EP0137292A2 - Reaktionsbehälter für immunologische Analysen - Google Patents
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- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
- B01L3/5082—Test tubes per se
Definitions
- the invention relates to a tubular reaction container for immunological analyzes, which at least on its closed! Its or lower end has an inner wall to which an antibody is fixed, which binds the component to be analyzed (antigen) and the labeled component (labeled antigen).
- reaction containers consist of a test tube or test tube and whose inner wall is coated with an antibody.
- Systems are also known in which a ball or other shaped insert is dropped into a conventional untreated test tube and is coated with an antibody which binds the component to be analyzed and the labeled component to itself (US Pat. Nos. 4,320,087 and 4 225 575).
- a disadvantage of the above-mentioned reaction containers is that the antigen to be analyzed and the labeled constituent bind slowly to the antibody or to the sphere coated with the antibody or to a similar insert in the test tube.
- the reason for this is that the binding reaction rate is determined by the diffusion of the component to be analyzed (antigen) and the labeled component (labeled antigen) within the solution in the tube onto the walls of the tube.
- the diffusion distances are long and the binding is slow. If the dimensions As the molecule increases, the rate of diffusion decreases, which makes the analysis of macromolecular protein hormones, for example, slow.
- the use of a sphere coated with an antibody does not significantly increase the rate of binding compared to the use of a coated test tube.
- test tubes or the spheres and similar objects used as reaction containers are generally made of polystyrene or polypropylene.
- the antibody is chemically fixed to its surface by adsorption or in several stages. Such a fixation is cumbersome and the uniform coating of hundreds or thousands of test tubes in one or more batches is extremely difficult.
- the reaction container according to the invention overcomes the aforementioned disadvantages and is essentially characterized in that the surface of the inner wall of the reaction container at and next to its closed end is enlarged by the fact that in it one or more parallel to the longitudinal axis of the container, projecting into and in the container integrated surfaces are provided in the container wall.
- the container is provided with beads or turns.
- the reaction container is divided into several compartments by partitions so that the liquid can flow freely from one compartment to another.
- the reaction container according to the invention can also consist of a tube which encloses a second coaxial tube with a smaller diameter, the latter projecting upward from the bottom.
- the lower or closed part of the reaction container is provided with at least one and expediently with no more than eight beads, preferably distributed symmetrically over the circumference.
- the container is provided with four to six symmetrically arranged beads.
- Each bead can protrude from the wall into the reaction container by a piece which is approximately 1/8 to slightly less than 1/2, such as 1/8 to approximately 5/12, preferably 1/5 to 1/3 of the inside diameter of the container cross section corresponds, on the one hand, to shorten the diffusion distances sufficiently and, on the other hand, to allow an unimpeded flow of the liquid in the container.
- the longitudinal expansion of the beads allows the container to be emptied quickly and cleanly.
- the beads extend in the longitudinal direction of the reaction container over a length which is sufficient to extend beyond the level of the sample in the tube.
- This length is, for example, generally about 1/4 to 1/2, in particular about 1/3, of the length of the container if the container is in the form of a microreagent tube.
- the reaction container can be provided with partition walls which protrude into the container and are designed such that the liquid! can flow freely between the different parts of the container.
- the partitions can be, for example, flanges and generally perpendicular to the wall of the container, or they can be in the form of ribs.
- the aforementioned requirements in connection with the design of the beads also apply in this case with regard to the number of walls or ribs, their length and their extent into the 1 container.
- a particularly advantageous reaction container is a test tube, the lower or closed end of which is provided with five symmetrically arranged ribs in the tube wall, which extend from the wall into the tube by a piece corresponding to approximately one third of the inner diameter of the tube cross section.
- the reaction container consists of two coaxial tubes of different diameters, the inner tube extending upward from the bottom of the outer tube and thereby delimiting an annular reaction space between the two.
- the inner tube can be formed in that the bottom of the outer tube is pressed into the tube towards its mouth.
- the inner tube can also be attached to the bottom inner surface of the outer tube in any suitable manner.
- the breadth of the Ringrau Mes can fluctuate, but is expediently about 1/5 to 1/3 of the inner diameter of the outer tube.
- One or both of the coaxial tubes can also be provided with beads or fins or flanges, as described in connection with the single tube design.
- the inner and outer tubes are preferably provided with the same number of beads, for example, which interlock (FIG. 4).
- the reaction container according to the invention is preferably made of a plastic or another material containing hydrophilic functional groups, such as -COOH,! -OH, -CHO, -NH 2, etc.
- Suitable plastics for the reaction vessel are, for example, polyacrylate-ethylene copolymers; Polystyrene derivatives, such as, for example, polyaminostyrene, polystyrene-acrylonitrile or polyvinylbenzyl chloride; Polyhydroxyethyl metacrylate, tris-acrylic NH 2 .
- the antibody fixed to the wall of the container very quickly binds the component to be analyzed (antigen) and the labeled component (labeled antigen) from the solution (FIG. 5).
- the immunological analyzes can be carried out quickly and the possibility of errors decreases, since the binding reaction can proceed almost to the end before the solution is removed from the container and the amount of the labeled component bound to the wall is measured will. This is a clear benefit to the user when hundreds of analyzes generally need to be performed daily.
- the antibody is fixed to the reaction container according to the invention in a simple and reliable manner, since the material of the Re-; action container contains functional groups.
- the surface of the wall of the reaction vessel or tube is enlarged in that four turns or beads P are provided in the wall, which extend over part of the tube length.
- the liquid-filled space V in the tube also becomes somewhat narrower.
- the distance between two opposing beads is about half the pipe diameter.
- the reaction container according to FIG. 2 in which the liquid space V is divided into four compartments by partitions or ribs S, which protrude into the container by a piece corresponding to approximately 1/3 of the diameter. 3, the liquid space V is defined by two coaxial tubes T 1 and T 2 of different diameters.
- the liquid space is formed between two coaxial tubes as in FIG. 3, but the outer tube X and the inner tube Y are provided with turns or beads P corresponding to those in FIG. 1.
- the reaction container according to the invention is used as follows: The test sample and the marked constituent are introduced into the reaction container. The antigen then binds in the sample and the labeled antigen, which as the mar-: The component acts on the antibody on the wall of the reaction container. When the binding reaction is sufficiently advanced, the solution is poured out of the reaction vessel and the amount of the labeled component adhered to the wall of the reaction vessel is measured. The amount of labeled component can also be measured from the solution poured out of the reaction container. The analysis method depends on the marked component used. The antibody is fixed to the wall of the reaction container by chemical binding of the antibody to the functional groups of the material from which the reaction container is made.
- reaction vessels are obtained, even when mass-produced, while also ensuring perfect storage.
- the binding of the antigen and the labeled constituent to the antibody fixed to the wall of the reaction container takes place very quickly.
- the “antibody” fixed to the wall of the reaction container can also be an antigen.
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Abstract
Description
- Die Erfindung betrifft einen rohrförmigen Reaktionsbehälter für immunologische Analysen, welcher zumindest an seinem geschlos- ! senen oder unteren Ende eine Innenwandung aufweist, an welcher ein Antikörper fixiert ist, welcher den zu analysierenden Bestandteil (Antigen) und den markierten Bestandteil (markiertes Antigen) an sich bindet.
- Man kennt bereits Reaktionsbehälter, welche aus einem Reagenzglas oder Teströhrchen bestehen und deren innere Wandung mit einem Antikörper überzogen ist. Man kennt auch Systeme, bei denen man in ein herkömmliches unbehandeltes Reagenzglas eine Kugel oder einen anders geformten Einsatz hineinfallen läßt, welcher mit einem Antikörper beschichtet ist, welcher den zu analysierenden Bestandteil und den markierten Bestandteil an sich bindet (US-Patentschriften 4 320 087 und 4 225 575).
- Ein Nachteil der vorgenannten Reaktionsbehälter besteht darin, daß eine Bindung des zu analysierenden Antigens und des markierten Bestandteils an den Antikörper oder an die mit dem Antikörper beschichtete Kugel oder den ähnlichen Einsatz im Rea- j genzglas langsam vor sich geht. Der Grund dafür ist darin zu sehen, daß die Bindungsreaktionsgeschwindigkeit durch die Diffusion des zu analysierenden Bestandteils (Antigen) und des markierten Bestandteils (markiertes Antigen) innerhalb der Lösung im Rohr an die Wandungen des Rohres bestimmt wird. Bei einem herkömmlichen Reagenzglas sind die Diffusionsentfernungen groß und geht die Bindung langsam vor sich. Wenn die Abmessung des Moleküls zunimmt, nimmt seine Diffusionsgeschwindig- keit ab, wodurch die Analyse von beispielsweise makromolekularen Proteinhormonen langsam vor sich geht. Die Verwendung einer mit einem Antikörper beschichteten Kugel erhöht die Bindungsgeschwindigkeit im Vergleich zur Verwendung eines beschichteten Reagenzglases nicht wesentlich. Auch bringt das Einsetzen einer Kugel oder eines ähnlichen Objektes in das Reagenzglas einen weiteren Arbeitsschritt mit sich. Außerdem ist die Handhabung und Lagerung getrennter Elemente für ein Reaktionsbehältersystem unbequem und die mit Antikörper beschichtete Oberfläche des einzusetzenden Elementes kann leicht beschädigt werden, was zu ungenauen Analyseresultaten führt.
- Die als Reaktionsbehälter verwendeten Reagenzgläser oder die Kugeln und ähnliche Gegenstände sind im allgemeinen aus Polystyrol oder Polypropylen hergestellt. Der Antikörper wird an ihrer Oberfläche durch Adsorption oder in mehreren Stufen chemisch fixiert. Eine derartige Fixierung ist umständlich und die gleichmäßige Beschichtung von Hunderten oder Tausenden von Reagenzgläsern in einer oder mehreren Partien ist äußerst schwierig.
- Der erfindungsgemäße Reaktionsbehälter überwindet die vorgenannten Nachteile und ist im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche der Innenwandung des Reaktionsbehälters an und neben seinem geschlossenen Ende dadurch vergrößert ist, daß in ihr eine oder mehrere parallel zur Längsachse des Behälters verlaufende, in den Behälter hineinragende und in die Behälterwandung integrierte Flächen vorgesehen sind.
- Nach einem Vorschlag der Erfindung ist der Behälter mit Sicken oder Windungen versehen. Alternativ ist der Reaktionsbehälter durch Trennwände in mehrere Abteile derart unterteilt, daß die Flüssigkeit ungehindert vom einen Abteil zu einem anderen fliessen kann. Der erfindungsgemäße Reaktionsbehälter kann auch aus einem Rohr bestehen, welches ein zweites koaxiales Rohr mit kleinerem Durchmesser umschließt, wobei letzteres vom Boden aus nach oben ragt.
- Erfindungsgemäß ist der untere oder geschlossene Teil des Reaktionsbehälters mit wenigstens einem und zweckmäßigerweise mit nicht mehr als acht Sicken, vorzugsweise in symmetrischer Anordnung über den Umfang verteilt, versehen. Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausbildung ist der Behälter mit vier bis sechs symmetrisch angeordneten Sicken versehen. Jede Sicke kann von der Wandung in den Reaktionsbehälter um ein Stück hineinragen, welches etwa 1/8 bis etwas weniger als 1/2, wie beispielsweise 1/8 bis etwa 5/12, vorzugsweise 1/5 bis 1/3 des Innendurchmessers des Behälterquerschnittes entspricht, um einerseits die Diffusionsabstände ausreichend zu verkürzen und andererseits dennoch eine ungehinderte Strömung der Flüssigkeit im Behälter zu ermöglichen. Die Längsausdehnung der Sicken erlaubt ein schnelles und sauberes Entleeren des Behälters. Die Sicken erstrecken sich in Längsrichtung des Reaktionsbehälters über eine Länge, welche ausreicht, um über den Spiegel der Probe im Rohr hinauszureichen. Diese Länge beträgt beispielsweise im allgemeinen etwa 1/4 bis 1/2, insbesondere etwa 1/3 der Länge des Behälters, wenn der Behälter die Form eines Mikroreagenzrohres besitzt.
- Nach einem zweiten Vorschlag der Erfindung kann der Reaktionsbehälter mit Trennwänden versehen sein, welche in den Behälter hineinragen und derart ausgebildet sind, daß die Flüssigkeit ! zwischen den verschiedenen Teilen des Behälters ungehindert fließen kann. Die Trennwände können beispielsweise Flansche sein und im allgemeinen rechtwinklig zur Wandung des Behälters verlaufen oder sie können die Form von Rippen haben. Die vorgenannten Forderungen in Verbindung mit der Ausführung der Sicken gilt auch in diesem Fall in Bezug auf die Anzahl der Wandungen oder Rippen, ihre Länge und ihre Ausdehnung in den 1 Behälter hinein.
- Ein besonders vorteilhafter Reaktionsbehälter ist ein Testrohr, dessen unteres oder geschlossenes Ende mit fünf symmetrisch angeordneten Rippen in der Rohrwandung versehen ist, welche sich von der Wandung aus in das Rohr um ein etwa einem 1/3 des Innendurchmessers des Rohrquerschnittes entsprechendes Stück erstrecken.
- Gemäß einem dritten Ausführungsbeispiel besteht der Reaktionsbehälter aus zwei koaxialen Rohren unterschiedlichen Durchmessers, wobei das Innenrohr sich vom Boden des Außenrohres nach oben erstreckt und dadurch zwischen beiden ein kreisringförmiger Reaktionsraum begrenzt wird. Das Innenrohr kann dadurch ausgebildet werden, daß der Boden des Außenrohres in das Rohr zu dessen Mündung hin eingedrückt wird. Alternativ kann das Innenrohr auch an der Bodeninnenfläche des Außenrohres auf irgendwie geeignete Weise befestigt werden. Die Weite des Ringraumes kann schwanken, beträgt jedoch zweckmäßigerweise etwa 1/5 bis 1/3 des Innendurchmessers des Außenrohres. Eines oder beide der koaxialen Rohre können auch mit Sicken oder Rippen oder Flanschen versehen werden, wie dies im Zusammenhang mit der Ausführung aus einem einzigen Rohr beschrieben wurde. Dabei sind das Innen- und das Außenrohr vorzugsweise mit der gleichen Anzahl von beispielsweise Sicken versehen, welche ineinandergreifen (Fig.4).
- Der erfindungsgemäße Reaktionsbehälter ist vorzugsweise aus einem Kunststoff oder einem anderen, hydrophile funktionelle Gruppen enthaltenden Material hergestellt, wie beispielsweise -COOH, ! -OH, -CHO, -NH2 usw.. Geeignete Kunststoffe für den Reaktionsbehälter sind beispielsweise Polyakrylat-Äthylen-Copolymere; Polystyrolderivate, wie beispielsweise Polyaminostyrol, Polystyrolakrylnitril oder Polyvinylbenzylchlorid; Polyhydroxyäthylmetakrylat, Tris-akryl-NH2.
- Versuche haben gezeigt, daß in dem erfindungsgemäßen Reaktionsbehälter der an der Wandung des Behälters fixierte Antikörper sehr schnell den zu analysierenden Bestandteil (Antigen) und den markierten Bestandteil (markiertes Antigen) aus der Lösung an sich bindet (Fig. 5). Mit dem erfindungsgemäßen Reaktionsbehälter können die immunologischen Analysen schnell durchgeführt werden und die Möglichkeit von Fehlern nimmt ab, da die Bindungsreaktion fast bis zum Ende vor sich gehen kann, bevor die Lösung aus dem Behälter entfernt wird und die Menge des an der Wandung gebundenen markierten Bestandteils gemessen wird. Dies bedeutet einen eindeutigen Vorteil für den Benutzer, wenn im allgemeinen täglich Hunderte von Analysen durchgeführt werden müssen.
- Der Antikörper wird erfindungsgemäß am Reaktionsbehälter auf einfache und zuverlässige Weise fixiert, da das Material des Re- ; aktionsbehälters funktionelle Gruppen enthält.
- Die Erfindung wird nachstehend anhand der beiliegenden Zeichnung im einzelnen erläutert; es zeigt
- Fig. 1 einen Reaktionsbehälter, dessen unteres Teil gewunden ist oder mit Sicken versehen ist, und zwar im Längsschnitt und im Querschnitt;
- Fig. 2 einen Längs- und einen Querschnitt eines Reaktionsbehälters, welcher durch Trennwände in einzelne Abteile unterteilt ist;
- Fig. 3 einen Längs- und einen Querschnitt eines Reaktionsbehälters, der aus zwei koaxialen Rohren mit unterschiedlichen Durchmessern gebildet ist;
- Fig. 4 einen Querschnitt eines Reaktionsbehälters gemäß Fig. 3, bei welchem das Innen- und das Außenrohr mit Windungen oder Sicken versehen ist und I
- Fig. 5 das Bindevermögen des zu analysierenden Bestandteils (Antigen) und des markierten Bestandteils (markiertes Antigen) als eine Funktion der Zeit bei einer Messung mit einem erfindungsgemäßen Reaktionsbehälter (Kurve A) bzw. mit einem herkömmlichen Testrohr (Kurve B).
- Bei der Ausführung gemäß Fig. 1 ist die Oberfläche der Wandung des Reaktionsbehälters oder Rohres dadurch vergrößert, daß in der Wandung vier Windungen oder Sicken P vorgesehen sind, welche sich über einen Teil der Rohrlänge erstrecken. Auf diese Weise wird auch der flüssigkeitsgefüllte Raum V im Rohr etwas enger. Bei dieser Ausführung beträgt der Abstand zwischen zwei einander gegenüberliegenden Sicken etwa die Hälfte des Rohrdurchmessers. Gleiche Eigenschaften ergeben sich bei dem Reaktionsbehälter gemäß Fig. 2, bei welchem der Flüssigkeitsraum V durch Trennwände oder Rippen S in vier Abteile unterteilt ist, welche in den Behälter um ein etwa 1/3 des Durchmessers entsprechendes Stück hineinragen. In Fig. 3 ist der Flüssigkeitsraum V durch zwei koaxiale Rohre Tl und T2 unterschiedlichen Durchmessers definiert. In Fig. 4 wird der Flüssigkeitsraum zwischen zwei koaxialen Rohren wie in Fig. 3 ausgebildet, doch sind das Außenrohr X und das Innenrohr Y mit Windungen oder Sicken P entsprechend denen der Fig. 1 versehen.
- Der erfindungsgemäße Reaktionsbehälter wird wie folgt verwendet: Die Testprobe und der markierte Bestandteil werden in den Reaktionsbehälter eingebracht. Daraufhin bindet sich das Antigen in der Probe und das markierte Antigen, welches als der mar- : kierte Bestandteil fungiert, an den Antikörper an der Wandung des Reaktionsbehälters. Wenn die Bindungsreaktion weit genug fortgeschritten ist, wird die Lösung aus dem Reaktionsbehälter abgegossen und die Menge des an der Wandung des Reaktionsbehälters anhaftenden markierten Bestandteils gemessen. Die Menge an markiertem Bestandteil kann auch aus der aus dem Reaktionsbehälter ausgegossenen Lösung gemessen werden. Das Analyseverfahren hängt von dem verwendeten markierten Bestandteil ab. Die Fixierung des Antikörpers an der Wandung des Reaktionsbehälters erfolgt durch chemische Bindung des Antikörpers an die funktionellen Gruppen des Materials, aus welchem der Reaktionsbehälter besteht.
- Auf diese Weise erhält man gleichmäßige Reaktionsbehälter, und zwar selbst bei Herstellung in großen Serien, während außerdem eine einwandfreie Lagerung ermöglicht wird. Aufgrund der Form des erfindungsgemäßen Reaktionsbehälters geht die Bindung des Antigen und des markierten Bestandteils an dem an der Wandung des Reaktionsbehälters fixierten Antikörpers sehr schnell vor sich. Mit dem erfindungsgemäßen Reaktionsbehälter lassen sich alle derartigen Substanzen und Substanzkombinationen analysieren, welche eine immunologische Analyse erlauben. Bei dem an der Wandung des Reaktionsbehälters fixierten "Antikörper" kann es sich auch um ein Antigen handeln.
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