-1035, 2004).
  • Dendrimers are highly branched macromolecules composed of repetitive units of - typically - polyamides.
  • the molecules carry on their surface functional groups such as primary amino groups, which interact with other molecules through electrostatic interaction.
  • surface functional groups such as primary amino groups, which interact with other molecules through electrostatic interaction.
  • complex, rapid, and highly reproducible complex formation occurs, resulting in complexes with weak cytotoxicity (Nucleic Acids Research, 28: 4225-4231, 2000, Clin Cancer Res, 7: 3606-3612, 2001;
  • Cyanoacrylate nanoparticles have been tested since the early 1990's for delivery or delivery of oligonucleotides.
  • the interaction of oligonucleotides with the nano- Particles are formed by ion pairs of the anionic charge of the oligonucleotides with different hydrophobic cations, primarily with charged nanoparticles.
  • PIHCA polyisohexyl
  • PIBCA polyisobutyl
  • PHCA polyhexycyanoacrylates
  • Nanoparticles have also been used for in vivo use (Biochem Biophys Res Commun, 279: 401-406, 2000, Pharm Res, 13: 38-43, 1996).
  • Microparticles or so-called microspheres are typically biodegradable polymers poly (d, l-lactide-co-glycolide [P (LA-GA)] and are used for the sustained release of oligonucleotides (J Pharm Sei, 91: 790-799, 2000; J Controlled Release, 69: 197-207, 2000; J Drug Traget, 5: 291-302, 1998).
  • poly d, l-lactide-co-glycolide [P (LA-GA)
  • Electroporation is a transport technology that uses a strong electric field to destabilize the lipid double membrane, thereby permeabilizing the cell membrane and thus allowing transport of the substance to be administered, which may also be ionized (iontophoresis), into the cell. Electroporation has been used successfully to facilitate transdermal delivery of oligonucleotides ex vivo and in vivo (Int J Pharm, 184: 147-156, 1999, J Drug Traget, 5: 275-289, 1998, Pharm Res, 15: 1596 Int J Cancer, 85: 260-266, 2000; Biochem Biophys Res Commun, 212: 286-292, 1995; Blood, 88: 731-741, 1996).
  • shock waves high pressure acoustic pulses
  • Ultrasound is also an acoustic technology comparable to the shock waves, but uses higher frequency ranges (MHz instead of Hz) and shorter use times (seconds to minutes) and has already been supportive for gene therapy. See (Gene Gene Ther, 7: 1339-1346, 1996; Invest Radiol, 32: 723-727, 1997; Ultrasound Med Bio, 25: 1451-1457, 1999).
  • a novel delivery vehicle which is particularly suitable for the transport of functional nucleic acids such as aptamers, preferably functional L-nucleic acids and most preferably Spiegelmeren.
  • the delivery vehicle is a micelle-like or liposomal-like structure based on polyethyleneimine.
  • polyethyleneimine may, in principle, be present as a linear or branched polyethylenimine and also be used, with branched polyethylenimine in the branched form being particularly preferred.
  • polyethyleneimine can be present as a high molecular weight or low molecular weight polyethyleneimine and also be used.
  • high molecular weight polyethyleneimine has a molecular weight of about 800 kDa and low molecular weight polyethyleneimine has a molecular weight of about 3 kDa.
  • a polyethyleneimine having an average molecular weight of about 25 kDa is preferred, which is more preferably a branched polyethylenimine having a molecular weight of about 25 kDa.
  • the nucleic acid to be delivered itself also carries a modification. It is preferred if the modification is selected from the group comprising PEG radicals. It is further preferred that the PEG moiety has a molecular weight of about 1,000 to 10,000 Da, more preferably about 1,200 to 5,000 Da, and more preferably about 1,500 to 2,500 Da, and most preferably about 2,000 Da.
  • a quotient of the total number of nitrogen groups of the polyethyleneimine and the total number of phosphate groups of the nucleic acid to be delivered or packaged with or by the delivery vehicle is from about 1 to 20, preferably Example of about 1.5 to 10, more preferably from 2 to 5 and most preferably adjusted from about 2 to 3 or realized.
  • the delivery vehicle according to the invention thus also makes it possible to use the mechanism of the intracellular transport of nucleic acids via condensation or packaging with charged particles or reagents and associated change in the charge of the overall complex, also for functional nucleic acids such as aptamers and in particular L-nucleic acids such as Spiegelmers.
  • This complex is easily absorbed via endocytosis and thus enters the cytosol of the cell.
  • a disadvantage of this method is the stability of the DNA / RNA or the release of the nucleic acid from the endosomal compartment.
  • a lysosome is rapidly formed from the constricted endosome by the introduction of proteases or nucleases and by protonation of the compartment.
  • Nucleases digest the nucleic acids there. However, this does not apply to aptmers, as they are nuclease-stable due to their unnatural configuration. In addition, nucleic acids are not stable in the acidic milieu of the lysosome. However, this applies more to nucleic acids from DNA, less to nucleic acids made up of RNA. Through exocytosis or degradation in the Golgi apparatus, the entire complex is quickly transported back out of the cell and thus only a few nucleic acids enter the cell. One of the challenges posed by a suitable transfection system is thus the stabilization as well as the release of the nucleic acid from the endosomes into the cytosol. In terms of stability, RNA aptmers have ideal properties for transfection of eukaryotic cells since they are not cleaved by enzymes as enantiomers.
  • the transfection system according to the invention provided or designed with the delivery vehicles according to the invention is based on the formation of micelles from nucleic acids and branched polyethyleneimine (PEI).
  • PEI polyethyleneimine
  • the phosphodiester backbone of the nucleic acids interacts with the free nitrogen positions of the PEI and cross-branches to form small micelles, which have a positive charge due to the PEI.
  • These micelles are easily taken up by constricting the plasma membrane as endosomes from a cell.
  • the PEI now buffers incoming protons, whereupon many chloride ions inside the endosome lead to a swelling of the compartment due to the osmotic pressure.
  • composition according to the invention is administered as an aerosol.
  • spiegelmers can be derivatized with signal peptides for intracellular as well as intranuclear delivery, as well as for organ specific delivery Coupling of signal peptides directly to the polyethyleneimine can be done for a localized localization to organs or within the cell can be used.
  • the present invention relates to L-nucleic acids, particularly aptmers, and more preferably RNA aptmers directed against HMGA proteins.
  • the disclosed herein Spiegelmers against HMGA proteins are particularly examples of the present application also underlying finding that L-nucleic acids and aptmers in particular are able to overcome a phospholipid double membrane or a cytoplasmic membrane of a cell and intracellularly with the intracellular To bind receptor on the specific binding of which they have been selected.
  • HMGA high mobility group
  • HMGB HMGB
  • HMGN HMGN
  • HMGA HMGA
  • AT-hook HMGA
  • the HMGA family includes two genes, HMGA1 and HMGA2. From HMGA1, three different proteins can be expressed by alternative splicing (HMGAIa [formerly HMG-I], HMGAIb [formerly HMG-Y], HMGAIc [formerly HMG-I / R]), HMGA2 only one (HMGA2 [earlier : HMGI-C]).
  • HMGA1a, HMGA1b and HMGA2 are polypeptides of approximately 100 amino acids in length and have a modular sequence organization: they have three strongly basic regions ("AT-hooks") which bind the narrow minor groove of double-stranded AT-rich DNA (Reeves & Nissen 1990)
  • the C-terminus contains many acidic amino acids, which have no stable secondary structure in solution and do not adopt a defined conformation until complexed with DNA or other proteins (Huth et al 1997) to the most highly modified proteins in the mammalian cell nucleus and are phosphorylated, acetylated, and methylated (Reeves & Beckerbauer 2001).
  • HMGA proteins do not have any transcriptional activity per se, but as so-called architectural transcription factors, through their protein-protein and protein-DNA interactions, they organize the formation of the nucleoprotein-DNA transcription complex (Wolffe 1994). They thus have an activating or inhibitory influence on the expression of a multiplicity of genes.
  • the most prominent example of a positive regulation is the involvement of HMGA1 in the regulation of IFN- / 3 (Thanos & Maniatis, 1992).
  • the HMGAIb stimulates the binding of NF- ⁇ B and ATF-2 to the DNA double helix and at the same time alters the DNA structure such that NF- ⁇ B and ATF-2 interact with each other and presumably also with the rest of the transcription machinery (Thanos & Maniatis 1992, Du et al 1993).
  • Another transcriptional activating effect associated with arteriosclerotic pathogenesis is HMGA1-induced CD44 gene regulation (Foster et al 1998).
  • CD44 is a cell surface glycoprotein and involved in the migration and proliferation of smooth muscle cells after endothelial injury (Jain et al 1996, Cuff et al 2001).
  • CD44 Transcriptional regulation of CD44 is induced by the binding of c-Fos and c-Jun to the AP-I binding site in the CZW promoter and enhanced by the binding of HMGA1.
  • Studies in rats have shown that CD44 overexpression leads to an increased recruitment of smooth muscle cells and has a direct influence on the development of arteriosclerotic lesions (Pellacani et al 1999, Foster et al., 1998, 2000).
  • HMGA1 gene located in the chromosomal band 6 ⁇ 21.3 and the HMGA2 gene localized in the region 12ql4-15 revealed that they are mainly active in processes of cellular differentiation. Accordingly, strong expression of these genes is found during embryonic development and in undifferentiated cells (Chiappetta et al 1996) as well as in growth factor-stimulated cells (Friedman et al 1993, Johnson et al 1990, Ogram et al 1995, Holth et al 1997).
  • HMGA1 In the adult, differentiated tissue HMGA1 is strongly expressed only in the retina, while in the other tissues HMGA2 is not found at all and HMGA1 is found only in very low concentrations (Bussemakers et al 1991, Chiappetta et al 1996, Rogalla et al 1996 Zhou et al 1995; Chau et al 2000).
  • HMGA proteins in differentiated normal tissue is thereby associated with the growth and differentiation of adipocytes (Zhou et al 1995, Anand & Chada 2000, Melillo et al 2001), the proliferation of smooth muscle cells in the blood vessels after vascular injury (Chin et al 1999), the immune response in inflammatory reactions (Pellacani et al 1999) and apoptotic processes (Diana et al 2001, Sgarra et al 2003).
  • the amount of HMGA1 varies depending on the proliferation rate of the cells (Johnson et al 1990).
  • HMGA1 expression is concentrated on specific organs of ecto-, meso- or endodermal origin, while HMGA2 is restricted to mesenchymal tissues. So far, there is no information on the phenotype of HMGA1 knockout mice, possibly because the lack of this factor damages embryonic development too much.
  • HMG ⁇ 2-knockout mice are dwarf and have low levels of adipose tissue (Zhou et al 1995) and are also resistant to diet-induced obesity (Anand & Chada 2000).
  • HMGA2 or HMGAlb expression is undetectable in adipose tissue of normal mice, but dramatically increased in fat of fat or diabetic mice (Chada et al., 2004), suggesting an association between obesity and HMGA expression
  • HMGA1 overexpression of HMGA1 influences (Reeves et al 2001):
  • Intermediary filament markers such as cytokeratin, type 1
  • apoptosis regulators such as TRARl 5
  • Oncogenic and tumor suppressor genes such as MET
  • Angiogenesis regulators such as FGFR2
  • cell-cell interaction genes such as cadherin 12
  • HMGA1 Abnormal regulation of HMGA1 could therefore lead to general alterations in gene expression, thereby significantly contributing to the formation of transformed and / or metastatic phenotypes.
  • HMGA proteins appear to play different roles in mesenchymal or epithelial tumors: in malignant epithelial tumors, HMGA expression is more associated with later stages of carcinogenesis, while benign - rarely-converting mesenchymal tumors - already express HMGA in early hyperplasia. This indicates that HMGA proteins in tissues of different embryonic origins perform different functions, which also directly affects the corresponding applications. fertilize the L-nucleic acids according to the invention in the diagnosis and / or treatment of - corresponding - diseases, as shown in more detail below darg Dead.
  • HMGA 1 expression of the tumor correlates with its metastatic potential and thus is a characteristic feature of a malignant transformed cell (Giancotti et al 1987).
  • HMGAl-associated - in this case benign, mesenchymal tumors - are characterized by chromosomal alterations in the chromosomal HMGL4 / region 6p21.3. Such aberrations have so far been among others for
  • HMGA proteins Aberrations in the genetic mechanisms that control growth and proliferation are the primary cause of carcinogenesis.
  • the expression of HMGA proteins is strongly associated with tumor development, as shown in a number of papers (Giancotti et al., 1987, 1989, 1993).
  • HMGA2 expression was found in chemically or virally generated as well as in spontaneously obtained tumors, whereas in non-transformed cells or healthy tissue this protein could not be detected (Giancotti et al., 1989).
  • oncogenic retrovirus-infected cells in which the synthesis of HMGA2 expression had been specifically blocked lacked various phenotypic markers for transformation (Berlingieri et al., 1995).
  • HMGA2 knockout MMse show dwarfism, d. H. the animals are about 60% smaller than wild-type mice. However, these dwarf mice have a high resistance to chemically induced skin tumors.
  • the main cause of mortality and morbidity of cancer patients is the metastatic spread of the primary neoplasm in the body. Metastasis is not a simple process, as successful colonization of distant organs by scattered neoplastic cells must pass through many stages. Neoplastic cells must detach from the primary neoplasm, enter the bloodstream, extravagate at distant locations, and finally proliferate again in the parenchyma of the corresponding organ. Many genes are involved in the different stages of this highly complex metastatic cascade express proteins such as proteases, adhesion molecules, motility factors and angiogenic factors.
  • HMGA1 HMGA1 gene as one of the most important factors controlling this process is a valid candidate for this.
  • the gene products of HMGA1 affect the transcription of many genes that are important for successful metastasis. For example, other metastasis-associated genes have been shown to be less expressed when suppressed by HMGA1 expression (Battista 1998, Vallone 1997).
  • HMGA1 is therefore an interesting therapeutic target molecule.
  • the blockade of HMGA1 is therefore in principle suitable for controlling the cancer and preventing its metastatic spread (Evans 2004, Sgarra 2004).
  • antisense RNAs directed against HMGA transcripts in cancer cells in vitro, it was possible to reduce cell proliferation or even to induce apoptosis (Masciullo 2003, Scala 2000, Chau 2003).
  • the animal model has shown that gene therapy (adoenoviral expression of antisense RNAs directed against HMGA transcripts) drastically reduces the growth of various pancreatic cancer xenografts (Trapasso et al 2004).
  • HMGA1 could continue to be used as a prognostic diagnostic marker to determine which patients would benefit from more aggressive cancer therapy. There is a close correlation between the degree of malignant transformation and the amount of HMGA1 expressed. This in turn can be correlated with a poor prognosis in many human cancers, such as prostate (Tamimi 1996, Bussemakers 1991) and colorectal carcinoma (Abe 1999) or neuroblastoma (Giannini 2000).
  • HMGA proteins are considered by many viruses to be control factors for the expression of viral genes or cofactors provided by the host cell, among others
  • herpes simplex virus Panagiotidis 1999, French et al 1996)
  • HIV-1 virus (Henderson et al 2000) used.
  • HMGA proteins are implicated in the regulation of transcription of a variety of viral genes in a host cell. Examples include the regulation of the expression of the early and late expressed genes of the human papovavirus JC (Leger et al., 1995), regulation of the EBNA1 (Epstein-Barr virus nuclear antigen 1) gene of the Ebstein-Bar virus (EBV), which is responsible for the control of viral latency is, (Schaefer et al., 1997), regulation of the IE-3 (immediate early) gene of herpes simplex virus-1 (HSV-I), which encodes the early expressed protein ICP4 (Panagiotidis et al., 1999 ), Regulation of the latent phase active promoter 2 of HSV-I (French et al., 1996) and regulation of the LTR (long terminal repeats) promoter of the human HIV-1 virus (Henderson et al., 2000).
  • EBNA1 Epstein-Barr virus nuclear antigen 1
  • HSV-I
  • HMGA1 also appears to play a decided role as an architectural cofactor in integrating the viral DNA of the HIV-I virus, the Moloney murine leukemia virus (MoMuLv) and sarcoma poultry flu virus (ASV) into the human genome and thus appears to be an interesting therapeutic approach of antiviral Therapy (Van Maele et al 2006, Li et al 1998, Hindmarsh et al., 1999)
  • inhibitors of HMGA proteins are also suitable for the treatment and diagnosis of viral infections (Reeves & Beckerbauer 2002).
  • HMGA proteins in various diseases or their suitability as diagnostic markers
  • directed L-nucleic acid and in particular aptmers can be used for the prevention, therapy and diagnosis of precisely these diseases.
  • Particularly preferred aptmers are the aptmer described herein.
  • the individual aptmers have been generated for a given HMGA protein, as a result of the domain approach illustrated in Example 2, these also allow cross-reactivity with other HMGA proteins, as can be seen in US Pat in Fig. 2 shows alignment.
  • nucleic acids of the invention have a number of structural motifs that define a class of aptmers that bind to HMGA proteins as intracellular receptors. The various structural motifs are further detailed in Example 1.
  • the nucleic acids according to the invention also comprise those nucleic acids which are substantially homologous to the sequences specifically disclosed herein.
  • the term "substantially homologous” herein is preferably understood to mean that the homology is at least 75%, preferably 85%, more preferably 90%, and most preferably more than 95, 96, 97, 98 or 99%.
  • nucleic acids or nucleic acids according to the present invention should furthermore also include those nucleic acids which comprise nucleic acid sequences as disclosed herein or parts thereof, preferably to the extent that the nucleic acids or the said parts thereof are involved in binding to HMGAs. Proteins are involved.
  • nucleic acid can be derived from those disclosed herein, e.g. B. by shortening or truncation.
  • a truncation may refer to either or both ends of the nucleic acids as disclosed herein.
  • a truncation may also involve the inner sequence of nucleotides, i. H. it may involve nucleotide (s) between the 5 'and 3' terminal nucleotides, respectively.
  • truncation should also refer to the deletion of as little as a single nucleotide from the sequence of the nucleic acids disclosed herein. Shortening may also refer to more than one region of the nucleic acid (s) of the invention, wherein each of these regions may be as small as one nucleotide in length.
  • the nucleic acids according to the present invention may furthermore be either D-nucleic acids or L-nucleic acids.
  • the nucleic acids according to the invention are L-nucleic acids.
  • one or more parts of the nucleic acid are present as D-nucleic acids, or at least one or more parts of the nucleic acids are L-nucleic acids.
  • the term "part" of the nucleic acids is not intended to refer to any nucleotide, and such nucleic acids are generally referred to herein as D- or L-nucleic acids.
  • the nucleic acids L-acids according to the present invention from L-nucleotides and comprise at least one D-nucleotide.
  • a D-nucleotide is preferably attached to a part other than the region (s) defining the nucleic acids according to the present invention, preferably those parts thereof which interact with other parts of the nucleic acids.
  • such a D-nucleotide is attached to the end of each region or nucleic acid according to the present invention.
  • such D-nucleotides may function as a spacer or a linker which preferably binds modifications such as PEG and HES to the nucleic acids of the present invention.
  • the nucleic acids according to the invention also include those which are part of a longer nucleic acid, wherein these longer nucleic acids can comprise several parts, wherein at least one part is a nucleic acid according to the present invention or a part thereof.
  • the other part or parts of these longer nucleic acids may be either a D-nucleic acid or an L-nucleic acid. Any combination may be used in connection with the present invention and for the purposes or uses as disclosed for the nucleic acids of the invention herein.
  • This other part or parts of the longer nucleic acid may have a function other than binding and in particular binding to HMGA protein.
  • One possible function is to interact with other molecules, e.g. B. for purposes of immobilization, cross-linking, detection, amplification or modification or molecular weight increase to allow.
  • L-nucleic acids as used herein are nucleic acids consisting of L-nucleotides, preferably consisting entirely of L-nucleotides.
  • D-nucleic acids are nucleic acids consisting of D-nucleotides, preferably consisting entirely of D-nucleotides.
  • the nucleic acid according to the invention consists of D-nucleotides, L-nucleotides or a combination thereof of both, wherein the combination, for. B., is a random combination or sequence of regions consisting of at least one L-nucleotide and at least one D-nucleic acid
  • the nucleic acid may consist of one or more deoxyribonucleotides, ribonucleotides, and combinations thereof.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition which consists of at least one of the nucleic acids according to the invention in combination with one or more other nucleic acids, wherein the other nucleic acids preferably bind / bind to target molecules other than HMGA protein or one of performs / exercise various functions on the nucleic acids of the invention.
  • L-nucleic acids are enantiomers of naturally occurring nucleic acids.
  • D-nucleic acids are not very stable in aqueous solutions and especially in biological systems and in biological samples due to the extensive presence of nucleases.
  • Naturally occurring nucleases, especially animal cell nucleases are unable to degrade L-nucleic acids.
  • the biological half-life of L-nucleic acid in such a system, including the human and animal body is significantly increased. Due to the lack of degradability of L-nucleic acids no nuclease degradation products are produced and thus no side effects are observed.
  • This aspect effectively delimits the L-nucleic acid from any other compounds used in the therapy of diseases and / or disorders, and the presence of HMGA or its causal involvement comprises L-nucleic acids that specifically bind to a target molecule through a mechanism, which is different from the Watso ⁇ -Crick base pairing, or aptamers which are partially or fully composed of L-nucleotides, especially those portions of the aptamer involved in the binding of the aptamer to the target molecule are referred to as Spiegelmers.
  • nucleic acids according to the invention are available as single-stranded or double-stranded nucleic acids. pelstrlindige nucleic acids may be present.
  • the nucleic acids according to the invention are single-stranded nucleic acids which, as a consequence of the primary sequence, have defined secondary structures and can thus also form tertiary structures.
  • the nucleic acids according to the invention can also be double-stranded in the sense that two strands which are complementary or partially complementary to one another are hybridized with one another. This confers stability to the nucleic acids, which will be particularly advantageous when the nucleic acid is present in the naturally occurring D-form rather than the L-form.
  • nucleic acids according to the invention can be modified. Such modifications may involve single nucleotides of the nucleic acid and are well known in the art. Examples of such modification include, inter alia, described in Venkatesan N. et al. (2003) Curr Med Chem. Oct; 10 (19): 1973-91; Kusser, W. (2000) J. Biotechnol. 74: 27-38; Aurup, H. et al. (1994) Nucleic Acids Res, 22, 20-4; Cummins, LL et al, (1995) Nucleic Acids Res, 23, 2019-24; Eaton, BE et al. (1995) Chem Biol, 2, 633-8; Green, LS.
  • nucleic acid according to the present invention may comprise at least one LNA nucleotide.
  • the nucleic acid according to the present invention consists of LNA nucleotides, preferably entirely of LN A nucleotides.
  • the nucleic acids according to the present invention may be a multi-part nucleic acid.
  • a multi-part nucleic acid as used herein is a nucleic acid consisting of at least two nucleic acid strands. These at least two nucleic acid strands form a functional unit, wherein the functional unit is a ligand for a target molecule.
  • the at least two strands of nucleic acid can be derived from one of the nucleic acids of the invention either by cleaving the nucleic acid to generate two strands, or by synthesizing one nucleic acid corresponding to a first part of the invention, ie total nucleic acid, and another nucleic acid corresponding to the second part of the total nucleic acid , It is recognized that Both cleavage and synthesis can be used to generate a multi-part nucleic acid where more than the two strands may be present as described above.
  • the at least two strands of nucleic acid are preferably different from two strands that are complementary to each other and hybridize to each other, although there may be some degree of complementarity between the different nucleic acid parts.
  • the present inventors have found that the nucleic acids according to the present invention have a very advantageous K D value range or dissociation value range and thus a very advantageous binding constant.
  • An example to determine the binding constant is the use of an equilibrium binding assay as described in Example 1.
  • the K D value of the nucleic acids according to the invention is preferably less than 1 ⁇ M.
  • a K D value of about one ⁇ M should be characteristic of non-specific binding of a nucleic acid to a target.
  • the KD value of a group of compounds such as the nucleic acids according to the present invention will vary within a particular range.
  • the above-mentioned K D of about 1 ⁇ M is a more preferred upper limit of the K D value.
  • the preferred lower limit for the KD of the target molecule-binding nucleic acids may be about picomolar or lower. It is within the scope of the present invention that the K D values of individual nucleic acids which bind to HMGA are preferably within this range.
  • Preferred ranges can be selected by selecting a first number within this range and a second number within that range.
  • Preferred upper values are 0.25 ⁇ M, 0.1 ⁇ M, preferred lower values are 100 nM, 10 nM, 1 nM and 0.05 nM.
  • the nucleic acids according to the invention preferably bind to HMGAIb at 37 ° C. in solution with a dissociation constant K D ⁇ 20 nM, as shown in Example 2.
  • the nucleic acids according to the present invention may be of any length provided that they are still capable of binding to the target molecule. It will be appreciated in the art that certain lengths of the nucleic acids according to the present invention are preferred. Typically, the length is between 15 and 120 nucleotides. It will be further appreciated by those skilled in the art that any integer between 15 and 120 is a preferred length of potential for the nucleic acids of the present invention. Preferred ranges for the length of the nucleic acids according to the present invention are lengths of about 20 to 100 nucleotides, about 20 to 80 nucleotides, about 20 to 60 nucleotides, about 20 to 50 nucleotides and about 30 to 50 nucleotides.
  • ⁇ nucleic acids of the invention can be modified.
  • a particularly preferred form of modification is pegylation. This is the modification of the nucleic acids according to the invention by coupling with polyethylene glycol (PEG) or other groups.
  • PEG polyethylene glycol
  • the nucleic acids according to the invention are provided as a physiological solution for local or systemic administration.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention thus comprises at least one of the nucleic acids according to the present invention and preferably a pharmaceutically acceptable binder.
  • a binder may be any known or known binder in the art.
  • such a binder is any binder as described in connection with the preparation of the medicament as disclosed herein.
  • the pharmaceutical composition comprises another pharmaceutically active agent. It is within the scope of the present invention that the medicament described herein is the pharmaceutical composition as described herein.
  • the pharmaceutical composition is for intravenous administration.
  • compositions can be administered intramuscularly, intraperitoneally, or subcutaneously.
  • Other routes of administration are oral or intranasal, with the preferred mode of administration being the least invasive, while retaining the efficacy of the pharmaceutical composition or pharmaceutically active agent.
  • the nucleic acids of the invention are preferably contained or dissolved as such or in association with the pharmaceutical composition of the invention in a pharmaceutically acceptable solvent.
  • solvents are especially those selected from the group consisting of water, physiological saline, PBS, or a glucose solution, especially a 5% glucose solution.
  • a carrier can, for. B., water, buffer, PBS, glucose solution, preferably a 5% glucose solution (iso-osmotic), starch, sugar, gelatin or any other acceptable vehicle.
  • Such carriers are generally known to those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition contains at least one of the nucleic acids according to the invention in their various embodiments, including, but not limited to, the nucleic acid as a co-conjugate as described herein.
  • the medicament comprises a further pharmaceutically active agent.
  • Such further pharmaceutically active agents are, for example, protease inhibitors, proliferation inhibitors and angiogenesis inhibitors and / or agents which have a cystostatic effect.
  • another pharmaceutically active agent is another nucleic acid according to the present invention.
  • the medicament comprises at least one or more nucleic acids that bind to a target molecule other than HMGA or having a function different from any of the nucleic acids of the present invention.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be used for the treatment, diagnosis and / or prevention of any of the diseases or disorders described herein.
  • the present invention relates to a method of treating a subject in need of such treatment, the method comprising administering a pharmaceutically active amount of at least one of the nucleic acids according to the present invention.
  • the subject is suffering from or at risk of contracting such a disorder, the disorder being any of those disclosed herein, in particular, any disorder associated with the use of any of the nucleic acids according to the present invention present invention for the preparation of a medicament is described.
  • HMGA proteins and their genes have been increasingly associated with the diagnosis and prognosis of neoplastic diseases and have been proposed as potential biomarkers.
  • the level of expression of HMGA la / b proteins is very low, if detectable at all.
  • Increased HMGA la / b protein expression is characteristic of the phenotype of a variety of tumors and metastases of various cancers (Sarhadi et al., 2006, Balcercak et al., 2005, Bliese et al., 2006, Chang et al., 2005, Peters et al.
  • HMGA1a / b expression level in biopsies and their histological characterization represents a diagnostic approach for the early detection, prognosis and identification of neoplastic diseases, in particular the diseases and conditions described above. Furthermore, an association of HMGA1 proteins with arteriosclerotic plaques is described in the literature (Schlueter et al., 2005).
  • HMGA1 regulates CD44, one of the major target genes for plaque formation. In comparison with the surrounding tissue, the affected regions, such as neointimal, vascular smooth muscle cells, macrophages and new blood vessels, show a high expression of HMGA1.
  • HMGA1 seems to be one of the mediators in the development of plaques and thus represents a target molecule for the diagnosis.
  • biotinylated HMGA1 a / b recognizes baclimeric 5 '-bio-NOX-A50 binding bacteria in the Western blot HMGA1 a / b as a single band in cancer cell lines. Furthermore, as described in Example 2, recombinantly expressed HMGAIb protein could be detected.
  • the detection of the biotinylated aptmer is carried out, for example, via an anti-biotin antibody conjugated by means of Horse Raddish Peroxidase (HRP).
  • HRP Horse Raddish Peroxidase
  • HMGA la / b Another approach is the in vivo diagnosis of HMGA la / b, in which the nucleic acids according to the invention can be used. Tumors and metastases are often embedded by necrotic tumor cells, which release HMGA1 a / b into the surrounding tissue. The detection of extracellular HMGA la / b represents an approach to the diagnosis of tumors and metastases embedded in healthy tissue.
  • a diagnostic or diagnostic agent or diagnostic agent is capable of detecting, either directly or indirectly, an HMGA protein, preferably HMGA la / b as described herein, and more preferably HMGAla / b as described herein in connection with U.S. Patent Nos. 4,646,974; different disorders and Diseases.
  • the diagnostic agent is suitable for detection and / or aftercare for any of the diseases or diseases described herein. Such detection is possible by the binding of the nucleic acids according to the present invention to HMGA1 a / b. Such binding can be detected either directly or indirectly.
  • the corresponding methods and means are known to those skilled in the art.
  • the nucleic acids according to the present invention may comprise a label which allows the detection of the nucleic acids according to the present invention, preferably the nucleic acid which is bound or capable of binding to HMGA protein and preferably HMGA1 a / b.
  • a label is preferably selected from the group consisting of radioactive, enzymatic and fluorescent labels.
  • any known antibody-engineered assays can be adapted for the nucleic acids of the present invention with the target-binding antibody replaced by a target-molecule-binding nucleic acid.
  • detection is preferably by a secondary antibody modified with radioactive, enzymatic or fluorescent labels and binding to the target-binding antibody on its Fc fragment.
  • the nucleic acid is modified with such a label, whereby preferably such a label is selected from the group consisting of biotin, CY-3 and CY-5, and such a label is detected by an antibody directed against such label, e.g. As an anti-biotin antibody, an anti-CY-3 antibody or an anti-CY5 antibody or in the case that the label is biotin, the label is detected by streptavidin or avidin, which binds naturally to biotin.
  • an antibody, streptavidin or avidin is in turn preferably modified with a corresponding label, e.g. As a radioactive, enzymatic or fluorescent label, analogous to a secondary antibody.
  • the nucleic acids according to the present invention are detected or analyzed by a second detection means, wherein the detection means is a molecular beacon
  • the detection means is a molecular beacon
  • molecular beacons are nucleic acid probes that have a reverse complement to the are the nucleic acid sample, and therefore hybridize with a portion of the nucleic acid sample to be detected which is to be detected.
  • the fluorophore groups of the molecular beacon are separated from each other, resulting in the change of the fluorescence signal, preferably a change in intensity. This change correlates with the amount of nucleic acid sample present.
  • nucleic acids according to the invention can be used correspondingly as L-nucleic acids within the scope of the various aspects disclosed herein.
  • the nucleic acids according to the invention can furthermore be used as starting material for the design of pharmaceutical active ingredients (English, drug design). Basically, there are two possible approaches. One approach is to screen libraries of compounds, such libraries of compounds being preferably low molecular weight (small molecule) libraries. Such libraries are known to those skilled in the art. In one embodiment, the screening is high throughput screening. Preferably, high-level screening is fast, efficient, and is performed as a trial-and-error evaluation of drugs in a target-molecule-based assay.
  • the nucleic acids can be used for the rational design of drugs.
  • the rational design of drugs is the design of a pharmaceutical drug candidate.
  • the target molecule which is usually determined by methods such as X-ray analysis or nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR)
  • NMR nuclear magnetic resonance spectroscopy
  • computer programs are used to search databases with structures of a variety of different chemical compounds. The selection is carried out by the computer. The selected compounds are additionally tested in the laboratory.
  • the rational design of active ingredients may here be based on any of the nucleic acids according to the present invention and comprises a structure, in particular a three-dimensional structure, which is similar to the structure of the nucleated nucleic acid according to the invention.
  • Liche acid (s) is or is identical to that part of the structure of the nucleic acid (s) of the invention, which mediates the binding to HMG proteins. In any case, such a structure still shows the same or at least a similar binding behavior as the nucleic acid (s) according to the invention.
  • the preferably three-dimensional structure of those parts of the HMG protein-binding nucleic acids is mimicked by chemical groups, which are preferably different from nucleotides and nucleic acids.
  • a compound can be constructed which is different from the nucleic acid or nucleic acids used as starting materials for the rational design of the active ingredient.
  • Such a compound or drug is preferably a small molecule (Engl., Small molecule) or a peptide.
  • HMG analogs In the case of screening of compound libraries using competitive assays known to those skilled in the art, appropriate HMG analogs, HMG agonists, and HMG antagonists can be found.
  • Such competitive assays can be constructed as follows.
  • the nucleic acid according to the invention preferably a spiegelmer, d. H. an L-nucleic acid binding the target molecule is coupled to a preferably solid phase.
  • labeled HMG protein is added to the test system.
  • the HMG protein could also be coupled to a solid phase and the nucleic acid according to the invention could be labeled.
  • a potential analogue or potential agonist or antagonist would compete with the HMG molecules that bind to the aptmer, which would be accompanied by a decrease in the signal obtained from the corresponding label. Screening for agonists or antagonists may involve the use of a cell culture assay system known to those skilled in the art.
  • the nucleic acids according to the invention can be used owing to their characteristic binding behavior to HMG protein for the target validation ("target” is English for "target molecule”).
  • the nucleic acids of the invention can be used in an ex vivo organ model to study the function of HMG protein. Basically ex vivo models exist in which HMG agonists / antagonists can be tested.
  • a kit according to the present invention may comprise at least one or more of the nucleic acids of the invention.
  • the kit may include at least one or more positive or negative controls. As positive controls can z.
  • HMG protein against which the nucleic acid of the invention has been screened or to which it binds, preferably in liquid form may be used.
  • a peptide can be used, which behaves in terms of its biophysical properties similar to HMG protein, which is not recognized by the nucleic acids of the invention or a peptide with the same amino acid composition but of HMG protein of different sequence.
  • the kit may comprise one or more buffers.
  • the various ingredients may be present in the kit in dry or lyophilized form, or dissolved in a liquid.
  • the kit may include one or more containers, which in turn may contain one or more of the components of the kit.
  • the vessels contain reaction mixtures as required for a one-time experiment using one or more components of the kit.
  • hybridizing the two sections is understood herein to mean that the sections can hybridize in vitro due to general base pairing rules, or that the sections can hybridize or hybridize under the conditions of use, but not necessarily together are hybridized or hybridized under the conditions of use.
  • nucleic acids can be freely selected according to the technical teaching disclosed herein, d. H. can be chosen so that they show the required binding behavior to the respective target molecule and / or the structures described herein, in particular secondary structures are able to form.
  • FIG. 1A shows aptamers generated by in vitro selection against D-21AS-HMGAla / b, which bind the 21 AS-HMGA1a / b domain;
  • Figure 1B is a representation of the identified recurring sequence regions of the aptamers produced by in vitro selection against D-2 IAS -HMGA la / b, which bind the 2 IAS-HMGAla / b domain;
  • FIG. 2 shows a sequence comparison of HMGA1 a / b and HMGA2;
  • FIG. 3 shows a truncation of HMGA 1 a / b-binding aptamer NOX-f
  • Figure 4 shows the binding properties of truncated HMGA1 a / b binding aptamer NOX-f; 5 shows a competition assay for measuring the binding of HMGA to the double-stranded natural target DNA in the multiwell plate assay; the binding of the aptmer competes with the binding of the recombinant HMGAIb to the biotinylated dsDNA (AT-hook motif).
  • Figure 6 is a comparison of aptmer NOX-A and aptmer NOX-f (48nt; 33nt) in the competitive multiwell plate assay; Spiegelmer NOX-A, as well as Spiegeimer NOX-f and its shortened version Spiegeimer NOX-D3 in the plate assay prevent the binding of recombinant HMGAIb to its natural occurring binding partner in the low nanomolar range.
  • Figure 7 shows the activity of 2kDa PEG-coupled aptamer NOX-A and non-functional control mirror mer in the competitive multiwell plate assay; the PEGylated aptmer NOX-A competes with the binding of recombinant HMGAIb to the AT-hook motif of the dsDNA with an IC50 of 15nM; the inverse control aptmer of NOX-A exhibits a nonspecific interaction with HMGAIb at high aptmer concentrations;
  • Fig. 8 is a Western blot; Detection of immobilized HMGAIb by biotinylated aptmer; recombinant HMGAIb migrates in the electrophoretic field like a 2OkDa protein and can be detected at low concentrations (3nM) by the biotinylated aptmer (here by the example of NOX-A); an inverse control aptmer could not detect HGMGAIb;
  • Figure 9 shows the activity of free and PEGylated aptamer NOX-A in the competitive multiwell plate assay
  • FIG. 10 an examination of the packaging of PEGylated aptmer in micelles in the "RiboGreen exclusion assay";
  • FIG. 11 shows the stability of PEI aptmer micelles in the "RiboGreen exclusion assay"
  • FIG. 14 shows a proliferation assay with a "naked” aptmer
  • FIG. 15 shows the proliferation of non-small cell lung cancer (H1299) cells after treatment with PEI-packed NOX-A-2kDa PEG; Inhibition of proliferation of H-1299 cells with 1 ⁇ M aptmer administered as PEI aptmer micelles (N / P 2.5); NOX-A showed a slight inhibition of proliferation compared to the control aptmer;
  • FIG. 16 shows the inhibition of HMGA1a / b-induced cdc25a gene expression as detected by quantitative RT-PCR; Determination of specific inhibition of cdc25a mRNA expression in H-1299 cells by l ⁇ M NOX-A Spiegelmer micelles (N / P 2.5) by means of RT-PCR;
  • NOX-A Quantification of the dose-dependent inhibition of cdc25a mRNA expression in HI 299 cells by RT-PCR; NOX-A Spiegelmer micelles (N / P 2.5) showed a specific inhibition of cdc25a mRNA expression after 25OnM; at a concentration> 4 ⁇ M, an unspecific effect of the control aptmer and toxic effects of polyethylenimine (PEI) at> 10 ⁇ M were shown (data not shown);
  • PEI polyethylenimine
  • FIG. 18 shows the inhibition of tumor growth in the xenograft model in nude mice by the aptamer NOX-A; Inhibition of tumor growth after subcutaneous injection of PSN-I cells by 2 mg / kg aptmer micelles (N / P 2.5). Spiegelmer NOX-A showed a significant reduction of tumor growth; FIG. 19 shows the statistical analysis of the data from the xenograft experiment; FIG. Inhibition of the
  • FIG. 20 the tissue distribution of aptmer NOX-A in the xenograft experiment; FIG. quantitative analysis of the distribution of aptmer NOX-A in plasma and tissues; In the tumor tissue, a high concentration of aptmer NOX-A was detectable compared to the other tissues and plasma.
  • Fig. 21 Tissue distribution of micellar packaged and unpacked aptamer
  • Fig. 22 Distribution of micropacked and unpacked aptmer in
  • the HMGAI a / b-binding RNA tikmers were generated by in vitro selection against D-21 AS-HMGAl a / b and subsequent truncation steps.
  • the generated aptameres that bind the 21 AS-HMGA la / b domain are shown in FIG. 1A.
  • the different clones were prepared as aptamers (D-RNA) by standard phosphoramidite synthesis and radioactively labeled at the 5 'end by kinasing (see below). The clones were then analyzed for their affinity and activity at two concentrations of D-bio-21aa HMGA1 a / b by equilibrium binding assay.
  • the reaction was carried out for one hour at 37 0 C and was then stopped by heating (10 min at 65 ° C).
  • the separation of radioactive nucleotides from labeled oligonucleotides was carried out by analytical polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) (see below). Then a crush-and-soak gel elution with ammonium acetate and an ethanol precipitation (see below) .
  • the amount of purified RNA was estimated by the radioactivity of the pellet (after precipitation) relative to the radioactivity of the excised band.
  • oligonucleotides from PAA gels 500 ⁇ l ammonium acetate (2 M) was added after chopping the excised PAA gel bands with a pipette tip or spatula.
  • the "crush-and-soak" elution was 2 x 1.5 h at 68 0 C in a thermal shaker (1000 U / min) is performed.
  • the supernatants were "Ultrafree-MC-small columns (Millipore / Amicon, Schwalbach , Germany) in a tabletop centrifuge (16,100 xg) of gel residues. The thus eluted RNA was then desalted by means of an ethanol precipitation.
  • oligonucleotides were 30 min at -80 0 C and precipitated for 30 min at 16,100 xg, 4 ° C by centrifugation. The pellet was washed Ix with 70% ethanol and 5 min at 16,100 xg, 4 ° C centrifuged.
  • each of the 5 'radiolabeled aptamers were prepared in Biotinyl-D-HMGAla / b-21mer (EPSEVPTPKRPRGRPKGSKNK [SEQ ID: 17], see Figure 2), prepared by Bachern (Weil am Rhein, Germany). Solutions in the concentration range of 1 - 3000 nM (or for two-point measurement with 30O nM and 30 nM or 10O nM and 10 nM peptide) for one hour at 37 ° C in selection buffer (10 mM Tris HCl pH 7.4, 5 mM KCl, 0.8mM MgC12, 0.1% Tween).
  • the background control was a solution without biotinylated D-HMGA1 a / b-21mer. Peptide and complexes were then immobilized with 10 ⁇ l Streptavidin Ultra-Link gel within 30 min at 37 ° C. The radioactivity of the suspension was decided. The supernatant was removed. Then the matrix was washed once with 100 ⁇ l of selection buffer and then filled up with selection buffer. By measuring the radioactivity, the aptamer content present in the complex with biotinyl-D-HMGAla / b-21mer was determined for each peptide concentration. Graphical application and Fit (Gra-Fit, version 4.0.10, Erithacus Software) were used to determine the dissociation constant of the active species and the proportion of active molecules.
  • FIG. 3 shows by way of example on the candidate NOX-f (132-B3) the shortening of the aptamer based on the stabilizing Stem structure which is shown in an extended form in the candidates 132-C3, 132-B3, 132-C4, 132-E2, 132-A2, 132-H1, 132-F1, 122-G2, 122-E2 (see FIG. 1A). Shortening to a 32-nucleotide aptamer variant of NOX-f with a 6-nucleotide star (NOX-f 32nt) did not result in loss of binding properties to the 21aa HMGAla / b fragment ( Figures 3 and 4).
  • sequences 132-G2, 122-A1, 122-C1, 122-B2 and 122-B4 have a markedly shorter stem at the 5'-end and 3'-end of the repetitive sequence motif (GGGCG and GGGAG, respectively) Structure on. Shortening them led to a loss of binding. A possible shortening of the longer for these sequences, central region between the repetitive sequence motif (GGGCG or GGGUG or GGGAG) was not made.
  • the SEQ IDs of the aptamer sequences of the HMGA-binding nucleic acids disclosed herein are as follows:
  • the L-nucleotide enantiomer of an aptamer ie, a D-nucleic acid generated against a D-peptide
  • This L-nucleic acid is also referred to herein as a spiegelmer and otherwise has basically the same binding properties as the aptamer.
  • Characteristic of all Spiegelmers that bind to HMGA la / b is a repetitive sequence element of the sequence GGGCG or GGGUG or GGGAG. This sequence element appears twice in HMGA1 a / b-binding Spiegelmers ( Figures IA and IB).
  • the sequence element closer to the 5 'end of the aptmer is referred to herein as Box Al.
  • the sequence element closer to the 3 'end of the aptmer is referred to herein as box A2.
  • Box Al and Box A2 and their arrangement to each other probably represent the decisive feature of HMGAl a / b-binding Spiegelmers.
  • box A1 and box A2 are either a sequence section of six to seven nucleotides in length or 12 to 22 nucleotides in length ( Figures IA and IB). Since these sequence sections differ not only in their length, they are dealt with separately.
  • sequence section lying between box A1 and box A2 has a length of six nucleotides, then the sequence section has the sequence UGGUUG, UGGCUG, CGGUUG, AGGUUG or GUGUAA. Insertion of one nucleotide (uracil) into the sequence CGGUUG, resulting in the sequence CGGUUUG, has neither a negative nor a positive influence on the binding properties of the Spiegelmers.
  • the sequence section lying between box Al and box A2 has a length of 12 to 22
  • Nucleotides this sequence section has two sequence regions of equal length, the optionally hybridize with each other (Helix C). The Hybidleiter is accomplished thereby in each case three to six nucleotides. Between the nucleotides forming the helix C are three to five unpaired nucleotides. Between the 3 'end of Box Al and the 5' end of Helix C, one to three nucleotides are unpaired. Between the 3 'end of Helix C and the 5' end of Box A2, one to five nucleotides can be unpaired.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer L-Nukleinsäure als intrazellulär aktives Agens.

Description

Neue Verwendung von Spiegelmeren
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem Aspekt eine neue Verwendung von Spiegelmeren. In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung HMG-Proteine bindende Spiegelmere.
Mit den Fortschritten in der molekularen Medizin ist es möglich geworden, an einer Erkrankung oder einem Krankheitszustand beteiligte Zielmoleküle zu identifizieren und auf diese spezifisch einzuwirken, um dadurch die Erkrankung oder den Krankheitszustand zu behandeln, zu verhindern oder zumindest die damit verbundenen Symptome zu lindern. Die Zielmoleküle können grundsätzlich in zwei Gruppen eingeteilt werden. Die erste Gruppe umfasst Zielmoleküle, die extrazellulär vorhanden sind und somit grundsätzlich durch Gabe eines Wirkstoffes in eine Körperflüssigkeit oder eine Körperkavität, die das Zielmolekül enthält, mit diesem in Kontakt gebracht werden. Die erste Gruppe von Zielmolekülen werden hierin auch als extrazelluläre Zielmoleküle bezeichnet. Die zweite Gruppe von Zielmolekülen umfasst Zielmoleküle, die in Zellen vorhanden sind, wobei die Zellen mit der zu behandelnden Erkrankung oder der Disposition für die Erkrankung im Zusammenhang stehen. Es ist dabei nicht erforderlich, dass das Zielmolekül unmittelbar für den Krankheitszustand verantwortlich ist oder unmittelbar mit der Disposition für die Erkrankung im Zusammenhang steht. Vielmehr ist es ausreichend, dass das jeweilige Zielmolekül an einer Wirkkaskade beteiligt ist, die in ihrem Ablauf durch den Wirkstoff beeinflusst wird, mit der Folge, dass der Wirkstoff für die Behandlung oder Prävention der Erkrankung geeignet ist. Die zweite Gruppe von Zielmolekülen wird hierin auch als intrazelluläre Zielmoleküle bezeichnet.
Die Art des Zielmoleküls, d. h. extrazelluläres oder intrazelluläres Zielmolekül, bestimmt grundsätzlich die Verbindungsklasse, mit der versucht werden kann, die für die therapeutische oder präventive Wirkung erforderliche Wechselwirkung zwischen dem Wirkstoff, typischerweise dem pharmazeutischen Wirkstoff, und dem Zielmolekül bereitzustellen. Nahezu ubiquitär lassen sich sog. small molecules einsetzen, d. h. chemische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von typischerweise 1000 oder weniger Dalton. Diese Moleküle können direkt mit extrazellulären, aber auch mit intrazellulären Zielmolekülen in erwünschter Weise wechselwirken. Vor diesem Hintergrund wurden von der biotechnologischen Industrie neue Wirkstoffklassen entwickelt, wie beispielsweise Antikörper, insbesondere monoklonale Antikörper, Antisense- Moleküle, siRNA-Moleküle, Aptamere und Spiegelmere. Obgleich einige dieser Molekülklassen noch am Beginn von klinischen Untersuchungen stehen, existieren zumindest im Falle von Antikörpern und Antisense-Molekülen bereits in der Klinik eingesetzte Produkte. Gleichwohl bestehen auch mit diesen neuen Substanzklassen erhebliche Probleme, wenn es gilt, intrazelluläre Zielmoleküle zu adressieren. So ist beispielsweise die intrazelluläre Verwendung von Antikörpern derzeit immer noch nicht möglich, zumindest nicht in einem Umfang oder in einer Art und Weise, die eine routinemäßige Anwendung von gegen intrazelluläre Zielmoleküle gerichteten Antikörpern am Patienten zur Therapie und/oder Prophylaxe erlaubt. Auch die anderen neuen Wirkstoffklassen, insbesondere Antisense-Moleküle und siRNA-Moleküle, müssen infolge ihres Wirkmechanismus' in die jeweilige, das Zielmolekül oder das dafür codierende Gen enthaltende Zelle eingebracht werden. Die zielgerichtete Abgabe des Wirkstoffes, auch als Delivery bezeichnet, ist auch für diese Substanzklassen der derzeit limitierende Faktor für eine klinische Anwendung.
Gleiches gilt auch für Aptamere und Spiegelmere, d. h. funktionale Nukleinsäuren mit einer definierten dreidimensionalen Struktur, die die spezifische Wechselwirkung mit den jeweiligen Zielmolekülen ermöglicht. Die Anwendung von Aptameren, um intrazellulär vorliegende Zielmoleküle zu adressieren, bedient sich dabei Methoden der Gentechnologie, genauer der Gentherapie. Die gegen ein intrazelluläres Zielmolekül gerichteten, auch als Intramere bezeichneten Aptamere, werden vermittels gentechnologischer Verfahren in die jeweilige Zielzelle eingeschleust. Ein derartiger Ansatz ist jedoch ebenfalls mit erheblichen Beschränkungen verbunden, nicht zuletzt wegen der fehlenden Akzeptanz von Behandlungsansätzen auf der Grundlage der Gentherapie. Speziell der bei Intrameren beschrittene Weg der intrazellulären Expression einer für das jeweilige Aptamer intrazellulär codierenden Nukleinsäure ist den Spiegelmeren grundsätzlich verschlossen, da kein biologisches System existiert, welches Spiegelmere, d. h. aus L- Nukleotiden bestehende Aptamere, aufzubauen in der Lage wäre.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist somit, eine Substanzklasse bereitzustellen, die in der Lage ist, spezifisch mit intrazellulären Zielmolekülen, d. h. Zielmolekülen, die in einer Zelle vorhanden sind, zu wechselwirken. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch den Gegenstand der beigefügten unabhängigen Ansprüche. Bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die zugrundeliegende Aufgabe durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst in einem ersten Aspekt durch die Verwendung einer L-Nukleinsäure als intrazelluläres aktives Agens.
In einer ersten Ausführungsform des ersten Aspektes ist die L-Nukleinsäure ein Spiegeimer.
In einer zweiten Ausführungsform des ersten Aspektes, die auch eine Ausfuhrungsform der ersten Ausführungsform ist, tritt die L-Nukleinsäure in Wechselwirkung mit einem intrazellulären Rezeptor.
In einer dritten Ausführungsform des ersten Aspektes, die auch eine Ausfuhrungsform der zweiten Ausfuhrungsform ist, ist der intrazelluläre Rezeptor ausgewählt aus der Gruppe umfassend molekulare Rezeptoren, Enzyme, Chaperon-Moleküle, Signalpeptide, intrazelluläre Strukturen und Stoffwechselintermediate.
In einer vierten Ausführungsform des ersten Aspektes, die auch eine Ausfuhrungsform der zweiten Ausführungsform ist, ist der intrazelluläre Rezeptor ausgewählt aus der Gruppe umfassend Polypeptide, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren, Lipide und Kombinationen davon.
In einer fünften Ausführungsform des ersten Aspektes, die auch eine Ausfuhrungsform der zweiten, dritten und vierten Ausfuhrungsform ist, tritt die L-Nukleinsäure mit einem intrazellulären Rezeptor innerhalb einer Zelle in Wechselwirkung.
In einer sechsten Ausführungsform des ersten Aspektes, die auch eine Ausführungsform der zweiten, dritten, vierten und fünften Ausfuhrungsform ist, ist der intrazelluläre Rezeptor ausgewählt aus der Gruppe umfassend Transkriptionsfaktoren und einen AT-Haken bindende DNA- bindende Proteine. In einer siebten Ausführungsform des ersten Aspektes, die auch eine Ausführungsform der sechsten Ausfuhrungsform ist, ist der intrazelluläre Rezeptor ausgewählt aus der Gruppe umfassend die HMG-Proteine, bevorzugterweise aus der Gruppe umfassend HMGAl, HMGAIa, HMGAIb, und HMGA2.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst in einem zweiten Aspekt durch ein Verfahren zum Binden eines intrazellulären Rezeptors umfassend:
Bereitstellen einer Zelle enthaltend mindestens den einen intrazellulären Rezeptor,
Bereitstellen einer L-Nukleinsäure, und
Inkubieren der Zelle mit der L-Nukleinsäure.
In einer ersten Ausfuhrungsform des zweiten Aspekts erfolgt das Inkubieren unter Bedingungen, so dass die L-Nukleinsäure an den intrazellulären Rezeptor in der Zelle bindet.
In einer zweiten Ausfuhrungsform des zweiten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der ersten Ausfuhrungsform ist, ist die L-Nukleinsäure ein Spiegeimer.
In einer dritten Ausfuhrungsform des zweiten Aspekts, die auch eine Ausfuhrungsform der ersten und zweiten Ausfuhrungsform ist, wird nach der Inkubation der Zelle mit der L-Nukleinsäure bestimmt, ob eine Bindung, insbesondere eine intrazelluläre Bindung, der L-Nukleinsäure an dem intrazellulären Rezeptor erfolgt ist.
In einer vierten Ausfuhrungsform des zweiten Aspekts, die auch eine Ausfuhrungsform der ersten, zweiten und dritten Ausfuhrungsform ist, ist der intrazelluläre Rezeptor ausgewählt aus der Gruppe umfassend molekulare Rezeptoren, Stoffwechselintermediate und Enzyme.
In einer fünften Ausfuhrungsform des zweiten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der ersten, zweiten, dritten und vierten Ausfuhrungsform ist, ist der intrazelluläre Rezeptor ausgewählt aus der Gruppe umfassend Polypeptide, Kohlenhydrate, Nukleinsäure, Lipide und Kombinationen davon. In einer sechsten Ausführungsform des zweiten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der ersten, zweiten, dritten, vierten und fünften Ausführungsform ist, ist der intrazelluläre Rezeptor ausgewählt aus der Gruppe umfassend Transkriptionsfaktoren und einen AT-Haken bindende DNA-bindende Proteine.
hi einer siebten Ausführungsform des zweiten Aspekts, die auch eine Ausfuhrungsform der sechsten Ausführungsform ist, ist der intrazelluläre Rezeptor ausgewählt aus der Gruppe umfassend HMG-Proteine, bevorzugterweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend HMGAl, HMGAIa, HMGAIb und HMGA2.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst in einem dritten Aspekt durch die Verwendung einer L-Nukleinsäure zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung und/oder Prävention einer Erkrankung, wobei das Zielmolekül des Medikamentes ein intrazelluläres Zielmolekül ist.
In einer ersten Ausführungsform des dritten Aspekts ist der intrazelluläre Rezeptor ausgewählt aus der Gruppe umfassend molekulare Rezeptoren, Enzyme, Chaperon-Moleküle, Signalpeptide, intrazelluläre Strukturen und Stoffwechselintermediate.
In einer zweiten Ausführungsform des dritten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der ersten Ausführungsform ist, ist der intrazelluläre Rezeptor ausgewählt aus der Gruppe umfassend Polypeptide, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren, Lipide und Kombinationen davon.
hi einer dritten Ausführungsform des dritten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der ersten und zweiten Ausführungsform ist, ist das Zielmolekül ausgewählt aus der Gruppe, die Transkriptionsfaktoren und einen AT-Haken bindende DNA-bindende Proteine umfasst.
hi einer vierten Ausführungsform des dritten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der dritten Ausführungsform ist, ist das Zielmolekül ausgewählt aus der Gruppe umfassend HMG-Proteine, bevorzugterweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend HMGAl, HMGAIa, HMGAIb und HMGA2.
In einer fünften Ausführungsform des dritten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der dritten und vierten Ausführungsform ist, ist die Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe umfassend Tumorerkrankungen, Virusinfektionen und Arteriosklerose. In einer sechsten Ausführungsform des dritten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der fünften Ausführungsform ist, ist die Tumorerkrankung ausgewählt aus der Gruppe umfassend mesenchymale Tumoren, epitheliale Tumoren, benigne Tumoren, maligne Tumoren und metastasie- rende Tumoren.
In einer siebten Ausfuhrungsform des dritten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der dritten, vierten, fünften und sechsten Ausführungsform ist, sind das Zielmolekül HMGA und die Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe umfassend Karzinome von Prostata, Pankreas, Schilddrüse, Cervix, Magen, Brust, Colon/Rektum, Ovarien; Neuroblastome; Lymphome, Uterusleio- myome; Lipome; Endometriumpolypen; chondroide Hamartome der Lunge; pleomorphe Adenome der Kopfspeicheldrüsen; Hämangiopericytome; chondromatöse Tumore; aggressive Angi- omyxome; diffuse Astrocytome; Osteoklastome; Hautkrebs; Burkitts Lymphom; Lewis- Lungenkrebs; Leukämie; nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom; sowie jeweils Metastasen und/oder metastasierende Formen davon.
In einer achten Ausführungsform des dritten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der fünften Ausführungsform ist, ist die Arteriosklerose durch HMGAl, HMGAIa, HMGIb und/oder HMGA2 vermittelte Bildung von artierosklerotischen Plaques ausgelöst oder bedingt.
In einer neunten Ausführungsform des dritten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der ersten, zweiten, dritten, vierten, fünften, sechsten, siebten und achten Ausführungsform ist, liegt das intrazelluläre Zielmolekül intrazellulär vor.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst in einem vierten Aspekt durch die Verwendung einer L-Nukleinsäure zur Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Diagnose, wobei das Zielmolekül des diagnostischen Mittels ein intrazelluläres Zielmolekül ist.
In einer ersten Ausführungsform des vierten Aspekts ist der intrazelluläre Rezeptor ausgewählt aus der Gruppe umfassend molekulare Rezeptoren, Enzyme, Chaperon-Moleküle, Signalpeptide, intrazelluläre Strukturen und Stoffwechselintermediate. In einer zweiten Ausfϊihrungsform des vierten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der ersten Ausfuhrungsform ist, ist der intrazelluläre Rezeptor ausgewählt aus der Gruppe umfassend Polypeptide, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren, Lipide und Kombinationen davon.
hi einer dritten Ausfuhrungsform des vierten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der ersten und zweiten Ausfuhrungsform ist, ist das Zielmolekül ausgewählt aus der Gruppe, die Transkriptionsfaktoren und einen AT-Haken bindende DNA-bindende Proteine umfasst.
In einer vierten Ausführungsform des vierten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der dritten Ausführungsform ist, ist das Zielmolekül ausgewählt aus der Gruppe umfassend HMG- Proteine, bevorzugterweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend HMGA, HMGAIa, HMGAIb und HMGA2.
In einer fünften Ausfuhrungsform des vierten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der dritten und vierten Ausführungsform ist, ist die Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe umfassend Tumorerkrankungen, Virusinfektionen und Arteriosklerose.
In einer sechsten Ausführungsform des vierten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der fünften Ausführungsform ist, ist die Tumorerkrankung ausgewählt aus der Gruppe umfassend mesenchymale Tumoren, epitheliale Tumoren, benigne Tumoren, maligne Tumoren und me- tastatisierende Tumoren.
In einer siebten Ausführungsform des vierten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der dritten, vierten, fünften und sechsten Ausfuhrungsform ist, ist das Zielmolekül HMGA und die Erkrankung ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend Karzinome von Prostata, Pankreas, Schilddrüse, Cervix, Magen, Brust, Colon/Rektum, Ovarien; Neuroblastome; Lymphome, Uterusleio- myome; Lipome; Endometriumpolypen; chondroide Hamartome der Lunge; pleomorphe Adenome der Kopfspeicheldrüsen; Hämangiopericytome; chondromatöse Tumore; aggressive Angi- omyxome; diffuse Astrocytome; Osteoklastome; Hautkrebs; Burkitts Lymphom; Lewis- Lungenkrebs; Leukämie; nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom; sowie jeweils Metastasen und/oder metastasierende Formen davon. In einer achten Ausfuhrungsform des vierten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der fünften Ausführungsform ist, wird die Arteriosklerose durch HMGAl, HMGAIa, HMGIb und/oder HMGA2 vermittelte Bildung von artierosklerotischen Plaques ausgelöst.
In einer neunten Ausführungsform des vierten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der ersten, zweiten, dritten, vierten, fünften, sechsten und siebten Ausführungsform ist, liegt das intrazelluläre Zielmolekül intrazellulär vor.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst in einem fünften Aspekt durch eine Zusammensetzung umfassend eine an ein intrazelluläres Zielmolekül bindende L-Nukleinsäure und ein Abgabevehikel.
In einer ersten Ausfuhrungsform des fünften Aspekts ist das Abgabevehikel ein für die intrazelluläre Abgabe der L-Nukleinsäure geeignetes Abgabevehikel.
In einer zweiten Ausfuhrungsform des fünften Aspekts, die auch eine Ausführungsform der ersten Ausfuhrungsform ist, ist das Abgabevehikel ausgewählt aus der Gruppe umfassend Vehikel, Konjugate und physikalische Maßnahmen.
In einer dritten Ausführungsform des fünften Aspekts, die auch eine Ausführungsform der zweiten Ausführungsform ist, ist das Abgabevehikel ein Vehikel, wobei das Vehikel ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Liposome, Nanopartikel, Mikropartikel, Cyclodextrine oder Dendri- mere, oder ein Vesikel, das aus Polypeptiden, Polyethylenimin und/oder amphipathischen Molekülen besteht.
In einer vierten Ausfuhrungsform des fünften Aspekts, die auch eine Ausführungsform der zweiten Ausführungsform ist, ist das Abgabevehikel ein Konjugat, wobei das Konjugat ein Konjugat für die Rezeptor-vermittelte Endozytose, ein Konjugat mit einem fusogenen Peptid, ein Konjugat mit einem Signalpeptid, ein Konjugat mit einer Nukleinsäure, bevorzugterweise ein Konjugat mit einem Spiegeimer oder ein lipophiles Konjugat ist.
In einer fünften Ausführungsform des fünften Aspekts, die auch eine Ausfuhrungsform der zweiten Ausführungsform ist, ist das Abgabevehikel eine physikalische Maßnahme, wobei die Maß- nähme bevorzugterweise ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Elektroporation, Iontophore- se, Druck, Ultraschall und Schockwellen.
In einer sechsten Ausführungsform des fünften Aspekts, die auch eine Ausfuhrungsform der dritten Ausfuhrungsform ist, umfasst das Abgabevehikel Polyethylenimin.
In einer siebten Ausführungsform des fünften Aspekts, die auch eine Ausführungsform der sechsten Ausführungsform ist, ist das Polyethylenimin ein verzweigtes Polyethylenimin mit einem Molekulargewicht von etwa 25 kDa.
In einer achten Ausführungsform des fünften Aspekts, die auch eine Ausführungsform der sechsten und siebten Ausführungsform ist, bildet das Polyethylenimin eine Mizelle oder eine mizellenartige Struktur aus.
In einer neunten Ausführungsform des fünften Aspekts, die auch eine Ausführungsform der ersten, zweiten, dritten, vierten, fünften, sechsten, siebten und achten Ausführungsform ist, ist die L-Nukleinsäure ein Spiegeimer.
In einer zehnten Ausführungsform des fünften Aspekts, die auch eine Ausführungsform der neunten Ausführungsform ist, trägt das Spiegeimer eine Modifikation, wobei die Modifikation ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend PEG-Reste.
In einer elften Ausführungsform des fünften Aspekts, die auch eine Ausführungsform der zehnten Ausführungsform ist, weist der PEG-Rest ein Molekulargewicht von etwa 1.000 bis 10.000 Da auf, bevorzugterweise ein Molekulargewicht von etwa 1.500 bis 2.500 Da und am bevorzugtesten ein Molekulargewicht von etwa 2.000 Da.
In einer zwölften Ausführungsform des fünften Aspekts, die auch eine Ausführungsform der zehnten und elften Ausführungsform ist, ist die Modifikation am 5 '-Terminus oder am 3'- Terminus der L-Nukleinsäure gebunden.
In einer dreizehnten Ausführungsform des fünften Aspekts, die auch eine Ausführungsform der neunten, zehnten, elften und zwölften Ausführungsform ist, beträgt in der Zusammensetzung das Verhältnis aus Gesamtanzahl der Stickstoffgruppen des Polyethylenimins und Gesamtanzahl der Phosphatgruppen der in der Zusammensetzung enthaltenen Nukleinsäure etwa 1 bis 20, bevor- zugterweise etwa 1,5 bis 10, bevorzugtererweise etwa 2 bis 5 und am bevorzugtesten etwa 2 bis 3.
In einer vierzehnten Ausführungsform des fünften Aspekts, die auch eine Ausfuhrungsform der ersten, zweiten, dritten, vierten, fünften, sechsten, siebten achten, neunten, zehnten, elften, zwölften und dreizehnten Ausführungsform ist, stellt die Zusammensetzung die L-Nukleinsäure intrazellulär bereit.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst in einem sechsten Aspekt durch die pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine Zusammensetzung nach dem fünften Aspekt, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
In einer Ausführungsform der Verwendung nach dem ersten Aspekt ist die L-Nukleinsäure eine Zusammensetzung nach dem fünften Aspekt.
In einer Ausführungsform des Verfahrens nach dem zweiten Aspekt ist die L-Nukleinsäure eine Zusammensetzung nach dem fünften Aspekt.
In einer Ausführungsform der Verwendung nach dem dritten Aspekt ist die L-Nukleinsäure eine Zusammensetzung nach dem fünften Aspekt.
In einer Ausführungsform der Verwendung nach dem vierten Aspekt ist die L-Nukleinsäure eine Zusammensetzung nach dem fünften Aspekt.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst in einem siebten Aspekt durch eine HMGA bindende Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure einen Abschnitt Box Al und einen Abschnitt Box A2 umfasst, wobei der Abschnitt Box Al und der Abschnitt Box A2 durch einen Zwischenabschnitt miteinander verbunden sind und wobei Box Al und Box A2 einzeln und unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die GGGCG, GGGUG und GGGAG umfasst.
In einer ersten Ausführungsform des siebten Aspekts besteht der Zwischenabschnitt entweder aus einem Zwischenabschnitt Zl umfassend sechs oder sieben Nukleotide oder aus einem Zwi- schenabschnitt Z2 umfassend 12 bis 25 Nukleotide. In einer zweiten Ausfuhrungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der ersten Ausführungsform ist, weist die Nukleinsäure am 5 '-Ende des Abschnittes Box Al einen ersten Abschnitt und am 3 '-Ende des Abschnittes Box A2 einen zweiten Abschnitt auf, wobei bevorzugterweise beide Abschnitte unabhängig voneinander je vier bis acht Nukleotide umfassen.
In einer dritten Ausfuhrungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der zweiten Ausfuhrungsform ist, sind die beiden Abschnitte wenigstens teilweise oder vollständig miteinander hybridisiert, wobei sich die Hybridisierung über vier bis acht Nukleotidpaare erstreckt.
In einer vierten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der zweiten und dritten Ausführungsform ist, weist die Nukleinsäure am 5'-Ende des Abschnittes Box Al einen Abschnitt Helix Al und am 3 '-Ende des Abschnittes Box A2 einen Abschnitt Helix A2 auf, wobei bevorzugterweise der Abschnitt Helix Al vier bis acht Nukleotide umfasst und bevorzugterweise der Abschnitt Helix A2 vier bis acht Nukleotide umfasst, und wobei bevorzugterweise der Abschnitt Helix Al den ersten Abschnitt am 5'-Ende des Abschnittes Box Al oder einen Teil davon darstellt, und wobei bevorzugterweise der Abschnitt Helix A2 den zweiten Abschnitt am 3 '-Ende des Abschnittes Box A2 oder einen Teil davon darstellt, wobei die Länge des Abschnittes Helix Al unabhängig von der Länge des Abschnittes Helix A2 ist.
In einer fünften Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der vierten Ausführungsform ist, sind die Abschnitte Helix Al und Helix A2 wenigstens teilweise oder vollständig miteinander hybridisiert, wobei sich die Hybridisierung über vier bis acht Nukleotidpaare erstreckt.
In einer sechsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der vierten und fünften Ausführungsform ist, ist zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Helix Al und dem 5'-Ende des Abschnittes Box Al ein Abschnitt Helix Bl und zwischen dem 3'-Ende des Abschnittes Box A2 und dem 5 '-Ende des Abschnittes Helix A2 ein Abschnitt Helix B2 angeordnet, wobei bevorzugterweise die Länge des Abschnittes Helix Bl und Helix B2 jeweils einzeln und unabhängig eine Länge von vier bis acht Nukleotiden umfasst.
In einer siebten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der sechsten Ausführungsform ist, sind die Abschnitte Helix Bl und Helix B2 wenigstens teilweise oder vollständig miteinander hybridisiert, wobei sich die Hybridisierung über vier bis acht Nukleotidpaare erstreckt.
In einer achten Ausfuhrungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausfuhrungsform der sechsten und siebten Ausführungsform ist, sind zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Helix Al und dem 5'-Ende des Abschnittes Helix Bl null bis fünf Nukleotide angeordnet.
In einer neunten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der achten Ausführungsform ist, sind zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Helix Al und dem 5'- Ende des Abschnittes Helix Bl zwei Nukleotide angeordnet.
In einer zehnten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausfuhrungsform der sechsten, siebten, achten und neunten Ausfuhrungsform ist, sind zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Helix B2 und dem 5 '-Ende des Abschnittes Helix A2 null bis sechs Nukleotide angeordnet.
In einer elften Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der zehnten Ausführungsform ist, bevorzugterweise insoweit diese eine Ausführungsform der neunten Ausführungsform ist, ist zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Helix B2 und dem 5 '-Ende des Abschnittes Helix A2 ein Nukleotid angeordnet.
In einer zwölften Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der sechsten, siebten, achten, neunten, zehnten und elften Ausfuhrungsform ist, beträgt die Summe der Nukleotide von Abschnitt Helix Al und von Abschnitt Helix Bl 10 bis 12 Nukleotide und die Summe der Nukleotide von Abschnitt Helix A2 und von Abschnitt Helix B2 10 bis 12 Nukleotide.
In einer dreizehnten Ausfuhrungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausfuhrungsform der zwölften Ausfuhrungsform ist, beträgt die Summe der hybridisierten Nukleotide aus der Hybridisierung von Abschnitt Helix Al mit Abschnitt Helix A2 und von Abschnitt Helix Bl mit Abschnitt Helix B2 10 bis 12 Nukleotidpaare.
In einer vierzehnten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der sechsten, siebten, achten, neunten, zehnten, elften, zwölften und dreizehnten Ausführungsform ist, bevorzugterweise der sechsten oder siebten, umfasst die Nukleinsäure keinen Abschnitt Helix Al und Helix A2, wodurch am 5'-Ende der Nukleinsäure der Abschnitt Helix Bl und am 3'- Ende die Helix B2 angeordnet ist, wobei bevorzugterweise die Länge des Abschnittes Helix Bl und Helix B2 jeweils einzeln und unabhängig eine Länge von vier bis acht Nukleotiden umfasst.
In einer fünfzehnten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der vierzehnten Ausführungsform ist, sind die Abschnitte Helix Bl und Helix B2 wenigstens teilweise oder vollständig miteinander hybridisiert, wobei sich die Hybridisierung über vier bis acht Nukleotidpaare erstreckt.
In einer sechzehnten Ausfuhrungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der vierten und fünften Ausführungsform ist, sind zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Helix Al und dem 5'-Ende des Abschnittes Box Al ein bis fünf Nukleotide und zwischen dem 3'-Ende des Abschnittes Box A2 und dem 5 '-Ende des Abschnittes Helix A2 ein bis drei Nukleotide angeordnet.
In einer siebzehnten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der sechsten, siebten, achten, neunten, zehnten, elften, zwölften, dreizehnten, vierzehnten und fünfzehnten Ausführungsform ist, sind zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Helix Bl und dem 5'- Ende des Abschnittes Box Al zwei Nukleotide und zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Box A2 und dem 5 '-Ende des Abschnittes Helix B2 eins bis sieben Nukleotide angeordnet.
In einer achtzehnten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der ersten, zweiten, dritten, vierten, fünften, sechsten, siebten, achten und zehnten Ausführungsform ist, soweit diese eine Ausführungsform der sechsten, siebten und achten Ausführungsform ist, der zwölften und dreizehnten Ausführungsform, soweit diese Ausführungsformen der sechsten, siebten, achten und zehnten Ausführungsform sind, der vierzehnten und fünfzehnten Ausführungsform, soweit diese Ausfuhrungsformen der sechsten, siebten, achten, zehnten, zwölften und dreizehnten Ausführungsform sind, oder der siebzehnten Ausführungsform, soweit diese Ausführungsformen der sechsten, achten, zehnten, zwölften, dreizehnten und fünfzehnten Ausführungsform sind, jeweils in dem hierin eingeschränkten Umfang, umfasst der Zwischenabschnitt Zl sechs oder sieben Nukleotide. In einer neunzehnten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausfuhrungsform der achtzehnten Ausführungsform ist, weist der Zwischenabschnitt Zl die Sequenz NiN2GNgN3N4Ns auf, wobei
N, = U, C, A oder G ist; N2 = G oder U ist; N3 = U oder C ist; N4 = U oder A ist; N5 = G oder A ist; und N8 = U ist oder fehlt.
In einer zwanzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der neunzehnten Ausführungsform ist, umfasst die Nukleinsäure einen Abschnitt Box Al und einen Abschnitt Box A2, wobei das 3'-Ende des Abschnittes Box Al direkt mit dem 5'-Ende des Zwischenabschnittes Zl verbunden ist, und das 3 '-Ende des Zwischenabschnittes Zl direkt mit dem 5 '-Ende des Abschnittes Box A2 verbunden ist.
In einer einundzwanzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der achtzehnten, neunzehnten und zwanzigsten Ausführungsform ist, insbesondere der zwanzigsten, umfasst die Nukleinsäure einen Abschnitt Helix Bl und einen Abschnitt Helix B2.
In einer zweiundzwanzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der einundzwanzigsten Ausfuhrungsform ist, umfassen die Abschnitte Helix Bl und Helix B2 jeweils einzeln und unabhängig voneinander vier bis acht Nukleotide, die bevorzugterweise vollständig oder teilweise miteinander hybridisiert sind.
In einer dreiundzwanzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der einundzwanzigsten und zweiundzwanzigsten Ausführungsform ist, sind zwischen dem 3'-Ende des Abschnittes Helix Bl und dem 5'-Ende des Abschnittes Box Al in 5 '-3 '-Richtung zwei Nukleotide N6, N7 angeordnet, wobei N6 G, A oder U ist, und N7 = G oder U ist.
In einer vierundzwanzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausfuhrungsform der einundzwanzigsten, zweiundzwanzigsten und dreiundzwanzigsten Ausführungsform ist, ist zwischen dem 3'-Ende des Abschnittes Box A2 und dem 5'-Ende des Abschnittes Helix B2 kein Nukleotid, oder in 5'-3 '-Richtung die Nukleotidsequenz GNy angeordnet, wobei Ny null bis sechs Nukleotide umfasst, bevorzugterweise 0 oder 6 Nukleotide.
In einer fünfundzwanzigsten Ausfuhrungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausfuhrungsform der achtzehnten, neunzehnten, zwanzigsten, einundzwanzigsten, zweiundzwanzigsten, dreiundzwanzigsten und vierundzwanzigsten Ausführungsform ist, umfasst die Nukleinsäure einen Abschnitt Helix Al und Helix A2.
In einer sechsundzwanzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der fünfundzwanzigsten Ausführungsform ist, umfassen die Abschnitte Helix Al und Helix A2 jeweils und unabhängig voneinander vier bis acht Nukleotide, wobei bevorzugterweise die Abschnitte Helix Al und Helix A2 vollständig oder teilweise miteinander hybridisiert sind.
In einer siebenundzwanzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der fünfundzwanzigsten und sechsundzwanzigsten Ausführungsform ist, umfasst zwischen dem 3'-Ende des Abschnittes Helix Al und dem 5'-Ende des Abschnittes Helix Bl eine Nukleotidsequenz Nx angeordnet ist, wobei Nx null bis fünf Nukleotide.
In einer achtundzwanzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der fünfundzwanzigsten, sechsundzwanzigsten und siebenundzwanzigsten Ausführungsform ist, umfasst zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Helix B2 und dem 5 '-Ende des Abschnittes Helix A2 eine Nukleotidsequenz Nz angeordnet ist, wobei N2 null bis sechs Nukleotide.
In einer neunundzwanzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der einundzwanzigsten, zweiundzwanzigsten, dreiundzwanzigsten, vierundzwanzigsten, fünfundzwanzigsten, sechsundzwanzigsten, siebenundzwanzigsten und achtundzwanzigsten Ausführungsform ist, beträgt die Summe der hybridisierten Nukleotide aus der Hybridisierung von Abschnitt Helix Al mit Abschnitt Helix A2 und von Abschnitt Helix Bl mit Abschnitt Helix B2 10 bis 12 Nukleotidpaare.
In einer dreißigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der vierundzwanzigsten, fünfundzwanzigsten, sechsundzwanzigsten, siebenundzwanzigsten, achtundzwanzigsten und neunundzwanzigsten Ausführungsform ist, ist zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Box A2 und dem 5'-Ende des Abschnittes Helix B2 in 5 '-3 '-Richtung die Nukleo- tidsequenz GNy angeordnet, wobei Ny null bis sechs Nukleotide umfasst, bevorzugterweise 0 oder 6 Nukleotide.
In einer einunddreißigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungs- form der dreißigsten Ausführungsform ist, umfasst die HMGA bindende Nukleinsäure die folgende Struktur
Helix Al-Nv-Helix B1-N6N7JBOXÄT|NIN2GN8N3N4N5[BOX A2|G-Nγ-Helix B2-N7-Helix A2
wobei
N1 = U, C, A oder G ist;
N2 = G oder U ist;
N3 = U oder C ist;
N4 = U oder A ist;
N5 = G oder A ist;
N6 = G, A oder U ist;
N7 = G oder U ist;
N8 = U oder kein Nukleotid ist;
Nx = null bis fünf Nukleotide ist;
Ny = null oder sechs Nukleotide ist; und
N2 = null bis sechs Nukleotide ist;
der Abschnitt Box Al und Abschnitt Box A2 jeweils einzeln und unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe von Nukleotidsequenzen umfassend GGGCG, GGGUG und GGGAG;
der Abschnitt Helix Al und der Abschnitt Helix A2 jeweils einzeln und unabhängig voneinander vier bis acht Nukleotide umfassen, wobei bevorzugterweise die Abschnitte Helix Al und Helix A2 vollständig oder teilweise miteinander hybridisiert sind, und
die Abschnitte Helix Bl und Helix B2 jeweils einzeln und unabhängig voneinander vier bis acht Nukleotide umfassen, wobei bevorzugterweise die Abschnitte Helix Bl und Helix B2 vollständig oder teilweise miteinander hybridisiert sind und der hybridisierende Bereich vier bis acht Nukleotide umfasst, und wobei die Summe der hybridisierten Nukleotide aus der Hybridisierung von Abschnitt Helix Al mit Abschnitt Helix A2 und von Abschnitt Helix Bl mit Abschnitt Helix B2 10 bis 12 Nukleotidpaare beträgt.
In einer zweiunddreißigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungs- form der dreißigsten und einunddreißigsten Ausfuhrungsform ist, umfasst die HMGA bindende Nukleinsäure eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ. ID. No. 1, SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 3, SEQ. ID. No. 5, SEQ. ID. No. 6, SEQ. ID. No. 7 und SEQ. ID. No. 13.
In einer dreiunddreißigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der vierundzwanzigsten, fünfundzwanzigsten, sechsundzwanzigsten, siebenundzwanzigsten, achtundzwanzigsten und neunundzwanzigsten Ausführungsform ist, schließt sich das 3'- Ende des Abschnittes Box A2 unmittelbar an das 5 '-Ende des Abschnittes Helix B2 an.
In einer vierunddreißigsten Ausfuhrungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der dreiunddreißigsten Ausfuhrungsform ist, umfasst die HMGA bindende Nukleinsäure die folgende Struktur
Helix Al-Nv-Helix BI-N6N7POXATJNIN2GN8N3N4N5IBOX Ä^Helix B2-N7-Helix A2
wobei
Ni = U, C, A oder G ist;
N2 = G oder U ist;
N3 = U oder C ist;
N4 = U oder A ist;
N5 = G oder A ist;
N6 = G, A oder U ist;
N7 = G oder U ist;
Ng = U oder kein Nukleotid ist;
Nx = null bis fünf Nukleotide ist; und
Nz = null bis sechs Nukleotide ist; der Abschnitt Box Al und Abschnitt Box A2 jeweils einzeln und unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe von Nukleotidsequenzen umfassend GGGCG, GGGUG und GGGAG;
der Abschnitt Helix Al und der Abschnitt Helix A2 jeweils einzeln und unabhängig voneinander vier bis acht Nukleotide umfassen, wobei bevorzugterweise die Abschnitte Helix Al und Helix A2 vollständig oder teilweise miteinander hybridisiert sind, und
die Abschnitte Helix Bl und Helix B2 jeweils einzeln und unabhängig voneinander vier bis acht Nukleotide umfassen, wobei bevorzugterweise die Abschnitte Helix Bl und Helix B2 vollständig oder teilweise miteinander hybridisiert sind und der hybridisierende Bereich vier bis acht Nukleotide umfasst, und wobei die Summe der hybridisierten Nukleotide aus der Hybridisierung von Abschnitt Helix Al mit Abschnitt Helix A2 und von Abschnitt Helix Bl mit Abschnitt Helix B2 10 bis 12 Nukleotidpaare beträgt.
In einer fünfunddreißigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der dreiunddreißigsten und vierunddreißigsten Ausführungsform ist, umfasst die HMGA bindende Nukleinsäure eine Sequenz umfassend SEQ. ID. No. 3.
In einer sechsunddreißigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der einunddreißigsten Ausführungsform ist, umfasst die HMGA bindende Nukleinsäure die folgende Struktur
Helix Bl-N6N7|Box A1|NIN2GN8N3N4N5|BOX A2JG-Nγ-Helix B2
In einer siebenunddreißigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausfuhrungsform der vierunddreißigsten Ausfuhrungsform ist, umfasst die HMGA bindende Nukleinsäure die folgende Struktur
Helix BI-N6N7IBOX AIININ2GN8N3N4N5IBOX Ä2jHelix B2
In einer achtunddreißigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausfuhrungsform der sechsunddreißigsten Ausfuhrungsform ist, umfasst die HMGA bindende Nukleinsäure eine Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend SEQ. ID. No. 15 und SEQ. ID. No. 16.
In einer neununddreißigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausfuhrungsform der ersten, zweiten, dritten, vierten, fünften, sechsten, siebten, achten, neunten, zehnten, elften, zwölften, dreizehnten und sechzehnten oder siebzehnten Ausführungsform des siebten Aspekts ist, umfasst die HGMA bindende Nukleinsäure einen Zwischenabschnitt Z2 der 12 bis 25 Nukleotide umfasst.
In einer vierzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der neununddreißigsten Ausführungsform ist, umfassend die HGMA bindende Nukleinsäure einen Zwischenabschnitt Z2 einen Abschnitt Helix Cl und einen Abschnitt Helix C2.
In einer einundvierzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der vierzigsten Ausführungsform ist, ist zwischen dem Abschnitt Helix Cl und dem Abschnitt Helix C2 der HMGA bindenden Nukleinsäure ein zentraler Abschnitt Nc angeordnet.
In einer zweiundvierzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der vierzigsten oder einundvierzigsten Ausführungsform ist, ist die Länge des Abschnittes Helix Cl und Helix C2 der HGMA bindenden Nukleinsäure gleich lang.
In einer dreiundvierzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der vierzigsten, einundvierzigsten und zweiundvierzigsten Ausführungsform ist, ist die Länge des Abschnittes Helix Cl und Helix C2 der HGMA bindenden Nukleinsäure einzeln und unabhängig drei bis sechs Nukleotide.
In einer vierundvierzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der vierzigsten, einundvierzigsten, zweiundvierzigsten und dreiundvierzigsten Ausführungsform ist, sind die Abschnitte Helix Cl und Helix C2 der HMGA bindenden Nukleinsäure vollständig oder teilweise miteinander hybridisiert.
In einer fünfundvierzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der neununddreißigsten, vierzigsten, einundvierzigsten, zweiundvierzigsten, dreiundvier- zigsten und vierundvierzigsten Ausfuhrungsform ist, umfasst der zentrale Abschnitt Nc der HMGA bindenden Nukleinsäure drei bis fünf Nukleotide.
In einer sechsundvierzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der neununddreißigsten, vierzigsten, einundvierzigsten, zweiundvierzigsten, dreiundvierzigsten, vierundvierzigsten und fünfundvierzigsten Ausfuhrungsform ist, umfasst die HMGA bindende Nukleinsäure einen Abschnitt Box Al und einen Abschnitt Box A2, wobei zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Box Al und dem 5 '-Ende des Abschnittes Helix Cl eine Nukleo- tidsequenz Nb angeordnet ist und drei Nukleotide umfasst.
In einer siebenundvierzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausfuhrungs- form der neununddreißigsten, vierzigsten, einundvierzigsten, zweiundvierzigsten, dreiundvierzigsten, vierundvierzigsten, funfundvierzigsten und sechsundvierzigsten Ausfuhrungsform ist, umfasst die HMGA bindende Nukleinsäure einen Abschnitt Box Al und einen Abschnitt Box A2, wobei zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Helix C2 und dem 5 '-Ende des Abschnittes Box A2 eine Nukleotidsequenz Nd angeordnet ist und zwei bis fünf Nukleotide umfasst.
In einer achtundvierzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungs- form der neununddreißigsten, vierzigsten, einundvierzigsten, zweiundvierzigsten, dreiundvierzigsten, vierundvierzigsten, fünfundvierzigsten, sechsundvierzigsten und siebenundvierzigsten Ausführungsform ist, umfasst die HMGA bindende Nukleinsäure einen Abschnitt Helix Al und einen Abschnitt Helix A2.
In einer neunundvierzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der achtundvierzigsten Ausführungsform ist, umfassen die Abschnitte Helix Al und Helix A2 der HMGA bindenden Nukleinsäure jeweils einzeln und unabhängig voneinander fünf bis sechs Nukleotide, wobei bevorzugterweise der Abschnitt Helix Al und der Abschnitt Helix A2 vollständig oder teilweise miteinander hybridisiert sind.
In einer fünfzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der achtundvierzigsten und neunundvierzigsten Ausführungsform ist, ist zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Helix Al und dem 5'-Ende des Abschnittes Box Al der HMGA bindenden Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz Na angeordnet, wobei N3 ein bis fünf Nukleotide umfasst. In einer einundfünfzigsten Ausfuhrungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungs- form der achtundvierzigsten, neunundvierzigsten und fünfzigsten Ausführungsform ist, ist zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Box A2 und dem 5 '-Ende des Abschnittes Helix A2 der HMGA bindenden Nukleinsäure in 5 '-3 '-Richtung eine Nukleotidsequenz GNe angeordnet, wobei Ne eins bis zwei Nukleotide, bevorzugterweise A oder UU umfasst.
In einer zweiundfünfzigsten Ausfuhrungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der achtundvierzigsten, neunundvierzigsten, fünfzigsten und einundfünfzigsten Ausführungsform ist, weisen der Abschnitt Helix Cl und der Abschnitt Helix C2 der HMGA bindenden Nukleinsäure jeweils einzeln und unabhängig voneinander eine Länge von fünf oder sechs Nukleotiden auf, wobei bevorzugterweise die Abschnitte Helix Cl und Helix C2 vollständig oder teilweise miteinander hybridisiert sind.
In einer dreiundfünfzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der zweiundfünfzigsten Ausführungsform ist, umfasst die HMGA bindende Nukleinsäure die folgende Struktur:
Helix_Al-Na-|Box AlJ-Nb-1HeIiX CH-N6-1HeIiX C2'-Nd-JBox Ä2|-G-Ne-Helix A2 (III)
wobei
N3 = ein bis fünf Nukleotide ist;
Nb = drei Nukleotide ist;
Nc = drei bis fünf Nukleotide ist;
Nd = zwei bis fünf Nukleotide ist; und
Ne = eins bis zwei Nukleotide, bevorzugterweise A oder UU ist;
der Abschnitt Box Al und der Abschnitt Box A2 jeweils einzeln und unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, die GGGCG, GGGUG und GGGAG umfasst,
die Abschnitte Helix Al und Helix A2 jeweils einzeln und unabhängig voneinander fünf oder sechs Nukleotide umfassen, und ^
die Abschnitte Helix Cl und Helix C2 jeweils fünf oder sechs Nukleotide umfasst, die bevorzugterweise vollständig oder teilweise miteinander hybridisiert sind.
In einer vierundfünfzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausfύhrungs- form der dreiundfünfzigsten Ausführungsform ist, umfasst die HMGA bindende Nukleinsäure eine Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend SEQ. ID. No. 8, SEQ. ID. No. 9, SEQ. ID. No. 10, SEQ. ID. No. 11, SEQ. ID. No. 14, SEQ. ED. No. 22 und SEQ. ID. No. 24.
In einer fünfundfünfzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der neununddreißigsten, vierzigsten, einundvierzigsten, zweiundvierzigsten, dreiundvierzigsten und vierundvierzigsten Ausführungsform ist, umfasst die Nukleinsäure einen Abschnitt Box Al und einen Abschnitt Helix Cl der HMGA bindenden Nukleinsäure, wobei zwischen dem 3'-Ende des Abschnittes Box Al und dem 5 '-Ende des Abschnittes Helix Cl ein Nukleotid A angeordnet ist.
In einer sechsundfünfzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der fünfundfünfzigsten Ausführungsforrn ist, umfasst die HMGA bindende Nukleinsäure einen Abschnitt Helix C2 und einen Abschnitt Box A2, wobei zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Helix C2 und dem 5 '-Ende des Abschnittes Box A2 ein Nukleotid G angeordnet ist.
In einer siebenundfünfzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der fünfundfünfzigsten oder sechsundfünfzigsten Ausführungsform ist, umfasst der zentrale Abschnitt Nc der HMGA bindenden Nukleinsäure vier Nukleotide, wobei Nc bevorzugterweise GAUG ist.
In einer achtundfünfzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der fünfundfünfzigsten, sechsundfünfzigsten und siebenundfünfzigsten Ausführungsform ist, umfasst die HMGA bindende Nukleinsäure einen Abschnitt Helix Bl und einen Abschnitt Helix B2.
In einer neunundfünfzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der achtundfünfzigsten Ausführungsform ist, umfassen die Abschnitte Helix Bl und Helix B2 der HMGA bindenden Nukleinsäure einzeln und unabhängig voneinander jeweils fünf Nukleotide, wobei bevorzugterweise der Abschnitt Helix Bl mit dem Abschnitt Helix B2 hybridisiert ist.
In einer sechzigsten Ausfuhrungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausfuhrungsform der achtundfunfzigsten oder neunundfünfzigsten Ausfuhrungsform ist, sind zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Helix Bl und dem 5 '-Ende des Abschnittes Box Al der HMGA bindenden Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz umfassend zwei Nukleotide Nj angeordnet, wobei Nj bevorzugterweise AG ist.
In einer einundsechzigsten Ausfuhrungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der achtundfünfzigsten, neunundfünfzigsten und sechzigsten Ausführungsform ist, ist zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Box A2 und dem 5 '-Ende von Helix B2 der HMGA bindenden Nukleinsäure ein Nukleotid G angeordnet.
In einer zweiundsechzigsten Ausfuhrungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausfuhrungsform der fünfundfünfzigsten, sechsundfünfzigsten, siebenundfünfzigsten, achtundfunfzigsten, neunundfünfzigsten, sechzigsten und einundsechzigsten Ausfuhrungsform ist, umfasst die HGMA bindende Nukleinsäure einen Abschnitt Helix Al und einen Abschnitt Helix A2.
In einer dreiundsechzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der zweiundsechzigsten Ausfuhrungsform ist, umfassen die Abschnitte Helix Al und Helix A2 der HMGA bindenden Nukleinsäure einzeln und unabhängig voneinander jeweils sechs Nukleotide und sind bevorzugterweise der Abschnitt Helix Al und der Abschnitt Helix A2 miteinander hybridisiert.
In einer vierundsechzigsten Ausfuhrungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausfuhrungsform der zweiundsechzigsten und dreiundsechzigsten Ausfuhrungsform ist, ist zwischen dem 3'- Ende des Abschnittes Helix Al und dem 5'-Ende des Abschnittes Helix Bl eine Nukleotidsequenz umfassend zwei Nukleotide Nj angeordnet, wobei Nj bevorzugterweise CA ist.
In einer fünfundsechzigsten Ausfuhrungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der zweiundsechzigsten, dreiundsechzigsten und vierundsechzigsten Ausfuhrungsform ist, ist zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Helix B2 und dem 5 '-Ende des Abschnittes Helix A2 ein Nukleotid A angeordnet. In einer sechsundsechzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausfuhrungsform der fünfundfünfzigsten bis fünfundsechzigsten Ausführungsform ist, umfassen die Abschnitte Helix Cl und Helix C2 jeweils drei Nukleotide, wobei bevorzugterweise die Abschnitte Helix Cl und Helix C2 miteinander hybridisiert sind.
In einer siebenundsechzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der sechsundsechzigsten Ausführungsform ist, umfasst die HMGA bindende Nukleinsäure die folgende Struktur:
He!ix_Ai-NrHelix
wobei
Nj = zwei Nukleotide umfasst, bevorzugterweise CA ist; Nj = zwei Nukleotide umfasst, bevorzugterweise AG ist; Nc = vier Nukleotide umfasst, bevorzugterweise GAUG ist;
die Abschnitte Box Al und Box A2 jeweils einzeln und unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend die Sequenzen GGGCG, GGGUG und GGGAG;
die Abschnitte Helix Al und Helix A2 jeweils einzeln und unabhängig sechs Nukleotide umfassen, die bevorzugterweise miteinander hybridisiert sind;
die Abschnitte Helix Bl und Helix B2 jeweils einzeln und unabhängig fünf Nukleotide umfassen, wobei bevorzugterweise der Abschnitt Helix Bl und der Abschnitt Helix B2 miteinander hybridisiert ist; und
die Abschnitte Helix Cl und Helix C2 jeweils einzeln und unabhängig drei Nukleotide umfassen, wobei bevorzugterweise die Abschnitte Helix Cl und Helix C2 miteinander hybridisiert sind. In einer achtundsechzigsten Ausfϊihrungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungs- form der siebenundsechzigsten Ausfuhrungsform ist, umfasst die HMGA bindende Nukleinsäure eine Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend SEQ. ID. No. 12.
In einer neunundsechzigsten Ausführungsform des siebten Aspekts, die auch eine Ausführungsform der zweiten bis siebenundsechzigsten Ausführungsform ist, ist die Nukleinsäure eine solche, die an Transkriptionsfaktoren bindet, insbesondere Transkriptionsfaktoren, die einen AT- Haken aufweisen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst in einem achten Aspekt durch eine Nukleinsäure , die an einen Transkriptionsfaktor umfassend einen AT-Haken bindet, wobei die Nukleinsäure einen Aufbau gemäß dem siebten Aspekt umfasst.
In einer Ausführungsform der Zusammensetzung nach dem sechsten Aspekt ist die L- Nukleinsäure eine Nukleinsäure nach dem siebten Aspekt.
In einer Ausführungsform der Verwendung nach dem ersten Aspekt ist die L-Nukleinsäure eine Nukleinsäure nach dem siebten Aspekt.
In einer Ausführungsform des Verfahrens nach dem zweiten Aspekt ist die L-Nukleinsäure eine Nukleinsäure nach dem siebten Aspekt.
In einer Ausfühnmgsform der Verwendung nach dem dritten Aspekt ist die L-Nukleinsäure eine Nukleinsäure nach dem siebten Aspekt.
In einer Ausführungsform des Verfahrens nach dem vierten Aspekt ist die L-Nukleinsäure eine Nukleinsäure nach dem siebten Aspekt.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst in einem neunten Aspekt durch ein Verfahren zum Screenen eines HMGA- Antagonisten oder HMGA-Agonisten umfassend die folgenden Schritte:
Bereitstellen eines Kandidaten-HMGA-Antagonisten und/oder eines Kandidaten- HMGA-Agonisten, Bereitstellen einer Nukleinsäure nach dem siebten Aspekt,
Bereitstellen eines Testsystems, welches ein Signal in Gegenwart eines HMGA- Antagonisten und/oder eines HMGA- Agonisten liefert, und
Bestimmen, ob der Kandidaten-HMGA-Antagonist ein HMGA-Antagonist ist und/oder ob der Kandidaten-HMGA-Agonist ein HMGA- Agonist ist.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst in einem zehnten Aspekt durch ein Verfahren zum Screenen eines HMGA-Agonisten und/oder eines HMGA-Antagonisten umfassend die folgenden Schritte:
Bereitstellen eines an einer Phase, bevorzugterweise einer Festphase, imobilisier- ten HMGA,
Bereitstellen einer Nukleinsäure gemäß dem siebten Aspekt, bevorzugterweise eine Nukleinsäure nach dem siebten Aspekt, die markiert ist,
Zugeben eines Kandidaten-HMGA-Agonisten und/oder eines Kandidaten- HMGA- Antagonisten, und
Bestimmen, ob der Kandidaten-HMGA-Agonist ein HMGA-Agonist ist und/oder ob der Kandidaten-HMGA-Antagonist ein HMGA-Antagonist ist.
In einer Ausführungsform des zehnten Aspekts ist vorgesehen, dass die Bestimmung so durchgeführt wird, dass getestet wird, ob die Nukleinsäure durch den Kandidaten-HMGA-Agonisten oder durch den Kandidaten-HMGA- Antagonisten ersetzt wird.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst in einem elften Aspekt durch einen Kit für den Nachweis von HMGA, umfassend eine Nukleinsäure nach dem siebten Aspekt.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst in einem zwölften Aspekt durch einen HMGA- Antagonisten, der durch ein Verfahren nach dem zehnten Aspekt erhältlich ist. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst in einem dreizehnten Aspekt durch einen HMGA- Agonisten, der durch ein Verfahren nach dem zehnten Aspekt erhältlich ist.
Erfmdungsgemäß wird die Aufgabe gelöst in einem vierzehnten Aspekt durch einen Komplex umfassend ein HMGA-Protein und eine Nukleinsäure nach dem siebten Aspekt.
Der vorliegenden Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass es entgegen der Auffassung im Stand der Technik möglich ist, L-Nukleinsäuren und insbesondere Spiegelmere zu verwenden, um intrazelluläre Zielmoleküle zu adressieren. Bei den intrazellulären Zielmolekülen handelt es sich bevorzugterweise um Zielmoleküle, die in einer Zelle vorliegen. Die den funktionalen L-Nukleinsäuren durch ihren Aufbau aus L-Nukleotiden inhärenten Eigenschaften wie hohe Spezifität der Wechselwirkung mit ihren Zielmolekülen bei gleichzeitig hoher Stabilität und Fehlen von toxischen oder immunologisch aktiven Abbauprodukten bei Anwendung derselben in biologischen Systemen und insbesondere im tierischen und menschlichen Körper erlaubt es nicht, die zellulären Mechanismen zu nutzen, um, wie im Falle der Intramere, L- Nukleinsäuren von einem Plasmid oder allgemein einem Vektor codieren zu lassen und damit die eigentlich funktionale Nukleinsäure durch den intrazellulär ablaufenden Prozess der Transkription bereitzustellen.
Dieses unentrinnbare Dilemma wird mit der vorliegenden Erfindung gelöst: Funktionale L- Nukleinsäuren und insbesondere Spiegelmere können unter Beibehaltung ihrer Spezifität was ihre Bindung an ihr Zielmolekül anbelangt, und ihrer Aktivität über eine Cytoplasmamembran transportiert werden. Diese Durchgängigkeit der funktionalen L-Nukleinsäuren ist den Spiegel- meren inhärent und kann durch die Verwendung von Abgabevehikeln oder Abgabetechniken noch verstärkt werden. Ohne im folgenden darauf festgelegt sein zu wollen, gehen die vorliegenden Erfinder davon aus, dass funktionale L-Nukleinsäuren an sich die Cytoplasmamembran ü- berwinden können, bzw. bei Beteiligung von endosomalen Transportmechanismen bei der Ü- berwindung der Cytoplasmamembran, diese aus den sich dabei ausbildenden Vesikelstrukturen unter Einnahme einer zwei- bzw. dreidimensionalen Struktur zu befreien in der Lage sind, die die spezifische Wechselwirkung der funktionalen Nukleinsäure mit ihrem Zielmolekül erlaubt. Mit der hierin gegebenen technischen Lehre wendet man sich bewusst von dem für Aptamere entwickelten Prinzip der Nutzung von intrazellulären Transkriptionsmechanismen zur Erzeugung von Aptameren in der Zelle ab und stellt erstmalig Mittel für die Anwendung von funktionalen L-Nukleinsäuren und insbesondere von Spiegelmeren in Zellen bereit. Wie hierin in einer bevorzugten Ausfuhrungsform verwendet, bezeichnet der Begriff der funktionalen Nukleinsäuren solche Nukleinsäuren, die verschieden sind von strukturellen, insbesondere natürlich vorkommenden strukturellen Nukleinsäuren wie rRNAs oder von codierenden Nukleinsäuren wie mRNAs. Insbesondere sind funktionale Nukleinsäuren Nukleinsäuren, die aufgrund ihrer zwei- und/oder dreidimensionalen Struktur in der Lage sind, an Zielmoleküle zu binden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bindung an das Zielmolekül nicht durch Hybridisierung oder Basenpaarung auf der Grundlage von Watson-Crick- Basenpaarungen oder einer Hoogsteen-Basenpaarung. Besonders bevorzugte funktionale Nukleinsäuren sind Aptamere und Spiegelmere.
Eine L-Nukleinsäure ist in einer bevorzugten Ausführungsform eine Nukleinsäure, die vollständig, im wesentlichen oder teilweise aus L-Nukleotiden aufgebaut ist. Besonders bevorzugt ist, wenn die L-Nukleinsäure vollständig aus L-Nukleotiden besteht. Der Begriff „im wesentlichen" bezeichnet dabei eine Ausführungsforrn, bei der derjenige Teil der L-Nukleinsäure, der für die Wechselwirkung mit dem Zielmolekül verantwortlich ist bzw. derjenige Teil, der die Bindung an das Zielmolekül vermittelt, aus L-Nukleotiden besteht oder aus diesen aufgebaut ist.
Wie hierin verwendet ist eine funktionale L-Nukleinsäure eine funktionale Nukleinsäure, die vollständig, im wesentlichen oder teilweise aus L-Nukleotiden aufgebaut ist.
Die Synthese von L-Nukleinsäuren ist den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und beispielsweise beschrieben in Nolte et al., Nat. Biotech, 14, 1116-1119, 1996.; und Klussmann et al, Nat. Biotechnol, 14, 1112-1115, 1996.
Das grundsätzliche Verfahren zur Erzeugung von Aptameren ist beispielsweise beschrieben in Tuerck et al. Science, 248, 505-510, 1990; oder Ellington et al. Nature, 346, 818-822, 1990, das grundsätzliche Verfahren zur Erzeugung von Spiegelmeren ist beispielsweise beschrieben in Nolte et al., Nat. Biotech, 14, 1116-1119, 1996.; oder Klussmann et al., Nat. Biotechnol, 14, 1112-1115, 1996 Spielgelmere sind somit Aptamere, die aus L-Nukleotiden statt aus D- Nukleotiden bestehen. Im Zusammenhang mit der Erzeugung von Aptameren bzw. Spiegelmeren bezeichnet der Begriff Zielmolekül dasjenige Molekül, das im Selektionsprozess zur Erzeugung der Aptamere bzw. Spiegelmere verwendet wird bzw. dasjenige Molekül, das letztlich durch das Aptamer bzw. das Spiegeimer gebunden wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein intrazellulär aktives Agens eine chemische Verbindung, die in einer Zelle an ein Molekül zu binden in der Lage ist. Dabei ist besonders bevorzugt, wenn die Zelle eine Zelle ist, die isoliert in einem Gewebe oder einem Organ vorliegt, aber bevorzugtererweise nicht in einem menschlichen oder tierischen Körper. Ist das intrazellulär aktive Agens ein Spiegeimer, so ist es bevorzugterweise dann ein intrazellulär aktives Agens, wenn es in der Lage ist, an ein intrazelluläres Zielmolekül zu binden. Alternativ ist das Spiegeimer dann ein intrazellulär aktives Agens, wenn es in der Lage ist, an sein Zielmolekül unter Bedingungen zu binden, wie sie in einer Zelle vorliegen. Tests, um diese Eigenschaften zu bestimmen, sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und umfassen z.B. Gleichgewichtsanbindung- sassays unter Pufferbedingungen, wie sie intrazellulär vorliegen (Ionenstärke und Solutzusam- mensetzung, pH, Temperatur) wie in Beispiel 1 offenbart.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Zielmolekül der L-Nukleinsäure, insbesondere der funktionalen L-Nukleinsäure ein intrazellulärer Rezeptor. Ein intrazellulärer Rezeptor, wie hierin verwendet, ist bevorzugterweise eine chemische Verbindung oder eine chemische Struktur oder jeweils ein Teil davon, mit der/dem die funktionale L-Nukleinsäure in Wechselwirkung tritt und bevorzugterweise eine solche, an die die funktionale L-Nukleinsäure bindet, wobei der intrazelluläre Rezeptor, d.h. die chemische Verbindung oder die chemische Struktur oder jeweils ein Teil davon, intrazellulär, d. h. in einer Zelle vorliegt, wie sie bevorzugt in dem vorstehenden Absatz beschrieben ist, vorliegt. Dabei ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass der intrazelluläre Rezeptor das Zielmolekül bei der Erzeugung der funktionalen Nukleinsäure, insbesondere der funktionalen L-Nukleinsäure, ist.
In einer Ausführungsform bezeichnet der Begriff des Rezeptors einen jeglichen Wechselwirkungspartner, bevorzugterweise einen spezifisch bindenden Wechselwirkungspartner der funktionalen Nukleinsäure, d.h. einen mit der funktionalen Nukleinsäure interagierenden Wechselwir- kungspartner, der eine bestimmte räumliche Struktur, Ladungsverteilung, Hydrophobizitätsver- teilung etc. aufweisen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform entspricht der Wechselwirkungspartner dem Zielmolekül der funktionalen Nukleinsäure, wie es bei der Erzeugung der funktionalen Nukleinsäure verwendet wurde. Dabei ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass ein Rezeptor auch von dem bei der Erzeugung der funktionalen Nukleinsäure verwendeten Zielmolekül verschieden sein kann, jedoch die spezifische Wechselwirkung durch eine Kreuzreaktivität der funktionalen Nukleinsäure zwischen dem Wechselwirkungspartner und dem bei der Erzeugung der funktionalen Nukleinsäure verwendeten Zielmolekül bedingt wird.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform bezeichnet der Begriff „intrazellulärer Rezeptor" einen Rezeptor, der in einer Zelle vorliegt, oder einen Rezeptor, der in einer Zelle vorliegen kann, unter natürlichen Umständen in einer Zelle vorkommt oder unter solchen in einer Zelle vorhanden ist. Dabei ist besonders bevorzugt, wenn die Zelle eine Zelle ist, die isoliert in einem Gewebe oder einem Organ vorliegt, aber bevorzugtererweise nicht in einem menschlichen oder tierischen Körper. Wie hierin verwendet bezeichnet das Begriff „intrazellulärer Rezeptor" aber auch einen Rezeptor, der unter Bedingungen vorliegt, wie sie in einer Zelle vorliegen.
In einer bevorzugten Ausführungsform bezeichnet der Begriff der Zelle eine Zelle, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die prokaryotische und eukaryotische Zellen umfasst. Bevorzugterweise ist die eukaryotische Zelle ausgewählt aus der Gruppe, die Pilzzellen, pflanzliche Zellen, tierische Zellen und menschliche Zellen umfasst. In einer alternativen Ausfuhrungsform bezeichnet der Begriff der Zelle hierin allgemein ein durch eine Phospholipiddoppelmembran, die in einer bevorzugten Ausfuhrungsform einer Cytoplasmamembran entspricht, begrenztes Kompartiment, das durch die Membran von der Umgebung abgetrennt ist. Die Abtrennung von der Umgebung ist dabei nicht eine vollständige Abtrennung, sondern erlaubt einen Energieaustausch und einen Stoffaustausch zwischen der Zelle und der Umgebung. Bevorzugterweise ist der Stoffaustausch beschränkt. Die Beschränkung des Stoffaustausches wird im Falle der Abgrenzung der Zelle gegenüber der Umgebung durch eine Cytoplasmamembran oder durch eine einer Cytoplasmamembran ähnlichen Membran durch die Transporteigenschaften der Membran definiert. In einer Ausfuhrungsform umfasst der Begriff der Zelle hierin somit auch Vesikel und/oder Komparti- mente von einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen wie hierin definiert, die sowohl wiederum innerhalb einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle als auch ausserhalb einer derartigen prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle vorliegen oder vorliegen können, beispielsweise als Vesikel oder von einer Cytoplasmamembran umgebene Teile einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle, die in einer Ausführungsform in einer Körperflüssigkeit vorliegen kann. In einer bevorzugten Ausführungsform ist in einer Zelle gemäß der zweiten alternativen Ausfuhrungsform vorgesehen, dass die Bedingungen innerhalb einer solchen Zelle im wesentlichen jenen entsprechen, wie sie in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle vorliegen, insbesondere hinischtlich der Faktoren, die die Bindung der funktionalen Nukleinsäure an ihr Zielmolekül beeinflussen. In einer Bevorzugten Ausführungsform ist die Körperflüssigkeit aus der Gruppe ausgewählt, die Blut, Urin, Liquor, Lymphflüssigkeit, Serum, Plasma, Vaginalsekret, Speichel und Sperma um- fasst.
In einer Ausführungsform ist der Rezeptor über seine Funktion in einer Zelle definiert. Entsprechend kann der Rezeptor aus der Gruppe ausgewählt sein, die molekulare Rezeptoren, Enzyme, Stoffwechselintermediate, Signalpeptide, Chaperon-Moleküle und intrazelluläre Strukturen wie beispielsweise Ribosomen, Mitochondrien, Elemente des Zytoskeletts wie z.B. Tubulin- und Aktinfilamente, endosomale Partikel, Lysosomen, sonstige intrazelluläre Strukturen wie Vesikel, insbesondere intrazelluläre Vesikel umfasst. Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff des molekularen Rezeptors in einer bevorzugten Ausführungsform ein Molekül, welches Informationen) aufnimmt und innerhalb einer Zelle, einem Gewebe, einem Organ oder einem Organismus weiterleitet. Die Information wird typischerweise durch ein Molekül vermittelt, das mit dem molekularen Rezeptor in Wechselwirkung tritt. Infolge der Wechselwirkung ist der molekulare Rezeptor in der Lage, ein Signal zu erzeugen. Ein derartiges Signal kann in der Änderung der Konformation und/oder der Aktivität des Rezeptors begründet sein oder sich darin manifestieren. Das Signal selbst ist in der Lage, die aufgenommene oder von ihm dargestellte Information in einer anderen Form weiterzuleiten. Infolge der Änderung der Konformation bzw. der Aktivität des molekularen Rezeptors kann das Signal bevorzugterweise ein chemisches, biochemisches oder ein elektrisches Signal sein. Bevorzugterweise ist der molekulare Rezeptor Teil einer Reaktionskaskade, noch bevorzugtererweise einer Signalkaskade. Die von einem molekularen Rezeptor übertragene Information kann eine quantitative und/oder eine qualitative Information sein, beispielsweise betreffend die Anwesenheit einer Verbindung und/oder deren Konzentration.
In einer bevorzugten Ausführungsform bezeichnet der Begriff der Stoffwechselintermediate all jene Verbindungen, die durch metabolische Aktivitäten in einer Zelle als Bestandteile des Kata- bolismus ebenso wie des Anabolismus auftreten.
In einer weiteren Ausführungsform ist der Rezeptor über seine chemische Natur definiert. Bevorzugterweise ist der Rezeptor aus der Gruppe ausgewählt, die Polypeptide, Kohlenhydrate, Nukleinsäure, Lipide und Kombinationen davon umfasst. Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff Polypeptid bevorzugterweise ein jegliches Polymer aus zwei oder mehr Aminosäuren. Bevorzugterweise handelt es sich bei den Aminosäuren um L-Aminosäuren, wobei jedoch auch D-Aminosäuren im Rahmen der Ausführungsform verwendet werden können. Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff Nukleinsäuren bevorzugterweise ein Polymer aus zwei oder mehreren Nukleotiden oder Nukleotidanaloga, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, wobei es sich um entweder D-Nukleotide oder um L-Nukleotide oder Mischungen davon handelt. Bevorzugte Kombinationen umfassen glykosilierte Polypeptide und glykosilierte Lipide
Eine besondere Gruppe von intrazellulären Rezeptoren sind Transkriptionsfaktoren und DNA- bindende Proteine, die an einen AT-Haken binden. Beispielhafte Transkriptionsfaktoren sind in der folgenden Tabelle 1 angebeben:
Tabelle 1 : Transkriptionsfaktoren
gamma )OBP ALF AP-2alphaA
(STAT5A)4 ALL-1 AP-2alphaB
120-kDa CRE- alpha-CBF AP-2beta
Bindungsprotein alpha-CP2b AP-2gamma
14-3-3 epsilon alphaHO AP-2rep
14-3-3 zeta alphaH2-alphaH3 AP-3 (1 )
50-55K Protein ALX3 AP-3 (2)
53BP1 Alx-4 AP-4
70-75K Protein aMEF-2 AP-5
80-90K Protein AML1 APC
AAF AMLIa AR
ABF-1 AMLI b Amt
AD A2 AMLIc Amt (774 AA Form)
ADA3 AMLI DeltaN ARNT2
ADA-N F 1 AML2 ASC-2
AFP1 AML3 ASPP1
AhR AML3a ASPP2
AhR:Arnt AML3b ATBF 1 -A
AIIN3 AMY-1L ATBF 1 -B
Aiolos A-Myb ATF
AIRE ANF ATF-1
AKNA AP-1 ATF2 ATF-2 BRCA1 cdk2
ATF-2:c-Jun BRCA2 cdk9
ATF3 BRG1 Cdx- 1
ATF3 deltaZIP BRIP1 CDX2
ATF4 Brm Cdx-4
ATF5 BTEB 1 c-Ets- 1
ATF6 BTEB2 c-Ets-2
ATF-a BTEB3 CFF
ATF-adelta BTEB4 c-Fos
ATOH 1 B-TFIID ChCh
ATPF 1 C/EBPalpha CHOP-10
Bachi C/EBPbeta Chx10
BacMt C/EBPdelta CIITA
Bach2 C/EBPepsilon c-J u n
B AF 155 C/EBPgamma c-Jun:JunD
BAF47 CA150 CLIM1
BAF53a c-abl CLIM2
BAF60A CACCC-Bindungsfaktor CLOCK
BarhM CAR c-Myb
Barhl2 CAR:RXR-alpha c-Myc
Band Cart-1 C-Myc 1
Barx2 CBAF c-Myc:Max
Bcl-3 CBF (4) CNBP
BCL-6 CBF (5) CoS beta-catenin CBP COUP-TF1
Bin1 CCAAT- COUP-TF2
BMAL2 Bindungsfaktor CP1A
B-Myb CCF CP1C
BNC CCG1 CP2
BP1 CCK-Ia CPBP
BP2 CCK-I b CPE Bindungsprotein
BR140 CD28RC CREB
Brachyury Cdc5 CRE-BPa c-Rel DBP DPBF c-Rel:RelA DbpA DRIL1
CREMalpha DbpAv DSIF
CREST DbpB DSIF-p14
CRF DCoHm DSIF-p160
Crx DDB DTF
CSA DDB-1 DUX1
CSB DDB-2 DUX2
CSBP-1 DEC1 DUX3
CSEN DEC2 DUX4 c-S ki DEF E
CtBPI deltaCREB E12
CtBP2 deltaFosB E2F
CTCF deltaMax E2F+E4
CTF DeltaN p63beta E2F+p107
CTF-1 DeltaN p73alpha E2F-1
CTF-2 DeltaN p73beta E2F-1 :DP-1
CTF-3 DeltaN p73gamma E2F-1 :DP-2
CTF-5 DeltaNp63alpha E2F-2
CTF-7 DeltaNp63gamma E2F-3a
CUP Dermo-1 E2F-4
CUTL1 DF-1 E2F-4:DP-1
CUTL2 DF-2 E2F-4:DP-2
Cx DF-3 E2F-5 cyclin A Dlx-1 E2F-6 cyclin T1 Dlx-2 E2F-7 cyclin T2 Dlx-3 E47 cyclin T2a Dlx-4 (lange Isoform) E4BP4 cyclin T2b Dlx-4 (kurze Isoform) E4F
DAP Dlx-5 E4F1
DAX1 Dlx-6 E4TF2
DB 1 DP-1 E7; HPV-16, Papilloma
DBF4 DP-2 Virus Typ 16 EAR2 ER-beta2 FAC 1
EBF ER-beta3 factor 2
EBP-80 ER-beta4 FBP
EC2 ER-beta5 f-EBP
EF1 ERF FEV
EgM Erg-1 Fgf3
Egr-2 Erg-2 FKBP59
Egr-3 ERM FKHL18
Egr-4 ERR1 FKHRL1P2
EIIaE-A ERR2 FKLF
EIIaE-B ERR3 FIM
EllaE-Calpha ERR3-1 FosB
EllaE-Cbeta ERR3-2 FOXB1
EivF ERR3-3 FOXC1
EKLF ERRalphal FOXC2
ELF-1 ESE-1 FOXD1
ELFR ESE-Ia FOXD2 elios ESE-I b FOXD3
Elk-1 ESE-2 FOXD4
Emx-1 ESE-2a FOXE1
Emx-2 ESE-2b FOXE3
En-1 ESE-3 FOXF1
En-2 ESE-3a FOXF2
ENH-Bindungsprotein ESE-3b FOXGIa
ENKTF-1 ESXR1 FOXGI b
EP400 ETF FOXG 1c
EPAS1 Ets-1 deltaVIl FOXH 1
Epicardin EvM FOXH epsilonFI EVX1 FOXJIa
ER-alpha EZF-2 FOXJIb
ER-alpha:ER-beta EZH 1 FOXJ2 (lange Isoform)
ER-beta EZH2 FOXJ2 (kurze Isoform)
ER-beta1 F2F FOXJ3 F0XK1 GAAP-1 GRF-1
F0XK2a GABP G sc
F0XK2b GABP-alpha Gscl
F0XK2c GABPB GT-IC
F0XL1 GABP-beta1 GT-IIA
F0XL2 GABP-beta2 GT-IIBalpha
FOXMIa GAF GT-IIBbeta
FOXMIb gammaCAAT H1TF1
FOXM 1c gammaCACI H1TF2
FOXN 1 gammaCAC2 H1TF2A
FOXN2 GATA-1 H4TF-1
FOXN3 GATA-2 H4TF-2
FOXOIa GATA-3 HAF
FOXOIb GATA-4 HAND1
FOXO2 GATA-5 HAND2
FOXO3a GATA-6 HB9
FOXO3b Gbx1 HDAC1
FOXO4 Gbx2 HDAC2
FOXP1 GCF HDAC3
FOXP2 GCMa HDAC4
FOXP3 GCN5 HDAC5
FOXP4 GCNF-1 hDaxx
Fra-1 GCNF-2 HDBP1
Fra-2 GF1 HDBP2
FTF GKLF Hitze-induzierter Faktor
FTS - ~ "~ ^ GLM HEB
FXR GLI2 HEB1-p67
FXR:RXR-alpha GLI3 HEB1-p94
FXR-alpha GLIS2 HEF-1B
FXR-beta1 GMEB-1 HEF-1T
FXR-beta2 GR HEF-4C
G factor GR-alpha HEN1
G6 factor GR-beta HEN2 HES-1 HNF-1alpha-A H0XA9B
HES-2 HNF-1alpha-B H0XB1
Hesxi HNF-1alpha-C H0XB13
Hex HNF-1beta-A H0XB2
Hey1 HNF-1 beta-B H0XB3
Hey2 HNF-1 beta-C H0XB4
HeyL HNF-3 H0XB5
HFH-1 HNF-3alpha H0XB6
HIC-1 HNF-3beta H0XB7
Hic-5 HNF-3gamma H0XB8
HIF-1 HNF-4 H0XB9
HIF-1 alpha HNF-4alpha HOXC10
HiNF-A HNF-4alpha1 H0XC11
HiNF-B HNF-4alpha2 H0XC12
HiNF-C HNF-4alpha3 H0XC13
HiNF-D HNF-4alpha4 H0XC4
HiNF-D3 HNF-4alpha7 H0XC5
HiNF-E HNF-4gamma H0XC6
HiNF-P HNF-6alpha H0XC8
HIP1 hnRNP K H0XC9
HIV-EP2 H0X11 HOXD10
HIf H0XA1 H0XD11
HLTF HOXA10 H0XD12
HLTF (Met123) HOXA10 PL2 H0XD13
HLX H0XA11 H0XD3
HMBP H0XA13 H0XD4
HMG I H0XA2 H0XD8
HMG I(Y) H0XA3 H0XD9
HMG Y H0XA4 Hp55
HMGB1 HOXA5 Hp65
HMGB2 H0XA6 HPX42B
HMGI-C H0XA7 HrpF
HMX1 HOXA9A HSBP1 HSF IL-6 RE-BP JunB
HSF1 (lang) II-6 RF JunB:Fra-1
HSF1 (kurz) ING1 JunB:Fra-2
HSF2 INGI b JunD
HSF4a INSAF JunD:Fra-2
HSF4b IPCS-BF kappaY FaKtor
HSF4c IPF1 KBP-1 hsp56 IPF1 :Pbx KER1
Hsp90 IRF-1 KER-1
IA-1 IRF-1 :C/EBPbeta KLF 15 iASPP IRF-2 KLF7 iASPP-RAI IRF-3 Kox1
IB1 IRF-4 KR3
IBP-1 IRF-5 KRF-1
ICER-II IRF-6 KRN
ICER-Ilgamma IRF-7A KSR-1
Id1 IRF-7B Ku Autoantigen
IdI H IRF-7H Ku70
Id2 IRF-8 Ku80
Id3 IRF-9 KUP
Id3 / Heir-1 irIB LAF-4
IF1 IRX-1 LANA; KSHV, Kaposi's
IFI-16 IRX2a sarcoma-associated lgPE-1 lrx-3 herpesvirus ( herpesvi- lgPE-2 lrx-4 rus δ) lgPE-3 ISGF-1 LBP-1 lk-1 ISGF-3 LBP-Ia
IkappaB ISGF-3alpha LBP-Id
IkappaB-alpha lsl-1 alpha LBP-32
IkappaB-beta ITF LBP-9
IkappaBR ITF-1 LBX1
11-1 RF ITF-2 LCR-F 1
IL-10E1 JRF LEF-1 LEF-1B MafG:MafG Meis-2c
LF-A1 MafK Meis-2d
LHX1 MAML1 Meis-2e
LHX2 MASH-1 Meis-3
LHX3a Max Mel-18
LHX3b Maxi Meoxi
LHX5 Max2 Meoxia
LHX6.1a MAZ Meox2
LHX6.1b MAZi MHox (K-2)
LIT-1 MAZR MIF-1
LITAF MBF1 MITF
LKLF MBF2 MIXL1
Lmo1 MBF3 Miz-1
Lmo2 MBP-1 (1) MLX
LM03 MBP-1 (2) MM-1
LMX1A MBP-2 MondoA
LMX1 B MDBP MOP3
L-Myc-1 (lange Form) MECP-2 MR
L-Myc-1 (kurze Form) MEF-2A MRF-2
L-Myc-2 MEF-2B1 Msx-1
LUN-1 MEF-2C Msx-2
LUN-2 MEF-2C/delta32 MTA1-L1
LXR-alpha MEF-2C/delta8 MTB-Zf
LXR-alpha:RXR-alpha MEF-2C/delta8,32 MTF-1
LXR-beta MEF-2D00 mtTFA
LXR-beta:RXR-alpha MEF-2D0B Mxi1
Lyl-1 MEF-2DA0 Myf-3
M factor MEF-2DAO Myf-4
Mad1 MEF-2DAB Myf-5
Maf MEF-2DA'B Myf-6
MafB Meis-1 Myocardin, Splice Form
MafF Meis-2a 1
MafG Meis-2b MyoD MyoD:E12 NFbetaA NF-kappaE3
MyT1 NF-CLEOa NF-MHCIIA
MZF-1 NF-CLEOb NF-MHCIIB
NC1 NFdeltaE3A NF-muE1
NC2 NFdeltaE3B NF-muE2
NC0R1 NFdeltaE3C NF-muE3
NC0R2 NFdeltaE4A NF-S
NCX NFdeltaE4B NF-X
NELF NFdeltaE4C NF-X1
NERF NFe NF-X2
NERF-Ia NF-E NF-X3
NERF-Ib NF-E2 NF-Xc
NERF-2 NF-E2 p45 NF-Y
Net NF-E3 NF-YA
NeuroDI NFE-6 NF-Zc
NEUROD-2 NF-GMa NF-Zz
NEUROD-3 NF-GMb NGN3
NF Ill-a NFI/CTF NHP-1
NF Ill-c NFIA NHP-2
NF Ill-e NFIB NHP3
NF-1 NF-IL-2A NHP4
NF-4FA NF-IL-2B Nkx2-1
NF-4FB NFIX Nkx2-2
NF-4FC NF-jun Nkx2-3
NF-AB NF-kappaB Nkx2-5
NF-AT1 NF-kappaB(-ähnlich) Nkx2-8
NF-AT1 NF-kappaB1 Nkx3-1
NF-AT2 NF-kappaB1 Vorläufer Nkx3-1 vi
NF-AT2-alpha NF-kappaB2 Nkx3-1 v2
NF-AT2-beta NF-kappaB2 (p49) Nkx3-1 v3
NF-AT3 NF-kappaB2 Vorläufer Nkx3-1 v4
NF-AT4 NF-kappaE1 Nkx3-2
NF-AT5 NF-kappaE2 Nkx6-1 Nkx6-2 OCA-B p65delta
Nmi Octa-factόr p73
N-Myc Octamer- p73alpha
N-Oct-2alpha Bindungsfaktor p73beta
N-Oct-2beta Oct-B1 p73delta
N-Oct-4 oct-B2 p73epsilon
N0R1 oct-B3 p73eta
N0R1/MIN0R OLIG2 p73gamma
NPA3 Oligol p73kappa
NPAS 1 Otx1 p73zeta
NPAS2 Otx2 Pax-1
NP-TCII Otx3 Pax-2
NRF OZF Pax-3
Nrf1 p107 Pax-3A
NRF-1 p130 Pax-3B
Nrf1 :MafG p160MBP Pax-4a
Nrf1 :MafK p28 Modulator Pax-5
Nrf2 p300 Pax-6
Nrf2:MafG p38erg Pax-6 / Pd-5a
Nrf2:MafK p40x; HTLV-I, T-ZeII Pax-7
NRF-2beta1 Lymphotropischer Virus Pax-8
NRF-2gamma1 Typ I Pax-8a
Nrf3 p45 Pax-8b
Nrf3:MafK p49erg Pax-8c
NRL p50:c-Rel Pax-8d
NRSF p53 Pax-8e
NRSF Form 1 p55 Pax-8f
NRSF Form 2 p55erg Pax-9
NTF p63 Pbx
Nur77 p63alpha Pbx1
NURR1 p63beta Pbx1:HoxB1
OAZ p63delta Pbx1:HoxB2
OC-2 p63gamma Pbx1 :HoxB3 Pbx1 :HoxB4 PEA3 POU2F3, Isoform d1
Pbx1 :HoxB5 PEBP2alpha POU2F3, Isoform d2
Pbx1 :HoxB6 PEBP2beta POU3F1
Pbx1 :HoxB8 PGC-1 POU3F2
Pbx1 :PKN0X1 PITX1 POU3F2 (N-Oct-5a)
Pbx1 :Tcl3 PITX2 POU3F2 (N-Oct-5b)
Pbxia PITX2A POU3F3
Pbx1A:HoxA5 PITX2A: Nkx2.5 POU3F4
Pbx1 a:Hoxb7 PITX2B POU4F1(I)
Pbx1a:Hoxb8 PITX2B:Nkx2.5 POU4F1(s)
Pbx1 a:Hoxc6 PITX2C POU4F2
Pbx1A:HoxC8 PITX2C:Nkx2.5 POU4F3
Pbx1A:HoxD4 PITX3 POU5F1
Pbx1 a:IPF1 PKN0X1 POU5F1A
Pbxi b PKN0X2 POU5F1B
Pbx1 B:HoxA5 PLAGL1 POU5F1C
Pbx1 B:HoxB7 PLAGL2 POU6F1
Pbx1B:HoxB8 PLZF PPAR-alpha
Pbx1 B:HoxC8 PML PPAR-alpha:RXR-
Pbx1 B:HoxD4 PML-3 alpha
Pbx1 b:PKN0X1 Pmx2a PPAR-beta
Pbx2 Pmx2b PPAR-gamma1
Pbx2:HoxB8 PNR PPAR-gamma2
Pbx2:Hoxc6 PO-B PPAR-gamma3
Pbx2:PKN0X1 Pontin52 PPAR-gamma4
Pbx3a POU1F1 PPUR
Pbx3a:Hoxc6 POU2F1 PR
Pbx3b POU2F2 PR A
PC2 POU2F2 (Oct-2.1) PR B
PC4 POU2F2B pRb
PC5 POU2F2C PRDI-BF1
PCAF POU2F3 PRDI-BFc
PDEF POU2F3, Isoform a Preb Prop-1 RAR-gamma RREB-1
PR0X1 RAR-gamma:RXR- RSRFC4
PSE1 alpha RSRFC9
P-TEFb RAR-gamma1 RVF
PTF Rb:E2F-1 :DP-1 RX
PTFalpha RBP60 RXR-alpha
PTFbeta RBP-Jkappa RXR-beta
PTFdelta Ref-1 RXR-gamma
PTFgamma ReIA SAP-Ia
Pu box Bindungsfaktor ReIB SAP-Ib
Pu box Bindungsfaktor REVERB-alpha SF-1
(BJA-B) REVERB-beta SHOX2a
PU.1 RFX1 SHOX2b
PuF RFX1:RFX2 SHOXa
Pur factor RFX1.RFX3 SHOXb pX; HBV, Hepatitis B RFX2 SHP
Virus RFX3 SIII-P110
PXR-1 RFX4 Slll-p15
PXR-1 :RXR-alpha RFX5 Slll-p18
PXR-1 :RXR-beta RFX5: RFXAP: RFXANK SIM1
PXR-2 RFXANK SIM2
R1 RFXAP SIP1
R2 RFX-B-delta5 Six-1
RAR-alpha RF-Y Six-2
RAR-alpha:RXR-alpha RORalphal Six-3
RAR-alpha: RXR-beta RORalpha2 Six-4
RAR-alpha:RXR- RORalpha3 Six-5 gamma RORbeta Six-6
RAR-alpha1 RORgamma SKIP
RAR-alpha2 Rox SLUG
RAR-beta RP58 Smadi
RAR-beta:RXR-alpha RPF1 Smad2
RAR-beta2 RPGalpha Smad2 (437 AmiSox8 STAT6 nosäuren) Sox9 SXR
Smad3 Sp1 SXR:RXR-alpha
Smad3:Smad4 Sp2 SYT
Smad4 Sp3 T3R-alpha
Smad4delta3 Sp4 T3R-alpha:RXR-alpha
Smad4delta4 Spi-B T3R-alpha1
Smad4delta4-6 SPT16 T3R-alpha2
Smad4delta4-7 SRC-1 T3R-beta1
Smad4delta5-6 SRC-3 T3R-beta2
Smad4delta6 SRCAP TAF(I)HO
Smad5 SREBP-Ia TAF(I)48
Smad6 SREBP-Ib TAF(I )63
Smad7 SREBP-Ic TAF(II)IOO
Smadδ SREBP-2 TAF(II)125
SMIF SRE-ZBP TAF(II)135
Sna SRF TAF(11)170
SnoN SRF:SRF TAF(11)18
Sox1 SRY TAF(I I )20
Sox10 SSRP1 TAF(ll)250
Sox11 Staf-50 TAF(ll)250Delta
Sox12 STAT1 TAF(II)28
Sox13 STAT1 :STAT1 TAF(I I )30
Sox14 STAT1 :STAT3 TAF(II)31
Sox17 STAT1 alpha TAF(II)55
Sox18 STATI beta TAF(ll)70-alpha
Sox2 STAT2 TAF(ll)70-beta
Sox20 STAT3 TAF(ll)70-gamma
Sox21 STAT3:STAT3 TAF-I
Sox3 STAT4 TAF-II
Sox4 STAT5A TAF-L
Sox5 STAT5B TaM
Sox7 STAT5B:STAT5B TaMbeta Tal-2 TCF-1D TFIID
TAR factor TCF-1 E TFIIE tat; HIV-1 , Immunode- TCF-1F TFIIE-alpha fizienz Virus Typ 1 TCF-1G TFIIE-beta
Tax; HTLV-I, T-ZeII TCF-2alpha TFIIF
Lymphotropisches ViTCF-3 TFIIF-alpha rus Typ I TCF-4 TFIIF-beta
T-bet TCF-4(K) TFIIH
TBP TCF-4B TFIIH*
Tbr-1 TCF-4E TFIIH-CAK
TBR2 TEF TFIIH-cyclin H
TBX18 TEF-1 TFIIH-MAT1
TBX19 TEF-2 TFIIH-MO15
TBX1A TEF-3 TFIIH-p34
TBX1B TEF-5 TFIIH-p44
TBX2 TEL1 TFIIH-p62
TBX20 Tel-2a TFIIH-pβO
Tbx22 Tel-2b TFIIH-p80:CAK
TBX3 (722 AmiTel-2c TFIIH-p90 nosäuren) Tel-2d TFII-I
TBX3 (742 AmiTel-2e TFIIIA nosäuren) Tel-2f Tf-LFI
TBX4 TFE3 Tf-LF2
TBX5 (lange Isoform) TFEB TFP-95
TBX5 (kurze Isoform) TFEB-A TGIF
Tbx5:Nkx2.5 TFEC TGIF2
TBX6 TFIIA TGT3
TCF TFI I A-alpha/beta VorTIEG-1
TCF-1 läufer (Hauptform) TIFIa
TCF17 TFIIA-alpha/beta VorTIFIg
TCF-1A läufer (Nebenform) Tl F2
TCF-1B TFIIA-gamma TLE 1
TCF-1C TFIIB TLX TLX3 Vav ZER6 p52
TMF Vax-2 ZER6 p71
TR2-11 VDR ZF1
TR2-5 VITF; Vacciniavirus/, ZF2
TR2-9 Homo sapiens ZFP-37
TR4 Vpr; HIV-1 , Immunode- ZFX
TRAP fizienz Virus Typ 1 ZFY
TREB-1 WBSCR14 ZHX1
TREB-2 WSTF ZIC2
TREB-3 WT1 ZID
TREF1 WT1 I ZNF11a
TREF2 WT1 I -KTS ZNF124
TRF (2) WT1 l-del2 ZNF133
TRRAP WT1 -KTS ZNF143
TWIST WT1-del2 ZNF174
TxRE BP XBP-1 ZNF-20
TxREF XW,V ZNF-24
UBF YAF2 ZNF33a
UBP-1 YB-1 ZNF35
UEF-1 YEBP ZNF43
UEF-2 YL-1 ZNF44
UEF-3 YY1 ZNF45
UEF-4 ZAC ZN F7
USF1 ZBP89 ZNF76
USF1 :USF2 ZBP99 ZNF83
USF2 ZEB (1124 AA) ZNF85
USF2b ZEB (1154 AA)
Eine weitere Gruppe von intrazellulären Rezeptoren sind die in der nachfolgenden Tabelle 2 dargestellten intrazellulären Zielmoleküle. Tabelle 2: Intrazelluläre Zielmoleküle
"long-chain"-Fettsäuren- Acetyl-CoA-Malat-Citrat- Amyloid- Vorläuferprotein
CoA-Ligase Synthase Ankarin
"major basic"-Protein Acetylglucosaminyl- Arginase
"mixed function"- Transferase Argininosuccinate-
Oxygenase Acetylspermin- Synthetase
11/3-Hydroxylase (EC Deacetylase Argininosuccinat-Lyase
1.14.15.4) Acetyltransacylase Aromatase
18-Hydroxylase Aconitase Arylsulfatase l-Acylglycerol-3- Actin Aspartat- phosphate Acyltransferase Adenosin-Deaminase Aminotransferase
2,3- Adenosylhomocysteine- Aspartat-
Oxidosqualenlanosterol- Hydrolase Transcarbamoylase
Cyclase Adenosylmethionine- ATPase
21 -Steroid-Hydroxylase Decarboxylase ATP-Diphosphohydrolase
(EC 1.14.99.10) Adenylatcyclase bcl-2 Onkogen-Protein
24,28-Sterolreduktase Adenylatdeaminase Bindegewebeaktivieren¬
3-Hydroxybutyrat- Adenylatkinase des Peptid
Dehydrogenase Adenylsuccinate-Lyase C5a-inaktivierender Fac-
3-Ketothiolase Adenylsuccinate-Synthase tor
3 -ß-Hydroxy-steroid- Alanin- Aminotransferase Calcitonin
Dehydrogenase Aldolase Calmodulin
(EC5.3.3.1) Aldose-Reductase Calpain I
5'-Nucleotidase Alkalische Phosphatase Calreticulin
8-Oxoguanosin- Alkohol-Dehydrogenase Carbamoylphosphat-
Deglykosylase Amidophosphoribosyla- Synthetase abl Onkogen-Protein min-Transferase Carbonat- Anhydrase
Acetolactat-Synthase AMP- Caseinkinase 1
Acetylcholinesterase Phosphodiestererase Caseinkinase 2
Acetyl-CoA-Carboxylase Amyloid ß I A4-Protein Catalase Catechol- Dihydrouracil- Glycerinphosphat-
Methyltransferase Dehydrogenase Acyltransferase
Cathepsin Dioxygenase Glycerinphosphat-
Cathepsin B and L Dopaminmonooxygenase Dehydrogenase cdc 10 Dynenin Glycinamide- cdc 13 p60 Elastase Ribonucleotidtransformyl cdc 2 p34 Elastin ase cdc 25 p80 Elongation factor Tu GTP bindendes Protein
Chaparonin Endo-Rhamosidase Hämoglobin A
Cholesterin-Esterase Enolase Hämoglobin Al
Cholesterin- Enoyl-ACP-Hydratase Hämoglobin Barcelona
Monooxygenase Enoyl-ACP-Reductase Hämoglobin Barts
Citratsynthetase ets Onkogen-Protein Hämoglobin Beth Isreal
Clathrin Ferritin Hämoglobin Bunbury
Collagenase Ferrodoxin Hämoglobin Cochin-Port
Cortison-Dehydrogenase Fettsäuresynthetase Royal crk Onkogen-Protein fgr Onkogen-Protein Hämoglobin Cowtown
Cyclin A and B fps Onkogen-Protein Hämoglobin Cranston
Cyclophilin Fructosebisphosphat- Hämoglobin Creteil
Cytidin-Deaminase Aldolase Hämoglobin D
Cytidylate-Deaminase Fumarase Hämoglobin D-Los Ange¬
Cytochrom C-Peroxidase GABA-Aminotransferase les
Cytochrom P450 Galactosidase Hämoglobin D-Punjab
Cytosin- Gelatinase Hämoglobin F
Methyltransferase Gelsolin Hämoglobin Gower dbl Onkogen-Protein Glucophosphat-Isomerase Hämoglobin Hammers¬
Defensin Glucosylceramid- mith
Diacylglycerol- Galactosyltransferase Hämoglobin Hiroshima
Acyltransferase Glutaminase Hämoglobin Indianapolis
Dihydrofolate-Reductase Glutamin- Hämoglobin Kansas
Dihydroorotatase Phosphoribosylpyrophosp Hämoglobin Kariya
Dihydroorotat- hat-Amidotransferase Hämoglobin Kempsey
Dehydrogenase Hämoglobin Kenya Hämoglobin Lepore Hydroxymethylglutaryl- Myeloperoxidase Hämoglobin M CoA-Reductase Myofilament Hämoglobin M Hyde Hydroxymethylglutaryl- Myristoyltransferase Park CoA-Sythetase Na / K ATPase
Hämoglobin M Iwate Hydroxysteroid- N-Acetylglucuronidase Hämoglobin M Saskatoon Dehydrogenase NAD-abhängige Sterol-4- Hämoglobin Nancy Hypoxanthine-Guanine- carboxylase Hämoglobin Philly Phosphoribosyltransferase NADase Hämoglobin Quong Sze IMP-Dehydrogenase NADPH-abhängige 3- Hämoglobin Raleigh Indollyase Oxosteroidreductase Hämoglobin Ranier Inositolphosphat- Nexin Hämoglobin S Phosphatase N-ras Onkogen-Protein Hämoglobin Sealy int-1 Onkogen-Protein Nukleolusprotein B23 Hämoglobin Seattle Isocitratlyase Nukleosiddiphosphat- Hämoglobin St. Louis Kininbildendes Enzym Kinase Hämoglobin St. Mande Ki-ras Onkogen-Protein Ornithin- Hämoglobin Titusville Lactat-Dehydro genäse Aminotransferase Hämoglobin Torino Lactoferrin Ornithin- Hämoglobin Wayne Laminin Carbamoyltransferase Hämoglobin York Leukozyten-Elastase Ornithin-Decarboxylase Hämoglobin Zürich Lipocortin Orotate-Decarboxylase Ha-ras Onkogen-Protein Lipoxygenase Orotat- Hexokinase L-myc Onkogen-Protein Phosphoribosyltransferase Histaminase Lysozym p53 Histidin-Decarboxylase Malat-Dehydrogenase Peptidylamidoglycolate- HSP 27 Malat-Synthase Lyase
Hydropyrimidine- Malonyltransacylase Peptidyl-Prolyl-Isomerase Hydrolase Mannosidase PF4 Hydroxyacyl-CoA- met Onkogen-Protein Phenylalanine- Dehydrogenase Methämoglobin Hydroxylase Hydroxymethylglutaryl- Methionin- Phosphatidat-Phosphatase CoA Spaltendes Enzyme Adenosyltransferase Phosphoenolpyruvate- mos Onkogen-Protein Carboxykinase Phosphofructokinase rel Onkogen-Protein tRNA-Synthetase Phosphoglucokinase Ribonucleotid-Reduktase Tropomyosin Phosphoglucomutase Ribosephosphate- Tryptophan-Synthase Phosphoglycerate-Kinase Pyrophosphat-Kinase Tubulin Phosphoglyceromutase Ricintropoelastin Tyrosinkinase Phospholipase A2 Saure Phosphatase Ubioquinon-Reduktase Phospholipase C Saure Protease UPA Phospholipase CGI Schweres Meromyosin Uridinmonophosphat- Phospholipase D Serine / Threonin-Kinase Kinase Phospholipase S Spectrin Vitamin K-Reduktase Phosphoribomutase Spermine-Synthase wee-\ Genproduct Phosphoribosylphosphat- Squalene-Epoxidase Xanthindehydrogenase Transferase Squalen-Monooxygenase Xanthinoxidase pim Onkogen-Protein src Onkogen-Protein Xylosyltransferase Plasminogenaktivator- Sterolmethyltransferase yes Onkogen-Protein Inhibitor SMC 1 pl3 α-Actin Porin Succinyl-CoA-Synthetase α-Mannosidase pRB (Retinoblastomgen- Superoxid-Dismutase α-Melogenin Produkt) Tartrat-Dehydrogenase α-Tubulin pRb Retinablastom- Thioesterase i8-Actin Genprodukt Thioredoxin /3-Glucuronidase Properdin Thrombospondin /3-Glycerophosphatase
Prostaglandin-Synthase Thromboxane-A2- /3-Ketoacyl-ACP- Proteinkinase C Synthetase Reduktase Purinnucleosid- Thymidylat-synthetase /3-Ketoacyl-ACP- Phosphorylase Transacylase Synthetase PyruvateDehydrogenase Triosephophat-Isomerase /?-Spectrin Pyruvate-Kinase Triosephosphate- j8-Tropomyosin raf Onkogen-Protein Dehyrogenase j3-Tubulin
Eine weitere besonders bevorzugte Gruppe von intrazellulären Rezeptoren sind die HMG- Proteine wie beispielsweise in der internationalen Patentanmeldung PCT/EP96/00716 be- schrieben und insbesondere die HMGA-Proteine. Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff der HMGA-Proteine bevorzugterweise summarisch die folgenden Proteine: HMGAl, HMGAIa, HMGAIb und HMGA2.
Die HMGA-Proteine sind modular aufgebaut und besitzen je drei DNA-bindende Domänen, die als „AT-hooks" oder als „AT-Haken" bezeichnet werden und als DBDl bis DBD3 in Fig. 2 dargestellt sind, sowie einen sehr sauren C-terminalen Bereich. Es ist für den Fachmann offenkundig, dass Antagonisten, die an einen der „AT-hooks" binden, nicht nur die HMGAl- Proteine und dabei die beiden Splice-Varianten HMGAIa und HMGAIb erkennen (siehe Fig. 2), sondern auch Kreuzreaktivität mit ähnlichen DNA-bindenden Molekülen wie HMGA2 aufweisen. Außer HMGA2 besitzen noch viele weitere Proteine den „AT-hooks" ähnliche Sequenzen und stellen in jedem Falle weitere Rezeptoren dar. Solche Proteine sind unter anderen die in Tabelle 3 angegebenen:
Tabelle 3:
Spalte l: Proteindatenbank-Zugriffscodes; Spalte 2: Proteinbezeichnung
Q9UKB0 Humanes HMG-Protein-R
Q9UKY1 ZHXl_Humanes Zinkfinger- und Homöobox-Protein 1
P55198 AF17_HUMAN AF- 17 Protein [MLLT6]
Q59F28 Humanes Trithorax Homologon (Fragment)
Q6PJQ2 Humanes ZNF406 Protein (Fragment)
Q75PJ9 Humanes ZFAT-I Protein
Q75PJ7 Humanes ZFAT-3 Protein
Q75PJ6 Humanes TR-ZFAT Protein
Q9ULG1 Humanes KIAA1259 Protein
Q9NUK2 Humanes Hypothetisches Protein FLJ11314
Q9NTG6 Humanes Hypothetisches Protein DKFZp434B0616
Q8IX01 SFR14_HUMAN Mutmaßlicher Spleißfaktor
Q9HSJ8 Humanes Hypothetisches Protein FLJ23363 Humanes MGC5306 Protein Spleiß- Isoform 2 von Q8IX01 Spleiß- Isoform 3 von Q8IX01 Spleiß-Isoform 4 von Q8IX01 RBBP5_HUMAN Retinoblastom-bindendes Protein 5 (RBBP-5) MECP2_HUMAN Methyl-CpG-bindendes Protein 2
Humanes FLJ12800 Protein
Humanes Methyl-CpG-bindendes Protein 2, Isoform B
Humanes Hypothetisches Protein FLJ13629
Humanes Hypothetisches Protein DKFZp686A24l60 ENK7_HUMAN HERV-K_lq23.3 Provirus ENK16_HUMAN HERV-K_10pl4 Provirus Humanes MYB bindendes Protein Ia [MYBBPlA] Humanes Hüllprotein RIC-2 Humanes REPINl Protein (Hypothetisches Protein ZNF464) Humanes KIAA1205 Protein Humanes Dhfr Oribeta-bindendes Protein RIP60 Humaner Linensepithel -enthaltener Wachstumsfaktor p52 Humane regulatorische Untereinheit 2 der Proteinphosphatase-4 Humanes HMGA2/RAD51L1 Fusionsprotein
095368 Humaner Transkriptioneller Koaktivator p52 Q9P015 Humanes HSPC145 (Mitochondriales Ribosomenprotein L15)
Q5U071 Humanes HMG Protein "box 2'
Q9H0Y1 Humanes Hypothetisches Protein DKFZp564I206
Q6ZP45 Humanes Hypothetisches Protein FLJ26517
P17096-2 Spleiß-Isoform HMG-Y von P17096 [HMGAl]
Q9Y6X0 SETBP_HUMAN SET-bindendes Protein (SEB) [SETBPl]
Q8TEK3 DOT1L_HUMAN Histon-Lysine N-Methyltransferase
Q8TEK3-2 Spleiß-Isoform 1 von Q8TEK3 [DOTlL]
Q03164 HRX_HUMAN Zinkfinger-Protein HRX (ALL-I)
Q86YP1 Humaner Transkriptionsfaktor MLL UPN96240
Q86YN9 Humaner Transkriptionsfaktor MLL UPN95022
Q03164-2 Spleiß-Isoform 14P-18B von Q03164 [MLL]
P04920 B3A2_HUMAN Anionenaustauscher-Protein 2
Q59GF1 Humane Anionenaustauscher-2 Typ a-Variante
Q8TAG3 Humanes SLC4A2 Protein
Q6P391 Humanes PSIPl Protein
075475 Humaner Linensepithel-enthaltener Wachstumsfaktor p75
Q9UEY6 Humaner Anionenaustauscher-2 Typ a [SLC4A2]
Q9UEY5 Humaner Anionenaustauscher-2 Typ b2 [SLC4A2]
Q9UEY4 Humaner Anionenaustauscher-2 Typ bl [SLC4A2]
Q9UER6 Humaner Transkriptioneller Koaktivator p75
000256 Humanes DFS70
P04920-2 Spleiß-Isoform Bl von P04920 [SLC4A2]
Q9BTB1 Humanes Hypothetisches Protein MGC10561
Q9UKB0 Humanes HMG Protein-R
043167 ZBT24_HUMAN Zinkfinger- und BTB-Domänen enthaltendes Protein
Q8N455 Humanes ZBTB24 Protein [ZBTB24]
Q5TED5 Humanes Zinkfinger-Protein 450 [ZNF450]
Q96CK0 Humanes Zinkfinger-Protein 653
Q96AS7 Humanes Zinkfinger-Protein 653
P51888 PRELP_HUMAN Prolargin-Vorläufer
Q5JPC9 Humanes Hypothetisches Protein DKFZp667H216
Q6FHG6 Humanes PRELP-Potein
Q6ZR44 Humanes Hypothetisches Protein FLJ46672
Q8NEZ4 MLL3_HUMAN Myeloid/lymphoid-Leukämieprotein 3 Homologon
Q96AC6 KIFC2_HUMAN Kinesin-ähnliches Protein KIFC2
Q9C0H5 K1688_HUMAN Protein KIAA1688
P52926 HMGIC_HUMAN HMG Protein I -C
Q9UKV3 ACINU_HUMAN Induktor apoptotischer Chromatinkondensation
Q59F82 Humane C21orf2 -Proteinvariante
Q5VYT7 Humanes OTTHUMP00000021181
Q96M56 Humanes Hypothetisches Protein FLJ32810
Q69YJ6 Humanes Hypothetisches Protein DKFZp667N107
Q8NEY3 SPAT4_HUMAN Spermatogenes-Assoziiertes Protein 4
Q12809 KCNH2_HUMAN Kalium Potential-gesteuerte Ionenkanal-Subfamilie
Q8IYY4 Humanes dem DAZ-interagierenden Protein 1-ähnliches Protein [DZIPlL]
Q6ZN04 Humanes Hypothetisches Protein FLJ16544
Q5SXN7 Humanes Serologisch definiertes Kolonkrebs-Antigen 3
Q8IVG2 Humanes KIAA2009 Protein (Fragment) [RKHD3]
Q75VX8 Humanes KIAA2038 Protein (Fragment) [KIAA2038]
Q12809-2 Spleiß-Isoform 2 von Q12809 [KCNH2]
Vor diesem Hintergrund betrifft die vorliegende Erfindung auch L-Nukleinsäuren und insbesondere Spiegelmere, die gegen ein jegliches der in den Tabellen 1 bis 3 genannten Zielmoleküle gerichtet sind.
Indem die L-Nukleinsäure als intrazellulär aktives Agens insbesondere innerhalb einer Zelle verwendet wird, um dort an einen intrazellulären Rezeptor zu binden, können intrazellulär verschiedene Formen der Wechselwirkungen zwischen dem intrazellulären Rezeptor und seinen Wechselwirkungspartnern beeinflusst werden. In Abhängigkeit von der Art der Wechselwirkungspartner des intrazellulären Rezeptors erlaubt somit die intrazelluäre Verwendung von L-Nukleinsäuren die Beeinflussung von Wechselwirkungen von Proteinen, Nukleinsäuren, Lipiden, Kohlenhydraten, oder Kombinationen von Proteinen, Nukleinsäuren, Lipiden, Kohlenhydraten miteinander und untereinander.
Im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Verwendung einer L-Nukleinsäure, insbesondere eines Spiegeimers, als intrazelluläres Agens bzw. dem Verfahren zum Binden eines intrazellulärem Rezeptors ist beachtlich, dass es sich dabei bevorzugterweise im eine in vitro Anwendung bzw. ein in vitro Verfahren handelt.
Im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßem Verwendung einer L-Nukleinsäure, insbesondere eines Spiegeimers, zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung und/oder Prävention einer Erkrankung und/oder zur Herstellung eines Mittels zur Diagnose ist das Zielmolekül ein intrazelluläres Zielmolekül. In diesem Zusammenhang ist das intrazelluläre Zielmolekül ein solches, das an der zu verhindernden, zu therapierenden oder zu diagnostizierenden Erkrankung oder Krankheit kausal oder nicht-kausal beteiligt ist, in einem jeden Fall aber dessen Bindung an eine daran spezifisch bindende L-Nukleinsäure dazu führt, dass im Falle eines Medikamentes die Erkrankung gelindert, verhindert, oder geheilt wird und/oder im Falle eines diagnostischen Mittels die Erkrankung oder eine Disposition festgestellt oder diagnostiziert werden kann. Wie hierin verwendet umfasst der Begriff der Diagnose eine Erstdiagnose ebenso wie nachfolgende Diagnosen, insbesondere Diagnosen oder Untersuchungen, um, bspw., den Verlauf der Erkrankung oder die Stadien der Erkrankung zu verfolgen oder zu bestimmen. Es ist im Rahmen der Erfindung, dass das Ziehnolekül ein intrazellulärer Rezeptor wie hierin beschrieben ist, insbesondere ein Transkriptionsfaktor, ein intrazelluläres Zielmolekül oder ein HMG-Protein. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung ganz besonders bevorzugt, dass das Zielmolekül intrazellulär vorliegt, d.h. innerhalb einer Zelle und die auf die Erkrankung und/oder Diagnostik Einfluss nehmende Wechselwirkung zwischen der L- Nukleinsäure und insbesondere dem Spiegeimer und dem Zielmolekül, d. h. dem Rezeptor, intrazellulär erfolgt. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, wenn das Zielmolekül außerhalb einer Zelle vorliegt und die Wechselwirkung zwischen der L- Nukleinsäure und insbesondere dem Spiegeimer und dem Zielmolekül, d. h. dem Rezeptor, extrazellulär erfolgt.
Die indikationsmäßige Anwendung des unter Verwendung einer L-Nukleinsäure hergestellten Medikamentes, wobei die Nukleinsäure gegen ein intrazelluläres Zielmolekül gerichtet ist, ergibt sich für den Fachmann aus der Beteiligung des intrazellulären Zielmoleküls an dem der jeweiligen Indikation zugrundeliegenden Pathogenitätsmechanismus. So ist bspw. für HMGA-Proteine bekannt, dass diese mit Karzinomen (u.a. von Brust, Lunge, Haut, Schilddrüse) sowie Leukämien und Lymphomen sowie anderen malignen Tumoren wie u.a. Sarkomen (Rhabdomyosarkom, Osteosarkom) assoziiert sind. Ausserdem werden sie in vielerlei mesenchymalen Tumoren, u.a. Hamartome (Brust und Lunge), Fettgewebstumoren (Lipome), pleomorphen Adenomen der Kopfspeicheldrüsen, Uterus-Leiomyomen, Angiomyxomen, Fibroadenomen der Brust, Polypen des Endometriums und atherosklerotischen Plaques exprimiert. HMGA ist ein interessantes therapeutisches Target. Blockade von HMGA könnte ein geeigneter Ansatzpunkt zur Kontrolle des Krebses sein und seine metastatische Verbreitung verhindern. Wie detaillierter hierin beschrieben sind gegen HMGA-Proteine gerichtete L-Nukleinsäuren auch für die Diagnose und/oder Therapie von Virus erkrankungen und Arteriosklerose geeignet infolge der Beteiligung der HMGA-Proteine an der Regulation der Transkription einer Vielzahl viraler Gene bzw. der starken Expression von HMGA und insbesondere HMGAl in dem von Areteriosklerose betroffenen Gewebe, das mit neointimalen, vaskuläre glatten Muskelzellen, Makrophagen und neuen Blutgefäßen assoziiert ist
Obwohl - wie von den vorliegenden Erfindern überraschend festgestellt - Nukleinsäuren, bevorzugt L-Nukleinsäuren und bevorzugterweise Spiegelmere in der Lage sind, als solches eine Phospholipid-Doppelmembran wie eine Cytoplasmamembran zu durchdringen und dann intrazellulär funktional zu sein im Sinne der - spezifischen - Wechselwirkung mit dem intrazellulären Rezeptor, kann die Wirksamkeit der Einschleusung der L-Nukleinsäure durch die Verwendung verschiedener Techniken beeinflusst und insbesondere erhöht werden. Zu diesen Techniken gehört die Verwendung von chemischen Verbindungen oder Molekülen ebenso wie die Verwendung von physikalischen Maßnahmen. Unabhängig von der Art werden diese Techniken hierin allgemein als Abgabevehikel bezeichnet. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Erfinder ebenfalls festgestellt haben, dass auch Aptamere diese Eigenschaft aufweisen und wie die somit Spiegelmere ebenfalls zusammen mit der erfmdungsge- mäßen Zusammensetzung zu den grundsätzlich gleichen Zwecken, Anwendungen und Verwendungen verwendet oder herangezogen werden können.
Bei der Verwendung von chemischen Verbindungen bzw. Molekülen kann weiter unterschieden werden, ob die Nukleinsäure für die Abgabe modifiziert werden muss, oder ob sie nicht modifiziert werden muss. Eine Modifikation zu Zwecken der Verwendung eines Abgabevehikels ist typischerweise nicht erforderlich, wenn das Abgabevehikel ein Vesikel darstellt oder umfasst, wie beispielsweise bei Liposomen, Polypeptid-Vehikeln, Cyclodextrinen, Dendrimeren, Nano- und Mikropartikeln sowie Polyethylenimin. Eine Modifikation zu Zwecken der Verwendung eines Abgabevehikels ist dagegen typischerweise erforderlich wenn das Abgabevehikel Rezeptor-vermittelte Endozytose, fusogene Peptide, Signalpeptide oder Ii- pophile Konjugate verwendet. Die Gruppe der physikalischen Techniken umfasst insbesondere Elektroporation und Iontophorese. Es wird anerkannt werden, dass den Fachleuten auf dem Gebiet weitere Techniken bekannt sind, um eine Verbindung über eine Phospholipid- Doppelmembran wie eine Cytoplasmamembran zu transportieren, die grundsätzlich auch für den Transfer eine funktionalen Nukleinsäure wie beispielsweise eines Aptamers und/oder eines Spielgelmers geeignet sind.
Im folgenden sollen die einzelnen Abgabevehikel, die im Rahmen der verschiedenen Aspekte der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, detaillierter beschrieben werden.
Liposomen bestehen aus künstlichen kationischen Lipiden wie N-[I -(2,3 -dioleoyloxy) pro- pyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA) und N-[l-(2,3-dioleoyloxy) propyl]- N,N,N-trimethylammoniumsulfat (DOTAP), in denen die kationischen Gruppen mit den negativ geladenen Nukleinsäuren wechselwirken und deren anionischen Ladung neutralisieren. Der Transport erfolgt über Endozytose (PNAS, 93:11493-11498, 1996). Allerdings sind kationische Liposomen zytotoxisch, insbesondere in höheren Konzentrationen, was ihre Anwendung in vitro und in vivo begrenzt (Biochem Biophys Res Commun, 197:818, 1993; Biochem Biophys Res Commun, 1372:55-68, 1998). Eine nicht toxische Formulierung stellt dagegen das amphiphile Pyridinium-basierte Lipid SAINT-2 dar (Nucleic Acids Res, 29:2079-2087, 2001). Eine Alternative stellen auch pH-sensitive Liposomen dar, die aus amphipatischen Molekülen wie Cholesterylhemisuccinat (CHEMS) und Dioleylphosphatidylethanolamin (DOPE) bestehen (J Pharmacol Exp Ther, 297:1129-1136, 2001). Verschiedenste Formulie- rungen von Liposomen finden sich in den Übersichtsartikeln von Dass und Torchili (Drug Delivery, 9:169-180, 2002; Nat Rev Drug Disc, 4:145-160, 2005).
Bei der Rezeptor-vermittelten Endozytose (RME) werden Transportmechanismen, die bereits in der Zellmembran vorhanden sind, genutzt. Dazu wird die Nukleinsäure beispielsweise über einen Poly-L-lysin (PPL)-Linker kovalent mit einem Transporter-Protein (,,Carrier"-Protein) verknüpft. Die Auswahl des Transporter-Proteins ist dabei abhängig von der Fähigkeit an bestimmte Rezeptoren der Zellmembran zu binden und in der Zelle durch Endozytose zu akkumulieren. So kann ein zellspezifischer Transport realisiert werden. So konnte beispielsweise ein gegen c-myc gerichtetes Antisense-Phosphorothioat in M- 14 humane Melanom-Zellen geschleust werden (Anticancer Res, 17:29-35, 1997). Allerdings hängt ein effektiver Transport mittels RME dabei nicht nur von der Affinität des Rezeptors für den Liganden sondern auch von der Limitierung des ausgewählten Rezeptors bezüglich der Zellen - speziell in vivo - ab. Des weiteren muss der ausgewählte Ligand inaktiv oder verstärkend bezogen auf das therapeutischen Ergebnis sein, um eine mögliche Toxizität des Transportvehikels zu vermeiden. So ist die Auswahl und die ubiquitäre Verbreitung des ausgewählten Rezeptors in vivo entscheidend für einen erfolgreichen RME-basierten Transport. Des weiteren konnte eine Sequestration von Nukleinsäuren in endosomalen Kompartments bei RME-basiertem Transport beobachtet werden, was diese Methode für einen intrazellulären Transport bzw. eine intrazelluläre Abgabe oder Delivery wenig vielversprechend erscheinen lässt. Zuallerletzt muss die Verknüpfung zwischen Rezeptor und Nukleinsäure so gewählt werden, dass sowohl die Funktion des einen oder des anderen nicht reduziert wird (J Pharmaceutical Science, 92 (8): 1559- 1573, 2003).
Fusogene Peptide sind verwendet worden, um Peptid-Oligonukleotid-Konjugaten die Fusion mit der Zellmembran zu ermöglichen und so den Transport in die Zelle zu realisieren (Bio- conjug Chem, 9: 466-475, 1998; Bioconjug Chem, 6:43-53, 1995; Nucleic Acids Research, 25:2730-2736, 1997).
Der selektive Import von Kernproteinen aus dem Zytosol in den Nukleus wird durch kurze Peptidsequenzen, die „Nuclear localization signals" (NLS) genannt werden, vermittelt. So können verschiedene NLS-Peptidderivate verwendet werden, um Nukleinsäuren in den Nukleus zu transportieren (Bioconjug Chem, 10:1005-1012, 1999; Bioconjug Chem, 10:598-606, 1999; Bioconjug Chem, 6:101-108, 1995). Zudem gibt es auch sogenannte „Signal import Peptides" (IP), die die zelluläre Aufnahme von Nukleinsäuren befördern können und beispielsweise aus dem Kaposi 's Fibroblastenwachstumsfaktor (K-FGF) abgeleitet werden konnten (Adv Drug Deliv Rev, 44:35-49, 2000).
Durch Blöcke von Polypeptiden können Vesikel analog zu viralen Kapsiden ausgebildet werden, die als mögliche Transportvehikel für einen intrazellulären Transport dienen (Nat Materials, 3(4):244-8, 2004).
Der hydrophile Charakter von Oligonukleotiden und das anionische Phosphodiester-Rückgrat reduzieren die zelluläre Permeation. Daher stellen lipophile Konjugate eine Möglichkeit dar, die Fähigkeit von Oligonukleotiden zu erhöhen, an Lipoproteine zu binden und dadurch die intrazelluläre Delivery zu verbessern. Das am besten untersuchte Konjugat ist das Cholesterin (Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 12:103-128, 2002).
Cyclodextrine sind zyklische Oligosaccharide, die eine zentrale hydrophobe Kavität und multiple Hydroxylgruppen an der äußeren Oberfläche aufweisen. Cyclodextrine konnten so bereits für den Transport von Antisense-Oligonukleotiden in humane T- Zelllinien (Antisense Res Dev, 5:185-192, 1995) und auch in vivo zum intrazellulären Transport bzw. zur intrazellulären Abgabe oder Delivery von immunogenen CpG-Sequenzen verwendet werden (Bio- chem Pharmacol, 52:1537-1544, 1996). Verschiedenste Formulierungen von Cycloodextrinen finden sich in dem Übersichtsartikel von Davis und Brewster (Nature Reviews Drug Discovery 3:1023-1035, 2004).
Dendrimere sind hochverzweigte Makromoleküle, die sich aus repetitiven Einheiten von - typischerweise - Polyamiden zusammensetzen. Die Moleküle tragen auf ihrer Oberfläche funktionelle Gruppen wie primäre Aminogruppen, die mit anderen Molekülen durch elektrostatische Interaktion wechselwirken. Dadurch findet schnell und hoch reproduzierbar eine komplexe Formbildung statt, die zu Komplexen mit schwacher Zytotoxizität führt (Nucleic Acids Research, 28:4225-4231, 2000; Clin Cancer Res, 7:3606-3612, 2001;)
Zyanacrylatnanopartikel sind seit Beginn der 1990er Jahre für die Abgabe oder Delivery von Oligonukleotiden getestet worden. Die Wechselwirkung von Oligonukleotiden zu den Nano- Partikeln erfolgt durch Ionen-Paare der anionischen Ladung der Oligonukleotide mit verschiedenen hydrophoben Kationen vorrangig mit geladenden Nanopartikeln. Typischerweise werden zur Bildung von Nanopartiklen Polyisohexyl-(PIHCA), Polyisobutyl-(PIBCA) oder Polyhexycyanoacrylate (PHCA) verwendet, obwohl auch eine Vielzahl von lipophilen Kati- on-Oligonukleotid-Paaren getestet wurde (Pharm Res., 1 :1370-1378, 1994; PNAS, 91:10460- 10464, 1994; Pharm Res, 9:441-449, 1992). Auch zur in vivo Anwendung wurden Nanoparti- kel bereits eingesetzt (Biochem Biophys Res Commun, 279:401-406, 2000; Pharm Res, 13:38-43, 1996).
Mikropartikel oder sogenannte Mikrokugeln („microspheres") sind typischerweise aus bioab- baubaren Polymeren Poly(d,l-laktid-co-glykolide [P(LA-GA)] und werden zum verzögerten Abgabe von Oligonukleotiden eingesetzt (J Pharm Sei, 91:790-799; 2000; J Controlled Release, 69:197-207, 2000; J Drug Traget, 5:291-302, 1998)
Elektroporation ist eine Transporttechnologie, die ein starkes elektrisches Feld benutzt, um die Lipiddoppelmembran zu destabilisieren, dadurch die Zellmembran zu permeabilisieren und so einen Transport der zu verabreichenden Substanz, die auch ionisiert vorliegen kann (Iontophorese), in die Zelle zu ermöglichen. Elektroporation ist bereits erfolgreich verwendet worden, um transdermalen Transport von Oligonukleotiden ex vivo sowie in vivo zu ermöglichen (Int J Pharm, 184:147-156, 1999; J Drug Traget, 5:275-289, 1998; Pharm Res, 15:1596- 1602, 1998; Int J Cancer, 85:260-266, 2000; Biochem Biophys Res Commun, 212:286-292, 1995; Blood, 88:731-741, 1996).
Durch Aufwendung von hohem Druck kann die Aufnahme „nackter" Oligonukleotide in Zellen in vitro und ex vivo verbessert werden. Die Notwendigkeit geschlossener Systeme zur Verwendung dieser Technologie lässt nur eine. Verwendung für ex vivo Anwendungen zu (PNAS, 96:6411-6416, 1999; Hum Gene Ther, 10:2355-2664, 1999).
Auch die Verwendung von Schockwellen, akustischen Hochdruckpulsen, ermöglicht den Transport von Oligonukleotiden in Zellen (J Mol Med, 79:306-313, 2001; Cancer Res, 58:219-221, 1998). Ultraschall ist ebenfalls eine akustische Technolgie vergleichbar zu den Schockwellen, benutzt allerdings höhere Frequenzbereiche (MHz statt Hz) und kürzere Verwendungszeiten (Sekunden bis Minuten) und wurde bereits unterstützend für gentherapeuti- sehe Ansätze verwende (Hum Gene Ther, 7:1339-1346, 1996; Invest Radiol, 32:723-727, 1997; Ultrasound Med Bio, 25:1451 -1457, 1999).
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein neues Abgabevehikel bereitgestellt, das insbesondere für den Transport von funktionalen Nukleinsäuren wie Aptameren, bevorzugt funktionalen L-Nukleinsäuren und ganz besonders bevorzugt Spiegelmeren geeignet ist. Das Abgabevehikel ist dabei eine mizellenartige oder liposomenartige Struktur auf der Grundlage von Polyethylenimin. Ohne darauf im folgenden festgelegt sein zu wollen, gehen die vorliegenden Erfinder derzeit davon aus, dass die Nukleinsäure in der micellenartigen oder liposomenartigen Struktur eingebettet oder enthalten vorliegt. Polyethylenimin kann grundsätzlich als lineares oder verzweigtes Polyethylenimin vorliegen und auch verwendet werden, wobei verzweigtes Polyethylenimin in der verzweigten Form besonders bevorzugt ist. Des weiteren kann Polyethylenimin als hochmolekulares oder niedermolekulares Polyethylenimin vorliegen und auch verwendet werden. Bevorzugterweise weist hochmolekulares Polyethylenimin ein Molekulargewicht von etwa 800 kDa auf und niedermolekulares Polyethylenimin ein Molekulargewicht von etwa 3 kDa auf. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird ein Polyethylenimin mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 25 kDa bevorzugt, wobei es sich dabei bevorzugtererweise um ein verzweigtes Polyethylenimin mit einem Molekulargewicht von etwa 25 kDa handelt.
Obgleich es für ein Funktionieren nicht obligatorisch, ist es doch bevorzugt, dass bei dem erfindungsgemäßen Abgabevehikel die abzugebende Nukleinsäure selbst auch eine Modifikation trägt. Dabei ist es bevorzugt, wenn die Modifikation aus der Gruppe ausgewählt ist, die PEG-Reste umfasst. Dabei ist weiter bevorzugt, wenn der PEG-Rest ein Molekulargewicht von etwa 1000 bis 10000 Da, bevorzugtererweise etwa von 1200 bis 5000 Da und weiter bevorzugtererweise etwa von 1500 bis 2500 Da und am bevorzugtesten von etwa 2000 Da aufweist.
Bei der Mischung der Nukleinsäure mit dem Abgabevehikel zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung wird ein Quotient aus Gesamtanzahl der Stickstoffgruppen des Polyethylenimins und Gesamtanzahl der Phoshpatgruppen der mit oder durch das Abgabevehikel abzugebenden oder zu verpackenden Nukleinsäure von etwa 1 bis 20, bevorzugter- weise von etwa 1,5 bis 10, bevorzugtererweise von 2 bis 5 und am bevorzugtesten von etwa 2 bis 3 eingestellt bzw. realisiert.
Das erfindungsgemäße Abgabevehikel erlaubt somit, auch für funktionale Nukleinsäure wie Aptamere und insbesondere L-Nukleinsäuren wie Spiegelmere den Mechanismus des intrazellulären Transports von Nukleinsäuren über Kondensation bzw. Verpackung mit geladenen Partikeln oder Reagenzien und damit verbundene Änderung der Ladung des Gesamtkomplexes zu nutzen. Dieser Komplex wird leicht über Endozytose aufgenommen und gelangt somit in das Zytosol der Zelle. Ein Nachteil dieser Methode ist die Stabilität der DNA/ RNA bzw. das Freisetzen der Nukleinsäure aus dem endosomalen Kompartiment. Im Zytosol der Zelle entsteht aus dem eingeschnürten Endosom durch das Einbringen von Proteasen bzw. Nuklea- sen und durch Protonierung des Kompartiments schnell ein Lysosom. Nukleasen verdauen dort die Nukleinsäuren. Das gilt jedoch nicht für Spiegelmere, da diese durch ihre unnatürliche Konfiguration nukleasestabil sind. Zudem sind Nukleinsäuren im saurem Milieu des Ly- sosoms nicht stabil. Allerdings gilt dies eher für Nukleinsäuren aus DNA, weniger für Nukleinsäuren, die aus RNA aufgebaut sind. Über Exozytose bzw. den Abbau im Golgi-Apparat wird der gesamte Komplex schnell wieder aus der Zelle transportiert und somit gelangen nur wenige Nukleinsäuren in die Zelle. Eine der Herausforderung an ein geeignetes Transfekti- onssystem ist somit die Stabilisierung, sowie die Freisetzung der Nukleinsäure aus den Endo- somen in das Zytosol. Hinsichtlich der Stabilität haben RNA-Spiegelmere ideale Eigenschaften für eine Transfektion von eukaryotischen Zellen, da sie als Enantiomere nicht von Enzymen gespalten werden.
Die erfindungsgemäße Verwendung der L-Nukleinsäuren und insbesondere im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ist gerade für diese Wirkstoffklasse von Bedeutung, da deren Wirkmechanismus auf einem stöchiometrischen Ansatz und nicht auf einem katalytischen Ansatz beruht, bei dem bereits die intrazelluläre Abgabe von einigen wenigen Molekülen ausreichend ist, "um die gewünschte Wirkung zu erzielen. Insoweit wird mit der vorliegenden Erfindung ein bisher durch die Techniken des Standes der Technik nicht befriedigter Bedarf befriedigt.
Das mit den erfindungsgemäßen Abgabevehikeln bereitgestellte bzw. ausgebildete erfindungsgemäße Transfektionssystem basiert auf der Bildung von Mizellen aus Nukleinsäuren und verzweigtem Polyethylenimin (PEI). Das Phosphodiesterrückgrat der Nukleinsäuren in- teragiert mit den freien Stickstoff-Positionen des PEI und bildet über Querverzweigung kleine Mizellen, welche aufgrund des PEI eine positive Ladung haben. Diese Mizellen werden leicht durch Einschnürung der Plasmamembran als Endosomen von einer Zelle aufgenommen. Das PEI puffert nun einströmende Protonen ab, woraufhin viele Chlorid-Ionen im Inneren des Endosoms zu einem Anschwellen des Kompartiments aufgrund des osmotischen Drucks führen. Dieser Effekt des PEI wird als Protonen-Schwamm-Effekt in der Literatur beschrieben und führt letztlich zum Platzen des Endosoms und zur Freisetzung der Spiegelmere in das Zytosol. (Pharm Res, 22 (3): 373-80, 2005; Eur J Cell Biol 83 (3): 97-111, 2004; Gene Ther 9(24): 1700-7, 2002).
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die erfindungsgemäße Zusammensetzung als Aerosol verabreicht wird.
Des Weiteren können Spiegelmere mit Signalpeptiden für die intrazelluläre, sowie intranukle- äre Abgabe (engl. „Delivery"), als auch für die Organ spezifische Delivery derivatisiert werden. Eine Kopplung von Signalpeptiden direkt an das Polyethylenimin kann für eine gerichte Lokalisation zu Organen oder innerhalb der Zelle verwendet werden.
In einem noch weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung L-Nukleinsäuren, insbesondere Spiegelmere und noch bevorzugter RNA-Spiegelmere, die gegen HMGA-Proteine gerichtet sind. Die hierin offenbarten Spiegelmere gegen HMGA-Proteine stellen insbesondere Beispiele dar für die der vorliegenden Anmeldung ebenfalls zugrundeliegende Erkenntnis, dass L-Nukleinsäuren und insbesondere Spiegelmere in der Lage sind, eine Phospholipid- Doppelmembran bzw. eine Cytoplasmamembran einer Zelle zu überwinden und intrazellulär mit dem intrazellulären Rezeptor, auf dessen spezifische Bindung hin sie selektiert worden sind, zu binden. Hinsichtlich der Ausgestaltung der HMGA-Proteine und der dagegen gerichteten L-Nukleinsäuren gilt das hierin zu der intrazellulären Verwendung von L-Nukleinsäure offenbarte auch im Zusammenhang mit dem vorliegenden Aspekt der Erfindung (und vice versa) und wird zur Vermeidung unnötiger Wiederholungen an dieser Stelle durch Bezugnahme wiederholt. Die HMG (high mobility group)-Familie von DNA-bindenden Phosphoproteinen sind als Nicht-Histon-Komponenten des Chromatins ubiquitär in Säugerzellen vorhanden (Grosschedl et al. 1994). Die basischen HMG-Proteine werden in drei verschiedene Familien eingeteilt - die HMGB- (früher: HMG-1/-2), die HMGN- (früher: HMG-14/-17), und die HMGA-Familie (früher: HMG-IΛ7C). Jede HMG-Familie besitzt ihr charakteristisches funktionelles Sequenzmotiv: die „HMG-box" (HMGB-Familie), die „nucleosomal binding domain" (HMGN- Familie), bzw. den „AT-hook" (HMGA-Familie).
Zum gegenwärtigen Stand umfasst die HMGA-Familie zwei Gene, HMGAl und HMGA2. Von HMGAl können durch alternatives splicing drei verschiedene Proteine exprimiert werden (HMGAIa [früher: HMG-I], HMGAIb [früher: HMG-Y], HMGAIc [früher: HMG-I/R]), von HMGA2 nur eines (HMGA2 [früher: HMGI-C]). HMGAIa, HMGAIb und HMGA2 sind Polypeptide von ungefähr 100 Aminosäuren Länge und weisen eine modulare Sequenzorganisation auf: sie besitzen drei stark basische Regionen („AT-hook") die die schmale kleine Furche von doppelsträngiger AT-reicher DNA binden (Reeves & Nissen 1990). Der C-Terminus dagegen enthält viele saure Aminosäuren. Die Proteine besitzen frei in Lösung keine stabile Sekundär struktur und nehmen erst eine definierte Konformation an, wenn sie im Komplex mit DNA oder anderen Proteinen vorliegen (Huth et al 1997). HMGA-Proteine gehören zu den am stärksten modifizierten Proteinen im Säugerzellkern und werden phosphoryliert, acety- liert, und methyliert (Reeves & Beckerbauer 2001).
Die HMGA-Proteine besitzen per se keine transkriptioneile Aktivität, organisieren aber als s.g. architektonische Transkriptionsfaktoren durch ihre Protein-Protein sowie Protein-DNA- Interaktionen die Ausbildung des Nukleoprotein-DNA-Transkriptionskomplexes (Wolffe 1994). Sie nehmen somit regulatorisch auf die Expression einer Vielzahl von Genen einen aktivierenden oder inhibitorischen Einfluß. Das prominenteste Beispiel einer positiven Regulation ist die Involvierung von HMGAl in die Regulation des IFN-/3 (Thanos & Maniatis, 1992). So stimuliert beispielsweise im Falle des IFN-ß-Promotors das HMGAIb die Bindung von NF-κB und ATF-2 an die DNA-Doppelhelix und verändert gleichzeitig die DNA- Struktur dergestalt, dass NF-κB und ATF-2 miteinander und vermutlich auch mit der restlichen Transkriptionsmaschinerie interagieren können (Thanos & Maniatis 1992, Du et al 1993). Ein weiterer transkriptionsaktivierender Effekt im Zusammenhang mit der arteriosklerotischen Pathogenese ist die durch HMGAl induzierte CD44-Genregulation (Foster et al 1998). CD44 ist ein Zelloberflächen-Glykoprotein und in die Migration und Proliferation glatter Muskelzellen nach Endothelverletzung involviert (Jain et al 1996, Cuff et al 2001). Die transkriptioneile Regulation von CD44 wird durch die Bindung von c-Fos und c-Jun an die AP-I Bindungsstelle im CZW-Promotor induziert und durch die Bindung von HMGAl verstärkt. Untersuchungen in Ratten zeigten, daß es durch CD44-Überexpression zu einer verstärkten Rekrutierung glatter Muskelzellen kommt und dies direkten Einfluß auf die Entstehung von arteriosklerotischen Läsionen hat (Pellacani et al 1999; Foster et al. 1998; 2000).
Untersuchungen zur Expression des in der chromosomalen Bande 6ρ21.3 lokalisierten HMGAl-Gens und des in der Region 12ql4-15 lokalisierten HMGA2- Gens zeigten, dass diese hauptsächlich bei Prozessen zellulärer Differenzierung aktiv sind. Dementsprechend ist eine starke Expression dieser Gene während der Embryonalentwicklung und in undifferenzierten Zellen (Chiappetta et al 1996) sowie in Wachstumsfaktor-stimulierten Zellen zu finden (Friedman et al 1993; Johnson et al 1990; Ogram et al 1995; Holth et al 1997). Im adul- ten, differenzierten Gewebe ist lediglich in der Retina HMGAl stark exprimiert, während in den übrigen Geweben HMGA2 gar nicht und HMGAl nur noch in sehr geringen Konzentrationen zu finden ist (Bussemakers et al 1991; Chiappetta et al 1996; Rogalla et al 1996; Zhou et al 1995; Chau et al 2000). Eine reaktivierte Expression von HMGA-Proteinen in differenziertem Normalgewebe wird dabei mit dem Wachstum und der Differenzierung von Adipozy- ten (Zhou et al 1995; Anand & Chada 2000; Melillo et al 2001), der Proliferation glatter Muskelzellen in den Blutgefäßen nach Gefäßverletzungen (Chin et al 1999), der Immunantwort bei entzündlichen Reaktionen (Pellacani et al 1999) sowie mit apoptotischen Prozessen (Diana et al 2001; Sgarra et al 2003) assoziiert. Die Menge an HMGAl variiert dabei in Abhängigkeit von der Proliferationsrate der Zellen (Johnson et al 1990).
Im Verlauf der Embryonalentwicklung konzentriert sich die HMGAl -Expression auf spezifische Organe ekto-, meso- oder endodermalen Ursprungs, während HMGA2 auf mesenchymale Gewebe beschränkt ist. Bislang liegen keine Informationen über den Phänotyp von HMGAl -knockout Mäusen vor, möglicherweise weil das Fehlen dieses Faktors die embryonale Entwicklung zu sehr schädigt. HMGΛ 2-knockout Mäuse dagegen sind zwergwüchsig und weisen besonders wenig Fettgewebe auf (Zhou et al 1995) und sind darüber hinaus gegen diätinduzierte Fettleibigkeit resistent (Anand & Chada 2000). Schließlich ist HMGA2- bzw. HMGAlb-Expression nicht nachweisbar im Fettgewebe von normalen Mäusen, jedoch dramatisch erhöht im Fett von fetten oder diabetischen Mäusen (Chada et al. 2004), was auf einen Zusammenhang von Adipositas und HMGA-Expression hindeutet
Überexpression von HMGAl beeinflusst im Einzelnen (Reeves et al 2001):
• Regulatoren von Zellzyklus und Wachstum wie cdc25A,
• Intermediäre Filamentmarker wie Zytokeratin, Typ 1
• Apoptoseregulatoren wie TRARl 5
• Onkogene und Tumorsuppressor-Gene wie MET
• Gene für DNA-Reparatur und -Rekombination wie DNase X
• Regulatoren von Zellschicksal und -entwicklung wie frizzled-5
• Rezeptoren wie FGFRl
• Zelladhäsions-, Motilitäts- und Invasionsgene wie collagen type 1
• Angiogenese-Regulatoren wie FGFR2
• Invasionsregulatoren wie MMP-16
• kleinen GTPasen der Rho-Familie und ihre Regulatoren wie RhoC
• Zell-Zellinteraktionsgene wie Cadherin 12
• Wachstumsfaktoren und Zytokine wie IL-11
Abnormale Regulation von HMGAl könnte daher zu generellen Alterationen der Genexpression führen und dadurch signifikant zur Bildung von transformierten und/oder metastatischen Phänotypen beitragen.
HMGA-Proteine scheinen in mesenchymalen bzw. epithelialen Tumoren unterschiedliche Rollen zu spielen: in malignen epithelialen Tumoren ist HMGA-Expression eher mit späteren Stadien der Karzinogenese assoziiert, während die benignen - eher selten konvertierenden mesenchymalen Tumoren - bereits in früher Hyperplasie HMGA exprimieren. Dies deutet darauf hin, dass HMGA-Proteine in Geweben von unterschiedlicher embryonaler Herkunft verschiedene Funktionen erfüllen, woraus sich auch unmittelbar die entsprechenden Anwen- düngen der erfindungsgemäßen L-Nukleinsäuren in der Diagnose und/oder Therapie von - entsprechenden - Erkrankungen ergeben, wie auch im Folgenden auch detaillierter dargstellt.
In Tiermodellen wurde die Expression von HMGAl in verschiedenen menschlichen und tierischen Neoplasmen untersucht. Die Rolle von HMGA-I konnte in Tiermodellen bezüglich Tumorigenese (Leman et al 2003; Ram et al 1993) sowie neoplastischer Progression gezeigt werden (Bussemakers et al 1991; Nestl et al 2001; Ram et al 1993).
Erhöhte Expression des HMGAl -Gens ist belegt für Karzinome von
• Prostata (Bussemaker et al 1991; Tamimi et al 1996, Leman et al 2003; Nestl et al 2001)
• Pankreas ( Nestl et al 2001 ; Abe et al 2000, 2002; Tarbe et al 2001)
• Schilddrüse (Chiappetta et al 1998, 1995)
• Zervix (Bandiera et al 1998)
• Magen (Xiang et al 1997)
• Brust (Holth et al 1997; Baldassarre et al 2003; Reeves et al 2001; Nestl et al 2001; Ram et al 1993; Dolde et al 2002)
• Colon/Rektum (Fedele et al 1996; Abe et al 1999; Kim et al 1999; Chiapetta et al 2001)
• Ovarien (Masciullo et al 2003) • und weiterhin für
• Neuroblastome (Giannini et al 2000; 1999) sowie
• Lymphome (Wood et al 2000a; b).
Die genaue Basis für die erhöhte Expression und die Rolle des HMGAl-Gens in der Pathogenese des Tumors und des Prozesses der Metastasierung ist zwar noch nicht ganz geklärt. Verschiedene Studien legen jedoch nahe, dass die Stärke der HMGA 1 -Expression des jeweiligen Tumors als prognostischer Marker mit dessen Metastasierungspotential korreliert und damit ein charakteristisches Merkmal für eine maligne transformierte Zelle darstellt (Giancotti et al 1987).
Weitere HMGAl -assoziierte - in diesem Falle benigne, mesenchymale Tumore - sind charakterisiert durch chromosomale Veränderungen in der chromosomalen HMGL4 /-Region 6p21.3. Derartige Aberrationen wurden bislang unter anderem für
• Uterus-Leiomyome (Mark et al 1988; Ozisik et al 1993)
• Lipome (Sreekantaiah et al 1990)
• Endometriumpolypen (Fletcher et al 1992; Dal Cin et al 1995) sowie
• chondroide Hamartome der Lunge (Fletcher et al 1991; Johansson et al 1992, 1993)
beschrieben.
Aberrationen in den genetischen Mechanismen, die Wachstum und Proliferation kontrollieren, sind die primäre Ursache für Karzinogenese. Die Expression von HMGA-Proteinen ist stark mit Tumorentwicklung assoziiert, wie in einer Anzahl von Arbeiten gezeigt werden konnte (Giancotti et al. 1987, 1989, 1993). So wurde eine beträchtliche HMGA2-Expression in chemisch oder viral erzeugten wie auch in spontan erhaltenen Tumoren gefunden, während in nicht-transformierten Zellen bzw. gesundem Gewebe dieses Protein nicht nachgewiesen werden konnte (Giancotti et al. 1989). In Einklang damit fehlten mit onkogenen Retroviren infizierten Zellen, in denen die Synthese von HMGA2-Expression spezifisch blockiert worden war, verschiedene phänotypische Marker für Transformation (Berlingieri et al. 1995).
Die Schlüsselrolle der HMGA-Proteine für normales wie auch pathologisches Wachstum konnte in Mausmodellen herausgearbeitet werden: HMGA2 knockout-MMse zeigen Zwergwuchs, d. h. die Tiere sind ca. 60% kleiner als Wildtyp-Mäuse. Diese Zwergmäuse jedoch weisen eine hohe Resistenz gegen chemisch induzierte Hauttumoren auf.
Mit Hilfe zytogenetischer Untersuchungen wurden in den letzten Jahren für eine ganze Reihe von benignen Tumoren mesenchymalen Ursprungs - hierbei handelt es sich um die größte Gruppe gutartiger Neoplasien des Menschen - strukturelle Aberrationen der chromosomalen Region 12ql4-15 das HMGA2-Gen betreffend gefunden. Trotz einer Vielzahl an Aberrationen (Schoenmakers et al 1995; Kottickal et al 1998; Klotzbüchel et al 1999) haben die veränderten Formen aber immer eine Gemeinsamkeit: sie beinhalten alle die drei DNA-bindenden Domänen, gleichzeitig verlieren sie aber sowohl die saure C-terminale Domäne als auch auf Ebene der RNA die Informationen des 3'UTRs.
Solche Veränderungen wurden bereits für viele (meist gutartige) mesenchymalen HMGA- assoziierte Tumore gefunden:
• Leiomyome des Uterus, die häufigsten Unterleibstumoren bei Frauen und Indikation . für über 200.000 jährliche Hysterektomien in den USA (Heim et al 1988; Turc-Carel et al 1986; Vanni et al 1988)
• Lipome (Heim et al 1988; Turc-Carel et al 1986; Mandahl et al 1987; Sreekantaiah et al 1991; Beige et al 1992)
• Endometriumpolypen (Walter et al 1989; Vanni et al 1993; Dal Cin et al 1995)
• chondroide Hamartome der Lunge (Fletcher et al 1991 , 1995 ; Dal Cin et al 1993)
• pleomorphe Adenome der Kopfspeicheldrüsen (Mark et al 1980, 1986; Bullerdiek et al 1987)
• Hämangiopericytome (Mandahl et al 1993)
• chondromatöse Tumore (Mandahl et al 1989; Bridge et al 1992)
• benigne Tumore der Brust (Birdsal et al 1992; Rohen et al 1995; Staats et al 1996)
• aggressive Angiomyxome (Kazmierczak et al 1995)
• diffuse Astrocytome
• Osteoklastome (Nuguera et al 1989)
Die Hauptursache für Mortalität und Morbidität von Krebspatienten ist die metastatische Verbreitung des primären Neoplasmas im Körper. Metastasierung ist ein kein einfacher Vorgang, da eine erfolgreiche Kolonisierung von entfernten Organen durch ausgestreute neoplastische Zellen viele Stadien durchlaufen muss. Neoplastische Zellen müssen sich vom primären Neoplasma lösen, in den Blutkreislauf eintreten, an entfernten Orten wieder extravadieren, und schliesslich im Parenchym des entsprechenden Organs wieder proliferieren. Bei den verschiedenen Stadien dieser hochkomplexen metastatischen Kaskade sind viele Gene beteiligt die Proteine wie Proteasen, Adhäsionsmoleküle, Motilitätsfaktoren und angiogene Faktoren exprimieren.
Welches dieser Gene letztendlich das ausschlaggebende für die Metastasierung ist, ist nicht bekannt. Das HMGAl-Gen als einer der wichtigsten Faktoren, der diesen Prozess kontrolliert, ist jedoch ein valider Kandidat dafür. Die Genprodukte von HMGAl beeinflussen die Transkription vieler Gene, die für erfolgreiche Metastasierung wichtig sind. So wurde bereits gezeigt, dass andere Metastase-assoziierte Gene bei Suppression von HMGAl -Expression ihrerseits vermindert exprimiert werden (Battista 1998; Vallone 1997).
HMGAl ist daher ein interessantes therapeutisches Zielmolekül. Die Blockade von HMGAl ist somit grundsätzlich geeignet den Krebs zu kontrollieren und seine metastatische Verbreitung zu verhindern (Evans 2004; Sgarra 2004). So konnte beispielsweise durch Einsatz von gegen HMGA-Transkripte gerichtete Antisense-RNAs in Krebszellen in vitro die Zellprolife- ration verringert oder die Zellen sogar zur Apoptose gebracht werden (Masciullo 2003; Scala 2000; Chau 2003). Im Tiermodell wurde gezeigt, dass durch Gentherapie (adoenovirale Expression von gegen HMGA-Transkripte gerichtete Antisense-RNAs) das Wachstum von verschiedenen Pankreaskrebs-Xenografts drastisch reduziert wird (Trapasso et al 2004).
HMGAl könnte weiterhin als prognostischer diagnostischer Marker verwendet werden, um zu bestimmen, welche Patienten von einer aggressiveren Krebstherapie profitieren würden. Es besteht eine enge Korrelation zwischen dem Grad der malignen Transformation und der Menge an exprimiertem HMGAl. Dies kann wiederum mit einer schlechten Prognose bei vielen menschlichen Krebstypen korreliert werden, wie Prostata- ( Tamimi 1996; Bussemakers 1991) und kolorektale Karzinome (Abe 1999) bzw. Neuroblastome (Giannini 2000).
HMGA-Proteine werden von vielen Viren als von der Wirtszelle bereitgestellte Kontrollfaktoren für die Expression viraler Gene oder als Cofaktoren, unter anderem von
• humanem Papovavirus JC (Leger et al 1995)
• Epstein-Barr- Virus (Schaefer et al 1997)
• Herpes-Simplex-Virus (Panagiotidis 1999 ; French et al 1996 )
• HIV-I Virus (Henderson et al 2000) verwendet.
Insbesondere werden HMGA Proteine mit der Regulation der Transkription einer Vielzahl viraler Gene in einer Wirtszelle in Verbindung gebracht. Beispiele hierfür sind die Regulation der Expression der frühen und spät expremierten Gene des humanen Papovavirus JC (Leger et al. 1995), Regulation des EBNAl (Epstein-Barr virus nuclear antigen 1) Gens des Ebstein- Bar Virus (EBV), welches mitverantwortlich für die Kontrolle viraler Latenz ist, (Schaefer et al. 1997), Regulation des IE-3 (immediate-early) Gens des Herpes Simplex Virus-1 (HSV-I), welches das frühzeitig expremierte Protein ICP4 codiert (Panagiotidis et al. 1999), Regulation des während der Latenzphase aktiven Promotors 2 des HSV-I (French et al. 1996) und Regulation des LTR (long terminal repeats) -Promotors des humanen HIV-I Virus (Henderson et al 2000).
Die Requirierung von HMGA seitens der Wirtszelle im Rahmen viraler Erkrankungen ist nicht nur auf virale Gen-Regulation beschränkt. HMGAl scheint auch eine entschiedene Rolle als architektonischer Kofaktor bei der Integration der viralen DNA des HIV-I Virus, des Moloney murinen Leukämie Virus (MoMuLv) und Sarkomen Geflügelgrippe Virus (ASV) in das menschliche Genom zu spielen und scheint somit ein interessanter therapeutischer Ansatz antiviraler Therapie zu sein (Van Maele et al. 2006, Li et al 1998, Hindmarsh et al. 1999)
Somit sind Inhibitoren von HMGA Proteinen auch zur Behandlung und der Diagnose von Virusinfektionen geeignet (Reeves & Beckerbauer 2002).
Infolge der vorstehend dargelegten Beteiligung von HMGA-Proteinen an verschiedenen Erkrankungen bzw. ihrer Eignung als diagnostische Marker, können dagegen gerichtete L- Nukleinsäure und insbesondere Spiegelmere für die Prävention, Therapie und Diagnose von eben diesen Erkrankungen verwendet werden. Besonders bevorzugte Spiegelmere sind dabei die hierin beschriebenen Spiegelmeren. In diesem Zusammenhang wird von den Fachleuten anerkannt werden, dass obwohl die einzelnen Spiegelmere für ein bestimmtes HMGA-Protein generiert worden sind, infolge des in Beispiel 2 dargestellten Domänen-Ansatzes diese auch eine Kreuzreaktivität mit anderen HMGA-Proteinen erlauben, wie sich auch aus dem in Fig. 2 dargestellten Alignment ergibt. Weiterhin wird von den Fachleuten auf dem Gebiet anerkannt werden, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren eine Reihe von Strukturmotiven aufweisen, die eine Klasse von Spiegelmeren definieren, die gegen HMGA-Proteine als intrazelluläre Rezeptoren binden. Die verschiedenen Strukturmotive werden detaillierter in Beispiel 1 weiter dargestellt.
Die erfϊndungsgemäßen Nukleinsäuren umfassen in einer bevorzugten Ausführungsform auch solche Nukleinsäuren, die im Wesentlichen homolog zu den spezifisch hierin offenbarten Sequenzen sind. Der Begriff „im Wesentlichen homolog" soll hierin bevorzugterweise so verstanden werden, dass die Homologie wenigstens 75 %, bevorzugterweise 85 %, bevorzugtererweise 90 % und am bevorzugtesten mehr als 95, 96, 97, 98 oder 99 % beträgt.
Der Begriff der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung soll weiterhin auch jene Nukleinsäuren umfassen, die Nukleinsäuresequenzen umfassen, wie sie hierin offenbart sind oder Teile davon, bevorzugterweise in dem Umfang, dass die Nukleinsäuren oder die besagten Teile davon an der Bindung an HMGA-Proteine beteiligt sind. Eine derartige Nukleinsäure kann von den hierin offenbarten abgeleitet werden, z. B. durch Verkürzung oder Trunkierung. Eine Verkürzung kann entweder ein oder beide Enden der Nukleinsäuren, wie sie hierin offenbart sind, betreffen. Eine Verkürzung kann auch die innere Sequenz aus Nukleotiden betreffen, d. h. sie kann Nukleotid(e) zwischen dem 5'- bzw. dem 3 '-terminalen Nukleotid betreffen. Darüber hinaus soll der Begriff Verkürzung auch die Deletion von so wenig wie einem einzelnen Nukleotid von der Sequenz der hierin offenbarten Nukleinsäuren betreffen. Verkürzung kann auch mehr als einen Bereich der erfindungsgemäßen Nukleinsäure(n) betreffen, wobei ein jeder dieser Bereiche so klein wie ein Nukleotid lang sein kann.
Die Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung können darüber hinaus entweder D- Nukleinsäuren oder L-Nukleinsäuren sein. Bevorzugterweise sind die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren L-Nukleinsäuren. Zusätzlich ist es möglich, dass ein oder mehrere Teile der Nukleinsäure als D-Nukleinsäuren vorliegt, oder wenigstens ein oder mehrere Teile der Nukleinsäuren L-Nukleinsäuren sind. Der Begriff „Teil" der Nukleinsäuren soll sowenig wie ein Nukleotid bezeichnen. Derartige Nukleinsäuren werden allgemein hierin als D- bzw. L- Nukleinsäuren bezeichnet. Deshalb bestehen in einer bevorzugten Ausführungsform die Nuk- leinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung aus L-Nukleotiden und umfassen wenigstens ein D-Nukleotid. Ein derartiges D-Nukleotid ist bevorzugterweise an einem Teil befestigt, der von dem/den Bereich(en) verschieden ist, die die Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung definieren, bevorzugterweise jenen Teilen davon, mit denen eine Wechselwirkung mit anderen Teilen der Nukleinsäuren erfolgt. Bevorzugterweise ist ein derartiges D- Nukleotid am Ende eines jeden Bereiches bzw. einer jeden Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung befestigt. In einer bevorzugten Ausführungsform können derartige D- Nukleotide als ein Spacer oder ein Linker fungieren, der bevorzugterweise Modifikationen wie PEG und HES an die Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung bindet.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfassen in einer Ausfuhrungsform die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren auch solche, die Teil einer längeren Nukleinsäure sind, wobei diese längeren Nukleinsäuren mehrere Teile umfassen können, wobei wenigstens ein Teil eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung oder ein Teil davon ist. Der andere Teil oder die anderen Teile dieser längeren Nukleinsäuren können entweder eine D-Nukleinsäure oder eine L-Nukleinsäure sein. Eine jegliche Kombination kann in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung und zu den Zwecken bzw. Verwendungen verwendet werden, wie sie für die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren hierin offenbart sind. Dieser andere Teil bzw. diese anderen Teile der längeren Nukleinsäure können eine Funktion aufweisen, die vom Binden und insbesondere vom Binden an HMGA-Protein, verschieden ist. Eine mögliche Funktion besteht darin, eine Wechselwirkung mit anderen Molekülen, z. B. zu Zwecken der Immobilisierung, Kreuzvernetzung, des Nachweises, der Amplifikation oder Modifikation oder Molekulargewichtserhöhung zu erlauben.
Insbesondere in diesem Zusammenhang sind L-Nukleinsäuren, wie hierin verwendet, Nukleinsäuren, die aus L-Nukleotiden bestehen, bevorzugterweise vollständig aus L-Nukleotiden bestehen.
Entsprechend sind insbesondere D-Nukleinsäuren, wie hierin verwendet, Nukleinsäuren, die aus D-Nukleotiden bestehen, bevorzugterweise vollständig aus D-Nukleotiden bestehen.
Unabhängig davon, ob die erfindungsgemäße Nukleinsäure aus D-Nukleotiden, L- Nukleotiden oder einer Kombination davon aus beiden besteht, wobei die Kombination, z. B., eine zufällige Kombination oder eine definierte Sequenz aus Bereichen ist, die aus wenigstens einem L-Nukleotid und wenigstens einer D-Nukleinsäure bestehen, kann die Nukleinsäure aus einem oder mehreren Desoxyribonukleotiden, Ribonukleotiden und Kombinationen davon bestehen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die aus mindestens einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in Kombination mit einer oder mehreren anderen Nukleinsäuren besteht, wobei die andere(n) Nukleinsäuren bevorzugterweise an von HMGA-Protein verschiedene Zielmoleküle bindet/binden oder eine von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren verschiedene Funktion ausübt/ausüben.
Die Konstruktion der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren als L-Nukleinsäure ist aus mehreren Gründen vorteilhaft. L-Nukleinsäuren sind Enantiomere von natürlicher Weise auftretenden Nukleinsäuren. D-Nukleinsäuren sind jedoch in wässrigen Lösungen und insbesondere in biologischen Systemen und in biologischen Proben infolge des umfänglichen Vorhandenseins von Nukleasen nicht sehr stabil. Natürlicherweise auftretende Nukleasen, insbesondere Nukleasen aus tierischen Zellen, sind nicht in der Lage, L-Nukleinsäuren abzubauen. Infolge dessen ist die biologische Halbwertszeit der L-Nukleinsäure in einem derartigen System, einschließlich des menschlichen und tierischen Körpers, signifikant erhöht. Infolge der fehlenden Abbaubarkeit von L-Nukleinsäuren werden keine Nuklease- Abbauprodukte erzeugt und somit werden keine dadurch bedingten Nebenwirkungen beobachtet. Dieser Aspekt grenzt die L- Nukleinsäure von faktisch allen anderen Verbindungen ab, die bei der Therapie von Erkrankungen und/oder Störungen verwendet werden und die Anwesenheit von HMGA oder dessen kausale Involvierung umfassen L-Nukleinsäuren, die spezifisch an ein Zielmolekül durch einen Mechanismus binden, der von dem Watsoη-Crick-Basenpaarung unterschiedlich ist, oder Aptamere, die teilweise oder vollständig aus L-Nukleotiden bestehen, insbesondere wobei jene Teile des Aptamers, die an der Bindung des Aptamers an das Zielmolekül beteiligt sind, werden als Spiegelmere bezeichnet.
Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, unabhängig davon, ob sie als D-Nukleinsäuren, L-Nukleinsäuren oder D-L- Nukleinsäuren vorliegen, und ob sie DNA oder RNA sind, als einzelsträngige oder dop- pelsträngige Nukleinsäuren vorhanden sein können. Typischerweise sind die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren einzelsträngige Nukleinsäuren, die infolge der Primärsequenz definierte Sekundärstrukturen aufweisen und somit auch Tertiärstrukturen ausbilden können. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können jedoch auch doppelsträngig sein in dem Sinne, dass zwei Stränge, die komplementär oder teilweise komplementär zueinander sind, miteinander hybridisiert sind. Dies verleiht den Nukleinsäuren Stabilität, was insbesondere vorteilhaft sein wird, wenn die Nukleinsäure in der natürlicherweise auftretenden D-Form statt der L-Form vorliegt.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können modifiziert werden. Derartige Modifikationen können einzelne Nukleotide der Nukleinsäure betreffen und sind in der Technik gut bekannt. Beispiele für eine derartige Modifikation sind, unter anderem, beschrieben in Venkatesan N. et al. (2003) Curr Med Chem. Oct;10(19):1973-91; Kusser, W.(2000) J Biotechnol, 74: 27-38; Aurup, H. et al. (1994) Nucleic Acids Res, 22, 20-4; Cummins, L.L. et al, (1995) Nucleic Ac- ids Res, 23, 2019-24; Eaton, B.E. et al. (1995) Chem Biol, 2, 633-8; Green, LS. et al., (1995) Chem Biol, 2, 683-95; Kawasaki, A.M. et al., (1993) J Med Chem, 36, 831-41; Lesnik, E.A. et al., (1993) Biochemistry, 32, 7832-8; Miller, L.E. et al., (1993) J Physiol, 469, 213-43. Eine derartige Modifikation kann beispielhaft ein H-Atom, ein F-Atom oder eine O-CH3-Gruppe oder NH2-Gruppe an der 2'-Position eines einzelnen Nukleotids sein, das in der Nukleinsäure enthalten ist. Darüberhinaus kann die Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung wenigstens ein LNA-Nukleotid umfassen. In einer Ausführungsform besteht die Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung aus LNA-Nukleotiden, bevorzugterweise vollständig aus LN A-Nukleotiden .
In einer Ausführungsform können die Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung eine mehrteilige Nukleinsäure sein. Eine mehrteilige Nukleinsäure, wie hierin verwendet, ist eine Nukleinsäure, die aus wenigstens zwei Nukleinsäuresträngen besteht. Diese wenigstens zwei Nukleinsäurestränge bilden eine funktionale Einheit, wobei die funktionale Einheit ein Ligand für ein Zielmolekül ist. Die wenigstens zwei Nukleinsäurestränge können von einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren abgeleitet werden entweder durch Spalten der Nukleinsäure, um zwei Stränge zu erzeugen, oder durch Synthetisieren von einer Nukleinsäure entsprechend einem ersten Teil der erfindungsgemäßen, d. h. Gesamtnukleinsäure, und einer weiteren Nukleinsäure entsprechend dem zweiten Teil der Gesamtnukleinsäure. Es wird anerkannt, dass sowohl die Spaltung als auch die Synthese verwendet werden kann, um eine mehrteilige Nukleinsäure zu erzeugen, wo mehr als die beiden beispielhaft oben beschriebenen Stränge Vorhandensein können. Mit anderen Worten, die wenigstens zwei Nukleinsäurestränge sind bevorzugterweise verschieden von zwei Strängen, die komplementär zueinander sind und miteinander hybridisieren, obwohl eine Komplementarität in einem bestimmten Umfang zwischen den verschiedenen Nukleinsäureteilen bestehen kann.
Die vorliegenden Erfinder haben festgestellt, dass die Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung einen sehr vorteilhaften KD-Wertebereich oder Dissoziationswertebereich und damit eine sehr vorteilhafte Bindungskonstante aufweisen. Ein Beispiel, um die Bindungskonstante zu bestimmen, ist die Verwendung eines Gleichgewichtsanbindungsassay , wie er in Beispiel 1 beschrieben ist.
Der KD- Wert der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren beträgt bevorzugterweise weniger als 1 μM. Ein KD- Wert von etwa ein μM soll für eine nicht-spezifische Bindung einer Nukleinsäure an ein Ziel charakteristisch sein. Wie von den Fachleuten anerkannt werden wird bewegt sich der KD- Wert einer Gruppe von Verbindungen wie beispielsweise der Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung, innerhalb eines bestimmten Bereiches. Der oben erwähnte KD von etwa 1 μM ist ein bevorzugterer oberer Grenzwert für den KD- Wert. Der bevorzugte untere Grenzwert für den KD von das Zielmolekül bindenden Nukleinsäuren kann etwa pikomolar oder niedriger sein. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die KD- Werte von einzelnen Nukleinsäuren, die an HMGA binden, bevorzugterweise innerhalb dieses Bereiches liegen. Bevorzugte Bereiche können ausgewählt werden, indem eine erste Zahl innerhalb dieses Bereiches ausgewählt wird, und eine zweite Zahl innerhalb dieses Bereiches. Bevorzugte obere Werte sind 0,25 μM, 0,1 μM, bevorzugte untere Werte sind 100 nM, 10 nM, 1 nM und 0,05 nM.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren binden bevorzugterweise an HMGAIb bei 37° C in Lösung mit einer Dissoziationskonstante KD<20 nM , wie in Beispiel 2 dargestellt.
Die Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung können eine beliebige Länge aufweisen unter der Voraussetzung, dass sie noch in der Lage sind, an das Zielmolekül zu binden. Es wird in der Technik anerkannt werden, dass bestimmte Längen der Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt sind. Typischerweise beträgt die Länge zwischen 15 und 120 Nukleotiden. Es wird von den Fachleuten weiterhin anerkannt werden, dass irgendeine ganze Zahl zwischen 15 und 120 eine bevorzugte mögliche Länge für die Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung ist. Bevorzugterere Bereiche für die Länge der Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung sind Längen von etwa 20 bis 100 Nukleotiden, etwa 20 bis 80 Nukleotiden, etwa 20 bis 60 Nukleotiden, etwa 20 bis 50 Nukleotiden und etwa 30 bis 50 Nukleotiden.
In einer^Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren modifiziert vorliegen. Eine besonders bevorzugte Form der Modifizierung ist die PEGylierung. Dabei handelt es sich um die Modifizierung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren durch Kopplung mit Polyethylenglycol (PEG) oder anderer Gruppen.
Infolge der hohen Stabilität der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, insbesondere in der Aus- führungsförm, dass diese als L-Nukleinsäuren vorliegen, ist eine direkte Gabe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zur Behandlung eines Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf, möglich. Bevorzugterweise werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren als physiologische Lösung zur lokalen oder systemischen Verabreichung bereitgestellt.
Neben der direkten Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zur Behadnlung, Prävention und Diagnostik der hierin beschrieben Erkrankungen kann diese einzeln oder in Kombination mit anderen in einer pharmazeutischen Zusammensetzumng vorliegen bzw. verwendet werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst somit wenigstens eine der Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung und bevorzugterweise einen pharmazeutisch akzeptablen Binder. Ein derartiger Binder kann ein jeglicher bekannter oder auf dem Gebiet bekannter Binder sein. Insbesondere ist ein derartiger Binder irgendein Binder, wie er im Zusammenhang mit der Herstellung des Medikaments beschrieben ist, wie hierin offenbart. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung ein weiteres pharmazeutisch aktives Agens. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass das hierin beschriebene Medikament die pharmazeutische Zusammensetzung darstellt, wie sie hierin beschrieben ist. Bevorzugterweise ist die pharmazeutische Zusammensetzung für die intravenöse Verabreichung. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass derartige pharmazeutische Zusammensetzungen intramuskulär, intraperitoneal, oder subkutan verabreicht werden können. Andere Wege der Verabreichung sind per orum oder intranasal, wobei diejenige Verabreichungsart bevorzugt ist, die am wenigsten invasiv ist, unter gleichzeitiger Beibehaltung der Wirksamkeit der pharmazeutischen Zusammensetzung bzw. des pharmazeutisch aktiven Agens.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren sind bevorzugterweise als solches oder im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen pharmazeutischen- Zusammensetzung in einem pharmazeutisch akzeptablen Lösungsmittel enthalten oder gelöst. Derartige Lösungsmittel sind insbesondere jene, die aus der Gruppe ausgewählt sind, Wasser, physiologische Kochsalzlösung, PBS, oder eine Glukoselösung, insbesondere eine 5% Glukose-Lösung umfasst. Ein derartiger Träger kann, z. B., Wasser, Puffer, PBS, Glucoselösung, bevorzugterweise eine 5% Glukoselösung (iso-osmotisch), Stärke, Zucker, Gelatine oder irgendeine andere akzeptable Trägersubstanz sein. Derartige Träger sind den Fachleuten auf dem Gebiet im allgemeinen bekannt.
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die pharmazeutische Zusammensetzung mindestens eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in ihren verschiedenen Ausfuhrungsformen enthält, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, die Nukleinsäure als Koηjugat, wie hierin beschrieben.
In einer weiteren Ausfuhrungsform umfasst das Medikament ein weiteres pharmazeutisch aktives Agens. Derartige weitere pharmazeutische aktive Agenzien sind beispielsweise Pro- teasehemmer, Proliferationsinhibitoren und Angiogenesehemmer und/ oder Agenzien die zystostatsich wirken. Alternativ oder zusätzlich ist ein derartiges weiteres pharmazeutisch aktives Agens eine weitere Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung. Alternativ umfasst das Medikament wenigstens eine oder mehrere Nukleinsäuren, die an ein Zielmolekül binden, das von HMGA verschieden ist oder eine Funktion aufweist, die verschieden ist von einer der Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kann für die Behandlung, Diagnose und/oder Prävention einer jeglichen der hierin beschriebenen Erkrankungen oder Störungen verwendet werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Behandlung eines Lebewesens, das einer derartiger Behandlung bedarf, wobei das Verfahren die Verabreichung einer pharmazeutisch aktiven Menge von wenigstens einer der Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst. In einer Ausführungsform leidet das Lebewesen unter einer Erkrankung oder es besteht das Risiko, dass es an einer derartigen Erkrankung erkrankt, wobei die Erkrankung eine jede der hierin offenbarten ist, insbesondere eine jede Erkrankung, die im Zusammenhang mit der Verwendung von einer der Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung für die Herstellung eines Medikaments beschrieben ist.
Obgleich sich die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren bereits aus der oben dargestellten Involvierung der HMGA-Proteine bei den verschiedenen Erkrankungen und Zuständen ergibt, soll auf diesen Aspekt im folgenden zur Veranschaulichung weiter eingegangen werden.
HMGA Proteine und deren Gene wurden insbesondere vermehrt mit der Diagnose und Prognose neoplastischer Erkrankungen in Verbindung gebracht und als potentielle Biomarker vorgeschlagen. In gesundem Gewebe ist das Expressionsniveau von HMGA la/b Proteinen sehr niedrig, wenn überhaupt detektierbar. Erhöhte HMGA la/b Proteinexpression ist charakteristisch für den Phänotyp einer Vielzahl von Tumoren und Metastasen unterschiedlichster Krebserkrankungen (Sarhadi et al. 2006, Balcercak et al. 2005, Bliese et al. 2006, Chang et al. 2005, Peters et al. 2005, Sato et al. 2005, Chiappetta et al.2004, Li et al. 2004 , Chuma et al. 2004 , Donato et al. 2004, Czyz et al. 2004, Kettunen et al. 2004, Lee et al. 2004, Chen et al. 2004, Abe et al. 2003, Blacerczak et al. 2003, Flohr et al. 2003 , Masciullo et al. 2003, Nam et al. 2003, Pierantoni et al. 2003). Hohe HMGA-Proteinexpression korreliert signifikant mit einer schlechten Prognose und der Entstehung von Metastasen. Die Detektion des HMGAl a/b Expressionsniveaus in Biopsien und deren histologischen Charakterisierung stellt einen diagnostischen Ansatz zur Früherkennung, Prognose und Identifizierung von neoplastischen Erkrankungen dar, insbesondere den vorstehend dargestellten Erkrankugnen und Zuständen. Des Weiteren ist in der Literatur eine Assoziation von HMGAl Proteinen mit arteriosklerotischen Plaques beschrieben (Schlueter et al. 2005.). HMGAl reguliert CD44, eines der hauptsächlichen Zielgene für die Entstehung von Plaques. Dabei zeigte im Vergleich zum umliegenden Gewebe, dass die betroffene Regionen wie neointimale, vaskuläre glatte Muskelzellen, Makrophagen und neue Blutgefäßen eine starke Expression von HMGAl aufweisen. HMGAl scheint hierbei einer der Mediatoren bei der Entstehung von Plaques zu sein und stellt so ein Zielmolekül für die Diagnostik dar.
Die hier beschriebenen L-Nukleinsäuren und insbesondere die Spiegeimer, die HMGA la/b binden,. - können im Rahmen der dem Fachmann bekannten Methoden ähnlich Antikörpern eingesetzt werden. Bisher sind nur sehr wenig spezifische (differenzierende) und affine Antikörper gegen HMGAl identifiziert worden und kommerziell erhältlich. Dies scheint durch die nicht vorhandene Sekundärstruktur von HMGAl bedingt zu sein, welche kein geeignetes Ziel für den MHC Komplex bei der Generierung von Antikörpern darstellt.
Vor diesem Hintergrund konnte hierin überraschenderweise gezeigt werden, dass das biotiny- lierte HMGAl a/b bindende Spiegeimer 5 '-bio-NOX-A50 im Western Blot HMGAl a/b als einzelne Bande in Krebszelllinien erkennt. Des Weiteren konnte - wie in Beispiel 2 beschrieben - rekombinant expremiertes HMGAIb Protein detektiert werden. Die Detektion des bioti- nylierten Spiegeimers erfolgt beispielsweise über einen anti-Biotin Antikörper konjugiert mittels Horse Raddish Peroxidase (HRP).
Einen weiteren Ansatz stellt in die in-vivo Diagnostik vom HMGA la/b dar, bei der die erfi- undungsgemäßen Nukleinsäuren verwendet werden können. Tumore und Metastasen sind oft eingebettet von nekrotischen Tumorzellen, welche HMGAl a/b in das umliegende Gewebe abgeben. Die Detektion des extrazellulären HMGA la/b- stellt einen Ansatz der Diagnose vom in gesunden Gewebe eingebetteten Tumoren und Metastasen dar.
Wie bevorzugterweise hierin verwendet ist ein Diagnostikum oder diagnostisches Agens oder diagnostisches Mittel in der Lage, entweder direkt oder indirekt ein HMGA-Protein, bevorzugterweise HMGA la/b, wie hierin beschrieben, nachzuweisen und bevorzugtererweise HMGAla/b, wie hierin beschrieben im Zusammenhang mit den verschiedenen Störungen und Erkrankungen. Das Diagnostikum ist geeignet für den Nachweis und/oder die Nachsorge für eine jegliche der hierin beschriebenen Krankheiten bzw. Erkrankungen. Ein derartiger Nachweis ist möglich durch die Bindung der Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung an HMGAl a/b. Ein derartiges Binden kann entweder direkt oder indirekt nachgewiesen werden. Die entsprechenden Verfahren und Mittel sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Unter anderem können die Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung eine Markierung umfassen, die den Nachweis der Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung erlaubt, bevorzugterweise der Nukleinsäure, die an HMGA-Protein und bevorzugterweise HMGAl a/b gebunden ist oder binden kann. Eine derartige Markierung ist bevorzugterweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus radioaktiven, enzymatischen und Fluoreszenz-Markierungen. Im Prinzip können alle bekannten Tests, die für Antikörper entwickelt worden sind, für die Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung angepasst werden, wobei der Zielmolekül- bindende Antikörper durch eine Zielmolekül-bindende Nukleinsäure ersetzt ist. In Antikörper-Tests, die unmarkierte Zielmolekül-bindende Antikörper verwenden, erfolgt der Nachweis bevorzugterweise durch einen Sekundärantikörper, der mit radioaktiven, enzymatischen oder Fluoreszenz-Markierungen modifiziert ist und an den Zielmolekül-bindenden Antikörper an seinem Fc-Fragment bindet. Im Falle einer Nukleinsäure, bevorzugterweise einer Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung, ist die Nukleinsäure mit einer derartigen Markierung modifiziert, wobei bevorzugterweise eine derartige Markierung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Biotin, CY-3 und CY-5, und eine derartige Markierung nachgewiesen wird durch einen Antikörper, der gegen eine derartige Markierung gerichtet ist, z. B. ein anti- Biotin-Antikörper, ein anti-CY-3-Antikörper oder ein anti-CY5-Antikörper oder in dem Fall, dass die Markierung Biotin ist, wird die Markierung durch Streptavidin oder Avidin nachgewiesen, das natürlicherweise an Biotin bindet. Ein derartiger Antikörper, Streptavidin oder Avidin ist wiederum bevorzugterweise mit einer entsprechenden Markierung modifiziert, z. B. einer radioaktiven, enzymatischen oder Fluoreszenz-Markierung, analog einem Sekundärantikörper.
In einer weiteren Ausführungsform werden die Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung nachgewiesen oder analysiert durch ein zweites Nachweismittel, wobei das Nachweismittel ein molekularer Leuchtturm (engl, „molecular beacon") ist. Die Technik der molekularen Leuchttürme ist den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Kurz gesagt sind diese molekularen Leuchttürme Nukleinsäuresonden, die ein reverses Komplement zu der nachzuweisen- den Nukleinsäureprobe sind, und hybridisieren deshalb mit einem Teil der nachzuweisenden Nukleinsäureprobe, die es nachzuweisen gilt. Nach Binden der Nukleinsäureprobe werden die Fluorophorgruppen des molekularen Leuchtturms voneinander getrennt, was zur Änderung des Fluoreszenzsignals fuhrt, bevorzugterweise eine Änderung der Intensität. Diese Änderung korreliert mit der Menge an vorhandener Nukleinsäureprobe.
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren im Rahmen der verschiedenen hierin offenbarten Aspekte entsprechend als L-Nukleinsäuren verwendet werden können.
Die erfmdungsgemäßen Nukleinsäuren können weiterhin als Ausgangsmaterial für das Design von pharmazeutischen Wirkstoffen (engl, drug design) verwendet werden. Grundsätzlich gibt es hierzu zwei mögliche Ansätze. Ein Ansatz besteht in dem Screening von Bibliotheken von Verbindungen, wobei derartige Bibliotheken von Verbindungen bevorzugterweise Bibliotheken von niedermolekularen Verbindungen (engl, low oder small molecules) sind. Derartige Bibliotheken sind den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt. In einer Ausführungsform, ist das Screening ein Hochdurchsatzscreening. Bevorzugterweise ist Hochdruchsatzscreening schnell, effizient und wird als Versuch-und-Fehler-Evaluation („Trial-and-Error-Evaluation") von Wirkstoffen in einem Zielmolekül-basierten Assay durchgeführt.
Alternativ können gemäß der vorliegenden Erfindung die Nukleinsäuren für das rationale Design von Wirkstoffen verwendet werden. Bevorzugterweise ist das rationale Design von Wirkstoffen das Design eines pharmazeutischen Wirkstoffkandidaten. Beginnend von der dreidimensionalen Struktur des Zielmoleküls, die üblicherweise durch Methoden wie Röng- tenstrukturanalyse oder Magnetresonanzspektroskopie (NMR = nuclear magnetic resonance spectroscopy) bestimmt wird, werden Computerprogramme verwendet, um Datenbanken mit Strukturen einer Vielzahl verschiedener chemischer Verbindungen zu durchsuchen. Die Auswahl wird dabei von dem Computer durchgeführt. Die ausgewählten Verbindungen werden zusätzlich im Labor getestet.
Das rationale Design von Wirkstoffen kann dabei seinen Ausgangspunkt von irgendeiner der Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung nehmen und umfaßt eine Struktur, insbesondere eine dreidimensionale Struktur, die ähnlich der Struktur der erfindungsgemäßen Nuk- leinsäure(n) ist oder identisch ist zu dem Teil der Struktur der erfindungsgemäßen Nuklein- säure(n), die die Bindung an HMG-Proteine vermittelt. In einem jeden Fall zeigt eine derartige Struktur noch das gleiche oder ein zumindest ähnliches Bindungsverhalten, wie die erfin- dungsgemäße(n) Nukleinsäure(n). In entweder einem weiteren Schritt oder als ein alternativer Schritt wird bei dem rationalen Design von Wirkstoffen die bevorzugterweise dreidimensionale Struktur jener Teile der an HMG-Proteine bindenden Nukleinsäuren durch chemische Gruppen nachgeahmt, die bevorzugterweise verschieden sind von Nukleotiden und Nukleinsäuren. Durch dieses Nachahmen, auch als Mimikry bezeichnet, kann eine Verbindung konstruiert werden, die von der Nukleinsäure bzw. den Nukleinsäuren verschieden ist, die als Ausgangsmaterialien für das rationale Design des Wirkstoffes verwendet wurde. Eine derartige Verbindung oder Wirkstoff ist bevorzugterweise ein kleines Molekül (engl, small molecu- Ie) oder ein Peptid.
Im Falle des Screenings von Verbindungsbibliotheken unter Verwendung kompetitiver Tests, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, können geeignete HMG-Analoga, HMG- Agonisten und HMG-Antagonisten gefunden werden. Derartige kompetitive Assays können wie folgt aufgebaut sein. Die erfindungsgemäße Nukleinsäure, bevorzugterweise ein Spiegeimer, d. h. eine das Zielmolekül bindende L-Nukleinsäure, wird an eine bevorzugterweise feste Phase gekoppelt. Um HMG-Analoga zu identifizieren, wird mit einer Markierung versehenes HMG-Protein zu dem Testsystem hinzugegeben. Alternativ könnte auch das HMG- Protein an eine feste Phase gekoppelt werden und die erfindungsgemäße Nukleinsäure könnte markiert sein. Ein potentielles Analogon bzw. ein potentieller Agonist oder Antagonist würde mit den HMG-Molekülen, die an das Spiegeimer binden, kompetitieren, was mit einer Abnahme des Signals, das von der entsprechenden Markierung erhalten wird, einhergehen würde. Das Screenen auf Agonisten oder Antagonisten kann die Verwendung eines Zellkultur- Testsystems umfassen, das den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist.
In einem weiteren Aspekt können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren infolge ihres charakteristischen Bindungsverhaltens an HMG-Protein für die Targetvalidierung („Target" ist englisch für „Zielmolekül") verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können in einem ex vivo-Organmodell verwendet werden, um die Funktion von HMG-Protein zu studieren. Grundsätzlich existieren ex vivo Modelle, in denen HMG- Agonisten/ Antagonisten getestet werden können. Ein Kit gemäß der vorliegenden Erfindung kann wenigstens eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren umfassen. Zusätzlich kann der Kit wenigstens eine oder mehrere Positiv- oder Negativkontrollen umfassen. Als Positivkontrollen kann z. B. HMG-Protein verwendet werden, gegen das die erfindungsgemäße Nukleinsäure gescreent wurde, oder an die diese bindet, bevorzugterweise in flüssiger Form. Als Negativkontrolle kann unter anderem ein Peptid verwendet werden, welches sich hinsichtlich seiner biophysikalischen Eigenschaften ähnlich wie HMG-Protein verhält, welches jedoch nicht durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren erkannt wird oder ein Peptid mit gleicher Aminosäurezusammensetzung aber von HMG-Protein verschiedener Sequenz.
Weiterhin kann der Kit einen oder mehrere Puffer umfassen. Die verschiedenen Bestandteile können in dem Kit in trockener oder lyophilisierter Form, oder gelöst in einer Flüssigkeit vorliegen. Der Kit kann eine oder mehrere Behältnisse umfassen, die wiederum ein oder mehrere der Bestandteile des Kits enthalten können. Bevorzugterweise enthalten die Gefäße Reaktionsansätze, wie sie für eine einmalige Durchführung eines Experimentes unter Verwendung einer oder mehrerer Bestandteile des Kits erforderlich sind.
Es wird anerkannt werden, dass, sofern nicht gegenteiliges angegeben ist, die hierin angeführten Sequenzen in 5 '-3 '-Richtung angegeben sind. Weiterhin wird anerkannt werden, dass der Begriff, das zwei Abschnitt miteinander hybridisieren, hierin so verstanden wird, dass die Abschnitte in vitro aufgrund von allgemeinen Basenpaarungsregeln hybridisieren können, oder dass die Abschnitte unter den Bedingungen der Anwendung hybridisieren oder hybridisieren können, jedoch nicht notwendigerweise miteinander unter den Bedingungen der Anwendung hybridisiert sind bzw. hybridisiert vorliegen.
Die verschiendenen SEQ.ID., der chemische Aufbau der Nukleinsäuren wie hierin offenbart und das Zielmolekül HMGA Ia/ Ib wie hierin verwendet, die tatsächlichen Sequenzen und die interne Referenz sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass, sofern für die einzelnen Abschnitte der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren keine Sequenzen explizit angegeben sind, diese gemäß der hierin offenbarten technischen Lehre frei gewählt werden können, d. h. so gewählt werden können, dass sie das erforderliche Bindungsverhalten an das jeweilige Zielmolekül zeigen und/oder die hierin beschriebenen Strukturen, insbesondere Sekundärstrukturen auszubilden in der Lage sind.
Weiterhin ist es im Rahmen von bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, dass für den Fall, dass in Sequenzen, die als RNA-Sequenzen bezeichnet werden, T statt U angegeben sind, T für U stehen soll.
Die vorliegende Erfindung wird weiter anhand der folgenden Figuren und Beispiele erläutert, aus denen sich weitere Merkmale, Ausfuhrungsformen und Vorteile ergeben. Dabei zeigt
Fig. IA durch in vitro Selektion gegen D-21AS-HMGAla/b erzeugte Aptamere, die die 21 AS-HMGAl a/b-Domäne binden;
Fig. IB eine Darstellung der identifizierten, wiederholt auftretenden Sequenzbereiche der durch in vitro Selektion gegen D-2 IAS -HMGA la/b erzeugten Aptamere, die die 2 IAS- HMGAla/b-Domäne binden;
Fig. 2 einen Sequenzvergleich von HMGAl a/b und HMGA2;
Fig.3 eine Verkürzung von HMGA 1 a/b-bindendem Aptamer NOX- f;
Fig. 4 die Bindungseigenschaften von verkürzten HMGAl a/b-bindendem Aptamer NOX-f; Fig. 5 einen Kompetitionsassay zur Messung der Bindung von HMGA an die doppelsträngi- ge natürliche Ziel-DNA im Multiwellplatten-Assay; die Bindung des Spiegeimers kompetiert mit der Bindung des rekombinanten HMGAIb an die biotinylierte dsDNA (AT-hook Motiv). Die Detektion des gebundenen HMGAIb erfolgt über den His-Tag per Nickel-HRP, welche ein Substrat in fluoreszierendes Signal umsetzt; Fig. 6 einen Vergleich von Spiegeimer NOX-A und Spiegelmmer NOX-f (48nt; 33nt) im kompetitiven Multiwellplatten-Assay; Spiegeimer NOX-A, sowie Spiegeimer NOX-f und dessen verkürzte Variante Spiegeimer NOX-D3 verhindern im Plattenassay die Bindung von rekombinaten HMGAIb an seinen natürlichen vorkommenden Bindungspartner im niedrig nanomolaren Bereich.
Fig. 7 die Aktivität von 2kDa-PEG-gekoppeltem Spiegeimer NOX-A sowie nichtfunktionalem Kontrollspiegelmer im kompetitiven Multiwellplatten-Assay; das PEGylierte Spiegeimer NOX-A kompetiert die Bindung von rekombinantem HMGAIb an das AT-Hook- Motiv der dsDNA mit einer IC50 von 15nM; das inverse Kontroll-Spiegelmer von NOX-A zeigt bei hohen Spiegeimerkonzentrationen eine unspezifische Interaktion mit HMGAIb;
Fig. 8 eine Western Blot; Nachweis von immobilisiertem HMGAIb durch biotinyliertes Spiegeimer; rekombinantes HMGAIb wandert im elektrophoretischen Feld wie ein 2OkDa großes Protein und kann bei niedrigen Konzentrationen (3nM) durch das biotinylierte Spiegeimer (hier am Beispiel von NOX-A) erkannt werden; ein inverses Kontroll Spiegeimer konnte HGMGAIb nicht erkennen;
Fig. 9: die Aktivität von freiem und PEGyliertem Spiegeimer NOX-A im kompetitiven Multiwellplatten-Assay;
Fig. 10: eine Untersuchung der Verpackung von PEGyliertem Spiegeimer in Mizellen im "RiboGreen exclusion assay";
Fig. 11 die Stabilität von PEI-Spiegelmer-Mizellen im "RiboGreen exclusion assay";
Fig. 12 die effiziente Aufnahme von in PEI-Mizellen verpacktem Spiegeimer, genauer einen Vergleich der Transfektion von „nacktem" Spiegeimer im Vergleich zu in Mizellen verpackten Spiegelmeren am Beispiel von Spiegeimer NOX-A-3'PEG2kDa.; die Zellen die mit Spiegeimer-Mizellen transfiziert wurden, zeigten bei geringerer Einstellung der Sensitivi- tät der Kamera (camera gain) eine stärkere Fluoreszenz im Zytosol verglichen mit Zellen die nur mit reinem Spiegeimer inkubiert wurden; die Effizienz lag bei beiden Transfektions- methoden bei >95%; Fig. 13 die Freisetzung von Spiegeimer aus dem endosomalen Kompartiment; Spiegeimer Mizellen zeigten eine deutlich höhere Fluoreszenz im Vergleich zu reinem Spiegeimer; Spiegelmer-Mizellen zeigten ein punktuelles perinukleäres, sowie zytoplasmatisches Verteilungsmuster; die punktuelle Verteilung weist auf eine Lokalisation in endosomalen Kompartimenten hin; die diffuse Verteilung im Zytosol und an der Plasmamembran deutet auf aus Endosomen freigesetztes Spiegeimer hin;
Fig. 14 einen Proliferationsassay mit "nacktem" Spiegeimer; dosisabhängige Hemmung der Proliferation von MCF-7 Zellen bei hohen Spiegeimerkonzentrationen nach 2 Tagen im Zellkulturmedium (Quantifizierung über Resazurin);
Fig. 15 die Proliferation von H1299-Zellen ("non-small cell lung Cancer") nach Behandlung mit PEI-verpacktem NOX-A-2kDa PEG; Hemmung der Proliferation von H- 1299 Zellen bei 1 μM Spiegeimer, appliziert als PEI-Spiegelmer-Mizellen (N/P 2,5); NOX-A zeigte eine geringe Hemmung der Proliferation im Vergleich zum Kontroll-Spiegelmer ;
Fig. 16 die Inhibierung der HMGAl a/b-induzierten cdc25a-Genexpression, nachgewiesen durch quantitative RT-PCR; Bestimmung der spezifischen Hemmung der cdc25a mRNA Expression in H-1299 Zellen durch lμM NOX-A Spiegelmer-Mizellen (N/P 2,5) mittels RT-PCR;
Fig. 17 Dosisabhängige Inhibition der cdc25a mRNA-Expression durch Spiegeimer
NOX-A; Quantifizierung der Dosis-abhängigen Hemmung der cdc25a mRNA Expression in Hl 299 Zellen mittels RT-PCR; NOX-A Spiegelmer-Mizellen (N/P 2,5) zeigten ab 25OnM eine spezifische Hemmung der cdc25a mRNA Expression; bei einer Konzentration >4μM zeigte sich ein unspezischer Effekt des Kontroll-Spiegelmers, sowie toxische Effekte des Po- lyethylenimins (PEI) bei > lOμM (Daten nicht gezeigt);
Fig. 18 die Hemmung des Tumorwachstums im Xenograft-Modell in Nacktmäusen durch das Spiegeimer NOX-A; Inhibition des Tumorwachstums nach subkutaner Injektion von PSN-I Zellen durch 2mg/kg Spiegelmer-Mizellen (N/P 2,5). Spiegeimer NOX-A zeigte eine deutliche Reduktion des Tumorwachstums; Fig. 19 die statistische Analyse der Daten aus dem Xenograft- Versuchs; Inhibition des
Tumorwachstums nach subkutaner Injektion von PSN-I Zellen durch 2mg/kg Spiegelmer- Mizellen (N/P 2,5); Endpunktanalyse und Darstellung als Box-andWhisker-plot. NOX-A bewirkte eine hoch signifikante Verringerung des Tumorwachstums (p=0,0098 gegenüber PBS und p=0,022 gegenüber inversem Kontroll-Spiegelmer);
Fig. 20: die Gewebeverteilung von Spiegeimer NOX-A im Xenograft-Versuch; quantitative Analyse der Verteilung von Spiegeimer NOX-A in Plasma und Geweben; Im Tumorgewebe war im Vergleich zu den anderen Geweben und Plasma eine hohe Konzentration an Spiegeimer NOX-A nachweisbar.
Fig. 21 : Gewebeverteilung von in Mizellen verpacktem und unverpacktem Spiegeimer
24 und 96 Stunden nach der letzten Injektion im Xenograft-Versuch; quantitative Analyse der Verteilung eines unfunktionalen Spieglemers in Plasma und Geweben; im Tumorgewebe war im Falle eines in Mizellen verpackten Spiegeimers im Vergleich zu den anderen Geweben und Plasma eine deutlich erhöhte Konzentration an Spiegeimer sowohl nach 24 als auch nach 96 Stunden nachweisbar.
Fig. 22: Verteilung von in Mizellen verpacktem und unverpacktem Spiegeimer im
Plasma und im Tumor 24 und 96 Stunden nach der letzten Injektion im Xenograft-Versuch; quantitative Analyse der Verteilung eines unfunktionalen Spieglemers in Plasma und Tumor; Im Tumorgewebe war im Falle eines in Mizellen verpackten Spiegeimers im Vergleich zu unverpackten Spiegeimers eine deutlich erhöhte Konzentration an Spiegeimer sowohl nach 24 als auch nach 96 Stunden nachweisbar. Beispiel 1: HMGAl a/b-bindende Spiegelmere
1.1 HMGAl a/b-bindende Sequenzen
Die HMGAl a/b-bindenden RNA-Spiegelmere wurden durch in vitro Selektion gegen D-21 AS-HMGAl a/b und nachfolgende Verkürzungschritte generiert. Die erzeugten Aptame- re, die die 21 AS-HMGA la/b-Domäne binden, sind in Fig. IA dargestellt.
1.1.1 Ranking auf Aptamerebene
Die unterschiedlichen Klone (siehe Fig . IA) wurden als Aptamere (D-RNA) mittels Stan- dard-Phosphoramidit-Synthese hergestellt und am 5 '-Ende durch Kinasierung radioaktiv markiert (siehe unten). Die Klone wurden anschließend bei zwei Konzentrationen an D-bio-21aa HMGAl a/b mittels Gleichgewichtsanbindungsassay hinsichtlich Ihrer Affinität und Aktivität analysiert.
Radioaktive Markierung durch Kinasierung:
Substanz [final]
RNA 5 μM
T4 Forward Reaction Buffer (Invi trogen) Ix
T4 Polynucleotide Kinase (Invi trogen) 10 U/ 10 μlReaktionsansatz
[Y-32P]-ATP 1 μl/10 μlReaktionsansatz
Die Reaktion lief für eine Stunde bei 370C und wurde dann durch Erhitzen (10 min bei 65°C) gestoppt. Die Abtrennung radioaktiver Nukleotide von markierten Oligonukleotiden erfolgte über eine analytische Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) (siehe folgend). Danach erfolgte eine „Crush-and-Soak"-Gel-Elution mit Ammoniumacetat und eine Ethanolfällung (siehe folgend). Die Menge der aufgereinigten RNA wurde über die Radioaktivtät des Pellets (nach der Fällung) im Verhältnis zur Radiokativität der ausgeschnittenen Bande abgeschätzt.
PolyacryΙamid-Gelelektrophorese (PAGE)
Zur präparativen Reinigung von Oligonukleotiden wurden den Reaktionsansätzen 14 bis 2 Volumina konzentrierten Probenpuffers für denaturierende PAGE hinzugefügt. Zusätzlich wurden bei Bedarf Größenstandards vorbereitet (je 250 pmol) und in Probenpuffer aufge- nommen. Die Ansätze wurden 5 min bei 950C denaturiert und auf Eis abgekühlt. Ein präpara- tives, denaturierendes 7 %iges oder 10 %iges PAA-GeI (20O x 20O x 1,5 mm) wurde durch Anlegen der Spannung von maximal 600 V bei 40-50 W vortemperiert (ca. 1 h). Nach Spülen der Taschen mit Ix TBE wurden die Proben aufgetragen. Nach Abschluß der Trennung (50 min bei 50 W) wurde das Gel auf eine durch Klarsichtfolie geschützte, fluoreszierende Dünnschicht-Chromatographie-Platte (Farbstoff 60F254) gelegt. Mittels UV-Licht (254 nm) konnten die Banden als Schatten visualisiert werden („UV-Shadowing") und mit einem Skalpell ausgeschnitten werden. Danach erfolgte eine „Crush-and-Soak"-Gel-Elution mit Ammo- niumacetat.
„Crush-and-Soak"-Gel-Elution
Zur Elution von Oligonukleotiden aus PAA-Gelen wurde nach Zerkleinerung der ausgeschnittenen PAA-Gel-Banden mit einer Pipettenspitze oder einem Spatel 500 μl Ammoniumacetat (2 M) zugegeben. Die „Crush-and-Soak"-Elution wurde 2 x 1,5 h bei 680C in einem Thermo- schüttler (1000 U/min) durchgeführt. Die Überstände wurden durch „Ultrafree-MC-Säulchen (Millipore/Amicon, Schwalbach, Germany) in einer Tischzentrifuge (16.100 x g) von Gelresten befreit. Die so eluierte RNA wurde dann mittels einer Ethanolfällung entsalzt.
Ethanolfällung
Zur Ethanolfällung wurden 1-2 μl Glycogen als Fällungshilfsmittel eingesetzt. Nach Zugabe von 2,5 Volumen absoluten Ethanols und „Vortexen" wurden die Oligonukleotide 30 min bei -800C gefällt und 30 min bei 16.100 x g, 4°C abzentrifugiert. Das Pellet wurde Ix mit 70 %igem Ethanol gewaschen und 5 min bei 16.100 x g, 4°C zentrifugiert.
Aufnahme von Bindungsisothermen im Gleichgewichts-Anbindungs-Assay
Je 2 ρmol der 5 '-radioaktiv markierten Aptamere wurden in Biotinyl-D-HMGAla/b-21mer (EPSEVPTPKRPRGRPKGSKNK [Seq. ID. 17]; siehe Fig. 2), wurde hergestellt von Bachern (Weil am Rhein, Deutschland). Lösungen im Konzentrationsbereich von 1 - 3000 nM (oder zur Zwei-Punkt-Mesung mit 30O nM und 3O nM oder 10O nM und 1O nM Peptid) für eine Stunde bei 37°C in Selektionspuffer (1OmM Tris HCl pH7,4, 5mM KCl, 0,8mM MgC12, 0,1% Tween) inkubiert. Als Hintergrundkontrolle diente eine Lösung ohne Biotinyliertes-D- HMGAl a/b-21mer. Peptid und Komplexe wurden anschließend mit 10 μl Streptavidin Ultra- Link Gel innerhalb von 30 min bei 37°C immobilisiert. Die Radioaktivität der Suspension wurde bestimmt. Der Überstand wurde abgenommen. Dann wurde die Matrix einmal mit 100 μl Selektionspuffer gewaschen und dann mit Selektionspuffer aufgefüllt. Durch Messung der Radioaktivität wurde für jede Peptidkonzentration der mit Biotinyl-D-HMGAla/b-21mer im Komplex vorliegende Aptamer- Anteil ermittelt. Durch grafische Auftragung und Fit (Gra- Fit, Version 4.0.10, Erithacus Software) konnten die Dissoziationskonstante der aktiven Spezies und der Anteil aktiver Moleküle ermittelt werden.
Ergebnisse
Für alle als Aptamere (D-RNA) synthetisierten Klone wurde im Gleichgewichtsanbindungsas- say eine Dissoziationskonstante für die Bindung an das 21 Aminosäure lange D-Fragment von HMGAla/b (Biotinyl-D-HMGAla/b-21mer) von 8 - 22 nM ermittelt (Fig. IA).
1.1.2 Verkürzung am Beispiel 132-B3
Alle Kandidaten der Selektionen zeigten ein repetitiv auftretendes Sequenzmotiv GGGCG bzw. GGGUG bzw. GGGAG, welches am 5 'und am 3 '-Ende von einem Helix/ Stem-Motiv stabilisiert wird (Fig. 3).
Eine Analyse der voraussichtlichen Struktur und Faltung der RNA-Aptamere nach Zuker (Nucleic Acids Res. 2003 JuI l;31(13):3406-15) ergab, dass sich die vorgegebene Stern/ He- lix-Struktur in einigen verlängert hat (132-C3, 132-B3, 132-C4, 132-E2, 132-A2, 132-H1, 132-F1, 122-G2, 122-E2, siehe Fig. IA). Diese Stem-Helix-Struktur stellte die Grundlage für die weitere Verkürzung dieser Kandidaten dar. Diese weitere Verkürzung der Kandidaten erfolgte über die Identifizierung und Stabilisierung des minimalen Bindungsmotivs über FaI- tungs- und anschließende Deletionsanalyse der synthetischen D-RNAs im Hinblick auf die Bindung an das HMGAla/b Fragment. Die Bestimmung dieser Bindungseigenschaften erfolgte per Gleichgewichtsanbindungsassay. Fig. 3 zeigt exemplarisch am Kandidaten NOX-f (132-B3) die Verkürzung des Aptamers auf Grundlage der stabilisierenden Stem-Struktur, die in verlängerter Form bei den Kandidaten 132-C3, 132-B3, 132-C4, 132-E2, 132-A2, 132-H1, 132-F1, 122-G2, 122-E2 (siehe Fig. IA) zu finden ist. Eine Verkürzung auf eine 32 Nukleotide lange Aptamer- Variante von NOX-f mit einem 6 Nukleotide langen Stern (NOX-f 32nt) führte zu keinem Verlust der Bindungseigenschaften an das 21aa HMGAla/b Fragment (Fig. 3 und 4). Das artifϊzielle Einfügen eines Adenosins an der dritten Position des 5 '-ständigen Stern führte zu einer theoretischen Ausbildung eines 7 Nukleotid langen Sterns ohne ausgeloopten Bereich und diente zur Komplettierung des Sterns im 3 '-Bereich (NOX-f 33nt, Fig. 3 und 4). Die Messung der Bindungseigenschaften (Affinität und Aktivität) mittels Gleichgewichtsanbindungsassay an die 21 Aminosäure lange Domäne von HMGAl a/b wurde nicht von diesen Veränderungen beeinflusst.
Die Sequenzen 132-G2, 122-A1, 122-C1, 122-B2 und 122-B4 weisen dagegen am 5'-Ende und 3'-Ende des repetitiv aufretenden Sequenzmotivs (GGGCG bzw. GGGUG bzw. GGGAG) eine deutlich kürzere Stem-Struktur auf. Eine Verkürzung derselben führte zu einem Verlust an Bindung. Eine mögliche Verkürzung des für diese Sequenzen längeren, zentralen Bereichs zwischen dem repetitiven Sequenzmotivs (GGGCG bzw. GGGUG bzw. GGGAG) wurde nicht vorgenommen.
Die Seq.-ID's der Aptamersequenzen der hierin offenbarten HMGA-bindenden Nukleinsäuren sind wie folgt:
Wie hierin bereits dargelegt und den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt, bindet das aus L- Nukleotiden bestehende Enantiomer eines Aptamers, d.h. einer D-Nukleinsäure, das gegen ein D-Peptid erzeugt wurde, an das spiegelbildliche Enantiomer des D-Peptids, d.h. das L- Peptid, wie es natürlicherweise vorkommt. Diese L-Nukleinsäure wird hierin auch als Spiegeimer bezeichnet und weist ansonsten grundsätzlich die gleichen Bindungseigenschaften wie das Aptamer auf.
1.2 Charakteristische Eigenschaften von HMGAl a/b-bindenden Spigegelmeren
1.2.1 Repetitive Sequenzelemente: Box Al und Box A2
Charakteristisch für alle Spiegelmere, die gegen HMGA la/b binden, ist ein repetitives Sequenzelement der Sequenz GGGCG bzw. GGGUG bzw. GGGAG. Dieses Sequenzelement taucht zweimal in HMGAl a/b-bindenden Spiegelmeren auf (Fig. IA und IB). Das dem 5'- Ende der Spiegelmere näher liegende Sequenzelement wird hierin als Box Al bezeichnet. Das dem 3 '-Ende der Spiegelmere näher liegende Sequenzelement wird dagegen hierin als Box A2 bezeichnet. Box Al und Box A2 und ihre Anordnung zueinander stellen wahrscheinlich das entscheidende Merkmal HMGAl a/b-bindender Spiegelmere dar.
1.2.2 Sequenzabschnitt zwischen Box Al und Box A2
Zwischen Box Al und Box A2 liegt entweder ein Sequenzabschnitt mit einer Länge von sechs bis sieben Nukleotiden oder 12 bis 22 Nukleotiden (Fig. IA und IB). Da sich diese Sequenzabschnitte nicht nur in ihrer Länge unterscheiden, werden sie getrennt abgehandelt.
Fall 1 : Sequenzabschnitt umfasst sechs bis sieben Nukleotide
Hat der zwischen Box Al und Box A2 liegende Sequenzabschnitt eine Länge von sechs Nukleotiden, so weist der Sequenzabschnitt die Sequenz UGGUUG, UGGCUG, CGGUUG, AGGUUG oder GUGUAA auf. Ein Einschub von einem Nukleotid (Uracil) in die Sequenz CGGUUG, was zu der Sequenz CGGUUUG führt, hat weder einen negativen noch einen positiven Einfluß auf die Bindungseigenschaften der Spiegelmere.
Fall 2: Sequenzabschnitt umfasst 12-22 Nukleotide
Hat der zwischen Box Al und Box A2 liegende Sequenzabschnitt eine Länge von 12 bis 22
Nukleotiden, so weist dieser Sequenzabschnitt zwei Sequenzbereiche gleicher Länge auf, die miteinander ggf. hybridisieren können (Helix C). Die Hybidisierung wird dabei von jeweils drei bis sechs Nukleotiden bewerkstelligt. Zwischen den die Helix C ausbildenden Nukleotiden liegen drei bis fünf ungepaarte Nukleotide vor. Zwischen dem 3'-Ende von Box Al und dem 5 '-Ende von Helix C liegen eins bis drei Nukleotide ungepaart vor. Zwischem dem 3'- Ende von Helix C und dem 5 '-Ende von Box A2 können eins bis fünf Nukleotide ungepaart vorliegen.
1.2.3 Helikale Struktur am 5'- und am 3'-Ende der Spiegelmere
Alle HMGAl a/b-bindenden Spigelmere zeichnen an ihren 5'- und 3 '-Enden durch Sequenzabschnitte aus, die miteinander hybridisieren können (Helix Al und Helix A2, (Fig. IA und IB). Die Anzahl der jeweils der miteinander hybridisierenden Nukleotide kann dabei von vier bis acht variieren. Dabei kann dieser vermeintlich doppelsträngige Bereich an das 5 '-Ende von Box Al und das 3 '-Ende von Box A2 heranreichen. Sollte dies nicht der Fall sein, so können Box Al und Box A2 von zusätzlich miteinander hybridisierenden Nukleotiden (Helix Bl und Helix B2) flankiert sein. Dabei kann es sich um Bereiche von jeweils vier bis acht Nukleotiden handeln (Fig. IA und IB).
Im Rahmen der der vorliegenden Anmeldung zugrundeliegenden Erfindung wurden verschiedenen Klassen von Nukleinsäuren und insbesondere L-Nukleinsäuren identifiziert, die an das Zielmolekül binden. Die folgende Darstellung und Beschreibung dieser Klassen, die hierin auch als Fälle bezeichnet werden, stellt insoweit einen integralen Bestandteil der vorliegenden Anmeldung dar. Im folgenden werden für eine jede Klasse deren prinzipieller Aufbau und beispielhafte L-Nukleinsäuren für diese Klasse unter Verwendung der jeweiligen Kurzbezeichnungen der L-Nukleinsäuren angegeben.
Fall 1: 132-C3, 132-B3, 132-C4, 132-E2, 132-A2, 132-H1, 132-F1, 122-G2, 132-B3 32nt, 132-B3 33nt
HeH2C Ai-Nx-HeIiX Bl-N6Nτ|Box A1|N,N2GN8N3N4N5|BOX A2|G-Nγ-Helix B2-N,-Hglix A2_(FaIl IA)
bzw.
HeHx AI-Nx-HeIiX Bl-N6NτtBox AIlN1N2GN8N3N4N5IBOX A2|HeIix B2-N,-Helix A2 (Fall IB) N1 = U5 C5 A5 G;
N2 = G5 U;
N3 = U5 C;
N4 = U5 A;
N5 = G5 A;
N6 = G, A, U;
N7 = G5 U;
N8 = U oder kein Nukleotid;
Nx = null bis fünf Nukleotide;
Ny = null oder sechs Nukleotide;
Nz = null bis sechs Nukleotide;
|Box Al| = |Box A2l = GGGCG oder GGGUG oder GGGAG;
Helix Al und Helix A2 = jeweils vier bis acht Nukleotide, die vollständig oder teilweise miteinander hybridisieren, wobei die Summe der jeweils miteinander hybridisierenden Nukleotide aus Helix Al und Helix A2 und Helix Bl und Helix B2 10 bis 12 Nukleotide beträgt;
Helix Bl und Helix B2 = jeweils vier bis acht Nukleotide, die miteinander hybridisieren, wobei die Summe der jeweils miteinander hybridisierenden Nukleotide aus Helix Al und Helix A2 und Helix Bl und Helix B2 10 bis 12 Nukleotide beträgt.
Die Moleküle sind auch nach der Verkürzung am 5'- und am 3 '-Ende aktiv. Nach der Entfernung der Helix Al und A2 sowie sowie der Bereiche N6N7 und GNy behalten die verkürzten Moleküle ihre Bindungseigenschaften bei. Gezeigt wurde dies für die verkürzten Varianten 132-B3 32nt (NOX-f 32nt) und 132-B3 33nt (NOX-f 33nt) (siehe Fig. 3 und 4). Fall 2A: 132-G2, 122-A1, 122-C1, 122-B2, 122-B4
Hehx Al-Na-tBox Alj-Nb-lHehx C lj-Nc-jHelϊx C2J-Nd-)Box Äl|-G-Ne-Helix A2
Na = ein bis fünf Nukleotide
Nb = drei Nukleotide
Nc = drei bis fünf Nukleotide
Nd = zwei bis fünf Nukleotide
Ne = eins bis zwei Nukleotide, bevorzugterweise A oder UU
|Box Al| = |Box A2| = GGGCG oder GGGUG oder GGGAG
Hehx Al und Hehχ A2 = jeweils fünf bis sechs Nukleotide, die vollständig oder teilweise miteinander hybridisieren, ΪHehx Cl und Hehx C2!= jeweils fünf bis sechs Nukleotide, die miteinander hybridisieren,
Fall 2B: 122-E2
HehxAl-N.-Helix Bl-N|-JBox ÄΪ|-A-ΗeTix'ci'-Nc-'Heiϊx CJl-G-tBox Ä2|-G-Helix B2-A-Hehx A2
N, = zwei Nukleotide, bevorzugterweise CA Nj = zwei Nukleotide, bevorzugterweise AG Nc = vier Nukleotide, bevorzugterweise GAUG
iBox Alj = JBox A2| = GGGCG oder GGGUG oder GGGAG Hehx Al und Hehx A2 = jeweils sechs Nukleotide, die miteinander hybridisieren, Helix Bl und Helix B2 = jeweils fünf Nukleotide, die miteinander hybridisieren iHeϊix CΪ und Helix C2ι = jeweils drei Nukleotide, die miteinander hybridisieren Beispiel 2: Domain-Approach
2.1 Bestimmung der Interaktion von HMGAl a/b-Spiegelmeren und rekombinantem HMGAIb im Kompetitionsassay
Durchfuhrung/Methode
Klonierung von His6-markiertem HMGAIb
Der BD-Freedom™ ORF Klon GH00552L1.0 (high mobility group AT hookl) mit der für HMGAIb kodierenden Sequenz wurde von BioCat, Heidelberg gekauft. Die Sequenz ist darin bereits so verändert, dass das Stop-Codon in ein für Leucin kodierendes Codon umgewandelt ist, um C-terminale Fusionen zu ermöglichen. Die Sequenz des Klons entspricht am meisten der in der RefSeq-Datenbank mit der Nummer NM002131 gespeicherten Sequenz. Mit den primern HMGJwdl (TCGACACCATGGGTGAGTC, Seq.ID 34) und HMGjrevl (GTCTAGAAAGCTTCCCAACTG, Seq.ID 35) wurde mit Hilfe einer Standard-PCR die für HMGAIb kodierende Sequenz amplifϊziert. Dabei wurde die Base nach dem ATG von A nach G verändert, um damit eine Ncol-Schnittstelle einzuführen. Das PCR-Produkt wurde entsprechend der Herstellerangaben mit den Restriktionsenzymen Ncol und Hindlll Beide von NEB, Frankfurt am Main; Deutschland) geschnitten und über ein Agarosegel gereinigt. Der Vektor pHO2d (Fasshauer et al. (1997) J.Biol.Chem. 272:28036 - 28041) ) wurde ebenfalls mit Ncol und Hindill geschnitten und über ein Agarosegel gereinigt. Der Vektor pHO2d erlaubt die Expression eines am C-terminalen Ende mit einer Sequenz aus 6 Histidinresten (His6-tag) fusionierten Proteins unter Kontrolle eines T7-Promotors (Fasshauer et al., 1997, JBC 272:28036).
Das gereinigte und geschnittene PCR-Produkt wurde über Nacht bei 150C mit Hilfe einer T4- Ligase entsprechend der Herstellerangaben (MBI Fermentas, St. Leon-Roth, Deustchland) in den vorbereiteten Vektor ligiert. Mit dem Ligationsprodukt wurden Bakterien vom Stamm DH5 transformiert. Die Korrektheit der Plasmide aus erhaltenen Kolonien wurde durch Sequenzierung sichergestellt. Das von pHO2d/HMGAlb kodierte Fusionsprotein HMGAIb- His6 hat gegenüber dem natürlichen HMGAlb-Protein ein Glycin (G) statt Serin (S) an Position 2 und nach dem C-terminalen Glutamin (Q) ein Leucin (L) (s.o.), gefolgt von 5 weiteren Aminosäuren (G S L N S) (vom Vektor kodiert), an die sich die sechs Histidine (H) anschließen. Expression und Reinigung von HMGlb-His6
Für die Expression des Fusionsproteins wurden Bakterien vom Stamm BL21 mit dem Plasmid pHO2d/HMGAlb transformiert. Die Expression des Fusionsproteins wurde mit Isopro- pylthio-ß-D-Galaktosid (IPTG) induziert. Nach 4 h wurden die Bakterien für 15 min bei 10.000 x g abzentrifugiert und das Pellet bis zur weiteren Verwendung bei -20°C aufbewahrt.
Für die Extraktion des Fusionsproteins wurden zu einem gefrorenem Bakterienpellet von 500 ml Kultur 25 ml Extraktionspuffer (1% n-Octyl-ß,D-Thioglucoρyranosid (OTG) in 50 mM NaxPO4-Puffer, pH 8.0, 250 mM NaCl, 10 mM Imidazol und MiniProteaselnhibitoren- Tabletten (Roche, Mannheim, Deutschland) (5 St/50 ml)) gegeben, mit 5 μl Benzonase (gra- del ; MERCK, Darmstadt, Deutschland) versetzt, durch Auf- und Abpipettieren homogenisiert und 5 min bei RT inkubiert. Danach wurde 15 min bei 10.000 x g (RT) zentrifugiert. Der Ü- berstand wurde durch einen Faltenfilter geklärt und dann auf eine mit Waschpuffer (50 mM NaxPO4-Puffer, pH 8.0, 250 mM NaCl, 10 mM Imidazol, alle MERCK, Darmstadt, Deutschland) äquilibrierte HIS-Select-Säule (HIS-SELECT Cartridge, Sigma, Deisenhofen, Deutschland) aufgetragen. Nach Waschen der Säule mit 10 - 15 ml Waschpuffer wurde das Fusionsprotein mit Elutionspuffer (250 mM Imidazol in Waschpuffer) in 0,5 - 1 ml großen Fraktionen eluiert. Proteinhaltige Fraktionen wurden mittels Gelelektrophorese (16% Polyacrylamid- gel nach Schäger & Jagow, 1987, Anal.Biochem. 166:368-379) auf Reinheit überprüft. Fraktionen mit Fusionsprotein wurden vereinigt, ggf. gegen einen geeigneten Puffer dialysiert und nach Proteinbestimmung nochmals auf Reinheit überprüft. Das gereinigte Fusionsprotein wurde in Aliquots bei -200C gelagert.
Bestimmung der Interaktion von HMGAl a/b-Spiegelmeren und HMGAlb-His6
Zur genaueren Analyse der Affinität der HMGAl a/b-Spiegelmere zu HMGAIb wurde ein auf dem 96-well Format basierender Test verwendet. In diesem Test verhindert die Bindung der HMGAla/b-Spiegelmere an HMGAlb-His6 dessen Interaktion mit einem DNA- Oligonukleotid, das eine Bindungsstelle für HMGAl a/b besitzt. Dieses DNA-Oligonukleotid (dsDNA AT-Hook) (Fashena et al., 1992) ist an einem Strang mit einem Biotin-Molekül markiert, über das es an mit Streptavidin beschichtete Platten gebunden werden kann. Der Nachweis von an DNA gebundenem HMGAl b-His6 erfolgt über mit Nickel modifizierter Meerret- tichperoxidase (Nickel-HRP), welche ein fluorogenes Substrat umsetzt. Das Spiegeimer ver- drängt in diesem Assay das rekombinante HMGAIb von seinem natürlichen Bindungspartner. Auf Grund der 1 :1 :1 Stöchometrie von Spiegeimer/ rHMGAlb/ dsDNA AT-Hook lassen sich direkt Aussagen über die Affinität der Spiegelmere gegenüber HMGAIb treffen. Das Prinzip des Assays ist inFig. 5 dargestellt.
Zur Durchführung dieses Tests werden in einer Spitzbodenplatte Spiegelmere in verschiedenen Konzentrationen und HMGAlb-His6 (0,36μg/ml; ca. 30 nM) in einem Gesamtvolumen von 100 μl 10 min bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Die Inkubationslösung enthält ausserdem: 25 mM Tris/HCl, pH 7.0 (Ambion, Austin, TX, USA), 140 mM KCl (Ambion, Austin, TX, USA), 12 mM NaCl (Ambion, Austin, TX, USA), 0,8 mM MgC12 (Ambion, Austin, TX, USA), 0,25 mg/ml BSA (Roche, Mannheim, Deutschland), 1 mM DTT (Invitro- gen, Karlsruhe, Deutschland), 18 - 20 μg/ml poly(dGdC) (Sigma, Deisenhofen, Deutschland)), 0,05 % Tween 20 (Roche, Mannheim, Deutschland). Dann werden 2 μl biotinyliertes DNA-Oligonukleotid dsDNA AT-Hook (äquimolare Mischung von 5'biotin- TCGAAAAAAGCAAAAAAAAAAAAAAAAAACTGGC (34nt) und
5'GCCAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCTTTTTT (31 nt); 75 μM in 150 mM NaCl (Ambion, Austin, TX, USA)) zugegeben und weitere 10 min unter Schütteln bei RT inkubiert. Anschließend werden die Ansätze in eine mit Streptavidin beschichtete schwarze 96-well Platte (ReactiBind v. Pierce, Bonn, Deustchland)) überführt und 30 min unter leichtem Schütteln bei RT inkubiert. Danach werden die Vertiefungen der Platte drei mal mit je 200 μl TBSTCM (20 mM Tris/HCl, pH 7,6 (Ambion, Austin, TX, USA); 137 mM NaCl (Ambion, Austin, TX, USA), 1 mM MgC12 (Ambion, Austin, TX, USA), 1 mM CaC12 (Sigma, Deisenhofen, Deustchland), 0,05% Tween20 (Roche, Mannheim, Deustchland)) gewaschen. In jede Vertiefung werden 50 μl einer verdünnten Nickel-HRP-Lösung gegeben (ExpressDe- tector Nickel-HRP, (Medac, Hamburg, Deutschland) 1:1000 in 10 mg/ml BSA (Roche, Mannheim, Deustchland)in TBSTCM) und 1 h unter leichtem Schütteln bei RT inkubiert. Danach werden die Vertiefungen wieder drei mal mit je 200 μl TBSTCM gewaschen. Zu jeder Vertiefung werden dann 100 μl des fluorogenen HRP Substrats (QuantaBlue, Pierce, Bonn, Deutschland) gegeben und nach 15 min die Fluoreszenz gemessen (ex: 340/em: 405 nm). Ergebnis
Es konnte gezeigt werden, dass die Spiegelmere NOX-A (50nt), NOX-f (33nt) und NOX-f
(48nt) konzentrationsabhängig mit der Bindung von HMGAlb-His6 an das biotinylierte
DNA-Oligonukleotid kompetieren (Fig. 6). Für Spiegeimer NOX-A ergibt sich eine IC50 von ca. 15 nM.
Im Gegensatz zu dem aktiven Spiegeimer zeigte ein Kontrollspiegelmer mit zu NOX-A inver- ser Sequenz bis zu einer Konzentration von 0,5 μM keinen Effekt auf die Bindung von
HMGAlb-His6 an das DNA-Oligonukleotid hat und erst bei Konzentrationen über 1 μM un- spezifische Interaktionen mit HMGAlb-His6 auftreten (Fig. 7).
2.2 Verwendung von Spiegelmeren zum Nachweis von HMGAIb durch Western Blot
Durchführung/Methoden
Das rekombinant exprimierte HMGAIb wurde über Gelelektrophorese auf einem 16% PAA- Tricin-Gel aufgetrennt und mittels Elektroblottings auf Nitrozellulosemembranen transferiert. Die Membran wurde nachfolgend mit 5% Magermilch und 10OnM unspezifischen Spiegeimer in IxTBST (20 mM Tris/HCl ph 7.6, 137 raM NaCl, 0.1% Tween) für 1 Stunde geblockt und 3mal für 10 Minuten mit IxTBST gewaschen. Die Detektion des rekombinaten HMGAIb erfolgte mit am 5 '-Ende biotinyliertem Spiegeimer NOX-A (5'bioNOX-A). 5'bioNOX-A wurde in IxTBST mit je ImM Kalzium und Magnesium (TBST+Ca/Mg)und 10OnM unspezifischem Spiegeimer verdünnt und für 1,5 Stunden inkubiert. Der Blot wurde anschließend 3mal für 10 Minuten mit Ix TBST+ Ca/ Mg gewaschen und das gebundene biotinylierte Spiegeimer mit einem anti-Biotin-Antikörper in TBST+ Ca/Mg für 45 Minuten inkubiert. Anschließend wurde der Blot 5mal für 10 Minuten mit lxTBST+Ca/Mg gewaschen und der mit gekoppelter Meerrettichperoxidase (HRP) Sekündarantikörper mittels LumiGLO Nachweisreagens (Cell Signaling Technology) detektiert.
Ergebnis
Mit Hilfe des beschriebenen Verfahrens konnte die Bindung eines 5 '-terminal biotinylierten Spiegeimers an das rekombinant exprimierte HMGAIb gezeigt werden. Ähnlich einer auf Antikörper basierenden Detektion wurden 5μg HMGAIb nach Transfer auf eine Blot- membran mit 3nM bio-NOX-A detektiert. Das inverse Spiegeimer von NOX-A konnte HMGAIb nicht erkennen, was die spezifische Bindung von NOX-A belegt (Fig. 8).
Beispiel 3: PEI-Spieglmer-Formulierung
3.1 Prinzip der Polyethylenimine vermittelten Transfektion von Spiegelmeren
Das Zielmolekül HMGAl a/b wird im Zytosol exprimiert und findet als Transkriptionsfaktor seinen natürlichen Bindungspartner, die doppelsträngige DNA im Zellkern. Durch Bindung des Spiegeimers an HMGAl a/b im Zytosol und Kompetition des durch die AT-Hooks auf der DNA gebundenen HMGAl a/b im Zellkern der Zelle sollen die HMGAl a/b- vermittelten zellulären Antworten antagonisiert werden. Aufgrund der negativen Ladung der Plasmamembran werden DNA- und RNA-Moleküle schlecht durch passiven Transport von einer Zelle aufgenommen. Einer der Ansätze des intrazellulären Transports vom Nukleinsäuren ist die Kondensation bzw. Verpackung mit geladenen Partikeln oder Reagenzien und damit verbundene Änderung der Ladung des Gesamtkomplexes. Dieser Komplex wird leicht über Endozytose aufgenommen und gelangt somit in das Zytosol der Zelle. Nachteile dieser Methode ist die Stabilität der DNA/ RNA bzw. das Freisetzen der Nukleinsäure aus dem endosomalen Kom- partementen. Im Zytosol der Zelle entsteht aus dem eingeschnürten Endosom durch das Einbringen von Proteasen bzw. Nukleasen und durch Protonierung des Kompartiments schnell ein Lysosom. Nukleasen verdauen dort die Nukleinsäuren und zudem ist die Nukleinsäure im saurem Milieu nicht stabil. Über Exozytose bzw. Abbau im Golgi Apparat wird der gesamte Komplex schnell wieder aus der Zelle transportiert und somit gelangen nur wenige Nukleinsäuren in die Zelle. Eine der Herausforderung an ein geeignetes Transfektionssystem ist somit die Stabilisierung, sowie die Freisetzung der Nukleinsäure aus den Endosomen in das Zytosol. Hinsichtlich der Stabilität haben RNA-Spiegelmere ideale Eigenschaften für eine Transfektion von eukaryotischen Zellen, da sie als unnatürliche Enantiomere nicht von Enzymen gespalten werden.
Das ausgewählte Transfektionssystem basisiert auf der Bildung von Mizellen von Nukleinsäuren mit verzweigtem Polyethylenimin (PEI). Das Phosphatrückrat der Nukleinsäuren in- teragiert mit den freien Stickstoff-Positionen des PEI und bildet über Querverzweigung kleine Mizellen, welche aufgrund des PEI eine positive Ladung haben. Dabei wird PEI mit einem Molekulargewicht von 3 bis 800 kDa verwendet. Je kleiner das PEI gewählt wird desto kleiner sind die gebildeten Mizellen. Die Verwendung von 25 kDa querverzweigtem PEI (Sigma- Aldrich Cat. No. 40;872-7) fuhrt bei der Zugabe von Nukleinsäuren zu Polyplexen von einer Größe von 100 bis zu 500nm, typischerweise jedoch zu Polyplexen einer Größe von 100- 200nm. In der Regel wird eine Stickstoff/ Phosphat-ratio von 2:1 bis 5:1 verwendet; teilweise sogar bis zu 20:1. Die Verpackung der Nukleinsäure in Mizellen hat eine Änderung des zeta- Potential des Komplexes auf - (+)21mV bei einer N/P 3 zur Folge. Es ist bekannt, dass mit zunehmenden, positiven zeta-Potential von Komplexen die Toxizität für kultivierte Zellen steigt. Diese Mizellen werden jedoch leicht durch Einschnürung der Plasmamembran als En- dosomen von einer Zelle aufgenommen. Das PEI puffert nun einströmende Protonen ab, woraufhin viele Chlorid-Ionen im Inneren des Endosoms zu einem Anschwellen des Komparti- ments aufgrund des osmotischen Drucks führen. Dieser Effekt des PEI wird als Protonen- Schwamm-Effekt in der Literatur beschrieben (Sonawane et al., JBC, 2003, Vol.278; No.45(7) pp.44826-44831) und führt letztlich zum Platzen des Endosoms und zur Freisetzung der Spiegelmere in das Zytosol.
Der Nukleinsäure-PEI Komplex neigt aufgrund einer stark positiven Ladung zur Interaktion und Aggregation mit Serumproteinen, sowie zur bereits beschriebenen Zelltoxizität. So wurde in der Literatur beschrieben, dass hohe Dosen an Nukleinsäure-PEI Mizellen nach subkutaner und intravenöser Injektion in Ratten schnell zu einer Akkumulation in der Lunge und somit zu Embolien/ Infarkten führen kann. Die Lösung für das Problem stellt die Derivatisierung der Nukleinsäure mit 2kDa Polyethylenglycol (PEG) dar. Diese Reste legen sich wie ein Schild um die Mizellen und verhindern die Bindung an Serumproteine ( Ogris et al., Gene Therapy, 1999, 6(595-605). Des Weiteren wird das zeta-Potential auf +/- OmV abgesenkt, was zu einer geringeren Zelltoxizität bei gleichbleibender Pufferkapazität des PEI hinsichtlich des proton- sponge-effect führt.
3.2 Aktivität Spiegeimer mit PEG2000
Die Leitkandidaten NOX-A und NOX-f wurden synthetisch als Aptamer und Spiegeimer mit 3 '-terminaler Aminogruppe hergestellt und anschließend über den Amino-Rest PEGyliert. Mittels Gleichgewichtsanbindungsassays konnte gezeigt werden, dass die PEGylierung keinen Einfluss auf die Bindungseigenschaften der Aptamere an das HMGAl a/b Fragment hat. Des Weiteren konnte mittels Kompetitionsassays mit rekombinantem Volllänge- HMGAl a/b gezeigt werden, dass auch die Bindung von Spiegelmeren an das Volllänge- HMGAl a/b unabhängig von der 3 '-terminalen PEGylierung ist (Fig. 9).
3.3 Verpackung Spiegeimer
Die Verpackung von sterilem, PEGyliertem Spiegeimer erfolgte in PBS durch Zugabe von 25kDa querverzweigtem Polyethylenimine (PEI) (ALDRICH, Cat: 40,872-7) in einem Verhältnis von 2,5:1 des absoluten Stickstoffanteils des PEI zum absoluten Phosphat des Ribonukleinsäurerückgrats (N/P 2,5). Die sterile, autoklavierte PEI Lösung hatte eine Konzentration von 20OmM freien Stickstoffgruppen und wurde mit 1 M Salzsäure auf einen pH von 7,4 eingestellt. Das sterile filtrierte Spiegeimer wurde dabei mit einer Konzentration von bis zu 700 μM in IxPBS mit Ca/Mg vorgelegt und nach der Zugabe von steril filtriertem PEI für 30- 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Idealerweise läuft die Komplexbildung bei möglichst geringer vorgelegter Konzentration an Spiegeimer ab, da hohe Konzentration an Spiegeimer zu unspezifisch großen Aggregaten fuhren. Die Bildung von Spiegelmer-Mizellen wurde mittels eines Farbstoff-Ausschluss-Assays gemessen. Dabei wurde bestimmt, wie viel Spiegeimer sich per Farbstoff vor und nach Verpackung in Mizellen nachweisen lässt. Als Farbstoff wurde RiboGreen (M. Probes) verwendet und die Fluoreszenz mit einem ELISA- Reader bestimmt. Je lμM Spiegeimer wurde in lOOμl IxPBS vorlegt und steigende Mengen an PEI zugegeben. In einer fluoreszenz-geeigneten 96-well Mikrotiterplatte wurden lOOμl 0,2μg/μl RiboGreen vorgelegt und nach einer Inkubationzeit des Mizellenansatzes von 30 Minuten bei Raumtemperatur je lOμl in die Mikrotiterplatte pipettiert. Ab einem N/P Verhältnis von 2 lagen mehr als 90% der Spiegelmere als Mizellen vor (Fig.10). PEI allein hatte dabei keinen Einfluss auf die Fluoreszenz des Farbstoffs
3.4 Stabilität Spiegelmer-Micellen lμM Spiegeimermizellen wurden unter in Fig. 11 aufgeführten Bedingungen gelagert. Die Stabilität von Spiegelmer-Mizellen wurde mit unter Absatz 3.3 beschriebenen Farbstoff- Ausschluss-Assays gemessen. Eine Stabilitätsstudie der Mizellen zeigte, dass die Lagerung von Mizellen in unterschiedlichen Medien, sowie bei verschiedenen Temperaturen keinen Einfluss auf die Spiegelmer-Mizellen hat. In der Literatur beschieben ist auch die Gefriertrocknung von Ribozym/ PEI-Komplexen ohne Verlust der Eigenschaften des Ribozyms (Brus-C et al„ J. Control Release, 2004, Feb, 20, 95(1), 199-31) 3.5 Aufnahme von Spiegelmer-Micellen
Die intrazelluläre Aufnahme von Spiegeimer Mizellen wurde am Zellkultursystem von HS578T Zellen etabliert. IxIO4 HS578T Zellen wurden auf sterile 20mm Deckgläschenwur- den bis zu einer Konfluenz von 30-40% wachsen gelassen. 5 '-markiertes Spiegeimer NOX-A- 3'-PEG wurde mit einer N/P Ratio von 2,5:1 in Mizellen verpackt, in einer Konzentration von lμM zu den Zellen gegeben und für 16 Stunden bei 370C inkubiert. Als Kontrolle für die passive Aufnahme von Spiegelmeren wurde je lμM reines Fluoreszenz-markiertes Spiegeimer mit den Zellen inkubiert. Die Zellen wurden anschließend 3xlml IxPBS gewaschen und für 30 Minuten mit 3% Paraformaldehyd fixiert. Die Präparate wurden wiederum mit 3xlml IxPBS gewaschen, zur Färbung des Chromatins im Zellkern für weitere 10-20 Sekunden mit einer DAPI-Lösung (lμl Stock auf 10ml IxPBS) inkubiert, nochmals gewaschen und mit einer Paramountlösung eingedeckt. Die so vorbereiten Präparate wurden an einem Fluoreszenzmikroskop analysiert (Emission 488nm/ Extinktion 514-522nm).
Es konnte gezeigt werden, dass Spiegelmer-Mizellen eine erhöhte Transfektionsquantität gegenüber „nackten", nicht verpacktem Spiegeimer haben (Fig. 12)
Die Transfektionseffizienz lag dabei >95% der Gesamtzellen und zeigte keinen Einfluss auf die Morphologie der Zellen. Das 5 '-FITC-gekoppelte Spiegeimer war hauptsächlich im Zyto- sol und assoziiert an die Plasmamembran zu finden. Das punktuelle Verteilungsmuster weist auf einen Einschluss in Kompartimenten und das diffuse Muster auf freigesetztes Spiegeimer hin. Im Zellkern konnten nur ein geringes Signal an Spiegeimer detektiert werden.
3.6 Freisetzung von Spiegeimer
Die punktuelle Verteilung des Spiegelmere im Zytosol und perinukleären Raum der H578T Zellen deutet auf eine Anreicherung in Kompartementen der Zellen, z.B. Endosomen hin. Zur Überprüfung der Freisetzung der Spiegelmere aus diesen Kompartementen wurde das Verteilungsmuster einzelner stark vergrößerter Zellen analysiert (Fig.13). Es konnte zusätzlich zu der punktuellen Lokalisation der Spiegelmere ein diffuses Verteilungsmuster im Zytosol und an der Plasmamembran festgestellt werden, was ein Hinweis auf die endosomale Freisetzung der Spiegelmeren ist. Dieses Muster konnte bei „nackten" Spiegeimer nicht festgestellt werden. Beispiel 4: Bioaktivität in vivo
4.1 Proliferationsassay ohne PEI
Wirkung auf die Proliferation von MCF-7 Zellen
Die potentielle Rolle von HMGAl a/b bei der Zellteilung wurde mittels Proliferations- Assays untersucht. Zunächst wurde Spiegeimer in einer hohen Dosis als „nackte" Nukleinsäure in das Zellkulturmedium gegeben und das Wachstum der Zellen über die Zeit verfolgt. Die Brustkrebszelllinie MCF-7 wurde als Modell ausgesucht, da in diesen Zellen eine geringe(zu anta- gonisierende) Expression von HMGAl a/b gefunden, bzw. die Rolle von HMGAl a/b in der Proliferation dieser Zellen bereits in der Literatur beschrieben wurde. Reeves et al. (Reeves-R et al., Molecular and Cellular Biology, Jan 2001, p575-594) konnten zeigen, dass die Überexpression von HMGAl a/b in MCF-7 Zellen zu einer verstärkten Proliferation führt und die Inhibition von HMGAl a/b mittels exprimierter antisense-Konstrukte die Proliferation von MCF-7 Zellen inhibiert.
Durchführung/ Methode
0,5 x 104 MCF-7 Zellen (ATCC) wurden in 96- well Platten (Costar) mit planem, durchsichtigem Boden ausgesät und für 16-24 Stunden in 100 μl RPMI 1640-Medium mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) kultiviert. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen und für weitere 48 Stunden mit Standardzellkulturmedium unter direkter Zugabe von steril filtriertem Spiegeimer kultiviert. Es folgte die Zugabe von lOμl einer Resazurin-Lösung (0,44 mM in PBS) zu den jeweiligen Ansätzen und die weitere Inkubation für 2 Stunden bei 37°C. Die Umsetzung von Resazurin durch den Stoffwechsel der Zelle korreliert direkt mit der Zellzahl. Die Farbänderung wurde in einem Fluostar Optima Multidetektions-Plattenlesegerät (BMG) gemessen (Emission 544 ran, Extinktion 590 ran). Jeder Wert wurde pro Experiment als Dreifachansatz bestimmt und auf die Werte von unbehandelten Kontrollzellen bezogen.
Ergebnis
NOX-A inhibierte nach 2 Tagen Dosis-abhängig die Proliferation von MCF-7 Zellen (n=12)
(Fig. 14). Die maximale Hemmung der Proliferation auf ca. 30% des Wertes von unbehandel- ten Zellen wurde bei 40 μM gemessen. Bei Konzentrationen bis 40 μM konnte kein unspezifischer Effekt des inversen Kontroll-Spiegelmer festgestellt werden.
4.2 Proliferationsassay mit PEI
Wirkung von Spiegelmer-Mizellen auf die Proliferation von H- 1299 Zellen
Durchfuhrung/ Methode
IxIO4 NCI-H-1299 Zellen (Lungenkarzinomzellen; ATCC) wurden in 24-well Platten (Costar) mit planem, durchsichtigem Boden ausgesät und für 16-24 Stunden in ImI RPMI 1640 Medium mit 10% FCS kultiviert. Anschließend wurden die Zellen 2x mit PBS gewaschen und für weitere 3 Tage mit Zellkulturmedium mit 1% FCS und Spiegelmer-Mizellen kultiviert. Die Verpackung von sterilem, PEGyliertem Spiegeimer erfolgte zuvor in PBS durch Zugabe von 25kDa querverzweigtem Polyethylenimine (PEI) (Sigma) in einem Verhältnis von 2,5:1 des absoluten Stickstoffanteils des PEI zum absoluten Phosphat des Ribonukleinsäurerückgrats (N/P 2,5). Das sterile Spiegeimer wurde dabei mit einer Konzentration von 30 μM vorgelegt und nach der Zugabe des PEI für 30-60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Spiegelmer-Mizellen mit Zellkulturmedium mit 1% FCS auf lμM verdünnt, direkt zu den gewaschenen Zellen gegeben und für 3 Tage bei 370C inkubiert
Es folgte die Zugabe von 100 μl Resazurin-Lösung zu den jeweiligen Ansätzen und die weitere Inkubation für 2 Stunden bei 370C Die Umsetzung von Resazurin durch den Stoffwechsel der Zelle korreliert direkt mit der Zellzahl. lOOμl wurden den Ansätzen entnommen, in eine 96-well Platte überführt und die Farbänderung in einem Fluostar Optima Multidetektions- Plattenlesegerät (BMG) gemessen (Emission 544 nm, Extinktion 590 nm). Jeder Wert wurde pro Experiment als Doppelansatz bestimmt und auf die Werte von unbehandelten Kontrollzellen bezogen.
Ergebnis
Die Verwendung von PEI (N/P 2,5) bei 1 μM Spiegeimer zeigte zunächst keine Wirkung auf die Proliferation von Zellen. Durch Reduktion der Menge an FKS im Zellkulturmedium unter 1 % konnte gezeigt werde, dass die Transfektion mit Spiegelmer-Mizellen einen Einfluss auf die Proliferation von H- 1299 Zellen hat, welcher bei 10% FKS zuvor nicht sichtbar war (Fig 15). Möglicherweise stimuliert FKS die Proliferation so stark, dass der geringe Effekt nicht beobachtet werden konnte. Die Reduktion der FKS-Konzentration bei MCF-7 Zellen führte zum Absterben der Zellen über einem Zeitraum von 3 Tagen.
4.3 Inhibition Tumormarker cdc25a (mit PEI)
Wirkung auf die HMGA la/b vermittelte Regulation von Zellzyklusfaktoren am Beispiel des potentiellen Onkogens cdc25a
Reeves et al. (Molecular and Cellular Biology, Jan 2001, p575-594) konnten mittels cDNA Arrays durch Überexpression von HMGAl a/b in MCF-7 Zellen zeigen, dass HMGAl a/b die Expression einer Vielzahl von Genen induziert. Bis zu 100-fach überexprimiert werden dabei auch Zellzyklus- und Wachstumsfaktoren, wie etwa das als potentielles Onkogen identifizierte cdc25a (cell-division-cycle 25a-Phosphatase), welches für die Kontrolle des Übergangs von der Gl zur S-Phase des Zellzyklus eine entscheidende Rolle spielt. Die Aktivierung von solchen Kontrollpunkten führt nach Hemmung der Zellzyklus-Progression entweder zur Transkription von Genen, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind oder, falls die DNA- Schäden irreparabel sind, zur Induktion der Apoptose. Als Zellkultur-Testsystem wurden hierfür die H- 1299 Zellen ausgewählt, da diese bereits eine erhöhte Expression von HMGAl a/b zeigten.
Durchführung/ Methode
1x104 H- 1299 Zellen wurden in 24-well Platten Platten (Costar) mit planem, durchsichtigem Boden ausgesät und für 16-24 Stunden in RPMI 1640-Medium mit 10% FCS kultiviert (Volumen 1 ml). Anschließend wurden die Zellen 2x mit PBS gewaschen und die Zellen für weitere 3 Tage mit Zellkulturmedium mit Spiegeimer-Mizellen mit 10% FCS kultiviert. Die Verpackung von sterilem, PEGyliertem Spiegeimer erfolgte zuvor in IxPBS durch Zugabe von 25kDa querverzweigten Polyethylenimine (PEI) (Sigma) in einem Verhältnis von 2,5:1 des absoluten Stickstoffanteils des PEI zum absoluten Phosphat des Ribonukleinsäurerückgrats (N/P 2,5). Das sterile Spiegeimer wurde dabei mit einer Konzentration von 30μM vorgelegt und nach der Zugabe des PEI für 30-60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Spiegelmer-Mizellen mit Zellkulturmedium mit 1%FCS auf die jeweilige Konzentration verdünnt, direkt zu den gewaschenen Zellen gegeben und für 3 Tage bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden 2mal mit PBS gewaschen und mittels eines Zellschabers geerntet. Anschließend wurde die mRNA der Zellen mittels Roti-Quick-Kits (Roth, Cat.No.979.1) aus den Zellen isoliert und 0,2-1 μg Gesamt-RNA als Template für die PCR von cdc25a und GAPDH einsetzt.
Die Primer für die Amplifikation von GAPDH waren: forward primer: 5'- ACATGTTCCAAT ATGATTCC-3' und reverse primer: 5-
TGGACTCCACGACGTACTCAG-3' bei einer Annealingtemperatur von 510C , sowie für die Amplifikation von cdc25a : forward primer: 5 '-GAGGAGTCTCACCTGGAAGTACA-S ' und reverse primer 5 '-GCCATTCAAAACCAGATGCCATAA-3 ' bei einer Annelaingtempe- ratur von 59°C Die PCR Bedingungen waren wie folgt: 0,2-0,75μM Primer, l,5mM MgC12 und 0,2mM dNTPs. Alle 2 PCR Zyklen wurde je ein Aliquot von 5μl über PicoGreen quantifiziert und in Korrelation zu GAPDH als Beladungskontrolle ausgewertet: dabei wird im ersten Schritt für jede untersuchte Probe der s.g. „crossing-point"-Wert (CP) des Referenzgens vom CP Wertdes zu untersuchenden Gens subtrahiert (dCP=CPZielgen-CP Referenzgen). Als CP ist die Anzahl der PCR Zyklen definiert, die nötig sind um ein konstant definiertes Fluoreszenzniveau zu erreichen. Am CP befindet sich in allen Reaktionsgefäßen die gleiche Menge an neu synthetisierter DNA. Nach dieser Normierung wird vom dCP Wert der experimentell behandelten Proben der dCP Wert einer Kontrolle (in diesem Fall GAPDH) abgezogen; man kommt zum s.g. „delta-delta CT" Berechnungsmodell. Der relative Expressionsunterschied einer Probe zwischen Behandlung und der Kontrolle (Ratio), normalisiert zum Referenzgen und bezogen auf eine Standardprobe, ergibt sich aus der arithmetischen Formel 2" ddCP
dCP=CP (cdc25a)- CP (GAPDH) ddCP= dCP (Behandlung Spiegeimer NOX-A)- dCP( Kontrolle: PBS oder NOX-A invers)
Ratio=2-ddCP
Ergebnis
Mittels RT-PCR konnten cdc25a und HMGA^ in MCF-7 und H- 1299 Zellen nachwiesen werden. MCF-7 Zellen zeigten bei einer geringen Expression von HMGAl a/b auch eine geringe Expression von cdc25a, wohingegen in H- 1299 Zellen HMGAl a/b und cdc25a stark exprimiert wurden. Die Transfektion von H- 1299 Zellen für 2 Tage mit HMGAl a/b bindenden Spiegelmeren führte zu einer deutlichen, dosisabhängigen Reduktion der Expression von cdc25a mRNA (Fig. 16 und Fig.17). Ein Kontroll-Spiegelmer zeigte bis 4μM keinen unspezifischen Effekt, weder auf die GAPDH noch auf die cdc25a mRNA Expression. Daraus kann geschlussfolgert werden, dass mittels Spiegelmeren die HMGA la/b induzierte Überexpression des potentiellen Onkogen cdc25a inhibiert werden kann.
Beispiel 5 Wirksamkeitsstudie Xenograft-Modell
Wirkung von Spiegelmeren auf das Tumorwachstum in vivo
Um die Hypothese zu überprüfen, dass HMGAl a/b bindende Spiegelmere das Wachstum von Tumoren in-vivo hemmen, wurden für die stark HMGAl a/b exprimierenden pankreaskarzi- nom Zellen PSN-I ein Xenograft Modell entwickelt. Auf Grundlage dieses Modells wurde ein Therapieversuch mit 2mg/kg NOX-A Spiegelmer-Mizellen bei einer N/P 2,5 durchgeführt (siehe Beispiel 3, Absatz 3.3).
Durchfuhrung/ Methode
Männlichen Nacktmäusen (NMRI: nu/nu) (Gruppengröße n = 8) wurden jeweils 107 PSN-I Zellen (ECACC) subkutan in die Flanke injiziert und das Tumorwachstum über 22 Tage verfolgt. Die Tiere hatten ein mittleres Gewicht von 25-27 g und waren 6-8 Wochen alt. Das aktive Spiegeimer NOX- A-3 'PEG und das inverse Kontroll-Spiegelmers INV-3'PEG wurden wie oben beschrieben durch Zugabe von PEI in einem Verhältnis von N/P 2,5 in Mizellen verpackt. lOOμl der Spiegeimer-Mizellen-Suspension (entsprechend 3,46 nmol/Tier bzw 2 mg/kg) wurden jeweils täglich in Tumornähe subkutan injiziert. Die Messung des Tumorvolumens und Körpergewichts erfolgte 3x die Woche. Die Tiere wurden am Tag 22 getötet und die Verteilung von NOX-A im Plasma, Leber, Niere und Tumor quantifiziert.
Dazu wurden die Gewebe in Hybridisierungspuffer (0,5x SSC pH 7,0; 0,5% (w/v) SDSarco- sinat) homogenisiert und 10 min bei 4000χ g zentrifugiert. Die gewonnenen Überstände wurden bis zur weiteren Benutzung bei -200C gelagert.
Die Menge an Spiegeimer in den Plasmaproben und in den Gewebhomogenaten wurde mittels eines Hybridisierungsassays untersucht (Drolet et al. (2000) Pharm.Res. 17:1503). Der Hybri- disierungsassay basiert auf folgendem Prinzip: das nachzuweisende Spiegeimer (L-RNA- Molekül) wird an eine immobilisierte L-DNA-Oligonukleotidsonde ( = Capture-Sonde NOX- A; hier: 51- CCCATATCCACCCACGTATCAGCCTTTTTTTT-NH2 -3"; komplementär zum 5 '-Ende von HMGAla/b-NOX-A) hybridisiert und mit einer biotinylierten Nachweis-L-DNA- Sonde (= Detektor-Sonde NOX-A; hier: S'-Biotin-
TTTTTTTTGGCTGAAACCACCCACATGG-3'; komplementär zum 3'-Ende von HMGAla/b-NOX-A) detektiert. Dazu wird ein Streptavidin-Alkalische-Phosphatase- Konjugat in einem weiteren Schritt an den Komplex gebunden. Nach Zugabe eines Chemilu- mineszenz-Substrats wird Licht generiert und in einem Luminometer gemessen.
Immobilisierung der Oligonukleotid-Sonde: 100 μl der Capture-Sonde (0,75 pmol/ml in Kopplungspuffer: 500 mM Na2HPO4 pH 8,5, 0,5 mM EDTA) wurden pro well (Vertiefung einer Platte) in DNA BIND Platten (Corning Costar) überfuhrt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Anschließend wurde 3 x mit je 200 μl Kopplungspuffer gewaschen und für 1 h bei 37°C mit je 200 μl Blockierungspuffer (0,5% (w/v) BSA in Kopplungspuffer) inkubiert. Nach nochmaligem Waschen mit 200 μl Kopplungspuffer und 3χ 200 μl Hybridisierungspuffer können die Platten zum Nachweis verwendet werden.
Hybridisierung und Nachweis: 10 μl EDTA Plasma oder Gewebehomogenat wurden mit 90 μl Detektionspuffer (2 pmol/μl Detektor-Sonde in Hybridisierungspuffer) gemischt und zentrifugiert. Je nach Bedarf erfolgten weitere Verdünnungen. Anschliessend wurden die Ansätze bei 950C für 10 min denaturiert, in die entsprechend vorbereiteten DNA-BIND wells (s.o.) transferiert und für 45 min bei ca. 400C inkubiert. Danach folgten Waschschritte: 2χ 200 μl Hybridisierungspuffer und 3χ 200 μl Ix TBS/Tween20 (20 mM Tris-Cl pH 7,6, 137 mM NaCl, 0,1 % (v/v) Tween 20). 1 μl Streptavidin-Alkalische-Phosphatase-Konjugat (Promega) wurden mit 5 ml Ix TBS/Tween 20 verdünnt. 100 μl des verdünnten Konjugats wurden pro well zugegeben und für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Es folgten Waschschritte: 2χ 200 μl Ix TBS/Tween 20 und 2χ 200 μl Ix Assay-Puffer (20 mM Tris-Cl pH 9,8, 1 mM MgCl2). Abschließend wurden 100 μl CSPD „Ready-To-Use Substrate" (Applied Biosystems) zugegeben, 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und die Chemilumines- zenz in einem Fluostar Optima Multidetektions-Plattenlesegerät (BMG) gemessen. Ergebnis
In einem Vorversuch hatte sich gezeigt, dass H- 1299 Zellen nach Transplantation als Tumor deutlich langsamer wuchsen als PSN-I und bei Vergleich der einzelnen Tiere ein inhomogenes Tumorwachstum zeigten und daher nicht als Xenograft-Modell für eine Therapiestudie geeignet erschienen. PSN-I Zellen zeigten innerhalb von 22 Tagen ein aggressives Tumorwachstum. Es konnte gezeigt werden, dass NOX-A-Mizellen bei einer Dosis von 2mg/kg das Wachstum von PSN-I Tumoren deutlich gegenüber der PBS Kontrolle verringern (Fig. 18 ). Das Gewicht der Tiere war von der Behandlung mit Spiegelmer-Mizellen unbeeinflusst. Das Kontroll-Spiegelmer zeigte keine unspezifische Inhibition des Tumorwachstums und hatte ebenfalls keine Wirkung auf das Gewicht der Tiere. Die Unterschiede der Tumorgrößen waren ab Tag 10 der Behandlung mit NOX- A3 'PEG Mizellen gegenüber nicht behandelten Tieren (PBS Kontrolle) signifikant bzw. hoch signifikant (student's t-Test). Die Endpunkt- Analyse nach 22 Tagen zeigte eine hoch signifikante, spezifische Verringerung des Tumorwachstums (p=0,0098 gegenüber PBS und p=0,022 gegenüber inversem Kontroll-Spiegelmer) (Fig. 19). PBS behandelte Mäuse zeigten einen durchschnittliches Tumorwachstum von 2,5 cm3, Tiere behandelt mit Kontroll-Spiegelmer ein durchschnittliches Tumorvolumen von 2,6 cm3 und NOX-A behandelte Tiere ein durchschnittliches Tumorvolumen von 1 ,2 cm3 nach 22 Tagen. (Box-andWhisker-Analyse). Dies entspricht einer Reduktion des Tumorwachstums um mehr als 50%.
Die Analyse der Gewebeverteilung von NOX-A zeigte eine hohe Konzentration im Tumor (Fig. 20).
Beispiel 6: Vergleich der in vivo Gewebeverteilung von verpackten und unverpackten Spiegeimer
Zur Überprüfung der effizienten Einschleusung von Spiegeimer Mizellen wurde ein nicht funktionelles Spiegeimer (Proof Of Concept = POC) am 3 '-Ende mit PEG 2kDa PEGyliert und mit einer Stickstoff/ Phosphat Ratio (N/P) von 2,5 in Mizellen verpackt (siehe Beispiel 3, Absatz 3.3). Analog zu dem in Beispiel 5 beschriebenen Versuchsaufbau wurde dieser Ansatz mit in Mizellen verpackten Spiegeimer sowie freiem, unverpackten Spiegeimer durchgeführt. Durchführung/ Methode
Männlichen Nacktmäusen (NMRI: nu/nu) (Gruppengröße n = 8) wurden jeweils 107 PSN-I Zellen (ECACC) subkutan in die Flanke injiziert und das Tumorwachstum über 25 Tage verfolgt. Die Tiere hatten ein mittleres Gewicht von 25-27 g und waren 6-8 Wochen alt. Das nicht funktionelles Spiegeimer POC-3 'PEG wurde wie oben beschrieben durch Zugabe von PEI in einem Verhältnis von N/P 2,5 in Mizellen verpackt. Als Kontrolle für die nicht PEI vermittelte Einschleusung von Spiegeimer diente nicht in Mizellen verpacktes Spiegeimer POC-3'PEG. lOOμl der Spiegelmer-Mizellen-Suspension bzw. Spiegeimer Lösung (entsprechend 1500 nmol/kg bzw. 2000 nmol/kg) wurden jeweils täglich in Tumornähe subkutan injiziert. Die Messung des Tumorvolumens und Körpergewichts erfolgte 3x die Woche. 24 bzw. 96 Stunden nach der letzten Injektion wurden je zwei Tiere pro Gruppe getötet und die Verteilung von POC-3TEG (verpackt/unverpackt) im Plasma, Gehirn, Herz, Lunge, Leber, Niere, Gallenblase, Bauchspeicheldrüse und Tumor quantifiziert.
Dazu wurden die Gewebe in Hybridisierungspuffer (0,5χ SSC pH 7,0; 0,5% (w/v) SDSarco- sinat) homogenisiert und 10 min bei 4000χ g zentrifugiert. Die gewonnenen Überstände wurden bis zur weiteren Benutzung bei -2O0C gelagert.
Die Menge an Spiegeimer in den Plasmaproben und in den Gewebhomogenaten wurde mittels eines Hybridisierungsassays untersucht (Drolet et al. (2000) Pharm.Res. 17:1503). Der Hybri- disierungsassay basiert auf folgendem Prinzip: das nachzuweisende Spiegeimer (L-RNA- Molekül) wird an eine immobilisierte L-DNA-Oligonukleotidsonde ( = Capture-Sonde POC ; hier: 5'- NH2(C7)-TTTTTTTTTAGCTCTGCACAGCGCT-3'; komplementär zum 3'-Ende von POC) hybridisiert und mit einer biotinylierten Nachweis-L-DNA-Sonde (= Detektor- Sonde POC; hier: 5'-CCGCATCAGACCGAGTTTCCTTATTTTTTTT-Biotin-3'; komplementär zum 5'-Ende von POC) detektiert. Dazu wird ein Streptavidin-Alkalische- Phosphatase-Konjugat in einem weiteren Schritt an den Komplex gebunden. Nach Zugabe eines Chemilumineszenz-Substrats wird Licht generiert und in einem Luminometer gemessen.
Immobilisierung der Oligonukleotid-Sonde: 100 μl der POC-Capture-Sonde (0,75 pmol/ml in Kopplungspuffer: 500 mM Na2HPO4 pH 8,5, 0,5 mM EDTA) wurden pro well (Vertiefung einer Platte) in DNA BIND Platten (Corning Costar) überführt und über Nacht bei 4°C inku- biert. Anschließend wurde 3 x mit je 200 μl Kopplungspuffer gewaschen und für 1 h bei 37°C mit je 200 μl Blockierungspuffer (0,5% (w/v) BSA in Kopplungspuffer) inkubiert. Nach nochmaligem Waschen mit 200 μl Kopplungspuffer und 3χ 200 μl Hybridisierungspuffer können die Platten zum Nachweis verwendet werden.
Hybridisierung und Nachweis: 10 μl EDTA Plasma oder Gewebehomogenat wurden mit 90 μl Detektionspuffer (2 pmol/μl POC-Detektor-Sonde in Hybridisierungspuffer) gemischt und zentrifügiert. Je nach Bedarf erfolgten weitere Verdünnungen. Anschliessend wurden die Ansätze bei 950C für 10 min denaturiert, in die entsprechend vorbereiteten DNA-BIND wells (s.o.) transferiert und für 45 min bei ca. 40°C inkubiert. Danach folgten Waschschritte: 2χ 200 μl Hybridisierungspuffer und 3χ 200 μl Ix TBS/Tween20 (20 mM Tris-Cl pH 7,6, 137 mM NaCl, 0,1 % (v/v) Tween 20). 1 μl Streptavidin-Alkalische-Phosphatase-Konjugat (Promega) wurden mit 5 ml Ix TBS/Tween 20 verdünnt. 100 μl des verdünnten Koηjugats wurden pro well zugegeben und für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Es folgten Waschschritte: 2x 200 μl Ix TBS/Tween 20 und 2χ 200 μl Ix Assay-Puffer (20 mM Tris-Cl pH 9,8, 1 mM MgCl2). Abschließend wurden 100 μl CSPD „Ready-To-Use Substrate" (Applied Biosystems) zugegeben, 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und die Chemilumines- zenz in einem Fluostar Optima Multidetektions-Plattenlesegerät (BMG) gemessen.
Ergebnis
Die Analyse der Gewebeverteilung des nicht funktionellen Spiegeimers POC-3 'PEG, welches in Mizellen verpackt wurde, zeigte nach 24 Stunden eine signifikant höhere Konzentration im Tumorgewebe (24,925 +/- 13,301 pmol/mg) als nicht verpacktes Spiegeimer (0,840 +/- 0,255 pmol/mg) (Fig. 21 A). Während die Konzentration des verpackten Spiegeimers sich nach weiteren drei Tagen (96 Stunden) halbiert hatte (11,325 +/- 7,050 pmol/mg), konnte vom unverpackten Spiegeimer nur noch eine sehr geringe Menge (0,120 +/- 0,057 pmol/mg) nachgewiesen werden.
Der Plasmaspiegel von nicht verpacktem Spiegeimer (2,950 +/- 0,438 pmol/ml) nach 24 Stunden war vergleichbar mit dem von PEI verpacktem Spiegeimer (1,930 +/- 2,729 pmol/ml). Nach 96 Stunden zeigten sich deutliche Unterschiede, wobei etwa die vierfache Menge des verpackten gegenüber dem unverpackten Spiegeimer nachgewiesen werden konnte.
Eine leichte Anreicherung in der Niere nach 24 Stunden konnte für beide Formulierungen beobachtet werden, wohingegen nur für nicht verpacktes Spiegeimer eine geringe Anreicherung in der Leber und Gallenblasen gefunden wurde. Nach 96 Stunden konnten in Leber und Niere für beide Formulierungen nur noch geringe Mengen an Spiegeimer nachgewiesen werden. Dahingegen konnte für verpacktes im Vergleich zum unverpacktem Spiegeimer leicht erhöhte Werte in der Gallenblase und Bauchspeicheldrüse (jedoch hohe Standardabweichung) beobachtet werden.
Zusammenfassend, konnte im Vergleich der Gewebeverteilung (24 bzw. 96 Stunden nach letzter Injektion) von Spiegelmeren in An- und Abwesenheit von PEI gezeigt werden, dass Spiegelmer-Mizellen eine deutlich verlängerte Verweildauer im Plasma und Tumor im Vergleich zu nicht verpacktem Material aufweisen (Abb. 21B) und somit einen vielversprechenden Ansatz zur Verwendung von Spiegelmeren gegen intrazelluläre Zielmoleküle darstellen.
Die folgenden Literaturstellen werden hierin durch Bezugnahme aufgenommen.
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Die in der vorangehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination zur Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.

Claims

Ansprüche
1. Verwendung einer L-Nukleinsäure als intrazellulär aktives Agens.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die L-Nukleinsäure ein Spiegeimer ist.
3. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass die L- Nukleinsäure in Wechselwirkung mit einem intrazellulären Rezeptor tritt.
4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der intrazelluläre Rezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend molekulare Rezeptoren, Enzyme, Chape- ron-Moleküle, Signalpeptide, intrazelluläre Strukturen und Stoffwechselintermediate.
5. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der intrazelluläre Rezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Polypeptide, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren, Lipide und Kombinationen davon.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die L- Nukleinsäure mit einem intrazellulären Rezeptor innerhalb einer Zelle in Wechselwirkung tritt.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der intrazelluläre Rezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Transkriptionsfaktoren und einen AT-Haken bindende DNA-bindende Proteine.
8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der intrazelluläre Rezeptor aus der Gruppe umfassend die HMG-Proteine ausgewählt ist, bevorzugterweise aus der Gruppe umfassend HMGAl, HMGAIa, HMGAIb und HMGA2 ausgewählt ist.
9. Verfahren zum Binden eines intrazellulären Rezeptor umfassend: Bereitstellen einer Zelle enthaltend mindestens den einen intrazellulären Rezeptor,
Bereitstellen einer L-Nukleinsäure, und
Inkubieren der Zelle mit der L-Nukleinsäure.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Inkubieren unter Bedingungen erfolgt, so dass die L-Nukleinsäure an den intrazellulären Rezeptor in der Zelle bindet.
11. Verfahren nach Anspruch 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, dass die L-Nukleinsäure ein Spiegeimer ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Inkubation der Zelle mit der L-Nukleinsäure bestimmt wird, ob eine Bindung, insbesondere eine intrazelluläre Bindung, der L-Nukleinsäure an dem intrazellulären Rezeptor erfolgt ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der intrazelluläre Rezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend molekulare Rezeptoren, Stoffwechselintermediate und Enzyme.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der intrazelluläre Rezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Polypeptide, Kohlenhydrate, Nukleinsäure, Lipide und Kombinationen davon.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der intrazelluläre Rezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Transkriptionsfaktoren und einen AT-Haken bindende DNA-bindende Proteine.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der intrazelluläre Rezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend HMG-Proteine, bevorzugterweise ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend HMGAl, HMGAIa, HMGAIb und HMGA2.
17. Verwendung einer L-Nukleinsäure zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung und/oder Prävention einer Erkrankung, wobei das Zielmolekül des Medikamentes ein intrazelluläres Zielmolekül ist.
18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der intrazelluläre Rezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend molekulare Rezeptoren, Enzyme, Chaperon-Moleküle, Signalpeptide, intrazelluläre Strukturen und Stoffwechselinter- mediate.
19. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der intrazelluläre Rezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Polypeptide, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren, Lipide und Kombinationen davon.
20. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Zielmolekül ausgewählt ist aus der Gruppe, die Transkriptionsfaktoren und einen AT- Haken bindende DNA-bindende Proteine umfasst.
21. Verwendung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Zielmolekül ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend HMG-Proteine, bevorzugterweise ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend HMGAl, HMGAIa, HMGAIb und HMGA2.
22. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Tumorerkrankungen, Virusinfektionen und Arteriosklerose.
23. Verwendung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumorerkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend mesenchymale Tumoren, epitheliale Tumoren, benigne Tumoren, maligne Tumoren und metastasierende Tumoren.
24. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Zielmolekül HMGA ist und die Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Karzinome von Prostata, Pankreas, Schilddrüse, Cervix, Magen, Brust, Colon/Rektum, Ovarien; Neuroblastome; Lymphome, Uterusleiomyome; Lipome; Endometriumpoly- pen; chondroide Hamartome der Lunge; pleomorphe Adenome der Kopfspeicheldrüsen; Hämangiopericytome; chondromatöse Tumore; aggressive Angiomyxome; diffuse Astrocytome; Osteoklastome; Hautkrebs; Burkitts Lymphom; Lewis-Lungenkrebs; Leukämie; nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom; sowie jeweils Metastasen und/oder metastasierende Formen davon.
25. Verwendung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Arteriosklerose durch HMGAl, HMGAIa, HMGIb und/oder HMGA2 vermittelte Bildung von artie- rosklerotischen Plaques ausgelöst oder bedingt ist.
26. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass das intrazelluläre Zielmolekül intrazellulär vorliegt.
27. Verwendung einer L-Nukleinsäure zur Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Diagnose, wobei das Zielmolekül des diagnostischen Mittels ein intrazelluläres Zielmolekül ist.
28. Verwendung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass der intrazelluläre Rezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend molekulare Rezeptoren, Enzyme, Chaperon-Moleküle, Signalpeptide, intrazelluläre Strukturen und Stoffwechselinter- mediate.
29. Verwendung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass der intrazelluläre Rezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Polypeptide, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren, Lipide und Kombinationen davon.
30. Verwendung nach einem der Ansprüche 27 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Zielmolekül ausgewählt ist aus der Gruppe, die Transkriptionsfaktoren und einen AT- Haken bindende DNA-bindende Proteine umfasst.
31. Verwendung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass das Zielmolekül ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend HMG-Proteine, bevorzugterweise ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend HMGA, HMGAIa, HMGAIb und HMGA2.
32. Verwendung nach einem der Ansprüche 30 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Tumorerkrankungen, Virusinfektionen und Arteriosklerose.
33. Verwendung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumorerkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend mesenchymale Tumoren, epitheliale Tumoren, benigne Tumoren, maligne Tumoren und metastatisierende Tumoren.
34. Verwendung nach einem der Ansprüche 30 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass das Zielmolekül HMGA ist und die Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Karzinome von Prostata, Pankreas, Schilddrüse, Cervix, Magen, Brust, Colon/Rektum, Ovarien; Neuroblastome; Lymphome, Uterusleiomyome; Lipome; Endometriumpoly- pen; chondroide Hamartome der Lunge; pleomorphe Adenome der Kopfspeicheldrüsen; Hämangiopericytome; chondromatöse Tumore; aggressive Angiomyxome; diffuse Astrocytome; Osteoklastome; Hautkrebs; Burkitts Lymphom; Lewis-Lungenkrebs; Leukämie; nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom; sowie jeweils Metastasen und/oder metastasierende Formen davon.
35. Verwendung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Arteriosklerose durch HMGAl, HMGAIa, HMGIb und/oder HMGA2 vermittelte Bildung von artie- rosklerotischen Plaques ausgelöst wird.--.,,.
36. Verwendung nach einem der Ansprüche 27 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass das intrazelluläre Zielmolekül intrazellulär vorliegt.
37. Zusammensetzung umfassend eine an ein intrazelluläres Zielmolekül bindende L- Nukleinsäure und ein Abgabevehikel.
38. Zusammensetzung nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass das Abgabevehikel ein für die intrazelluläre Abgabe der L-Nukleinsäure geeignetes Abgabevehikel ist.
39. Zusammensetzung nach Anspruch 37 oder 38, dadurch gekennzeichnet, dass das Abgabevehikel ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Vehikel, Konjugate und physikalische Maßnahmen.
40. Zusammensetzung nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass das Abgabevehikel ein Vehikel ist, wobei das Vehikel ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Liposome, Nanopartikel, Mikropartikel, Cyclodextrine oder Dendrimere, oder ein Vesikel ist, das aus Polypeptiden, Polyethylenimin und/oder amphipathischen Molekülen besteht.
41. Zusammensetzung nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass das Abgabevehikel ein Konjugat ist, wobei das Konjugat ein Konjugat für die Rezeptor-vermittelte Endozytose, ein Konjugat mit einem fusogenen Peptid, ein Konjugat mit einem Sig- nalpeptid, ein Konjugat mit einer Nukleinsäure, bevorzugterweise ein Konjugat mit einem Spiegeimer oder ein lipophiles Konjugat ist.
42. Zusammensetzung nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass das Abgabevehikel eine physikalische Maßnahme ist, wobei die Maßnahme bevorzugterweise ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Elektroporation, Iontophorese, Druck, Ultraschall und Schockwellen.
43. Zusammensetzung nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass das Abgabevehikel Polyethylenimin umfasst.
44. Zusammensetzung nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyethylenimin ein verzweigtes Polyethylenimin mit einem Molekulargewicht von etwa 25 kDa ist.
45. Zusammensetzung nach Anspruch 43 oder 44, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyethylenimin eine Mizelle oder eine mizellenartige Struktur ausbildet.
46. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 37 bis 45, dadurch gekennzeichnet, dass die L-Nukleinsäure ein Spiegeimer ist.
47. Zusammensetzung nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, dass das Spiegeimer eine Modifikation trägt, wobei die Modifikation ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend PEG-Reste.
48. Zusammensetzung nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, dass der PEG-Rest ein Molekulargewicht von etwa 1.000 bis 10.000 Da aufweist, bevorzugterweise ein Molekulargewicht von etwa 1.500 bis 2.500 Da und am bevorzugtesten ein Molekulargewicht von etwa 2.000 Da aufweist.
49. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 47 oder 48, dadurch gekennzeichnet, dass die Modifikation am 5 '-Terminus oder am 3 '-Terminus der L-Nukleinsäure gebunden ist.
50. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 46 bis 49, dadurch gekennzeichnet, dass in der Zusammensetzung das Verhältnis aus Gesamtanzahl der Stickstoffgruppen des Polyethylenimins und Gesamtanzahl der Phosphatgruppen der in der Zusammensetzung enthaltenen Nukleinsäure etwa 1 bis 20, bevorzugterweise etwa 1,5 bis 10, bevorzugtererweise etwa 2 bis 5 und am bevorzugtesten etwa 2 bis 3 beträgt.
51. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 37 bis 50, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung die L-Nukleinsäure intrazellulär bereitstellt.
52. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 37 bis 51 , und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
53. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die L-Nukleinsäure eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 37 bis 52 ist.
54. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 16, wobei die L-Nukleinsäure eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 37 bis 52 ist.
55. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 26, wobei die L-Nukleinsäure eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 37 bis 52 ist.
56. Verwendung nach einem der Ansprüche 27 bis 36, wobei die L-Nukleinsäure eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 37 bis 52 ist.
57. HMGA bindende Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure einen Abschnitt Box Al und einen Abschnitt Box A2 umfasst, wobei der Abschnitt Box Al und der Abschnitt Box A2 durch einen Zwischenabschnitt miteinander verbunden sind und wobei Box Al und Box A2 einzeln und unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, die GGGCG, GGGUG und GGGAG umfasst.
58. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 57, dadurch gekennzeichnet, dass der Zwischenabschnitt entweder aus einem Zwischenabschnitt Zl umfassend sechs oder sieben Nukleotide oder aus einem Zwischenabschnitt Z2 umfassend 12 bis 25 Nukleotide besteht.
59. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 57 bis 58, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure am 5 '-Ende des Abschnittes Box Al einen ersten Abschnitt aufweist und am 3 '-Ende des Abschnittes Box A2 einen zweiten Abschnitt aufweist, wobei bevorzugterweise beide Abschnitte unabhängig voneinander je vier bis acht Nukleotide umfassen.
60. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 59, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Abschnitte wenigstens teilweise oder vollständig miteinander hybridisiert sind, wobei sich die Hybridisierung über vier bis acht Nukleotidpaare erstreckt.
61. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 59 oder 60, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure am 5 '-Ende des Abschnittes Box Al einen Abschnitt Helix Al und am 3 '-Ende des Abschnittes Box A2 einen Abschnitt Helix A2 aufweist, wobei bevorzugterweise der Abschnitt Helix Al vier bis acht Nukleotide umfasst und bevorzugterweise der Abschnitt Helix A2 vier bis acht Nukleotide umfasst, und wobei bevorzugterweise der Abschnitt Helix Al den ersten Abschnitt am 5 '-Ende des Abschnittes Box Al oder einen Teil davon darstellt, und wobei bevorzugterweise der Abschnitt Helix A2 den zweiten Abschnitt am 3 '-Ende des Abschnittes Box A2 oder einen Teil davon darstellt, wobei die Länge des Abschnittes Helix Al unabhängig von der Länge des Abschnittes Helix A2 ist.
62. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 61, dadurch gekennzeichnet, dass die Abschnitte Helix Al und Helix A2 wenigstens teilweise oder vollständig miteinander hybridisiert sind, wobei sich die Hybridisierung über vier bis acht Nukleotidpaare erstreckt.
63. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 61 oder 62, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Helix Al und dem 5 '-Ende des Abschnittes Box Al ein Abschnitt Helix Bl angeordnet ist und zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Box A2 und dem 5 '-Ende des Abschnittes Helix A2 ein Abschnitt Helix B2 angeordnet ist, wobei bevorzugterweise die Länge des Abschnittes Helix Bl und Helix B2 jeweils einzeln und unabhängig eine Länge von vier bis acht Nukleotiden umfasst.
64. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 63, dadurch gekennzeichnet, dass die Abschnitte Helix Bl und Helix B2 wenigstens teilweise oder vollständig miteinander hybridisiert sind, wobei sich die Hybridisierung über vier bis acht Nukleotidpaare erstreckt.
65. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 63 oder 64, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Helix Al und dem 5 '-Ende des Abschnittes Helix Bl null bis fünf Nukleotide angeordnet sind.
66. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 65, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Helix Al und dem 5 '-Ende des Abschnittes Helix Bl zwei Nukleotide angeordnet sind.
67. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 63 bis 66, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Helix B2 und dem 5'-Ende des Abschnittes Helix A2 null bis sechs Nukleotide angeordnet sind.
68. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 67, bevorzugterweise insoweit sich dieser auf Anspruch 66 bezieht, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Helix B2 und dem 5 '-Ende des Abschnittes Helix A2 ein Nukleotid angeordnet ist.
69. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 63 bis 68, wobei die Summe der Nukleotide von Abschnitt Helix Al und von Abschnitt Helix Bl 10 bis 12 Nukleotide -beträgt und die Summe der Nukleotide von Abschnitt Helix A2 und von Abschnitt Helix B2 10 bis 12 Nukleotide beträgt.
70. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 69, wobei die Summe der hybridisierten Nukleotide aus der Hybridisierung von Abschnitt Helix Al mit Abschnitt Helix A2 und von Abschnitt Helix Bl mit Abschnitt Helix B2 10 bis 12 Nukleotidpaare beträgt.
71. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 63 bis 70, bevorzugterweise 63 oder 64, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure keinen Abschnitt Helix Al und Helix A2 umfasst, wodurch am 5 '-Ende der Nukleinsäure der Abschnitt Helix Bl und am 3 '-Ende die Helix B2 angeordnet ist, wobei bevorzugterweise die Länge des Abschnittes Helix Bl und Helix B2 jeweils einzeln und unabhängig eine Länge von vier bis acht Nukleotiden umfasst.
72. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 71, wobei die Abschnitte Helix Bl und Helix B2 wenigstens teilweise oder vollständig miteinander hybridisiert sind, wobei sich die Hybridisierung über vier bis acht Nukleotidpaare erstreckt.
73. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 61 bis 62, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Helix Al und dem 5 '-Ende des Abschnittes Box Al ein bis fünf Nukleotide angeordnet sind und zwischen dem 3'- Ende des Abschnittes Box A2 und dem 5 '-Ende des Abschnittes Helix A2 ein bis drei Nukleotide angeordnet sind.
74. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 63 bis 72, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Helix Bl und dem 5 '-Ende des Abschnittes Box Al zwei Nukleotide angeordnet sind und zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Box A2 und dem 5 '-Ende des Abschnittes Helix B2 eins bis sieben Nukleotide angeordnet sind.
75. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 58 bis 65, 67, soweit sich dieser auf die Ansprüche 63 bis 65 bezieht, 69 und 70, soweit sich diese auf die Ansprüche 63 bis 65 und 67 beziehen, 71 und 72 soweit sich diese auf die Ansprüche 63 bis 65 und 67 und 69 und 70 beziehen, oder 74, soweit sich dieser auf die Ansprüche 63 bis 65, 67, 69 bis 72 bezieht, jeweils in dem hierin eingeschränkten Umfang, dadurch gekennzeichnet, dass der Zwischenabschnitt Zl sechs oder sieben Nukleotide umfasst.
76. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 75, dadurch gekennzeichnet, dass der Zwischenabschnitt Zl die Sequenz NiN2GN8N3N4N5 aufweist, wobei
N, = U, C, A oder G ist; N2 = G oder U ist; N3 = U oder C ist; N4 = U oder A ist; N5 = G oder A ist; und N8 = U ist oder fehlt.
77. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 76, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure einen Abschnitt Box Al und einen Abschnitt Box A2 umfasst, wobei das 3 '-Ende des Abschnittes Box Al direkt mit dem 5 '-Ende des Zwischenabschnittes Zl verbunden ist, und das 3 '-Ende des Zwischenabschnittes Zl direkt mit dem 5'- Ende des Abschnittes Box A2 verbunden ist.
78. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 75 bis 77, insbesondere 77, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure einen Abschnitt Helix Bl und einen Abschnitt Helix B2 umfasst.
79. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 78, dadurch gekennzeichnet, dass die Abschnitte Helix Bl und Helix B2 jeweils einzeln und unabhängig voneinander vier bis acht Nukleotide umfassen, die bevorzugterweise vollständig oder teilweise miteinander hybridisiert sind.
80. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 78 oder 79, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem 3'-Ende des Abschnittes Helix Bl und dem 5'-Ende des Abschnittes Box Al in 5 '-3 '-Richtung zwei Nukleotide N6, N7 angeordnet sind, wobei N6 G, A oder U ist, und N7 = G oder U ist.
81. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 78 bis 80, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Box A2 und dem 5'-Ende des Abschnittes Helix B2 kein Nukleotid angeordnet ist, oder in 5 '-3 '-Richtung die Nukleotidsequenz GNy angeordnet ist, wobei Ny null bis sechs Nukleotide umfasst, bevorzugterweise 0 oder 6 Nukleotide.
82. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 75 bis 81, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure einen Abschnitt Helix Al und Helix A2 umfasst.
83. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 82, dadurch gekennzeichnet, dass die Abschnitte Helix Al und Helix A2 jeweils und unabhängig voneinander vier bis acht Nukleotide umfassen, wobei bevorzugterweise_die Abschnitte Helix Al und Helix A2 vollständig oder teilweise miteinander hybridisiert sind.
84. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 82 oder 83, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Helix Al und dem 5 '-Ende des Abschnittes Helix Bl eine Nukleotidsequenz Nx angeordnet ist, wobei Nx null bis fünf Nukleotide umfasst.
85. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 82 bis 84, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Helix B2 und dem 5 '-Ende des Abschnittes Helix A2 eine Nukleotidsequenz N2 angeordnet ist, wobei N2 null bis sechs Nukleotide umfasst.
86. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 78 bis 85, wobei die Summe der hybridisierten Nukleotide aus der Hybridisierung von Abschnitt Helix Al mit Abschnitt Helix A2 und von Abschnitt Helix Bl mit Abschnitt Helix B2 10 bis 12 Nukleotidpaare beträgt.
87. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 81 bis 86, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Box A2 und dem 5 '-Ende des Abschnittes Helix B2 in 5 '-3 '-Richtung die Nukleotidsequenz GNy angeordnet ist, wobei Ny null bis sechs Nukleotide umfasst, bevorzugterweise 0 oder 6 Nukleotide.
88. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 87 umfassend die folgende Struktur
Helix Al-Nv-Helix BI-N6N7POxAlIN1N2GN8N3N4NSiBOX AlIG-NY-HeIiX B2-N7-Helix A2
wobei
N2 = G oder U ist;
N3 = U oder C ist;
N4 = U oder A ist;
N5 = G oder A ist;
N6 = G, A oder U ist;
N7 = G oder U ist;
N8 = U oder kein Nukleotid ist;
Nx = null bis fünf Nukleotide ist;
Ny = null oder sechs Nukleotide ist; und
N2 = null bis sechs Nukleotide ist; der Abschnitt Box Al und Abschnitt Box A2 jeweils einzeln und unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe von Nukleotidsequenzen umfassend GGGCG, GGGUG und GGGAG;
der Abschnitt Helix Al und der Abschnitt Helix A2 jeweils einzeln und unabhängig voneinander vier bis acht Nukleotide umfassen, wobei bevorzugterweise die Abschnitte Helix Al und Helix A2 vollständig oder teilweise miteinander hybridisiert sind, und
die Abschnitte Helix Bl und Helix B2 jeweils einzeln und unabhängig voneinander vier bis acht Nukleotide umfassen, wobei bevorzugterweise die Abschnitte Helix Bl und Helix B2 vollständig oder teilweise miteinander hybridisiert sind und der hybridisierende Bereich vier bis acht Nukleotide umfasst, und wobei die Summe der hybridisierten Nukleotide aus der Hybridisierung von Abschnitt Helix Al mit Abschnitt Helix A2 und von Abschnitt Helix Bl mit Abschnitt Helix B2 10 bis 12 Nukleotidpaare beträgt.
89. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 87 oder 88, umfassend eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ. ID. No. 1, SEQ. ID. No. 2, SEQ. ED. No. 3, SEQ. ID. No. 5, SEQ. ID. No. 6, SEQ. ID. No. 7 und SEQ. ID. No. 13.
90. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 81 bis 86, dadurch gekennzeichnet, dass sich das 3 '-Ende des Abschnittes Box A2 unmittelbar an das 5'- Ende des Abschnittes Helix B2 anschließt.
91. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 90 umfassend die folgende Struktur
Helix Al-Nv-Helix B 1-N6N7POX AIIN1 N2GN8N3N4N5IBOX Ä2|Helix B2-Nz-Helix A2
wobei
N, = U, C, A oder G ist; N2 = G oder U ist; N3 = U oder C ist; N4 = U oder A ist;
N5 = G oder A ist;
N6 = G, A oder U ist;
N7 = G oder U ist;
N8 = U oder kein Nukleotid ist;
Nx = null bis fünf Nukleotide ist; und
N2 = null bis sechs Nukleotide ist;
der Abschnitt Box Al und Abschnitt Box A2 jeweils einzeln und unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe von Nukleotidsequenzen umfassend GGGCG, GGGUG und GGGAG;
der Abschnitt Helix Al und der Abschnitt Helix A2 jeweils einzeln und unabhängig voneinander vier bis acht Nukleotide umfassen, wobei bevorzugterweise die Abschnitte Helix Al und Helix A2 vollständig oder teilweise miteinander hybridisiert sind, und
die Abschnitte Helix Bl und Helix B2 jeweils einzeln und unabhängig voneinander vier bis acht Nukleotide umfassen, wobei bevorzugterweise die Abschnitte Helix Bl und Helix B2 vollständig oder teilweise miteinander hybridisiert sind und der hybridisierende Bereich vier bis acht Nukleotide umfasst, und wobei die Summe der hybridisierten Nukleotide aus der Hybridisierung von Abschnitt Helix Al mit Abschnitt Helix A2 und von Abschnitt Helix Bl mit Abschnitt Helix B2 10 bis 12 Nukleotidpaare beträgt.
92. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 90 oder 91, umfassend eine Sequenz umfassend SEQ. ID. No. 3.
93. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 88, umfassend die folgende Struktur
Helix Bl-N6N7JBoX AIININ2GN8N3N4N5IBOX A2|G-NY-Helix B2
94. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 91 , umfassend die folgende Struktur. Helix Bl-N6N7JBoX AIININ2GN8N3N4N5IBOX Ä2|Helix B2
95. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 93, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend SEQ. ED. No. 15 und SEQ. ID. No. 16.
96. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 58 bis 70 und 73 oder 74, dadurch gekennzeichnet, dass der Zwischenabschnitt Z2 12 bis 25 Nukleotide umfasst.
97. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 96, dadurch gekennzeichnet, dass der Zwischenabschnitt Z2 einen Abschnitt Helix Cl und einen Abschnitt Helix C2 umfasst.
98. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 97, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem Abschnitt Helix Cl und dem Abschnitt Helix C2 ein zentraler Abschnitt Nc angeordnet ist.
99. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 97 oder 98, dadurch gekennzeichnet, dass die Länge des Abschnittes Helix Cl und Helix C2 gleich lang ist.
100. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 97 bis 99, dadurch gekennzeichnet, dass die Länge des Abschnittes Helix Cl und Helix C2 einzeln und unabhängig drei bis sechs Nukleotide ist.
101. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 97 bis 100, dadurch gekennzeichnet, dass die Abschnitte Helix Cl und Helix C2 vollständig oder teilweise miteinander hybridisiert ist.
102. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 96 bis 101, dadurch gekennzeichnet, dass der zentrale Abschnitt N0 drei bis fünf Nukleotide umfasst.
103. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 96 bis 102, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure einen Abschnitt Box Al und einen Abschnitt Box A2 umfasst, wobei zwischen dem 3'-Ende des Abschnittes Box Al und dem 5'-Ende des Abschnittes Helix Cl eine Nukleotidsequenz Nb angeordnet ist und drei Nukleotide umfasst.
104. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 96 bis 103, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure einen Abschnitt Box Al und einen Abschnitt Box A2 umfasst, wobei zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Helix C2 und dem 5 '-Ende des Abschnittes Box A2 eine Nukleotidsequenz Nd angeordnet ist und zwei bis fünf Nukleotide umfasst.
105. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 96 bis 104, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure einen Abschnitt Helix Al und einen Abschnitt Helix A2 umfasst.
106. HMGA bindende Nukleinsäure Anspruch 105, dadurch gekennzeichnet, dass die Abschnitte Helix Al und Helix A2 jeweils einzeln und unabhängig voneinander fünf bis sechs Nukleotide umfassen, wobei bevorzugterweise der Abschnitt Helix Al und der Abschnitt Helix A2 vollständig oder teilweise miteinander hybridisiert sind.
107. HMGA bindende Nukleinsäure einem der Ansprüche 105 bis 106, dadurch gekennzeichnet, dass das zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Helix Al und dem 5'-Ende des Abschnittes Box Al eine Nukleotidsequenz Na angeordnet ist, wobei Na ein bis fünf Nukleotide umfasst.
108. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 105 bis 107, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Box A2 und dem 5 '-Ende des Abschnittes Helix A2 in 5 '-3 '-Richtung eine Nukleotidsequenz GNe angeordnet ist, wobei Ne eins bis zwei Nukleotide, bevorzugterweise A oder UU umfasst.
109. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 105 bis 108, dadurch gekennzeichnet, dass der Abschnitt Helix Cl und der Abschnitt Helix C2 jeweils einzeln und unabhängig voneinander eine Länge von fünf oder sechs Nukleotiden aufweisen, wobei bevorzugterweise die Abschnitte Helix Cl und Helix C2 vollständig oder teilweise miteinander hybridisiert sind.
1 10. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 109, umfassend die folgende Struktur:
(III)
wobei
N3 = ein bis fünf Nukleotide ist;
Nb = drei Nukleotide ist;
Nc = drei bis fünf Nukleotide ist;
Nd = zwei bis fünf Nukleotide ist; und
Ne = eins bis zwei Nukleotide, bevorzugterweise A oder UU ist;
der Abschnitt Box Al und der Abschnitt Box A2 jeweils einzeln und unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, die GGGCG, GGGUG und GGGAG um- fasst,
die Abschnitte Helix Al und Helix A2 jeweils einzeln und unabhängig voneinander fünf oder sechs Nukleotide umfassen, und
die Abschnitte Helix Cl und Helix C2 jeweils fünf oder sechs Nukleotide umfasst, die bevorzugterweise vollständig oder teilweise miteinander hybridisiert sind.
111. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 110, umfassend eine Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend SEQ. ED. No. 8, SEQ. DD. No. 9, SEQ. ID. No. 10, SEQ. ED. No. 11, SEQ. ID. No. 14, SEQ. ID. No. 22 und SEQ. ID. No. 24.
112. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 96 bis 101, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure einen Abschnitt Box Al und einen Abschnitt Helix Cl umfasst, wobei zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Box Al und dem 5'- Ende des Abschnittes Helix Cl ein Nukleotid A angeordnet ist.
113. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 112, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure einen Abschnitt Helix C2 und einen Abschnitt Box A2 umfasst, wobei zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Helix C2 und dem 5 '-Ende des Abschnittes Box A2 ein Nukleotid G angeordnet ist.
114. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 112 oder 113, dadurch gekennzeichnet, dass der zentrale Abschnitt Nc vier Nukleotide umfasst, , wobei Nc bevorzugterweise GAUG ist.
115. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 112 bis 114, umfassend einen Abschnitt Helix Bl und einen Abschnitt Helix B2.
116. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 115, dadurch gekennzeichnet, dass die Abschnitte Helix Bl und Helix B2 einzeln und unabhängig voneinander jeweils fünf Nukleotide umfassen, wobei bevorzugterweise der Abschnitt Helix Bl mit dem Abschnitt Helix B2 hybridisiert ist.
117. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 115 oder 116, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem 3'-Ende des Abschnittes Helix Bl und dem 5'-Ende des Abschnittes Box Al eine Nukleotidsequenz umfassend zwei Nukleotide N, angeordnet sind, wobei Nj bevorzugterweise AG ist.
118. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 115 bis 117, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Box A2 und dem 5 '-Ende von Helix B2 ein Nukleotid G angeordnet ist.
119. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 112 bis 118, umfassend einen Abschnitt Helix Al und einen Abschnitt Helix A2.
120. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 119, wobei die Abschnitte Helix Al und Helix A2 einzeln und unabhängig voneinander jeweils sechs Nukleotide umfassen und bevorzugterweise der Abschnitt Helix Al und der Abschnitt Helix A2 miteinander hybridisiert sind.
121. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 119 oder 120, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Helix Al und dem 5'-Ende des Abschnittes Helix Bl eine Nukleotidsequenz umfassend zwei Nukleotide N, angeordnet ist, wobei Nj bevorzugterweise CA ist.
122. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 119 bis 121, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem 3 '-Ende des Abschnittes Helix B2 und dem 5 '-Ende des Abschnittes Helix A2 ein Nukleotid A ist.
123. HMGA bindende Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 112 bis 122, dadurch gekennzeichnet, dass die Abschnitte Helix Cl und Helix C2 jeweils drei Nukleotide umfassen, wobei bevorzugterweise die Abschnitte Helix Cl und Helix C2 miteinander hybridisiert sind.
124. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 123 umfassend die folgende Struktur:
Helix Al-NrHelix Bl-Nj-fBox Al|-A-Ηelix Cl'-Nc-<Helix C2'-G-|Box Ä2|-G-Helix B2-A
Helix A2
wobei
Nj = zwei Nukleotide umfasst, bevorzugterweise CA ist; Nj = zwei Nukleotide umfasst, bevorzugterweise AG ist; Nc = vier Nukleotide umfasst, bevorzugterweise GAUG ist;
die Abschnitte Box Al und Box A2 jeweils einzeln und unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend die Sequenzen GGGCG, GGGUG und GGGAG;
die Abschnitte Helix Al und Helix A2 jeweils einzeln und unabhängig sechs Nukleotide umfassen, die bevorzugterweise miteinander hybridisiert sind; die Abschnitte Helix Bl und Helix B2 jeweils einzeln und unabhängig fünf Nukleotide umfassen, wobei bevorzugterweise der Abschnitt Helix Bl und der Abschnitt Helix B2 miteinander hybridisiert ist; und
die Abschnitte Helix Cl und Helix C2 jeweils einzeln und unabhängig drei Nukleotide umfassen, wobei bevorzugterweise die Abschnitte Helix Cl und Helix C2 miteinander hybridisiert sind.
125. HMGA bindende Nukleinsäure nach Anspruch 124, umfassend eine Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend SEQ. ID. No. 12.
126. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 57 bis 125, dadurch gekennzeichnet, dass sie an Transkriptionsfaktoren binden, insbesondere Transkriptionsfaktoren, die einen AT- Haken aufweisen.
127. Nukleinsäure bindend an einen Transkriptionsfaktor umfassend einen AT-Haken, wobei die Nukleinsäure einen Aufbau gemäß einem der Ansprüche 57 bis 126 umfasst.
128. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 37 bis 52, wobei die L-Nukleinsäure eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 57 bis 127 ist.
129. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die L-Nukleinsäure eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 57 bis 127 ist.
130. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 16, wobei die L-Nukleinsäure eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 57 bis 127 ist.
131. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 26, wobei die L-Nukleinsäure eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 57 bis 127 ist.
132. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 36, wobei die L-Nukleinsäure eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 57 bis 127 ist.
133. Verfahren zum Screenen eines HMGA- Antagonisten oder HMGA- Agonisten umfassend die folgenden Schritte:
Bereitstellen eines Kandidaten-HMGA-Antagonisten und/oder eines Kandida- ten-HMGA-Agonisten,
Bereitstellen einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 57 bis 127,
Bereitstellen eines Testsystems, welches ein Signal in Gegenwart eines HMGA-Antagonisten und/oder eines HMGA-Agonisten liefert, und
Bestimmen, ob der Kandidaten-HMGA-Antagonist ein HMGA-Antagonist ist und/oder ob der Kandidaten-HMGA-Agonist ein HMGA- Agonist ist.
134. Verfahren zum Screenen eines HMGA-Agonisten und/oder eines HMGA- Antagonisten umfassend die folgenden Schritte:
Bereitstellen eines an einer Phase, bevorzugterweise einer Festphase, imobili- sierten HMGA,
Bereitstellen einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 57 bis 127, bevorzugterweise eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 57 bis 127, die markiert ist,
Zugeben eines Kandidaten-HMGA-Agonisten und/oder eines Kandidaten- HMGA-Antagonisten, und
Bestimmen, ob der Kandidaten-HMGA-Agonist ein HMGA-Agonist ist und/oder ob der Kandidaten-HMGA-Antagonist ein HMGA-Antagonist ist.
135. Verfahren nach Anspruch 134, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung so durchgeführt wird, dass getestet wird, ob die Nukleinsäure durch den Kandidaten- HMGA-Agonisten oder durch den Kandidaten-HMGA-Antagonisten ersetzt wird.
136. Kit für den Nachweis von HMGA, umfassend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 57 bis 127.
137. HMG A- Antagonist, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 134 oder 135.
138. HMGA-Agonist, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 134 oder 135.
139. Komplex umfassend ein HMGA-Protein und eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 57 bis 127.
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