EP1058832A1 - Verwendung von fluoreszenzfarbstoffen zur oberflächenuntersuchung - Google Patents

Verwendung von fluoreszenzfarbstoffen zur oberflächenuntersuchung

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EP1058832A1
EP1058832A1 EP99908892A EP99908892A EP1058832A1 EP 1058832 A1 EP1058832 A1 EP 1058832A1 EP 99908892 A EP99908892 A EP 99908892A EP 99908892 A EP99908892 A EP 99908892A EP 1058832 A1 EP1058832 A1 EP 1058832A1
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EP
European Patent Office
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fluorescent dyes
adsorption
amino
fluorescence
imino
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP99908892A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Ralf NÖRENBERG
Wolfgang Schrof
Norbert Mahr
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BASF SE
Original Assignee
BASF SE
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Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of EP1058832A1 publication Critical patent/EP1058832A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • D06P—DYEING OR PRINTING TEXTILES; DYEING LEATHER, FURS OR SOLID MACROMOLECULAR SUBSTANCES IN ANY FORM
    • D06P1/00—General processes of dyeing or printing textiles, or general processes of dyeing leather, furs, or solid macromolecular substances in any form, classified according to the dyes, pigments, or auxiliary substances employed
    • D06P1/0004—General aspects of dyeing
    • D06P1/0012—Effecting dyeing to obtain luminescent or phosphorescent dyeings
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
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    • Y10T436/17—Nitrogen containing
    • Y10T436/173845—Amine and quaternary ammonium

Definitions

  • the present invention relates to the use of fluorescent dyes which carry at least one reactive group which can react with nucleophilic groups for the qualitative and optionally quantitative fluorescence analysis determination of the adsorption of compounds which carry amino and / or imino groups on surfaces.
  • fluorescent dyes are used for dyeing fibers and moldings.
  • fluorescence property is also used in analysis.
  • fluorescence chromophores are used in biochemistry e.g. used for labeling antibodies or low molecular weight compounds in the context of immunoassays or other immunological detection methods. In these methods, however, the fluorescent dyes are coupled with these detection reagents before the detection reaction.
  • the determination of the adsorption of amines on surfaces has a different purpose. This is not about the detection of certain amines in mixtures, but the question of what affinity an oligo- or polyamine has for certain materials.
  • fluorescent dyes which carry at least one reactive group which can react with nucleophilic groups, has been found for the qualitative and quantitative fluorescence-analytical determination of the adsorption of compounds which carry amino and / or imino groups on surfaces.
  • fluorescent dyes With the suitable fluorescent dyes, the chemical nature of the chromophore is only of minor importance. Rather, what is essential is its reactive group, which forms a rapid bond to any adsorbed compounds with amino and / or imino groups. Fluorescent dyes are known to the person skilled in the art and are described, for example, in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry 5th Ed., Vol. All, p. 279. Suitable classes of such dyes are naphthalides, coumarins, xanthenes, thioxanthenes, naphtholactams, azlactones, methines, stilbenes, oxazines and thiazines.
  • coumarins such as derivatives of 7-dialkylaminocoumarin, xanthenes such as fluorescine and its halogenation products eosin, erythrosine, phloxin and rose bengal and rhodamines, and in particular methine dyes such as cyanines, have proven particularly useful.
  • a dye is chosen that has a clearly different fluorescence spectrum from those of the other adsorbed compounds.
  • optical brighteners such as those used for paper, one would choose a dye that fluoresces in the red or near infrared spectral range.
  • Suitable reactive groups are radicals which react with the nucleophilic amino or imino group, for example Michael systems, such as vinylsulfonyl or the sulfuric acid half-esters, which eliminate them under basic conditions.
  • Reactive groups known from peptide chemistry such as acetylazide, aryl halide, dichlorotriazine, isothiocyanate, sulfonyl chloride and sulfosuccinimidyl ester residues, are also suitable.
  • dyes are chosen with those reactive radicals which are selective towards amino and imino groups.
  • Succinimidyl esters have proven particularly useful in these cases, which are distinguished on the one hand by high selectivity and on the other hand good stability in aqueous solutions.
  • fluorescent dyes are commercially available as labeling reagents for biomolecules such as proteins and antibodies, for staining.
  • Common commercial markers are e.g. Cyanines with one or more succinimidyl ester residues.
  • succinimidyl esters can also be prepared simply by reacting fluorescent dyes which carry carboxylic acid groups with N-hydroxysulfosuccinimides.
  • the surface is examined in such a way that a sample of the substrate to be examined is treated with a dye solution. Anchoring of the dye takes place at those points on the surface on which compounds bearing amino or imino groups are adsorbed. In a subsequent rinsing step, dye that is not anchored is washed off. In this way, it is possible to obtain an image of the surface coverage by means of fluorescence microscopy.
  • Compounds with amino and / or imino groups which can be determined advantageously by staining with the fluorescent dyes, are oligo- and polyamines which carry amino or imino groups.
  • the amino or imino groups are linked to aliphatic or aromatic chains and, in addition to the amino groups, can contain further functional residues or quaternary ammonium ions. Such substances are used as aids in a wide variety of applications.
  • Examples include polyvinylamines as described, for example, in US Pat. No. 4,217,214, EP-A-071 050 and EP-A-0 216 387.
  • Such compounds are polymers of N-vinylcarboxamides or their copolymers with ethylenically unsaturated monomers, which are converted into the polyvinylamines after the polymerization by splitting off the carboxylic acid residues.
  • Such polyvinylamines are used, for example, as paper auxiliaries for fixing water-soluble and insoluble contaminants and have average molecular weights M w of 200 to 10 million. 4
  • polyethylene imines as described in US-A-21 82 306 or US-A-32 03 910, which have average molecular weights M w of 250 to 2 million, mostly from 500 to 10,000 Tools are used in a variety of ways. Only the use of polyethyleneimines as retention agents in papermaking may be mentioned by way of example.
  • derivatives of polyvinylamines and polyethyleneimines can also be easily colored as long as not all free amino groups have been derivatized.
  • Examples of derivatization reactions which may be mentioned are carboxymethylations and reactions with alkyl epoxides, as described in WO-A-97/40087 and WO-A-97/42229.
  • Oligoamines obtained by the condensation reaction of, for example, primary mono- or diamines or secondary diamines with epichlorohydrin can also be readily detected as amines.
  • the addition products of these amines with acrylonitrile and subsequent hydrogenation may also be mentioned as examples.
  • An example of the first-mentioned oligoamine type are partially quaternized piperazine condensates with epichlorohydrin, which have an average molecular weight of 200 to 70,000. These amines are used as textile auxiliaries in the dyeing of cotton fibers.
  • the use of the fluorescent dyes enables the detection of compounds bearing amino and / or imino groups which are adsorbed on any surface of substrates.
  • Examples include paper, wood, leather, fabrics made of synthetic, semi-synthetic or natural fibers, hair, fur, layered silicate, hard surfaces such as glass, metal, ceramics or catalyst surfaces.
  • the surfaces can be covered with the oligo- or polyamines, for example by treatment with cleaning or care formulations. However, it can also take place in the course of a finishing step of fibers and fabrics or directly during, for example, paper production.
  • oligo- and polyamines have different molecular weights depending on the requirements of the application. However, this is irrelevant for the coloring of the oligo- and polyamines on the substrate, since they are adsorbed on the surface. The detection limit is only reached when the amines to be examined differ so easily loosen the surface that this happens during the short staining and rinsing step.
  • An aqueous solution of the fluorescent dye is generally prepared for the dyeing step.
  • An aqueous solution is also understood to mean those solutions which, in addition to water, contain up to 20% by weight of a water-miscible organic solvent such as C 1 -C 4 -alkanols, in particular methanol, ethanol, isopropanol or a cyclic ether such as tetrahydrofuran - hold.
  • a water-miscible organic solvent such as C 1 -C 4 -alkanols, in particular methanol, ethanol, isopropanol or a cyclic ether such as tetrahydrofuran - hold.
  • water is preferably used as the sole solvent.
  • the pH of the solution should be in the range 5-14, preferably 6-10. Since more acidic conditions cause protonation of the amino groups, this would slow down the reaction.
  • the pH can be adjusted using inorganic bases such as the hydroxides, oxides and basic salts of alkali and alkaline earth metals, for example sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, potassium carbonate or calcium carbonate, or with buffer systems.
  • inorganic bases such as the hydroxides, oxides and basic salts of alkali and alkaline earth metals, for example sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, potassium carbonate or calcium carbonate, or with buffer systems.
  • the concentration of the dye can be from 10 " 3 to 10" 6 mol / 1 solvent. If commercially available marking dyes are used for biopolymers, these can be used in the same concentrations as prescribed for the marking reaction.
  • the dyeing step is usually completed within a few minutes and is preferably carried out at room temperature.
  • the colorations can be achieved either by spraying or by immersing a substrate sample in the coloring solution.
  • the unbound dye is removed by rinsing with water or the aqueous solvent mixture.
  • Fluorescence analytical determinations are generally carried out as fluorescence microscopic examinations, for which incident light microscopes are preferred. For example, one or two-photon excitations, laser scanning devices and confocal, ie depth-resolving, setups be used. Spectral or time-resolved fluorescence detection is also possible to view double markings with different dyes.
  • the viewer sees a surface on which the oligo- or polyamines appear as dots, so that it is possible for him to recognize the locations of high density, for example on a fabric. It is therefore possible to make a qualitative statement of where and with what strength the surface is covered with amines. Likewise, the depth of penetration of the amines can be determined by examining a cross section.
  • This dyeing process also offers the possibility, by creating a calibration line, to make quantitative statements about the amount of amine adsorbed. This is a simpler, faster investigation method compared to conventional methods, especially when developing amines and when producing new formulations with such amines.
  • the use according to the invention of the fluorescent dyes enables the parallel determination of the adsorption of a group of amino and / or imino group-bearing compounds on the surface to be examined and can be used to select amines with good adsorption behavior.
  • An important advantage of the use of the fluorescent dyes is the fact that a qualitative and quantitative statement about the adsorbed oligo- and polyamines is possible without the adsorption process being influenced by a modification carried out before the adsorption.
  • the fluorescence intensity of all three samples was measured. The measurements were carried out in a fluorescence spectrometer (SPEX Fluorolog® II) after excitation at 620 nm. By subtracting the fluorescence signals of sample 1 (self-fluorescence of the polyethyleneimine) and sample 2 (self-colorability of the leather) from the signal of sample 3, the surface coverage could be determined.
  • SPEX Fluorolog® II fluorescence spectrometer
  • Example 4 A partially quaternized polypiperazine condensate (molar mass approx. 30,000 g / mol) was dissolved in distilled water in a concentration of 10 g / l and added to polyester fabric in various concentrations of 0.01 to 0.05 mg polypiperazine / g tissue and under running water. Thereafter, dyeing was carried out in accordance with the dyeing instructions of Example 1 (sample 4).
  • Example 6 A piece of polyester fabric was dyed directly without treatment with the polypiperazine condensate as described in Example 1 (sample 5). c) A piece of polyester fabric was treated with 0.05 mg polypiperazine / g fabric (sample 6). The sample showed no increased fluorescence.
  • the fluorescence intensities of samples 4, 5 and 6 were determined. The measurements were carried out in a fluorescence spectrometer (SPEX Fluorolog® II) after excitation at 620 nm. Sample 5 was used to determine the intrinsic fluorescence of the tissue, the baseline, which remained unchanged due to non-stained piperazine condensate (Sample 6).
  • the polyester fabric covered with different concentrations of poly according to the above method has now also been examined using fluorescence optics. The adsorption of the piperazine condensate could be demonstrated by subtracting the signals from samples 5 and 6 by a remaining fluorescence signal. The fluorescence intensity correlated with the amount of quaternized piperazine condensate offered, corresponding to the adsorption isotherm.
  • a bentonite suspension was treated with polyethyleneimine as described under b) and stained as described under a). The fluorescence intensity was measured (sample 7). The fluorescence was measured under a fluorescence spectrometer (SPEX Fluorolog II) after excitation at 620 nm.
  • SPEX Fluorolog II fluorescence spectrometer
  • sample 8 A reference sample was prepared under identical conditions, but without polyethyleneimine in step b) (sample 8). The fluorescence intensity of this sample was also measured.
  • the signal of reference sample 8 was subtracted from the signal of sample 7.
  • the adsorption of polyethyleneimine on bentonite could be demonstrated by a remaining fluorescence signal.

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Abstract

Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, die mindestens eine reaktive Gruppe tragen, welche mit nucleophilen Gruppen reagieren kann, zur qualitativen und gegebenenfalls quantitativen fluoreszenzanalytischen Bestimmung der Adsorption von Verbindungen, welche Amino- und/oder Iminogruppen tragen, an Oberflächen.

Description

Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen zur Oberflächenuntersuchung
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, die mindestens eine reaktive Gruppe tragen, welche mit nucleophilen Gruppen reagieren kann, zur qualitativen und gegebenenfalls quantitativen fluoreszenzanalyti- sehen Bestimmung der Adsorption von Verbindungen, welche Amino und/oder Iminogruppen tragen, an Oberflächen.
Die gängigste Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen ist ihr Einsatz zum Färben von Fasern und Formkörpern. Jedoch wird die Fluoreszenzeigenschaft auch in der Analytik genutzt. So werden Fluoreszenzchro ophore in der Biochemie z.B. zur Markierung von Antikörpern oder niedermolekularen Verbindungen im Rahmen von Imunoassays oder anderen immunologischen Nachweismethoden eingesetzt. Bei diesen Verfahren werden die Fluoreszenzfarbstoffe jedoch vor der Nachweisreaktion mit diesen Nachweisreagentien gekuppelt .
Eine Methode zur Analytik von Amingemisehen wird in Anal. Chem. 1995, 67, 1742 - 1748 beschrieben, bei der Amingemische mit Fluoreszenzfarbstoffen, die einen Succinimidylesterrest haben, markiert werden, flüssigehromatographisch aufgetrennt werden und anhand von zuvor erstellten Referenzproben die qualitative und quantitative Zusammensetzung des Gemisches bestimmt wird.
Die Bestimmung der Adsorption von Aminen an Oberflächen hat eine andere Zielsetzung. Hier geht es nicht um die Detektion bestimmter Amine in Gemischen, sondern um die Fragestellung, welche Affinität ein Oligo- oder Polyamin zu bestimmten Materialien hat.
Bei der Entwicklung von Textil-, Leder- und Papierhilfsmitteln spielt es eine große Rolle, daß man den Adsorptionsgrad des Oligo- oder Polyamins bei seiner Anwendung auf den Substraten kennt. Besonders in Gemisch mit andersartigen Hilfsmitteln sind Untersuchungen im Hinblick auf die Affinität der speziellen Oligo- und Polyamine zu den Substraten wichtig.
Daher war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Markierungs- mittel zur Verfügung zu stellen, die eine qualitative und gegebenenfalls quantitative Aussage über die auf dem Substrat adsor- bierten Oligo- und/oder Polyamine ermöglichen. 2
Demgemäß wurde die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, die mindestens eine reaktive Gruppe tragen, welche mit nucleophilen Gruppen reagieren kann, gefunden, zur qualitativen und quantitativen fluoreszenzanalytischen Bestimmung der Adsorption von Verbindungen, welche Amino- und/oder Iminogruppen tragen, an Oberflächen.
Bei den geeigneten Fluoreszenzfarbstoffen kommt es auf die chemische Beschaffenheit des Chromophors nur in untergeordnetem Maße an. Wesentlich ist vielmehr seine reaktive Gruppe, die eine schnelle Bindung zu beliebigen adsorbierten Verbindungen mit Amino- und/oder Iminogruppen ausbildet. Fluoreszenzfarbstoffe sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry 5. Ed., Vol. All, S. 279 beschrieben. Geeignete Klassen solcher Farbstoffe sind Naphthal - i ide, Cumarine, Xanthene, Thioxanthene, Naphtholactame, Azlactone, Methine, Stilbene, Oxazine und Thiazine.
Besonders gut haben sich in der Praxis Cumarine wie Derivate des 7 -Dialkylaminocumarins, Xanthene wie Fluorescin und seine Ha- logenierungsprodukte Eosin, Erythrosin, Phloxin und Rose Bengal und Rhodamine sowie insbesondere Methinfarbstoffe wie Cyanine bewährt .
Sofern fluoreszenzanalytische Untersuchungen von Oberflächen vorgenommen werden, auf denen weitere Verbindungen haften, die selber fluoreszieren, wählt man einen solchen Farbstoff, der sich in seinem Fluoreszenzspektrum deutlich von denen der anderen adsorbierten Verbindungen unterscheidet. Im Fall von optischen Aufhellern, wie sie beispielsweise bei Papier verwendet werden, würde man einen im roten oder nahe infraroten Spektralbereich fluoreszierenden Farbstoff wählen.
Als reaktive Gruppen, von denen mindestens eine mit dem Chromo- phor verknüpft ist, sind Reste geeignet, die mit der nucleophilen Amino- oder Iminogruppe reagieren, beispielsweise Michael - Systeme, wie Vinylsulfonyl oder die Schwefelsäurehalbester, die unter basischen Bedingungen zu diesen eliminieren. Weiterhin sind aus der Peptidchemie bekannte reaktive Gruppen wie Acetylazid- , Arylhalid-, Dichlortriazin- , Isothiocyanat- , Sulfonylchlorid- und Sulfosuccinimidylesterreste geeignet. In den Fällen, in denen die Substrate mehrere nucleophil reagierende Verbindungen adsorbiert haben, die in Konkurrenz zu den Amino- und Iminogruppen treten können, wählt man Farbstoffe mit solchen reaktiven Resten, die selektiv gegenüber Amino- und Iminogruppen sind. Besonders haben sich in diesen Fällen Succinimidylester bewährt, die sich zum einen durch eine hohe Selektivität und zum anderen eine gute Stabilität in wäßrigen Lösungen auszeichnen.
Dabei ist es möglich, solche Fluoreszenzfarbstoffe, wie sie als Markierungsreagenzien für Biomoleküle wie Proteine und Antikörper im Handel sind, direkt zum Anfärben zu verwenden. Gängige kommerzielle Markierungsmittel sind z.B. Cyanine mit einem oder mehreren Succinimidylesterresten.
Succinimidylester sind im übrigen auch einfach durch Umsetzung von Fluoreszenzfarbstoffen, die Carbonsäuregruppen tragen, mit N-Hydroxysulfosuccinimiden herzustellen.
Die Untersuchung der Oberfläche findet derart statt, daß eine Probe des zu untersuchenden Substrats mit einer Farbstofflösung behandelt wird. An den Stellen der Oberfläche, auf denen Amino- oder Iminogruppen tragende Verbindungen adsorbiert sind, findet eine Verankerung des Farbstoffs statt. Durch einen sich anschlie- ßenden Spülschritt wird nicht verankerter Farbstoff heruntergewaschen. Auf diese Weise ist es möglich, mittels Fluoreszenzmikroskopie ein Abbild der Belegung der Oberfläche zu bekommen.
Verbindungen mit Amino- und/oder Iminogruppen, die sich durch die Anfärbung mit den Fluoreszenzfarbstoffen vorteilhaft bestimmen lassen, sind Oligo- und Polyamine, die Amino- oder Iminogruppen tragen. Die Amino- oder Iminogruppen sind mit aliphatischen oder aromatischen Ketten verknüpft und können neben den Aminogruppen weitere funktioneile Reste oder auch quartäre Ammoniurαionen ent- halten. Solche Stoffe werden in den verschiedensten Anwendungen als Hilfsmittel verwendet.
Beispielhaft seien Polyvinylamine erwähnt, wie sie beispielsweise in der US-A-4 217 214, EP-A-071 050 und EP-A-0 216 387 beschrie- ben sind. Solche Verbindungen sind Polymere von N-Vinylcarbonsäu- reamiden oder ihre Copolymere mit ethylenisch ungesättigten Monomeren, die im Anschluß an die Polymerisation durch Abspalten der Carbonsäurereste in die Polyvinylamine umgewandelt werden. Solche Polyvinylamine werden beispielsweise als Papierhilfsmittel zur Fixierung von wasserlöslichen und -unlöslichen Störstoffen verwendet und haben mittlere Molekulargewichte Mw von 200 bis 10 Millionen. 4
Ebenfalls gut anfärbbare Oligo- und Polyamine sind Polyethylen- imine, wie in der US-A-21 82 306 oder US-A-32 03 910 beschrieben, die mit mittleren Molekulargewichten Mw von 250 bis 2 Millionen, meist von 500 bis 10000 als Hilfsmittel vielfältig eingesetzt werden. Beispielhaft sei nur die Verwendung von Polyethyleniminen als Retentionsmittel bei der Papierherstellung genannt.
Natürlich sind auch Derivate von Polyvinylaminen und Polyethyleniminen gut anfärbbar, solange nicht alle freien Aminogruppen derivatisiert sind. Als Derivatisierungsreaktionen seien beispielhaft Carboxymethylierungen sowie Umsetzungen mit Alkyl- epoxiden, wie sie in der WO-A-97/40087 und WO-A-97/42229 beschrieben sind, erwähnt.
Weiterhin sind als Amine Oligoamine, die durch Kondensations - reaktion beispielsweise von primären Mono- oder Diaminen oder sekundären Diaminen mit Epichlorhydrin erhalten werden, gut nachweisbar. Ebenfalls seien die Additionsprodukte dieser Amine mit Acrylnitril und anschließender Hydrierung beispielhaft erwähnt. Ein Beispiel für den erstgenannten Oligoamintyp sind teilweise quaternierte Piperazinkondensate mit Epichlorhydrin, die ein mittleres Molekulargewicht von 200 bis 70 000 aufweisen. Diese Amine finden als Textilhilfsmittel in der Färberei von Baumwoll- fasern Anwendung.
Die Verwendung der Fluoreszenzfarbstoffe ermöglicht den Nachweis von Amino- und/oder Iminogruppen tragenden Verbindungen, die an beliebigen Oberflächen von Substraten adsorbiert sind.
Beispielhaft seien Papier, Holz, Leder, Gewebe aus synthetischen, halbsynthetischen oder natürlichen Fasern, Haare, Fell, Schichtsilikat, harten Oberflächen wie Glas, Metall, Keramik oder auch Katalysatoroberflächen genannt.
Die Belegung der Oberflächen mit den Oligo- oder Polyaminen kann dabei beispielsweise durch Behandlung mit Reinigungs- oder Pflegeformulierungen erfolgt sein. Sie kann jedoch auch im Rahmen eines Veredlungsschritts von Fasern und Geweben oder direkt während beispielsweise der Papierherstellung erfolgen.
Je nach Anwendungsbereich haben solche Oligo- und Polyamine entsprechend den Anforderungen der Anwendung unterschiedliche Molekulargewichte. Dies spielt jedoch für die Anfärbung der Oligo- und Polyamine auf dem Substrat keine Rolle, da sie an der Oberfläche adsorbiert sind. Die Nachweisgrenze ist erst dann erreicht, wenn sich die zu untersuchenden Amine so leicht von der Oberfläche lösen, daß dies während des kurzen Anfärbe- und Spülschritts geschieht.
Für den Färbeschritt stellt man in der Regel eine wäßrige Lösung des Fluoreszenzfarbstoffs her. Dabei sind unter wäßriger Lösung auch solche Lösungen zu verstehen, die außer Wasser bis zu 20 Gew. -% eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels wie Ci- bis C -Alkanolen, insbesondere Methanol, Ethanol, Iso- propanol oder einen cyclischen Ether wie Tetrahydrofuran ent- halten. Bevorzugt wird jedoch Wasser als alleiniges Lösungsmittel verwendet. Der pH-Wert der Lösung sollte sich im Bereich von 5 - 14 bewegen, vorzugsweise 6 bis 10. Da saurere Bedingungen eine Protonierung der Aminogruppen bewirken, würde dies zu einer Verlangsamung der Reaktion führen. Der pH-Wert kann dabei so- wohl mit Hilfe anorganischer Base wie den Hydroxiden, Oxiden und basischen Salzen von Alkali- und Erdalkalimetallen, also beispielsweise Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat oder Calciumcarbonat oder mit Puffersystemen eingestellt werden.
Da die fluoreszenzspektroskopische Analytik sehr empfindlich ist, ist es nicht notwendig, einen äquimolaren Umsatz der Amino- oder Iminogruppen zu erzielen. Vielmehr ist es ausreichend bezogen auf ein Äquivalent einer freien Aminogruppe nur 0,1 bis 10 "5 Äquivalente Fluoreszenzfarbstoff einzusetzen.
Die Konzentration des Farbstoffs kann von 10"3 bis 10"6 mol/1 Lösungsmittel betragen. Sofern man handelsübliche Markierungs- farbstoffe für Biopolymere verwendet, kann man diese in denselben wie für die Markierungsreaktion vorgeschriebenen Konzentrationen einsetzen.
Der Färbeschritt ist in der Regel innerhalb weniger Minuten beendet und wird bevorzugt bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die Färbungen können sowohl durch Besprühen oder durch Eintauchen einer Substratprobe in die Färbelösung erzielt werden.
Im Anschluß an den Färbevorgang wird der nichtgebundene Farbstoff durch Spülen mit Wasser oder dem wäßrigen Lösungsmittelgemisch entfernt.
Fluoreszenzanalytische Bestimmtingen werden in der Regel als fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen durchgeführt, für welche bevorzugt Auflichtmikroskopen gewählt werden. Dabei können z.B. Ein- oder Zweiphotonenanregungen, Laser- Scanning Einrichtungen sowie konfokale, das heißt tiefenauflösende, Aufstellung verwendet werden. Ebenso ist eine spektral- oder zeitaufgelöste Fluoreszenzdetektion möglich, um Zweifachmarkierungen mit unterschiedlichen Farbstoffen zu betrachten.
Eventuelle Anfarbbarkeit der nichtbelegten Oberfläche und dadurch verursachte Fluoreszenz sowie mögliche Eigenfluoreszenz der Substrate ist durch einfache Blindexperimente feststellbar und als Untergrundsignale leicht zu berücksichtigen.
Der Betrachter sieht eine Oberfläche, bei der die Oligo- oder Polyamine als Punkte erscheinen, so daß es für ihn möglich ist, die Orte starker Dichte beispielsweise auf einem Gewebe zu erkennen. Es ist somit die qualitative Aussage, an welchen Stellen und mit welcher Stärke die Oberfläche mit Aminen belegt ist möglich. Ebenso läßt sich so bei Untersuchung eines Querschnitts die Eindringtiefe der Amine feststellen.
Dieses Färbeverfahren bietet daneben auch die Möglichkeit durch vorheriges Erstellen einer Eichgerade, auch quantitative Aussagen über die Menge des adsorbierten Amins zu machen. Dies ist besonders bei der Produktentwicklung von Aminen sowie beim Herstellen neuer Formulierungen mit solchen Aminen eine einfachere, schnellere Untersuchungsmethode im Vergleich zu den herkömmlichen Verfahren.
Weiterhin ermöglicht die erfindungsgemäße Verwendung der Fluoreszenzfarbstoffe die parallele Bestimmung der Adsorption einer Gruppe von Amino- und/oder Iminogruppe tragenden Verbindungen an der zu untersuchenden Oberfläche und kann zur Auswahl von Aminen mit gutem Adsorptionsverhalten genutzt werden.
So ist es auf einfache Weise möglich, verschiedene Oligo- und Polyamine gleichzeitig zu testen, indem sie auf einer Probenoberfläche als definierte Menge auf verschiedenen Feldern aufgetragen werden und die Oberfläche anschließend mit Fluoreszenzfarbstoffen angefärbt wird. Nach Entfernen des nichtgebundenen Farbstoffs ermöglicht die anschließende quantitative Auswertung der einzelnen Flecken mittels Fluoreszenzmikroskopie den Vergleich des Adsorptionsverhaltens der untersuchten Amine. Die hohe Empfindlich- keit der Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht eine miniaturisierte Probe und damit die parallele Untersuchung einer großen Anzahl von Verbindungen hinsichtlich ihres Adsorptionsverhaltens. Ferner ermöglicht diese Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen, das Adsorptionsverhalten von Aminen auf Schichtsilikaten zu untersuchen, was eine große Rolle bei der Bewertung der Eliminierbarkeit von Aminen in der Umweltanalytik spielt.
Ein wichtiger Vorteil der Verwendung der Fluoreszenzfarbstoffe ist darin zu sehen, daß eine qualitative und quantitative Aussage über die adsorbierten Oligo- und Polyamine möglich ist, ohne daß durch eine vor der Adsorption vorgenommene Modifizierung der Adsorptionsprozeß beeinflußt wird.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.
Beispiel 1
Aminnachweis auf Leder:
Eine Ampulle Cy5® (ca. 0,127 mg; Fa. Amersham) , eines Fluoreszenzfarbstoffs der Formel
H3C CH3
H03S • CH3 H3C^J S03H N -^r
CHw-- - -CrHw C ΓHH-- - -CrHυ: ■ - -.CrHv
(CH2), CH2
:0 CH3
Ny^O
wurde in 200 ml destilliertem Wasser gelöst (Lösung 1) .
Färbevorschrift:
1 ml der Fluoreszenzfarbstofflösung wurde auf das Lederstück auf • gebracht. Nach 1 Minute wurde das Substrat in eine Spülvorrichtung gebracht, in der es von einem laminaren Strom aus destilliertem Wasser umspült wurde. Das Lederstück wurde 5 min gespült und dann herausgenommen. ö
Probenpräparation:
a) Polyethylenimin (Molmasse ca. lOOOOg/mol) wurde in einer Konzentration von 10g/l in destilliertem Wasser gelöst, in einer Konzentration von ca. 0,02 mg/g auf ein Stück
Narbenleder gegeben und unter fließendem Wasser abgespült (Probe 1) .
b) Ein zweites Stück Narbenleder wurde ohne Behandlung mit Polyethylenimin mit dem Fluoreszenzfarbstoff gemäß der Färbevorschrift angefärbt (Probe 2) .
c) Ein drittes Narbeniederstück wurde mit Polyethylenimin wie unter a) beschrieben behandelt und nachträglich gemäß der Färbevorschrift angefärbt (Probe 3).
Messung und Analyse:
Von allen drei Proben wurde wurde die Fluoreszenzintensität gemessen. Die Messungen wurden in einem Fluoreszenzspektrometer (SPEX Fluorolog® II) nach Anregung bei 620 nm durchgeführt. Durch Subtraktion der Fluoreszenzsignale der Probe 1 (Eigenfluoreszenz des Polyethylenimins) und der Probe 2 (Eigenanfarbbarkeit des Leders) von dem Signal der Probe 3 ließ sich die Belegung der Oberfläche bestimmen.
Beispiel 2
Aminnachweis an Polyestergewebe
Probenpräparation :
a) Ein teilweise quaterniertes Polypiperazin-Kondensat (Molmasse ca. 30000g/mol) wurde in einer Konzentration von 10g/l in destilliertem Wasser gelöst und in verschiedener Konzentration von 0,01 bis 0,05 mg Polypiperazin/g Gewebe auf Polyestergewebe gegeben und unter fließendem Wasser abgespült. Danach wurde gemäß der Färbevorschrift des Beispiels 1 angefärbt (Probe 4) .
b) Ein Stück Polyestergewebe wurde direkt ohne Behandlung mit dem Polypiperazin-Kondensat wie in Beispiel 1 beschrieben angefärbt (Probe 5) . c) Ein Stück Polyestergewebe wurde mit 0,05 mg Polypiperazin/g Gewebe behandelt (Probe 6) . Die Probe zeigte keine erhöhte Fluoreszenz .
Die Fluoreszenzintensitäten der Proben 4, 5 und 6 wurden bestimmt. Die Messungen wurden in einem Fluoreszenzspektrometer (SPEX Fluorolog® II) nach Anregung bei 620 nm durchgeführt. Mit Probe 5 wurde die Eigenfluoreszenz des Gewebes, die Grundlinie, ermittelt, die durch nicht angefärbtes Piperazin-Kondensat unverändert blieb (Probe 6) . Die nach obiger Methode mit unterschiedlichen Konzentrationen Poly in belegten Stücke Polyestergewebe wurden nun ebenfalls fluoreszenzoptisch untersucht. Die Adsorption des Piperazin-Kondensat konnte nach Abzug der Signale von Probe 5 und 6 durch eine verbleibendes Fluoreszenzsignal nachgewiesen werden. Die Fluoreszenzintensität korrelierte mit der angebotenen Menge quaterniertes Piperazin-Kondensat, entsprechend der Adsorptionsisotherme.
Beispiel 3
A innachweis auf Bentonit (Schichtsilikat)
a) Färbevorschrift:
50 ml einer Suspension, die etwa 6 g Bentonit (mittlere Teil- chengröße 200 nm) enthält, wurden nach der Adsorption bei 15000 Umdrehungen/min 15 min zentrifugiert. Das Zentrifugat wurde in 50 ml destilliertem Wasser aufgeschlämmt und erneut bei 15000 U/min 15 zentrifugiert. Das Zentrifugat wurde erneut in destilliertem Wasser aufgenommen und mit 2 ml der in Beispiel 1 beschrieben Farbstofflösung versetzt. Die Probe wurde zentrifugiert, in 50 ml destilliertem Wasser aufgeschlämmt, zentrifugiert und auf eine Mikrotiterplatte aufgebracht.
b) Behandlung mit Polyethylenimin:
150 ml einer Suspension (Feststoffgehalt 2 gew.%) wurden mit 20 ml einer Polyethylenimin-Lösung (mittl. Molgewicht 10000 g/mol) (10 g/1) versetzt. Nach 20 min wurden 50 ml der Suspension bei 15000 U/min zentrifugiert und danach in Wasser aufgeschlämmt. Das zentrifugieren und in destilliertem Wasser aufnehmen wurde wiederholt-, bevor die Anfärbung durchgeführt wurde. Probenpräparation und Messung:
Eine Bentonit-Suspension wurde wie unter b) beschrieben mit Polyethylenimin behandelt und wie unter a) beschrieben angefärbt. Die Fluoreszenzintensität wurde gemessen (Probe 7) . Die Fluoreszenz wurde unter einem Fluoreszenzspektrometer (SPEX Fluorolog II) nach Anregung bei 620 nm gemessen.
Eine Referenzprobe wurde unter identischen Bedingungen herge- stellt, aber ohne Polyethylenimin in Schritt b) (Probe 8) . Die Fluoreszenzintensität dieser Probe wurde ebenfalls gemessen.
Zur Auswertung wurde das Signal der Referenzprobe 8 vom Signal der Probe 7 abgezogen. Die Adsorption von Polyethylenimin auf Bentonit konnte durch ein verbleibendes Fluoreszenzsignal nachgewiesen werden.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, die mindestens eine reaktive Gruppe tragen, welche mit nucleophilen Gruppen reagieren kannτ—zur qualitativen und gegebenenfalls quantitativen fluoreszenzanalytischen Bestimmung der Adsorption von Verbindungen, welche Amino und/oder Iminogruppen tragen, an Oberflächen.
2. Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen nach Anspruch 1, deren reaktive Gruppe selektiv mit Aminogruppen reagieren kann.
3. Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen nach Anspruch 1 oder 2, deren reaktive Gruppe ein Succinimidylester ist.
4. Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen nach den Ansprüchen 1 bis 3 zur Bestimmung der Adsorption von Oligo- und/oder Poly- aminenan Oberflächen.
5. Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen nach den Ansprüchen 1 bis 4 zur Bestimmung der Adsorption von Amino und/oder Iminogruppen tragenden Verbindungen an Gewebeoberflächen.
6. Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen nach den Ansprüchen 1 bis 4 zur Bestimmung der Adsorption von Amino und/oder Iminogruppen tragenden Verbindungen an Lederoberflächen.
7. Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen nach den Ansprüchen 1 bis 4 zur Bestimmung der Adsorption von Amino und/oder Iminogruppen tragenden Verbindungen an Katalysatoroberflächen.
8. Verwendung von Fluoreszenzf rbstoffen nach den Ansprüchen 1 bis 4 zur Bestimmung der Adsorption von Amino und/oder Imi - noruppen tragenden Verbindungen an Holz oder Papier.
9. Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen nach den Ansprüchen 1 bis 4 zur parallelen Bestimmung der Adsorption von Amino- und/oder Iminogruppen tragenden Verbindungen an einer Ober- fläche zur Auswahl von Aminen mit gutem Adsorptionsverhalten.
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