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Gebiet der
Erfindung
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Diese
Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von quaternären Verbindungen,
um hochempfindliche Fluoreszenznukleinsäurefärbemittel in wässrigen
Lösungsmitteln
zu stabilisieren. Diese Erfindung bezieht sich auch auf eine neue
Zusammensetzung für
vorgefärbte,
vorgegossene Agaroseelektrophoresegele mit einer gesteigerten nutzbaren
Lagerzeit für
hochempfindliche Nukleinsäuredetektion.
Diese Erfindung bezieht sich weiter auf Zusammensetzungen von Lösungsmitteln,
die als Fertigfärbelösungen nützlich sind.
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Hintergrund
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Fluoreszenzfarbstoffe
werden weit verwendet für
die Detektion von Nukleinsäuren
in biologischen Tests. Besonders wurde von einer Auswahl an asymmetrischen
Cyaninfarbstoffen gezeigt, dass sie hochempfindlich und nützlich bei
Elektrophorese und anderen lösungsbasierten
Tests für
DNA- und RNA-Analyse und -Detektion sind. Kommerzielle Produkte,
wie zum Beispiel SYBR®-Green-I- und -II-Färbemittel
(Molecular Probes Inc., Eugene OR; US-Patent Nummern 5,436,134 und
5,658,751); GelStarTM-Färbemttel
(BioWhittaker Molecular Applications Inc., Rockland ME, US-Patent
Nr. 5,863,753) und SYBR-Gold-Färbemittel
(Molecular Probes, Eugene OR), sind gewisse Beispiele jener asymmetrischen
Cyaninfarbstoffe. Diese Farbstoffe stellen eine hohe Sensitivität aufgrund
einer Kombination einer über
1000-fachen Fluoreszenzsteigerung nach Bindung an Nukleinsäuren und
einem sehr niedrigen Hintergrund im ungebundenen Zustand bereit.
Die Verwendung dieser Farbstoffe bei der Ultraviolettdurchleuchtung
erlaubt die Detektion von DNA auf Pikogrammniveau. Man nimmt an,
dass der Bindungsmodus der Farbstoffe an Nukleinsäuren ein
anderer Mechanismus ist als der der üblicheren Phenanthridininterkalationsfarbstoffe
wie Ethidiumbromid und Propidiumiodid.
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Trotz
der überlegenen
Empfindlichkeit asymmetrischer Cyaninfarbstoffe sind diese Farbstoffe
in wässrigen
Lösungsmitteln
nicht stabil. Sie sind in organischen Lösungsmitteln wie Dimethylsulfoxid
stabil, müssen aber
in wässrige
Lösungen
vor der Verwendung in biologischen Tests übertragen werden. In wässrigen
Lösungsmitteln
fällt die
Empfindlichkeit dieser Farbstoffe für DNA-Detektion auf ungefähr die Hälfte innerhalb
von vier bis 14 Tagen Lagerung bei Raumtemperatur ab. Als ein Ergebnis
haben vorgegossene Elektrophoresegele, die mit diesen empfindlichen
Färbemitteln
vorgefärbt
sind, eine kurze Lagerzeit und sind nicht zuverlässig nützlich, obwohl vorgegossene
Gele, die mit Ethidiumbromid vorgefärbt sind, kommerziell erhältlich sind
(z. B. vorgegossene Reliant®-Gele, verkauft von Bio
Whittaker Molecular Applications). Folglich ist die Verfügbarkeit von
vorgegossenen Gelen mit hochsensitiven Färbemitteln von wesentlichem
Nutzen, besonders für
Hochdurchsatzlaboratorien, wo die große Probenzahl ansonsten das
Gießen
von zahlreichen Gelen notwendig machen würde.
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Es
wurden Detergenzien verwendet, um die Stabilität von hochempfindlichen Nukleinsäurefärbemitteln
zu verbessern, aber sie verlängern
nur geringfügig
die Stabilität
von Färbemitteln,
falls überhaupt
(siehe Beispiel 1, Tabelle 1) und sind nicht nützlich für vorgegossene Gele. Berichte
von Mathies (Zeng et al., 1997, Analytical Biochemistry 252: 101-144;
Clark et al., 1997, Analytical Chemistry 69: 1355-1363) beschreiben
die Verwendung von Tetrapentylammoniumion in TAPS- (3-[tris-(Hydroxymethyl)methylamino]-1-propansulfonsäure-) Puffer,
um die Stabilität
von zwischen DNA und Bisinterkalationsfarbstoffen gebildeten Komplexen
zu steigern. Diese Berichte legen jedoch nicht nahe, dass die Stabilität der Farbstoffe
selbst bewirkt wurde oder erwähnen
die Wirkung auf asymmetrische Cyaninfarbstoffe wie SYBR-Green- und
GelStar-Färbemittel.
Deshalb gibt es immer noch einen Bedarf für ein Verfahren, hochempfindliche
Nukleinsäurefärbemittel
zu stabilisieren und Mittel zum Schaffen von vorgefärbten, vorgegossenen
Gelen und Lösungen
mit einer nützlichen Lagerzeit
bereitzustellen.
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Kurze Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Stabilisieren von
hochempfindlichen fluoreszierenden Nukleinsäurefärbemitteln in wässrigen
Lösungsmitteln
bereit, durch Hinzufügen
von einer oder mehreren quaternären
Verbindungen zu dem Lösungsmittel.
Es ist auch ein Ziel dieser Erfindung, eine Elektrophoresegelzusammensetzung
für ein
vorgegossenes Elektrophoresegelsystem bereitzustellen, welche ein
Gel, einen Elektrophoresepuffer, einen hochempfindlichen fluoreszierenden
Nukleinsäurebindungsfarbstoff
und eine oder mehrere quaternäre
Verbindungen einschließt,
wobei diese quaternären
Verbindungen bewirken, dass die in das Gel inkorporierten Farbstoffe
eine gesteigerte Stabilität
in wässrigen
Lösungsmitteln
haben. Es ist weiter ein Ziel dieser Erfindung, eine stabilisierte
Färbemittellösung bereitzustellen,
umfassend ein wässriges
Lösungsmittel,
ein fluoreszierendes Nukleinsäurefärbemittel
und eine stabilisierende Menge einer oder mehrerer quaternärer Verbindungen.
Die quaternären
Verbindungen der Erfindung haben die allgemeine Strukturformel R4NX, worin R4N ein
Kation ist und jedes R unabhängig
eine C1-6-Alkylgruppe oder eine C1-6-Alkoxygruppe ist, N ist Stickstoff, X
ist ein Halidanion oder ein Hydroxyanion, welches von dem Kation
(R4N)+ in einer
wässrigen Umgebung
dissoziiert, und worin das hochsensitive fluoreszierende Nukleinsäurefärbemittel
einen Cyaninfarbstoff umfasst. Die obigen Ziele und Vorteile der
vorliegenden Erfindung werden unter Berücksichtigung der folgenden
detaillierten Beschreibung ersichtlich werden.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung und der bevorzugten Ausführung
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Wir
stellen ein Verfahren zum Verlängern
der nützlichen
Lagerzeit von fluoreszierenden Färbemitteln in
wässriger
Lösung
bereit, durch Hinzufügen
von einer oder mehreren quaternären
Verbindungen zu dem wässrigen
Lösungsmittel,
das das Färbemittel
enthält.
Die quaternäre
Verbindung hat eine Strukturformel R4NX–,
worin R4 aus vier homogenen oder heterogenen
C1-6-Alkyl- oder -Alkoxyl-Ketten besteht,
die kovalent an einen quaternären
Stickstoff, N, gekoppelt sind, und X– ist
ein Anion, welches von dem Kation (R4N)+ in einer wässrigen Umgebung dissoziieren
wird. In bevorzugten Ausführungen
ist X– ein
Halid- oder ein Hydroxylanion. In bevorzugteren Ausführungen
ist X– ein
Chlorid- oder ein Bromidion. Die quaternäre Verbindung ist leicht in dem
wässrigen
System gelöst
und kann in jeder effektiven Menge vorhanden sein. Allgemein ist
die quaternäre Verbindung
in Konzentrationen zwischen 1 mM und 200 mM vorhanden, welche gemäß der Verwendung
optimiert werden können.
Wenn sie in Gelen für
die elektrophoretische Auftrennung von Nukleinsäuren und Proteinen verwendet
wird, liegt die nützliche
Konzentration der quaternären
Verbindung zwischen 5 und 20 mM.
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Fluoreszierende
Färbemittel
werden weit verwendet für
die Detektion von biologischen Molekülen. Eine solche Gruppe ist
die der asymmetrischen Cyanine, welche nach Bindung an Nukleinsäuren fluoreszieren,
einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf Verbindungen wie SYBR-Green-I- und -II-, SYBR-Gold- und GelStar-Nukleinsäurefärbemittel
und ihre Derivate und andere Färbemittel,
die im US-Patent Nr. 5,436,134, US-Patent Nr. 5,658,751 und US-Patent
Nr. 5,863,753 beschrieben sind. Wenn sich diese Färbemittel
in wässrigen
Systemen befinden (wie Elektrophoresegele oder biologische Puffer)
und in der Anwesenheit der zuvor genannten quaternären Verbindungen
gibt es eine wenigstens vierfache Zunahme in der Halbwertszeit dieser Färbemittel.
Für Zwecke
der vorliegenden Erfindung wird Halbwertszeit oder t½ definiert
als die Zeit, die es für die
Färbemittel
braucht, die Hälfte
ihrer Fluoreszenzintensität,
welche aus DNA-Bindung resultiert, zu verlieren. Quaternäre Salze
von Tetramethylammonium, Tetrabutylammonium und Tetrapentylammonium
sind besonders bevorzugte Ausführungen.
Quaternäre
Ammoniumhydroxide werden praktischerweise als Teil des Puffersystems
verwendet (wie zum Beispiel in dem Fall von TAPS-Puffer) und sind
mit hoch auflösender
Gelelektrophorese besonders kompatibel. Quaternäre Ammoniumhalide können praktischerweise
verwendet werden, um gepufferte oder ungepufferte Lösungsmittel
für die
Lagerung von Färbemitteln
zu ergänzen.
Eine Kombination aus zwei oder mehr quaternären Verbindungen kann verwendet
werden, solange sie mit der Verwendung kompatibel ist. Quaternäre Ammoniumverbindungen
mit Kohlenstoffketten, die länger
als 6 sind, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf Tetrahexylammoniumverbindungen
(die in den wässrigen
Lösungsmitteln
nicht löslich
sind) und Detergenzien (siehe Tabelle 1), sind für Zwecke der vorliegenden Erfindung
nicht nützlich.
Detergenzien können
jedoch zusätzlich
zu den erfinderischen quaternären
Verbindungen verwendet werden, um weiter die färbemittelstabilisierende Wirkung
zu steigern. Ein Beispiel ist in Tabelle 3 gezeigt, wo die Zugabe
eines Detergenz zu einer Lösung,
die Tetramethylammoniumhydroxid enthält, die Halbwertszeit von SYBR-Green-I-Färbemittel
um das 1,6- bis 2-fache zusätzlich
zu der vierfachen Zunahme verlängert,
die bereits durch Tetramethylammoniumhydroxid alleine erzielt wird.
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Weiter
zu den zuvor genannten asymmetrischen Cyaninen können fluoreszierende Nukleinsäurefarbstoffe
wie Cyanindimere und -monomere ebenfalls durch die quaternären Verbindungen
stabilisiert werden, wohingegen dies konventionelle Phenanthridinnukleinsäurefarbstoffe
wie Ethidiumbromid und Propidiumiodid nicht können. Bevorzugte Cyanindimere
und -monomere schließen
ein, sind aber nicht beschränkt
auf TOTO, YOYO, TO-PRO (jeweils kommerziell erhältlich von Molecular Probes,
Inc., Eugene, OR) und Cy3, Cy5 und Cy7 (jeweils kommerziell erhältlich von
Amersham Life Science Inc., Arlington Heights, IL).
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Das
Elektrophoresegel der Erfindung umfasst ein Hydrogel, ein Puffersystem,
einen fluoreszierenden Nukleinsäurefarbstoff
und eine oder mehrere quaternäre
Verbindungen. Für
Elektrophorese nützliche
Hydrogele schließen
Agarose- und Polyacrylamidgele ein, obwohl es sein kann, dass das
Färbemittel,
wenn Polyacrylamidgele verwendet werden, nach der Gelbildung beigemengt
werden muss, um den Abbau des Färbemittels
während
der Acrylamidpolymerisierung zu verhindern. Normalerweise für Elektrophorese
verwendete Puffer schließen
ein, sind aber nicht beschränkt
auf MOPS, TAPS (jeweils kommerziell erhältlich von Sigma, St. Louis,
MO), TAE (1x Konzentration ist 40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA) und
TBE, die für
die Erfindung verwendet werden können,
vorausgesetzt, dass der pH-Wert der Puffer nach Zugabe der quaternären Verbindungen geeignet
eingestellt wird und dass das System mit der elektrophoretischen
Auftrennung kompatibel ist. Die Kombination von TAPS-Puffer und
Tetrapentylammoniumhydroxid wird besonders bevorzugt. Die Kombination von
TAPS-Puffer und Tetrapentylammoniumhydroxid und Tetrabutylammoniumhydroxid
wird bevorzugt. Die Kombination von TBE- oder TAE-Puffer mit Tetrapentylammoniumbromid
wird ebenfalls bevorzugt. Fluoreszierende Nukleinsäurefarbstoffe
können
asymmetrische Cyaninfärbemittel
sein. Die Verwendung von GelStar-Nukleinsäurefärbemitteln wird besonders bevorzugt.
Die Verwendung von SYBR-Green-
oder SYBR-Gold-Färbemittelgelen
erfordert die Optimierung der Färbemittelkonzentration
und der Menge an auf das Gel aufgetragener DNA oder RNA, um hoch
auflösende
Elektrophoreseergebnisse zu erhalten.
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Lagerstabile
Farbstofflösungen
der Erfindung sind zusammengesetzt aus einem fluoreszierenden Cyaninfarbstoff
einem wässrigen
Lösungsmittel
und einer oder mehreren quaternären
Verbindungen. Die Lösungen
können
verwendet werden, um Gele nach Elektrophorese zu färben, damit
Nukleinsäuren
oder Proteine, die auf den Gelen aufgetrennt wurden, sichtbar gemacht
werden.
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Beispiel 1
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Farbstoffstabilisierung
in Gelen
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SeaKem-LE-Agarosegele
(1 % w/v, BMA Inc) wurden in 1x TAPS-Puffer (3-(N-tris(hydroxymethyl)methylamino)-propansulfonsäure, 40
mM) in der Anwesenheit von 1x GelStar-Nukleinsäurefärbemittel (BMA Inc) und in
Tabelle 1 angegebenen Additiven gegossen. Gele wurden im Dunkeln
für sechs
Tage bei 45 °C
inkubiert und für
die Detektion von DNA wie folgt getestet: Gele wurden in 1x TAPS-Elektrophoresepuffer
ohne Farbstoff eingetaucht. Dann wurde DNA durch das Gel bei 20
V/cm für
eine Stunde der Elektrophorese ausgesetzt. Die Intensität einer
2,5 ng DNA-Bande wurde durch Durchleuchtung bei 300 nm untersucht.
Das Färbemittel
in dem Gel wurde als stabilisiert erachtet, falls die Fluoreszenzintensität der DNA
mehr als 80 % betrug, im Vergleich dazu, wenn das Gel mit dem Färbemittel
frisch zubereitet worden war. GelStar-Nukleinsäurefärbemittel wurde durch die Anwesenheit
von Tetrapentylammonium- und Tetrabutylammoniumverbindungen stabilisiert, aber
nicht mit quaternären
Ammoniumdetergenzien. Die Qualität
der DNA-Auflösung in
frischen Gelen wurde als „gut" aufgenommen, wenn
die DNA-Bande scharf war, als „ausreichend", wenn die DNA-Bande
breit war und als „schlecht", wenn die DNA-Bande verschwommen
war.
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Tabelle
1: Die Wirkung von Additiven auf die Stabilität von GelStar-Nukleinsäurefärbemitteln
in Gelen
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Beispiel 2
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Farbstoffstabilisierung
in Lösung
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SYBR-Green-I-Nukleinsäurefärbemittel
(1X, BMA Inc.) wurde in den angegebenen Lösungsmitteln (Tabelle 2) suspendiert
und in Polypropylenflaschen bei 21-23 °C unter Umgebungslicht gehalten.
TBE-Puffer mit einer Konzentration von 1X bestand aus 89 mM Tris,
89 mM Borsäure
und 2 mM EDTA. Periodisch wurden 5 μl der Lösungen mit 3 ng lambda-DNA
vermischt und dann auf eine Polystyrolpetrischale (VWR, MA) getupft. Der
Tupfen wurde bei 500 nm angeregt (Dark Reader, Clare Chemical Research,
CO) und die Fluoreszenzintensität
wurde eingefangen und integriert über eine konstante Oberfläche durch
den AlphaImager („Spot
Density Tools",
Alpha Innotech, CA). Die Zahlen wurden dann gegen die Intensität beim Zeitpunkt
0 normalisiert. Die Zeit, die es braucht, bis das Färbemittel
die Hälfte
seiner Fluoreszenzintensität
verliert, wurde aufgenommen als t½. Der t½-Wert von SYBR-Green-I-Nukleinsäurefärbemittel
ohne erfinderische Additive lag zwischen 5 und 14 Tagen, in Abhängigkeit
von der Art des Kontrolllösungsmittels.
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Beispiel 3
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Farbstoffe, die durch
das Additiv stabilisiert werden
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Asymmetrische
Cyanine (1X SYBR-Green-I-, 1X SYBR-Gold- und 1X GelStar-Nukleinsäurefärbemittel),
Hoechst 33258 Pentahydrat (bis-Benzimid: BisBnz, 1,5 μg/ml) und
Phenanthridininterkalationsfarbstoffe (1 μg/ml Ethidiumbromid; 10 μg/ml Propidiumbiodid)
wurden für
Ansprechen auf das Stabilisierungsmittel TPABr getestet. Farbstoffe
wurden in 1X TAPS-Puffer getestet, der mit NaOH auf einen pH-Wert
von 8,2 eingestellt worden war, mit oder ohne 14,6 mM TPABr. Farbstoffstabilisierung
wurde unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrens
gemessen, mit der Ausnahme, dass für die Messung von Ethidiumbromid, Propidiumiodid
und Hoechst-33258-Farbstoffe eine Transilluminierung von 300 nm
verwendet worden ist. Die Wirkung von TPABr auf die Stabilität dieser
drei Verbindungen war marginal. Im Gegensatz dazu wurde die t½ von SYBR
Green auf über
100 Tage (im Vergleich mit fünf
Tagen ohne TPABr), die von SYBR-Gold-Färbemittel auf 36 Tage (im Vergleich
mit neuen Tagen ohne TPABr) und die von GelStar-Färbemittel
auf 24 Tage (im Vergleich mit vier Tagen ohne TPABr) verlängert.
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Beispiel 4
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Wirkung von
Detergenzien auf die Farbstoffstabilisierung
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Tabelle
3: Die Wirkung von Detergenzien in Kombination mit quaternärem Salz
