DE3486262T2

DE3486262T2 - Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers mit Spezifizität für vernetzte Fibrinderivate und ein Testverfahren mittels dieses Antikörpers.

Info

Publication number: DE3486262T2
Application number: DE3486262T
Authority: DE
Inventors: Peter Gregory Bundesen; Dennis Brian Rylatt
Original assignee: Agen Biomedical Ltd
Current assignee: Agen Biomedical Ltd
Priority date: 1983-03-17
Filing date: 1984-03-16
Publication date: 1994-06-16
Anticipated expiration: 2004-03-17
Also published as: PH22957A; EP0122478A3; EP0122478B1; IL71264A; JPH0583240B2; NO841023L; NO167338B; DK158284D0; PT78267B; ZA841878B; PT78267A; AU572125B2; KR840008288A; US4758524A; CA1247022A; NO167338C; ATE99738T1; GR81951B; DE3486262D1; EP0122478A2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf einen monoklonalen Antikörper mit Spezifität für vernetzte Fibrinderivate, ein Verfahren zur Herstellung desselben und ein Analysenverfahren (assay procedure) unter Verwendung dieses Antikörpers.
Das Analysenverfahren gemäß der Erfindung kann als diagnostischer Test für Fibrinabbauprodukte bei der Fibrinolyse im allgemeinen und für präthrombotische und thrombotische Zustände einschließlich disseminierter intravaskulärer Koagulation (Disseminated Intravascular Coagulation) (DIC) verwendet werden.
Fibrinogen ist ein großes Proteinmolekül, das normalerweise im Blutplasma in gelöstem Zustand zirkuliert. Bei Angriff eines Enzyms Thrombin ketten sich die Fibrinogenmoleküle aneinander, richten sich spontan zu einem fadenähnlichen Polymer oder Netzwerk aus, welches mit Fibrin bezeichnet wird und der primäre Bestandteil von Blutgerinnseln ist.
Es wurde festgestellt, daß nach Digestion mit einem Enzym, das mit Plasmin bezeichnet wird, (welches im Blut bewirkt, daß das Fibrinnetzwerk zerstört und der flüssige Zustand des Plasmas wiederhergestellt wird), Fibrinogen in Fragmente zerfällt, welche mit A-E bezeichnet werden. Die Fragmente D und E machen die Menge der rückgewonnenen Masse aus, und es sind etwa zweimal soviel Fragmente D als Fragmente E vorhanden. Es wurde auch festgestellt, daß Fibrinogen eine trinodulare Form aufweist, wobei E eine zentrale Komponente und D eine Endkomponente ist.
Plasmindigests von Fibrin und Fibrinogen können voneinander differenziert werden durch Verwendung von Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE). Die Vernetzung von Fibrin mit einem Enzym, welches mit Faktor XIIIa bezeichnet wird, bildet Dimere des Fragments D, welche als D-Dimere bezeichnet werden. Der Faktor XIIIa ist ein Enzym, welches im Fibrin kovalente Bindungen zwischen benachbarten Monomeren einfügt und dadurch die Fibrinstruktur zu stabilisieren vermag. Für eine detailliertere Erklärung der Natur der Vernetzung zwischen Fibrinmonomeren wird Bezug genommen auf Budzynski et al, Blood, Vol. 54, No. 4 (Oktober) 1979.
Der Faktor XIIIa wird aktiviert durch die Thrombin-katalysierte Entfernung eines Peptids aus einem Precursor in dem Plasma und in Blutplättchen. Das D-Dimer ist ein Molekül von etwa 189.000 Dalton, welches im wesentlichen aus zwei Fragment-D-Stücken besteht, die aus verschiedenen Fibrinmolekülen abgeleitet sind, welche durch vernetzende Bindungen zwischen den gamma-Kettenresten von Fibrinogen kovalent gebunden sind. Fibrinogen selbst umfaßt 6 Ketten mit zwei Kopien einer alpha-, beta- und gamma-Kette.
Ein anderer Komplex (DD)E wird gebildet durch Plasminabbau von vernetztem menschlichem Fibrin und umfaßt eine Kombination von zwei D-Fragmenten und Fragment E.
Andere vernetzte Derivate können hergestellt werden, wie in einem Artikel in Seminars in Thrombosis and Haemostasis, Vol. 8, No. 1 (1982) unter dem Titel "Detection and Relevance of Crosslinked Fibrin Derivatives in Blood" von Graeff und Halfer beschrieben ist. Diese schließen vernetzte Derivate mit hohem Molekulargewicht ein, auf die in der oben angegeben Referenz als Derivate DY, YY, XD, XY, DXD und YXD Bezug genommen wird.
Normale Hämostase oder Koagulation von Blut beinhaltet, daß intravaskuläre Bestandteile in einer flüssigen Phase oder Suspension gehalten werden, während gleichzeitig in Bereichen von Gefäßschäden die lokale Ablagerung von Blutkomponenten der festen Phase gestattet wird. Bei Gesundheit wurde angenommen aber niemals experimentell bestätigt, daß eine Balance besteht zwischen einer niedrigen intravaskulären Ablagerung von Fibrin und seiner Entfernung durch Fibrinolyse oder zellulare Phagozytose.
Frühe klinische Beobachtungen brachten ans Licht, daß einige ernsthaft kranke Patienten Anzeichen von Hämorrhagie und massive Bildung blauer Flecken entwickelten und verlängerte Gerinnungszeiten und Thrombozytopenie hatten. Postmortal konnten in einigen Fällen Fibrinthromben in dem Mikrogefäßsystem nachgewiesen werden. Die diffuse Natur dieser Thromben führte zu dem Term "disseminierte intravaskuläre Koagulation" (DIC). Anschliessend zeigte sich, daß Koagulationsfaktoren reduziert waren. Diese Ergebnisse führten zu dem Konzept der "konsumptiven Koagulopathie" (consumptive coagulopathy), einem Term, der manchmal als ein Synonym für DIC verwendet wurde.
Die derzeit akzeptierte Sequenz der Vorgänge in DIC umfaßt Aktivierung des Koagulationssystems, woraus Plättchenverbrauch, Thrombinerzeugung, Fibrinablagerung und sekundäre Fibrinolyse resultieren. Der rein biologische Effekt dieses Prozesses reflektiert eine Balance zwischen Fibrinablagerung und Fibrinentfernung. Die resultierenden klinischen Manifestationen können Hämorrhagie sein, wenn eine Erschöpfung der Koagulationsfaktoren vorherrscht, oder ischämischer Gewebeschaden, zurückzuführen auf Effekte vaskulärer Verschlüsse.
Es wurde berichtet, daß DIC ein sekundäres Phänomen bei einer Vielzahl von Erkrankungen ist, insbesondere denjenigen, welche durch eine Kombination von Schock, Azidose und Hypoxämie begleitet werden. Die gut erkennbaren klinischen Assoziationen sind Sepsis, schweres Trauma, Malignität und obstetrische Störungen. In diesen klinischen Umgebungen resultiert aus der Aktivierung der Koagulationssequenz ein Verbrauch von Koagulationsprotein und Plättchen, was zu einer Fibrinablagerung in der Mikrozirkulation führt. Die genauen Faktoren, die DIC initiieren, sind nicht bekannt, aber viele potentielle Mechanismen sind in Tierversuchen gezeigt worden.
Im Idealfall würde eine definitive Diagnose von DIC die direkte Anzeige diffuser Fibrinablagerung erfordern. Die praktische Schwierigkeit, Ergebnisse aus mehrfacher direkter Biopsie zu erhalten, um zwischen lokalisierter und allgemeiner Fibrinbildung zu unterscheiden, hat zu der Entwicklung indirekter Tests geführt, die als diagnostische Endpunkte ersetzt werden. Diese Tests sind jedoch nicht spezifisch für das Syndrom der intravaskulären Fibrinablagerung. Ihre Spezifität wird weiter herabgesetzt durch die Wirkung anderer Enzyme, die, obwohl nicht in der Lage, Fibrinogen in Fibrin umzuwandeln, ähnliche Veränderungen wie Thrombin bei den anderen Koagulationsfaktoren, welche an der Thrombose beteiligt sind, bewirken können. Alle indirekten Tests basieren auf dem Prinzip, daß Thrombin das einzige Enzym ist (Schlangengifte ausgenommen), welches im Menschen Fibrinogen in Fibrin umwandeln kann.
Außer den Parakoagulationtests, welche die Gegenwart löslicher Fibrinmonomer-Komplexe detektieren, ist auch keiner der spezifischeren Thrombinspezifischen Tests ohne weiteres verfügbar oder nützlich für unmittelbare klinische Anwendung bei der Diagnose klinischer DIC. Diese Tests schließen den FPA (Fibrinopeptid A) Test, bei dem FPA durch ein spezifisches RIA Verfahren gemessen wird, Fibrinmonomer-Assays, Fibrinogengel-Ausschlußchromatographie und Tests für FPB (Fibrinopeptid B) oder Thrombin erhöhende FPB ein.
Tests mit biochemischer Nichtspezifität für die Thrombinwirkung schließen die Prothrombinzeit (PT), Thromboplastinzeit (A PPT) und Thrombingerinnungszeit (TCT) Tests ein. Obgleich häufig in der Praxis von Nutzen, muß erkannt werden, daß Information, die aus diesen Tests erhalten wird, in ihrer Natur unspezifisch ist und als ein Maß für die Gerinnungsfaktorverminderung unabhängig von der Ätiologie wirkt.
Es wurde auch gefunden, daß Koagulationsfaktor-Assays relativ unspezifisch sind, und diese schließen Assays für Kofaktoren V und VIII wie auch Tests für Fibrinogenspiegel ein.
Bis jetzt haben sich Tests für Fibrin-Fibrinogen-Abbauprodukte als unspezifisch für die Wirkung von Plasmin auf Fibrin erwiesen und können zu positiven Ergebnissen führen, wo eine Fibrinogenolyse ohne vorherige Thrombinwirkung auf das Fibrinogenmolekül stattgefunden hat. Diese Tests schließen Tests für die Fragmente D und E ein.
Es wurde gefunden, daß Tests für Thrombinvermittelte Plättchenwechselwirkung oder Freisetzung der Natur nach unspezifisch sind. Diese schließen Plättchenzahl, Plättchenlebensdauer und Plättchenfreisetzung ein.
Es wurde auch versucht, radiomarkiertes Fibrinogen im Hinblick auf die Identifizierung von Gerinnungsfaktoren zu verwenden, aber als zu zeitaufwendig und als zu schwierig in der Ausführung befunden.
So liegt, den Stand der Technik zusammenfassend, die Wirksamkeit eines diagnostischen Tests in seiner Fähigkeit, die An- oder Abwesenheit von Krankheit anzuzeigen. Es gibt gut bekannte wesentliche Designprinzipien für Studien zur Bestimmung der Wirksamkeit eines diagnostischen Tests, welche gestatten, die vier Indices Empfindlichkeit, Spezifität, positiv vorhersagbarer Wert und negativ vorhersagbarer Wert zu bestimmen. Die erste Forderung ist die Adoption eines geeigneten Diagnosestandards. Im Idealfall sollte sollte dieser Standard etwas mehr als eine klinische Definition sein und sollte so spezifisch wie möglich sein im Hinblick auf das Wesen der Krankheit. Eine inhärente Schwierigkeit in Beziehung zu DIC ist das Fehlen einer umfassenden Definition dieser Krankheit. Das klinische Bild ist sehr unspezifisch. Vielen der routinemäßig verfügbaren Laboratoriumtests fehlt auch die diagnostische Spezifität. Eine niedrige Plättchenzahl unterstützt die Wahrscheinlichkeit von DIC, kann aber auch als ein isolierter Befund im Nachgang zu einer Infektion auftreten.
Viele Koagulationsassays können ähnlichen Einschränkungen unterliegen. Hypofibrinogenämie unterscheidet nicht zwischen primärer Fibrinolyse, zurückzuführen entweder auf die Wirkung von Plasmin oder Elastasen, und sekundärer Fibrinolyse, welche einer Thrombinvermittelten Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin folgt. Alternativ sind empfindliche Tests der Thrombinwirkung verfügbar, aber es gibt offensichtlich Nachteile bei ihrer klinischen Anwendung. Ein Beispiel ist der FPA Assay, welcher, obwohl spezifisch für die Thrombinwirkung, äußerst empfindlich ist und lokale intravaskuläre Koagulation anzeigen kann, was zu einem positiven Ergebnis bei unkomplizierter venöser Thrombose führt. Die klinische Bedeutung eines erhöhten FPA Spiegels, sogar mit einem positiven Parakoagulationstest, ist dann angezeigt insbesondere wenn die Plättchenzahl, globale Gerinnungstests und Fibrinogenspiegel normal sind.
Aus diesen Gründen können Empfindlichkeit, Spezifität und vorhersagbare Werte nicht im Standardverfahren bestimmt werden. Die klinische Darstellung der Krankheit ist komplex und nicht vorhersagbar. Die Anwendung der verfügbaren Diagnosetests werden daher am besten betrachtet im Hinblick auf die verschiedenen klinischen Syndrome intravaskulärer Koagulat ion.
In Fibrinogen-Structure, Functional Aspects, Metabolism, Vol. 2, Seiten 227-233, 1983 (Walter de Gruyter & Co, Berlin-New York) werden monoklonale Antikörper beschrieben, welche auf vernetzte Fibrin-Abbauprodukte und Fibrinogen-Abbauprodukte D und E gerichtet sind.
Es wurde auch vorgeschlagen, auf das D Dimer hin zu analysieren als diagnostischer Test für DIC. Dies hätte jedoch, wie zuvor beschrieben, die Verwendung von PAGE erforderlich gemacht, und diese Technik ist viel zu umständlich für klinische Routineanwendung. Man hat Antikörper zu von Fibrin abgeleiteten D-D-E Fragmenten entstehen lassen, aber in ihrer gegenwärtigen Form führen diese eine Vernetzungsreaktion mit Fibrinogenfragment D Derivaten aus und sind bis jetzt unbrauchbar für klinische Anwendung.
Eine nützliche Zusammenfassung von DIC und konventionellen diagnostischen Tests findet sich in Seminars in Thrombosis and Hemostasis, Vol. 8, No. 3 (1983) und in einem Artikel mit dem Titel DIC: The Application and Utility of Diagnostic Tests, von Ockelford and Carter.
Die oben angegebene Budzynski Referenz beschreibt das Studium von polyklonalen Anti-D-Dimer-Antikörpern bei Verwendung zweier verschiedener Antiseren. In diesem Test hat man Antikörper gegen spezifische Marker auf dem D-Dimermolekül entstehen lassen. In dem Test wurden Antiseren in Hühnern und Hasen erhalten gegen eine Mischung (1 : 1) von D&sub2;E Komplex und D-Dimer und gegen D-Dimer, das einem 3M Bereich ausgesetzt war bei pH 5,5. Wie aus Tab. 1 (S.19) ersichtlich ist, zeigten Antiseren einen hohen Titer gegen Harnstoff-behandeltes Fragment DD. Im Vergleich dazu ist die Reaktionsfähigkeit mit intaktem Fragment DD nahezu vernachlässigbar. Da ein diagnostisches Verfahren auf Serum oder Plasma nicht gestattet, das DD durch Harnstoffbehandlung zu modifizieren, sind die Antiseren gegen Harnstoff behandeltes DD, wie sie von Budzynski et al erhalten werden, nicht brauchbar in einem diagnostischen Test bei Verwendung von Serum oder Plasma. Deshalb wird ein Fachmann auf diesem Gebiet aus diesen Daten ein Vorurteil ableiten, was die Verwendung polyklonaler oder monospezifischer Antikörper gegen Fragment DD aufgrund von Vernetzungsfähigkeit mit Fragment D anbelangt. Er wird auch ableiten, daß ein Verfahren zur Herstellung von Antiseren gegen Harnstoff behandeltes D-Dimer nicht zu einem erfolgreichen klinischen Test von intaktem D-Dimer, wie es in Serum und Plasma vorhanden ist, führt. Die Tatsache, daß Budzynski keinen diagnostischen Test für klinische Anwendung bereitstellt, wird weiterhin durch die Tatsache unterstützt, daß der Test, der von diesem Autor beschrieben wird, wenigstens sechs Tage zu seiner Ausführung benötigt (siehe Seite 797, erster Paragraph).
Der oben erwähnte Graeff und Hafter Artikel stellt auch heraus, daß vernetzte Fibrinderivate im Blut, wie D-Dimer, als ein Marker für DIC betrachtet werden können. Es ist jedoch in diesem Artikel nichts zu finden, das beweist, daß ein verläßlicher Test für DIC ausgearbeitet werden könnte, der auf vernetzten Fibrinderivaten basiert. Es ist deshalb ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Analysenverfahren (assay procedure) für vernetzte Fibrinderivate vorzustellen, welches auf einer klinischen Basis verwendet werden könnte. Der Gegenstand der Erfindung wird gelöst durch die Bereitstellung eines monoklonalen Antikörpers, wie in den Ansprüchen 1 und 2 definiert ist. Des weiteren umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des besagten monoklonalen Antikörpers, abgeleitet von einem vernetzten Fibrinderivat, das die Schritte umfaßt:
(i) ein vernetztes Fibrinderivat oder ein Extrakt zu erhalten, welches dasselbe enthält, und
(ii) einen Antikörper zu bilden, der spezifisch ist für vernetzte Fibrinderivate, aber nicht Fragment D, durch Klonen von Antikörper bildenden Zellen von einem Tier, dem besagtes Derivat oder besagtes Extrakt verabreicht worden ist.
In Schritt (i) konnte ein geeignetes Antigenextrakt erhalten werden durch plasmischen Abbau von Fibrinklumpen oder durch gleichzeitige Einwirkung von Thrombin, Faktor XIIIa und Plasmin auf Fibrinogen mit vorübergehender Klumpenbildung und anschließender Lyse der Klumpen. Bei der letzteren Methode wird das Fibrinogen in Fibrin umgewandelt durch die Einwirkung von Thrombin und Faktor XIIIa und anschließend digeriert mit Plasmin. Es ist natürlich erwünscht, daß das Fibrinderivat oder Extrakt, das dasselbe enthält, von einer menschlichen oder einer anderen geeigneten tierischen Quelle erhalten werden kann.
Die obigen Verfahren zum Erhalt der rohen Antigenfraktion sind in vitro Verfahren. Noch ein geeignetes in vivo Verfahren wäre, die Seren oder andere Körperflüssigkeiten, welche das vernetzte Fibrinderivat von einem Tier einschließlich des Menschen enthalten, zu erhalten und die Körperflüssigkeit einem PAGE Verfahren zu unterwerfen, bei dem im wesentlichen reine vernetzte Fibrinderivate isoliert werden könnten.
Alternativ könnten vernetzte Fibrinderivate, die aus einem Serum von Patienten erhalten werden, die an ernsthaften thrombotischen Störungen leiden, gereinigt werden auf der Basis einer Technik, die Gelfiltration in Kombination mit Ionenaustauscher-Chromatographie verwendet und beschrieben ist von Willner et al, Biochemistry 21, 2687-2692 (1982), wo humanes Fibrinogen, gereinigte Fragmente D, E und D-Dimer hergestellt wurden.
Wenn reine vernetzte Fibrinderivate verwendet werden wie das D- Dimer, dann muß bei seiner Herstellung darauf geachtet werden, daß das Molekül nicht verändert wird, denn es ist sehr leicht anfällig für Denaturierung.
Wegen einer vollständigeren Beschreibung der oben erwähnten Verfahren zur Herstellung eines Antigenextrakts, das im allgemeinen im Rohzustand ist, wird Bezug genommen auf den oben erwähnten Graeff und und Hafter Artikel. Geeignete vernetzte Fibrinderivate zur Verwendung in der Erfindung können eines der zuvor beschriebenen sein, aber vorzugsweise ist das Derivat D&sub2;E oder D-Dimer, und am besten geeignet für die Verwendung in der Erfindung ist D-Dimer.
In Schritt (ii) ist ein geeignetes Tier, dem das Derivat oder Extrakt verabreicht werden kann, eine Maus oder eine Ratte. Eine Maus wird bevorzugt. Es wird auch bevorzugt, am Anfang ein oder mehrere Male rohes Extrakt zu verabreichen und dieses weiterzuverfolgen mit der Verabreichung von reinem oder im wesentlichen reinem vernetztem Fibrinderivat. Dieses Vorgehen wird bevorzugt, so daß die Aufgabe, monoklonale Antikörper, welche spezifisch gegenüber dem Derivat sind, vereinfacht ist.
Nach der Verabreichung werden die Mäuse, denen Derivat oder Extrakt verabreicht worden war, auf geeignete Weise getötet und die Milzen für die nachfolgende Verarbeitung zu einer Zellsuspension entfernt. Weitere Reinigung der Zellsuspension kann stattfinden (z. B. durch Zentrifugieren), um aus der Milz weiße Blutzellen oder Lymphozyten zu isolieren, welche mit Maus-Myelomzellen verschmolzen sein können.
Die Klonierungstechnik kann auf breiter Grundlage auf der Technik basieren, die von Galfre et al Nature 266, 550-2 (1977) beschrieben ist, bei der Polyethylenglykol als Zellverschmelzungsmittel verwendet wird, um eine Hybridomzelle zu bilden, die dann wie gewünscht geklont oder rückgeklont wird, in geeigneter Weise auf der Basis begrenzter Verdünnung unter Verwendung von Zellzuführschichten.
Für die Züchtung von Hybridomzellen werden vorzugsweise Platten mit Vertiefungen (well plates) verwendet, wobei in jede Vertiefung Zellsuspensionen zusammen mit geeigneten Zellzüchtungsmitteln gegeben werden.
Es wird bevorzugt, Zellproben zu entnehmen für Screening-Assays, und diese können wie nachfolgend beschrieben ausgeführt werden. Eine Anzahl von Vertiefungen mit stärkstem Wachstum werden in geeigneter Weise ausgewählt für Aufrechterhaltung auf der Basis von Screening Assays. Nach den Screening Assays ist es möglich, eine Anzahl spezifische Antikörper produzierender Klontypen auszuwählen, um monoklonale Antikörper absondernde Zell-Linien durch begrenzte Verdünnung herzustellen.
Auf der Basis weiterer Screening Assays, welche an Proben durchgeführt wurden, die von Platten mit Vertiefungen entnommen wurden und die die Klontypen durch begrenzte Verdünnung enthalten, können eine Anzahl spezifischer durch Antikörper hergestellte Klone ausgewählt werden für die Ausweitung auf Massenkultur. Ein geeigneter Screening Assay für die Verwendung in dem oben erwähnten Verfahren kann die Schritte umfassen:
(a) Beschichten einer Oberfläche mit Antigen, ausgewählt aus vernetztem Fibrinderivat oder Extrakt, welches besagtes enthält, oder Fibrinogenabbauprodukt,
(b) in Verbindung bringen des Antigens in Schritt (i) mit monoklonalem Antikörper, der spezifisch für vernetztes Fibrinderivat aber nicht für Fragment D ist und wie oben beschrieben hergestellt wird,
(c) Unterwerfen des Komplexes, der in Schritt (ii) gebildet wurde, einem Signalverstärkungsschritt.
In Schritt (a) kann nützlicherweise eine Platte mit Vertiefungen verwendet werden, in der vernetztes Fibrinderivat, wie zum Beispiel D-Dimer und/oder Fibrinogenabbauprodukt (vorzugsweise in einem Verfahren erhalten, bei dem Fibrinogen in geeigneter Weise mit Thrombin digeriert wurde, um Fragment D, Fragment E und wahlweise Fragmente X und Y zu erhalten) auf die einzelnen Vertiefungen angewendet wurde.
Anschließend wurde dann monoklonaler Antikörper, welcher von vernetztem Fibrinderivat abgeleitet wurde, jeder Vertiefung zugefügt. Ein geeigneter Signalverstärkungsschritt, welcher angewendet werden kann, ist ein EIA Schritt, bei dem ein geeignetes Enzymkonjugat an den Komplex gekuppelt werden kann und Substrat anschließend zugefügt wird. Alternativ können RIA, FIA, Agglutination, Adhärenz oder Chemolumineszenz als geeignete Signalverstärkungsschritte verwendet werden.
Der Zweck des Screening Assays, auf das oben Bezug genommen wird, ist, sicherzustellen, daß die Zellen, welche getestet werden, Antikörper produzieren, die spezifisch für die relevanten vernetzten Fibrinderivate sind, aber nicht für Fragment D. Es sollte keine Reaktion mit Fibrinogen oder Fibrinogen-Abbauprodukten stattfinden und eine positive Reaktion mit dem Derivat.
Die Erfindung umfaßt in ihrem Umfang auch ein Assayverfahren für den Nachweis der Gegenwart eines vernetzten Fibrinderivats, welches die Schritte umfaßt:
(1) In Berührung bringen eines monoklonalen Antikörpers, welcher für vernetzte Fibrinderivate spezifisch ist, aber nicht für Fragment D, mit einer Flüssigkeitsprobe, die erwartungsgemäß ein Antigen, welches von einem vernetzten Fibrinderivat abgeleitet ist, oder ein vernetztes Fibrinderivat per se enthält; und
(2) Unterwerfen des in Schritt (1) gebildeten Komplexes einem Signalverstärkungsschritt.
In dem ober erwähnten Assayverfahren ist das vernetzte Fibrinderivat in geeigneter Weise D-Dimer, D&sub2;E oder irgendein anderes Derivat hochmolekularer Natur, wie oben beschrieben. Der monoklonale Antikörper wird wie zuvor beschrieben hergestellt, welcher wichtig ist für das bestimmte vernetzte Fibrinderivat, welches analysiert wird.
Der einzelne Verstärkungsschritt kann irgend einer derjenigen sein, die im Zusammenhang mit dem Screening Analysenverfahren bereits beschrieben wurden, ist aber vorzugsweise EIA.
Die Anwesenheit des vernetzten Fibrinderivats kann verwendet werden als geeignete diagnostische Hilfe für präthrombotische, thrombotische oder andere Zustände, die die Bildung und den Zerfall von Fibrin beinhalten.
Der Assay gemäß der Erfindung kann auch verwendet werden zur Überwachung lytischer Therapie, wie zum Beispiel Streptokinase-Therapie und Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Therapie (TPA). Ein Beispiel für einen präthrombotischen Zustand ist ein Stresszustand. Beispiele für thrombotische Zustände schließen DIC, Lungenembolie, Thrombose, invasive Tumoren und andere thrombotische Zustände, welche nachfolgend beschrieben werden, ein.
Die Flüssigkeitsprobe kann aus irgendeiner Körperflüssigkeit, wie Lymphe, Serum, Plasma oder Exudat erhalten werden.
Das Assayverfahren kann durchgeführt werden unter Verwendung eines Rohrs, einer Platte mit Vertiefungen oder einer Mikroplatte, wie zuvor beschrieben, oder kann in jeder anderen geeigneten Weise einschließlich konventioneller Verfahren durchgeführt werden. Ein "Klebe"verfahren, welches ein einzelnes verlängertes Element verwendet, kann verwendet werden, bei dem anfänglich Ag oder Ab darauf abgeschieden wird vor Anwendung der Schritte (b) und (c).
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können die monokloklonalen Antikörper kovalent an kleine Perlen gebunden werden. Solche Perlen ermöglichen einen schnellen (d. h. 2-3 Minuten) Test, welcher in Serumplasma oder anderen Körperflüssigkeiten auf das Vorhandensein von vernetzten Fibrinderivaten durchgeführt werden kann. Die Perlen können aus Polystyrol, Nylon, Glas oder anderem geeigneten Material hergestellt werden. Was Polystyrol anbetrifft, kann das Mab mit diesem verbunden werden unter Anwendung der Carbodiimid Methode, wie beschrieben von Molday et al in J. Cell Bio 64, 75 (1975). Für Nylonperlen ist ein geeignetes Verfahren zur Verbindung, das Glutaraldehyd verwendet, von Hendry und Herrman in J. Immun. Method 35, 285 (1980) beschrieben. Für die Verbindung mit Glasperlen ist ein geeignetes Verfahren, das Silanagentien verwendet, in U. S. Patent 4 210 723 beschrieben. In diesen Perlenassays oder Latexassays können, wenn die Perlen, die bereits mit MAb verbunden sind, mit Testserum oder Plasma oder Körperflüssigkeit getestet werden, die Perlen auf Agglutination geprüft werden unter Verwendung eines geeigneten Eichstandards. In diesem Ausführungsbeispiel werden Latexpartikel oder Perlen als gleichmäßige Kugeln hergestellt mit bekanntem Brechungsindex und als Eichstandards verwendet für Lichtstreuungsvergrößerung, Schattenwinkel, Dicke des Schattenmaterials, Raster- und Transmissions-Elektronenmikroskopie oder Laserstreuung.
Es ist natürlich erwünscht, daß Assays, welche auf einer Einfang- Markierungstechnik basieren, bei der ein erstes MAb von einem Antigen eingefangen wird, welches danach markiert wird durch ein gekennzeichnetes zweites MAb (wobei die Kennzeichnung in geeigneter Weise in einem EIA oder RIATest verwendet werden kann), im Hinblick auf diese Erfindung Anwendung finden können.
In einigen Fällen können jedoch Assays, welche auf der Verwendung eines einzigen MAb basieren, angewendet werden wie die oben erwähnten Perlen- oder Latexanalysen.
In Beziehung auf ein Assay für ein spezifisches vernetztes Fibrinderivat wurde gefunden, daß von allen getesten MAbs eine Anzahl, welche panspezifisch waren, entdeckt wurde (d. h. Bindung an Epitope oder reaktive Gruppen an Fibrinabbauprodukten wie auch an Fibrinogenabbauprodukten), und andere waren monospezifisch (d. h. Bindung nur an reaktive Gruppen an D-Dimer und an andere vernetzte Fibrinderivate).
Wenn Einfang-Markierungstechnik-Experimente, wie nachfolgend diskutiert wird, in einem Assaytyp ausgeführt wurden, wurde ein monospezifisches MAb an die Oberfläche einer Unterlage gebunden und mit Serum oder anderer Körperflüssigkeit getestet, von der erwartet wird, daß sie vernetzte Fibrinderivate enthielt. Wenn markiert mit einem zweiten Antikörper, welcher ein panspezifisches MAb, befestigt an einer geeigneten Kennzeichnung, war, die in dem Signalverstärkungsschritt verwendet wurde, ergab dieses einen präzisen Assay auf vernetztes Fibrinderivat, wenn das panspezifische MAb mit einem Epitop in der Probe verbunden war.
In Abänderung dieser Technik könnte ein panspezifisches MAb an die Oberfläche einer Unterlage gebunden und mit Körperflüssigkeit getestet werden, von der erwartet wird, daß sie das vernetzte Fibrinderivat enthielt. Anschließend könnte ein monospezifisches MAb als Markierung mit dem Antigen der Körperflüssigkeit, welches mit einer geeigneten Kennzeichnung versehen ist, verbunden werden.
In einer anderen Version ist es auch möglich, ein erstes monospezifisches MAb an die Oberfläche einer Unterlage zu binden und besagtes mit einer Probe von Körperflüssigkeit zu testen, von der erwartet wird, daß sie ein vernetztes Fibrinderivat enthält. Anschließend könnte ein zweites monospezifisches MAb als Markierung mit dem Antigen der Körperflüssigkeit, welches mit einer geeigneten Kennzeichnung versehen ist, verbunden werden.
In den folgenden Experimenten werden Humanfibrinogen und gereinigte Fragmente D, E und D-Dimer hergestellt, wie oben in der Wilner Referenz beschrieben. Fibrinogenabbauprodukte wurden hergestellt, wie von Haverkate und Timan in Thromb. Res. 10, 803-812, (1977) beschrieben ist. Vernetztes Fibrin, welches für die Herstellung von D-Dimer erforderlich war, wurde hergestellt und mit Plasmin digeriert, wie von Olexa und Budzynski in Biochemistry 18, 991 (1979) beschrieben ist.

EXPERIMENTELLER TEIL

Zellverschmelzung und Hybridauswahl

Milzen wurden aseptisch von zwei immunisierten Mäusen, welche durch zervikale Dislokation getötet wurden, drei Tage nach einer Injektion von D-Dimer entnommen. Zuvor waren die Mäuse immunisiert worden durch drei Injektionen von Fibrinlysat, digeriert mit proteolytischen Enzymen Thrombin und Plasmin, wie in der zuvorgenannten Graeff und Hafter Referenz beschrieben ist. Zwei Milzen wurden in eine 60 mm Petrischale gelegt (Falcon, 3001, Oxnard, Calif.), die 5 ml vollständigen Mediums (85% RPMI 1640, 15% fetales Kalbserum, 100 I.U./ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin und 2·10&supmin;³ M Glutamin; Gibco, Grand Island, N.Y.) enthielt. Eine Zellsuspension wurde hergestellt durch Entkapseln der Milz mit 2·18 Standardmaß Nadeln, welche an 3 ml fassenden Spritzen befestigt waren, wobei der letzte cm der Spitze auf einen Winkel von 60º umgebogen war. Die Zellsuspension wurde dann mit einer 10 ml Spritze angesaugt, die mit einer 22 Standardmaß Nadel ausgestattet war, und mit mäßigem Druck ausgedrückt. Dieser Vorgang wurde zweimal ausgeführt, ehe die Zellen durch ein feinmaschiges Edelstahlsieb in eine Falcon 2001 Röhre filtriert wurden, um größere Zellklumpen und Trümmer zu entfernen.
Die Zellsuspension wurde 5 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, damit sich kleinere Klumpen und Membranfragmente absetzen konnten, ehe die Zellsuspension in eine frische Falcon 2001 Röhre übertragen wurde. Die Zellen wurden fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit 350G zentrifugiert, und die obenstehende Flüssigkeit wurde von dem Rückstand der ersten Zelle in eine frische Röhre abdekantiert und 5 Minuten lang in 700G Drehungen versetzt, um einen zweiten Zellrückstand zu erhalten, und die beiden Rückstände wurden zusammengetan und in 5 ml des vollständigen Mediums resuspendiert. Die weißen Blutzellen der Milz (spleen white blood cells) (SWBC) wurden dann gezählt und ihre
Lebensfähigkeit durch Turks und Trypan blaue Färbungen jeweils geschätzt, und 100·10&sup6; lebensfähige SWBC wurden in getrennte Falcon 2001 Röhren gegeben in einem Gesamtvolumen von 5 ml des vollständigen Mediums. Die NS-1 Myelomzellen, welche für die Verschmelzung verwendet wurden, wurden einmal gewaschen durch 15 Minuten dauerndes Zentrifugieren bei 380G und Raumtemperatur und auf 5·10&sup6; lebensfähige Zellen/ml in vollständigem Medium eingestellt.
Fünfundzwanzig · 10&sup6; NS-1 und 100·10&sup6; immune SWBC wurden gemischt und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in 350G Drehungen versetzt. Die obenstehende Flüssigkeit wurde dekantiert, das zurückbleibende Medium wurde sorgfältig mit einer Pasteur Pipette entfernt und 2 ml einer 42%igen (Gew./Vol.) Lösung von Polyethylenglykol (PEG, MW1540) (Baker Chemical Co., New Jersey) in RPMI 1640, welche 15% (Vol./Vol.) Dimethylsulfoxid (DMSO) bei 37ºC enthielt, wurden zugefügt mit einer 5 ml Glaseinwegpipette (Corning Glass, Corning, N.Y.), und die Zellen wurden resuspendiert mit der gleichen 5 ml Pipette für 30 Sekunden mit der Hilfe eines elektrischen Pipetters (Pipet-aid Drummond Scientific Co., Broomall, Pa.). Die PEG Zellsuspension wurde weitere 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur stehengelassen, ehe 5 ml des vollständigen Mediums tropfenweise mit einer Pasteur Pipette über eine Peribde von 90 Sekunden zugegeben wurden, bei konstantem schnellem Drehen der Röhre, welches ausreichend war, ein vollständiges Mischen mit der viskosen PEG Lösung zu gewährleisten. Weitere 5 ml des vollständigen Mediums wurde unmittelbar danach zugefügt und gemischt durch Wenden, und man ließ die Zellsuspension weitere 150 Sekunden bei Raumtemperatur stehen vor dem 5 Minuten dauernden Zentrifugieren bei 350G bei Raumtemperatur. Das Obenstehende wurde dekantiert, und der feste Rückstand der Zelle wurde sanft resuspendiert in 5 ml des vollständigen Mediums unter Verwendung einer 5 ml Pipette mit dem elektrischen Pipetter; es wurde mit extremer Vorsicht verfahren, um nicht alle Zellklumpen aufzubrechen. Unter Verwendung eines Tridak Steppers (Bellco Glass Inc., Vineland, N.J.) wurden 0,05 ml der Zellsuspension zu jeder Vertiefung von 4 Costar 24 Platten mit Vertiefungen (Costar 3524, Cambridge, Mass.) gegeben, welche 1·10&sup6; normales BALB/c Maus SWBC als Fütterzellen in 1 ml vollständigen Mediums mit einem Gehalt an 10&supmin;&sup4; M Hypoxanthin (Sigma), 4·10&supmin;&sup7; M Aminopterin (Sigma), 1,6·10&supmin;&sup5; M Thymidin (Sigma) und 4·10&supmin;&sup5; M 2-Mercaptoethanol (HAT medium) enthielt und auf die nachfolgend als 1º Fusionsplatten Bezug genommen wird.
Die 10 Fusionsplatten wurden dann in eine angefeuchtete 5% CO&sub2; 95% Luftatmosphäre bei 37ºC gegeben. Die Zellen wurden zuerst gefüttert entweder an den Tagen 5 oder 7 und danach, wenn notwendig, mit 0,5 ml frischen HAT Mediums. Im allgemeinen wurden an Tag 10 0,5 ml des Mediums von jeder Vertiefung entnommen für die Screening Analyse, welche Hybridomwachstum zeigte, und 0,5 ml frisches HAT Medium wurde ersetzt.
Eine Anzahl der Vertiefungen mit stärkstem Wachstum wurden für die Aufrechterhaltung auf der Basis der Screening Analyse ausgewählt. Die ausgewählten Vertiefungen ließ man wachsen bis zum Zusammenfluß in der originalen Vertiefung (1º Vertiefung), dann wurde jede hälftig aufgeteilt und in eine frische Vertiefung (2º Vertiefung) einer 24 Vertiefungen Costarplatte (2º Platte) übertragen. Die Vertiefungen wurden täglich geprüft und wenn notwendig zu einer zweiten, dritten oder vierten Vertiefung der 2º 24-Vertiefungen Costarplatte erweitert. Von den Tagen 14-28 an wurden die Zellen mit HT Medium gefüttert. Wenn ein starkes Wachstum in wenigstens 2 Vertiefungen der 2º Platte stattfand, wurde Obenstehendes von jeder Vertiefung eines jeden Klontyps ausgewählt für Rescreening, und eine Anzahl spezifische Antikörper produzierender Klontypen wurden ausgewählt aus den Ergebnissen des zweiten Screening- Assays, um monoklonale Antikörper absondernde Zell-Linien durch begrenzte Verdünnung herzustellen.

Klonen von Hybridomzellen

Eine 2º Vertiefung jedes ausgewählten Klontyps wurde resuspendiert, und die Anzahl der lebensfähigen Zellen pro Vertiefung wurde geschätzt durch Trypan Blau Ausschluß. Unmittelbar vor dem Plattieren jedes Klontyps wurden die relevanten Verdünnungsserien in HT Medium oder vollständigem Medium gemacht (wenn die Zellen älter als 28 Tage nach der Verschmelzung waren), um eine Frequenz von 0,5 Zellen/0,05 ml zu ergeben. Dieses Volumen wurde dann mit einem Tridak Stepper zu jeder Vertiefung einer 96 Vertiefungen Gewebekulturplatte mit flachem Boden gegeben (Flow Laboratories, Mississauga, Ontario, Canada) (LD Platte), welche 1·10&sup5; normale Mausmilz-Fütterungszellen in 0,1 ml HT oder vollständigem Medium enthielt. Die LD Platten wurden dann in ein 37ºC befeuchtete 5% CO&sub2;, 95% Luftatmosphäre gebracht und 7 bis 10 Tage später auf klonales Wachstum untersucht. Von jeder Vertiefung positiven Wachstums wurden 0,1 ml Obenstehendes für Screening entfernt, und diese Vertiefungen wurden zum ersten Mal mit 0,1-0,15 ml HT oder vollständigem Medium versorgt. Auf der Basis von LD Screening Assay wurde schließlich ein Minimum von 2 der 'besseren' spezifische Antikörper produzierenden Klone für die Ausweitung auf Massenkultur ausgewählt.
Alternativ, wenn es erwünscht war, eine große Menge von MAb zu erhalten, wurde weiblichen BALB/c Mäusen eine intraperitoneale Injektion von 0,5 ml 2,5,10,14-Tetramethylpentadecan (Pristane, Aldrich Chemical Corp., Milwaukee, Wisconsin) 14 Tage vor der Injektion von 2·10&sup6; lebensfähigen Hybridomzellen gegeben, und Aszitesflüssigkeiten wurden von den Mäusen 12 bis 14 Tage nach Injektion der Zellen gesammelt. Die Aszitesflüssigkeit wurde durch Zentrifugieren geklärt, und MAbs wurden gewonnen durch Ausfällen mit 45% Ammoniumsulfat und aufbewahrt entweder bei 4ºC oder -70ºC in Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS), welche 0,01% Natriumazid enthielt.

Monoklonale Antikörper Screening Analyse

Die Vertiefungen einer 96 Vertiefungen U Boden Mikrotestplatte (Disposable Products Pty. Ltd., Adelaide, South Australia) wurden beschichtet durch Hinzufügen von 50 ul entweder von D Dimer (5 ug/ml) oder von Fibrinogen Abbauprodukten (5 ug/ml) in PBS während einer Stunde bei Raumtemperatur (25ºC). Überschüssiges Antigen wurde entfernt durch Wenden und Klopfen der Platte, und die Platte wurde dann dreimal mit PBS, welches 0,05% Tween 20 (Sigma Chemical Corp., St Louis, Missouri) enthielt, gewaschen. Klone, welche MAb an D-Dimer oder Fibrinogen- Abbauprodukte sekretieren, wurden dann detektiert durch Hinzufügen von 50 ul Gewebekultur, auf jeder Vertiefung obenstehend, und Inkubieren für eine Stunde bei Raumtemperatur. Nicht gebundenes MAb wurde entfernt durch Umkehren und Klopfen, und die Platte wurde dreimal mit PBS/Tween gewaschen. Einhundert ul einer 1/1000 Verdünnung von Peroxidase konjugiertem Hasen Antimaus Immunglobulin (Dakopatts, Kopenhagen, Dänemark) in PBS/Tween wurden hinzugefügt für ein Inkubieren während einer weiteren Stunde bei Raumtemperatur. Die Platte wurde wieder gewendet und dreimal gewaschen mit PBS/Tween, und 100 ul von aktiviertem Substrat (unmittelbar vor Verwendung wurden 10 ul einer 3%igen Lösung von Wasserstoffperoxidlösung zu 10 ml einer Substratlösung gegeben, welche 50 mM Citrat, 2,5 mM o-Tolidindihydrochlorid (o-Tolidin, Sigma Chemical Co., rekristallisiert aus verdünnter HCl), 0,025 mM EDTA enthielt, pH 4,5) wurden jeder Vertiefung zugegeben. Die Farbreaktion wurden nach 10 Minuten angehalten durch die Zugabe von 50 ul 3M HCl, welche einen Farbwechsel von blau nach gelb verursachte, und die Absorbanz wurde aufgezeichnet bei 450 nm auf einem Titertek multiscan.

Peroxidasekonjugation

Die Konjugation von D Dimer monoklonalen Antikörpern wurde ausgeführt durch eine Modifikation des Verfahrens von Nakane and Kaiwoi, J. of Histochem and Cytochem 22, 1084-91, (1974) mit Perjodat oxidierter Peroxidase. 5 mg/ml Peroxidase in destilliertem Wasser wurden gemischt mit einem 1/5 Volumen von 0,1 M Natriumperjodat, für 20 Minuten bei Raumtemperatur, und nicht umgesetztes Perjodat wurde durch Gelfiltration an einer Säule von Sephadex G25, äquilibriert mit 0,001 M Citrat, pH 4,5 entfernt. Monoklonale Antikörper (in PBS) wurden in einem Verhältnis von 2 mg Antikörper per mg Peroxidase zugefügt, und der pH wurde unmittelbar auf pH 9,0-9,5 eingestellt durch die Zugabe von 1 M Natriumcarbonat, pH 9,5. Man ließ die Reaktion 2 bis 3 Stunden lang bei Zimmertemperatur fort schreiten mit gelegentlichem Mischen und Beendigung durch die Zugabe von 1/10 Volumen 2,0 M Ethanolamin, pH 9,5, Barbour, H.M., J. of Immunol Meth. 11, 15-23, (1976). Nach Stehenlassen über Nacht bei 4ºC wurde Ethanolamin durch Gelfiltration auf einer Sephadex G25 Säule, äquilibriert mit PBS, entfernt und das Enzymkonjugat wurde aufbewahrt bei 4ºC in Gegenwart von 0,01% Methiolat.

Proteinbestimmung

Proteinbestimmung wurde ausgeführt nach der Methode von Rylatt and Parish, Analytical Biochem, 121, 213-214 (1982).

Einfangmarkierungs-Experimente und D-Dimer Analyse

Antigen Einfang/Markierungs-Experimente wurden durchgeführt durch Inkubieren von jeder Vertiefung einer 96 Vertiefungen Mikrotiterplatte mit 50 ul (10 ug/ml) jedes der relevanten MAb in PBS für eine Stunde bei Raumtemperatur. Nichtgebundenes MAb wurde entfernt durch Wenden und Klopfen der Platte, gefolgt von Waschen mit PBS/Tween, wie für den Screening Assay beschrieben. Antigeneinfang wurde dann erreicht durch Zugabe von 50 ul jedes Antigens (0-1 mg/ml) in PBS/Tween zu den MAb beschichteten Vertiefungen während einer Stunde bei Raumtemperatur. Die Vertiefungen wurden, wie zuvor beschrieben, gewaschen. Eingefangenes Antigen wurde dann markiert mit Peroxidase konjugiertem MAb durch Zugabe von 50 ul (1 ug/ml) der verschiedenen Peroxidase konjugierten MAb in PBS/Tween zu jeder Vertiefung für eine Stunde bei Raumtemperatur. Nach dem Waschen wurde das Vorhandensein von gebundenem Konjugat bestimmt durch die Zugabe von 100 ul Substrat, wie in dem Screening Assay beschrieben. Für die Bestimmung des Vorhandenseins von vernetzten Derivaten in Plasma oder Serum wurden 50 ul einer 1/5 Verdünnung von Plasma oder Serum in PBS/Tween inkubiert anstelle von Antigen im zweiten Schritt.

ERGEBNISSE

Spezifität

Einige hundert Hybridomklone, welche MAb gegen Human-D-Dimer absonderten, wurden anfänglich identifiziert durch Enzym Immunanalyse, und zwei verschiedene Klassen von MAb wurden erhalten (Tabelle 1). TABELLE 1 Spezifität D-Dimer monoklonaler Antikörper: Vernetzungsreaktion mit Fibrinogen und Fibrinogen-Abbauprodukten Monoklonal Antigen Fibrinogen Abbau-Produkte Fibrin D-Dimer Titer (1) Optische Dichte für die Reaktion gegen D-Dimer wurde für jedes Monoklonale als 100% angenommen. Die Werte stellen dann Vernetzungsreaktionen dar, wie durch die relative optische Dichte bestimmt, welche mit den anderen Antigenen erhalten wurde. (2) Der Titer ist die niedrigste Verdünnung, welche eine Anzeige unter Verwendung von D-Dimer als das Antigen von A450 nm > 0,1 ergibt.
Die erste Gruppe, welche die überwältigende Mehrheit positiver Klone enthielt (Beispiele derselben waren B44.7.4D2/182 (DD-4D2/182), B44.7.2C1/19 (DD-2C1/19), B41.7.2D5/38 (DD-2D5/38)), stellte MAb her, das sich mit Epitopen verband, welche auf intaktem Fibrinogen, einem Extrakt mit einem Gehalt an Fibrinogen-Abbauprodukten, Fragment D und D-Dimer vorhanden waren. Die oben erwähnte erste Gruppe verband sich jedoch nicht mit Fragment E. Die zweite und viel kleinere Gruppe (Beispiele derselben waren B42.7.3B6/22 (DD-3B6/22) und B41.7.1C3/108 (DD-1C3/108)), reagierte mit Determinanten, welche auf D-Dimer aber nicht auf Fragment D vorhanden waren.
Keine Vernetzungsreaktion wurde gefunden mit gereinigtem intaktem Fibrinogen oder Fibrinogen-Abbauprodukten.

D-Dimer Monoklonale als Einfang-Antikörper

Um festzustellen, ob die verschiedenen MAb mit besagten oder bestimmten Stellen auf D-Dimer reagierten, wurden Einfang/Markierungs- Experimente ausgeführt. Die Vertiefungen einer 96 Vertiefungen Mikroplatte wurden mit jedem MAb beschichtet und inkubiert entweder mit Fibrinogen-Abbauprodukten oder D-Dimer. Nach dem Auswaschen ungebundenen Proteins wurden Peroxidase konjugierte MAb zugegeben, und nach dem Waschen wurde das Vorhandensein von gebundenem Konjugat durch die Zugabe von aktiviertem Substrat bestimmt (Tabelle 2). TABELLE 2 Antigeneinfang mit D-Dimer monoklonalen Antikörpern Einfang Antigen Fibrinogen-Abbauprodukte Markierung D-Dimer Die Werte sind ausgedrückt als ein Wechsel in A450nm, erhalten nach einer 10 Minuten Inkubation mit Substrat, verglichen mit einem Kontrollexperiment, in welchem PBS/T mit dem Einfang-Monoklonalen anstelle des relevanten Antigens inkubiert wurde.

DD-2C1/19

Dieses MAb war in der Lage, mit dem monospezifischen MAb DD-1C3/108 oder DD-3B6/22 zu kombinieren, nur wenn D Dimer als Antigen verwendet wurde und das panspezifische MAb DD-2D5/38, wenn andererseits Fibrinogen als Abbauprodukte von D-Dimer Antigenen verwendet wurden. Es war nicht in der Lage, mit dem anderen panspezifischen MAb DD-4D2/182 mit einem der Antigene zu kombinieren. Diese Ergebnisse schlagen vor, daß DD-2C1/19 sich nahe an der Stelle bindet, die durch DD-4D2/182 erkannt wird, aber an Epitope, die von denen, die von DD-2D5/38, DD-1C3/108 oder DD-3B6/22 erkannt werden, sehr verschieden sind.

DD-4D2/182

Das panspezifische MAb DD-4D2/182 hatte ein spezifisches Muster analog zu DD-2C1/19. Die Ergebnisse schlagen vor, daß DD-4D2/182 und DD-2C1/19 sehr nahe oder sich überlappende Bindungsstellen haben könnten. DD-2D5/38
Das panspezifische MAb DD-2D5/38 konnte auch mit DD-1C3/108 und DD-3B6/22 kombinieren, nur wenn D-Dimer verwendet wurde, war aber in der Lage, mit beiden der anderen panspezifischen MAb DD-4D2/182 und DD-2C1/19 zu kombinieren, sowohl mit D-Dimer oder Fibrinogen-Abbauprodukten als Antigene. Dieser Monoklonale war der einzige dieser Serie, der zur Kombination mit sich selbst in der Lage war, was das Vorhandensein von wenigstens zwei Bindestellen per D-Dimermolekül vorschlägt. Es ist jedoch klar, daß diese Bindestellen sich unterscheiden müssen von den Stellen, die von den anderen vier Monoklonalen erkannt werden.

DD-3B6/22 und DD-1C3/108

Das D- Dimer spezifische MAb DD-3B6/22 war befähigt, mit irgendeinem der panspezifischen Monoklonalen DD-4D2/182, DD-2C1/19 oder DD-2D5/38 zu kombinieren, wenn D-Dimer das eingefangene Antigen war. MAb DD-1C3/108 hatte ein ähnliches Spezifitätsmuster, es zeigte jedoch ein relativ schwaches Verhalten als das Einfang MAb. Die Gesamtergebnisse schlagen vor, daß dieser Satz von Monoklonalen sich an drei ausgewählte Bereiche auf dem D-Dimer Molekül bindet, an eine einzige Stelle, erkannt durch DD-2D5/38, eine andere, aufgeteilt zwischen DD-4O2/182 und DD-2C1/19 und eine D-Dimer spezifische Stelle, aufgeteilt zwischen DD-1C3/108 und DD-3B6/22.

Eine spezifische Analyse für D-Dimer

Die obigen Ergebnisse zeigten, daß einige Kombinationen dieser MAb sich nützlich erweisen könnten, ein spezifisches Assay für D-Dimer zu entwickeln und vielleicht zu einer allgemeinen Analyse für Fibrinolyse zu führen. Im ersten Typ der Kombination wurde das monospezifische MAb DD-3B6/22 als ein Einfang MAb verwendet und Antigen wurde markiert mit entweder mit panspezifischem MAb DD-4D2/108 oder DD-2D5/38. Ein Assay, welcher Peroxidase konjugiertes DD-4D2/108 als eine Markierung MAb verwendete, hatte eine Empfindlichkeit von 10-20 ng/ml von D-Dimer (Fig. 1).
Fig. 1 zeigt eine spezifische Analyse für D-Dimer. Der D-Dimer spezifische Monoklonale DD-3B6/22 (10 ug/ml) wurde abgelagert in den Vertiefungen einer Mikroplatte und zuerst umgesetzt entweder mit D-Dimer ( - ), Fibrinogen-Abbauprodukten (Δ-Δ), Fibrinogen ( - ), Fibrin- Abbauprodukten ( - ), oder D Monomer ( - ) und dann markiert mit Peroxidase konjugiertem DD-4D2/182. Kontrollexperimente zeigten, daß sich keine Bindung in der Abwesenheit von Einfang Monoklonal (DD-3B6/22) bildete. Es gab eine starke Reaktion mit Fibrin-Abbauprodukten, aber keine Reaktion wurde mit Fibrinogen-Abbauprodukten oder Fragment D gesehen. Im wesentlichen identische Ergebnisse wurden erhalten bei Verwendung von Peroxidase konjugiertem DD-2D5/38 als die Markierung MAb (nicht gezeigt). Bei einem anderen Kombinationstyp wurde der panspezifische Monoklonale DD-4D2/182 als Einfang MAb verwendet, und das Antigen wurde mit Peroxidase konjugiertem DD-1C3/108 markiert (Fig. 2).
In Fig. 2 wurde panspezifisches MAb DD-4D2/182 (10 ug/ml) auf den Vertiefungen einer Mikroplatte abgelagert und zuerst umgesetzt mit sowohl D Dimer ( - ) als auch Fibrin-Abbauprodukten ( - ) und dann markiert mit Peroxidase konjugiertem DD-4D2/182. Kontrollexperimente zeigten an, daß sich keine Bindung in der Abwesenheit von Einfang Monoklonal (DD3B6/22) bildete. In diesem Fall erzeugten 10-20 ng/ml Konzentrationen von beiden, D-Dimer und Fibrinabbauprodukten, reine Signale, aber es war keine Vernetzungsreaktion weder mit intaktem Fibrinogen, Fibrinogen-Abbauprodukten oder Fragment D zu erkennen. Qualitativ wurden ähnliche Ergebnisse erhalten, wenn entweder mit DD-2C1/19 oder DD-2D5/38 Einfang stattfand (nicht gezeigt).
Assays, welche auf diesen beiden monoklonalen Kombinationen basierten, wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, D-Dimer und andere vernetzte Derivate im Blut festzustellen. Serum oder Plasma, 1/5 verdünnt in PBS/Tween, von sowohl normalgesunden Freiwilligen (Kontrolle war 19, 20, 23) als auch von Patienten mit klinisch diagnostizierter DIC wurden inkubiert mit Mikroplatten, welche mit DD-3B6/22 oder DD-4D2/82 beschichtet waren und nach Inkubation für eine Stunde bei Raumtemperatur wurde die Anwesenheit von gebundenem D Dimer oder vernetztem Derivat ermittelt durch Zugabe des relevanten konjugierten MAb (Tabelle 3). Assays auf der Basis von DD-3B6/22 ergaben positive Ergebnisse sowohl mit Serum wie auch Plasma, während diejenigen auf der Basis von DD-1C3/108 nur mit Serum positive Ergebnisse ergaben. Tabelle 3 Die Bestimmung der Anwesenheit vernetzter Fibrinderivate im Blut durch Enzym-Immunoassay Probe DIC Score Einfang Serum Plasma Markierung D-Dimer Gel (1) DIC Score (DIC Maßzahl) Die Diagnose Disseminierte Intravaskuläre Koagulation wurde für die Patienten gestellt in Übereinstimmung mit dem Scoring System von Whaun und Oski, Can. Med. Assoc. J. 107, 963-66 (1972) (2) Die Werte werden angegeben als Wechsel in A450 nm relativ zu einem Kontrollexperiment, in welchem PBS/Tween mit einem Einfang MAb inkubiert wurde anstelle des relevanten Antigens. (3) Das Vorhandensein von D-Dimer wurde festgestellt durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Lane D. A. et al, Thromb. Res., 9, 191-200 (1976).

LATEX PERLEN TEST

Latexpartikel sind Polystyrolperlen mit einem Durchmesser von ungefähr 1 um, an die der monoklonale Antikörper DD-3B6/22 kovalent gebunden ist.

TESTVERFAHREN

1. 0,02 ml Perlen wurden auf einem Objektträger (vor Gebrauch geschüttelt) mit 0,01 ml Serum oder verdünnter Testprobe gemischt.
2. Der Objektträger wurde sanft gewiegt für 2 Minuten und die An- oder Abwesenheit von Agglutination wurde festgehalten.

SCHÄTZUNG DES SPIEGELS VERNETZTER FIBRINDERIVATE

Positive Agglutination wurde erhalten mit Proben, welche > 200 ug/ml vernetztes Derivat enthielten. Genauere Schätzungen höherer Spiegel von vernetzten Derivaten in einer besonderen Probe wurden durch aufeinanderfolgende Verdünnungen der Probe in PBS Puffer erhalten, wie in Fig. 4 dargestellt ist.

WEITERE KLINISCHE STUDIEN

Personen

Die Gruppen, welche untersucht wurden, waren (a) 45 gesunde Freiwillige im Laboratorium als Kontrollpersonen; (b) 10 Patienten mit venographisch nachgewiesener tiefer venöser Thrombose und/oder arterieller Thrombose; (c) 6 Patienten mit Lungenembolie und (d) 30 Patienten mit im Laboratorium nachgewiesener konsumptiver Koagulopathie und Diagnosen, die in charakteristischer Weise mit disseminierter intravaskulärer Koagulation assoziiert sind. Die Patienten der Gruppe (d) erfüllten alle die Kriterien für disseminierte intravaskuläre Koagulation, wie von Whaun and Oski in Can. Med. Assc. J. 107, 963-66 (1972) beschrieben. Zwei ml Blut wurden mit Thrombin (20 iu) zur Gerinnung gebracht in Gegenwart von Sojabohnen-Tripsin-Inhibitor (Becton and Dickinson 3,67 n.f. units) und das Serum wurde verwendet zum Assay löslicher vernetzter Fibrinderivate unter Anwendung der zuvor beschriebenen Einfang/Markierungsmethode. Ergebnisse unter dem Aspekt des D&sub2; Verhältnisses (Verhältnis von Probe verglichen mit Blanket) sind in Tabelle 4 für Gruppe (a), in Tabelle 5 für Gruppe (d), in Tabelle 6 für Gruppe (b) und in Tabelle 7 für Gruppe (c) gegeben. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 auch graphisch aufgetragen. TABELLE 4 Normalgesunde Freiwillige Nr. D&sub2; Verhältnis (1) D&sub2; Verhältnis abgeleitet aus A&sub4;&sub5;&sub0; Testprobe/A&sub4;&sub5;&sub0; Kontrolle n = 45 x= 0,9 SD = 0,3 TABELLE 5 Patienten mit Disseminierter Intravaskulärer Koagulation Nr. Klinischer Zustand Score Verhältn. Page Analyse Disseminiertes Brustkarzinom, Lungenembolus und Blutung Zerrissene Plazenta und Post Partum Hämorrhagie Disseminiertes Karzinom, Venöse Thrombose und nachoperative Blutung Lymphom, Aszites, Le Veen Shunt Alkoholbedingte Lebererkrankung Septikämie und Blutung Hämorrhagische Pankreatitis und Septikämie Akutes Nierenversagen, Septikämie und Blutung Blutung Ösophagische Varizen Analgesische Nephropathie und Septikämie Schwere Präeklamptische Toxämie und Hämophtysis Mehrfachverletzungen und durchsickerndes Blut Alkoholbedingte Lebererkrankung, Zirrhose, Blutung und Thrombose Chronisches Nierenversagen und Septikämie Hodgkins Krankheit und Blutung Meningokokoll, Septikämie und Petechien Melaena, Hämaturie und Purpura Prostatakarzinom Disseminiertes Karzinom und Mikroangiopathische Hämolytische Anämie Akute Pankreatitis und Disseminierte Thrombose Akute Pankreatitis, Azidose und Blutung Alkoholische Lebererkrankung Septikämie, Akutes Atemwegserkrankungs Syndrom und Blutung Subakute Bakterielle Endokarditis Schwere Präeklamptische Toxämie Chronisches Nierenversagen und Leberkrankung Septikämie Schwere Präeklamptische Toxämie Promyelozytenleukämie (M3) Akute Pankreatitis und Blutung Perinatale Hypoxie
Fortsetzung Tabelle 5:
(1) DIC diagnostiziert nach Whaun and Oski, Can. Med. Assoc. J. 107, 963-966 (1972) A&sub4;&sub5;&sub0; Testprobe
(2) D&sub2; Verhältnis abgeleitet aus A&sub4;&sub5;&sub0; Kontrolle
(3) Die Gegenwart von D Dimer oder Fibrinabbauprodukten mit hohem Molekulargewicht, nachgewiesen nach Lane et al, Thrombosis Res., 9, 191-200 (1976). TABELLE 6 Patienten mit tiefer venöser Trombose oder arterieller Thrombose Nr. Klinischer Zustand D&sub2; Verh.(1) Tiefe venöse Thombose und Lungenembolus Zerebralarterien-Thrombose (Mitralstenose) Linke Femoralarterien-Thombose Wiederkehrende tiefe venöse Thrombose Rechte tiefe venöse Thrombose Linke tiefe venöse Thrombose Rechte tiefe venöse Thrombose Linke tiefe venöse Thrombose Ernste chronische Lebererkrankung, wahrscheinlich Thrombose in der Inferior Vena cava (1) D&sub2; Verhältnis abgeleitet aus A&sub4;&sub5;&sub0; Testprobe/A&sub4;&sub5;&sub0; Kontrolle TABELLE 7 Patienten mit Lungenembolus Nr. Klinischer Zustand D&sub2; Verh. (1) Tiefe venöse Thrombose und Lungenembolus Lungenembolus (postoperativ) Hohe Wahrscheinlichkeit von Lungenembolus durch Lung Scan Niedrige Wahrscheinlichkeit von Lungenembolus durch Lung Scan Möglicher Lungenembolus Lungenembolus und Le Veen Shunt (1) D&sub2; Verhältnis abgeleitet von A&sub4;&sub5;&sub0; Testprobe/A&sub4;&sub5;&sub0; Kontrolle
Frühere Versuche zum Erhalt spezifischer Antikörpersonden für die Unterscheidung zwischen vernetzten Fibrinderivaten wurden beeinträchtigt durch die Natur der Response polyklonaler Antikörper auf Antigene, welche für die Immunisierung verwendet wurden. Mehrere Antikörperpräparationen sind bereits beschrieben worden mit einer ausgesprochenen Präferenz für vernetzte Derivate - 50 fach größere Reaktivität für D-Dimer verglichen mit D (siehe die zuvorerwähnte Budzynski Referenz), oder 100 fache für vernetzte gamma-gamma Ketten verglichen mit nichtvernetzten und Peptid (Purves et al Biochemistry 19, 4051-58 (1980)), oder 8 fach für D-Dimer verglichen mit Fibrinogen oder Fibrinogen-Abbauprodukten (Lahiri et al, Thromb Res 23, 103-112 (1981)). Der Grad der Vernetzungsreaktion mit nicht-vernetzten Fragmenten war noch hoch genug, um ihren Wert als diagnostische Reagentien auszuschließen.
Das Problem der Herstellung diagnostischer Reagentien konnte nicht gelöst werden, bis monospezifische MAbs hergestellt wurden (DD-3B6/22 und DD-1C3/108), die nur mit vernetzten Fibrinderivaten reagierten. Diese MAbs wurden zur Verwirklichung diagnostischer Assays verwendet, von denen Systeme vom Einfang/Markierungstyp bevorzugt sind. Es können jedoch auch konventionelle, Bindungen verhindernde Assays, welche gekennzeichnetes monospezifisches DD-3B6/22, DD-1C3/108 oder gekennzeichnetes vernetztes Fibrinderivat anwenden, verwendet werden.
In einem Einfang/Markierung Assay reagiert das in Frage kommende Antigen mit zwei Antikörpern mit Spezifität für unterschiedliche Regionen des gleichen Moleküls. Im allgemeinen wird ein Einfang-Antikörper mit einer festen Phase verbunden, und nach der Zugabe von Antigen, das die Bildung von Bindungen zuläßt, kann die Gegenwart von gebundenem Antigen nach dem Waschen durch die Zugabe eines zweiten gekennzeichneten Antikörpers entdeckt werden.
MAb DD-1C3/108 obgleich sehr spezifisch für D-Dimer, wirkte sehr wenig als ein Einfang MAb, das Peroxidase konjugierte MAb war doch eine gute Markierung. Andererseits war das andere spezifische monoklonale DD-3B6/22 ein gutes Einfang MAb, aber eine relative geringe Markierung.
Assays, welche auf DD-1C3/108 als Markierung basierten, banden D-Dimer und Fibrin-Abbauprodukte gleich gut, während Assays, welche DD-3B6/22 als ein Einfang MAb verwendeten, D-Dimer ungefähr 100 mal besser banden. Ähnlich kann ein Signal erzeugt werden mit hohen Konzentrationen von Fibrinogen mit dem DD-3B6/22 Assay aber nicht mit DD-1C3/108. Jeder dieser Monoklonalen zeigt einen ähnlichen Grad von Vernetzungsreaktion mit diesen beiden Antigenen in der Standard Immunoassay (Tabelle 1).
Beide dieser Assays können niedrige D-Dimerspiegel oder andere vernetzte Derivate, welche im Serum von Patienten mit DIC vorhanden sind, detektieren, aber es überrascht nicht, daß die hohen Fibrinogenspiegel, welche im Plasma (ungefähr 3000 ug/ml) vorhanden sind, Assays auf der Basis von MAb DD-1C3/108 als ein markierender Antikörper davon daran hindern würden, positive Ergebnisse mit Plasma zu geben. Der Einfang- Antikörper, in diesem Fall DD-4D2/182, reagiert stark mit beiden, Fibrinogen und D-Dimer, und die relativ hohe Konzentration von Fibrinogen im Plasma könnte erwartungsgemäß den Einfangmonoklonalen auf der festen Phase überschwemmen. Andererseits wird der Plasmaassay, welcher auf dem monospezifischen DD-3B6/22 basiert, selektiv vernetzte Derivate einfangen, sogar in Gegenwart von Konzentrationen von Fibrinogen, welche einige Größenordnungen höher sind (Fig. 2), und ist deshalb wirksamer im Hinblick auf Assay von vernetzten Fibrinderivaten.
Die Latexperlen-Assay-Ergebnisse, entsprachen, wie in Fig. 4 gezeigt ist, den anderen experimentellen Ergebnissen, welche durch EIA erhalten wurden, auf das früher Bezug genommen wurde. Der Latexperlen-Assay bietet deshalb ein schnelles diagnostisches Testpotential an.
Die oben erwähnten Assays können zwischen 4-40ºC, aber in geeigneterer Weise bei Raumtemperatur ausgeführt werden. Der Kontakt zwischen der Testprobe und dem relevanten MAb kann bei einem pH von 5-9 ausgeführt werden, wobei eine geeignete obere Grenze der Ionenstärke IM ist.

Claims

1. Ein monoklonaler Antikörper gerichtet gegen nicht-denaturiertes D-Dimer, welcher verwendet werden kann in einem Verfahren zur Diagnose von disseminierter intravaskulärer Koagulation (DIC) oder anderen thrombotischen Zuständen, das Körperflüssigkeit wie Lymphe, Serum, Plasma oder Exudat verwendet, wobei besagter Antikörper die wesentliche Charakteristik der Reaktivität mit D-Dimer und anderen vernetzten Fibrinderivaten und der Nicht-Reaktivität mit Fibrinogen und Fibrinogen-Abbauprodukten inklusive Fragment D und Fragment E aufweist.

2. Ein monoklonaler Antikörper gerichtet gegen nicht-denaturiertes D-Dimer, welcher verwendet werden kann in einem Verfahren zur Diagnose von disseminierter intravaskulärer Koagulation (DIC) oder anderen thrombotischen Zuständen, das Körperflüssigkeit wie Lymphe, Serum, Plasma oder Exudat verwendet, wobei besagter Antikörper die wesentliche Charakteristik der Reaktivität mit D-Dimer und anderen vernetzten Fibrinderivaten und der Nicht-Reaktivität mit Fibrinogen und Fibrinogen-Abbauprodukten inklusive Fragment D und Fragment E, und positive Agglutination in einem Latexperlen-Test aufweist, wobei besagter monoklonaler Antikörper an Polystyrolperlen gebunden ist und diese mit einer Flüssigkeitsprobe, welche mehr als etwa 200 ng/ml vernetztes Fibrinderivat enthält, in Kontakt gebracht wurde.

3. Ein Screening-Assay zur Verwendung bei der Herstellung eines monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 1, welcher die Schritte einschließt:

(A) Beschichten einer Oberfläche mit Antigen ausgewählt aus

(i) vernetztem Fibrinderivat;

(ii) Extrakt, welches besagtes Derivat enthält; oder

(iii) Fibrinogen oder Fibrinogen-Abbauprodukt;

(B) Kontaktieren besagten Antigens mit besagtem monoklonalem Antikörper; und

(C) Feststellen besagten in Schritt (B) gebildeten Komplexes.

4. Ein Assayverfahren für die Feststellung des Vorhandenseins eines vernetzten Fibrinderivates in einer Körperflüssigkeit, welches die Schritte einschließt

(i) Kontaktieren des monoklonalen Antikörpers, wie in Anspruch 1 definiert, mit einer Probe einer Körperflüssigkeit, von der erwartet wird, daß sie ein von vernetztem Fibrin abgeleitetes Antigen enthält; und

(ii) Aussetzen des in Schritt (i) gebildeten Komplexes einem Feststellungsschritt.

5. Ein Assayverfahren nach Anspruch 4, bei dem der Feststellungsschritt ein Signalverstärkungsschritt ist.

6. Ein Assayverfahren nach Anspruch 4 und 5, bei dem das vernetzte Fibrinderivat D-Dimer ist.

7. Ein Assayverfahren nach den Ansprüchen 4 und 5, bei dem die Körperflüssigkeit Blut oder Plasma ist.

8. Ein Assayverfahren, wie in einem der Ansprüche 4 bis 7 beansprucht, bei dem ein erster monoklonaler Antikörper in Schritt (i) ein Antigen in besagter Körperflüssigkeit einfängt, welches danach in Schritt (ii) durch einen gekennzeichneten zweiten monoklonalen Antikörper markiert wird, wobei beide von besagtem erstem monoklonalem Antikörper und von besagtem zweitem monoklonalem Antikörper gewählt sind aus der Klasse, welche einen panspezifischen monoklonalen Antikörper, der sich nicht nur an vernetzte Fibrinderivate sondern auch an Fibrinogen und Fibrinogen-Abbauprodukte bindet, und einen monospezifischen monoklonalen Antikörper umfaßt, welcher sich nur an vernetzte Fibrinderivate bindet.

9. Ein Assayverfahren wie in Anspruch 8 beansprucht, bei dem besagter erster monoklonaler Antikörper besagter monospezifischer monoklonaler Antikörper ist, und der besagte zweite monoklonale Antikörper besagter panspezifischer monoklonaler Antikörper ist.

10. Ein Assayverfahren wie in Anspruch 8 beansprucht, bei dem besagter erster monoklonaler Antikörper besagter panspezifischer monoklonaler Antikörper ist, und besagter zweiter monoklonaler Antikörper besagter monospezifischer monoklonaler Antikörper ist.

11. Ein Assayverfahren wie in Anspruch 8 beansprucht, bei dem der erste monoklonale Antikörper besagter monospezifischer monoklonaler Antikörper ist, und besagter zweiter monoklonaler Antikörper besagter monospezifischer monoklonaler Antikörper ist.

12. Ein Assayverfahren wie in einem der Ansprüche 8 bis 11 beansprucht, bei dem der zweite monoklonale Antikörper mit einem Enzym gekennzeichnet ist, welches danach mit einem Substrat für besagtes Enzym umgesetzt wird.

13. Ein Assayverfahren wie in einem der Ansprüche 8 bis 11 beansprucht, bei dem der zweite monoklonale Antikörper gekennzeichnet ist mit einer radioaktiven Spezies.

14. Ein Assayverfahren nach Anspruch 4 oder 6, bei dem der monoklonale Antikörper anfänglich an Latexperlen gekoppelt ist, ehe er mit besagter Flüssigkeitsprobe in Berührung gebracht und anschließend auf Agglutination geprüft wird, und besagter monoklonaler Antikörper ein monospezifischer Antikörper ist, welcher sich nur an vernetzte Fibrinderivate bindet.

15. Ein Verfahren zur Feststellung vernetzter Fibrinderivate in einer Körperflüssigkeit wie Lymphe, Serum, Plasma oder Exudat, welches die Schritte umfaßt:

(i) Immunisieren eines Tiers mit einem nicht-denaturierten, vernetzten Fibrinderivat oder Extrakt, welches besagtes enthält;

(ii) Entfernen einer Milz von dem Tier;

(iii) Behandeln der Milz, um eine Zellsuspension zu bilden;

(iv) Reinigen der Zellsuspension, um Milz-weiße Blutzellen oder Lymphozyten zu isolieren;

(v) Bilden von Hybridomzellen, die als eine Komponente besagte Milzweiße Blutzellen oder Lymphozyten enthalten;

(vi) Klonen oder Reklonen besagter Hybridomzellen unter Verwendung geeigneter Zell-Fütterschichten;

(vii) Ausführen von Screening-Assays mit Antigen, ausgewählt aus vernetztem Fibrinderivat, oder Extrakt, welches besagtes oder Fibrinogen und Fibrinogen-Abbauprodukt enthält, um so Hybridomzellen zu isolieren, welche monoklonalen Antikörper wie in Anspruch 1 definiert produzieren;

(viii) Kontaktieren einer Flüssigkeitsprobe, die erwartungsgemäß vernetztes Fibrinderivat oder davon abgeleitetes Antigen enthält, mit monoklonalem Antikörper, hergestellt aus Hybridomzellen, welche nach Schritt (vii) isoliert wurden, und

(ix) Aussetzen des in Schritt (viii) gebildeten Komplexes einem Feststellungsschritt.

16. Ein Verfahren zur Diagnose disseminierter intravaskulärer Koagulation (DIC) und anderer thrombotischer Zustände, welches die Schritte einschließt:

(i) Isolieren eines monoklonalen Antikörpers wie in Anspruch 1 definiert;

(ii) Kontaktieren besagten monoklonalen Antikörpers mit einer Flüssigkeitsprobe von einem Patienten, von dem angenommen wird, daß er an DIC oder anderem thrombotischem Zustand leidet; und

(iii) Analysieren der Gegenwart von vernetztem Fibrinderivat in besagter Probe, um zu bestimmen, ob das vernetzte Fibrinderivat mit besagtem monoklonalem Antikörper reagiert hat.