CN114736948B

CN114736948B - 一种α2-抗纤溶酶活性测定试剂盒

Info

Publication number: CN114736948B
Application number: CN202210651763.7A
Authority: CN
Inventors: 曹佳强; 胡彦勇; 蔡晓霞; 赵伟
Original assignee: Shenzhen Dymind Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Dymind Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2022-06-10
Filing date: 2022-06-10
Publication date: 2022-11-08
Anticipated expiration: 2042-06-10
Also published as: CN114736948A

Abstract

本发明公开了一种α2‑抗纤溶酶活性测定试剂盒，包括R1、R2以及稀释试剂；R1试剂包括重组牛纤溶酶、第一缓冲液和第一辅料，重组牛纤溶酶浓度为5‑7 IU/mL；R2试剂包括发色底物S‑2403、第二缓冲液和第二辅料，发色底物S‑2403浓度为2‑4 mmol/L；稀释试剂包括第三缓冲液和第三辅料，第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液的pH均为7.2‑7.6；本发明将重组牛纤溶酶和发色底物S‑2403搭配使用，检测时切割效率高，反应信号强，反应速度快，灵敏度高，线性范围宽，反应时间短，增加了样本的区分度，有利于线性范围建立以及临床样本测试；试剂为液态，使用方便、成本低廉、稳定性好。

Description

一种α2-抗纤溶酶活性测定试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种α2-抗纤溶酶活性测定试剂盒。

背景技术

纤溶酶原经PA（纤溶酶原激活物）激活，转变为 PL后，不仅发挥纤溶作用，溶解血栓，而且参与体内一系列与蛋白质水解有关的生理、病理过程。纤溶酶在血液中被激活后迅速与α2-抗纤溶酶结合形成纤溶酶-α2-抗纤溶酶复合物而失活，纤溶活性降低是导致血栓形成的重要机制之一，α2-抗纤溶酶（α2-AP）是直接抑制纤溶酶的活性，检测人体内α2-抗纤溶酶的活性，有助于判断体内的纤溶状态，用于出血、血栓性疾病的辅助诊断；临床上普遍使用分光光度计法、免疫化学法测定α2-抗纤溶酶的活性，虽然具有一定的可操作性，但是其检测结果的重复性较差，并且抗干扰能力差，结果易受各种因素的影响，无法反应患者体内真实的α2-抗纤溶酶活性水平。

随着临床上对α2-抗纤溶酶活性检测需求的提升，国外率先推出了适配于全自动凝血分析仪的α2-抗纤溶酶活性测定试剂盒，但是其需要进口全自动凝血分析仪及配套试剂盒搭配使用，定价昂贵，给医院和患者均带来了一定的经济负担；其次，市售大部分的α2-抗纤溶酶活性测定试剂盒（发色底物法）仍为冻干粉形态，使用前均需要复溶、颠倒、混匀，静置一段时间后才能使用，不利于客户的操作，降低了检测的效率；此外，该类α2-抗纤溶酶活性测定试剂盒的盒内普遍不附赠配套复溶剂，客户需自行准备复溶剂，对所使用的复溶剂质量无法把控，对测试结果带来了一定的影响。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的缺陷，提供一种α2-抗纤溶酶活性测定试剂盒，价格低廉、全液体、试剂灵敏度高、线性范围宽、便捷、快速。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种α2-抗纤溶酶活性测定试剂盒，包括R1试剂、R2试剂与稀释试剂；

所述R1试剂包括重组牛纤溶酶、第一缓冲液和第一辅料，所述重组牛纤溶酶的浓度为5-7 IU/mL，所述第一缓冲液的pH为7.2-7.6；

所述R2试剂包括发色底物S-2403、第二缓冲液和第二辅料，所述发色底物S-2403的浓度为2-4 mmol/L，所述第二缓冲液的pH为7.2-7.6；

所述稀释试剂包括第三缓冲液和第三辅料，所述第三缓冲液的pH为7.2-7.6。

进一步地，优选所述第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液分别为Tris缓冲液、Hepes缓冲液、MES缓冲液、MOPS缓冲液、柠檬酸缓冲液中的至少一种。

进一步地，优选所述第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液均为浓度100-150mmol/L 的Tris缓冲液。

进一步地，优选所述第一辅料包括第一稳定剂，所述第一稳定剂包括氯化钠、谷氨酸、蔗糖、半乳糖、聚乙二醇2000、NP-40、明胶、吐温-20、海藻糖、葡萄糖、β-环糊精、甘露醇和氯化钾中的一种或几种。

进一步地，优选第一稳定剂包括组分：氯化钠、谷氨酸、蔗糖、聚乙二醇2000、NP-40，且以上组分在所述R1试剂中的质量百分比为： 0.5-1.5%氯化钠、3-5%谷氨酸、3-5%蔗糖、1-3% PEG-2000、0.5-1.5% NP-40。

进一步地，优选所述第二辅料包括第二稳定剂，所述第二稳定剂包括氯化钠、谷氨酸、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、NP-40、明胶、吐温-20、海藻糖、葡萄糖、β-环糊精、甘露醇和氯化钾中的至少一种。

进一步地，优选所述第二稳定剂包括组分：氯化钠、谷氨酸、蔗糖、PVP、NP-40，且以上组分在所述R2试剂中的质量百分比为： 0.5-1.5%氯化钠、3-5%谷氨酸、3-5%蔗糖、1-3%PVP、0.5-1.5% NP-40。

进一步地，优选所述第三辅料还包括第三稳定剂，所述第三稳定剂包括氯化钠、明胶、吐温-20、海藻糖、葡萄糖、β-环糊精、甘露醇和氯化钾中的一种或几种。

进一步地，优选所述第三稳定剂包括氯化钠，其在稀释试剂中的质量百分比为0.5-1.5%。

进一步地，优选所述R1试剂、R2试剂、稀释试剂均包括防腐剂，所述防腐剂为苯甲酸钠、叠氮化钠、Proclin-300、庆大霉素以及亚硝酸盐中的至少一种。

进一步地，优选所述R1试剂、R2试剂、稀释试剂均包括质量百分比为0.03-0.05%的Proclin-300。

进一步地，优选所述R1试剂、所述R2试剂均包括蛋白酶保护剂，所述蛋白酶保护剂为BSA、HAS、Prionex中的至少一种。

进一步地，优选所述蛋白酶保护剂为Prionex，Prionex在所述R1试剂、所述R2试剂的质量百分比均为1-5%。

进一步地，优选所述R1试剂还包括PAI-1，所述PAI-1的浓度为1-2 IU/mL。

本发明的有益效果：本发明提供的一种α₂-抗纤溶酶活性测定试剂盒，本发明的试剂盒试剂为液态，使用方便、成本低廉、灵敏度高、线性范围宽、抗干扰能力强、稳定性好，为国产首创全液态检测α2-抗纤溶酶活性的测定试剂盒，可以实现对进口α2-AP活性测定试剂盒的替代，充分满足临床检验的需求；还能降低医院购买检测试剂的成本，同时减少病人的检测费用，降低负担；通过使用重组牛纤溶酶和发色底物S-2403为试剂原料，二者搭配使用时，检测时切割效率高，反应信号强，反应速度快，其试剂灵敏度更高，线性范围更宽，所需的反应时间更短，增加不同浓度样本的区分度，有利于定标操作、线性范围建立以及临床样本测试。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1是本发明实施例1的试剂盒与参比试剂盒的相关性线性回归图；

图2是本发明实施例2的试剂盒与参比试剂盒的相关性线性回归图；

图3是本发明实施例3的试剂盒与参比试剂盒的相关性线性回归图。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现详细说明本发明的具体实施方式。

一种α2-抗纤溶酶活性测定试剂盒，包括R1试剂、R2试剂与稀释试剂；R1试剂包括重组牛纤溶酶、第一缓冲液和第一辅料，重组牛纤溶酶的浓度为5-7 IU/mL，第一缓冲液的pH为7.2-7.6；R2试剂包括发色底物S-2403、第二缓冲液和第二辅料，发色底物S-2403的浓度为2-4 mmol/L，第二缓冲液的pH为7.2-7.6；稀释试剂包括第三缓冲液和第三辅料，第三缓冲液的pH为7.2-7.6。

本发明试剂盒的工作原理：在反应体系中加入过量的重组牛纤溶酶，后者与血浆中的α2-AP（α2-抗纤溶酶）形成 1： 1复合物，即重组牛纤溶酶-α2抗纤溶酶复合物，剩余重组牛纤溶酶作用于发色底物S-2403，释放出对硝基苯胺（pNA），显色反应的深浅与剩余重组牛纤溶酶的量呈正相关，而与α2-抗纤溶酶的活性呈负相关，进而实现快速检测α2-抗纤溶酶活性。

本发明提供的一种α2-抗纤溶酶活性测定试剂盒，通过使用重组牛纤溶酶和发色底物S-2403为试剂原料，二者搭配使用时，切割效率高，反应信号强，反应速度快，其试剂灵敏度更高，线性范围更宽，所需的反应时间更短，增加不同浓度样本的区分度，有利于定标操作、线性范围建立以及临床样本测试；本发明的试剂盒试剂为液态，使用方便、成本低廉、灵敏度高、线性范围宽、抗干扰能力强、稳定性好，为国产首创全液态检测α2-抗纤溶酶活性的测定试剂盒，可以实现对进口α2-AP活性测定试剂盒的替代，充分满足临床检验的需求；还能降低医院购买检测试剂的成本，同时减少病人的检测费用，降低负担。

重组牛纤溶酶采用基因工程制备所得，酶的纯度更高，单位活性更强，酶的使用量更低，有利于节约成本；发色底物S-2403为纤溶酶特异的高效底物，该底物的氨基酸序列做了特殊调整与修饰，相比于其他普通的发色底物来说，对于纤溶酶的敏感度更高，被切割的效率更高，反应更迅速；将重组牛纤溶酶和发色底物S-2403搭配使用时，使得切割效率高，反应信号强，反应速度快，使得试剂灵敏度更高，线性范围更宽，所需的反应时间更短，增加了对不同浓度样本的区分度，有利于定标操作、线性范围建立以及临床样本测试；在反应时间上，本发明中含有重组牛纤溶酶的R1试剂加待测样本不孵育，加入R2试剂后只需孵育时间约为60s，而现有的试剂盒的R1试剂加待测样本不孵育或孵育时间在60-180s之间，加入现有试剂盒的R2试剂后孵育时间在120-240s之间，相比之下，本发明的反应更快速，单个测试所需时间更短，减少标本的等待时间，更快的拿到检测报告，优化用户体验，并有利于患者的临床治疗。

第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液分别为Tris缓冲液、Hepes缓冲液、MES缓冲液、MOPS缓冲液、柠檬酸缓冲液中的至少一种。第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液的pH均为7.2-7.6，通过采用以上任意一种缓冲液都能够有效地将R1试剂、R2试剂、稀释试剂维持在预定的范围内，即将溶液稳定在pH为7.2-7.6之间，并且，通过采用以上的第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液不会对待检测样品中的测定α2-抗纤溶酶活性造成不利的影响；进一步地，优选第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液均为浓度100-150 mmol/L 的Tris缓冲液，在该缓冲液下，重组牛纤溶酶和发色底物S-2403可以发挥最大效率，提高试剂的灵敏度，同时增加了不同浓度样本的区分度，有利于定标操作、线性范围建立以及临床样本测试。

第一辅料包括第一稳定剂，第一稳定剂包括氯化钠、谷氨酸、蔗糖、半乳糖、聚乙二醇2000、NP-40、明胶、吐温-20、海藻糖、葡萄糖、β-环糊精、甘露醇和氯化钾中的一种或几种。第一稳定剂的加入可提高试剂的稳定性，可以在不影响反应体系敏感性的前提下，抑制体系中的非特异性吸附，更重要的是，还可有效保护试剂中重组牛纤溶酶的活性，提高重组牛纤溶酶的稳定性的作用；如，添加蔗糖、半乳糖、海藻糖、葡萄糖、明胶等一方面有利于抑制蛋白发生冷冻变性，可以保证冷冻不会导致R1试剂出现沉淀和非特异性聚集的情况，从而保证试剂储存、运输等稳定性，另一方面明胶大分子具有网状结构，可产生筛孔效应，能够对蛋白进行空间限位，降低了蛋白分子之间的相互碰撞，一定程度上提高了蛋白的稳定性；添加聚乙二醇2000等多羟基醇，可提高试剂的粘度，有利于重组牛纤溶酶均匀的悬浮于第一缓冲液中，不易沉降，从而起到较好的稳定性作用，还可作为防冻剂，有效降低凝固点，从而达到较好的抗冻融效果；氯化钠、氯化钾等无机盐的加入可以用于调节该具有重组牛纤溶酶溶液的渗透压，从而可以提高该重组牛纤溶酶在测定α2-抗纤溶酶时的效率；添加吐温-20等可起到表面活性剂的作用，进一步提高试剂稳定性；同时第一稳定剂的添加对蛋白酶也能起到一定的保护作用，以提高试剂盒的稳定性。

在一具体实施例中，第一稳定剂包括组分：氯化钠、谷氨酸、蔗糖、聚乙二醇2000、NP-40，且上述组分在R1试剂中的重量百分比为： 0.5-1.5%氯化钠、3-5%谷氨酸、3-5%蔗糖、1-3% PEG-2000、0.5-1.5% NP-40；上述配比下，有利于试剂盒准确度高、稳定性好。

第二辅料包括第二稳定剂，第二稳定剂包括氯化钠、谷氨酸、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、NP-40、明胶、吐温-20、海藻糖、葡萄糖、β-环糊精、甘露醇和氯化钾中的至少一种。第二稳定剂的加入可提高R2试剂的稳定性，可以在不影响反应体系敏感性的前提下，抑制体系中的非特异性吸附，更重要的是，提高发色底物S-2403的稳定性的作用；如，添加蔗糖、海藻糖、葡萄糖、明胶等一方面有利于抑制蛋白发生冷冻变性，可以保证冷冻不会导致R1试剂出现沉淀和非特异性聚集的情况，从而保证试剂储存、运输等稳定性，另一方面明胶大分子具有网状结构，可产生筛孔效应，能够对蛋白进行空间限位，降低了蛋白分子之间的相互碰撞，一定程度上提高了蛋白的稳定性；氯化钠、氯化钾等无机盐的加入可以用于调节该具有发色底物S-2403溶液的渗透压，从而可以提高该发色底物S-2403在测定α2-抗纤溶酶时的效率；添加吐温-20等可起到表面活性剂的作用，进一步提高试剂稳定性；同时第二稳定剂的添加对蛋白酶也能起到一定的保护作用，进一步提高试剂盒的稳定性。

在一具体实施例中，第二稳定剂包括组分：氯化钠、谷氨酸、蔗糖、PVP、NP-40，且上述组分在R2试剂中的质量百分比为： 0.5-1.5%氯化钠、3-5%谷氨酸、3-5%蔗糖、1-3% PVP、0.5-1.5% NP-40。上述配比下，有利于试剂盒准确度高、稳定性好。

第三辅料还包括第三稳定剂，第三稳定剂包括氯化钠、明胶、吐温-20、海藻糖、葡萄糖、β-环糊精、甘露醇和氯化钾中的一种或几种，以提高试剂盒的稳定性。

在一具体实施例中，第三稳定剂包括氯化钠，且其在稀释试剂中的质量百分比为0.5-1.5%；上述配比下，有利于试剂盒准确度高、稳定性好。

R1试剂、R2试剂、稀释试剂均包括防腐剂，防腐剂为苯甲酸钠、叠氮化钠、Proclin-300、庆大霉素以及亚硝酸盐中的至少一种；添加防腐剂可达到防腐效果，防止由于微生物污染而导致试剂盒失效，有利于延长试剂盒的储存有效期。在一具体实施例中，R1试剂、R2试剂、稀释试剂均包括质量百分比为0.03-0.05% 的Proclin-300，上述配比下，试剂防腐效果好，有利于提高试剂的稳定性。

R1试剂、R2试剂均包括蛋白酶保护剂，蛋白酶保护剂为BSA、HAS、Prionex中的至少一种，蛋白酶保护剂在R1试剂、R2试剂的质量百分比均为1-5%。蛋白酶保护剂用于延长试剂盒中的R1试剂、R2试剂的稳定性，有利于试剂盒的长期使用和存储，有利于保护酶的活性，防止凝血酶变性，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对重组牛纤溶酶起保护作用；防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，减轻不利环境因素如加热、表面张力及化学因素引起的变性。优选蛋白酶保护剂为Prionex。

R1试剂还包括PAI-1（即完全纤溶酶原激活物抑制剂1），PAI-1的浓度为1-2 IU/mL。通过添加适量的PAI-1可以降低血浆中PLG的影响，防止血浆中PLG对α2-抗纤溶酶活性测定产生干扰，R1试剂中含有一定浓度的PAI-1，消除样本中由于纤溶酶原（PLG）激活而对检测结果产生的影响，进而增加测定结果的准确度；PAI-1的作用原理为：PAI-1对组织型纤溶酶原激活物（t-pa）和尿激酶型纤溶酶原激活物(u-pa)起抑制作用，从而使有活性的纤溶酶生成减少。能够增强试剂盒抗干扰能力，增加测试准确度。

以下通过具体实施方式对本发明做进一步解释说明。

实施例1

一种α2-抗纤溶酶活性测定试剂盒，包括R1试剂、R2试剂与稀释试剂；具体组分见下表：

表1.实施例1的试剂盒的各试剂组分

注：“/”表示不含此成分。

实施例2

表2.实施例2的试剂盒的各试剂组分

注：“/”表示不含此成分。

实施例3

表3.实施例3的试剂盒的各试剂组分

注：“/”表示不含此成分。

对比例1

对比例1中R1试剂中重组牛纤溶酶替换为普通牛纤溶酶，R2试剂中的发色底物S-2403替换为发色底物S-2251，其他组分及用量均与实施例1相同。

对比例2

对比例2中不含PAI-1，其他组分及用量均与实施例1相同。

对比例3

对比例3中R1试剂、R2试剂、稀释试剂中不含蛋白酶保护剂Prionex，其他均与实施例1相同。

使用实施例1-3以及对比例1-3的α2-抗纤溶酶（α2-AP）活性测定试剂盒进行定标、空白限、准确度、线性范围、重复性、稳定性以及临床相关性测试。

1.定标及其结果

采用实施例1-3以及对比例1在全自动凝血分析仪上搭配校准品（104.6%），使用单点浓缩、稀释定标的方式完成校准曲线的绘制。定标结果如表4-7所示。定标结果应符合要求：标准曲线的线性回归方程R²≥0.98，C6/C5校准品定标点的OD值信噪比应≥2。

表 4. 实施例1的试剂盒定标结果

表5. 实施例2的试剂盒定标结果

表6. 实施例3的试剂盒定标结果

表7. 对比例1的试剂盒的定标结果

从表4-7的测试结果发现，实施例1-3标准曲线性回归方程满足R²≥0.98，C6/C5校准品定标点的OD值信噪比≥2，符合要求，证明实施例1-3能得到质量较好的标准曲线。而对比例1标准曲线性回归方程的R²＜0.98，C6/C5校准品定标点的OD值信噪比＜2，不符合要求，试剂的整体灵敏度较差，所得的标准曲线的质量较差，进一步说明了重组牛纤溶酶和发色底物S-2403搭配使用时，具有较好的OD值，对不同浓度的样本区分度高，定标时更易拉开，切割效率高，反应信号强，反应速度快，使得试剂灵敏度更高。

2.空白限测试及其结果

采用实施例1-3的试剂盒测定空白样本20次，按照以下的公式（1）和公式（2）计算平均值（X）、标准差（SD）以及空白限（X＋2SD），测试结果如表8-10所示。测试结果应符合要求：空白限应≤8%。

公式（1）：

公式（2）：

式中：

——测试结果的平均值；

——每次的实测值；

n——测试的次数；

i——测试的序号；

B——相对偏差；

SD——标准差。

表8.实施例1的空白限测试结果

表9.实施例2的空白限测试结果

表10.实施例3的空白限测试结果

从表8-10的测试结果发现，实施例1-3的试剂盒均符合所规定的空白限要求。

3.准确度测试及其结果

采用实施例1-3以及对比例2分别测定两个α2-抗纤溶酶（α2-AP）正确度控制品，每个正确度控制品重复测试 3次，按照上述公式（1）和（3）计算相对偏差，测试结果如表 11-14所示。测试结果应符合要求：相对偏差应在±15.00%范围内。

公式（3）：

式中：

T——正确度控制品标示值；

B——相对偏差。

表11.实施例1的准确度测试结果

表12.实施例2的准确度测试结果

表13.实施例3的准确度测试结果

表14.对比例2的准确度测试结果

从表11-14的测试结果发现，实施例1-3的相对偏差比较小，证明实施例1-3都具有很好的准确性。对比例 2 的相对偏差不符合均在±15%范围内的要求，由实施例1与对比例2的结果可知，通过添加适量的PAI-1可以降低血浆中PLG的影响，防止血浆中PLG对α2-抗纤溶酶活性测定产生干扰，实施例1中的R1试剂中含有一定浓度的PAI-1，消除样本中由于纤溶酶原（PLG）激活而对检测结果产生的影响，进而增加测定结果的准确度，而对比例2未添加PAI-1，受样本中PA的干扰，活化PLG形成额外的PL，从而导致α2-AP的测试结果不准。因此，对比例2的准确性不如实施例1-3。

4.线性范围测试及其结果

将接近试剂盒线性范围上限的α2-抗纤溶酶（α2-AP）样本，分别稀释成 5 个不同浓度的样本，采用实施例1-3和对比例1的试剂盒对每个浓度的样本测试3次，以理论浓度为（x），实测结果均值为(y)，求出线性回归方程，计算线性回归的相关系数（r），测试结果如表15-18所示。测试结果应符合要求：α2-AP活性在10-170%的线性范围内时，线性相关系数 r≥0.98。

表15.实施例1的线性测试结果

表16. 实施例2的线性测试结果

表17. 实施例3的线性测试结果

表18. 对比例1的线性测试结果

从表15-18的测试结果发现，实施例1-3的线性相关系数 r≥0.99，说明实施例1-3的试剂盒均符合上述线性范围要求。而对比例1的线性范围r=0.95，不符合要求，由实施例1与对比例1可知，使用重组牛纤溶酶和S-2403（实施例1）相比于普通纤溶酶和底物（对比例1）区分度更高，线性范围更宽。

5.重复性测试及其结果

采用实施例1-3测试α2-抗纤溶酶（α2-AP）低值和高值质控品各10次。按照公式（1）和（2）计算测试结果平均值平均值（X）和标准差（SD），按照公式（4）计算变异系数（CV），测试结果如表19-21所示。测试结果应符合要求：低值质控品变异系数（CV）≤10%；高值质控品变异系数（CV）≤8%。

公式（4）：

，式中：CV为变异系数。

表19. 实施例1的重复性测试结果

表20.实施例2的重复性测试结果

表21.实施例3的重复性测试结果

从表 19-21的测试结果发现，实施例1-3均符合上述重复性要求，且结果重复性较好。

6.稳定性测试及其结果

1)开瓶稳定性：将实施例1-3的R1试剂、R2试剂与稀释试剂开瓶后置于2-8℃储存，在第0天、第14天、第28天、第30天，第32天进行准确度测试，测试结果如表22所示。测试结果应符合要求：R1试剂、R2试剂与稀释试剂开瓶后置于2-8℃储存可以稳定30天，即相对偏差应在±15%范围内。

表22. 实施例1-3开瓶稳定性测试结果

2)从表22的测试结果发现，实施例 1-3 符合上述开瓶稳定性要求，R1试剂、R2试剂与稀释试剂开瓶后置于2-8℃至少可稳定储存32天。加速稳定性：将实施例1-3以及对比例3的R1试剂、R2试剂与稀释试剂在未开封状态下置于37℃储存，在第0天、第8天、第12天、第16天、第18天进行准确度测试，测试结果如表23所示。测试结果应符合要求：R1，R2及稀释液在未开封状态下置于37℃储存可以稳定16天，即相对偏差应在±15%范围内。

表23.实施例1-3及对比例3加速稳定性测试结果

从表23的测试结果发现，实施例1-3符合上述加速稳定性要求，R1，R2及稀释液在未开封状态下置于37℃至少可以稳定储存18天，对比例 3的相对偏差在第12天检测时已不符合均在±15%范围内的要求，即R1，R2及稀释液在未开封状态下置于37℃无法稳定储存12天，不符合加速稳定性要求，由实施例1与对比例3的结果可知，通过添加适量的酶蛋白保护剂Prionex有利于试剂盒的长期使用和存储，有利于保护酶的活性，防止凝血酶变性，使得试剂盒具有极好的加速稳定性，相比于对比例3，实施例1-3的试剂盒具有更高的加速稳定性。

7.临床相关性测试及其结果

采用第三方购买的参比试剂盒（厂家Siemens，批号565098）和实施例1-3同时测试一组覆盖线性范围的临床样本（40例），以参比试剂盒的实测值为x轴，实施例1-3试剂盒的实测值为y轴，做线性回归分析，测试结果如表24和附图1-3所示。测试结果应符合要求：线性回归方程的斜率k在0.9-1.1之间且相关系数R²≥0.95。

表24.实施例1-3临床相关性测试结果

从表24的测试结果发现，实施例1-3的试剂盒与参比试剂盒测试临床样本的结果做线性回归分析，线性回归方程的斜率k及相关性R²均符合要求，证明实施例1-3的试剂盒与参比试剂盒具有良好的相关性。

以上数据及附图表明，使用本发明的试剂盒进行相关性能测试，所得结果均符合接受标准。通过上述具体实施例来验证本发明的可行性与合理性，该实施例仅为本发明可供选择的个别实施例说明，但并不局限于此。对于本领域的技术人员而言，凡是根据本发明申请的专利范围所进行的变化，修改和替换均应包含在本发明的权利要求范围内，皆属于本发明的保护范畴。

Claims

1.一种α2-抗纤溶酶活性测定试剂盒，其特征在于，包括R1试剂、R2试剂与稀释试剂；

所述R1试剂由重组牛纤溶酶、第一缓冲液、蛋白酶保护剂、PAI-1、Proclin-300和第一辅料组成，所述第一辅料由氯化钠、谷氨酸、蔗糖、聚乙二醇2000和NP-40组成，且所述第一辅料中各组分在所述R1试剂中的质量百分比分别为： 0.5-1.5%氯化钠、3-5%谷氨酸、3-5%蔗糖、1-3% 聚乙二醇2000和0.5-1.5% NP-40，所述重组牛纤溶酶的浓度为5-7 IU/mL，所述PAI-1的浓度为1-2 IU/mL，所述Proclin-300在R1试剂中的质量百分比为0.03-0.05%，所述蛋白酶保护剂为BSA、Prionex中的至少一种，所述蛋白酶保护剂在所述R1试剂中的质量百分比为1-5%，所述第一缓冲液的pH为7.2-7.6；

所述R2试剂由发色底物S-2403、第二缓冲液、Proclin-300、蛋白酶保护剂和第二辅料组成，所述第二辅料由氯化钠、谷氨酸、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮和NP-40组成，且所述第二辅料中各组分在所述R2试剂中的质量百分比为： 0.5-1.5%氯化钠、3-5%谷氨酸、3-5%蔗糖、1-3%聚乙烯吡咯烷酮和0.5-1.5% NP-40，所述发色底物S-2403的浓度为2-4 mmol/L，所述Proclin-300在R2试剂中的质量百分比为0.03-0.05%，所述蛋白酶保护剂为BSA、Prionex中的至少一种，所述蛋白酶保护剂在所述R2试剂中的质量百分比为1-5%，所述第二缓冲液的pH为7.2-7.6；

所述稀释试剂由第三缓冲液、Proclin-300和第三辅料组成，所述第三辅料为氯化钠，所述氯化钠在所述稀释试剂中的质量百分比为 0.5-1.5%，所述Proclin-300在所述稀释试剂中的质量百分比为0.03-0.05%，所述第三缓冲液的pH为7.2-7.6；

所述第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液均为100-150 mmol/L Tris缓冲液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂的第一缓冲液为100 mmol/L的Tris缓冲液，所述蛋白酶保护剂为BSA，所述BSA在所述R1试剂中的质量百分比为1%，所述Proclin-300在所述R1试剂中的质量百分比为0.03%，所述重组牛纤溶酶的浓度为5IU/mL，所述PAI-1的浓度为1IU/mL，所述第一辅料中的各组分在所述R1试剂中的质量百分比分别为：0.5%氯化钠、3%谷氨酸、3%蔗糖、1% 聚乙二醇2000、0.5%NP-40，所述R1试剂的pH为7.2；

所述R2试剂的第二缓冲液为100 mmol/L的Tris缓冲液，所述蛋白酶保护剂为BSA，所述BSA在所述R2试剂中的质量百分比为1%，所述Proclin-300在所述R2试剂中的质量百分比为0.03%，所述发色底物S-2403的浓度为2 mmol/L，所述第二辅料中的各组分在所述R2试剂中的质量百分比分别为：0.5%氯化钠、3%谷氨酸、3%蔗糖、1%聚乙烯吡咯烷酮、0.5%NP-40，所述R2试剂的pH为7.2；

所述稀释试剂的第三缓冲液为100 mmol/L的Tris缓冲液，所述Proclin-300在所述稀释试剂中的质量百分比为0.03%，所述氯化钠在所述稀释试剂中的质量百分比0.5%，所述稀释试剂的pH为7.2。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂的第一缓冲液为125 mmol/L的Tris缓冲液，所述蛋白酶保护剂为BSA，所述BSA在所述R1试剂中的质量百分比为3%，所述Proclin-300在所述R1试剂中的质量百分比为0.04%，所述重组牛纤溶酶的浓度为6IU/mL，所述PAI-1的浓度为1.5IU/mL，所述第一辅料中的各组分在所述R1试剂中的质量百分比分别为：1%氯化钠、4%谷氨酸、4%蔗糖、2% 聚乙二醇2000和1%NP-40，所述R1试剂的pH为7.4；

所述R2试剂的第二缓冲液为125 mmol/L的Tris缓冲液，所述蛋白酶保护剂为BSA，所述BSA在所述R2试剂中的质量百分比为3%，所述Proclin-300在所述R2试剂中的质量百分比为0.04%，所述发色底物S-2403的浓度为3mmol/L，所述第二辅料中的各组分在所述R2试剂中的质量百分比分别为：1%氯化钠、4%谷氨酸、4%蔗糖、2%聚乙烯吡咯烷酮、1%NP-40，所述R2试剂的pH为7.4；

所述稀释试剂的第三缓冲液为125 mmol/L的Tris缓冲液，所述Proclin-300在所述稀释试剂中的质量百分比为0.04%，所述氯化钠在所述稀释试剂中的质量百分比1%，所述稀释试剂的pH为7.4。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂的第一缓冲液为150 mmol/L的Tris缓冲液，所述蛋白酶保护剂为Prionex，所述Prionex在所述R1试剂中的质量百分比为5%，所述Proclin-300在所述R1试剂中的质量百分比为0.05%，所述重组牛纤溶酶的浓度为7IU/mL，所述PAI-1的浓度为2IU/mL，所述第一辅料中的各组分在所述R1试剂中的质量百分比分别为：1.5%氯化钠、5%谷氨酸、5%蔗糖、3% 聚乙二醇2000、1.5%NP-40，所述R1试剂的pH为7.6；

所述R2试剂的第二缓冲液为150mmol/L的Tris缓冲液，所述蛋白酶保护剂为Prionex，所述Prionex在所述R2试剂中的质量百分比为5%，所述Proclin-300在所述R2试剂中的质量百分比为0.05%，所述发色底物S-2403的浓度为4 mmol/L，所述第二辅料中的各组分在所述R2试剂中的质量百分比分别为：1.5%氯化钠、5%谷氨酸、5%蔗糖、3%聚乙烯吡咯烷酮、1.5%NP-40，所述R2试剂的pH为7.6；

所述稀释试剂的第三缓冲液为150 mmol/L的Tris缓冲液，所述Proclin-300在所述稀释试剂中的质量百分比为0.05%，所述氯化钠在所述稀释试剂中的质量百分比1.5%，所述稀释试剂的pH为7.6。