DE69919702T2

DE69919702T2 - Verfahren zur Bestimmung der Blutgerinnung in Plasma

Info

Publication number: DE69919702T2
Application number: DE69919702T
Authority: DE
Inventors: G. Kenneth MANN; D. Matthew RAND; Kevin M. Cawthern
Original assignee: University of Vermont; University of Vermont and State Agricultural College
Current assignee: University of Vermont; University of Vermont and State Agricultural College
Priority date: 1998-06-08
Filing date: 1999-06-08
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2019-06-09
Also published as: ATE274600T1; EP1084270A1; JP2002517739A; CA2333890A1; EP1084270A4; AU757459B2; US20020042144A1; US6403381B1; DE69919702D1; WO1999064622A1; US6566140B2; AU4548699A; EP1084270B1

Description

1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Untersuchung der Gerinnung in Plasma, und insbesondere auf die Verwendung eines Inhibitors zur Minimierung der Blut- oder Plasma-Gerinnung in vitro, und zur Beseitigung von Quellen für Inkonsistenz und Fehler bei der Blutgerinnung. Die vorliegende Erfindung kann z.B. zur Optimierung der Empfindlichkeit von Plasmagerinnungs-Assays eingesetzt werden.
2. Hintergrund der Erfindung
Blutgerinnung unterstützt die Homöostase, indem sie Blutverlust minimiert. In vivo erfordert die Gerinnung üblicherweise eine Gefäßschädigung, eine Thrombozytenaggregation, Gerinnungsfaktoren und eine Fibrinolyse-Inhibierung. Es wurde beschrieben, dass die Gerinnungsfaktoren bzw. Koagulationsfaktoren durch eine Kaskade wirken, die sich von einer Gefäßschädigung bis zur Bildung eines Blutklumpen erstreckt. Siehe allgemein L. Stryer, Biochemistry, 3. Ausg., W.H. Freeman Co., New York; A.G. Gilman et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9. Ausgabe, Mc Graw Hill Inc., New York, S. 1341-1359; und Mann, K.G., et al. (1992) Semin. Hematol. 29:213.
Die Initiierung der Blutgerinnung ergibt sich aus zwei verschiedenen Wegen: dem intrinsischen (Kontakt-) und dem extrinsischen Weg. Der intrinsische Weg kann in vitro durch Kontakt eines aus Blut stammenden Faktors mit künstlich negativ geladenen Oberflächen, z.B. Glas, ausgelöst werden. Dagegen kann der extrinsische Weg in vivo oder in vitro initiiert werden, wenn Gewebefaktor (tissue factor = TF) an einer Phospholipidoberfläche, der normalerweise vom Kreislaufsystem sequestriert ist, mit Blut als Folge einer Verletzung in Kontakt kommt. Beide Wege werden durch die Anordnung mehrerer Proteinkomplexe an Prokoagulansoberflächen charakterisiert, wobei diese dazu dient, die Anwort auf die Verletzungsstelle zu lokalisieren. Siehe z.B. Mann, K.G., et al. (1990) Blood 76:1; Mann, K.G., et al. (1992), oben.
Derzeitige Theorien über die Gerinnung behaupten, dass eine Wechselwirkung zwischen den zwei Wegen für eine effiziente Blutgerinnung erforderlich ist. Siehe S.I. Rapaport und L.V.M. Rao (1995) Throm. Haemost. 74:7; und Stryer, L., oben, und darin zitierte Referenzen.
Der Kontaktweg wurde außerdem in frühe und späte Stufen aufgeteilt. Diese Stufen sind typischerweise mit spezifischen Gerinnungsfaktoren bzw. Koagulationsfaktoren verbunden. Beispielsweise ist der frühe Kontaktweg mit aktiviertem Prekallikrein und Faktor XII assoziiert, wohingegen der späte Kontaktweg die Faktoren VIII und IX involviert. Es wurde beschrieben, dass Hämophilie A, B und C jeweils mit Defizientien im späten Kontaktweg in Korrelation stehen (Faktor VIII, Faktor IX bzw. Faktor XI). Für Prekallikrein- oder Faktor XII-Defiziens wurden keine hämorrhagischen Tendenzen festgestellt. Demnach wird davon ausgegangen, dass diese frühen Kontaktfaktoren für eine Initiierung und Aufrechterhaltung der Gerinnung nicht relevant sind. Siehe z.B. Davie, E.W., et al. (1991) Biochem. 30:10363.
Viele Aktivitäten dieser extrinsischen und intrinsischen Tenase (Faktor VIIIa-Faktor IXa) und des Prothrombinasekomplexes werden durch aktivierte Thrombozyten und andere Phospholipidmembranen erleichtert. Eine Charakterisierung der Auswirkung therapeutischer Mittel in vivo wird üblicherweise durch Verfahren analysiert, bei denen der Kontaktweg abgeschwächt oder eliminiert ist. Siehe Nemerson, Y. (1988) Blood 71:1; Rand, M.D., et al. (1996) Blood 88: 1; und Monroe, D.M. et al. (1994) Brit. J. of Haemot. 88:364.
Es wurden Anstrengungen unternommen um zu klären, wie die Blutgerinnung initiiert und kontrolliert wird. Ein Ansatz bestand darin, die Blutgerinnung so zu reproduzieren, wie angenommen wird, dass sie in vivo abläuft. Durch Analysieren von Reaktionen, die mit einer Blutgerinnung in vitro verbunden sind, war es z.B. möglich, Beziehungen zwischen bestimmten Blutgerinnungsfaktoren nachzuweisen. Spezifische Ansätze involvierten eine Analyse von fraktioniertem Blut, und insbesondere von Blutprodukten, z.B. Plasma. Derzeitige in vitro-Modelle der Blutgerinnung konzentrieren sich auf die Aktivität spezifischer Blutfaktoren. Siehe z.B. Davie, E.W. et al., oben.
Verwirrung über die Rolle dieser Stoffwechselwege bei der Koagulation resultierten aus verschiedenen Schwierigkeiten, z.B. bei der Verarbeitung, Lagerung und der Untersuchung von Blut und Blutprodukten. Nicht-behandeltes Vollblut oder Blutprodukte, z.B. Plasma, gerinnen typischerweise innerhalb von Minuten. Die Gerinnung kann durch Zusatz eines Calciumchelatierenden Agenses, z.B. Citrat, reduziert oder eliminiert werden. Von Citrat wurde insbesondere berichtet, dass es mit der Anordnung und Funktion von Prothrombinase und extrinsischen und intrinsischen Tenasen wechselwirkt bzw. diese stört. Citrat-Blut kann in flüssiger Form für einen begrenzten Zeitraum (z.B. Tage bis Wochen) gelagert werden oder kann zur Herstellung von Blutprodukten, z.B. Blutzellisolaten, Thrombozyten-reichem und Thrombozyten-armem Plasma manipuliert werden. Plasmen, die Citrat enthalten, können für lange Zeiträume (Monate bis Jahre) durch Gefrieren bei Temperaturen unter etwa –70°C gelagert werden. In vielen Fällen wird das Plasma zur Verwendung recalcifiziert. Allerdings wird recalcifiziertes Plasma typischerweise infolge einer Kontaktaktivierung in den meisten Lagerungsbehältern, in denen eine Kontakaktivierung innerhalb von etwa 2 bis 4 Minuten erfolgen kann, spontan gerinnen. Das Resultat ist, dass die meisten Gerinnungs-Assays üblicherweise an Citrat-Plasmafraktionen durchgeführt werden, die zur Lagerung gefroren worden waren und dann aufgetaut wurden. Allerdings können solche Fraktionen bis unmittelbar vor der Verwendung nicht recalcifiziert werden.
Koagulationstests werden oft entweder an Blut oder Blutprodukten durchgeführt. In einfachen Tests, z.B. Tests auf Blutungszeit, werden Wunden bei einem Patienten angelegt, und die Zeit bis zur Gerinnselbildung wird aufgezeichnet. Zusätzlich wurden Vollblut-Koagulationstests bzw. -Gerinnungstests konstruiert, indem Blut direkt in ein Röhrchen aufgezogen wurde, dann hin- und herbewegt oder bewegt wurde, bis ein Gerinnsel beobachtet wurde. Solche Tests sind nicht sehr informativ, da die Initiierungsquellen nicht gut kontrolliert werden und Vergleiche unter Patienten schwierig sind. In klinischen Anordnungen werden mit Citrat versetzte Plasmaisolate am häufigsten als Blutprodukte für Gerinnungstests verwendet, und zwar infolge der Bedeutung der Tests auf Prothrombinzeit (PT) und auf aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT). Der PT-Test ist ein zweckdienlicher Assay und wird durch Zusatz einer großen Menge an Thromboplastin zu dem Citratplasma mit anschließender Initiierung der Reaktion durch Calciumzusatz durchgeführt. Die Zeit bis zur Gerinnselbildung wird aufgezeichnet; sie beträgt für die meisten normalen Spender typischerweise etwa 10 bis etwa 14 Sekunden. Der aPTT-Test involviert eine etwa 3- bis etwa 5-minütige Vorinkubation des Citratplasmas mit einem Gemisch aus Phopholipiden und Feststoffen, die negativ geladene Oberflächen besitzen. Die Reaktion wird durch Calciumzusatz initiiert, und die Gerinnungszeit für normale Spender beträgt typischerweise 25 bis 43 Sekunden. Trotz guter Einführung in der klinischen Praxis ist kein Assay vollständig geeignet um die physiologische Gerinnungsreaktion in ihrer Gesamtheit nachzuahmen. Siehe allgemein Williams Hematology, unten.
Während z.B. die PT-Messung den physiologisch relevanten Initiator TF verwendet und der Assay gegenüber den Faktoren V, VII, X und Prothrombin (II) empfindlich ist, ist die verwendete Konzentration ausreichend hoch, so dass die Reaktion üblicherweise gegenüber Defizienzen oder Abnormalitäten bei den Gerinnungsfaktoren VIII oder IX unempfindlich ist. Eine Gerinnung tritt bei normalen Individuen schnell auf (etwa 10 bis etwa 14 Sekunden), und Messfehler in der Größenordnung von Sekunden sind ein signifikanter Bruchteil der Gesamtgerinnungzeit. Wenn der Assay verwendet wird um eine Verabreichung von Antikoagulantien bzw. gerinnungshemmenden Mitteln zu überwachen, so beträgt der Zielbereich zur Verlängerung der Gerinnungszeit zwischen dem etwa 2,5- bis etwa 3,5-Fachen des Normalwertes oder zwischen etwa 25 und 49 Sekunden. Es gab die Erkenntnis, dass dieser Zeitbereich oft zu klein ist um eine genaue Analyse zu erlauben.
Der aPTT-Assay ist auch mit Problemen behaftet. Da eine Initiierung durch die Glieder des frühen Kontaktwegs abläuft, wird Faktor VII bei dieser Reaktion umgangen. Das Resultat ist, dass dieser Assay gegenüber Defizientien oder Abnormalitäten bei diesem biologisch wichtigen Gerinnungsfaktor unempfindlich ist. Aus diesem Grund wird aPTT als nicht typischerweise zur Überwachung der Anti-Koagulation durch Coumadin oder andere Warfarin-Derivate, die die Fähigkeit, von Faktor VIIa, als Initiator der Gerinnungsreaktion zu dienen, stark beeinträchtigen, geeignet angesehen.
Außerdem verwenden die meisten aPTT-Assays Plasma und sind mit Vollblut nicht kompatibel. So muss oft eine Phospholipidquelle bereitgestellt werden, und die Beiträge von Thrombozyten und anderen Zellen oder Inhibitoren zellulärer Prozesse können nicht beurteilt werden. Es wurde beschrieben, dass bestimmte Vollblut-Gerinnungs-Assays, und insbesondere die aktivierte Koagulationszeit (ACT) für Thrombozytenaggregationshemmung verantwortlich sind. Siehe z.B. Moliterno, D.J., et al. (1995) Am J. Cardiol. 75: 559; Ammar, T., et al. (1997) Circulation 95:614.
Darüber hinaus wird recalcifiziertes Plasma typischerweise infolge des Kontaktweges spontan gerinnen. Oft müssen supraphysiologische Konzentrationen an Gewebefaktor zugesetzt werden um den PT mit reproduzierbaren Resultaten durchzuführen. Die resultierende schnelle Zeit zum Gerinnen (weniger als etwa 15 Sekunden) eliminiert den Beitrag der intrinsischen Tenase und begrenzt die Assayempfindlichkeit für eine Vielzahl therapeutischer Mittel wesentlich. Siehe z.B. Schultz, N.J. (1991) Pharmacotherapy 11: 312.
Obgleich es einen gewissen Fortschritt in Richtung der Kontrolle der Gerinnung von Blut, Plasma und anderen Blutprodukten in vitro gab, besteht ein Bedarf für verbesserte Verfahren zur Lagerung dieser Materialien. Während z.B. Citrat und andere Calcium-Chelatbildner, z.B. Ethylendiamintetraacetat (EDTA), üblicherweise wirksame Attenuatoren für die Funktion und die Anordnung von Prothrombinase und Tenase sind, haben diese Chelatbildner aber eine geringe Wirkung auf die frühen Kontaktreaktionen, die eine Faktor XII-, Faktor XI- und Prekallikrein-Aktivierung involvieren, die oft während der Lagerung ungeprüft abläuft. Es wurden andere Verfahren entwickelt, die eine Verwendung bestimmter geladener Polymere, z.B. Heparinoide, involvieren. Diese Verbindungen sind üblicherweise bei der Verringerung eines falschen Gerinnens in Blut und Blutprodukten wirksam. Allerdings haben diese Verbindungen auch Nachteile. Siehe z.B. A.B. Gilman et al., oben.
Diese und verwandte Probleme haben auch Gesamtblut-Gerinnungs-Assays behindert. Beispielsweise hat eine frühere Praxis die schnelle Analyse des Gesamtbluts innerhalb von Minuten nach Probennahme auferlegt. Ein Ansatz bestand darin, Plasma aus Vollblut herzustellen um eine Analyse zu späterem Zeitpunkt zu erleichtern. Wie angegeben wurde, war es allerdings schwierig, Assays, die empfindlich, reproduzierbar sind und genaue Modelle einer in vivo-Gerinnung produzieren, durchzuführen. Siehe auch Osterud, B., et al. (1977) PNAS (USA) 74:5260.
Es gab gewisse Fortschritte in Richtung der Steuerung der in vitro-Vollblutgerinnung. Es wurde z.B. Corn-Trypsin-Inhibitor (CTI) verwendet um die Vollblutgerinnung in vitro zu verringern. Siehe Rand, M.D. (1996) et al. Blood, 88:3432; Hojima, Y., et al. (1980) Thromb. Res., 20: 149; und Munakata, M., et al. (1996) Rinsho Byori (Japan), 44: 883.
Allerdings war die frühere Verwendung von CTI mit Nachteilen behaftet. Es war z.B. unklar, ob CTI die Gerinnung von Plasma und anderen Blutprodukten inhibieren kann. Es gab insbesondere die Erkenntnis, dass eine Fraktionierung oder eine längere Lagerung von Vollblut die Fähigkeit von CTI, Gerinnungszeiten zu verlängern, nachteilig beeinflussen kann. Zusätzlich werden einige Blutprodukte, und speziell Plasma, routinemäßig mehreren Zyklen des Gefrierens und Auftauens unterworfen. Auch diese Zyklen können die CTI-Wirksamkeit beeinträchtigen. Ferner kann CTI nicht immer die Gerinnung von Vollblut oder Blutprodukten in reproduzierbarer Art inhibieren. Diese und andere Betrachtungen haben eine Verwendung von CTI als Gerinnungs-Inhibitor begrenzt.
Es wäre wünschenswert, wirksame und reproduzierbare Verfahren zur Messung der Koagulation von Vollblut und Blutprodukten, z.B. Plasma, zu haben, die einer in vivo-Gerinnung stärker nahekommen. Es wäre speziell wünschenswert, Gewebefaktor-initiierte Plasmagerinnungs-Assays zu haben, die verlängerte Gerinnungszeiten und gesteigerte Empfindlichkeit für späte Kontaktwegfaktoren, und insbesondere für die Faktoren VIII und IX aufweisen, zu haben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Untersuchung der Gerinnung in Plasma, und insbesondere die Verwendung eines spezifischen Inhibitors zur Minimierung der Blut- oder Plasma-Gerinnung in vitro, und zur Beseitigung von Quellen für Inkonsistenz und Fehler bei der Blutgerinnung bereit. Die Verfahren beinhalten Zugeben von Corn-Trypsin-Inhibitor (CTI) in einer Menge, die ausreicht um die Gerinnungsanalyse zu verstärken, zu Plasma. Die Verfahren haben mehrere wichtige Verwendungszwecke, z.B. die Erhöhung der Empfindlichkeit und der Reproduzierbarkeit von Plasmagerinnungs-Assays.
Bevorzugtes Blut ist Vollblut oder minimal verändertes Blut aus einem Säuger, und insbesondere von einem menschlichen Patienten. In einer Ausführungsform reduzieren die Verfahren eine Gerinnung in Blut oder Plasma deutlich oder eliminieren sie, wobei für eine verbesserte Gerinnungsanalyse gesorgt wird. Speziell bevorzugte Verfahren verwenden eine wirksame Menge an Corn-Trypsin-Inhibitor (CTI) um eine Gerinnung des Blutes oder des Plasmas zu inhibieren. Der CTI kann selbst als alleiniges Antikoagulans verwendet werden oder der CTI kann in Kombination mit einer ausreichenden Menge mindestens eines anderen Antikoagulans, wie es unten beschrieben wird, eingesetzt werden.
Wir haben insbesondere festgestellt, dass CTI verwendet werden kann um verbesserte und genauere Resultate bei der Gerinnungsanalyse, sowohl mit Vollblut als auch mit Blutprodukten, z.B. Plasma, bereitzustellen. Wenn CTI verwendet wird, so wird die Gerinnungszeit eines Blutproduktes wesentlich verlängert, indem eine ausreichende Menge an CTI zugesetzt wird um eine intrinsische (Kontakt-) Gerinnung zu reduzieren oder zu eliminieren. In einer Ausführungsform inhibiert CTI die Plasmagerinnungszeit, indem es eine deutliche Verringerung bei der Kontaktgerinnung erleichtert. Die Menge an zugesetztem CTI ist vorzugsweise ausreichend um die Plasmagerinnungszeit in recalcifiziertem Plasma über etwa 1.000 bis etwa 3.600 Sekunden oder länger im Vergleich zu einer geeigneten Kontrolle im selben Gerinnungs-Assay zu verlängern.
Bei Bezugnahme auf ein "Blutprodukt" oder einen ähnlichen Ausdruck, ist eine gereinigte Zusammensetzung gemeint, die sich vom Vollblut eines Säugers, und speziell eines menschlichen Patienten, ableitet, gemeint. Vorzugsweise wurde mindestens eine Blutkomponente (z.B. Blutzellen, Blutfaktoren oder mit Blut in Verbindung stehende Proteine) aus dem Vollblut entfernt. Besonderen Blutprodukten mangelt es an mindestens einem spezifischen Zelltyp, z.B. Erythrozyten, Leukozyten (Immunzellen) und Thrombozyten. Ein bevorzugtes Blut produkt ist Plasma, d.h., der flüssige Teil des Blutes. Ein besonderer Plasma-Typ wird als "Thrombozyten-armes" oder "Thrombozyten-defizientes" Plasma bezeichnet.
Die Mengen an CTI oder die spezifische Aktivität von CTI, die in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, variiert in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern, z.B. vorgesehene Verwendung und spezifischer entsprechend dem gewünschten Inhibierungsgrad. In den meisten Fällen allerdings wird die Menge oder die spezifische Aktivität des CTI ausreichend sein um die Gerinnungszeit eines gewünschten Blutproduktes etwa 100 bis 2.000 Sekunden oder länger, bis zu etwa 3.600 Sekunden, im Vergleich zu einer Kontrolle im selben Gerinnungs-Assay zu verlängern. In einer spezifischen Auführungsform wird die verwendete Menge an CTI ausreichend sein um die Plasmagerinnungszeit zu verlängern, und insbesondere die Gerinnungszeit in Thrombozyten-armem Plasma zu verlängern, wie es durch einen geeigneten Gerinnungs-Assay bestimmt wird.
Wir haben auch festgestellt, dass CTI den nützlichen Bereich bestimmter modifizierter Gerinnungs-Assays, z.B. der unten Beschriebenen, ausdehnt. Diese Ausdehnung ist wünschenswert um eine Reaktionsfähigkeit auf Blutgerinnungsfaktoren, und insbesondere die Faktoren VIII und IX, in bestimmten Assays sicherzustellen. Plasmagerinnungs-Assays, die die physiologische Gerinnungsreaktion nachahmen, werden durch Empfindlichkeit gegenüber Konzentrationen der Faktoren VIII oder IX im Bereich zwischen etwa 0 Einheiten/ml und etwa 1 Einheit/ml bis zu etwa 2 Einheiten/ml oder mehr verbessert werden.
Von Bedeutung ist auch die Feststellung, dass der CTI eine einheitlichere und reproduzierbarere Gerinnungsanalyse, speziell unter Verwendung von Plasma, bereitstellt. Die Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit der erfindungsgemäßen Verfahren machen diese speziell für eine Charakterisierung von Blutkrankheiten, die mit abnormalen Leveln dieser und anderer Gerinnungsfaktoren, einschließlich Prothrombin-Faktor V, Faktor VII, Faktor X und Faktor XI, in Verbindung stehen, einsetzbar.
Ohne eine Bindung an eine Theorie eingehen zu wollen, wird angenommen, dass CTI Gerinnungs-Assays verbessert, indem es die nachteilige Wirkung des Kontaktweges reduziert oder eliminiert, wobei dieser Effekt in Abhängigkeit von den Zusammensetzungen der Proben und der Natur der Oberflächen, mit denen diese Proben in Kontakt kommen, variieren kann. Von Bedeutung ist die Annahme, dass eine CTI-Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmte Gerinnungs-Assays für in vivo-Gerinnungsreaktionen repräsentativer macht.
Das Verfahren kann die Zugabe von Plasma, und insbesondere von Thrombozyten-defizientem Plasma, in ein Reaktionsgefäß, das eine geeignete Menge an CTI umfasst, beinhalten. Bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem der Reaktionsbehälter außerdem mindestens ein geeignetes Antikoagulans, z.B. gepufferte Calcium-chelatisierende Verbindung, umfasst. Der CTI und das Antikoagulans können in einer beliebigen geeigneten Form, z.B. einer vorbestimmten Menge eines flüssigen, Suspensions- oder lyophilisierten Materials, bereitgestellt werden. Spe zifischere Beispiele für Antikoagulantien, die zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung geeignet sind, werden unten angeführt.
Des Weiteren werden Verfahren zur Messung der Gerinnung in Plasma bereitgestellt. Nach einem Aspekt beihalten die Verfahren Zugeben einer geeigneten Menge an CTI zu einem geeigneten Gerinnungs-Assay um eine verlängerte Gerinnung zu erleichtern. Beispielsweise kann die Erfindung mit einem PT-Assay mit Proben eingesetzt werden, die von einem Patienten erhalten werden, welcher eine Antikoagulantien-Therapie erhält. In einer spezifischeren Ausführungsform kann der CTI in einem PT-Assay mit Thrombozyten-armem Plasma eingesetzt werden. Der CTI kann verwendet werden um eine Kontaktgerinnung in anderen Assays, z.B. der Verdünnungs-Thromboplastin-Assay oder spezifische Assays, die für Faktor VIII, IX oder XI empfindlich sind und die nachfolgend beschrieben werden, eingesetzt werden, zu verringern oder zu eliminieren.
In einer Ausführungsform umfassen die Verfahren Behandeln eines Blutproduktes mit mindestens einem Antikoagulans, z.B. ein Calcium-chelatisierendes Mittel oder ein Heparinoid, und danach Unterwerfen des Bluts Bedingungen, die zur Herstellung des Blutproduktes führen. In einer spezifischeren Ausführungsform ist das Blutprodukt Plasma und umfassen die Bedingungen herkömmliche Filtrations- oder Zentrifugationsschritte um unerwünschte Blutzellen im Blut zu reduzieren oder aus dem Blut zu eliminieren. In dieser Ausführungsform kommt das Plasma auch mit einer Menge an CTI in Kontakt, die ausreicht um eine Kontaktgerinnung zu inhibieren oder zu eliminieren. In Fällen, in denen das Antikoagulans ein Calcium-chelatisierendes Mittel ist, wird das Plasma vorzugsweise recalcifiziert. Das recalcifizierte Plasma kann dann in einem gewünschten Gerinnungs-Assay eingesetzt werden.
Wenn es gewünscht wird, kann das Verfahren durch Zugeben einer geeigneten Menge an CTI zum Blut vor oder nach Behandlung mit dem Antikoagulans (mit den Antikoagulantien) modifiziert werden.
Das Verfahren kann auch für neue Blutgerinnungs-Assays eingesetzt werden, die geeigneterweise zur Verwendung mit Vollblut oder minimal verändertem Blut angepasst sind. Die Assays haben ein weites Spektrum bedeutender Verwendungen, einschließlich eines Assays, der manchmal als "point-of-care"-Analyse bezeichnet wird. D.h., bevorzugte Blutgerinnungs-Assays sind mit einer Verwendung am Krankenbett, z.B. im Krankenhaus, bei einem ambulanten Patienten oder bei einer Heimanordnung, kompatibel. Dieses Merkmal der Erfindung erleichtert eine Blutgerinnungsanalyse in "Realzeit" wesentlich, wodurch die Patientenbehandlung verbessert wird und eine Beurteilung therapeutischer Mittel im Blut verstärkt wird. Bessere Blutgerinnungs-Assays sind für relevante Plasma- und Zellevents, die bei der Blutgerinnung involviert sind, einschließlich einer Behandlung mit pharmakologischen Mitteln, empfindlich. In bevorzugten Blutgerinnungs-Assays wird die Gerinnung durch geringe Konzentrationen an lipidiertem Gewebefaktor initiiert, während der Kontaktweg mit CTI unterdrückt ist. Der Assay detektiert die Aktivität einer weiten Vielzahl von Agentien, z.B. Antikoagulantien, und speziell antithrombotischen und/oder Antithrombozyten-Mitteln mit erhöhter Empfindlichkeit. Der Assay erleichtert auch eine Detektion von additiven und synergistischen Effekten der Kombinationen der Mittel. Zusätzliche Verwendungen und Vorzüge des point-of-care-Blutgerinnungs-Assays werden nachfolgend und in den Beispielen diskutiert.
Bereitgestellt wird auch ein Assay, der manchmal hier als Extended Plasma Prothrombin time (XpPT)-Assay bzw. Assay auf verlängerte Plasma-Prothrombin-Zeit genannt wird. In einer Ausführungsform kann der Assay geeigneterweise die Gerinnung in Plasma messen. Wie unten diskutiert wird, ist der Assay sehr flexibel und hat eine Reihe wichtiger Anwendungen, einschließlich als zweckdienliches Werkzeug zur Durchführung einer nahezu universellen Hämostase-Behandlung. Der Assay kann insbesondere eingesetzt werden um Gerinnungsreaktionen, die ein Hinweis für eine abnormale Blutung, z.B. solche, die mit kongenitalen Blutungsstörungen verbunden sind, zu überwachen und (wenn gewünscht) quantitativ zu bestimmen. Der Assay ist auch zur Überwachung der Wirkung der Antikoagulantien-Therapie nützlich. Von Bedeutung ist, dass der Assay gemäß I.S.I. titriert werden kann, was zu einem nahezu universellen äquivalenten Antikoagulans-Überwachungssystem führt, was üblicherweise von einer Thromboplastinquelle unabhängig ist. Dieser Vorteil der Erfindung reduziert oder eliminiert die Notwendigkeit, Blutkoagulationsreagentien "zu bevorraten", wodurch Analysen kosteneffektiver und leichter durchzuführen gemacht werden. Wie unten diskutiert wird, kann der Assay verwendet werden um "schwierig zu standardisierende" Reagentien, z.B. Thromboplastin, zu optimieren.
Die Verfahren können eine Behandlung von Vollblut mit einer geeigneten CTI-Menge und mindestens einem anderen Antikoagulans, vorzugsweise einem Calcium-chelatisierenden Mittel oder einem Heparinoid, umfassen. Das behandelte Vollblut wird dann Bedingungen, die zur Bildung des Blutproduktes führen, unterworfen. In einer Ausführungsform ist das Blutprodukt Plasma. Wenn das Antikoagulans eine Calcium-chelatisierende Verbindung, wie z.B. ein Citratsalz, ist, wird das Plasma recalcifiziert. Das recalcifizierte Plasma kann dann in einem geeigneten Gerinnungs-Assay eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung bietet signifikante Vorzüge. Beispielsweise können hierin beschriebene spezifische Verfahren einen geeigneten Gerinnungs-Assay, dem CTI zugesetzt wird, involvieren. In diesem Beispiel kann der Assay Gewebefaktor (TF) und speziell relipidierten TF bei stärker verdünnten Konzentrationen verwenden, als dies in früheren Gerinnungs-Assays, z.B. früheren PT- und Thromboplastin-Assays, der Fall war. Beispielsweise kann ein Plasmagerinnungs-Assay, der gemäß der Erfindung durchgeführt wird, eine extrinsische Gerinnung mit etwa 1 nM oder weniger TF initiieren. Wie bereits oben diskutiert wurde, maskiert eine Kontaktgerinnung oft physiologisch relevante Gerinnungsreaktionen. Somit stellt die Erfindung Verfahren zur Untersuchung einer Gerinnung bereit, die einer in vivo-Gerinnung viel näher kommen. Der Zusatz von CTI zu dem Assay macht spezifische Assays von hohen TF-Konzentrationen weniger abhängig und damit für eine in vivo-Gerinnung repräsentativer.
Die Erfindung bietet weitere Vorzüge. Beispielsweise stellt die Erfindung Empfindlichkeit gegenüber Faktor XI bei niedrigen TF-Konzentrationen, z.B. unter etwa 25 pM, bereit. Somit erlauben die Verfahren eine wirksame Überwachung von Gerinnungsfaktoren, deren Analyse bisher schwierig zu erreichen war.
Von Bedeutung ist, dass die Erfindung wirksame und reproduzierbare Mittel zur Untersuchung der Gerinnung bei Patienten, die eine Antikoagulantien-Therapie erhalten, bereitstellt. Der Zusatz von CTI zu einem Gerinnungs-Assay gemäß der Erfindung liefert z.B. eine größere Einheitlichkeit bei den INR-Wert-Bestimmungen. Die frühere Praxis hat es schwierig gemacht, genaue INR-Werte für Patienten zu erhalten, die Antikoagulantien, z.B. Coumadin, einnehmen. Die vorliegende Erfindung erlaubt eine stärkere Gleichmäßigkeit, indem sie lineare Beziehungen einfacher erhältlich macht, z.B. zwischen Gerinnungszeiten und INR-Werten.
Die Erfindung stellt noch weitere Vorteile bereit. Beispielsweise können die hierin beschriebenen Verfahren Citratplasma verwenden um Calcium zu entfernen. Ein Zusatz von CTI zu dem recalcifizierten Plasma verstärkt eine Verwendung dieses Plasmas, indem eine Störung durch Kontaktaktivierung reduziert oder eliminiert wird. Somit verstärkt die Durchführung der Erfindung die Initiierung der Gerinnung eher durch TF als durch Calcium. Im Gegensatz dazu hat die frühere Praxis im Allgemeinen eine Initiierung der Gerinnung durch Calciumzusatz vorgeschrieben. Demnach vereinfacht die vorliegende Erfindung den Einsatz von Gerinnungs-Assays, und speziell der Assays mit verdünntem TF, durch Verbesserung der Probenhandhabung.
Diese und verwandte Vorzüge der Erfindung verbessern die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren in einer Vielzahl von Fällen, z.B. in Verbindung mit kommerziellen, medizinischen, klinischen, Krankenhaus- oder Forschungsanwendungen.
Wie oben betont wurde, ist die vorliegende Erfindung flexibel und kann so angepasst werden, dass sie für eine vorgesehene Verwendung geeignet ist. Die erfindungsgemäßen Verfahren können z.B. modifiziert werden, wenn es gewünscht ist, Thrombozyten-armes Plasma mit Kontaktweg-Inhibitoren zu kombinieren, wodurch eine vorherige Recalcifizierung des Plasmas ermöglicht wird, während Gelegenheiten für eine falsche Kontakt-aktivierte Gerinnung vermieden werden.
Man kann eine wirksame und reproduzierbare Inhibierung der Kontaktgerinnung in einem Blutprodukt erreichen, das gefroren ist oder das mehreren Gefrier-Tau-Zyklen unterworfen wurde. So kann man eine effizientere Behandlung und Verwendung von gefrorenen oder vorher gefrorenen Blutprodukten, und insbesondere Plasma, z.B. Thrombozyten-defizientem Plasma, erreichen.
Weitere Aspekte und Vorteile der Erfindung werden unten diskutiert.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Diagramm, das den TF-Weg-Assay gegen I.N.R. aus PT in Plasma von Patienten zeigt, die eine Coumadin-Behandlung erhalten. Recalcifiziertes Plasma enthält 0,10 mg/ml CTI.
2A-D sind Diagramme, die die Gerinnung von normalem Blut und Hämophilie A-Blut mit und ohne Ersatz zeigen.
3 ist ein Diagramm, das die Gerinnung in Faktor XI-defizientem Plasma als eine Funktion von TF und Faktor XI zeigt.
4A-C sind Diagramme, die die Gerinnung von normalem Blut und Hämophilie C-Blut mit 25 pmol/l Initiator mit und ohne Ersatz zeigen.
5A und 5B sind Diagramme, die die Faktor Va-Bildung während der Gerinnung in normalem Blut und in Hämophilie C-Blut mit 25 pmol/l Initiator mit und ohne Ersatz zeigen.
6A-C sind Diagramme, die die Gerinnung in normalem und in Hämophilie C-Blut mit 5 pmol/l Initiator mit und ohne Ersatz zeigen.
7A und B sind Diagramme, die die Faktor Va-Bildung während der Gerinnung in normalem Blut und in Hämophilie C-Blut mit 5 pmol/l Initiator mit und ohne Ersatz zeigen.
8 ist ein Diagramm, das die Citratplasma-Gerinnungszeit nach Recalcifizierung in Gegenwart von Corn-Trypsin-Inhibitor (CTI) und Anti-Faktor XI-Antikörper zeigt.
9 ist ein Diagramm, das Gewebefaktor (TF), Phosphatidylcholin/Phosphatidylserin (PCPS)-Vesikel mit Calcium zeigt.
10 ist ein Diagramm, das eine Phospholipid-Titration des Assay auf verlängerte Plasma-Prothrombin-Zeit (XpPT) zeigt.
11 ist ein Diagramm, das eine Datensammlung unter Verwendung von normalem Plasma von Freiwilligen, erhalten über einen acht (8)-monatigen Zeitraum, zeigt.
12 ist ein Diagramm, das Assayzeiten für die ausgedehnte Plasma-Prothrombin-Zeit (XpPT) aus Proben zeigt, die von Plasmaspendern erhalten wurden.
13 ist eine Tabelle, die die Standardisierung des Assays der ausgedehnten Plasma-Prothrombin-Zeit (XpPT) mit Gewebefaktor (TF) zeigt.
14 ist eine Tabelle, die Messungen der Gerinnungszeit im Assay auf ausgedehnte Plasma-Prothrombin-Zeit (XpPT) für defizientes Plasma, gemessen mit Gewebefaktor (TF), zeigt.
15 ist ein Diagramm, das eine Analyse des Assays auf ausgedehnte Plasma-Prothrombin-Zeit (XpPT) mit Gewebefaktor (TF) für Personen in einer Warfin-Therapie zeigt.
16 ist ein Diagramm, das einen Vergleich der Gerinnungszeiten des Assays auf ausgedehnte Plasma-Prothrombin-Zeit (XpPT) für verschiedene INR-Plasmen, aktiviert mit Thromboplastinen aus verschiedenen standardisierten Quellen, zeigt.
17 ist ein Diagramm, das den Effekt von Corn-Trypsin-Inhibitor (CTI) auf die Plasmagerinnungszeit zeigt.
18 ist ein Diagamm, das die Wirkung von lipidiertem Gewebefaktor auf die Gerinnungszeit zeigt.
19 ist eine Tabelle, die Gewebefaktor-initiierte Plasmagerinnungszeiten (Sekunden) bei humanen Patienten zeigt.
20A und 20B sind Diagramme, die die Wirkung von Hirudin auf die Gerinnungszeit zeigen. Dargestellt sind Hemochron-detektierte Gerinnung (20A) und aPTT-detektierte Gerinnung (20B).
21A und 21B sind Diagramme, die die Wirkung von Zecken-Antikoagulanspeptid (rTAP) auf die Gerinnungszeit zeigen. Gezeigt sind eine Hemochron-detektierte Gerinnung (21A) und eine aPTT-detektierte Gerinnung (21B).
22A und 22B sind Diagramme, die die Wirkung von Heparin auf die Gerinnungszeit zeigen. Dargestellt sind Hemochron-detektierte Gerinnung (22A) und aPTT-detektierte Gerinnung (22B).
23A und 23B sind Diagramme, die die Wirkung von Enoxaparin auf die Gerinnungszeit zeigen. Dargestellt sind eine Hemochron-detektierte Gerinnung (23A) und eine aPTT-detektierte Gerinnung (23B).
24A und 24B sind Diagramme, die die Wirkung einer Kombination aus Heparin und abciximab (ein im Handel verfügbarer monokonaler Antikörper gegen Thrombozytenglykoprotein gpII_b-III_a) auf die Gerinnungszeit zeigen. Dargestellt sind eine Hemochron-detektierte Gerinnung (24A) und eine aPTT-detektierte Gerinnung (24B).
25A und 25B sind Diagramme, die die Wirkung einer Kombination von Enoxaparin und abciximab auf die Gerinnungszeit zeigen. Dargestellt sind eine Hemochrondetektierte Gerinnung (25A) und eine aPTT-detektierte Gerinnung (25B).
26 ist ein Diagramm, das die Gewebefaktor-initiierte Gerinnung in Vollblut zeigt.
27 ist ein Diagramm, das die Thrombinbildung während der Vollblutkoagulation mit variierender Thrombozytenzahl zeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie oben diskutiert wurde, stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Untersuchung der Gerinnung in Plasma, und insbesondere die Verwendung eines Inhibitors zur Minimierung der Blut- oder Plasma-Gerinnung in vitro und zur Ausschaltung von Quellen für Inkonsistenz und Fehler bei der Blutgerinnung bereit. Ausführungsformen der Verfahren, die hierin beschrieben werden, ermöglichen eine signifikante Verringerung oder Eliminierung einer intrinsischen Gerinnung bestimmter Blutprodukte, z.B. Plasma, und insbesondere Thrombozytenarmes Plasma. In besonderen Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Verfahren durch eine geeignete Menge an Corn-Trypsin-Inhibitor (CTI) gekennzeichnet um die Plasmagerinnung in geeigneten Gerinnungs-Assays, wie z.B. den unten spezifisch beschriebenen, zu verlän gern. Eine Durchführung der vorliegenden Erfindung macht viele frühere Gerinnungs-Assays, und speziell solche, die Plasma verwenden, für eine in vivo-Gerinnung repräsentativer, z.B. indem die Reaktion auf Gerinnungsfaktoren VIII und IX erhöht wird und die Abhängigkeit von hohen Konzentrationen an TF verringert oder eliminiert wird.
Das Verfahren kann zur Verbesserung der Gerinnungsanalyse von Vollblut oder minimal verändertem Blut, wie auch von Blutprodukten, z.B. Plasma, verwendet werden.
Die Verfahren umfassen ein Inkontaktbringen des Blutes oder des Plasmas mit einer Menge an CTI, die ausreichend ist um eine Gerinnung über einen gewünschten Zeitraum zu verringern oder zu inhibieren. Der CTI kann allein eingesetzt werden oder kann bei Bedarf in Kombination mit einer ausreichenden Menge mindestens eines anderen natürlich auftretenden oder synthetischen Antikoagulans, z.B. Blutfaktor-Antikörper, verwendet werden um die Gerinnung weiter zu verringern oder zu eliminieren. Die Verfahren sind flexibel und können zur Eignung für eine vorgesehene Verwendung maßgeschneidert werden. Bevorzugte Mengen an CTI zur Verwendung in diesen und anderen Verfahren der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend angeführt.
Die vorliegende Erfindung wendet sich einem Bedarf für Gerinnungs-Assays, und insbesondere Plasmagerinnungs-Assays, die einer in vivo-Gerinnung näher kommen, zu. Wie diskutiert wurde, erlaubt die Verwendung von CTI gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren eine direkte Gerinnungsdetektion, während Störungen durch Kontaktgerinnung minimiert oder eliminiert werden. Ein Zusatz von CTI zu einem Plasmagerinnungs-Assay ermöglicht auch eine Gerinnungsinitiierung mit einer geringeren TF-Konzentration als dies unter Verwendung früherer Gerinnungs-Assays möglich war. Es wird angenommen, dass bei den niedrigeren TF-Leveln, die mit der vorliegenden Erfindung erreichbar sind, die Assays für den klassischen extrinsischen Weg und die späteren Glieder des Kontaktwegs (insbesondere die Faktoren VIII und IX, wie in Hämophilie A und B) empfindlicher sind. Die Verwendung der Erfindung kann die Effekte des frühen Kontaktwegs (insbesondere Aktivierung von Prekallikrein und Faktor XII) in signifikanter Weise minimieren oder ausschließen. Siehe z.B. Rapaport, S.I, und Rao L.V.M. (1995) Thromb Haemost, 74:7.
Zusätzlich erleichtert die Erfindung die Verwendung von Gerinnungs-Assays durch Bereitstellung einer erhöhten Assay-Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit.
Die hierin beschriebenen Plasmagerinnungs-Assays bieten gegenüber Assays des Standes der Technik deutliche Verbesserungen. Viele Plasmagerinnungs-Assays des Standes der Technik verwenden z.B. TF-Level von zwischen etwa 5 nM TF oder größer und detektieren üblicherweise keine Abnormalitäten beim Faktor VIII oder IX. Obgleich einige frühere Assays etwas geringere TF-Level verwenden, werden solche früheren Assays durch falsche Aktivierung des frühen Kontaktweges nachteilig beeinflusst. Dagegen können die erfindungsgemäßen Verfahren mit außergewöhnlich verdünnten TF-Konzentrationen, d.h. im Bereich von 1 nM oder weniger, und insbesondere zwischen etwa 1 pM und etwa 1 nM, verwendet werden. Dar über hinaus sind die erfindungsgemäßen Verfahren gegenüber Gerinnungsfaktoren, z.B. den Faktoren VIII und IX, äußerst empfindlich. Somit kann die Verwendung von CTI gemäß der Erfindung einen weiten Bereich von Gerinnungszeiten bei niedrigen TF-Konzentrationen bereitstellen, während eine Störung durch einige Glieder des frühen Kontaktwegs (z.B. Kallikrein oder Faktor XIIa) minimiert oder ausgeschlossen wird. Darüber hinaus können geringe TF-Level, die durch die Verwendung der Erfindung erreicht werden können, eine wünschenswertere Gerinnungsgeschwindigkeit (d.h. langsamer) als die meisten früheren Assays liefern, wodurch eine genauere und reproduzierbare Analyse der Gerinnung ermöglicht wird.
Die Durchführung der vorliegenden Erfindung involviert im Allgemeinen Standardmethoden zur Herstellung, Untersuchung und Manipulierung von Blutprodukten. Spezifischere Techniken zum Erhalt von Blut, zur Herstellung von Plasma, und insbesondere von Thrombozyten-defizientem Plasma und zur Lagerung von Blut oder Blutprodukten bei niedriger Tempratur, wurden offenbart. Siehe z.B. Williams Hematology, infra, Kapitel 151, 153, L33 und L53.
Mit den Ausdrücken "Thrombozyten-defizient" oder "Thrombozyten-arm" ist gemeint, dass das Plasma vernachlässigbare Konzentrationen an Thrombozyten enthält, wie sie durch Standardverfahren bestimmt werden, z.B. elektrisches Impedanzverfahren oder andere automatisierte Verfahren. Siehe z.B. M.W. Morris et al. in Williams Hematology, infra, Kapitel L1.
Der hierin verwendete Hinweis auf eine geeignete Menge an CTI oder ein verwandter Ausdruck bedeutet eine Menge an CTI, die ausreichend ist um eine Kontaktgerinnung in einem gewünschten Gerinnungs-Assay zu inhibieren oder zu eliminieren. Besondere Mengen an CTI, die verwendet werden, werden durch anerkannte Parameter, z.B. das benötigte Ausmaß der Gerinnungs-Inhibierung, bestimmt.
Mit dem Ausdruck "Gerinnungs-Assay" oder einem verwandten Ausdruck ist ein Assay mit dem Kennzeichen einer TF-abhängigen Gerinnung gemeint, z.B. die unten beschriebenen Assays auf PT, verdünntes Thromboplastin, aPTT oder spezifischen Faktor VIII, IX oder XI. Der Gerinnungs-Assay wird typischerweise eine geeignete Menge an CTI enthalten, die ausreichend ist um eine Kontaktgerinnung zu inhibieren oder zu eliminieren. Bevorzugt sind Gerinnungs-Assays, bei denen eine optimale Gerinnung bei verdünnten TF-Konzentrationen beobachtet wird, z.B. bei solchen unter etwa 1 nM.
Wie oben diskutiert wurde, ist die vorliegende Erfindung zur Verwendung mit Vollblut oder Blutprodukten, z.B. Plasma, gut geeignet. Besondere Plasma-Typen, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, umfassen "Standard"-Plasma, das typischerweise Thrombozyten und Thrombozyten-defizientes Plasma umfasst. Allgemeine Verfahren zur Herstellung von Plasma, und insbesondere Thrombozyten-defizientem Plasma, werden unten beschrieben.
Zur Verwendung mit der Erfindung sind andere Plasma-Typen geeignet. Die Erfindung kann z.B. verwendet werden um die Gerinnungszeiten in einem geeigneten Gerinnungs-Assay unter Verwendung von fraktioniertem Plasma, d.h., in dem mindestens ein Plasmaprotein ent fernt wurde (beispielsweise ein Blutgerinnungsfaktor), zu verlängern. Verfahren zur Fraktionierung von Plasma sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen herkömmliche immunologische Techniken, z.B. Affinitätschromatographie. Zusätzlich können die hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden um Gerinnungszeiten mit "rekonstituiertem" Plasma, bei dem mindestens ein vorbestimmter Plasmafaktor dem Plasma zugesetzt worden war, z.B. Standard-Plasma oder Thrombozyten-armes Plasma, zu verlängern. Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Plasma, z.B. Thrombozyten-armes, rekonstituiertes und ergänztes Plasma, sind auf dem Fachgebiet bekannt und wurden diskutiert. Siehe z.B. Williams Hematology, infra, Kapitel L53.
Eine bevorzugte Verwendung der Erfindung involviert einen Plasmagerinnungs-Assay, und inbesondere einen Assay unter Verwendung eines Plasmas, das von einem Säuger erhalten wird. Besondere Säuger von Interesse umfassen Primaten, und speziell Menschen, z.B. Patienten. In einer Ausführungsform wird das Plasma von einem Patienten isoliert, der eine Blutgerinnungsstörung hat oder von dem angenommen wird, dass er eine Blutgerinnungsstörung hat, z.B. eine hämostatische oder thrombotische Abnormalität, Gerinnungs-Inhibitor-Mangel oder ein disseminiertes intravaskuläres Krankheitsbild hat. Der Patient wird insbesondere eine Defiziens bei mindestens einem Blutgerinnungsfaktor, z.B. Faktor VIII, IX (oder beiden), haben, z.B. Hämophilie Typ a, b oder c, oder es wird erwartet, dass der Patient eine derartige Defiziens hat. Siehe z.B. Williams Hematology, infra, Tabelle 126-1 in Kapitel 126.
Weitere Patientenproben liegen im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Z.B. kann Plasma von einem Patienten erhalten werden, der einen Zustand aufweist, welcher einer Anfälligkeit für Thrombose anzeigt, z.B. Faktor V^leiden, Protein C-Defiziens oder Anti-Thrombin III-Defiziens, oder von einem Patienten, bei dem dieser Zustand erwartet wird, erhalten werden.
In einer anderen Ausführungsform können Patienten, von denen eine Plasmaprobe erhalten wird, nicht immer mit einer Historie einer hämostatischen oder thrombotischen Abnormalität in Verbindung gebracht werden. In einer spezifischen Ausführungsform kann das Plasma z.B. von einem Patienten bereitgestellt werden, der ein invasives chirurgisches Verfahren durchmacht, durchgemacht hat oder dem dieses bevorsteht. Spezifischer ausgerdrückt, das invasive chirurgische Verfahren besteht für den Patienten in der Insertion einer Nadel, eines Stents oder einer verwandten Vorrichtung um Blut zu erhalten. Das invasive chirurgische Verfahren kann beispielsweise durchgeführt werden um die Gerinnungskapazität von Patientenblut zu bestimmen. Beispielsweise kann der Patient ein Heparinoid, z.B. Heparin; Warfin, Coumadin, oder ein verwandtes Antikoagulans erhalten oder soll dieses erhalten, beispielsweise als Prophylaktikum um ein in vivo-Auftreten einer Gerinnung zu verhindern oder zu verringern. Von Bedeutung ist, dass die vorliegende Erfindung für eine effiziente und reproduzierbare Untersuchung der Koagulation bzw. Gerinnung von Plasma, das von diesen Patienten erhalten wird, sorgt.
Ein bevorzugtes thrombotisches oder disseminiertes intravaskuläres Krankheitsbild kann mit einer Defiziens oder Abnormalität bei einem Gerinnungsregulator oder einer erworbenen Defiziens oder Abnormalität, z.B. erworbenen Autoantikörpern gegen Protein C oder S, verbunden sein.
Wie oben diskutiert wurde, ist es möglich, die Gerinnung von Plasma, und insbesondere von Thrombozyten-defizientem Plasma zu verlängern, indem eine geeignete Menge an CTI zugesetzt wird. Ebenfalls diskutiert wurde, dass die Menge an CTI ausreichend ist um eine Kontaktgerinnung im Assay zu reduzieren oder zu eliminieren. Vorzugsweise reicht die Menge an zugesetztem CTI aus um die Plasmagerinnungszeit etwa 10 bis etwa 3.600 Sekunden länger als die einer geeigneten Kontrolle, inbesondere etwa 50 bis etwa 1.500 Sekunden, und speziell etwa 150 bis etwa 1.050 Sekunden, länger als die der Kontrolle zu inhibieren. Zusätzlich bevorzugt sind Mengen an CTI, die Gerinnungszeiten mit einem International Normalized Ratio (INR) zwischen etwa 1 und etwa 6,5, insbesondere etwa 1 und etwa 3,5, bereitzustellen, wobei etwa 3,5 bis etwa 6,5 oder größer für Proben typisch sind, die von Patienten erhalten werden, welche eine Antikoagulantien-Therapie erhalten. Weiter bevorzugt sind Mengen an CTI, die eine Empfindlichkeit für Mengen an Faktor VIII oder IX im Bereich zwischen etwa Einheiten/ml und etwa 1 Einheit/ml bereitstellen. Bevorzugtere Definitionen für Einheiten der Faktor VIII- und IX-Einheiten können in Williams Hematology, infra, Kapitel L37, gefunden werden.
Mit dem Ausdruck "normal", wie er hier für Gesamtblut oder ein Blutprodukt, z.B. Plasma, verwendet wird, ist ein Material von einem gesunden Donor gemeint, wie der Ausdruck auch auf dem Fachgebiet verstanden wird.
Es ist bekannt, dass viele gesunde Donoren Faktor VIII- und IX-Level im Bereich von etwa weniger als 1 nM (Faktor VIII) und 100 nM (Faktor IX) haben. Von bestimmten normalen Donoren wurde berichtet, dass sie Faktor VIII- und Faktor IX-Level von etwa 0,7 nM bzw. 90 nM haben. Ein hierin genanntes besonderes Verfahren der Erfindung, das für Faktor VIII oder IX empfindlich ist, bedeutet, dass das Verfahren bei den spezifizierten Bereichen auf die Faktoren anspricht. Siehe dazu die folgenden Beispiele 1-4.
Zur Verwendung mit den erfindungsgemäßen Verfahren sind eine Vielzahl von Kontrollen geeignet. Beispielsweise kann die Kontrolle in Ausführungsformen, in denen die Plasmagerinnung gemessen wird, im Wesentlichen dieselbe Plasmaprobe sein, wie sie im (experimentellen) Verfahren verwendet wird, außer dass die Kontrolle üblicherweise kein zugesetztes CTI enthalten wird. Die Erhöhung der Gerinnungszeit, die durch Zusatz des CTI zu der experimentellen Plasmaprobe erleichtert wird, kann in einfacher Weise beobachtet werden, indem eine Gerinnung zwischen den experimentellen Proben und Kontrollproben detektiert und dann verglichen wird. In einigen spezifischen Fällen wird die Kontrolle Vollblut oder ein Blutprodukt, z.B. Plasma, sein, das von einem gesunden Donor erhalten wurde.
Verfahren zum Detektieren einer Gerinnung sind auf dem Fachgebiet bekannt und können z.B. durch Untersuchung von Reaktionsgefäßen, die einen gewünschten Gerinnungs-Assay umfassen, durchgeführt werden. Wie angegeben wurde, involviert eine bevorzugte Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren eine Verlängerung von Plasmagerinnungszeiten in einem geeigneten Gerinnungs-Assay. Spezifische Verfahren zur Durchführung von Gerinnungs-Assays, z.B. die PT- und aPTT-Assays, können in den folgenden Beispielen gefunden werden. Siehe auch Williams Hematology, infra, Kapitel L33.
Wie oben angegeben wurde, werden die Mengen und die spezifische Aktivität des in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten CTI manchmal variieren. In den meisten Fällen wird allerdings die Menge oder die spezifische Aktivität des CTI ausreichend sein um die Plasmagerinnungszeit zwischen etwa 10 Sekunden bis etwa 3.600 Sekunden oder mehr zu verlängern, wenn man Vergleiche mit einer geeigneten Kontrolle durchführt. In Ausführungsformen, in denen der PT- oder ein anderer geeigneter Gerinnungs-Assay verwendet wird, ist der CTI vorzugsweise fähig, eine Kontaktgerinnung zu reduzieren oder zu eliminieren und die Gerinnungszeit etwa 100 bis etwa 1.050 Sekunden zu verlängern, was für die meisten Anwendungen im Allgemeinen bevorzugt ist. Siehe die folgenden Beispiele 1-3.
Wie diskutiert wurde, können die erfindungsgemäßen Verfahren in einem weiten Spektrum von TF-abhängigen Gerinnungs-Assays, z.B. der PT-Assay oder ein anderer geeigneter Gerinnungs-Assay, durchgeführt werden. In spezifischen Ausführungsformen der Erfindung, in denen der PT-Assay oder ein anderer geeigneter Gerinnungs-Assay verwendet wird, werden die Mengen an TF, die verwendet werden um eine Gerinnung zu initiieren, und die Calciummengen, die verwendet werden um Plasma zu recalcifizieren, in Abhängigkeit von der angestrebten Verwendung variieren. In vielen Fällen wird die Menge an zugesetztem TF etwa 1 nM (TF) oder weniger, und zwischen etwa 2 und etwa 30 nM Calcium, das als geeignetes Salz, und insbesondere als Calciumchlorid, zugesetzt wird, sein. Spezifisch bevorzugte Gerinnungs-Assays werden in den später folgenden Beispielen beschrieben.
In einer Ausführungsform involvieren die Verfahren Zugeben von Plasma, und insbesondere von Thrombozyten-defizientem Plasma, in Reaktionsgefäße (z.B. Kunststoffgefäße oder Gefäße eines anderen geeigneten Typs, z.B. silanisierte Glasröhrchen), die zur Durchführung der Assays verwendet werden. In dieser Ausführungsform werden die Reaktionsgefäße typischerweise eine vorbestimmte Menge an CTI und gegebenenfalls mindestens ein zusätzliches Antikoagulans, z.B. ein Heparinoid (d.h.. Heparin oder eine Heparin-verwandte Verbindung) oder eine gepufferte Calcium-chelatisierende Verbindung, z.B. Citratsalz, Calciumchlorid; Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether) (EGTA), saure Citratdextrose und Citratphosphatdextrose, umfassen. Andere anerkannte Antikoagulantien können bei Bedarf verwendet werden. In einer spezifischen Ausführungsform werden zwischen etwa 0,05 und etwa 0,5 mg/ml CTI und zwischen etwa 0,1 und 0,4% (G/V) gepuffertes Citrat verwendet. Siehe die Beispiele unten.
Verfahren zur Recalcifizierung von Vollblut oder Blutprodukten, z.B. Plasma, und insbesondere Thrombozyten-defizientes Plasma, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Im Allgemei nen beinhaltet eine Recalcifizierung das Zugeben wenigstens eines molaren Überschusses eines gewünschten Calciumsalzes (vorzugsweise gepuffert), bezogen auf das zugesetztes Calcium-chelatisierende Mittel. Typischerweise wird eine Menge eines gewünschten Calciumsalzes, z.B. Calciumchlorid, zugegeben um etwa 2 bis etwa 30 nM Calcium, und vorzugsweise etwa 5 bis etwa 20 nM Calcium, bereitzustellen. Typischerweise ist die Zugabe einer geeigneten Menge an Calciumchlorid oder eines anderen akzeptablen Calciumsalzes bevorzugt. Spezifische Verfahren zur Recalcifizierung von Plasma werden in den folgenden Beispielen bereitgestellt.
Bevorzugte Mengen an CTI zur Verringerung oder Eliminierung einer Kontaktgerinnung in einem Vollblut oder einem bevorzugt Blutprodukt, z.B. Plasma, und insbesondere Thrombozyten-defizientes Plasma, liegen zwischen etwa 50 μg und etwa 200 μg oder mehr, bis zu etwa 500 μg CTI/ml Vollblut oder Blutprodukt, wobei Mengen zwischen etwa 80 und etwa 100 μg/ml im Allgemeinen bevorzugt sind. In den meisten Fällen wird das Plasma mit einer geeigneten Menge eines Calciumsalzes, z.B. Calciumchlorid, recalcifiziert werden. Mit dem Ausdruck "Anti-Koagulations-Effektiv" ist eine Menge des Calcium-chelatisierenden Mittels gemeint, die ausreichend ist um endogenes Calcium zu binden, so dass eine Gerinnung inhibiert und vorzugsweise eliminiert wird. Spezifische Verfahren zur Herstellung von CTI zur Verwendung mit der Erfindung werden weiter unten detaillierter beschrieben.
Bevorzugte Mengen an CTI zur Verringerung oder Eliminierung einer Kontaktgerinnung in einem Vollblut oder einem bevorzugten Blutprodukt, z.B. Plasma, und insbesondere Thrombozyten-defizientes Plasma, liegen zwischen etwa 50 μg und etwa 200 μg oder darüber, bis zu etwa 200 μg CTI/ml Vollblut oder Blutprodukt, wobei eine Menge zwischen etwa 80 und etwa 100 μg/ml im Allgemeinen bevorzugt ist. In den meisten Fällen wird das Plasma mit einer geeigneten Menge eines Calciumsalzes, z.B. Calciumchlorid, recalcifiziert. Mit dem Ausdruck "Anti-Koagulations-Effektiv" bzw. "gegen Gerinnung effektiv bzw. wirksam" ist eine Menge des Calcium-chelatisierenden Mittels gemeint, die ausreicht um endogenes Calcium zu binden, so dass eine Gerinnung inhibiert und vorzugsweise eliminiert wird. Spezifische Verfahren zur Herstellung von CTI zur Verwendung in der Erfindung werden später noch detaillierter beschrieben.
Wie diskutiert wurde, verwenden bevorzugte Assays zur Messung von Plasmagerinnungszeiten, und insbesondere von Gerinnungszeiten eines Thrombozyten-defizienten Plasmas, geeignete Gerinnungs-Assays, z.B. die, die in den Beispielen beschrieben werden. Bevorzugt sind Gerinnungs-Assays, die bei Verdünnungs-TF-Konzentrationen durchgeführt werden, bei denen eine Menge an relipidiertem TF zugesetzt wurde um eine extrinsische Gerinnung zu initiieren. Die Menge an TF wird in Abhängigkeit von der angestrebten Verwendung und dem Ausmaß und der Schnelligkeit der Gerinnung, die gewünscht sind, abhängen, wird aber im Allgemeinen im Bereich von zwischen etwa 0,005 und 5 nM TF, und vorzugsweise zwischen etwa 0,01 und etwa 2 nM TF, und bevorzugter zwischen etwa 0,05 und 1 nM TF, liegen. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung sind zusätzliche bevorzugte Assays solche, die das Zugeben eines etwa 500- bis etwa 2.000-fachen molaren Überschusses an Phosphotidylserin (25 Mol-%) und Phosphatidylcholin (75 Mol-%) (PSPC von Sigma, St. Louis, MO), verglichen mit der zugegebenen Menge an verwendetem TF, in einem geeigneten Puffer umfassen. Ein besonders bevorzugter Puffer ist HEPES-Puffer, der unten beschrieben wird. Andere, eine Gerinnung zulassende Lipide können verwendet werden, z.B. PSPC, das 0 bis etwa 50 Mol-% PS und etwa 50 bis etwa 100 Mol-% PC enthält. Außerdem kann Phosphotidylglycerin für das PS eingesetzt werden, wenn dies gewünscht wird. Bevorzugte Verfahren zur Herstellung des TF werden nachfolgend noch beschrieben. Bezüglich besonders bevorzugter Verfahren zur Herstellung von TF siehe Beispiel 9.
Wie diskutiert wurde, kann das erfindungsgemäße Verfahren im Format eines "point-of-care"-Blutgerinnungs-Assays verwendet werden, der ein weites Spektrum an bedeutenden Verwendungen hat. Der Assay involviert ein Sammeln von Vollblut von einem Säuger, und speziell einem menschlichen Patienten, und Inhibierung der Gerinnung in gesammeltem Blut durch Zusetzen einer CTI-Menge, die ausreicht um die Gerinnung zu inhibieren. Eine Gerinnung wird vorzugsweise mit relipidiertem Gewebefaktor initiiert und mit einer Standard-Durchführung oder einer Kombination von Standrad-Durchführungen, die ein Hemochron ACT-Gerät, das in den Beispielen beschrieben wird, umfassen, detektiert. Alternativ kann das Vollblut vor, während oder nach Zugabe des CTI minimal verändert werden. Das gesammelte Blut oder das minimal veränderte Blut, das mit CTI behandelt ist, wird vorzugsweise als Material für den "point-of-care"-Blutgerinnungs-Assay eingesetzt. Wie oben diskutiert wurde, kann das CTI-behandelte Blut z.B. zur Überwachung der pharmakologischen Konzentrationen eines Agenses im Blut, z.B. eines Antikoagulanses, z.B. eines antithrombotischen Mittels und/oder eines Mittels zur Hemmung der Thrombozytenaggregation, eingesetzt werden. Eine Verwendung des CTI gemäß der vorliegenden Erfindung sorgt für eine bequemere Analyse über einen längeren Zeitraum der Verarbeitbarkeit. Wie vorher diskutiert wurde, kann dieser Zeitraum viele 100 Sekunden sein, wodurch eine Gerinnungsanalyse erleichtert wird, und insbesondere die Probenhandhabung verbessert wird und Fehler verringert werden. Typische Agentien sind spezifische Antikoagulantien, die in den Beispielen beschrieben werden, z.B. Heparin, Zecken-Antikoagulans-Peptid, Enoxaprin und monoklonale Antikörper gegen Faktor XI, als "abciximab" bezeichnet. Siehe Beispiele 16-19.
Der "point-of-care"-Blutgerinnungs-Assay liefert zusätzliche Vorteile. Beispielsweise verstärkt eine bevorzugte Verwendung des Assays eine Überwachung bei antithrombotischen Arzneimitteln alleine und in Kombination mit Thrombozytenaggregations-Hemmungsmitteln, z.b. Glykoprotein IIb-IIIa-Inhibitoren. Eine Titration von antithrombotischen pharmakologischen Mitteln, sowohl einzeln als auch in Kombination, wird die Durchführung von Therapien, z.B. solchen, die eine Thrombose verhindern und/oder eine Hämostase aufrechterhalten, die ausreicht um Blutungskomplikationen zu begrenzen, erleichtern.
Außerdem kann die Verwendung der hierin bereitgestellten Blutgerinnungs-Assays helfen, additive oder synergistische Effekte herkömmlicher oder experimenteller Antikoagulantien-Therapien zu überwachen und zu quantifizieren (zu definieren). Eine bevorzugte Verwendung der Assays wird auch die Identifizierung optimaler Dosierungspläne für therapeutische Mittel unterstützen und bei der Überwachung möglicher synergistischer Wirkungen oder Nebenwirkungen helfen.
Die Verwendung des "point-of-care"-Blutgerinnungs-Assays ist unkompliziert und sollte eine minimale Investition an Zeit oder anderen Resourcen involvieren. Die Röhrchen können im voraus präpariert werden und nach Zusatz des lipidierten Gewebefaktors gelagert werden. In bevorzugten Ausführungsformen kann so Blut in ein Vacutainer-Röhrchen mit vorhandenem CTI (Haematologic Technologies, Essex, VT) entnommen werden und direkt in das Assayröhrchen gegeben werden. Es wird darauf geachtet, dass kein endogener Gewebefaktor eingeführt wird, so dass die Assayresultate hoch-reproduzierbar sind. Die konsistente Lipidierung von Gewebefaktor ist für den Erfolg des Assays kritisch. Um eine mögliche Charge-zu-Charge-Variablität zu kontrollieren, wird ein Standardisierungsverfahren, z.B. das, das für die Prothrombinzeit verwendet wird, für viele Anwendungen nützlich sein. Siehe Palaretti, G., et al. (1987) Thromb. Haemostas. 58:905.
Bevorzugte Mengen an CTI zur Verwendung in dem "point-of-care"-Assay werden im Allgemeinen durch die vorgesehene Verwendung bestimmt. In Ausführungsformen, in denen eine Verringerung oder Inhibierung der Gerinnung von zwischen etwa 100 bis etwa 1.000 Sekunden, vorzugsweise zwischen etwa 200 bis etwa 800 Sekunden, und bevorzugter etwa 300 bis etwa 400 Sekunden erforderlich ist, wird allerdings die Menge an CTI im Allgemeinen zwischen etwa 50 μg/ml bis etwa 500 μg/ml liegen, wobei etwa 200 μg/ml CTI für die meisten Anwendungen bei etwa Raumtemperatur bevorzugt sind. Verfahren zur Messung der Gerinnung in Blut und Blutprodukten sind bekannt und werden in den Beispielen unten detaillierter diskutiert.
Wie diskutiert wurde, können die "point-of-care"-Blutgerinnungs-Assays, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, viele Vorteile haben. Solche Assays sind z.B. speziell zur Überwachung von Patientenblut in effizienter und hoch Kosten-effektiver Weise verwendbar. Ein bevorzugter Assay ist insbesondere ein einfacher, durch Gewebefaktor initiierter Gerinnungs-Assay für minimal verändertes Vollblut mit unterdrückter Kontaktweggerinnung, der eine hohe Empfindlichkeit hat. Eine bevorzugte Verwendung des Assays ist ausreichend um Effekte von neuen antithrombotischen Agentien widerzuspiegeln, die beim "point-of-care" angewendet werden können. Der Assay ist mit einem Variationskoeffizienten zwischen Individuen von weniger als etwa 10% in hohem Maße reproduzierbar. Wie auch diskutiert wurde, hat der Assay einen weiten Bereich von Verwendungen, einschließlich Detektieren und Definieren antithrombotischer Effekte von Hirudin und rTAP mit verstärkter Empfindlichkeit. Der Assay kann auch eingesetzt werden um antithrombotische Wirkungen von Co-Faktor-abhängigen An tikoagulantien, z.B. Enoxaparin und Heparin, zu detektieren. Der Assay charakterisiert in signifikanter Weise die Gerinnung in Vollblut, wodurch eine Analyse von additiven und synergistischen Effekten von antithrombotischen Mitteln oder Mitteln zur Hemmung der Thrombozytenaggreation, wie auch bestimmter monoklonaler Antikörper gegen Blutfaktor, ermöglicht. Besonders bevorzugte Assays werden in den folgenden Beispielen 16-19 unten erläutert.
Der "point-of-care"-Blutgerinnungs-Assay der vorliegenden Erfindung hat andere bedeutende Verwendungen. Der Assay kann z.B. verwendet werden um die therapeutische Wirksamkeit spezifischerer antithrombotischer Mittel und Mittel zur Hemmung der Thrombozytenaggreation, z.B. Heparine mit niedrigem Molekulargewicht, direkte Thrombin-Inhibitoren und Inhibitoren von Faktor Xa-, Faktor VIIa-Gewebefaktor und Glykoprotein IIb-IIIa zu überwachen. Für Beispiele dieser und anderer Agentien siehe Catella-Lawson, F. (1997) in Direct Thrombin Inhibitor in Cardiovascular Disease. Coronary Artery Disease 1997; 8:105; Cohen, M., et al. (1997) N Engl J Med 337:447; Vlasuk, G., et al. (1997) Am J Cardiol 80:665; Stanssens, P., et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 93:2149; und Schulman, SP., et al. (1996) Circulation 94:1083.
Viele frühere in vitro-Gerinnungs-Assays sind gegenüber den Wirkungen vieler dieser Agentien bzw. Mittel unempfindlich. Dementsprechend ist eine optimale Überwachung der in vivo-Wirksamkeit oft begrenzt, und der therapeutische Wert nahezu jedes antithrombotischen Mittels wird typischerweise durch eine Verringerung der klinischen Events definiert. Diese Unzulänglichkeiten werden vermieden, indem ein "point-of-care"-Assay bereitgestellt wird, der genauer und in hohem Maße zuverlässige in vitro-Surrogatmessungen zur Überwachung und Quantifizierung, wenn diese benötigt wird, der klinischen Wirksamkeit einer Vielzahl pharmakologischer Agentien bereitstellt. Diese Vorzüge verbessern die Behandlung des Patienten, sorgen für schnellere und weniger Fehler-anfällige Resultate und erleichtern die klinische Beurteilung neuer Agentien. Die begrenzte Verfügbarkeit von genauen und empfindlichen Assays behindert oft Pilotstudien, die die Kosten für klinische Untersuchungen beschleunigen und verringern könnten, oder schließt diese aus. Die erfindungsgemäßen Assays vermeiden diesen Nachteil, indem sie für eine gute Inhibierung der Blutgerinnung, und speziell der Kontakt-Inhibierung, sorgen.
Die "point-of-care"-Blutgerinnungs-Assays der vorliegenden Erfindung sind beachtlich flexibel und können eingesetzt werden um einzelne Patienten zu überwachen, die verschiedenen Arzneimittelklassen, z.B. antithrombotischen Arzneimitteln, Arzneimitteln gegen Thrombozytenaggregation und fibrinolytischen Arzneimitteln, ausgesetzt sind.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Untersuchung der Gerinnung von Blutprodukten bereit. Eine bevorzugte Verwendung der Verfahren involviert eine Untersuchung der Gerinnung in Plasma durch mindestens einen der folgenden Schritte oder vorzugsweise alle folgenden Schritte:

a) Behandeln von Blut mit einer Lösung, die eine Menge eines Calcium-chelatisierenden Mittels enthält, die ausreichend ist um die Gerinnung zu hemmen,
b) Unterwerfen des Bluts Bedingungen, die zur Bildung von Plasma führen,
c) Inkontaktbringen des Plasmas mit einer Menge von Corn-Trypsin-Inhibitor (CTI), die ausreichend ist um eine Gerinnung zu hemmen,
d) Recalcifizieren des Plasmas, und
e) Untersuchen des recalcifizierten Plasmas.

Eine bevorzugte Verwendung des Verfahrens umfasst Untersuchung der Gerinnung in Thrombozyten-defizientem Plasma, obgleich andere Plasmatypen, wie sie hier diskutiert werden, auch eingesetzt werden können. Das Verfahren ist flexibel und kann in einfacher Weise modifziert werden um an eine vorgesehene Verwendung angepasst zu werden. Beispielsweise kann Schritt a) des Verfahrens Zugeben einer geeigneten Menge an CTI umfassen. Es ist bevorzugt, dass die im Verfahren eingesetzten Mengen an CTI ausreichend sind um die Gerinnungszeit in recalcifiziertem Plasma über mindestens 100 bis etwa 1.000 Sekunden, vorzugsweise zwischen etwa 1.000 bis etwa 3.600 Sekunden oder mehr, zu verlängern. Besonders bevorzugte Mengen an CTI liegen zwischen etwa 50 bis etwa 200 μg/ml oder höher, bis etwa 500 μg/ml, bis zu etwa 1.000 μg/ml, wobei im Allgemeinen etwa 80 bis etwa 100 μg/ml bevorzugt sind. Das Plasma wird vorzugsweise zur Gerinnung untersucht, indem geeignete Mengen an TF und PSPC zugesetzt werden, wie es bereits diskutiert wurde.
Es ist möglich, die Mengen oder die spezifische Aktivität von CTI unter Verwendung bestimmter Gerinnungs-Assays, und insbesondere unter Verwendung des aPTT-Assays, zu bestimmen. Beispielsweise kann eine Menge an CTI Plasma, beispielsweise Citratplasma oder Thrombozyten-defizientes Citratplasma, zugesetzt werden und die Gerinnungszeiten können durch den aPTT-Assay beurteilt werden. Die Menge an CTI kann bestimmt werden, indem die Gerinnungszeit mit einem Kontrollexperiment verglichen wird, indem eine Standardkurve mit bekannten Mengen an CTI erzeugt worden war. Meist weist ein aPTT-Assay Gerinnungszeiten im Bereich von etwa 25 bis etwa 43 Sekunden auf. Wenn etwa 500 μg/ml CTI zugesetzt wird, wird die Gerinnungszeit dagegen im Bereich von etwa 100 bis etwa 150 Sekunden oder mehr, bis zu etwa 240 Sekunden, verlängert. Dementsprechend liefert der aPTT-Assay ein zweckdienliches Verfahren zur CTI-Messung, das durch nachfolgen diskutierte bevorzugte Verfahren hergestellt wird.
Speziell bevorzugte Verfahren zur Verlängerung der Plasmagerinnungszeit sind die Gerinnungs-Assays, die unten in den Beispielen 1-6 beschrieben werden.
Darüber hinaus werden verwandte Verfahren zur Verlängerung der Plasmagerinnungszeit angeführt. Die Verfahren umfassen im Allgemeinen mindestens einen der folgenden Schritte, und vorzugsweise alle folgenden Schritte:

a) Behandeln von Blut mit einer Lösung, die eine gegen Gerinnung wirksame Menge an Corn-Trypsin-Inhibitor (CTI) und eines Calcium-chelatisierenden Mittels umfasst,
b) Unterwerfen des Blutes Bedingungen, die zur Bildung von Plasma führen,
c) Recalcifizieren des Plasmas, und
d) Untersuchung der Gerinnung im recalcifizierten Plasma.

Eine bevorzugte Verwendung des Verfahrens involviert die Herstellung von Thrombozyten-defizientem Plasma. Es ist bevorzugt, dass die in dem Verfahren verwendeten Mengen an CTI ausreichend sind um die Gerinnungszeit über wenigstens 100 bis etwa 1.000 Sekunden, vorzugsweise zwischen etwa 1.000 bis etwa 3.600 Sekunden oder mehr, wie sie durch einen geeigneten Gerinnungs-Assay bestimmt wird, zu verlängern. Spezifisch bevorzugte Mengen an CTI liegen zwischen etwa 50 bis etwa 200 μg/ml oder mehr, bis zu etwa 500 μg/ml bis zu etwa 1.000 μg/ml, wobei zwischen etwa 80 bis etwa 100 μg/ml im Allgemeinen bevorzugt sind. Das Plasma wird vorzugsweise auf Gerinnung untersucht, indem geeignete Mengen an TF und PSPC, wie es diskutiert wurde, zugesetzt werden.
Bezüglich weiter bevorzugter Assays, und speziell bezüglich des XpPT-Assays, in dem CTI zur Verringerung oder Inhibierung der Gerinnung in Blutprodukten, z.B. Plasma, eingesetzt wird, siehe die noch folgenden Beispiele 10-15. Der Assay ist mit der Verwendung einer Vielzahl spezifischer Plasma, einschließlich gefrorenem oder vorher gefrorenem Plasma, vollständig kompatibel.
Wie bereits diskutiert wurde, ist die Erfindung in hohem Maße flexibel und kann in einfacher Weise zur Anpassung an die vorgesehene Verwendung modifiziert werden. Es kann z.B. in einigen Fällen nützlich sein, die hierin offenbarten Verfahren und Assays zu modifizieren, indem der CTI durch eine wirksame Menge mindestens eines anderen Antikoagulans ersetzt wird. Beispiele umfassen Heparin, Warfin, rekombinantes Zecken-Antikoagulans (rTAP), Huridin, Enoxaparin und einen Antikörper gegen einen Blutgerinnungsfaktor. Ein besonders bevorzugter Antikörper ist ein monoklonaler Antikörper, der gegen Blutfaktor XI reaktiv ist, wie z.B. der Antikörper abcixmab, der in Beispiel 19 unten beschrieben wird.
In anderen Fällen kann es allerdings nützlicher sein, den CTI in den Verfahren und Assays mit wenigstens einem anderen Antikoagulans zu ergänzen, z.B. um die Antigerinnungs-Aktivität zu verstärken oder über einen gewünschten Zeitraum zu verlängern. In dieser Ausführungsform wird die Menge des zu verwendenden Antikoagulans von der vorgesehenen Verwendung bestimmt werden, wird aber im Allgemeinen ausreichend sein um eine Gerinnung zu verringern oder zu blockieren, was durch die hierin beschriebenen Standard-Assays bestimmt wird. Siehe auch Williams Hemoatology, oben, Kapitel L33. Besondere Gerinnungs-Assays sind in den Beispielen unter Verwendung von spezifischem Plasma offenbart (z.B. aPTT-, XpPT-Assays), Blutgerinnungs-Assays und Koagulation, wie sie durch das Hemochron ACT-Gerät detektiert wird.
In Ausführungsformen der Erfindung, d.h. in hierin beschriebenen Assays oder Verfahren, in denen der verwendete Gerinnungsfaktor ein geeigneter Antikörper gegen einen Blutgerinnungsfaktor, und insbesondere Blutfaktor XI ist, wird die zu verwendende Menge dieses An tikörpers in den meisten Fällen von Parametern, z.B. der Menge an benötigter Antigerinnungs-Aktivität und Dauer der erforderlichen Aktivität, abhängen. Insbesondere wenn der Antikörper der abcximab-Antikörper ist, was in Beispiel 19 beschrieben wird, wird die zu verwendende Menge an Antikörper im Allgemeinen im Bereich von zwischen etwa 0,001 E/ml bis etwa 10 E/ml, vorzugsweise zwischen etwa 0,01 E/ml bis etwa 1 E/ml, liegen, wobei etwa 0,01 bis 0,05 E/ml für die meisten Anwendungen bevorzugt ist. Einheitsdefinitionen sind solche, die von einem bevorzugten Hersteller (Eli Lilly) verwendet werden. Alternativ kann der abcixmab einer besonderen Probe in einer Menge zugesetzt werden, die ausreicht um eine Gerinnung zu inhibieren, d.h. in einer Menge zwischen etwa 0,1 μg/ml bis etwa 30 μg/ml, vorzugsweise zwischen etwa 1 μg/ml bis etwa 10 μg/ml, wobei etwa 3 bis 5 μg/ml für viele Anwendungen bevorzugt sind.
Mit dem Ausdruck "spezifische Bindung" oder einem ähnlichen Ausdruck ist ein Molekül, und insbesondere ein Antikörper oder Fragment davon, wie sie hierin offenbart sind, gemeint, das/der an ein anderes Molekül, typischerweise einen Liganden, unter Bildung eines spezifischen Bindungspaares bindet. Dieses spezifische Bindungspaar erkennt keine anderen Moleküle oder bindet daran, was z.B. durch Westernblotting, ELISA, RIA, Gelmobilitätsverschiebungs-Assay, Enzym-Immuno-Assay, kompetitive Assays, Sättigungs-Assays oder andere geeignete Proteinbindungs-Assays, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, bestimmt wird.
Wie oben diskutiert wurde, wird Vollblut, minimal verändertes Blut oder ein Blutprodukt zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeigneterweise einem Säuger, speziell einem menschlichen Patienten, entnommen. In Ausführungsformen, in denen das Material von einem menschlichen Patienten entnommen wird, kann dieser Patient normal sein, wobei dieser Ausdruck wie hierin definiert gebraucht wird. Alternativ kann der Patient an einer thrombolytischen oder fibrinolytischen Störung, die fachbekannt ist, leiden oder auch an einer Kombination dieser Störungen leiden oder es kann angenommen werden, dass er daran leidet. Ganz besondere Patienten, die zur Bereitstellung des Bluts oder des Blutproduktes geeignet sind, haben Thrombozytendefiziens oder eine Abnormalität, z.B. Thrombozytopenie, oder es wird angenommen, dass sie daran leiden.
Die folgenden spezifischen Beispiele sind für die vorliegende Erfindung erläuternd.
BEISPIEL 1 – Plasmareinigung mit zugesetztem Corn-Trypsin-Inhibitor (CTI)
Im Folgenden wird ein Verfahren zur direkten Sammlung von Plasma in Kontakt-Inhibitor-Lösungen, die CTI umfassen, beschrieben (Methode A). Das Verfahren wurde typischerweise angewendet um Plasma von normalen Donoren bzw. Spendern zu sammeln (PT = 10-14 Sekunden, aPTT = 26-40 Sekunden und normale Fibrinogen-Level).
Blut wurde durch eine sterile Vacutainer-Butterfly-Nadel (Nr. 19, 3/4 in.-Nadel mit 12 in. Röhre und Luer-Adapter, Becton-Dickinson und Co., Rutherford, NJ, Produkt Nr. 4919) in eine sterile 30 cm³-Spritze (Produkt-Nr. 309662, Becton-Dickinson und Co.), die eine Lösung von 3 mg Corn-Trypsin-Inhibitor in 330 mM Natriumcitrat (pH 6,5) enthielt, aufgezogen. Das Citratblut, das den Kontakt-Inhibitor enthielt, wurde in 50 ml-Erlenmeyer-Kolben (Falcon Nr. 2070) transferriert. Nach Zentrifugation mit 980 UpM in einer Beckmann-Zentrifuge, Modell TJ-6 (Rotormodell 792), für 30 min (4°C) wurde das überstehende Plasma in 1,7 ml konische "non-Stick"-Zentrifugenröhrchen mit Kappen (VWR; West Chester, PA; Produkt-Nr. 20170-650) in Aliquots (jeweils 1 ml) aufgeteilt, und zwar zur unmittelbaren nachfolgenden Verwendung oder zur Lagerung bei –80°C. Vor Verwendung in den Assays wird Thrombozyten-armes Plasma außerdem durch Zentrifugation in einer Tisch-Mikrozentrifuge, Eppendorf Modell 5415C (14.000 UpM; 10 Minuten; Standard-Rotormodell F-45-18-11, 25°C) isoliert, und die oberen Zweidrittel (~0,7 ml) werden in ein getrenntes konisches 1,7 ml-Mikrozentrifugenröhrchen (wie oben) gegeben. Thrombozyten-armes Plasma kann bei 1°-4°C gelagert werden, bis es im Assay verwendet wird (<2 h, 4°C).
Dieses Beispiel veranschaulicht ein Verfahren, bei dem CTI vor Plasmareinigung zu Vollblut gegeben werden kann. Bei Recalcifizierung des Plasmas, das durch das Verfahren hergestellt wurde, liegen die Gerinnungszeiten in Abwesenheit eines Inhibitors über etwa 2.000 Sekunden oder mehr.
BEISPIEL 2 – Corn-Trypsin-Inhibitor (CTI) hemmt die Plasmagerinnung.
Das Folgende beschreibt ein Verfahren zur Zugabe von CTI, nachdem Plasma gesammelt worden war (Methode B). Das Verfahren wurde routinemäßig für Proben, die von Patienten entnommen worden waren, verwendet. Die Aufarbeitung wurde im Hematology Laboratory bei Fletcher-Allen Health Care in Burlington, VT, durchgeführt.
Blut wurde direkt in sterile, gepufferte, 3,8% Natriumcitrat-Röhrchen (Vacutainer, Produkt-Nr. L10318-00, Becton-Dickinson and Co.) aufgezogen, und die Röhrchen wurden in einem 4227 RCF für 3 Minuten (Baxter Stat 60-Tisch-Zentrifuge) zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, und für jede Probe wurde ein automatischer PT-Wert entwickelt. Thrombozyten-arme Proben wurden durch weitere Zentrifugation für 10 Minuten mit 14.000 UpM isoliert, und die oberen Zweidrittel des Plasmas wurden in einen "Sarstedt rectic cup" transferriert, wo es für eine nachfolgende Analyse bei –80°C gelagert wurde. Vor dem Auftauen wurde CTI (Stammkonzentration 1-5 mg/ml) in einer Menge auf die gefrorene Probe geschichtet, die ausreichte um eine Endkonzentration von 100 μg CTI/ml Plasma zu erhalten. Solches Citratplasma, das CTI enthielt, wurde innerhalb von 0 bis 2 Stunden (gelagert bei 2-8°C) verwendet.
Dieses Beispiel erläutert ein Verfahren, durch das CTI Blutplasma zugesetzt werden kann.
BEISPIEL 3 – Plasmagerinnungs-Assay unter Verwendung von Corn-Trypsin-Inhibitor (CTI)
Thrombozyten-armes Plasma, das wie in Beispiel 1 oder 2 beschrieben entweder von Patienten oder normalen Spendern gesammelt worden war, wurde (100 μl) in ein 12 × 75 mm Polystyrol-Einwegröhrchen (VWR Scientific, Produkt-Nr. 60818-361) gegeben. Calciumchlorid (10 μl, 300 mM CaCl₂) wurde zugesetzt, unmittelbar danach wurde eine Menge an konzen triertem PSPC (wie oben beschrieben hergestellt, typische Stammkonzentration ~1-5 mM in HBS, pH 7,4) zugegeben, so dass die Endkonzentration an Lipid im Gemisch 50 nM war. Um die Reaktion zur Zeit null zu initiieren, wurden 20 μl Gewebefaktor-Stammreagens (unten beschrieben) zu einer End-TF-Konzentration von 1 nM zugesetzt. Das Röhrchen wurde in einem 37°C-Bad geschüttelt, bis ein Gerinnsel beobachtet wurde; dieser Zeitpunkt wurde aufgezeichnet.
BEISPIEL 4 – Empfindlichkeit des Plasmagerinnungs-Assays unter Verwendung von Corn-Trypsin-Inhibitor (CTI) für Blutgerinnungsfaktor-Defiziens
Unter den Bedingungen, dass verdünnter TF im Plasmagerinnungs-Assay verwendet wurde (Beispiel 3), war es wichtig festzustellen, ob der Assay auf Defiziens an Faktor VIII oder Faktor IX anspricht. Es wurde gezeigt, dass Plasma von Patienten mit Faktor IX-Defiziens (<1% Faktor IX, George King Biomedical, Thrombozyten-arm gemacht, wie in dem Verfahren in Beispiel 2 beschrieben, mit 100 μg/ml CTI) eine Gerinnung unter den vorliegenden Bedingungen innerhalb von 113-130 Sekunden zeigt, während normales Plasma (isoliert durch das Verfahren von Beispiel 1 mit 100 μg/ml CTI) zwischen 60 und 75 Sekunden gerinnt. Entsprechend gerinnt Plasma aus Faktor VIII-defizientem Plasma (<1% Faktor VIII, George King Biomedical, wie in Methode B Thrombozyten-arm gemacht, mit 100 μg/ml CTI) zwischen 125 und 140 Sekunden.
In beiden Fällen war die Verlängerung bei der Gerinnungszeit im Vergleich zum Normalwert etwa 2fach. Dagegen wichen manuelle PTs für alle drei Fälle nicht signifikant ab, und es wurde gefunden, dass sie für diesen Test im Normalbereich liegen (normales Plasma, Methode A = 14,7 Sekunden; Faktor IX-defizientes Plasma, Methode B = 14,8 Sekunden; und Faktor VIII-defizientes Plasma = 15,0 Sekunden). Demnach zeigt das erfindungsgemäße Beispiel, dass der in Beispiel 3 beschriebene Assay Defizientien bei Faktor VIII und IX besser widerspiegelt als der traditionelle PT-Assay und daher ein biologisch und klinisch relevanterer Assay als der PT bei hohem TF ist. Citrat-Normalplasma, das wie in Beispiel 3 recalcifiziert worden war, zeigte selbst nach 3.600 Sekunden ohne TF-Zugabe keine Gerinnung.
BEISPIEL 5 – Überwachung der Plasmagerinnung bei Patienten, die eine Antikoagulantien-Therapie erhalten
Der in Beispiel 3 oben beschriebene Plasmagerinnungs-Assay kann im Allgemeinen verwendet werden um Patientenblut zu überwaschen, und insbesondere um die Blutgerinnung bei Patienten zu messen, die eine Antikoagulantien-Therapie erhalten. Beispielsweise kann der Plasmagerinnungs-Assay eingesetzt werden um die Blutgerinnung bei Patienten, die ein Antikoagulans oder mehrere anerkannte Antikoagulantien erhalten, z.B. Heparin, oder ein orales Antikoagulans, z.B. Wafarin, Dicumarol oder Coumadin, wirksam und reproduzierbar zu überwachen. Für Beispiele anderer bekannter Antikoagulantien siehe A.G. Gilman et al, supra.
Für viele Anwendungen ist es nützlich, den PT-Assay auf einen akzeptierten Thromboplastin-Standard zu standardisieren. Obgleich ein Thromboplastin-Laborstandard verfügbar ist (WHO-Standard-Thromboplastin), verwenden Laboratorien typischerweise nicht immer dieses Reagens im PT-Assay. Statt dessen wird für einen gegebenen Patienten zuerst ein Wert für PT bestimmt, wobei ein im Handel verfügbares Thromboplastinreagens verwendet wird, das gegen den WHO-Standard kalibriert wurde. Diese PT-Daten werden dann verwendet um per Computer das Verhältnis des Patienten-PT zum geometrischen Mittel aus einem Bereich normaler Kontroll-PT-Werte (N>20) zu bestimmen. Aus diesem PT-Verhältnis wird ein international normalisiertes Verhältnis (INR) erhalten, indem das PT-Verhältnis zu der Kraft des ISI-Wertes, der für das Thromboplastinreagens in Verwendung angegeben ist, erhöht wird. Unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Näherung kann das INR dann für einen gegebenen Patienten als Maß für die relative Reaktivität des Patienten gegenüber Normalplasma im PT-Assay angegeben werden, der erhalten würde, wenn das WHO-Standard-Thromboplastinreagens im Verfahren eingesetzt würde. Siehe z.B. Miletich, JP (1995) in Prothrombin time (Kapitel L33) in Williams Hematology, 5. Ausgabe (Beutler, E. et al., Hrsg.), McGraw-Hill, Inc., Health Professions Div., New York, Seiten L82-L84.
Um die Beziehung zwischen dem in Beispiel 3 beschriebenen Plasmagerinnungs-Assay und dem für eine Reihe von Patientenplasma erhaltenen INR zu untersuchen, wurde Plasma von Patienten mit stabilisierter Coumadin-Therapie (mit INRs im Bereich von 1,7-5,5) von Flecher-Allen Health Care (Burlington, VT) erhalten. Diese Plasma wurden gegenüber normalen Werten in der Gerinnungszeit verlängert. Beispielsweise zeigt der gängige Assay, dass Plasma von Normalpatienten (mit einem INR = 1) zu Gerinnungszeiten im Bereich von 60-75 Sekunden führt. Ein Patient mit einem INR von 2,0 erreicht typischerweise Gerinnungszeiten im Bereich von 215-240 Sekunden, während Patienten mit einem INR von 5,0 Gerinnungszeiten zwischen 700 und 800 Sekunden haben.
1 zeigt eine nahezu lineare Beziehung zwischen Gerinnungszeiten, wie sie im derzeitigen Assay bestimmt werden, und dem INR, das durch einen normalisierten PT-Assay entwickelt wurde. Die Daten weisen einen hohen Linearitätsgrad über den INR-Bereich zwischen 1,0 und 5,5 auf, was sogar den strengsten Level einer Antikoagulantien-Therapie, die klinisch angewendet werden könnte, beinhaltet. Daher ist der in Beispiel 3 beschriebene Plasmagerinnungs-Assay geeignet, Detektionsdifferenzen bei der Gerinnung zwischen normalen Personen und Patienten, die eine Coumadin-Therapie erhalten, effektiv und reproduzierbar zu detektieren. Spezifischer ausgedrückt, der Plasmagerinnungs-Assay spricht überraschenderweise auf den Beitrag des späteren Teils des intrinsischen Wegs, sowohl bei normalem Plasma als auch bei Patientenplasma, an.
Die folgenden Beispiele 6-9 beweisen, dass eine Gerinnung von Vollblut bei geringem Gewebefaktor (~25 pM) von Faktor VIII abhängig ist, und dass eine Abhängigkeit von Faktor XI bei Plasma zwischen 25 pM TF und ~5 pM TF dokumentiert werden kann. Ähnliche Beobachtungen wie für den Faktor VIII-defizienten Fall wurden auch bei Faktor IX-defizientem Vollblut gemacht.
BEISPIEL 6 – Gerinnung in Faktor XI-defizientem Plasma als Funktion von TF
Von dem Borne, P.A.K. et al. (1995) Blood 86:3035, zeigten eine Wirkung von Faktor XI auf die Fibrinbildung in Faktor XII-defizientem Plasma bei sehr niedrigen Thromboplastin-Konzentrationen. Unter Verwendung abnehmender Konzentrationen an relipidiertem Gewebefaktor wurde eine ähnliche Abhängigkeit von Faktor XI für die Gerinnung in Faktor XI-defizientem Plasma bewiesen, was mit Unterdrückung der Kontaktaktivierung in Gegenwart von Corn-Trypsin-Inhibitor gemessen wurde (3). Gerinnungszeiten mit (ausgefüllte Kreise) und ohne (ausgefüllte Quadrate) Faktor XI liegen auf Kurven, die sich in der Nähe von 24 pM TF schneiden, aber bei TF-Konzentrationen unter 24 pM divergieren. Die Gerinnung bei 24 pM ist ohne Faktor XI 28 Sekunden langsamer, wohingegen die Differenz mit 6 pM TF 5,7 Minuten erreicht. Auf der Basis dieser Beobachtungen wurde die Blutgerinnung bei Hämophilie C bei 25 und 5 pM untersucht.
3 wird wie folgt erläutert: Die Gerinnungszeit in Faktor XI-defizientem Plasma (<1%) wurde als Funktion von Gewebefaktor und Faktor XI (wie in Methoden beschrieben) gemessen. Die Ordinate gibt Sekunden (linke Achse) und Minuten (rechte Achse) an. Es werden zwei Kurven gezeigt: eine für Faktor XI-defizientes Plasma ohne Faktor XI-Ersatz (<1%, ausgefüllte Quadrate) und eine zweite Kurve für dasselbe Plasma mit 1 E/ml Faktor XI (25 nM, ausgefüllte Kreise). Um die Daten zu verbinden wurden glatte Kurven gezeichnet, die sich in der Nähe von 24 pM TF treffen. Die Kurven divergieren zunehmend, wenn die Gewebefaktor-Konzentration auf 6 pM TF verringert wird, wobei die Differenz am ausgeprägtesten ist.
Beispiel 6 zeigt, dass die Bedingungen der Beispiele 4 und 5 weiter modifiziert werden können, indem die TF-Konzentration verringert wird, so dass der Assay für Faktor XI empfindlicher gemacht wird.
BEISPIEL 7 – Blutgerinnung bei Hämophilie A
Die Gerinnung in Blut von einem Patienten mit schwerer Hämophilie A (<0,5% VIII:C) wurde mit der Gerinnung in Blut aus normalen Donoren nach Initiierung mit 25 pM TF verglichen (2A-D). In 2A sind die Zeitabläufe für eine TAT-Erzeugung in normalem und Faktor VIII-defizientem Blut mit und ohne Faktor VIII-Ersatz gezeigt. Das normale Profil (ausgefüllte Kreise) wird aus gemittelten Daten ("s.e.m.") aus einer Reihe von 14 Experimenten, die über einen Zeitraum von 18 Monaten mit 4 normalen Personen durchgeführt worden waren, aufgebaut. Wenig TAT wird während der Initiierungsphase detektiert; anschließend wird die Masse des produzierten TAT explosionsartig (54,6 nM/min) während der Propagationsphase nach der Gerinnselbildungs-Zeit (4,0 +/– 0,2 Minuten, Pfeil a) erzeugt. In Faktor VIII-defizientem Blut (offene Kreise) ist die Gerinnungszeit bis 6,5 Minuten verzögert (Pfeil c), was eine Zunahme in der Initiierungsphase von etwa 60% gegenüber dem Normalfall darstellt. Die explosionsartige Thrombinerzeugung, die üblicherweise in normalem Blut nach der Gerinnungs-Zeit beobachtet wird, ist stark verringert (maximale Rate 1,9 nM/min, 4% vom Normal-wert). Ein Ersatz mit rekombinantem Faktor VIII (offen Quadrate, 1 E/ml) verkürzte die Gerin nungs-Zeit (4,1 Minuten, Pfeil b) und erhöhte die TAT-Bildung auf 45,9 nM/min zwischen 5 und 16 Minuten.
Der Kurvenverlauf für die FPA-Freisetzung in diesen Experimenten ist in 2B angegeben. Das normale Profil (ausgefüllte Kreise) ist der Mittelwert einer Reihe von 9 Experimenten mit 2 Personen. FPA wird mit einer maximalen Rate von 5,2 μM/min (zwischen 4 und 6 Minuten) freigesetzt, wobei etwa 4,8 μM (30% des Maximums) bei einer Gerinnungs-Zeit beobachtet wird (Pfeil a). Bei Faktor VIII-Defiziens (offene Kreise) ist die Höchstrate der FPA-Freisetzung auf 1,6 μM/min (30% des Normalwerts) reduziert. Allerdings ist die Fibrinopeptid A-Produktion am Ende des Experiments (20 Minuten) nahezu quantitativ. Das Ausmaß der FPA-Freisetzung im hämophilen Fall bei der Gerinnungs-Zeit (Pfeil c) ist dasselbe wie beim Normalprofil (etwa 30% des Maximums). Ein Ersatz von Faktor VIII (offen Quadrate) erhöht die maximale FPA-Rate auf 6,4 μM/min, was um 23% über der normalen Rate liegt. Bei der Gerinnungs-Zeit ist das Ausmaß der FPA-Freisetzung 35% (7,5 μM), was den Schätzungen für normales und Faktor VIII-defizientes Blut entspricht.
In 2C sind Profile für die Osteonectin-Freisetzung als Maß für die Thrombozyten-Aktivierung (Stenner, D.D., et al. (1986) Proc Nat. Acad Sci. (USA) 83:6892, und Kelm, R.J. Jr. und Mann, K.G. (1990) Blood 75:1105) angegeben. Im Blut einer normalen Person (ausgefüllte Kreise, gleichzeitige Kontrolle) ist die Osteonectin-Freisetzung etwa 50% zur Gerinnungszeit (Pfeil a) und ist innerhalb von 5 Minuten vollständig. In Faktor VIII-defizientem Blut (offene Kreise) ist der Kurvenverlauf im Vergleich zu normalem Blut leicht verzögert. Eine vollständige Osteonectin-Freisetzung wird bei 6 Minuten beobachtet, wobei diese maximale Level vor der Gerinnungszeit erreicht (6,5 Minuten, Pfeil c). Eine Kurve ähnlich der Kontrolle wurde erhalten, als Faktor VIII im defizienten Blut ersetzt wurde (nicht-ausgefüllte Quadrate). Die Ähnlichkeit dieser Profile zeigt an, dass die Thrombozyten-Aktivierung bei 25 pM TF durch das Fehlen von Faktor VIII nur leicht beeinträchtigt wird.
Der zeitliche Ablauf der Faktor Va^HC-Erzeugung in Hämophilie A-Blut ist in 2D mit und ohne Faktor VIII-Ersatz dargestellt. Wenn Faktor VIII vorliegt (ausgefüllte Quadrate), beginnt eine deutliche Erzeugung von Faktor Va^HC bei 3 Minuten und ist in 6 Minuten vollständig. Bei Abwesenheit von Faktor VIII (nicht-ausgefüllte Quadrate) ist die Erzeugung von Faktor Va^HC verlangsamt und erreicht bis 10 Minuten kein Maximum. Bei der Gerinnungs-Zeit sind in jedem Experiment etwa 60-65% der schweren Kette gebildet. Wenn Faktor VIII vorliegt, wird zuerst die Bildung der leichten Kette (LC, ausgefüllte Kreise, 2D) bei der Gerinnungs-Zeit detektiert (4,1 Minuten, Pfeil a) und ist nach 6 Minuten vollständig. Dagegen ist die Bildung von Faktor Va^LC in Faktor VIII-defizientem Blut (nicht-ausgefüllte Kreise) dramatisch verzögert, wobei Spuren bei 8 Minuten und eine schnelle Bildung nach 9 Minuten beobachtet werden. In Abwesenheit von Faktor VIII ist somit die LC-Produktion, der limitierende Schritt bei der Expression von Faktor Va-Cofaktor-Aktivität (Rand, M.D., et al. (1996) Blood 88:3432, und van't Veer C. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:7983) deutlich verzögert.
Die beeinträchtigte Faktor V-Aktivierung ist wahrscheinlich ein signifikanter Faktor, der die Prothrombinumwandlung in Hämophilien limitiert. In normalem Blut haben Rand, M.D., et al. (1996), oben, während der Ausbreitungsphase der Thrombingeneration Prothrombinase-Konzentrationen aus den TAT-Bildungsraten als 7 pM zur Gerinnungs-Zeit geschätzt, wobei 3 Minuten später ein Maximum von 150 pM erreicht wurde, Rand, M.D., et al. (1996), oben. Faktor Xa wurde als delimitierende Komponente der Prothrombinase beobachtet, da bewiesen wurde, dass Faktor Va-Level und eine Thrombozyten-Aktivierung bei Konzentrationen von über 150 pM auftraten. In der vorliegenden Untersuchung wird unter Verwendung der TAT-Daten für den Normalfall etwa 35 pM Prothrombinase zur Gerinnungs-Zeit errechnet, was in 12 Minuten der Reaktion ein Maximum von 106 pM erreicht; Schätzungen bei hämophilem Blut mit Faktor VIII-Ersatz waren ähnlich (19 pM zur Gerinnungs-Zeit, 136 pM am Maximum). In Faktor VIII-defizientem Blut wurde allerdings etwa 1 pM Prothrombinase zur Gerinnungs-Zeit angegeben, und sie überstieg während des Experiments 6 pM nicht. Daher wird der limitierende Faktor Xa in Hämophilie A gebildet, und seine Einarbeitung in Prothrombinase wird als Resultat der verzögerten Bildung von Faktor Va langsam sein. Freier Faktor Xa ist ein weniger wirksames Enzym für die Prothrombin-Umwandlung, Mann, K.G., et al. (1990) Blood, 76:1, und Mann, K.G., et al. (1992) Seminars in Hematology 29:213, und ihm fehlt der relative Schutz gegen eine Inaktivierung durch AT-III und TFPI, den Faktor Va im Prothrombinase-Komplex bereitstellt. Siehe Marciniak, E. (1973) Br J Haematol. 24: 391, und Mast, A.E. und Broze, G.J. (1996) Blood 87:1845.
Das vorliegende Beispiel zeigt, dass eine Koagulation in Faktor VIII-defizientem Blut im Vergleich zu einer normalen Koagulation bei 25 pM TF durch eine moderate Verlängerung der Gerinnungszeit charakterisiert ist. Demnach wird unter diesen Bedingungen die Empfindlichkeit für Faktor VIII aufrecht erhalten. Außerdem zeigen detaillierte Untersuchungen an Faktor VIII-defizientem Blut eine verlangsamte FPA-Freisetzung und größere Verringerungen bei den Bildungsgeschwindigkeiten von Faktor Va, Faktor Xa und Thrombin. Verwandte Experimente wurden mit Faktor IX durchgeführt.
2 wird wie folgt erläutert:
Unter Verwendung von 25 pM TF wurde eine Koagulation bzw. Gerinnung in normalem Blut und in Hämophilie A-Blut (siehe Verfahren und Rand, M.D., et al. (1996), oben), mit und ohne Faktor VIII-Ersatz (1 E/ml Blut) initiiert. Von Hand wurden glatte Kurven durch die Punkte gezogen um die Daten anzunähern. A. Zeitverlauf für TAT in Normalblut (ausgefüllte Kreise), Hämophilie A-Blut (offene Kreise) und Hämophilie A-Blut mit Faktor VIII-Ersatz (offene Quadrate). Jeder Punkt auf der Normalkurve stellt einen Durchschnitts-TAT-Wert aus 14 Experimenten an 4 normalen Personen dar (mit Fehlerbalken, s.e.m.). Die durchschnittliche Gerinnungszeit für die zusammengestellte Normalkurve ist 4,0 +/– 0,2 Minuten (Pfeil a). Die Gerinnung in Faktor VIII-defizientem Blut erfolgte bei 6,5 Minuten (Pfeil c), wobei diese mit Faktor VIII-Ersatz auf 4,1 Minuten verkürzt wurde (Pfeil b); ein Kontrollröhrchen ohne TF im Faktor VIII-defizienten Experiment zeigte keine Gerinnung (>20,6 min), und die Ersatzkontrolle gerann bei 17,8 Minuten. B. FPA-Bildung in Normalblut, Faktor VIII-defizientem Blut und Faktor VIII-defizientem Blut mit Ersatz (Symbole wie in A). Die normale Kurve stellt die gemittelten Resultate aus 9 Experimenten, durchgeführt an 2 Personen, mit Fehlerbalken dar (s.e.m.). Die durchschnittliche Gerinnungszeit für das normale Profil war 4,1 +/– 0,2 (Standardfehler des Mittelwerts, s.e.m.) Minuten (Pfeil a), wobei die anderen Gerinnungszeiten wie in Versuch A waren. C. Osteonectin-Freisetzung wurde gemessen um die Thrombozyten-Aktivierung zu untersuchen (Symbole wie in A). Die normale Kurve wird aus Blut, das von einem einzelnen normalen Donor entnommen wurde (Gerinnungszeit = 4,1 Minuten, Pfeil a), das gleichzeitig mit dem des Faktor VIII-defizienten Patienten entnommen wurde, erstellt. Andere Gerinnungszeiten und Symbole sind wie in A. D. Nach Analyse der Faktor V-Aktivierung durch Immunblotting wurden Profile durch densitometrische Analyse wie in Verfahren bzw. Methoden aufgebaut. Die Zeitabläufe sind für die Bildung der schweren (Quadrate) und leichten Ketten (Kreise) von Faktor Va (Faktor Va^HC und Va^LC) mit (ausgefüllte Symbole) und ohne (nicht-ausgefüllte Symbole) Faktor VIII-Ersatz angegeben. Aus Gründen der Klarheit ist das normale Profil weggelassen, ist aber ähnlich dem Profil mit Faktor VIII-Ersatz. Gerinnungszeiten sind 4,1 Minuten (Hämophilie A mit Faktor VIII-Ersatz, Pfeil a) und 6,5 Minuten (Hämophilie A, Pfeil b).
BEISPIEL 8 – Gerinnung in Faktor XI-defizientem und normalem Vollblut mit 25 pM TF
Tabelle 1 gibt die Gerinnungszeiten für eine Koagulation in Faktor XI-defizientem Blut, defizientem Blut mit Ersatz und normalem Vollblut, die mit 25 und 5 pM TF bei Unterdrückung einer Kontakt-Aktivierung durch Corn-Trypsin-Inhibitor initiiert wurde, an. Tabelle 1 unten zeigt Gerinnungszeiten für Experimente mit normalem und Faktor XI-defizientem menschlichem Blut und Kontrollen. Für jedes der im Text beschriebenen Experimente sind Daten zusammen mit Phlebotomie-Kontrollwerten (in Klammern) für eine Gerinnung in Abwesenheit von zugesetztem Gewebefaktorinitiator angegeben. Wenn Phlebotomie-Kontrollen bis zum Ende des Experiments keine Gerinnung aufwiesen, werden Zeiten als untere Grenzen angegeben (bezeichnet als ein "gößer als"-Symbol). In allen Experimenten, einschließlich der Kontrolle, wurde die Faktor XIIa-Aktivität durch Zusatz von Corn-Trypsin-Inhibitor in einer Konzentration von 48 μg/ml Blut unterdrückt (siehe Methoden für die kurze Beschreibung der Experimente). Für die Experimente mit 25 pM Initiator war Patient A der Donor; in den 5 pM-Experimenten war Patient B der Donor.
TABELLE I
Bei 25 pM TF, wo Defiziens an Faktor VIII zu einer verschlechterten Gerinnselbildung und zur Unterdrückung der Fortschreitungsphase der Thrombinbildung führt, hat Faktor XI-Defiziens eine vernachlässigbare Wirkung. Die Gerinnungszeit ist 3,5 Minuten (gleichzeitige normale Kontrolle = 3,3 Minuten), und diese wird durch Faktor XI-Ersatz (3,7 Minuten) nicht verkürzt. In Kontrollröhrchen (Corn-Trypsin-Inhibitor vorhanden, kein TF zugesetzt) ist die Gerinnung deutlich verringert oder nicht existent, was angibt, dass andere Initiierungsquellen in diesen Experimenten nur vernachlässigbare Beiträge leisten. Bei 25 pM TF sind die Thrombinbildungsprofile für normales Blut (ausgefüllte Kreise) und Faktor XI-defizientes Blut (nicht-ausgefüllte Kreise, Patient A) fast identisch, während das Profil für Faktor XI-Ersatz (nicht-ausgefüllte Quadrate) eine etwas schnellere Thrombinbildung aufweist (4A). Die maximalen Raten der Thrombinbildung sind in den normalen (61 nM/min) und Faktor XI-defizienten (63 nmol l/min)-Experimenten fast identisch, und ein Faktor XI-Ersatz erhöhte die Geschwindigkeit der Thrombinbildung auf 85 nmol l/min. Diese Erhöhung führt zu einer 65% höheren Konzentration an finalem TAT im Ersatzfall (950 nM) als im defizienten Fall (575 nm). Diese Resultate zeigen an, dass Faktor XI für eine explosionsartige Thrombinerzeugung in Blut, die mit 25 pM initiiert ist, nicht erforderlich ist, die Geschwindigkeit der Thrombinbildung nach der Gerinnselbildung bei diesem Individuum aber moderat beeinflusst.
4B zeigt die FPA-Profile, die mit 25 pM TF erhalten werden. Für jeden Fall erfolgt der Reaktionsfortschritt über ähnliche Zeitskalen und in ähnlichem Ausmaß. Bei Faktor XI-defizientem Blut (nicht-ausgefüllte Kreise) wird FPA mit einer maximalen Geschwindigkeit von 6,1 μM/min (5,6μM/min in Normalblut, ausgefüllte Kreise) freigesetzt, während Ersatz von Faktor XI diese Geschwindigkeit auf 7,3 μM/min (nicht-ausgefüllte Quadrate) erhöhte. Die Fibrinogen-Umwandlung lag zur Gerinnungszeit in allen Fällen zwischen 30 und 41 %. Außerdem zeigen die Osteonectin-Freisetzungsprofile (4C), dass eine Thrombozyten-Aktivierung durch das Vorliegen oder das Fehlen von Faktor XI nicht stark beeinflusst wird, wenn die Reaktion mit 25 pM TF initiiert wird. Die Profile waren in allen Fällen ähnlich und wiesen bei 5 Minuten eine maximale Freisetzung auf. Die Beurteilung der Faktor Va-Bildung in normalem Blut und in Faktor XI-defizientem Blut zeigte identische Aktivierungsprofile. Die densitometrischen Profile der schweren Kette und der leichten Kette (nicht-ausgefüllte Symbole, 5A) zeigen, dass Faktor Va^HC innerhalb einer Minute nach Initiierung in allen Reaktionen detektierbar ist und in jedem Profil zur Gerinnungszeit etwa 33-45% beobachtet werden. Entsprechend sind die Profile für die Bildung der leichten Kette im Faktor XI-defizienten (nicht-ausgefülltes Dreieck), Ersatz (nicht-ausgefülltes Quadrat) und im normalen (nicht-ausgefüllter Kreis) Experiment einander ähnlich. Die Konzentrationen an Faktor Va^LC liegen während der Initiierungsphase unter der Nachweisgrenze und zur Gerinnungszeit wird nur eine kleine Fraktion gebildet. Nach der Gerinnungszeit wird die leichte Kette innerhalb von 1-2 Minuten (4 und 5 Minuten nach Initiierung) quantitativ gebildet. Zusammen beweisen die Faktor Va^HC- und Va^LC-Profile, dass eine Co-Faktor-Aktivierung durch Faktor XI nicht beeinträchtigt wird.
Beispiel 8 zeigt, dass die Blutgerinnung im Assay unter Verwendung von 25 pM TF bei Vollblut gegenüber Faktor XI unempfindlich war.
Die 4A-C werden wie folgt erläutert:
Unter Verwendung von 25 pM TF wurde eine Gerinnung in normalem und in Hämophilie C-Blut (siehe Methoden; Rand, M.D. et al., oben) mit und ohne Faktor XI-Ersatz (1 E/ml Blut) initiiert. Zeitabläufe für TAT werden nach Immunoassay-Analyse von gequenchten Proben aus Normalblut (ausgefüllte Kreise), Hämophilie C-Blut (nicht-ausgefüllte Kreise) und Hämophilie C-Blut mit Faktor XI-Ersatz (nicht ausgefüllte Quadrate) bereitgestellt (A). Die Gerinnungszeiten für die Experimente und Kontrollröhrchen sind wie in Tabelle 1 angegeben und werden durch Pfeile für Blut von einer normalen Person (Pfeil a), Hämophilie C- (Pfeil c) und Hämophilie C-Donoren mit Faktor XI-Ersatz (Pfeil b, 1 E/ml) gekennzeichnet. Zusätzlich zu TAT werden FPA (B)- und Thrombozyten-Osteonectin (C)-Profile bereitgestellt (Symbole und Gerinnungszeiten wie in A).
Die 5A und B werden nachfolgend erläutert. Die Diagramme zeigen die Faktor Va-Bildung während der Gerinnung in normalem Blut und in Hämophilie C-Blut bei 25 pmol/l Initiator, mit und ohne Ersatz. Für die in 4 beschriebenen Experimente wurde die Analyse der Faktor V-Aktivierung durch Immunblotting durchgeführt. Profile des Faktors Va-schwere Kette (A) und -leichte Kette (B) wurden durch densitometrische Analyse, wie es unten beschrieben wird, erstellt. Die zeitlichen Abläufe sind für die Bildung der schweren und leichten Ketten in normalem Blut (nicht-ausgefüllte Kreise) und in Hämophilie C-Blut (Patient C1) mit (nicht-ausgefüllte Quadrate) und ohne (nicht-ausgefüllte Dreiecke) Faktor XI-Ersatz angegeben. Die Gerinnungszeiten sind wie in Tabelle 1 und 4, und die Kurven wurden mit der Hand durch die Punkte gezogen.
BEISPIEL 9 – Gerinnung in Faktor XI-defizientem und normalem Blut mit 5 pM TF
Die Gerinnung in normalem Blut und in Faktor XI-defizientem Blut nach Initiierung mit 5 pM TF sind in Tabelle 1 und 4 (Patient B) zusammengefasst. Die Bestätigung der Daten wurde in einem getrennten Experiment mit einer dritten Faktor XI-defizienten Person erhalten.
Die Gerinnung in Faktor XI-defizientem Blut mit 5 pM Initiator (15,7 Minuten, Tabelle 1) war bezüglich des normalen (11,1 Minuten, gleichzeitiger Donor) 4,6 Minuten verzögert. Faktor XI-Ersatz verkürzte die Gerinnungszeit in Hämophilie C-Blut um 6 Minuten (9,7 Minuten), was in Übereinstimmung mit den Vorhersagen des Plasma-Assays (3) stand. In Abwesenheit von TF (nur Corn-Trypsin-Inhibitor) geronnen die Kontrollen für Hämophilie C mit oder ohne Faktor XI-Ersatz (über 20,5 Minuten) nicht, was bestätigt, dass die Faktor XIa-Kontamination in Faktor XI-Präparaten nicht signifikant war.
In den TAT-Profilen von 6A wird die Masse des Thrombins nach der Gerinnungszeit gebildet, und der Faktor XI-Ersatz erhöht die Geschwindigkeit der Thrombinbildung während der Propagationsphase in Hämophilie C-Blut. In normalem Blut (ausgefüllte Kreise, 6A) wird TAT bei 110 nM/min nach der Gerinnungszeit (Pfeil b) gebildet, im Vergleich dazu erfolgt die Bildung in Faktor XI-defizientem Blut (nicht-ausgefüllte Kreise) mit etwa 37 nM/min nach der Gerinnungszeit (Pfeil c). Ein Faktor XI-Ersatz (nicht-ausgefüllte Quadrate) erhöht die TAT-Geschwindigkeit auf 119 nM/min bei der Gerinnungszeit (Pfeil a). Das Resultat ist, dass die endgültigen Level an TAT in den normalen und Ersatz-Experimenten höher sind (750 nm und 600 nm), aber nur ungefähr 150 nm erreichten, wenn das Faktor XI-defiziente Experiment beendet wurde. Selbst bei 5 pM TF ist die Thrombinbildung in Hämophilie C-Blut über den Leveln, die in Hämophilie A-Blut bei 25 pM beobachtet werden, was mit der relativen klinischen Schwere der zwei kongenitalen Erkrankungen in Beziehung steht. 6B zeigt Profile für die Freisetzung von Fibrinopeptid A, die auch von Faktor XI abhängig ist, bei 5 pM TF. Die Fibrinopeptid A-Freisetzung erfolgt in Hämophilie C-Blut mit 5 pM Initiator (nicht ausgefüllte Quadrate, maximale Geschwindigkeit 2,7 μM/min) langsamer als in normalem Blut (15,5 μM/min) und ist infolge des Endes des experimentellen Zeitraums unvollständig. Der Ersatz von Faktor XI (nicht-ausgefüllte Quadrate) erhöht die FPA-Bildung auf 7,4 μM/min und liefert eine vollständige Fibrinogen-Umwandlung innerhalb von 2-2,5 Minuten Gerinnungszeit.
Die Thrombozyten-Aktivierung in Blut, die mit 5 pM TF initiiert wurde, wurde durch Osteonectin-Freisetzung (6C) bestimmt, und es stand im krassen Gegensatz zu den Daten bei höheren Initiatorkonzentrationen (3C). In Faktor XI-defizientem Blut (nicht-ausgefüllte Quadrate) ist die Osteonectin-Freisetzung während der Initiierungsphase sehr langsam, erreicht während der Gerinnungszeit etwa 65% (Pfeil c). Während dieses Zeitraums wurden Aggregate als körnige Akkumulationen an den Wänden der Reaktionsröhrchen wahrgenommen. Mit Faktor XI-Ersatz (nicht-ausgefüllte Quadrate) nahm Osteonectin wiederum langsam über die Initiierungsphase zu und erreichte während der Gerinnungszeit 67% (Pfeil a); das restliche Osteonectin wird innerhalb von 2 Minuten freigesetzt. Dies war ähnlich wie beim normalen Profil (ausgefüllte Kreise), bei dem 42% Fluidphasen Osteonectin bei der Gerinnungszeit detektiert wird (Pfeil b), worauf eine schnelle und unvermittelte Freisetzung des restlichen Proteins folgt. Im Allgemeinen ist die Thrombozyten-Aktivierung bei 5 pM TF langsam und zur Gerinnungszeit unvollständig (42-67%) und ist mit einer begrenzten Thrombinerzeugung während der Initiierungsphase verbunden. Nach Gerinnselbildung aktiviert der beobachtete Thrombinausbruch die Thrombozyten schnell, was eine maximale Aktivierung sicherstellt. Anders als Hämophilie A und C mit 25 pM TF, wird die Thrombozyten-Aktivierung mit 5 pM TF signifikant durch das Fehlen von Faktor XI beeinflusst. Mit 5 pM TF ist die Erzeugung von Faktor Va^HC in Hämophilie C-Blut (7A, nicht-ausgefüllte Dreiecke) ähnlich wie die FPA-Freisetzung und die Thrombozyten-Aktivierung langsamer als normal (nicht-ausgefüllte Kreise). Die Masse der schweren Ketten scheint bis 20 Minuten nicht aufzutreten (Δ), wohingegen in den Ersatz- (nicht-ausgefüllte Quadrate) und normalen Profilen das Maximum nach der Gerinnungszeit in jedem Fall in der Nähe von 12 bzw. 15 Minuten auftritt. Nur geringe Mengen an Faktor Va^HC treten in diesen Experimenten vor der Gerinnung auf. Dagegen ist Faktor Va^LC (7B) in allen drei Experimenten bis nach der Gerinnungszeit nicht detektierbar und scheint wiederum der limitierende Schritt bei der Cofaktor-Aktivierung zu sein. Demnach wird die Faktor V-Aktivierung mit 5 pM TF durch das Vorliegen oder das Fehlen von Faktor XI beeinträchtigt, wobei die Masse der Faktor V-Aktivierung in jedem Fall nach der Gerinnungszeit erfolgt.
Die Beispiele 7-9 stellen Restulate der Gerinnung in Hämophilie A- und Hämophilie C-Blut bereit. Bei schwerer Hämophilie A wurde die Gerinnung mit 25 pM TF gegenüber normal verzögert (ungefähr 2,4 Minuten), was moderat reduzierte Thrombin-Konzentrationen während der Initiierungsphase widergibt und zur Gerinnselbildung führt. Siehe Beispiel 7. Eine eindrucksvollere Beobachtung war die schwer verringerte Thrombinerzeugung in der Propagationsphase (nachdem die Gerinnung detektiert worden war), welche weniger als 4% der normalen Rate war. Die verschlechterte Thrombinbildung war mit einer verringerten Rate der Fibrinogenspaltung und einer drastisch verzögerten Faktor Va-Bildung verbunden. Ein Ersatz von Faktor VIII stellte die normale Gerinnung und die normale Thrombinbildung in der Propagationsphase wieder her. Diese Resultate stützen frühere Beobachtungen einer verringerten Prothrombinase-Aktivität in Abwesenheit funktioneller intrinsischer Tenase. Osterud, B. und Rapaport, S.I. (1977) Proc Natl Acad Si. 74:5260; Lawson, J.H., et al. (1994) J Biol Chem. 269:23357; Van't Veer, C. und Mann, K.G. (1997) oben; Biggs, R. und Nossel, H.L. (1961) Thromb Diath Haemorrh. 6:1; und Hoffman, M. et al. (1995) Blood 86:1794. Außerdem zeigt Beispiel 7, dass eine reduzierte Thrombinbildung in Abwesenheit von Faktor VIII auch zu einer schwer reduzierten Faktor Va-Bildung führt, die die Wirksamkeit des limitierten Faktor Xa, der während der Koagulation bei Hämophilie A produziert wird, weiter verring Obgleich die Thrombinbildung, die Fibrinogenspaltung und die Thrombozyten-Aktivierung während einer Koagulation in Hämophilie A-Blut vermindert waren, zeigten die Beispiele 8 und 9 eine relativ leichte Verzögerung bei der Thrombozyten-Aktivierung gegenüber normalem Blut (~1 Minute). Diese Resultate stehen im Wesentlichen in Übereinstimmung mit anderen Studien. Siehe z.B. Hoffman et al. (1995) Blood 86:1794. Es wurde festsgestellt, dass eine Thrombozyten-Aktivierung von der intrinsischen Tenase weitgehend unabhängig ist.
Insgesamt zeigen die Beispiele, dass eine vollständige Thrombozytenaktivierung und eine langsame Fibrinogenbildung mit der Beschreibung der Gerinnung der Blutungszeit bei Wunden von Hämophilie-Patienten korrelieren; und wenn der primäre Thrombozytenstopfen keine normale Fibrinstabilisierung erfährt, führt dies zu einem brüchigen Gerinnsel, das schließlich reißt. Hovig T., et al. (1968) Am J Pathol 53:355, 1968; und Sixma JJ, van den Berg A (1984) Br J Haematol 58:741.
Die Beispiele 8 und 9 zeigen auch die Abhängigkeit von Faktor XI, wenn TF-Konzentrationen unter 25 pM verwendet werden. Dies zeigt an, dass Blut Komponenten enthält um eine biologisch ausreichende Faktor XIa-Aktivität bei einer physiologisch relevanten Zeitskala zu erzeugen. Außerdem beschreiben die Beispiele nicht nur die Thrombinbildung und Fibrin-Umwandlung, sondern auch eine Thrombozyten- und Co-Faktor(Faktor V)-Aktivierung. Ferner stellen die Beispiele die ersten Resultate bereit, in denen Thrombozyten und andere Blutzellen als Prokoagulansoberfläche verfügbar sind. Im Vergleich zu Plasmagerinnungs-Studien an exogenen Lipiden (siehe Bespiele 3-6) liefern diese Vollblut-Studien eine Beschreibung der Verfahren an endogenen Blutzellen während der Gerinnungsreaktion.
Die Beispiele 8 und 9 erstrecken diese Betrachtungen auf Thrombin, Faktor Va und Thrombozyten in Hämophilie C-Blut. Im Gegensatz zu den Resultaten für Hämophilie A bei 25 pM TF wurde die Gerinnung in Hämophilie C-Blut kaum beeinträchtigt. Die Gerinnung war in Hämophilie C- und in normalen Experimenten identisch; in der Propagationsphase gab es eine explosionsartige Thrombinerzeugung. Der Ersatz von Faktor XI erhöhte die Thrombinerzeugung nach der Gerinnungszeit moderat, aber alle anderen Produkte der Reaktion (Faktor V-Aktivierung, Osteonectin-Freisetzung aus aktivierten Thrombozyten und FPA) wurden durch dass Vorliegen oder das Fehlen von Faktor XI nicht beeinträchtigt. Eine Verringerung der Initiatorkonzentration auf 5 pM verlängert die Initiierungsphase der Hämophilie C-Blutgerinnung um 4,6 Minuten gegenüber normal, und Faktor XI-Ersatz verkürzt diese Gerinnungszeit um nahezu 6 Minuten.
Die Resultate geben an, dass eine verschlechterte Koagulation bzw. Gerinnung bei Hämophilie C nur bei geringeren Initiatorkonzentrationen als denen, die für eine verschlechterte Gerinnung bei Hämophilie A beobachtet wurden, auftritt. Darüber hinaus zeigen die Resultate, dass bei Hämophilie C die maximalen Thrombinbildungsraten abnehmen, wenn Gewebefaktor von 25 pM auf 5 pM verringert wird. In normalem Blut, wie auch in Hämophilie C-Blut mit Faktor XI-Ersatz, wurde jedoch eine solche Abnahme bei der Thrombinbildung nicht beobachtet. In der Tat wurde eine Erhöhung detektiert: Von 61 und 85 nmol TAT/l/min in normalen und Ersatz-Experimenten unter Verwendung von 25 pM TF auf 110 bzw. 119 nmol TAT/l/min mit 5 pM TF. Diese Beobachtungen zeigen, dass Faktor XI eine zunehmend bedeutende Rolle beim Supplementieren von Prothrombinase-Level spielt, wenn die Initiatorkonzentration verringert wird.
Die Resultate korrelieren mit der klinischen Schwere der Krankheiten. Mit 25 pM TF bei Hämophilie A werden Gerinnung und Produktbildung durch Defiziens an Faktor VIII messbar beeinträchtigt. Umgekehrt scheint Faktor XI-Defiziens nur geringe Folgen für eine Gerinnung mit 25 pM TF zu haben. Nur wenn die Initiatorkonzentration unter 25 pM fällt, wird die Reaktion gegenüber dem Vorliegen von Faktor XI empfindlich. Selbst bei 5 pM TF ist jedoch die Thrombinerzeugung nicht abladiert, wie bei Faktor VIII-Defizienz mit 25 pM TF, was mit der klinischen Beobachtung in Übereinstimmung steht, dass Hämophilie C eine weniger schwere Krankheit als Hämophilie A ist.
Die 6A-6C werden wie folgt erläutert: Unter Verwendung von 5 pM TF wurde eine Gerinnung in normalem Blut und Hämophilie C-Blut initiiert (siehe Methoden; Rand, M.D. et al. (1996) oben, mit und ohne Faktor XI-Ersatz (1 E/ml Blut)). Die Zeitabläufe für TAT werden bereitgestellt: (A) nach Immunoassay-Analyse von gequentschten Proben aus Normalblut (ausgefüllte Kreise), Hämophilie C-Blut (nicht-ausgefüllte Kreise) und Hämophilie C-Blut mit Faktor XI-Ersatz (nicht-ausgefüllte Quadrate). Die Gerinnungszeiten für die Experimente und die Kontrollröhrchen sind wie in Tabelle 1 angegeben und werden durch Pfeile gekennzeichnet: für Blut von einem normalen Donor (Pfeil a), Hämophilie C-Donor (Pfeil c) und Hämophilie C-Donor mit Faktor XI-Ersatz (Pfeil b, 1 E/ml). Zusätzlich zu TAT werden für FPA (B) und Thrombozyten-Osteonectin (C) Profile bereitgestellt. (Symbole und Gerinnungszeiten sind wie in A).
Die 7A und B werden wie folgt erläutert: Die Diagramme zeigen eine Faktor Va-Bildung während der Gerinnung von normalem Blut und Hämophilie C-Blut mit 5 pmol/l Initiator, mit und ohne Ersatz. Für die in 6 beschriebenen Experimente wurde die Analyse der Faktor V-Aktivierung durch Immunblotting durchgeführt. Profile, die die Faktor Va-schwere Kette (A) und -leichte Kette (B) verfolgen, wurden durch densitometrische Analyse, wie es unten diskutiert wird, erstellt. Die Zeitverläufe sind für die Bildung der schweren und leichten Ketten in normalem Blut (nicht-ausgefüllte Kreise) und in Hämophilie (C)-Blut (Patient C2) mit (nicht-ausgefüllte Quadrate) und ohne (nicht-ausgefüllte Dreiecke) Faktor XI-Ersatz angegeben. Die Gerinnungszeiten sind wie in Tabelle 1 und 5, und die Kurven wurden mit der Hand durch die Punkte gezeichnet.
Beispiel 9 zeigt, dass, obgleich der Assay bei TF-Konzentrationen (25 pM) durchgeführt wird, dieser für Faktor XI nicht empfindlich ist.
Die folgenden Materialien und Methoden wurden in den Beispielen 1-9 je nach Bedarf verwendet:
1. Herstellung von Gewebefaktor/Lipid-Reagens:
Rekombinanter humaner Gewebefaktor (Baxter-Hyland Health Care, Charge Nr. HY8003) in 1,2 % Vol./Vol. Octyl-β-D-glucosid wurde in kleine unilamellare Vesikel aus PSPC (25 Mol-% PS/75 Mol-% PC, 10 μM Gesamtlipid) in HBS (HEPES, 20 mM; NaCl, 150 mM; pH 7,4) plus Calcium (2 mM) für 30 Minuten bei 37°C relipidiert. Anschließend wurde konzentrierte Saccharose (60% G/V) zu dem Relipidierungsgemisch bis zu einer Endkonzentration von 10% gegeben um die Vesikel für eine Langzeitlagerung im Gefrierschrank (bis zu 12 Monaten) zu stabilisieren. Aliquots des Reagenses (200 μl) wurden lyophilisiert und bei –20°C gelagert, die dann vor jedem Experiment 60 Minuten rehydratisiert wurden und mit reproduzierbaren Resultaten eingesetzt wurden. Siehe Barenholz, Y. et al. (1997) Biochem. 16:2806; und Lawson, J.H. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:23357.
2. Assay auf Prothrombin-Zeit (PT) und aktivierte Partial-Thromboplastin-Zeit (aPTT):
Automatische PT- oder automatische aPTT-Assays wurden mit einem Patienten oder normalem Plasma (100 μl) im Hämatologie-Labor bei Fletcher-Allen durchgeführt, wobei entweder ein ACL Futura-Koagulometer (Instrumentation Laboratories) oder ein automatischer Koagulometer, Modell ST4 (Diagnostic Stago) nach den Empfehlungen der Hersteller verwendet wurde.
Für das manuelle PT-Verfahren wurden 100 μl Test-Citratplasma für 30 Sekunden bei 37°C vorerwärmt. Die Reaktion wurde zur Zeit null mit 200 μl Simplastin Excel (Produkt Nr. 52001, Organon Teknika, Durham, NC) initiiert, und die Probe wurde in einem 37°C-Bad geschüttelt, bis ein Blutgerinnsel beobachtet wurde; dieser Zeitpunkt wurde notiert. Manuelle aPTT-Assays wurden in Kunststoffröhrchen (VWR Scientific, Nr. 60818-270) mit 100 μl-Proben aus frischem, gefrorenem, humanem Citratplasma durchgeführt, wobei der manuelle "tilt-tube"-Ansatz verwendet wurde, der vom Hersteller des PT- oder aPTT-Reagenses beschrieben wurde. Wenn die Wirkung von Puffer oder Antikörper untersucht wurde, wurden nicht mehr als 5 μl des Additivs mit 95 μl Plasma vermischt um Verdünnungsfehler auf ein Minimum zu beschränken.
3. Untersuchung der Kontakt-Inhibitor-Aktivität
Die Aktivität von Kontaktwegs-Inhibitoren, die in diesen Experimenten verwendet wurde, wurde durch die Verlängerung der aPTT in normalem Plasma nach Zusatz des Reagenses bestimmt. Der Assay auf aktiviertes partielles Thromboplastin (aPTT) wurde manuell mit Testplasma, das 90 μl gesammeltes, normales Citratplasma (FACT-Standard-Plasma, George King Biomedical, Highland Park, K.S.) mit 10 μl Puffer oder Testlösung (z.B. Corn-Trypsin-Inhibitor-Extrakt) enthielt, durchgeführt, wobei die Instruktionen befolgt wurden, die vom Hersteller des aPTT-Reagenses geliefert wurden (automatisches APTT-Reagens, manuelles Verfahren, Produkt Nr. 35513, Organon Teknika Corp., Durham, NC). Die Inkubation des Testplasmas mit dem automatischen APTT-Reagens (100 μl) wurde bei 37°C für genau 3 Minuten vor Initiierung durch Zusatz von Calcium (100 μl 25 mM CaCl₂) durchgeführt.
4. Herstellung des Corn-Trypsin-Inhibitors:
Für diese Experimente wurde Hageman-Faktor (d.h. Faktor XIIa)-Inhibitor aus Mais (Corn-Trypsin-Inhibitor, CTI) nach dem Verfahren von Hojima et al., oben, mit wenigen Modifikationen gereinigt. Trockener Perlmaissamen (3 kg) wurde von einem Lebensmittelladen am Ort erhalten und wurde wiederholt extrahiert, bis keine weitere Verlängerung der aPTT in normalem Plasma beobachtet wurde (siehe das obige Verfahren "Analyse der Kontakt-Inhibitor-Aktivität). Dieses große Extraktvolumen (etwa 6-8 l) wurde in einem Konzentrator, Amicon Modell LP-1, der mit einem RA-2000-Tank und einer S1Y3-Spiralkartusche verbunden war, auf ein Grenzvolumen von etwa 400 ml konzentriert. Es wurde eine Acetonpräzipitation durchgeführt, wie es in der Literatur beschrieben ist, und das resuspendierte Material wurde auf eine DEAE-Sephacel-Säule (2,5 × 60 cm) aufgetragen, wie es von Hojima et al., oben, beschrieben wurde. Der Hauptpeak der Inhibitor-Aktivität wurde gesammelt und auf eine zweite Säule (2,5 × 94 cm) aus Sephadex G-50 aufgetragen, und die schließlich gesammelte Fraktion wurde unter Verwendung eines Rühr-Zellkonzentrators, Amicon Modell 8050 (YM-5-Filter, Ausschlussgrenze Molekulargewicht von 3.000), mit vier Austauschern in Hepes-gepufferte Salzlösung (HBS; enthaltend Hepes, 20 mM; NaCl, 150 mM; pH 7,4) konzentriert. Das Endprodukt zeigte durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Gradientengel mit 8-18%) im Wesentlichen eine einzelne Bande in der Nähe eines Molekulargewichts von 12.000 und wurde ohne weitere Reinigung bei –20°C gelagert, da Isoformen dieses Inhibitors alle ein ähnliches Inhibitorpotential wie Faktor XIIa aufweisen. Siehe Hojima et al., oben.
5. Faktor XI-Präparationen
Unter Verwendung eines Faktor Xa-Amplifikations-Assays haben andere Forscher, Von dem Borne, P.A.K. (1994) Thromb Haemost. 72:397, und Von dem Borne, P.A.K. et al., oben, gezeigt, dass Spuren von kontaminierendem Faktor XIa in Faktor XI-Präparationen (pM nach unten zu fM) die Level der intrinsischen Tenase signifikant beeinträchtigen können, was zu künstlich hohen Leveln der Faktor Xa-Bildung führt. Faktor XI-Präparationen wurden routinemäßig behandelt um Spuren von Faktor XIa zu entfernen. Konzentrierte Faktor XI-Stammlösungen (etwa 300-350 E/mg, ungefähr 3-5 mg/ml) wurden in eine Slide-A-Lyzer-Dialysekassette (Molekulargewichts-Cutoff: 10.000; Pierce Chemical, Rockford, IL) gefüllt und zunächst mit FPRck (10 μM, 30 Minuten, 25°C) in HBS behandelt. Nach Dialyse gegen HBS (2 Wechsel, 2 h, 4°C) wurde eine zusätzliche Behandlung mit DFP (2 mM) für einen 15-minütigen Zeitraum durchgeführt. Eine abschließende Analyse wurde gegen HBS (2 × 2 h, 4°C) durchgeführt, und die Faktor XI-Stammlösung wurde in Aliquots in Non-Stick-Mikrozentrifugenröhrchen mit Kappen (VWR Scientific, Westchester, PA) verteilt, in den verkappten Röhrchen durch Eintauchen in ein Trockeneis/Methanol-Bad schnell gefroren und bei –70°C gelagert. aPTT-Gerinnungs-Assays zeigten, dass die spezifische Aktivität von Faktor XI durch diese Behandlungen nicht beeinträchtigt wurde. Nach Behandlung mit FPRck und DFP wurde eine Analyse der Faktor XIa-Restaktivität durchgeführt, wobei ein Aminonaphthalinsulfonamid-Derivat (Butenas, S. et al. (1997) J Biol Chem. und Butenas, S. et al (1992) Biochem. 31:5399) des Tripeptids D-Leu-L-Pro-L-Arg mit k_cat/K_m = 7,10 × 10⁵ M^–1 s^–1 verwendet wurde. In Faktor XI-Präparationen (typischerweise 200 nM) lagen die Faktor XIa-Konzentrationen unter den Grenzen des Assays (<100 fM Faktor XIa-Aktivität). Daher war bei Plasmakonzentra tionen an Faktor XI (25-30 nM) die potentielle Kontamination durch Faktor XIa kleiner als 12,5 fM. Wenn Faktor XI und Corn-Trypsin-Inhibitor in Abwesenheit von TF zugesetzt wurden, wurde bei Faktor XI-defizientem Blut keine Gerinnung beobachtet (>20 Minuten). Als abschließende Vorsichtsmaßnahme für die Ersatz-Experimente unter Verwendung einer sehr geringen TF-Konzentration (5 pM) wurde ein Inhibitor für humane α₁-Protase (0,5 mg/ml, 9,6 μM) zu den Faktor XI-Präparationen (1,5 mg/ml, 9,4 μM) gegeben. Bolton-Maggs, P.H.B. et al. (1992) Thromb Haemost. 67:314. Der α₁-Protease-Inhibitor, der dem Blut mit diesen Faktor XI-Präparationen zugesetzt wurde, war im Vergleich zu dem bereits vorliegenden Inhibitor-Plasmalevel (~47 μM) unbedeutend.
6. Assay auf Gewebefaktor-Abhängigkeit im Faktor XI-defizienten Plasma
Relipidiertes Gewebefaktor-Reagens (siehe oben) wurde rehydratisiert (200 μl) und mit HBS/Calcium (2 mM) verdünnt, wobei ein Stammreagens erhalten wurde, das 552 pM TF und 1,10 μM PCPS enthielt. Diese anfängliche Stammlösung wurde weiter mit PCPS (1,10 μM) in HBS/Calcium (2 mM) verdünnt um einen Satz an Arbeits-TF-Stammkonzentrationen im Bereich von 17,25 bis 552 pM TF bei konstanter Lipidkonzentration zu erhalten. Der Assay wurde nach dem folgenden Protokoll durchgeführt. In ein Polystyrol-Röhrchen (12 × 75 mm,) wurden 200 μl humanes Plasma (XI-defizient, <1% XI:C; oder XI-defizient mit Faktor XI-Ersatz mit 3,5 μg/ml, 100 E/dl) und 10 μl Corn-Trypsin-Inhibitor (1,15 mg/ml in HBS) gegeben. Nach 30 Sekunden Äquilibrierung bei 37°C wurden 10 μl der Arbeits-TF-Stammlösung zugesetzt, worauf unverzüglich die Zugabe von 10 μl 390 mM CaCl₂ in Wasser folgte. Nach Zusatz des Calciums wurde eine Stoppuhr gestartet, und das Röhrchen wurde im 37°C-Wasserbad geschüttelt, bis Fibrinstränge oder ein festes Gerinnsel identifiziert wurden; zu diesem Zeitpunkt wurde die Zeit genommen.
7. Gerinnung in Vollblut
Das verwendete Protokoll ist eine Modifikation desjenigen von Rand, M.D. et al., oben, das unter der Aufsicht eines der Autoren (R.F.B.) am Clinical Research Center, Fletcher-Allen Health Care (Burlington, Vermont) durchgeführt wurde. Die Gerinnung wurde in frisch entnommenem, nicht-Antikoagulans-behandeltem Vollblut in 32 Polystyrol-Kulturröhrchen mit Kappe durchgeführt, wie es bereits beschrieben wurde, außer dass zwei Serien pro Experiment durchgeführt wurden (16 Röhrchen/Serie). Die Reagentien wurden in folgenden Mengen eingefüllt: Corn-Trypsin-Inhibitor (alle Röhrchen, so dass 50 μg/ml Blut erhalten wurden); relipidierter TF (Lipid:Protein = 2.000) in HBS mit 5 mM Calcium (alle Röhrchen in jeder Serie, außer dem Phlebotomie-Kontrollröhrchen, so dass 25 oder 5 pM TF/ml Blut erhalten wurden); Faktor VIII oder Faktor XI (alle Röhrchen, nur Ersatzserie, so dass 1 E/ml erhalten wurde); äquivalentes Volumen Faktor VIII/XI-Verdünnungspuffer (HBS, pH 7,4, alle Röhrchen, nur Defiziensserie). In jedes Röhrchen wurden nicht mehr als 45 μl Reagens gefüllt. Das Null-Röhrchen jeder Serie wurde mit 1 ml Inhibitor-Cocktail (enthaltend 50 mM EDTA und 20 mM Benzamidin-HCl in HBS, pH 7,4) und 10 μl 10 mM FPRck (verdünnt in 0,01 M HCl) vorbehandelt.
Patienten-Blut oder normales Donor-Blut wurde nach einem Protokoll, das vom Human Studies Committee at the University of Vermont anerkannt war, und wie es von Rand, M.D. et al., oben, beschrieben worden war, durch Venenpunktion entnommen. Die Gerinnung wurde durch Abgabe in die mit Reagens beladenen Röhrchen und unter periodischem Quenchen der Röhrchen mit Inhibitor-Cocktail und FPRck, wie es oben beschrieben wurde, initiiert. Es wurden zwei Serien gequenchter Proben erhalten, bei denen das Fortschreiten der Reaktion bis zu 20 Minuten nach Initiierung verfolgt wurde; aus jedem Röhrchen (60 μl Überstand, 190 μl 2% SDS-PAGE-Probenlösung, Rand, M.D. et al., oben, genau 5 Minuten bei 98 +/– 2°C erhitzt) wurden sowohl reduzierende (1% β-Mercaptoethanol), als auch nicht-reduzierende SDS-PAGE-Proben hergestellt. Ein Aliquot aus jedem Röhrchen wurde filtriert um zelluläre Verunreinigungen für Osteonectin-Assays zu entfernen (200 μl, 0,2 μm Acro Disc, Gelman Sciences, Ann Arbor, MI). Das verbleibende Serum und die verbleibenden Zellpellets/Gerinnsel wurden als Aliquots in Röhrchen mit Schraubverschluss gegeben, gefroren und bei –20°C zur Immunoblot- oder Immunoassay-Analyse gelagert.
8. Immunoassays und Western-Analyse
Handelsübliche ELISAs zur Fibrinopeptid A (FPA)-, Thrombin-Antihrombin III (TAT)- und Thrombozyten-α-Granulum-Freisetzung (Osteonectin) wurden nach Protokollen der Hersteller durchgeführt, wobei Korrekturen zur Probenverdünnung durch zugesetzte Quenchlösung (1,00 ml) und Hämatokrit (typischerweise 40% des gesamten Blutvolumens) vorgenommen wurden. Zur Analyse von Faktor Va wurden Proben an SDS-PAGE nach Laemmli, U.K. (1970) Nature 227:680, modifiziert durch unser Labor Rand, M.D., et al. (1996), oben, getrennt. Getrennte Gele wurden zur Analyse der schweren Kette und der leichten Kette laufen gelassen. Gele wurden mit einem vorgefärbten Molekulargewichts-Standardgemisch (14-200 kDa) und verdünnten Standards (3 Proben) beladen, wodurch ein Vergleich und eine quantitative Bestimmung der Analytenmenge horizontal an den Immunoblots möglich war. Eine Übertragung vom Gel auf Nitrocellulose (BioRad, Hercules, CA) wurde für 1,5-3 Stunden mittels eines SDS-freien Tank-Transferverfahren durchgeführt, wie es in der Literatur beschrieben ist (Towbin H. et al. (1979) Proc Natl Acad Sci. (USA) 76: 4350, und Gallagher, S., et al. (1993) Current Protocols in Molecular Biology. J. Wiley and Sons. 10.8.1.), wobei eine anschließende Immunoblot-Analyse nach Rand, M.D., et al. (1996), oben, durchgeführt wurde.
Immunoblotbilder auf Kodak X-Omat-Film wurden an einem Hewlett-Packard ScanJet 4C/T gescannt. Eine Analyse der TIFF-Dokumente erfolgte an einem Power Macintosh 9500/200-Computer unter Verwendung des allgemein zugänglichen NIH-Bildverarbeitungsprogramms (v. 1,60, Frühjahr 1994, entwickelt am US National Institutes of Health, und im Internet unter der Adresse zippy.nimh.nih.gov von FTP erhältlich oder auf Diskette vom National Technical Information Service, Springfield, VA, Teile-Nr. PB95-500195GEI, erhältlich). Die Dichte der interessierenden Banden wurde über Standardkurven, die durch Laufenlassen von Proben bekannter Konzentrationen an demselben Gel erhalten worden waren, in Konzentra tionen umgewandelt. Aus diesen Werten wurden Konzentrationen im Vergleich zum Maximum bestimmt.
9. Materialien
Rekombinanter humaner Gewebefaktor und rekombinanter Faktor VIII wurden als Geschenke von Dres. Roger Lundblad und Shu-Len Liu (Hyland Div., Baxter Healthcare Corp., Duarte, CA) bereitgestellt, und humaner Faktor XI war ein Geschenk von Dr. Richard Jenny (Hematology Technologies, Inc., Essex Junction, VT). Trypsin-Inhibitor aus Mais wurde von Fluka (Ronkonkoma, NY) bezogen. 1-Palmitoyl-2-oleoylphosphatidylserin (PS) und 1-Palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholin (PC) wurden entweder von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) oder Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL) bezogen. D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-Chlormethylketon (FPRck) wurde als Geschenk von Hematology Technologies, Inc. (Essex Junction, VT) erhalten oder von Calbiochem, LaJolla, CA, bezogen. Siehe Kettner C., et al. (1979) Thromb Res 14:969, 1979. Diisopropylfluorphosphat (DFP) wurde von Sigma Chemical Co. erhalten, in wasserfreiem Isopropanol auf Arbeitskonzentration (1 M) verdünnt und bei –20°C gelagert. Gesammelte standardisierte, normale (FACT, Charge D12S1) und Faktor XI-defiziente (Charge GK1122-N17P1)-Plasmen wurden von George King Biomedical (Overland Park, KS) erhalten. Thromboplastin (Simplastin Excel) und aPTT (Activated partial thromboplastin time Automated APTT)-Reagentien wurden von Organon Teknika (Durham, NC) bezogen. Die folgenden Analyten wurden unter Verwendung von ELISA-Kits, die von den Herstellern erhalten worden waren, bestimmt: Thrombin-Antithrombin III (Enzygnost TAT, Behring, Westwood, MA), Fibrinopeptid A (Asserachrom FPA, Diagnostica Stago/American Bioproducts, Parsippany New Jersey).
Der Assay zur Bestimmung des Thrombozyten-Osteonectin wurde als Geschenk von Dr. Richard Jenny (Hematologic Technologies, Inc., Essex Junction, VT) bereitgestellt und wurde nach den Instruktionen des Herstellers eingesetzt.
Ein monoklonaler muriner Antikörper (αFVa_HC#17, 5-10 μg/ml), der ein Epitop zwischen den Resten 307 und 506 in der schweren Kette (heavy chain = HC) von Faktor V/Va erkennt (Kalafatis, M. (1995) J Biol Chem. 270:4053), wurde nach früher veröffentlichten Verfahren hergestellt; Kalafatis, M. et al. (1996) Blood 87:4695. Die Reaktivität und Spezifität dieses Antikörpers in Western-Analysen war ähnlich denen eines früher Beschriebenen (αFVa_HC#6), Church, W.R. et al. (1988) J Biol Chem. 263:6259. Ein zweiter muriner monoklonaler Antikörper, der gegen die leichte Kette des Co-Faktors gerichtet war, (αFVa_LC#9, 5-10 μg/ml), wurde, wie von Foster, W.B. (1983) Blood 61:1060, beschrieben, hergestellt.
10. Humane Donoren
Alle Donoren, normale und defiziente, wurden angeworben und entsprechend einem Protokoll, das von der University of Vermont Human Studies Committee genehmigt worden war, beraten. Normale Personen (Alter im Bereich von 22-36) wurden so ausgewählt, dass Donoren mit einer persönlichen oder familiären Thrombose/Hämorrhagie-Geschichte oder regel mäßiger Aspirin- oder Arzneimittelverwendung ausgeschlossen wurden. Alle Personen wiesen Werte im normalen Bereich für PT (11,6-13,8 Sekunden), aPTT (27-36 Sekunden), Fibrinogen und Thrombozytenzahlen (172.000-376.000 mm³) auf. Im Anschluss an jedes Kontrollexperiment wurden für die normalen Donoren die Faktor XI-Level untersucht (Bereich 95119 E/dl), die im akzeptierten Bereich für einen normalen Erwachsenen (75-130 E/dl) fielen. Kitchens, C.S. (1991) Semin Thromb Hemost. 13:86.
Der in diesen Studien eingesetzte Hämophilie A-Donor war ein 46 Jahre alter Mann mit schwerer Faktor VIII-Defiziens (VIII:C < 0,5%), der eine lebenslange Tendenz zur Blutung aufwies. Der Proband litt an wiederkehrenden Hämarthrosen in den Ellenbogen, Knien und in den Sprunggelenken und hatte einen begrenzten Bewegungsbereich unter Schmerzen in den Schultern, Ellenbogen und Sprunggelenken; er hatte über einen Zeitraum von zweieinhalb Wochen vor dem Experiment keine Ersatztherapie erhalten. Wie es bei Hämophilie A-Patienten üblich ist, denen humane Produkte übertragen worden waren, hatte der Patient eine CDC-Klasse A-III HIV-Infektion entwickelt. Eine Behandlung mit Indinevir führte zu Thrombozytopenie, die teilweise nach Unterbrechung der Arzneimittelbehandlung aufgelöst wurde. Die Thrombozytenzahl war am Tag des Experiments 97.000 plts/mm³, fiel aber dann ab (Dezember 1995); es gab keinen Beweis für Antikörper gegen Thrombozyten. Gängige Medikationen sind Trimethoprim-Sulfamethoxazol, Zidovudin, Lamivudin und Zalcitabin.
Es wurden drei Hämophilie C (Faktor XI-defiziente)-Donoren untersucht; hier werden Resultate mit zwei dieser Patienten beschrieben. Patient A ist eine 53 Jahre alte Frau ohne Blutungs-Familienanamnese. Sie wies leichte Prellungen auf und zeigte häufig Nasenbluten, aber keine Menorrhagie. Mit 33 Jahren hatte sie eine chirurgische Korrektur eines anormalen Nasenseptums wegen des Nasenblutens, hatte danach aber weiterhin mildes Nasen- und Zahnfleischbluten. Im Alter von 48 wurde festgestellt, dass sie während einer voroperativen Untersuchung auf Osteoarthritis an der linken Hüfte eine verlängerte aPTT hatte. Die Patientin hatte eine PT von 12,4 Sekunden und eine verlängerte aPTT (Faktor XI: C = 2%). Faktor XII, Fibrinogen und Thrombozytenzahlen lagen im normalen Bereich; es gab keinen Beweis für einen Inhibitor. Die Patientin hatte eine erfolgreiche Hüftoperation nach Ersatz mit frischem, gefrorenem Plasma um die aPTT zu normalisieren, und hatte keine Komplikationen.
Patient B ist ein 49 Jahre alter Mann mit einer persönlichen Anamnese episodischer Blutungen, aber ohne Hämorrhagie-Familienanamnese. Mit 8 Jahren hatte er eine Tonsillektomie, die infolge übermäßiger Blutung einen zusätzlichen Tag Krankenhausaufenthalt erforderte, und im Alter von 10 Jahren hatte er nach einer Zahnextraktion zwei Tage Blutsickern. Eine Fraktur des Schlüsselbeins im Alter von 25 Jahren war von keiner signifikanten Blutung begleitet. Nach seinem 38. Geburtstag wurde er auf eine mögliche Blutungsstörung untersucht; diese Untersuchung ergab eine PT von 11,1 Sekunden, eine verlängerte aPTT (Faktor XI: C = 10%), eine Blutungszeit von 4,5 Minuten und Konzentrationen an Faktor VIII, IX und XII im normalen Bereich (90-103%, ohne Beweis für einen Inhibitor). Zum Zeitpunkt des Experiments zeigte Patient B auch eine Thrombozytenzahl (145.000/mm³), die leicht unter dem Normalbereich (172-376.000/mm³) war; diese Thrombozytenzahl wurde für diese Person bei zwei getrennten Gelegenheiten beobachtet.
BEISPIEL 10 – Universelle Hämostase-Behandlung unter Verwendung eines Assays auf ausgedehnte Plasma-Prothrombin-Zeit (Extended Plasma Prothrombin Time (xpPT))
Der xpPT-Assay wurde wie folgt entwickelt.
A. Assay-Entwicklung
Die Zeit für eine spontane Koagulation bzw. Gerinnung von recalcifizierten Citratplasmaproben, entweder mit Corn-Trypsin-Inhibitor oder einem inhibitorischen monoklonalen Antifaktor XI-Antikörper, wurde beurteilt, wie es in 8 gezeigt ist. Das Vorliegen des Antikörpers oder des Corn-Trypsin-Inhibitors in Konzentrationen von ≥ 100 μg/ml produzierte eine stabile Ausdehnung der zufälligen Plasmagerinnungszeit. Anschließende Studien zeigten, dass der Zusatz von Corn-Trypsin-Inhibitor mit 100 μg/ml frisches Blut in Citrat mit anschließender Plasmaherstellung oder das Auftauen der Standard-11 mM-Citratplasmaprobe in Gegenwart von 100 μg/ml Korntrypsin-Inhibitor (Endkonzentration) Proben mit äquivalenter Qualität für weitere Analysen lieferte.
8 zeigt insbesondere die Beurteilung der spontanen Gerinnungszeit von Citratplasma nach Endcalcifizierung in Gegenwart verschiedener Konzentrationen, entweder von Corn-Trypsin-Inhibitor (CTI) oder monoklonalem Antifaktor XI-Antikörper (α-fXI). Eine Unterdrückung des Kontaktwegs wird bei Konzentrationen von ≥ 100 μg/ml für jedes Reagens beobachtet.
Es wurden verschiedene Konzentrationen an Gewebefaktor, Phospholipiden und Ca++ mit dem Ziel durchgemustert, den xpPT-Assay zu entwickeln. Eine Titration der Gerinnungsaktivität bei steigenden Konzentrationen an Phospholipid und CaCl₂ bei 0,5 nM Gewebefaktor sind in den 9 und 10 dargestellt. Die Konzentrationsintervalle für diese Reagentien zur Produktion reproduzierbarer Gerinnungszeiten, innerhalb denen ein Plateau ohne Empfindlichkeit auf geringe Variationen der Reagentien erreicht wird, ist in den Assayresultaten gezeigt.
Das Resultat war ein Standardsystem der Gerinnungsbeurteilung, bei dem eine genommene Plasmaprobe in 11 mM Trinatriumcitrat gefroren wurde (Standard-Sammelsystem eines Pathologie-Labors), in Gegenwart von 100 μg/ml Corn-Trypsin-Inhibitor (Endkonzentration) aufgetaut wurde und der Assay schließlich durchgeführt wurde, wie es im Abschnitt Materialien und Methoden bzw. Verfahren unten beschrieben wird. Die Endkonzentrationen in der Gewebefaktor-Gerinnungsprobe umfassten 100 μg/ml CTI, 30 mM CaCl₂, 50 μM 75% PC:25 PS-Vesikel und 0,5 nM-Gewebefaktor. Dieses Verfahren wird als XpPT-Assay bezeichnet.
9 zeigt eine Titration bei 0,5 nM TF, 50 μM PCPS mit CaCl₂.
Konzentrationen über 20 mM sind ausreichend um den Assay von variablem Ca++ unabhängig zu machen. Außerdem zeigt 10 eine Phospholipid (75% PC:25% PS)-Titration der XpPT. Sowohl hohe als auch niedrige Konzentrationen verlängern die XpPT. Konzentrationen zwischen 50 und 75 μM liefern vernünftig stabile Resultate.
BEISPIEL 11 – Verwendung des Assays auf verlängerte Plasma-Prothrombin-Zeit (Extended Plasma Prothrombin Time (=xpPT)) zur Gerinnungsüberwachung
A. Empfindlichkeit des Assays gegenüber normaler Gerinnung
Mit Plasmaproben unter Verwendung von Plasma, das 25 Personen, die normale Rot-Kreuz-Blutspender waren, entnommen worden war, wurde eine Normalwert-Studie durchgeführt. Das Blut wurde an vier bis fünf Zeitpunkten für jede Person über einen Zeitraum von acht Monaten gesammelt. Die Werte der XpPT für diese Personen sind in 11 dargestellt, wobei die Analysen der Daten in 14 präsentiert werden. Bei 103 durchgeführten Assays betrug die mittlere Gerinnungszeit 80,78 Sekunden, und zwar mit einem cv-Wert von etwas über 3%. Es ist äußerst beachtenswert (12 und 13), dass die CVi-Werte bei einer Person, und die CVg-Werte zwischen Personen unter Verwendung dieses Assays fast die gleichen sind, was angibt, dass eine Messung an einem einzigen Punkt für irgendeine Person gültig sein wird um die Person mit dem Rest der Gruppe zu vergleichen.
11 zeigt insbesondere eine Datensammlung, die normales Plasma vom Roten Kreuz, das von 25 Freiwilligen bei verschiedenen (4-5) Intervallen über einen achtmonatigen Zeitraum erhalten worden war, verwendete. Es wurden doppelte Analysen (nicht-ausgefüllte und ausgefüllte Quadrate) an getrennten Daten durchgeführt und sind angegeben. 12 zeigt XpPT-Zeiten für die Proben von Personen, die von 25 Plasma-Donoren erhalten wurden, wobei die Proben zu verschiedenen (3-4) Zeitpunkten erhalten wurden.
Zusätzlich zeigt die Tabelle in 13 die Assay-Standardisierung mit 0,5 nM Gewebefaktor in der XpPT-Normalwert-Studie mit Plasma von 25 Personen für insgesamt 103 Plasmaproben. Der Variationskoeffizient (CVa) für die Gesamtanalyse war 3,17%. Der Variationskoeffizient der Personen (CVi) ist 5,42%, während die Variation von Person zu Person (CVg) 5,65% ist. Die Werte stehen im Gegensatz zu ähnlichen Variablen bei einer neueren Cholesterin-Studie (Hayes). 14, auch eine Tabelle, zeigt Gerinnungszeitmessungen im XpPT-Assay für defiziente Plasmen, gemessen mit 12,5 pM und 0,5 nM Gewebefaktor.
B. Empfindlichkeit des Assays auf therapeutische Mittel
Um die Wirkungen von Heparin zu untersuchen, wurden 0-3 E/ml (10.000 E/ml Stammlösung) in normales CTI (100 μg/ml)-Citratplasma titriert. In Reaktionsküvetten wurden 100 ml Plasma, 10 μl 300 mM CaCl₂ (Endkonzentration 30 mM) und 1,3 l 3,72 mM PCPS (Endkonzentration 50 μM) gegeben. Es wurden geeignete Volumina Heparin (10.000 E/ml) zugegeben um eine Endkonzentration von 0,25, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 und 3,0 E/ml in 100 μl Plasma zu erhalten. Die Reaktion wurde initiiert, indem 10 μl 5 nM rTF zugesetzt wurden (0,5 nM Endkonzentration).
C. Empfindlichkeit des Assays gegenüber Thrombozytenfaktor 4 (PF4)
Um die Wirkungen von Thrombozytenfaktor 4 (PF4) auf mit Heparin behandeltes Plasma zu untersuchen, wurde normales Patienten-Plasma (FACT-Plasma, George King Biomedicals) mit 3 E/ml Heparin und 100 μg/ml CTI behandelt. Die Gerinnungszeiten wurden in diesem Plasma mit 0-60 E/ml Heparin und 100 μg/ml CTI gemessen. Die Gerinnungszeiten in diesem Plasma wurden mit 0-60 E/ml PF4 (3,1 mg/ml Stammlösung mit 120 Einheiten/mg) gemessen.
D. Empfindlichkeit des Assays für Gewebefaktor-Stoffwechselweg-Inhibitor (TFPI)
Der Assay wurde entsprechend dem früher diskutierten Vorgehen angewendet, außer dass TFPI (50 μg/ml Stammlösung) bei einer Endkonzentration von 5,0, 10,0, 20,0, 60 nM zugesetzt wurde und eine Initiierung mit 10 μl 5,0 nM rTF (0,5 nM) durchgeführt wurde.
BEISPIEL 12 – Messung der Gerinnungszeit von defizientem Plasma unter Verwendung des XpPT-Assays
Es wurden die Gerinnungszeiten für im Handel verfügbare Plasmen, die bezüglich der Faktoren V, VII, VIII und IX (<1,0%) defzient waren, bestimmt. Die Messungen wurden bei 125 pM und 0,5 nM rTF durchgeführt. 14 zeigt den Einfluss verschiedener Plasmadefizientien auf die Gerinnungszeit, die im XpPT beurteilt wurde. Wie aus früheren Analysen der Protime erwartet wurde, verlängern Faktor V-, Faktor VII- und Prothrombin-Defiziens die XpPT, allerdings ist zu erkennen, dass Faktor VIII-, Faktor IX- und Faktor XI-Defiziens auch eine Ausdehnung der XpPT begünstigen.
Die Empfindlichkeit des Assays für Faktor VIII, Faktor IX und Fakaor XI ist von der Konzentration des Gewebefaktors abhängig, welche zur Initiierung des Assays verwendet wird. Unter "Standard-Assay-Bedingungen" (0,5 nM Gewebefaktor) ergeben Faktor VIII- und Faktor IX-Defizienszustände Verlängerungen von mehr als 100 Sekunden für die Gerinnungszeit, die für die in dieser Studie eingesetzte Pool-Plasmaprobe beobachtet wurde. Faktor XI-Defzienz liefert unter allen Umständen nur eine moderate Verlängerung der Gerinnungzeit; dies ist ein Resultat, das mit Beobachtungen bei Vollblut bei relativ hohen Konzentrationen an verwendetem Gewebefaktor übereinstimmt.
BEISPIEL 13 – Korrelation des International Normalized Ratio (INR) zur Gerinnungszeit unter Verwendung des XpPT-Assays
Die Beziehung zwischen den Assaywerten, die in den Beispielen 10-12 oben angegeben wurden, und dem INR für eine Gruppe von 15 Patienten mit moderater Coumadin-Therapie wurde mit 0,1 M Gewebefaktor beurteilt (15). Die in dieser Studie eingesetzten Proben wurden entweder vom Fletcher Allen Medical Center oder aus dem Handel erhalten; eine fast lineare Abhängigkeit der Gerinnungszeit vom INR wird bei einem INR von 1-5 beobachtet. Der Assay ist gegenüber kleinen Variationen beim INR extrem empfindlich, wobei ein INR von 2 eine zweiminütige Verlängerung der Gerinnungszeit erzeugt. Im Vergleich zu normalem Blut (INR, 1,0, 82,5 ± 0,63 [s.e.m.] Sekunden) zeigen Patienten mit einem INR von 2,0 eine Gerin nung bei 212,6 ± 2,2 s und zeigen Pateinten mit einem INR von 4,3 eine Gerinnung bei 610,8 ± 4,2 s.
15 zeigt insbesondere eine Analyse der XpPT-Gerinnungszeit mit 0,1 nM Gewebefaktor für Personen mit Warfarin-Therapie, von denen bestätigt wurde, dass sie verschiedene INRs haben.
BEISPIEL 14 – Standardisierung von Thromboplastin-Reagentien unter Verwendung des XpPT-Assays
Im Gegensatz zu der Standard-Prothrombin-Zeit (PT), die oben diskutiert wurde, trennt die XpPT die Beiträge von Gewebefaktor und Phospholipiden zur Gerinnungsreaktion im Gesamtplasma. Eine Hauptschwierigkeit bei der Standard-Prothrombin-Zeit-Anwendung bei der klinischen Einstellung der Gerinnungshemmung besteht in der "Empfindlichkeit" von Thromboplastin-Reagentien bei der Antikoagulantienbehandlung. Als Folge dieser Variationen wird die komplexe und manchmal unhandliche Technik der Standardisierung von "Thromboplastinen" bezüglich ihres internationalen standardisierten Indexes (ISI) durchgeführt, welcher dann verwendet wird um die Verlängerung der Gerinnungszeit, die mit einer Antikoagulation verbunden ist, unter Verwendung des international normalisierten Verhältnisses (INR) zu standardisieren. Da die bedeutendste Komponente bei der Variation des "Thromboplastins" mit dem Phospholipidgehalt und der Qualität verbunden ist, und da diese Komponente von der Gewebefaktorkomponente des XpPT verschieden ist, ist es möglich, "Thromboplastine" unter Verwendung des XpPT zu normalisieren, d.h. ein relativer ISI ist eins.
Simplastin Excel, Thromboplastin-HS, Thromboplastin-M, Thromboplastin (SIGMA), Thromboplastin-D, Rinderlungen-Thromboplastin (ICN), Thromboplastin-DS und Thromboplastin-DL wurden bei einem INR von 1 durch Titration standardisiert. Für jede Thromboplastin-Quelle waren die verwendeten Volumina in der Gerinnungszeit bis zu einem INR von 4,3 äquivalent und hielten eine nahezu lineare Korrelation aufrecht [16]. Diese Figur zeigt einen Vergleich der XpPT-Gerinnungszeiten verschiedener INR-Plasmen, die mit Thromboplastinen aus verschiedenen Quellen aktiviert wurden, standardisiert auf INR = 1.
BEISPIEL 15 – Empfindlichkeit des XpPT-Assay auf Heparin und Gewebefaktor-Stoffwechselweg-Inhibitor (TFPI)
Die Empfindlichkeit dieses Assays auf Heparin wurde bei einem normalen Patientenplasma (INR, 1) bestimmt. Heparin wurde nach Recalcifizierung in Konzentration von 0 bis 3 E/ml zu Plasma gegeben. Es wurde eine Dosis-abhängige Verlängerung der Gerinnungszeit von 82,0 s auf 516,8 s beobachtet. Um die Wirkungen von TFPI auf die Gerinnungszeit in normalem Patienten-Plasma (INR, 1) zu untersuchen, wurde 0,5 nM TF verwendet. TFPI wurde nach Recalcifizierung in einer Konzentration von 0 bis 60 nM zu Plasma gegeben. Es wurde eine Dosis-abhängige Verlängerung der Gerinnungszeit (88,0 auf 549,7 s) beobachtet.
Die Beispiele 10-15 zeigen, wie ein Assay zur Beurteilung der Gerinnung herzustellen und zu verwenden ist, wie auch Produkt/Vorläufer-Beziehungen in Blut oder einem Blutpro dukt, z.B. Plasma. Wie oben diskutiert wurde, ist der Assay stabil, reproduzierbar und kann verwendet werden um nahezu alle üblichen kongenitalen Blutungsstörungen bei Säugern, und speziell bei humanen Patienten, zu überwachen. Zusätzlich kann der Assay verwendet werden um die Wirksamkeit einer Antikoagulantien-Intervention, einschließlich Behandlung mit Heparin, Coumidin oder anderen anerkannten Therapeutika, zu überwachen. Der Assay ist insbesondere bezüglich I.S.I. titrierbar, was zu einem universell äquivalenten Antikoagulans-Überwachungssystem führt, das von der Thromboplastin-Quelle unabhängig ist.
Die folgenden Materialien und Methoden bzw. Verfahren wurden bei Bedarf in den Beispielen 10-15 oben verwendet:
1. Materialien
Rekombinanter humaner Gewebefaktor (1-242) wurde von Hyland Div., Baxter Healthcare Corp. bereitgestellt. 1-Palmitoyl-2-oleoylphosphatidylserin (PS) und 1-Palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholin (PC) wurden entweder von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) oder Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL), bezogen. Trypsin-Inhibitor aus Mais bzw. Corn (CTI) wurde hergestellt, wie es vorher beschrieben wurde. Monoklonale Antikörper auf Faktor IX und XI wurden von Antibody facility, University of Vermont College of Medicine erhalten. Gewebefaktor-Stoffwechselweg-Inhibitor (TFPI) war ein Geschenk von Chiron Corp. Rekombinanter Faktor VIIa wurde von Novo Nordisk bezogen. Gesammeltes, standardisiertes Normal-Plasma (FACT) und Faktor V-, Faktor VII-, Faktor VIII- und Faktor IX-defiziente Plasmen (≤1,0% von jedem Faktor) wurden von George King Biomedicals bezogen. Plasmen für Normalwert-Studien wurden von 25 Personen (freiwillige Spender des Roten Kreuzes) mit 4-5 Blutspenden über einen Zeitraum von 8 Monaten erhalten. Plasmaproben von Patienten unter moderater Coumadin-Therapie wurden vom Department of Pathology, University of Vermont College of Medicine, erhalten. Alle Citratplasmaproben wurden bei –80°C gelagert. Thromboplastin (Simplastin Excel) wurde von Organon Teknika (Durham, NC) bezogen. Thromboplastin-HS, Thromboplastin-M und Thromboplastin mit Calcium wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) bezogen. Thromboplastin-D, Thromboplastin-DS und Thromboplastin-DL wurden von Pacific Haemostasis (Huntersville, NC) bezogen. Rinderlungen-Thromboplastin wurde von ICN (Costa Mesa, CA) bezogen. Ein ST4-Gennnseldetektor bzw. Gerinnungsdetektor (Diagnostica-Stago) wurde zur Messung der Gerinnungszeit bzw. Gerinnselbildungszeit verwendet.
2. Herstellung von PCPS-Vesikeln
Phosphatidyl-Cholin (PC) [ 100 mg/ml] und Phosphatidyl-Serin [ 10 mg/ml] wurden auf Raumtemperatur kommen gelassen. PC und PS wurden im geeigneten Verhältnis (75:25) in einem 30 ml-Corex-Glasröhrchen vermischt. Die Lösungen wurden unter Stickstoff, während das Röhrchen gerollt wurde, wodurch ein dünner Überzug entlang der Wand hergestellt wurde, für 20 Minuten getrocknet. Das Röhrchen wurde dann mit 11 ml HBS, pH 7,4, gewaschen. Das PC/PS/HBS-Gemisch wurde dann für 45 Minuten unter Spülen mit Stickstoff auf einem Eisbad mit Ultraschall behandelt. Das POPS-Gemisch wurde dann in einer Beckman L5-50-Ultrazentrifuge, Rotor SW50.1, mit 35K UpM für 30 Minuten zentrifugiert. Die Geschwindigkeit wurde auf 40K UpM erhöht, und es wurde für weitere 3 Stunden zentrifugiert. Die oberen 3/4 des Überstands wurden entfernt und zur Konzentrationsbestimmung analysiert (Barenholz und Higgins). Nachdem die Konzentration bestimmt war, wurde Saccharose mit 10% v/a zugesetzt, und das Gemisch wurde in 100 μl-Aliquots aufgeteilt, blitzgefroren und über Nacht lyophilisiert. Die resultierenden lyophilisierten Produkte wurden vor Verwendung mit 100 μl HBS, pH 7,4, rekonstituiert.
3. Herstellung von Gewebefaktor/Lipid-Reagens
Rekombinantes Gewebefaktor-Reagens (2222 nM-Stammlösung) in Octylglucosid wurde für eine Endkonzentration von 5 nM zu 40 ml HBS + 5 mM CaCl₂, pH 7,4 (90 μl) gegeben. 107,5 μl PCPS-Vesikel (3,72 mM, 3/99-Präparation) wurden dann zu rTF/HBS gegeben um eine Endkonzentration von 10 μM zu erreichen. Das Gemisch wurde dann für 30 Minuten in einem 37°C-Wasserbad inkubiert. Nachdem die Inkubation vollständig war, wurden 10 ml 40% (Gew./Vol.) Saccharose zu dem Gemisch gegeben um eine Endkonzentration von 10% (Vol./Vol.) zu erhalten. 240 μl-Aliquots wurden blitzgefroren und über Nacht lyophilisiert. Die resultierenden lyophilisierten Produkte wurden bei –20°C gelagert und 60 Minuten vor jedem Experiment mit 200 μl destilliertem Wasser rehydratisiert, wodurch 5 nM rTF/10 μM PCPS erhalten wurden.
4. Messungen der Plasmagerinnungszeit
Thrombozyten-armes Citratplasma (PPP) aus einem normalen Pool, aus Patientengruppen oder Faktor V-, VII-, VIII- und IX-defizientem Pool, wurde vor einem Auftauen bei 37°C mit 3,7 μl 272 mg/ml Corn-Trypsin-Inhibitor (CTI) (100 μg/ml Endkonzentration) behandelt. Das aufgetaute Plasma wurde mit 16.000 × g (Eppendorf Modell 5415-C, Tischzentrifuge) für 10 Minuten zentrifugiert. Die Gerinnungszeiten wurden entweder durch ein manuelles "tilttube"-Verfahren oder unter Verwendung eines Stago ST-4-Detektors bestimmt (die Resultate der Verfahren waren äquivalent). Für beide Verfahren wurden Teströhrchen aus klarem Polystyrol oder ähnlichem klaren Kunststoff verwendet.
Die Reaktionsküvetten für den ST4-Gerinnungsdetektor wurden in den geeigneten Inkubationskammern auf 37°C (3 Minuten) äquilibriert. Eine Calciumäquilibrierung wurde begonnen, indem 10 μl 300 mM CaCl₂ (Endkonzentration 30 mM) zu 100 μl des CTI-behandelten Citrat-PPP (normal, Patient oder defizient) für 15 Sekunden gegeben wurden, worauf 1,3 μl 3,72 mM PCPS (25:75 PC/PS) (Endkonzentration 50 μM) für 15 Sekunden zugesetzt wurden. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 10 μl 5,0 nM rTF (Endkonzentration 0,5 nM TF) oder 2,5 μl 0,5 nM rTF (12,5 pM Endkonzentration) initiiert. Die Endpunkt-Gerinnungszeiten wurden visuell oder mechanisch am ST4-Gerät unter Verwendung des PTT-Modus ohne Inkubation mit einem oberen Zeitlimit von 999 Sekunden bestimmt.
5. Standardisierung von Thromboplastin-Reagentien
Die Standardisierung mehrerer im Handel verfügbarer Thromboplastin-Reagentien gegenüber der Gerinnungszeit von gepooltem Normal-Plasma (I.N.R., 1; FACT, George King Biomedicals) mit 0,5 nM rTF wurde durchgeführt, indem Verdünnungen der Reagentien in Wasser durchgeführt wurden und indem Volumina verwendet wurden, die eine Gerinnungszeit lieferten, die identisch mit der des rTF-Reagenses im FACT-Plasma ist. Es wurden Volumina aus einer 1:10-Verdünnung jeder Stammlösung verwendet. Um die Plasmen von Patienten mit moderater Coumadin-Therapie zu untersuchen, wurden anstelle der rTF-Stammlösung 6 μl Thromboplastin "Excel", 3 μl Thromboplastin, 3 μl "Thrombplastin-HS" und 4 μl Sigma Thromboplastin, 6 μl Pacific Hemostas-Thromboplastin-D, 6 μl ICN-Rinderlungen-Thromboplastin, 7 μl Pacific Hemostas-Thromboplastin-DS und 2 μl Thromboplastin-DL verwendet; ansonsten wurde der Assay durchgeführt, wie es oben beschrieben ist.
BEISPIEL 16 – Inhibierung des Kontaktwegs bei Vollblut
Eine optimale Verwendung moderner Mittel zur Thrombozytenaggregationshemmung und antithrombotischer Arzneimittel erfordern verbesserte Verfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit. Dementsprechend wurde der folgende Assay entwickelt, um so die Empfindlichkeit auf der Basis der Gerinnungsinitiierung durch Gewebefaktor in minimal verändertem Vollblut zu erhöhen.
Corn-Trypsin-Inhibitor (CTI) wurde verwendet um den Gerinnungs-Kontaktweg zu inhibieren, der normalerweise initiiert wird, wenn Blut mit einer künstlichen Oberfläche in Kontakt kommt. Experimente zur Bestimmung des Effekts von CTI auf Gerinnungszeiten wurden mit einem Hemochron-Instrument bei 8 Personen durchgeführt. Für diese Reihe von Experimenten war kein exogener Gewebefaktor vorhanden. Blut ohne CTI gerann in 360 ± 30 Sekunden. Der Zusatz von CTI führte zu einer Konzentrations-abhängigen Verlängerung der Zeit zum Gerinnen (17). Bei CTI-Konzentrationen von über 200 μg/ml wurde ein Wirkungsplateau sichtbar. Schließlich wurden alle Assays in den Beispielen 16-19 nach Zusatz von 200 μg/ml CTI durchgeführt.
Dieser Assay verwendet eine zur Antikoagulation ausreichende Menge an CTI um eine Gerinnung in minimal verändertem Vollblut zu inhibieren. Der Assay wird hier bevorzugt als "Gewebefaktor-abhängiger Gerinnungs-Assay" oder durch eine ähnliche Bezeichnung angegeben. Der Assay ist insbesondere zur Überwachung der Gerinnung in Vollblut oder minimal verändertem Vollblut einsetzbar. Beispielsweise ist der Assay als neues "Bedside"-Werkzeug einsetzbar, das eine verbesserte therapeutische Beurteilung, einschließlich antithrombotischer Standardtherapien und Therapien zur Thrombozytenaggregation, verbessert. Der Assay sollte auch eine verbesserte Dosiswahl, Titration oder Überwachung einer antithrombotischen, Thrombozytenaggregationshemmungs- und fibrinolytischen Mehrkomponenten-Behandlung erleichtern.
17 wird nachfolgend detaillierter erläutert. Blut wurde durch periphere Venenpunktion von gesunden Personen erhalten und ausgewählten Konzentrationen an Corn-Trypsin- Inhibitor (CTI) ausgesetzt. CTI ist ein spezifischer Inhibitor für Faktor XIIa ohne Wirkung auf andere Gerinnungsfaktoren. Die Gerinnung wurde mit einem ACT-Instrument detektiert. Die Werte stellen Mittelwerte ± S.D. für 8 Personen dar. Mit CTI gab es eine Konzentrationsabhängige Zunahme bei der Gerinnungszeit. Konzentrationen von über 200 μg/ml verlängerten die Gerinnungszeit nicht weiter.
BEISPIEL 17 – Initiierung der Blutgerinnung mit Gewebefaktor
Der Effekt von lipidiertem Gewebefaktor auf Hemochron-detektierte Gerinnung wurde bei 12 Personen analysiert. Es wurden Effekte von Gewebefaktor-Konzentrationen im Bereich von 1,0 bis 60 pM beurteilt. Der Gewebefaktor führt zu einer Konzentrations-abhängigen Abnahme der Gerinnungszeit, wie es in 18 gezeigt wird.
Nachfolgend wird 18 erläutert. Blut von gesunden Personen wurde ausgewählten Konzentrationen an lipidiertem Gewebefaktor ausgesetzt. Mit einem ACT-Instrument wurde die Gerinnung detektiert. Die Werte stellen Mittelwerte ± S.D. für 12 Personen dar. Der Zusatz von lipidiertem Gewebefaktor führt zu einer Konzentrations-abhängigen Verringerung der Gerinnungszeit.
BEISPIEL 18 – Variabilität des Gewebefaktor-abhängigen Gerinnungs-Assays
Die Gerinnungszeit wurde in Blutproben von 20 gesunden Personen charakterisiert. Die Gerinnung wurde mit 10 pM Gewebefaktor in Blut, das mit 200 μg/ml CTI vorbehandelt worden war, initiiert. In anschließenden Studien konnte, wenn die Gerinnung in weniger als 12 Minuten erfolgte, eine Verlängerung der Zeit zur Gerinnung durch antithrombotische Mittel und Mittel zur Thrombozytenaggregationshemmung identifiziert werden und eher der Inhibierung der Thrombin-Erzeugung, initiiert durch Gewebefaktor, als dem Kontakt-Stoffwechselweg zugeordnet werden. Die Gerinnungszeit in Proben aus 4 Personen, die an drei aufeinanderfolgenden Tagen erhalten wurden, und von 20 Personen, die an einem einzigen Tag entnommen und untersucht wurden, sind in der in 19 gezeigten Tabelle dargestellt. Die intra-individuellen Variationskoeffizienten und die inter-individuellen Variationskoeffizienten waren kleiner als 10% (19).
BEISPIEL 19 – Effekt verschiedener Mittel auf die Gerinnungszeit im Gewebefaktorabhängigen Gerinnungs-Assay
A. Hirudin
Blut von 5 Personen wurde 0,4 und 0,8 Anti-IIa E/ml Hirudin, einem direkten Thrombin-Inhibitor, ausgesetzt. Siehe 20A und 20B. Hirudin verlängerte die Gerinnungszeit bei beiden getesteten Konzentrationen deutlich (um 21 Sekunden mit 0,4 E/ml und um 37 Sekunden mit 0,8 E/ml, jeweils p<0,05).
Die aPTT war nur bei der höheren Hirudin-Konzentration, 0,8 E/ml, deutlich verlängert (um 16 Sekunden, p<0,05).
Die 20A und 20B werden wie folgt näher erläutert. Die Wirkung von Hirudin auf die Gerinnungszeit. Blut von gesunden Personen wurde mit 200 μg/ml CTI behandelt und auch 0,4 und 0,8 Anti-IIa E/ml Hirudin ausgesetzt. Die Gerinnung wurde mit 20 pM Gewebefaktor initiiert und mit einem ACT-Gerät detektiert. Resultate von 5 Personen sind durch Kreise dargestellt. Hirudin verlängerte die Gerinnungszeit bei jeder untersuchten Konzentration (p<0,05). Die Verlängerung der aPTT wurde nur mit 0,8 E/ml Hirudin detektiert.
B. Rekombinantes Zecken-Antikoagulans (rTAP)
Blut von 8 Personen wurde 0,4 Anti-Xa E/ml rekombinantem Zecken-Antikoagulans-Peptid (rTAP), einem spezifischen Inhibitor für Faktor Xa, ausgesetzt. Siehe 21A und 21B. rTAP verlängerte die Gerinnungszeit deutlich (um 229 Sekunden, p<0,05), hatte aber keine Wirkung auf die aPTT.
Im Folgenden werden die 21A und 21B detaillierter erläutert. Die Wirkung von Zecken-Antikoagulans-Peptid (rTAP) auf die Gerinnungszeit. Blut von gesunden Personen wurde mit 200 μg/ml CTI behandelt und auch 0,4 Anti-Xa E/ml rTAP ausgesetzt. Die Gerinnung wurde mit 20 pM Gewebefaktor initiiert und mit einem ACT-Gerät detektiert. Resultate von 8 Personen werden durch Kreise dargestellt. rTAP verlängerte die Gerinnungszeit (p<0,05). Die aPTT wurde durch rTAP nicht beeinträchtigt.
C. Heparin
Blut von 6 gesunden Personen wurde 0,25 und 0,4 Anti-IIa/Xa E/ml Heparin ausgesetzt. Diese Konzentrationen wurden so gewählt, dass sie dem in der klinischen Praxis erzielten Konzentrationsbereich entsprechen. Sowohl die Gerinnungszeit, als auch die aPTT wurden mit zunehmenden Heparin-Konzentrationen verlängert (jeweils p=0,001, 22A und 22B).
Im Folgenden werden die 22A und 22B erläutert. Die Wirkung von Heparin auf die Gerinnungszeit. Blut von gesunden Personen wurde mit 200 μg/ml CTI behandelt und auch 0,25 und 0,4 Anti-IIa E/ml Heparin ausgesetzt. Die Gerinnung wurde mit 20 pM Gewebefaktor initiiert und mit einem ACT-Gerät detektiert. Resultate von 6 Personen werden durch Kreise dargestellt. Heparin verlängerte sowohl die Gerinnungszeit, als auch die aPTT (jeweils p=0,001).
D. Enoxaparin
Blut von 5 gesunden Personen wurde 0,4 und 0,8 Anti-Xa E/ml Enoxaparin ausgesetzt. Diese Konzentrationen wurden so gewählt, dass sie denen entsprachen, die bei Patienten mit akuten koronaren Syndromen erreicht werden. Die Gerinnungszeit und die aPTT erhöhten sich mit steigenden Konzentrationen an Enoxaparin (jeweils p=0,001, 23A und 23B).
Nachfolgend werden die 23A und 23B näher erläutert. Die Wirkung von Enoxaparin auf die Gerinnungszeit. Blut von gesunden Personen wurde mit 200 μg/ml CTI behandelt und auch 0,4 und 0,8 Anti-Xa/IIa E/ml Enoxaparin ausgesetzt. Die Gerinnung wurde mit 20 pM Gewebefaktor initiiert und mit einem ACT-Instrument detektiert. Resultate von 5 Personen werden durch Kreise dargestellt. Enoxaparin verlängerte die Gerinnungszeit und die aPTT (jeweils p=0,001).
E. Antikörper, der gegenüber dem Thrombozytenoberflächen-Glycoprotein gp IIb/IIIa aktiv ist, (abciximab), kombiniert mit Heparin.
Der Zusatz von 3 μg/ml abciximab zu 0,1 Anti-IIa/Xa E/ml Heparin wurde in Blut von 5 gesunden Personen beurteilt. Der Zusatz von abciximab verlängerte die Gerinnungszeit im Vergleich zu der, die mit Heparin alleine festgestellt wurde, weiter (um 62 Sekunden, p<0,05, 24A und 24B). Die aPTT wurde durch den Zusatz von abciximab nicht beeinflusst.
Nachfolgend werden die 24A und 25B näher erläutert. Die Wirkung der Kombination aus Heparin und abciximab auf die Gerinnungszeit. Blut von gesunden Personen wurde mit 200 μg/ml CTI behandelt und auch 0,1 Anti-IIa E/ml Heparin allein und in Kombination mit 3 μg/ml abciximab ausgesetzt. Die Gerinnung wurde mit 20 pM Gewebefaktor initiiert und mit einem ACT-Instrument detektiert. Die Resultate von fünf Personen sind durch Kreise dargestellt. Die Kombination verlängerte die Gerinnungszeit im Vergleich zu Heparin alleine (p<0,05). Der Zusatz von abciximab zu Heparin verlängerte die aPTT nicht weiter.
F. Antikörper, der gegen das Thrombozytenoberflächen-Glykoprotein gp IIb/IIIa reaktiv ist (abciximab), kombiniert mit Enoxaparin
Die Kombination von Enoxaparin (0,4 Anti-Xa E/ml) und abciximab (3 μg/ml) wurde in Blut von fünf gesunden Personen charakterisiert. Der Zusatz von abciximab zu Enoxaparin verlängerte die Gerinnungszeit im Vergleich zu der, die mit Enoxaparin allein festgestellt wird, weiter (um 52 Sekunden, p<0,05, 25A und 25B). Die aPTT wurde durch den Zusatz von abciximab nicht beeinflusst.
Die 25A und 25B werden nachfolgend beschrieben. Die Wirkung der Kombination von Enoxaparin und abciximab auf die Gerinnungszeit. Blut von gesunden Personen wurde mit 200 μg/ml CTI behandelt, und auch 0,4 Anti-Xa E/ml Enoxaparin allein und in Kombination mit 3 μg/ml abciximab ausgesetzt. Die Gerinnung wurde mit 20 pM Gewebefaktor initiiert und mit einem ACT-Instrument detektiert. Resultate von fünf Personen werden durch Kreise dargestellt. Die Kombination verlängerte die Gerinnungszeit im Vergleich zu Enoxaparin allein (p<0,05). Der Zusatz von abciximab zu Enoxaparin verlängerte die aPTT nicht weiter.
Die Beispiele 16-19 oben liefern eine verbesserte Beurteilung der therapeutischen Wirksamkeit moderner antithrombotischer Mittel. Der dargestellte Assay ist durch eine Gewebefaktor-initiierte Gerinnung in minimal verändertem Vollblut gekennzeichnet. Die Resultate waren bei 20 Freiwilligen reproduzierbar (mittlere Gerinnungszeit = 118 ± 9 Sekunden). Hirudin (0,4 anti-IIa E/ml) und Zecken-Antikoagulanspeptid (0,4 Anti-Xa E/ml) erhöhte die Gerinnungszeit um 21 und 229 Sekunden, ohne dass die aPTT verlängert wurde. Der Zusatz von abciximab (3 μg/ml) zu Heparin und Enoxaparin verlängerte die Gerinnungszeit um weitere 62 und 52 Sekunden. Der Assay sollte eine verbesserte Dosisauswahl und eine verbesserte Überwachung einer antithrombotischen, fibrinolytischen und Thrombozytenaggregationshemmungs-Mehrkomponenten-Therapie erleichtern.
Experimentelle Resultate waren bei 20 Freiwilligen reproduzierbar (mittlere Gerinnungszeit = 118 ± 9 Sekunden). Hirudin (0,4 anti-IIa E/ml) und Zecken-Antikoagulanspeptid (0,4 anti-Xa E/ml) erhöhten die Gerinnungszeit um 21 und 229 Sekunden, ohne die aPTT zu verlängern. Der Zusatz von abciximab (3 μg/ml) zu Heparin und Enoxaparin verlängerte die Gerinnungszeit um weitere 62 und 52 Sekunden. Wie bereits diskutiert wurde, sollte der Assay eine verbesserte Dosisauswahl und eine verbesserte Überwachung einer antithrombotischen, fibrinolytischen und Thrombozytenaggregationshemmungs-Mehrkomponenten-Therapie erleichtern.
Die folgenden Materialien und Verfahren wurden bei Bedarf in den obigen Beispielen 16-19 verwendet.
1. Materialien und Methoden bzw. Verfahren
Von gesunden Personen wurden Blutproben erhalten, und der Kontaktweg der Gerinnung wurde mit Corn-Trypsin-Inhibitor (ein spezifischer Inhibitor für Faktor XIIa ohne Wirkung auf andere Gerinnungsfaktoren) inhibiert. Die Gerinnung wurde mit relipidiertem Gewebefaktor initiiert und mit einem Hemochron AC-Gerät detektiert. Die Resultate waren bei Proben von 20 gesunden Freiwilligen reproduzierbar (mittlere Gerinnungszeit = 118 ± 9 Sekunden). In anderen Untersuchungen wurde Blut in vitro pharmakologischen Konzentrationen an antithrombotischen Mitteln und Mitteln zur Thrombozytenaggregationshemmung ausgesetzt. Hirudin (0,4 Anti-IIa E/ml) verlängerte die Gerinnungszeit um durchschnittlich 21 Sekunden (p<0,05) im Vergleich zu einer 3 Sekunden-Verlängerung der aPTT. Zecken-Antikoagulanspeptid, ein direkter Inhibitor von Faktor Xa (0,4 Anti-Xa E/ml) verlängerte die Gerinnungszeit um durchschnittlich 229 Sekunden (p<0,05) im Vergleich zu einer 3 Sekunden-Verlängerung der aPTT. Additive Effekte von Mitteln zur Thrombozytenaggregationshemmung waren im Gegensatz zum Fall der aPTT-Assays leicht detektierbar. So verlängerte der Zusatz von 3 μg/ml abciximab zu 0,1 Anti-IIa/Xa E/ml Heparin und zu 0,4 Anti-Xa E/ml Enoxaparin die Gerinnungszeit um 62 bzw. 52 Sekunden (jeweils p<0,05).
2. Personen
Unter Verwendung eines Protokolls, das von der University of Vermont Institutional Review Board genehmigt worden war, wurde Blut durch periphere Venenpunktion von gesunden Freiwilligen erhalten. Die Personen hatten wenigstens 10 Tage lang kein Aspirin, keine nicht-steroidalen antiinflammatorischen Mittel oder eine andere Medikation eingenommen. Alle Personen bestätigten schriflich, dass sie informiert worden waren und einverstanden waren.
Blut wurde zwischen 900 und 1200 Stunden gesammelt. Phlebotomien wurden mit Butterfly-Nadeln Nr. 19 und einer Technik mit zwei Spritzen durchgeführt, bei der die ersten drei ml Blut verworfen wurden. Blutproben wurden in Spritzen aufgezogen, die Corn-Trypsin-Inhibitor (CTI, Enzyme Research Laboratories, South Bend, Indiana) allein in Konzentrationen im Bereich von 32 bis 300 μg/ml oder in Kombination mit ausgewählten pharmakologischen Konzentrationen an Heparin (0,1, 0,25 und 0,4 Anti-IIa/Xa E/ml), Enoxaparin (0,4 und 0,8 Anti-Xa E/ml, Rhone-Poulenc Rorer), Hirudin (0,4 und 0,8 Anti-IIa E/ml, Sigma), rekombinantes Zecken-Antikoagulanspeptid (rTAP, 0,4 Anti-Xa E/ml, freundlicherweise von Corvass International bereitgestellt) oder abciximab (3 μg/ml, Eli Lilly) enthielten. Die Konzentrationen an Heparin, Enoxaparin und abciximab wurden so gewählt, dass sie denen ähnlich waren, die in der klinischen Praxis erzielt wurden, und es wurden äquivalente Anti-IIa- und Anti-Xa-Konzentrationen an Hirudin und rTAP gewählt. Die Endvolumina waren 1 Teil Antikoagulans pro 9 Teile Blut.
3. Gerinnungszeiten
Ein 400 μl-Aliquot an Blut wurde in ein K-Harz-ACT-Röhrchen, das freundlicherweise von International Technidyne bereitgestellt wurde, gegeben, ohne dass die herkömmlicherweise verwendeten Glasperlen eingesetzt wurden, um den Kontaktweg zu aktivieren. Vor der Zugabe von Blut wurde lipidierter Gewebefaktor (1-60 pM, American Diagnostica, Greenwich, CT) in die K-Harz-Röhrchen gegeben.
Die Gewebefaktor und Blut-enthaltenden K-Harz-Röhrchen wurden unverzüglich in ein Hemochron ACT-Instrument gestellt. Die Gerinnungszeit wurde durch Verlagerung eines herabhängenden Magneten innerhalb des rotierenden Röhrchens, wenn sich Fibrinstränge gebildet hatten, detektiert. Das Blut wurde während des gesamten Assayverfahrens bei 37°C gehalten.
4. Statistische Analyse
Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichungen. Die Signifikanz von Differenzen wurde unter Verwendung der Varianzanalyse bestimmt. Differenzen zwischen Behandlungen wurden unter Verwendung des Student-Newman-Keul-Test analysiert. Signifikanz wurde als p < 0,05 definiert.
BEISPIEL 20 – Effekt von Thrombozytopenie auf den Gewebefaktor
Die Gefahr einer spontanen Blutung ist relativ gering, bis die Thrombozytenzahl unter etwa 10.000/mm³ abfällt. Die biologische Grundlage für diese scheinbare Schwelle ist unklar, zum Teil infolge der Beschränkungen der derzeit verfügbaren Labortests. Um die Beziehung zwischen Thrombozytopenie und Koagulation bzw. Gerinnung zu klären, verwendeten wir ein Modell für den Gewebefaktorweg, das kürzlich durch dieses Labor beschrieben wurde [Rand MD, et al. (1996) Blood 88:3432]. Die Koagulationsreaktion wurde in frisch aufgezogenem, minimal verändertem Vollblut mit variierenden Thrombozytenzahlen (5.000 bis 300.000/mm³) von 5 normalen Donoren und einem Patienten nach Hochdosis-Cytosinarabinosid-Chemotherapie untersucht. Die Koagulation bzw. Gerinnung wurde durch Gewebefaktor (12,5 pM) initiiert, eine Kontakt-Aktivierung wurde durch Corn-Trypsin-Inhibitor unterdrückt, und gequenchte Proben wurden im Verlauf der Reaktion gesammelt. Analysen wurden für die Thrombin-Antithrombin-Komplexbildung (TAT), Fibrinopeptid A (FPA) und Thrombozytendegranulierung (Osteonectin-Freisetzung) durchgeführt. Eine Gerinnung wurde am Ende der Initiierungsphase bei 4,1 ± 0,7 Minuten (s.d., n=11) durchgeführt und war für Thrombozytenzahlen im Bereich von 11.000 bis 309.000 Thrombozyten/mm³ im Wesentlichen unverändert. Dagegen verlängerten alle Thrombozytenzahlen ≤ 11.000/mm³ eine Gerinnung um durchschnittlich 8,5 ± 2,9 Minuten (s.d., n=3); klinisch hatte der Patient bei diesen Thrombozytenzahlen Petechie. Die maximale Rate der Thrombin (TAT)-Bildung wird nach der anfänglichen Gerinnselbildung detektiert (d.h. während der Propagationsphase) und steht mit der Thrombozytenkonzentration bei normalen Donoren und Patienten-Donoren, die von etwa 69 nM/min bei <112.000/mm³ bis 128 nM/min bei 289.000/mm³ liegt, in Korrelation.
Bei verringerten Thrombozytenzahlen, die mit klinischem Bluten verbunden sind, erfolgt die Thrombinbildung langsamer (17,8 nM/min bei <11.000 plts/mm³ und nur 4,4 nM/min bei 5.000/mm³). Wenn z.B. die Patienten-Thrombozytenzahl auf 9.000 plts/mm³ gefallen war, fiel die TAT-Bildung auf 17,6 nM/min; 16 Stunden nach Thrombozytentransfusion war die Thrombozytenzahl 47.000/mm³ und die TAT-Rate war auf 48,1 nM/min gestiegen. Im Gegensatz zu den TAT-Daten standen die FPA-Freisetzungsprofile in schlechter Korrelation mit der Thrombozytenzahl. Thrombozytendegranulierungs-Assays (Osteonectin-Freisetzung) spiegelte die vollständige Thrombozyten-Aktivierung innerhalb einer Minute Gerinnungszeit bzw. Gerinnselbildungszeit für Thrombozytenzahlen von etwa 112.000 Thrombozyten/mm³ wider. Bei niedrigeren Thrombozytenkonzentrationen waren die Daten infolge der Assaybegrenzungen nicht schlüssig. Diese Untersuchung zeigt, dass eine Verlängerung der Gerinnungszeit, und insbesondere eine verschlechterte Thrombinbildung, durch den Gewebefaktor-Stoffwechselweg-Assay detektiert werden, wenn die Thrombozytenzahlen auf Level abfallen, die mit klinischem Bluten verbunden sind. Dieser Vollblut-Assay sollte einsetzbar sein um den Beitrag der Thrombozytenzahl und die Funktion zur Gerinnung zu charakterisieren.
Dieses Beispiel zeigt, dass schwere Thrombozytopenie mit einer verschlechterten Gerinnung und Thrombinbildung im derzeitigen Assay verbunden ist. Als Resultat stellt dieser Assay einen zweckdienlichen ex vivo-Test auf Thrombozytendefiziens dar, der als "point-of-care"-Assay durchgeführt werden kann, viele frühere Assays verdrängen kann, die weniger zweckdienlich (Thrombozytenzählung) sind, für Fehler anfällig sind (Matrizen-Blutungszeit) oder für den Patienten deutlich unangenehm sind (Matrizen-Blutungszeit).
26 zeigt, dass der Gewebefaktor in Vollblut von Donoren und einem Patienten mit schwankenden Thrombozytenspiegeln eine Gerinnung initiierte. Unter den in Beispiel 7 beschriebenen Bedingungen mit wenigen geringen Modifikationen wurden zwölf Experimente an Vollblut durchgeführt. Es wurde eine Gewebefaktorkonzentration von 12,5 pM verwendet. Blut wurde von 5 normalen Donoren mit Thrombozytenkonzentrationen zwischen 148.000 und 309.000/mm³ (O) entnommen. Außerdem wurde Blut von einem Patienten in verschiedenen Stufen der Arabinosid-Chemotherapie (ausgefülltes Kästchen, nicht-ausgefülltes Kästchen; sieben Experimente) erhalten, das Thrombozytenzahlen zwischen 5.000 und 193.000/mm³ aufwies. In Blut von 5 normalen Donoren und dem Patienten vor der Chemotherapie erfolgt die Gerinnung durchschnittlich bei 4,0 ± 0,5 Minuten (Standardabweichung). Unmittelbar nach einem der Patienten-Experimente (Thrombozytenzahl = 9.000/mm³) wurde eine Thrombozy tentransfusion vorgenommen, und 16 Stunden später wurde ein Nachfolge-Experiment durchgeführt (ausgefülltes Kästchen). Bei den äußerst geringen Thrombozytenzahlen, bei denen eine schwere Thrombozytopenie auf der Basis der Thrombozytenzahl (≤11.000/mm³) erwartet wurde, war die Gerinnungszeit im Patientenblut im Vergleich zur Normalzeit deutlich verlängert (Durchschnitt 8,5 ± 2,9 Minuten). Eine Thrombozytentransfusion stellte die Patienten-Thrombozytenzahl auf 47.000/mm³ ein, was die Gerinnungszeit wieder zurück in den Normalbereich brachte (Grenzen werden durch die horizontalen Linien angegeben).
27 zeigt die maximalen Raten der Thrombinbildung in der Propagationsphase während der Vollblutgerinnung mit variierenden Thrombozytenzahlen. Für jedes der zwölf in 26 oben beschriebenen Experimente wurde die maximale Rate der Thrombinbildung unter Verwendung eines Immunassays auf den Thrombozyten-Antithrombin (TAT)-Komplex bestimmt. Die resultierenden Raten sind als Funktion der Thrombozytenzahl gezeigt. In Blut von normalen Spendern (O, Thrombozytenzahlen zwischen 148.000 und 309.000/mm³) lagen die Thrombinbildungsraten zwischen 69 und 128 nM/min. Mit Patientenblut (nicht-ausgefülltes Kästchen) wurden drei Experimente durchgeführt, wobei schwere Thrombozytopenie durch geringe Thrombozytenzahlen (≤11.000/mm³) angezeigt wurde. In diesen drei Experimenten lagen die Thrombinlevel unter 17,8 nM/min. In einem besonderen Experiment bei 9.000 Thrombozyten/mm³ erhöhte sich die Rate der Thrombinbildung signifikant auf 48 nM/min, genau unterhalb der beobachteten Untergrenze für den Normalbereich. Eine nachfolgende Thrombozytentransfusion (ausgefülltes Kästchen) erhöhte die Patientenzahlen auf 47.000/mm³ und erhöhte die Thrombinbildungsrate auf 48 nM/min, genau unterhalb der beobachteten Untergrenze für den Normalbereich.
In diesem Beispiel wurden die folgenden Materialien und Methoden bzw. Verfahren eingesetzt, wenn es erforderlich war.
1. Herstellung von Corn-Trypsin-Inhibitor
Corn-Trypsin-Inhibitor wurde nach Hojima et al., oben, allerdings mit geringen Modifikationen, hergestellt. Trockener Perlmaissamen aus einem Geschäft am Ort wurde mit 1,1 M Tris/0,15 < M NaCl (pH 8,0) extrahiert, bis keine weitere Verlängerung der aPTT in normalem Plasma beobachtet wurde. Eine Aceton-Präzipitation wurde durchgeführt, wie es beschrieben ist, und die Inhibitorfraktion (Schnitt 67-86%) wurde in 0,040 M Tris-HCl, pH 7,5, resuspendiert und dialysiert und auf eine DEAE-Sephacel-Säule (2,5 × 60 cm) aufgetragen. Der Hauptpeak der inhibitorischen Aktivität wurde mit einem linearen Salzgradienten (0-1 M NaCl) eluiert, gesammelt und auf eine zweite Säule (2,5 × 94 cm) mit Sephadex G-50 in 0,04 M Tris-HCl, pH 7,5, aufgetragen. Diese letzte gesammelte Fraktion wurde über Nacht (cutoff bei einem Molekulargewicht von 3.000) gegen 10 mM Ammoniumbicarbonat, pH 7,8, dialysiert, dann zur Trockene lyophilisiert. Das isolierte Protein wies eine einzelne Bande bei einem Molekulargewicht von 14.000 auf und wurde in HBS (HEPES, 20 mM; NaCl, 150 mM, pH 7,4) rekonstitu iert. Es wurden keine Anstrengungen unternommen um die Isoformen dieses Inhibitors weiter zu reinigen, wobei diese alle ein ähnliches Inhibitorpotential gegenüber Faktor Xiia aufweisen.
2. Herstellung von Gewebefaktor/Lipid-Reagens
Gewebefaktor (5 nM) wurde in kleine unilamellare Vesikel, siehe Y. Barenholz et al. (1997) Biochem. 16:2806, aus 25 Mol-% PC (10 μM Gesamtlipid) in HBS plus Calcium (2 mM) für 30 Minuten bei 37°C relipidiert. Siehe J.H. Lawson et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:23357. Zu dem Relipidierungsgemisch wurde anschließend konzentrierte Saccharose (60% Gew./Vol.) bis zu einer Endkonzentration von 10% gegeben um die Vesikel für eine Langzeitlagerung im Gefrierschrank (bis zu 12 Monaten) zu stabilisieren. Aliquots des Reagenses (200 μl) wurden bei –20°C gelagert, wobei sie 60 Minuten vor jedem Experiment rehydratisiert werden konnten und mit reproduzierbaren Resultaten eingesetzt werden konnten.
3. Humane Donoren
Fünf normale Donoren und ein Patient, der Arabinosid-Chemotherapie erhielt, wurden angeworben und entsprechend einem Protokoll, das von der University of Vermont Human Studies Committee zugelassen worden war, instruiert. Siehe Rand MD et al. (1996) Blood 88:3432. Die fünf normalen Personen (Alter im Bereich von 22-36) wurden ausgewählt, wobei Donoren mit einer persönlichen oder familiären Thrombose/Hämorrhagie-Anamnese oder mit regelmäßiger Aspirin- oder Arzneimittelverwendung ausgeschlossen wurden. Personen, die als normale Kontrollen ausgewählt wurden, wiesen typischerweise Werte im Normalbereich für die PT (11,6-13,8 Sekunden), aPTT (27-36 Sekunden), Fibrinogen und Thrombozytenzahlen (172.000 bis 376.000/mm³) auf. Am Tag des Experiments wurden Proben entnommen um die Zellzahl, PT, aPTT und Fibrinogen zu bestimmen.
Im Folgenden wird eine kurze Anamnese des Patienten angeführt. Eine 51 Jahre alte, weibliche Verwaltungsangestellte entwickelte Müdigkeit, und es wurde festgestellt, dass sie Panzytopenie hat. Eine Knochenmarksuntersuchung wurde als nicht-diagnostisch angesehen. Eine wiederholte Knochenmarksuntersuchung 6 Monate später zeigte Myelodysplasie mit 28% Stammzellen und einem normalen Karyotyp. Einen Monat später zeigte ihre Knochenmarksuntersuchung 35% Stammzellen, und sie begann mit einer Chemotherapie mit Idarubicin/Cytosinarabiosid. Nach dem ersten Behandlungszyklus enthielt ihr Knochenmark 14% Stammzellen. Ein zweiter Zyklus mit denselben Arzneimitteln führte zu einer vollständigen Remission. Da die Patientin keinen verwandten Knochenmarkspender hatte, erhielt sie drei Zyklen Cytosinarabinosid in hoher Dosis (3 g/m² alle 12 Stunden am Tag eins, drei und fünf). Sie vertrug die Konsolidierungs-Chemotherapie sehr gut, benötigte aber periodische Transfusionen mit Erythrozyten und Thrombozyten wegen der Zytopenie. Eine Suche nach einem nichtverwandten Spender führte nicht zum Ziel. Die Patientin befindet sich derzeit in vollständiger Remission ohne Medikation. Ihre jüngsten Blutwerte zeigten 13,0 g Hämoglobin, Hämatokrit 37,9, Leukozyten 5.120/mm³ und eine Thrombozytenzahl von 212.000/mm³.
4. Gerinnung in Vollblut
Das verwendete Protokoll ist eine Modifikation von Rand et al. (1996) Blood 88:3432, durchgeführt am General Clinical Research Center, Fletcher Allen Health Care (Burlington, Vermont). Die Gerinnung von frisch entnommenem, nicht-antikoaguliertem Vollblut wurde in 16 verkappten Polystyrol-Kulturröhrchen durchgeführt, wie es bereits beschrieben wurde. Reagentien wurden mit den folgenden Mengen beschickt: Corn-Trypsin-Inhibitor (alle Röhrchen unter Erhalt von 100 μg/ml Blut); relipidierter TF (Lipid : Protein = 2.000) in HBS mit 5 mM Calcium (alle Röhrchen in jeder Serie, außer Phlebotomie-Kontrollröhrchen, so, dass 12,5 pM TF/ml Blut erhalten wurden). Es wurden nicht mehr als 50 μl Reagens in jedes Röhrchen gefüllt. Das Röhrchen null jeder Serie wurde vorbehandelt, indem 1 ml Inhibitor-Cocktail (enthaltend 50 mM EDTA und 20 mM Benzamidin-HCl in HBS, pH 7,4) und 10 μl 10 mM FPRck (verdünnt in 0,01 M HCl) verwendet wurden.
Patientenblut oder normales Donorblut wurden durch Venenpunktion unter Anwendung eines Protokolls, das vom Human Studies Committee at the University of Vermont erprobt worden war und das in Rand MD et al. (1996) Blood 88:3432 beschrieben wurde, entnommen. Die Gerinnung wurde durch Abgabe in die mit Reagens beladenen Röhrchen und unter periodischem Quenchen der Röhrchen mit Inhibitor-Cocktail und FPRck, wie oben beschrieben, initiiert. Eine Serie abgeschreckter Proben wurde nach dem Reaktionsablauf bis zu 20 Minuten nach Initiierung erhalten. Ein Aliquot aus jedem Röhrchen wurde filtriert um zelluläre Kontaminanten für Osteonectin-Assays zu entfernen (200 μl, 0,2 μM AcroDisc, Gelman Sciences, Ann Arbor, MI). Das restliche Serum und Zellpellets/Gerinnsel wurden in Aliquots in Röhrchen mit Schraubverschluss gegeben und zur Immunoblot- oder Immunoassay-Analyse gefroren und bei –20°C gelagert.
5. Immunoassay-Analysen
Die folgenden Analyten wurden unter Verwendung handelsüblicher ELISA-Kits nach den von den Herstellern gelieferten Instruktionen bestimmt: Thrombin-Antithrombin-III (Enzygnost TAT, Behring); Fibrinopeptid A (Asserachrom FPA, Diagnostica Stage/American Bioproducts, New Jersey); und Thrombozyten-Osteonectin (ein Geschenk von Dr. Richard Jenny, Hematologic Technologies, Inc., Essex Junction, VT). Korrekturen für die Probenverdünnung durch zugesetzte Quentschlösung (1,00 ml) und Hämatokrit (typischerweise 40% des Gesamtblutvolumens) wurden durchgeführt, wie es früher beschrieben wurde (Ref. 7). Die Resultate wurden mit einem Vmax-Mikrotiterplatten-Lesegerät (Molecular Devices, Menlo Park, CA), ausgestattet mit SOFTMaz ver. 2,0 Software und einem IBM Personal System 2, Modell 30/286-PC, analysiert. Weitere Details der Analysen wurden bereits früher bereitgestellt. Siehe Rand M.D. et al. (1996) Blood 88:3432; und Cawthern, KM, et al. (1998) Blood 918:4581.
Wenigstens einige der Informationen aus diesem Beispiel wurden beim 40. Jahreskongress der American Society of Hematology, Miami, FI (Dezember 1998) präsentiert.
BEISPIEL 21 – Assay zur Überwachung relevanter Gerinnungsreaktionen im Plasma
Klinische Beurteilungen der Plasmagerinnung wurden traditionell durch Messungen der Prothrombinzeit (PT) und der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT) durchgeführt. Die PT wird bei hohen Gewebefaktor (TF)- und Lipidkonzentrationen unter Bedingungen durchgeführt, die zu einer schnellen Gerinnung (11-15 s) von recalcifiziertem Citratplasma führen. Infolge hoher Gewebefaktorkonzentrationen ist der PT-Assay für Defizientien im klassischen extrinsischen Weg (Faktoren I, II, V, VII und X) empfindlich und spiegelt nicht die Beiträge von Faktoren VIII, IX oder XI zur Koagulationsreaktion bzw. Gerinnungsreaktion wider. Der aPTT-Test enthält Lipid plus Initiatoren des Kontaktwegs und ist gegenüber den Faktoren I, II, V, VIII, IX, X, XI, XII, Prekallikrein und Kininogen mit hohem Molekulargewicht empfindlich. Ein Assay, der einen breiteren Bereich an Gerinnungszeiten bietet, die bei niedrigen TF-Konzentrationen verfügbar sind, indem eine Störung durch eine falsche Initiierung durch den Kontaktweg ausgeschlossen wird, wobei Corn-Trypsin-Inhibitor (CTI) verwendet wird, wurde entwickelt. Dieser Assay erlaubt eine vollständige Entwicklung von Kalzium-Gleichgewichten für Citratplasma vor einer Initiierung. Bei niedrigen Gewebefaktorkonzentrationen (≤ 0,5 nM) erfolgt die Reaktion mit einer viel niedrigeren Geschwindigkeit als im klassischen PT-Assay und ist demnach für solche Plasmafaktoren empfindlich, die das physiologische System widerspiegeln. Bei 0,5 nM TF, 100 μg/ml CTI, 50 μM Phosphatidylserin/Phosphatidylcholin (25:75, PCPS) und 30 mM CaCl₂-Citrat erfolgt die Plasmagerinnung bei 82 ± 6 s. Unter diesen Bedingungen ist der Assay für Defiziens von Faktor V (306 s), Faktor VII (230 s), Faktor VIII (189 s) und Faktor IX (189 s) empfindlich. Eine Untersuchung der Beziehung zwischen diesem Assay und dem International Normalized Ratio (INR) bei einer Gruppe aus 150 einzelnen Patienten mit Coumadin-Therapie wurde beurteilt. Im Vergleich zu Normalplasma (INR 1, 82 ± 6 s) zeigte Plasma mit einem INR von 2 eine Gerinnung bei 211 ± 8 s, während Plasma mit einem INR von 4,3 eine Gerinnung bei 616 ± 9 s zeigte. Es wird eine nahezu lineare Beziehung zwischen Gerinnungszeit und INR beobachtet. Dieser Assay wurde auch verwendet um mehrere kommerzielle Quellen für Thromboplastin-Reagens zu standardisieren, damit diese mit dem rekombinanten, relipidierten TF, der in unserem Labor produziert wurde, äquivalent war. Simplastin Excel, Thromboplastin-HS, Thromboplastin-M, Thromboplastin (Sigma), standardisiert auf ein INR von 1, waren bis zu einem INR von 4,3 in der Gerinnungszeit äquivalent. Der Assay ist gegenüber therapeutischen Mitteln, einschließlich Heparin (0-3 E/ml), Gewebefaktorweg-Inhibitor (TFPI) [0-60 nM], einem experimentellen monoklonalen Antikoagulans-Faktor IX-Antikörper (0-1.000 μg/ml) und verschiedenen spezifischen eigenen Antikoagulantien, die zur Bewertung anstanden, empfindlich. Wie durch diese Beobachtungen veranschaulicht wurde, haben wir einen umfassenden Assay entwickelt, der auf einen weiten Bereich relevanter Gerinnungsreaktionen anwendbar ist.
BEISPIEL 22 – Ein neuer Gewebefaktor-abhängiger Bedside-Gerinnungs-Assay
Eine optimale Verwendung moderner antithrombotischer Arzneimittel und Arzneimittel gegen Thrombozytenaggregation erfordert verbesserte Verfahren zur Beurteilung der therapeu tischen Wirksamkeit. Herkömmliche in vitro-Gerinnungs-Assays werden durch Wechselwirkungen zellulärer Bestandteile und Proteinbestandteile mit Glas und Kunststoff verzerrt. Es wurde ein Assay entwickelt, bei dem eine Gerinnung in Kontaktweg-inhibiertem Vollblut durch Zugabe von picomolaren Konzentrationen an lipidiertem Gewebefaktor initiiert wird und mit einem Hemochron ACT-Instrument detektiert wird. Es wurden Blutproben von 20 gesunden Personen erhalten. Der Kontaktweg wurde mit Corn-Trypsin-Inhibitor (ein spezifischer Inhibitor für Faktor XIIa) inhibiert. Die Gerinnung wurde durch Zusatz von Gewebefaktor (10 pM) initiiert. Die Gerinnungszeit war 118 ± 9 (s.d.) Sekunden. Blut wurde in vitro ausgewählten Konzentrationen an Hirudin (0,4 Anti-IIa E/ml), rekombinantem Zecken-Antikoagulanspeptid (rTAP, 0,4 Anti-Xa E/ml), Heparin (0,1 Anti-IIa/Xa E/ml) und Enoxaparin (0,4 Anti-Xa E/ml) ausgesetzt, was die Gerinnungszeit um 21, 229, 41 bzw. 46 Sekunden erhöhte (jeweils p < 0,05). Im Vergleich dazu wurde die aPTT durch Heparin und Enoxaparin um 34 bzw. 15 Sekunden erhöht, durch Hirudin oder rTAP aber nicht beeinträchtigt. Die Kombination aus abciximab (3 μg/ml) und Heparin verlängerte die Gerinnungszeit um 102 Sekunden (eine Erhöhung um 61 Sekunden gegenüber der mit Heparin allein, p < 0,05). Entsprechend beeinträchtigte die Kombination von abciximab die aPTT nicht. Dagegen beeinträchtigte der Zusatz von abciximab die aPTT nicht. Somit weist der entwickelte Assay eine verstärkte Empfindlichkeit auf, was eine Detektion von Additiven und synergistischen Effekten verschiedener Antikoagulantien und Arzneimittel gegen Thrombozytenaggregation erlaubt. Seine Verwendung sollte eine optimale "point-of-care"-Therapie erleichtern um so den unterschiedlichen Bedürfnissen einzelner Patienten zu entsprechen.

Claims

Verfahren zur Untersuchung der Gerinnung in Plasma, wobei das Verfahren umfasst: a) Behandeln einer Blutprobe mit einer Lösung, die eine Menge eines Calcium-chelatisierenden Mittels enthält, die ausreichend ist, um die Gerinnung zu hemmen, b) Unterwerfen der Blutprobe Bedingungen, die zur Bildung von Plasma führen, c) Inkontaktbringen des Plasmas mit einer Menge von Corn Trypsin Inhibitor (CTI), die ausreichend ist, um die Gerinnung zu hemmen, d) Recalcifizieren des Plasmas; und e) Untersuchen des recalcifizierten Plasmas.
Verfahren zum Untersuchen der Gerinnung in Plasma, wobei das Verfahren folgende Stufen umfasst: a) Behandeln einer Blutprobe mit einer Lösung, die eine antikoagulativ wirksame Menge von Corn Trypsin Inhibitor (CTI) und ein Calcium-chelatisierendes Mittel enthält, b) Unterwerfen der Blutprobe Bedingungen, die zur Bildung von Plasma führen, c) Recalcifizieren des Plasmas; und d) Untersuchen der Gerinnung in dem recalcifizierten Plasma.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Plasma von einem Patienten isoliert wird, der eine Blutgerinnungskrankheit, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus hämostatischer oder thrombotischer Abnormalität, Koagulationsinhibitordefizienz oder einer verbreiteten intravaskulären Krankheit, hat oder bei dem ein Verdacht hierauf besteht.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Plasma von einem Patienten erhalten wird, der einen Mangel an mindestens einem Blutgerinnungsfaktor hat oder bei dem ein Verdacht hierauf besteht.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Plasma von einem Patienten gewonnen wird, der sich einem invasiven chirurgischen Eingriff unterzogen hat oder unterziehen muss.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Blutgerinnungskrankheit Hämophilie vom Typ A, B oder C ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die in Stufe a) zugegebene Menge von Corn Trypsin Inhibitor (CTI) ausreichend ist, um die Gerinnungszeit etwa 10 Sekunden bis etwa 3 600 Sekunden zu verlängern.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Menge des Corn Trypsin Inhibitors (CTI) etwa 0,02 bis 1 mg CTI pro Milliliter Blut beträgt.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Stufe d) des Verfahrens zusätzlich das Zugeben eines etwa 500- bis etwa 2 000-fachen molaren Überschusses an Phosphotidylserin (25 mol-%) und Phosphatidylcholin (75 mol-%), verglichen mit der zugegebenen Menge an Gewebefaktor, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Stufe d) des Verfahrens zusätzlich das Zugeben von Gewebefaktor (TF) in einer Menge umfasst, die ausreichend ist, um etwa 0,001 bis 5 nM TF in dem Plasma zu ergeben.