EP0589011A1 - METHODE ZUR BESTIMMUNG VON PLASMIN-$g(a)2-ANTIPLASMIN KOMPLEXEN SOWIE VERWENDUNG DER BESTIMMUNGSMETHODE ALS MASS FÜR VERÄNDERUNGEN IM FIBRINOLYTISCHEN SYSTEM - Google Patents

METHODE ZUR BESTIMMUNG VON PLASMIN-$g(a)2-ANTIPLASMIN KOMPLEXEN SOWIE VERWENDUNG DER BESTIMMUNGSMETHODE ALS MASS FÜR VERÄNDERUNGEN IM FIBRINOLYTISCHEN SYSTEM

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EP0589011A1
EP0589011A1 EP93907638A EP93907638A EP0589011A1 EP 0589011 A1 EP0589011 A1 EP 0589011A1 EP 93907638 A EP93907638 A EP 93907638A EP 93907638 A EP93907638 A EP 93907638A EP 0589011 A1 EP0589011 A1 EP 0589011A1
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EP
European Patent Office
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pap
antibody
complexes
plasmin
antiplasmin
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP93907638A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Bernd Binder
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Berbi GmbH
Original Assignee
Berbi GmbH
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Publication date
Application filed by Berbi GmbH filed Critical Berbi GmbH
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/968—Plasmin, i.e. fibrinolysin

Definitions

  • the invention relates to a method for the quantitative determination of plasmin- ⁇ 2-antiplasmin complexes and the use of the determination method as a measure of fibrinolytic changes.
  • ⁇ 2-antiplasmin is the most important piasmin inhibitor. His reaction with plasmin results in the formation of an inactive complex composed of one molecule from each of the two components. Two stages are involved in this process; firstly, a reversible complex is formed between the lysine-binding site of the plasmin and the corresponding site in the carboxyl end of the ⁇ 2-antiplasmin molecule. In the second stage, an irreversible complex is formed by cleaving a peptide bond in the inhibito.
  • Non-fibrin-specific plasminogen activators such as streptokinase or urokinase, can cause complete consumption of plasmin inhibitors and can be increased due to plasminemia
  • plasmin- ⁇ 2-antiplasmin complexes can therefore serve on the one hand as an indicator of generalized plasminemia in hyperfibrinolytic conditions with fibrinogen and ⁇ 2-antiplasmin consumption and possible tendency to bleed, and on the other hand slightly increased plasma levels of plasmin ⁇ 2-antiplasmin complexes indicate continuous thrombus formation and dissolution, as in the case of thrombophilia or PAP complexes in serum, to the entire fibrinolytic potential.
  • a major advantage was the development of the double sandwich technique as used in the ELISA systems.
  • Various methods have been developed since then; either using an antibody against ⁇ 2-anti-plasmin as the binding antibody and an antibody against that Enzyme for quantification, or vice versa.
  • Harpel et al. was the first to publish a sensitive assay with a polyclonal antibody against ⁇ 2-antiplasmin as a binding antibody and POX-labeled Fab fragments against plasminogen as a detection system, whereby the Fab fragments have the advantage over ver intact antibodies offer reduced, non-specific binding of plasminogen and other plasma proteins.
  • Other ELISA systems were developed by Holvoet et al. and Mimuro et al.
  • DE-Al-41 15 993 discloses a method which relates to the production of a monoclonal antibody BMA PAP6 and the associated hybridoma cell line (BW PAP6), which antibody has a specific affinity for the PAP complex and none, or only one has low affinity for the individual components of this complex.
  • BMA PAP6 monoclonal antibody
  • BW PAP6 hybridoma cell line
  • This antibody was obtained by immunization with PAP complexes cleaved by ammonia treatment.
  • this antibody is also only functionally characterized in the ELISA, but not by means of Western blots.
  • a test system is therefore proposed here which comprises a specific, other, monoclonal antibody directed against the neoantigen in the PAP complex, which antibody was obtained by immunization with a natural, non-ammonia-treated PAP complex, which antibody also in the Western blot only with the PAP com plex reacts and which antibody is used as a binding antibody.
  • a corresponding PAP complex ELISA becomes highly specific and highly sensitive even in the plasma and serum environment.
  • the MPW7AP antibody used for the invention is secreted by the associated hybridoma cell line, which is deposited with the Public Health Laboratory Service, European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, UK, under the number 93031620.
  • the cell line is obtained by known methods by fusion of a mouse myeloma cell line (NSO) with spleen cells of a mouse, which was immunized with native PAP complexes.
  • NSO mouse myeloma cell line
  • the secreted monoclonal antibodies are characterized in that they react specifically in a Western blot only with the PAP complex, but not with the individual components (FIG. 1).
  • the test described here is a solid phase enzyme in munassy, in which MPW7AP, a monoclonal antibody specific for the neoantigen of the PAP complex, is adsorbed on plastic microtiter plates.
  • MPW7AP a monoclonal antibody specific for the neoantigen of the PAP complex
  • MPW2PG POX a peroxidase-labeled monoclonal antibody against the Kringle 1-3 region of the plasminogen part complex.
  • Labeling of labeled anti-gene-antibody conjugates is achieved using ABTS, a chromogenic substrate for peroxidase.
  • -ELISA reader for 405 nm and 492 nm wavelength (e.g. Anthos-Reader 2001, Zinsser, Austria).
  • BSA Serum Albium Bovine, purest
  • PBS Phosphate buffered saline
  • Dilution buffer 3 (DB3): DB1 + 10% PAP depleted plasma
  • Substrate buffer 1.29 citric acid monohydrate, 1.375 g Na2HP ⁇ 4-2H2 ⁇ with distilled water to 100 ml, pH 4.0
  • Stop solution 320 mg NaF / 100 ml distilled water; 100 ul / well
  • Coating buffers and coated plates are mixed with an antimicrobial substance and therefore stable at 4 ° C.
  • Other protein-containing solutions and wash buffers should be freshly made or kept under sterile conditions to prevent microbial growth.
  • the wells of an ELISA plate are filled with 100 ⁇ l / well coating solution - ideally using a multi-channel micropipette.
  • the plate is then covered with a self-adhesive plastic film and stored at 4 ° C for at least 16 hours or for any length of time.
  • the coated plate is emptied and mixed with 100 ⁇ l / well block solution and incubated for 1 h at 37 ° C. in order to block excess reactive groups on the plate surface.
  • the plates remain covered with a plastic film for all incubation steps.
  • Normal citrate or EDTA plasma can be used, but it should be noted that uninhibited plasmogenogen activators lead to an in vitro formation of PAP complexes. Especially when checking the sale of a thrombolytic therapy, inhibitors should always be added to the blood samples when they are taken (e.g. 2000 KlU / ml aprotinin + 20 M benzamidine final concentration).
  • the plasma samples are diluted 1:10 in DB1 for low concentrations and 1: 100 for high concentrations of PAP complexes. 100 ⁇ l / well are required and double determinations are recommended.
  • PAP Complex Standard Plasma is dissolved in distilled water and serial dilutions from 1: 100 to 1: 1800 or a zero value are made in DB3 for use with samples with low PAP concentrations and in DB2 for Use for samples with high PAP concentrations.
  • 100 ⁇ l / well and double determinations are required.
  • the plate is washed three times with approx. 300 ⁇ / well washing buffer, either manually or using an automatic washing device. After each wash, the plate is tapped on an absorbent paper.
  • the complexes thus formed are either frozen at -70 ° C or lyophilized at 4 ° C.
  • the ELISA measured values of this standard were compared with those of the PAP complexes from the purified components.
  • plasmin was freshly prepared from purified glu-plasminogen by incubation with urokinase-Sepharose and, after removal of urokinase-Sepharose, the resulting activity was immediately purified with S-2251 and after 30 min incubation at 37 ° C. with purified ⁇ 2-antiplasmin determined. The differences in the plasmin activity correspond to the amount of PAP complexes formed (FIG. 2).
  • the test described is specific for plasmin- ⁇ 2-antiplasmin complexes and gives good plasma recovery, provided the standard was dissolved in PAP-depleted plasma, in the same concentration as the plasma samples to be tested.
  • the detection limit is 10 ng / ml in the purified system as well as in plasma.
  • the PAP averages are 152 ⁇ 72 ng / ml for citrate and 132 ⁇ 72 ng / ml for EDTA plasma; PAP values are usually elevated in serum samples.
  • Thrombolytic therapy gives PAP plasma values of> 800 ng / ml.
  • PAP values were still elevated after 12 months (FIG. 3).
  • cytopenic purpura2 2.1 ⁇ g / ml
  • Standardization is therefore achieved by comparing the PAP complex standard plasma used, in which stable Complexes have formed with PAP complexes that were immediately freshly prepared from purified components.
  • Anti-neoantigen monoclonal as binding antibody
  • Antiplasminogen monoclonal as detection antibody 152 ⁇ 72 ng / ml> 1 ⁇ g / ml
  • This system corresponds to a PAP kit that is commercially available from Teijin.
  • Fig. 1 Western blot of 3 monoclonal antibodies which are directed against ⁇ 2-antiplasmin, a component of the PAP complex.
  • Antibody ⁇ # 3 ⁇ is the antibody - MPW7AP.
  • Fig. 2 Comparison of PAP complexes created in plasma with PAP complexes from purified components.
  • the insert shows amidolytic activity of freshly produced plasmin incubated with buffer or an excess of ⁇ 2-antiplasmin. The concentration of complexes formed is calculated from the difference between the two activities, correspondingly inhibited plasmin.
  • FIG. 3 PAP complexes in control persons and patients with coronary heart disease.
  • Fig. 4 Time course of the PAP complex in the serum of a reactive person.
  • Fig. 5 Time course of the generation of PAP complexes in the serum (0-4 hours) before (o), 1 week (•), 2 weeks ( ⁇ 4), after aspirin administration and 1 week after the end of aspirin administration ( ⁇ ) .

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Description

Methode zur Bestimmung von Plasmin-α2-Antiplasmin Komplexe sowie Verwendung der Bestimmungsmethode als Maß für Veränderungen im fibrinolytischen System
Die Erfindung betrifft eine Methode zur quantitativen Bestimmung von Plasmin-α2-Antiplasmin Komplexen sowie die Verwendung der Bestimmungsmethode als Maß für fibrinolyti¬ sche Veränderungen.
Einleitung:
α2-Antiplasmin ist der wichtigste Piasmininhibitor. Seine Reaktion mit Plasmin resultiert in der Bildung eines inaktiven Komplexes, zusammengesetzt aus je einem Molekül beider Komponenten. Zwei Stufen sind in diesem Prozeß involviert; erstens wird ein reversibler Komplex zwischen der lysinbindenden Stelle des Plasmin und der entsprechen¬ den Stelle im Carboxylende des α2-Antiplasmin Moleküls gebildet. In der zweiten Stufe wird ein irreversibler Komplex durch die Spaltung einer Peptidbindung im Inhibito gebildet. Während der Aktivierung von Plasminogen zu Plas¬ min und der Piasminwirkung besteht ein Gleichgewicht zwischen der Bildung von Plasmin-α2-Antiplasmin Komplexen, welche hauptsächlich in der flüssigen Phase gebildet wer¬ den, und der Bindung sowie Wirkung von Plasmin an der Fibrinoberfläche. Gebunden an Fibrin, ist Plasmin gegen di Hemmung durch α2-Antiplasmin geschützt. Sobald jedoch Fibrin völlig aufgelöst ist, wird das von der Fibrin- Oberfläche befreite Plasmin umgehend durch α2-Antiplasmin komplexier .
Wann immer Fibrin in der Zirkulation entsteht, wird dieser Prozeß, auf Grund der wohlbekannten Wirkung von Fibrin auf den Gewebeplasminogen Aktivator ( -PA), von einer Aktivierung des fibrolytischen Systems begleitet. Gebildetes Plasmin wird daher zum Teil durch α2-Antiplasmin komplexiert und führt zu erhöhten Werten von Plasmin-α2- Antiplasmin Komplexen im Plasma. Solche erhöhten Werte an PAP-Komplexen wurden daher in vielen Fällen bei vermehrter Fibrinbildung gefunden, wie bei Thrombophilie- Hypercoagu- labilität, disseminierter intravasaler Gerinnung, Endoto- xinschock, Leukämie, Lebererkrankungen, nephrotischen Syn- dromen und nach schweren chirurgischen Eingriffen. Sogar nach dem Venösen-Stau-Test wurden in den meisten Fällen erhöhte Plasmin-α2-Antiplasmin-Spiegel gefunden, in Über¬ einstimmung mit vermehrter Fibrinbildung und erhöhten Wer¬ ten von Gewebeplasminogen-Aktivator im Venenokklusions- Plasma. Dementsprechend ist auch zu erwarten, daß es bei der Gewinnung von Serum zeitabhängig zu einer Generierung von PAP-Komplexen kommt. Die Menge der hierbei im Serum gebil¬ deten PAP-Komplexe kann abhängig von den anderen in dem jeweiligen Milieu vorkommenden Plasminogenaktivatoren und Plasminogenaktivatorinhibitoren sowie entsprechenden Rezep¬ toren und Bindungsproteinen erwartet werden.
Während in allen vorgenannten Fällen nur eine geringe Erhöhung der PAP-Konzentration zu beobachten ist, führt eine thrombolytische Therapie durch die ausgedehnte Akti- vierung des fibrinolytischen Systems zu einer massiven
Piasminbildung in der flüssigen Phase und einer maximalen PAP-Komplexbildung. Speziell nicht-fibrin-spezifische Plasminogen-Aktivatoren, wie Streptokinase oder Urokinase, können einen völligen Verbrauch von Plasmin-Inhibitoren verursachen und auf Grund von Plasminämie zu verstärkter
Blutungsneigung führen. In diesem Fall ist die Plasmin-Wir¬ kung nicht mehr auf Fibrin als sein spezifisches Substrat beschränkt, sondern kann auch auf unspezifische Substrate wie Fibrinogen oder andere Gerinnungsfaktoren übergehen. Die Bestimmung von Plasmin-α2-Antiplasmin-Komplexen kann daher einerseits als Indikator für eine generalisierte Plasminämie bei hyperfibrinolytischen Zuständen mit Fibri¬ nogen und α2-Antiplasmin-Verbrauch und möglicher Blutungs¬ neigung dienen, anderseits sind gering erhöhte Plasma-Spie gel von Plasmin-α2-Antiplasmin-Komplexen ein Hinweis für eine ständig stattfindende Thrombus-Bildung und Auflösung, wie im Fall von Thrombophilie bzw. PAP-Komplexen im Serum auf das gesamte fibrinolytische Potential.
Verfügbare Methoden zur Bestimmung von PAP:
Es wurden bereits mehrere Testmethoden zur Bestimmung von PAP-Komplexen publiziert, unter anderem zweidimensio- nale Immunelektrophorese, ein Latex-Test, RIA und in neue¬ rer Zeit ELISA-Systeme. Zuerst wurde ein Latex-Agglutinati ons-Test zur Bestimmung von PAP-Komplexen von Plow et al. mit eher geringer Sensitivität vorgestellt. Anschließend wurde eine zweidimensionale Elektrophorese beschrieben, be der die unterschiedliche Mobilität von freiem und komple- xiertem α2-Antiplasmin Anwendung findet. Diese Methode war noch immer nicht sensitiv genug und ziemlich zeitraubend sowie ungeeignet für eine größere Anzahl von Proben. Unter Verwendung von polyklonalem Antiserum, gegen einen Komplex aus α2-Antiplasmin und der B-Kette von Plasmin, wurde von Wiman et al. ein RIA entwickelt, welcher auf diese Weise unabhängig war von intaktem Plasminogen oder Plasmin. Es wurde aber immer noch intaktes α2-Antiplasmin zusammen mit dem PAP-Komplex entdeckt, allerdings in einem weitaus geringeren Ausmaß.
Ein großer Vorteil war die Entwicklung der Doppel- Sandwich-Technik, wie in den ELISA-Systemen verwendet. Seither wurden verschiedene Methoden entwickelt; entweder unter Verwendung eines Antikörpers gegen α2-Anti-Plasmin als Bindungs-Antikörper und einem Antikörper gegen das Enzym für die Quantifizierung, oder vice versa. Harpel et al. hat als erster einen empflindlichen Assay mit einem polyklonalen Antikörper gegen α2-Antiplasmin als Bindungs- Antikörper und POX-markierten Fab-Fragmenten gegen Plasmi- nogen als Nachweis-System publiziert, wobei die Fab-Frag- mente gegenüber intakten Antikörpern den Vorteil einer ver¬ minderten, unspezifischen Bindung von Plasminogen und anderen Plasma Proteinen bieten. Andere ELISA-Systeme wur¬ den von Holvoet et al. und Mimuro et al. beschrieben, unter Verwendung von entweder zwei monoklonalen Antikörpern gegen je einen Teil des Komplexes oder einen polyklonalen und einem monoklonalen Antikörper. Erst kürzlich wurde ein Liposome-Immun-Lyse-Assay (LILA) von Hasada et al. vorge¬ stellt. Die bisher beschriebenen ELISA oder LILA Testsy- steme wurden allerdings bis zu einem gewissen Grad durch den großen Überschuß von nicht-komplexiertem α2-Antiplasmin oder Plasminogen im Vergleich zu der ziemlich niedrigen Konzentration des PAP-Komplexes beeinträchtigt, da alle oben beschriebenen Methoden Antikörper verwenden, die sowohl den Komplex als auch die nativen unkomplexierten Moleküle erkennen.
In der DE-Al-41 15 993 ist ein Verfahren geoffenbart, das die Gewinnung eines monoklonalen Antikörpers BMA PAP6 und die zugehörige Hybridomzellinie (BW PAP6) betrifft, welcher Antikörper eine spezifische Affinität zum PAP-Kom- plex und keine, oder nur eine sehr geringe Affinität zu den Einzelkomponenten dieses Komplexes hat. Dieser Antikörper wurde durch Immunisierung mit durch Ammoniakbehandlung gespaltenen PAP-Komplexen erhalten. Auch dieser Antikörper ist jedoch nur funktionell im ELISA, nicht aber mittels Western-Blots charakterisiert.
Daher wird hier ein Testsystem vorgeschlagen, das einen spezifischen, anderen, monoklonalen Antikörper, gerichtet gegen das Neoantigen im PAP-Komplex umfaßt, wel- eher Antikörper durch Immunisierung mit einem natürlichen, nicht ammoniakbehandelten PAP-Komplex erhalten wurde, wel¬ cher Antikörper auch im Western-Blot nur mit dem PAP-Kom- plex reagiert und welcher Antikörper als Bindungsantikörpe verwendet wird. Hierdurch wird ein entsprechender PAP-Ko - plex-ELISA hochspezifisch und hochempfindlich auch im Plasma- und Serum-Milieu.
Herstellung und Charakterisierung des Antikörpers gegen d Neoantigen im PAP-Komplex:
Der für die Erfindung verwendete Antikörper MPW7AP wird von der zugehörigen Hybridomzellinie, die bei Public Health Laboratory Service, European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, UK, unter der Nummer 93031620 hinterlegt ist, sezerniert. Die Zellinie ist nach bekannt Verfahren durch Fusion einer Mausmyelomzellinie (NSO) mit Milzzellen einer Maus, die mit nativen PAP-Komplexen immu nisiert wurde, erhalten. Die sezernierten monoklonalen Antikörper sind dadurch gekennzeichnet, daß sie spezifisc in einem Western-Blot nur mit dem PAP-Komplexen, nicht jedoch mit den Einzelkomponenten reagieren (Fig. 1).
Test Prinzip:
Der hier beschriebene Test ist ein solid phase-enzym i munassy, bei welchem MPW7AP, ein monoklonaler Antikörpe spezifisch für das Neoantigen des PAP-Komplexes, an Pla- stik-Microtiter-Platten adsorbiert wird. Bei der Inkubati mit den Testproben werden die PAP-Komplexe selektiv gebun den und nach Entfernen von nichtgebundenem Material durch MPW2PG POX, einem Peroxidase-markierten monoklonalen Anti körper gegen die Kringle 1-3 Region des Plasminogenteils Komplex nachgewiesen. Quantifizierung von markierten Anti gen-Antikörper Konjugaten werden durch ABTS erreicht, ein chromogenes Substrat für Peroxidase. Material und Geräte:
- 96-Napf Microtiter-Platten mit hoher Bindungs-Kapazität (z.B. NUNC Immunoplate Maxisorp 4-93454 oder GREINER ELISA Platten (Nr. 655061), Plattenverschlüsse (z.B. COSTAR 3095).
-ELISA-Reader für 405 nm und 492 nm Wellenlänge (z.B. Anthos-Reader 2001, Zinsser, Österreich).
- Antikörper gegen PAP Neoantigen MPW7AP und Antikörper gegen Kringle 1-3 Region von Plasminogen, Pox-markiert,
MPW2PG POX Technoclone, Wien Österreich).
-PAP Komplex Standard Plasma und PAP Komplex-depletiertes
Plasma, Technoclone, Wien, Österreich).
- ABTS 2-2' Azinobis (3-Äthylbenz-Thiazolinsulfonsäure von Boehringer Mannheim, Deutschland).
- Aprotinin (TrasylolR) von Bayer Leverkusen, Deutschland).
- 2-(Äthylmercurithio)-benzoesäure- Natriumsalz (ThimerosalR) 818957-, Merck, Deutschland.
- Polyoxyäthylensorbitan-Monooleat (Tween 20), P 13 79, Sigma, USA.
- Serum Albium Bovine, reinst (BSA) ORHO 20/21, Behring, Deutschland.
- Benzamidinchlorid 82012, Merck, Deutschland.
Lösungen:
Beschichtungspu r:
1,59 g Na2CÖ3.10H2θ, 2,93 g NaHC03 100 mg Thimerosal mit destilliertem Wasser auf 11, pH 9,6.
Beschichtungslösung:
20μ/ml MPW7AP in Beschichtungspuffer; lOOμl/Napf
Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS): 8 g NaCl, 0,2 g KH2PO4, 1,44 g Na2HP04 mit destillier¬ tem Wasser auf 11, pH 7,4 Wasch-Puffer: PBS + 0,5 % Tween 20
Blocklösung: PBS + 1 % BSA
Verdünnungs-Puffer 1 (DB1):
PBS + 1 % BSA + 2000 KlU/ml Aprotinin + 20 mM Benzamidin- chlorid oder ein spezifischer Inhibitor für t-PA, z.B. PPACK
Verdünnungs-Puffer 2 (DB2): DB1 + 1 % PAP depletiertes Plasma
Verdünnungs-Puffer 3 (DB3): DB1 + 10 % PAP depletiertes Plasma
Entwicklungs-Lösung: 10 μg/ml MPW2PG Box in DB1; 100 μl/Napf
Substrat-Puffer: 1,29 Zitronensäure Monohydrat, 1,375 g Na2HPθ4-2H2θ mit destilliertem Wasser auf 100 ml, pH 4,0
Substrat-Lösung:
1 mg ABTS/nl + 1 μl H202 30 % /ml in Substrat-Puffer, 100 μl/Napf
Stop-Lösung: 320 mg NaF/100 ml destilliertes Wasser; 100 μl/Napf
Stabilität der Reagenzien:
Beschichtungs-Puffer und beschichtete Platten sind mi einer antimikrobellen Substanz versetzt und daher bei 4° C stabil. Andere proteinhältige Lösungen und Wasch-Puffer sollten frisch hergestellt oder unter sterilen Bedingungen gehalten werden, um mikrobielles Wachstum zu verhindern.
Antibiotika sollten in diesen Fällen nicht verwendet werde um nachteilige Reaktionen mit Peroxidase zu vermeiden. Verfahren:
Beschichtung der Platten:
Die Näpfe einer ELISA-Platte werden mit 100 μl/Napf Beschichtungslösung gefüllt - am besten durch Verwendung einer Mehrkanal-Mikropipette. Anschließend wird die Platte mit einer selbstklebenden Plastikfolie abgedeckt und für mindestens 16 h oder auch für beliebig längere Zeit, bei 4° C gelagert. Vor der Verwendung wird die beschichtete Platte entleert und mit 100 μl/Napf Blocklösung versetzt und für 1 h bei 37° C inkubiert, um überschüssige reaktive Gruppen auf der Plattenoberfläche zu blockieren. Für alle Inkubationsschritte bleiben die Platten mit einer Platik- folie abgedeckt.
Proben-Vorbereitung:
Normales Zitrat oder EDTA-Plasma kann verwendet wer¬ den, es sollte aber beachtet werden, daß ungehemmte Plasmi- - nogen Aktivatoren zu einer in vitro Bildung von PAP-Komple¬ xen führen. Speziell bei der Verkaufskontrolle einer throm- bolytischen Therapie sollten daher den Blutproben bei der Abnahme immer Inhibitoren zugesetzt werden, (z.B. 2000 KlU/ml Aprotinin + 20 M Benzamidin Endkonzentration).
Die Plasmaproben werden 1:10 in DB1 für niedrige Kon¬ zentrationen und 1:100 für hohe Konzentrationen von PAP- Komplexen verdünnt. Es werden 100 μl/Napf benötigt und Dop¬ pelbestimmungen empfohlen.
Standard-Vorbereitung:
PAP Komplex Standard Plasma wird in destilliertem Was- ser gelöst und Serienverdünnungen von 1:100 bis 1:1800 bzw. ein Nullwert hergestellt und zwar in DB3 zur Verwendung für Proben mit niedrigen PAP Konzentrationen und in DB2 zur Verwendung für Proben mit hohen PAP-Konzentrationen. Auch hier sind 100 μl/Napf und Doppelbestimmungen erforderlich.
Waschen der Platten:
Zwischen allen Inkubationsschritten werden die Platte dreimal mit ca. 300 μ/Napf Waschpuffer gewaschen, entweder händisch oder mittels automatischen Waschgeräts. Nach jede Waschvorgang wird die Platte auf einem saugfähigen Papier ausgeklopft.
Testvorgang:
1) Beschichten der ELISA Platten über Nacht bei 4° C 2) Inkubation mit Blocklösung 1 h bei 37° C
3 ) Waschen
4) Inkubation der Proben über Nacht bei 4° C
5) Waschen
6) Inkubation mit Pox-markiertem Antikörper 2 h bei 37° C 7) Waschen
8) Inkubation mit Subtratlösung 30 min bei Raumtemperatur, vor Licht schützen
9) Zusatz der Stoplösung
10) Erstellen der Eichkurve in linearem Maßstab und Ables der Probenwerte von der entsprechenden Standardkurve für hohe bzw. niedere PAP Konzentrationen. Multiplikation mit dem Verdünnungsfaktor.
Auswertung der Ergebnisse: Zur Auswertung der Ergebnisse wird die Ablesung der Proben mit jener eines entsprechenden PAP-Komplex Referen Präparates verglichen.
Standardisierung: Da Plasmin-α2-Antiplasmin Komplexe nur schwer in ein stabilen gereinigten Form hergestellt werden können - der Komplex wird leicht proteolytisch gespalten und es können verschiedene Epitope entstehen, je nachdem, ob der Komplex im Überschuß von Plasmin oder seines Inhibitors gebildet wird (1) - entschloß man sich, PAP-Komplexe direkt im Plasma herzustellen und sie mit PAP-Komplexen aus gereinig- ten Komponenten zu eichen.. Zu diesem Zweck wurde Zitrat- Plasma mit einer mehr als ausreichenden Konzentration an Urokinase inkubiert um eine maximal mögliche Menge von Plasmin-α2-Antiplasmin-Komplexen zu erhalten. Anschließend wurde die Reaktion durch Zusatz von Benzamidin und Trasylol gestoppt. Die so gebildeten Komplexe sind entweder gefroren bei - 70° C oder lyophilisiert bei 4° C stabil. Um die tatsächliche Menge der Komplexe im Standard Plasma zu bestimmen, wurden die ELISA Meßwerte dieses Standards mit jenen der PAP-Komplexe aus den gereinigten Komponenten verglichen. Zu diesem Zweck wurde Plasmin frisch aus gerei¬ nigtem Glu-Plasminogen durch Inkubation mnit Urokinase- Sepharose hergestellt und, nach Entfernung der Urokinase- Sepharose, wurde die entstandene Aktivität mit S-2251 sofort- und nach 30 min Inkubation bei 37° C mit gereinigtem α2-Antiplasmin bestimmt. Die Differenzen in der Plasmin Aktivität entspricht der Menge an geformten PAP-Komplexen (Fig. 2).
Spezifität: Der beschriebene Test ist spezifisch für Plasmin-α2- Antiplasmin Komplexe und ergibt gute Plasma Recovery, vorausgesetzt der Standard war in PAP-depletiertem Plasma, in der gleichen Konzentration wie die zu testenden Plasma- Proben, gelöst.
Sensitiv!tat und Normal-Werte:
In' dieser Analyse liegt die untere Nachweisgrenze bei 10 ng/ml im gereinigtem System wie auch im Plasma.
Normalwerte:
In einer normalen Kontrollpopulation liegen die PAP- Mittelwerte bei 152 ± 72 ng/ml für Zitrat und 132 ± 72 ng/ml für EDTA Plasma; in Serumproben sind die PAP-Werte meistens erhöht.
Pathalogische Werte:
Thrombolytische Therapie ergibt PAP-Plasma Werte von >800 ng/ml. Bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit, die erfolgreich mit perkutaner transluminaler koronarer Angino- graphie (PTCS), behandelt wurden, lagen nach 12 Monaten noch erhöhte PAP-Werte vor ( Fig. 3 ) .
Bestimmung von PAP-Komplexen bei verschiedenen Gruppen von Patienten:
Methode Patienten Plasmaspiege
Gekreuzte Immun¬ disseminierte intravas- elektrophorese kulare Gerinnung ++ Carcinom/Leukämie , 8 ++
RIA2 Krebst 1,2-3,6 μg/m
Chirurgische Patienten3,4 2,1 μg/ml "hoch fibrogene" Patienten-5 2,1 μg/ml PAP-Spiegel waren von predik- tivem Wert für postoperative Venenthrombose
ELISAl Carcinome 0,12-0,15 μ
Akute promyelotische Leukämie >0,28 μM hämorrhagischer Schock >0,28 μM Sepsis 0,24 μM
ELISA9 Lebererkrankungen oder
LeberversagenlO, 15 0 7 μg/ml
DIC16,17 6,9 μg/ml Akute promyelotische
Leukämie!!. !4 11,5 μg/ml
Schock!1 14,1 μg/ml
Sepsis1! 2,2 μg/ml
Thrombotische thrombo-
cytopenische Purpural2 2,1 μg/ml
Septische Lupus Ery-
thematoydis^, 18 erhöht
PAP-Komplexe im Serum:
Wenn Serum unterschiedliche Zeiten nach Blutentnahme gewonnen wird und der PAP-Komplex-Gehalt in dem erhaltenen Serum bestimmt wird, zeigt sich, daß es bei bestimmten Per¬ sonengruppen zu einem zeitabhängigen Anstieg der PAP- Komplexe kommt (Fig. 4). Bei einer der Gruppen mit einem solchen PAP-Anstieg im Serum handelt es sich um Personen, die eine Veränderung ihres fibrinolytischen Potentials, z.B. durch die Einnahme von Aspirin (Acetylsäure) aufwei¬ sen. Hierbei kommt es beispielweise bei täglicher Einnahme von 100 mg Aspirin nach einer Woche zu einem deutlichen Anstieg der PAP-Komplexe, der nach 2-wöchntlicher Einnahme noch verstärkt ist. Eine Woche nach dem Ende der Aspi¬ ringabe ist die PAP-Erhöhung zwar geringer, aber immer noch nachweisbar (Fig. 5) .
Kontrolle und KalibrationsVorgänge:
Im Moment ist kein PAP-Standard verfügbar. Daher wird eine Standardisierung erreicht durch Vergleich des verwen¬ deten PAP Komplex Standard Plasmas, in welchem sich stabile Komplexe gebildet haben, mit PAP Komplexen, die unmittelba frisch aus gereinigten Komponenten hergestellt wurden.
Vergleiche von vorhandenen Daten mit Anderen:
Normal Plasma Voll aktivierte
Plasma
Latex Agglutination27
(nur Titer) 1:4 1:512
Gekreuzte Immunelektro-
phorose28 semiquantitativ (0 bis +++) 0 +++
Radioimmuno-Assay29 untere Nachweisgrenze 1,5 μg/ml 0-2 μg/ml n.d.
ELISA30
- Anti α2-AP als Bindungs¬ antikörper
- Antiplasminogen F(ab)2 als Nachweis-Antikörper 4,1-3,5 mol/ml 177,.6 gmol/m Plasmin-Äquivalent
ELISA7,32**
- Anti Plasminogen (polyklonal) als Bindungsantikörper - Anti α.2-AP monoklonal als Nachweis-Antikörper 0,2 ± 0,1 μg/ml n.d. LILA34
(gleiches System wie oben)
0,8 ± 0,4 μg/ml n.d.
ELISA35-37***
- Anti-Neoantigen monoklonal als Bindungsantikörper - Antiplasminogen monoklonal als Nachweis-Antikörper 152 ± 72 ng/ml >1 μg/ml
* Auf Grund von mangelnder Verfügbarkeit mehrerer Reagen¬ zien konnten keine direkten Vergleiche von Testsyste en durchgeführt werden.
** Dieses System entspricht einem PAP-Kit, welcher im Handel bei Teijin erhältlich ist.
*** Gegenstand dieser Erfindung.
Fig. 1 - Western-Blot von 3 monoklonalen Antikörpern, welche gegen α2-Antiplasmin, einer Komponente des PAP- Komplexes gerichtet sind. Antikörper ~#3~ ist der Antikörper —MPW7AP.
Fig. 2 — Vergleich von PAP-Komplexen erstellt in Plasma mit PAP-Komplexen aus gereinigten Komponenten. Das Insert zeigt amidolytische Aktivität von frisch hergestell¬ tem Plasmin inkubiert mit Puffer bzw. einem Überschuß an α2-Antiplasmin. Aus der Differenz der beiden Aktivitäten, entsprechend gehemmtem Plasmin, wird die Konzentration an entstandenen Komplexen berechnet.
Fig. 3 - PAP Komplexe in Kontrollpersonen und Patien¬ ten mit koronarer Herzkrankheit. Fig. 4 - Zeitlicher Verlauf des PAP—Komplexes im Serum einer reaktiven Person. Fig. 5 - Zeitlicher Verlauf der Generierung von PAP- Komplexen im Serum (0 - 4 Stunden) vor (o ) , 1 Woche (•), 2 Wochen (<4), nach Aspiringabe und 1 Woche nach Ende der Aspiringabe (Δ).

Claims

Patentansprüche:
1. Methode zur quantitativen Bestimmung von Plasmin- α2-Antiplasmin Komplexen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen monoklonalen Antikörper spezifisch für ein Neoantigen im Komplex verwendet, welcher Antikörper im Western-Blot nur mit dem PAP-Komplex reagiert.
2. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen monoklonalen Antikörpern mit den Charakter!- stika des Antikörpers MPW7AP einsetzt.
3. Methode nach einem der Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Sandwich ELISA System verwendet.
4. Methode nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Anti-PAP-Neontigen Antikörper als Bindungs¬ antikörper verwendet.
5. Methode nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man den Anti-PAB-Neoantigen Antikörper als Bindungs¬ antikörper und einen Antikörper gegen Plasminogen als- Nachweis-Antikörper einsetzt»
6. Verwendung der Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Erfassung von fibrinolytischen Veränderungen.
7. Verwendung der Methode nach Anspruch 6 zur Bestim¬ mung der PAP-Komplexe im Serum zur Erfassung von Verände- rungen des fibrinolytischen Potentials.
8. Verwendung der Methode nach Anspruch 6 oder 7 zur Kontrolle einer Aspirinmedikation.
9." Verwendung der Methode nach Anspruch 8 zur Kon¬ trolle einer Aspirinmedikation mittels Bestimmung von PAP- Komplexen im Serum.
EP93907638A 1992-04-14 1993-04-14 METHODE ZUR BESTIMMUNG VON PLASMIN-$g(a)2-ANTIPLASMIN KOMPLEXEN SOWIE VERWENDUNG DER BESTIMMUNGSMETHODE ALS MASS FÜR VERÄNDERUNGEN IM FIBRINOLYTISCHEN SYSTEM Withdrawn EP0589011A1 (de)

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