JP5737673B2 - アレルゲンのエピトープ又はその候補の検出方法及びその利用 - Google Patents
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Description
本発明は、アレルゲンのエピトープを検出する方法に関し、特に、少なくとも2つのエピトープのセットを検出する方法及びその利用に関する。
(a)被験試料として、複数のアレルギー陽性個体に由来する抗体を含有する被験試料群と、複数のアレルギー陰性個体に由来する抗体を含有する対照試料群とのそれぞれにつき、
可能性あるアレルゲンタンパク質又はその一部のアミノ酸配列に基づく所定長の複数のオーバーラップペプチドが固定化されたアレイに、前記各群の試料をそれぞれ供給し、前記複数のオーバーラップペプチドと前記1種又は2種以上の抗体とを接触させる工程、
(b)前記複数のオーバーラップペプチドにつき、前記1種又は2種以上の抗体との特異的結合を検出する工程、
(c)前記複数のオーバーラップペプチドから選択されるオーバーラップペプチドであって、前記対照試料群から得られる前記オーバーラップペプチドの前記特異的結合の強度に関する平均対照強度情報と前記被験試料群から得られる前記オーバーラップペプチドの前記特異的結合の強度に関する平均被験強度情報とに基づいて、前記特異的結合が肯定される1種又は2種以上の前記オーバーラップペプチドを、前記アレルゲンにおける第1のエピトープ又はその候補とする工程、及び
(d)前記被験試料群から選択される被験試料に関し、前記1種又は2種以上の第1のエピトープ又はその候補に相当する前記オーバーラップペプチドの個別の被験強度情報と前記平均対照強度情報とに基づいて、前記オーバーラップペプチドを前記第1のエピトープ又はその候補とすることができるとき、当該第1のエピトープ又はその候補以外の他の前記オーバーラップペプチドから、前記平均対照強度情報に基づいて得られる臨界値以上あるいは当該臨界値を超える個別被験強度情報を有する1種又は2種以上の前記オーバーラップペプチドを前記アレルゲンにおける第2のエピトープ又はその候補とする工程、
を備える、方法が提供される。
(e)前記第1のエピトープ候補のそれぞれにつき、前記オーバーラップペプチド毎に当該オーパーラップペプチドを第2のエピトープ又はその候補とする被験試料の個数情報を取得する工程、を備えることができ、また、さらに、(f)前記第1のエピトープ又はその候補のそれぞれにつき、前記被験試料群中所定割合以上の前記被験試料が特定の前記オーバーラップペプチドを第2のエピトープ又はその候補とするとき、前記第1のエピトープ又はその候補と当該第2のエピトープ又はその候補とを前記アレルゲンにおけるエピトープセット又はその候補とする工程、を備えることができる。
(a)アレルギー陽性個体に由来する抗体を含有する被験試料と、複数のアレルギー陰性個体に由来する抗体を含有する対照試料群とのそれぞれにつき、
可能性あるアレルゲンタンパク質又はその一部のアミノ酸配列に基づく所定長の複数のオーバーラップペプチドが固定化されたアレイに、前記各群の試料をそれぞれ供給し、前記複数のオーバーラップペプチドと前記1種又は2種以上の抗体とを接触させる工程、
(b)前記複数のオーバーラップペプチドにつき、前記1種又は2種以上の抗体との特異的結合を検出する工程、及び
(c)前記アレルギー陽性個体につき、
前記各オーバーラップペプチドについて得られる個別の被験強度情報と、前記対照試料群の前記各オーバーラップペプチドについて得られる前記特異的結合の強度に関する平均対照強度情報とに基づいて、前記特異的結合が肯定される1種又は2種以上のオーバーラップペプチドを第1のエピトープ又はその候補とし、当該第1のエピトープ又はその候補以外の他の前記オーバーラップペプチドから、前記平均対照強度情報に基づいて得られる臨界値以上あるいは当該臨界値を超える個別被験強度情報を有する1種又は2種以上の前記オーバーラップペプチドを前記アレルゲンにおける第2のエピトープ又はその候補とする工程、
を備える、方法も提供される。
(抗原抗体反応実施工程)
本発明のエピトープ又はその候補の検出方法は、まず、(a)被験試料として、複数のアレルギー陽性個体に由来する抗体を含有する被験試料群と、複数のアレルギー陰性個体に由来する抗体を含有する対照試料群とのそれぞれにつき、可能性あるアレルゲンタンパク質又はその一部のアミノ酸配列に基づく所定長の複数のオーバーラップペプチドが固定化された固相担体に、前記各群の試料をそれぞれ供給し、前記複数のオーバーラップペプチドと抗体とを接触させる工程を実施する。この工程により、オーバーラップペプチドと試料に含まれる抗体とを接触させて、抗原−抗体反応を生じさせることができる。
次に、複数のオーバーラップペプチドにつき、各試料中の抗体との特異的結合を検出する工程を実施する。固相担体上での抗原抗体反応は、従来のイムノアッセイに用いられる標識物質を用いて検出することができる。標識物質としては、蛍光物質、発光物質、色素、酵素、補酵素、あるいはラジオアイソトープ等が挙げられる。標識物質は、エピトープポリペプチドや該エピトープポリペプチドに結合する抗体に対する二次抗体に直接結合して標識することができる。あるいは標識物質を認識する抗体やアビジン−ビオチン系などを利用して間接標識することもできる。特異的結合は、こうした標識物質に基づくシグナルの種類に応じた検出装置を用いて検出する。検出したシグナル強度は、特異的結合した抗体量に関連付けすることができる。
次に、第1のエピトープ又はその候補を決定する工程を実施する。第1のエピトープ又はその候補は、オーバーラップペプチドから選択される。各被験試料につき得られる固相担体上のオーバーラップペプチドについての個別のシグナル強度情報(以下、個別被験強度情報という。)が得られる。これらの個別被験情報から、被験試料群につき、同一のオーバーラップペプチドについての全ての個別被験強度情報の平均化したシグナル強度情報(平均被験強度情報という。)を得ることができる。平均被験強度情報は、例えば、全ての個別被験強度情報の単純平均とすることができる。
さらに本検出方法では、第2のエピトープ又はその候補の決定工程を実施する。この工程は、被験試料群から選択される被験試料に関し、既に前段の工程で決定した第1のエピトープ又はその候補に相当するオーバーラップペプチドが、当該被験試料の個別被験強度情報と対照強度情報とに基づいて、被験試料中の抗体との特異的結合が肯定されるかどうかを判定する。換言すれば、被験試料群において決定された第1のエピトープ又はその候補が、個別の被験試料においても第1のエピトープ又はその候補とすることができるかどうかを判定する。判定方法は、被験試料群について第1のエピトープ又はその候補となるかどうかの判定手法を、個々の被験試料につき適用することができる。好ましくは、上記(3)の手法を採用する。
本発明は、個々のアレルギー陽性個体についてのアレルゲンのエピトープ又はその候補を検出する方法にも関する。検出方法は、既に説明した検出方法において、被験試料群に含まれる個別の被験試料につき、第1のエピトープ又はその候補及び第2のエピトープ又はその候補を決定するものとしてもよい。具体的には、第1のエピトープ又はその候補の決定工程を、個別の被験強度情報と平均対照強度情報に基づいて実施し、決定された第1のエピトープ又はその候補について、被験試料についての第2のエピトープ又はその候補を、個別被験強度情報と平均対照強度情報とに基づいて決定すればよい。また、アレルギー陽性個体のエピトープ又はその候補を検出するには、個別の被験試料について抗原抗体反応及び検出工程を実施すればよく、被験試料群としてこれらの工程を実施しなくてもよい。こうした個体特異的なエピトープの組み合わせを決定することで、より確度の高い診断が可能となる。
本発明によれば、牛乳アレルギー等のアレルゲンタンパク質のエピトープペプチド又はそのセットが提供される。エピトープペプチド及びそのセットは、牛乳アレルギーの診断、治療等に有用である。特に、本発明で特定されたエピトープペプチドのセットは、アレルギー症状の発現を誘発するのに関連が深いエピトープの組み合わせであるため、このセットを用いることで、偽陽性(アレルギー症状は発現しないがアレルゲンに対してIgEが高い検体)であるとの診断結果を回避してより確度の高い診断が可能である。
1.牛乳アレルギー陽性検体(61検体)
過去に以下に定義される“牛乳アレルギー症状”が確認されていること
(1)牛乳負荷試験で、30ml以下の牛乳摂取で即時型反応陽性
(2)30ml以下の牛乳又はそれに相当する乳製品(育児用ミルクでは、60mlに該当)摂取で即時型反応
(3)牛乳を含む加工品で即時型反応あり、そこに含まれる他の成分のアレルギーが否定されている
(4)いずれの場合も、摂取から2時間以内に症状が確認されていること
(1)乳幼児期から牛乳アレルギーの既往(誘発症状)があって牛乳アレルギーの診断が確定している
(2)年齢が5歳を超えてから、牛乳の摂取・接触又は吸入によって即時型のアレルギー症状の経験がある。現在の年齢は問わない
(3)症状は、体の広範囲に及ぶ皮膚症状(紅斑・膨疹・浮腫)、呼吸器症状(咳、喘鳴、呼吸困難)、消化器症状(腹痛、嘔吐)、循環器症状の一つ以上を含む(湿疹の悪化、口腔粘膜症状のみ、接触部位に限定した蕁麻疹、下痢のみ、は除く)
(4)摂取から2時間以内に症状が出現している
(5)症状を誘発した牛乳含有食品が、以下のいずれかに該当する(負荷試験か誤食かは問わない)
10ml以下の牛乳又はそれに相当する乳製品、牛乳をわずかに含む加工品(ただし、同時に含まれる他の成分(卵や小麦など)のアレルギーが否定されていること)、乳成分のコンタミネーションや牛乳との接触・乳製品を加熱した水蒸気の吸入、乳成分を含有することがわかっている医薬品(ラックB、エンテロノン、メイアクト)
(6)牛乳特異的IgE抗体陽性(クラス1以上)
(7)乳幼児期から現在まで、牛乳完全除去を継続している。ただし、乳糖と治療用加水分解乳(ミルフィー、MA−1、MA−mi、ペプディエット)は摂取可能であってもよい
(1)牛乳アレルギー陽性検体」の定義を満たす
(2)牛乳IgE(CAP−RAST)クラス3以下
ペプチドアレイは、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、αs1−カゼイン、αs2−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼインの6種のアレルゲンタンパク質につき、それぞれ、配列番号1〜51、配列番号52〜91、配列番号92〜154、配列番号155〜220、配列番号221〜287、配列番号288〜340に記載のオーバーラップペプチドを化学合成し、ペプチドアレイを作製した。ペプチドへのアレイへの固定化は以下の通りとした。なお、固相担体としては、ガラス基板を用いた。その後、イムノアッセイ(検体の供給及び蛍光検出)を行い、検出した蛍光強度を数値化した。なお、蛍光スキャナーは、Agilent社製scanner model G2505B, software G2565BA/DAを用い、数値解析ソフトとしては、Axon社製Gene Pix.Proを用いた。
a)80℃で1時間加熱処理をした
b)(2×SSC,0.2%SDS)溶液に15分間浸漬した(室温)
c)(2×SSC,0.2%SDS)溶液に5分間浸漬した(95℃)
d)滅菌水中で10回程度振とうした(3回)
e)遠心乾燥する
a)(50mMEthanolamine,0.1% SDS,0.1MTris(hydroxymethyl)aminomethane)溶液に90分間浸漬した(室温)
b)PBS−T(1×PBS,0.1% Tween20)溶液に5分間浸漬した(室温、3回)
c)(1% OVA,PBS−T)溶液で希釈した患者血清(1:10)200μLアプライした担体をマイクロカバーガラス(松浪ガラス社製size24×60mm、thickness No.4)で覆い、Humid chamber(Sigma社)内で1時間静置した(37℃)
d)c)で反応中の担体を4℃の環境下に移し、一晩静置した
e)PBS−T溶液中でマイクロカバーガラスを外した。
f)PBS−T溶液に5分間浸漬した(室温、3回)
g)(1%OVA、PBS−T)溶液で希釈したGoat anti−human IgE−Alexa647 polyclonal antibodies(1:500)200μLをc)と同様の手順で反応させ、暗所にて3時間静置した(室温)
h)PBS−T溶液中でマイクロカバーガラスを外す
i)PBS−T溶液に5分間浸漬した(室温、3回)
j)滅菌水中で10回程度振とうした(3回)
(a)第1のエピトープ又はその候補の決定
得られた蛍光強度情報を用いて、牛乳アレルギー陰性検体群と比較し、牛乳アレルギー陽性検体群(61検体)、超過敏症検体群(9検体)、牛乳アレルギー弱陽性群(30検体)で有意にIgEの結合が認められるエピトープ領域を下記の手順(図1参照)で特定した。
スキームを図2に示す。まず、陽性検体群の各検体につき、(a)で決定した第1のエピトープ又はその候補であって、5連続であっても、単独であっても双方において患者群に対して有意性を持つオーバーラップペプチドを抽出し、さらに、抽出したオーバーラップペプチド以外であって、陰性群(22検体)の平均蛍光強度値にその2SDを加えた値以上の強度を示すオーバーラップペプチド(第2のエピトープ又はその候補)を抽出した。陽性検体群の全ての検体についてこの作業を繰り返して、特定の第1のエピトープ又はその候補に対する第2のエピトープ又はその候補となるオーバーラップを有する検体数をオーバーラップペプチド毎に集計した。そして、該当検体数の90パーセンタイル以上で認められた2つのペプチドの組み合わせを抽出した。
(1)上記(a)の結果
主要な6つのミルクアレルゲン蛋白(β−lactalbumin、α−lactoglobulin,αs1−casein,αs2−casein,β−casein,κ−casein)の全アミノ酸配列を網羅した16−mer、3−offsetからなるオーバーラップペプチドに対し、患者群と陰性群で平均蛍光強度値の比較、t検定の両側検定、患者群で有意にIgEの結合が認められたペプチドの抽出をした結果を図3〜図20に示す。
実際のアレルギー症状の発現には患者血清中の2つのエピトープに対するIgEの組み合わせが必要であるため、次に牛乳アレルギー陽性検体中(61例)で認識される2つのIgE結合ペプチドの組み合わせを解析した。2つのIgE結合ペプチドの組み合わせをもつ陽性患者数をカウントした結果を図21〜図26に示す。なお、図21〜図26では、縦軸と横軸に示したそれぞれ、2つのペプチドを認識するIgEの組み合わせをもつ牛乳アレルギー陽性検体の数を交差するマス目に表示した。カットオフ値は牛乳アレルギー陰性検体群(22例)の平均蛍光強度値にその2SDを加えた値である。また、軸は同一タンパクのアミノ酸シークエンスのN末からC末の順にペプチドNo.を表記した。これらの図においては、アレルギー陽性検体群につき検出した第1のエピトープ又はその候補(表1参照)であるオーバーラップペプチドを、図毎の配列番号を示した項目欄において最淡グレー色で着色して示した。また、これらの図においては、検体群につき決定した第1のエピトープと第2のエピトープとの組合せのほか、検体群に含まれる個別の検体について決定した第1のエピトープと第2のエピトープとの組み合わせについても併せて記載している。
最後に患者個人で見た場合、アレルギー反応の誘発に関与すると考えられる2つIgEの組み合わせを示す(図27)。患者8番の血清中に存在するαs1−caseinのペプチドID(N→C末の順:横軸)を認識するIgE(蛍光強度値:縦軸)の組み合わせを示す。この患者ではαs1−casein中、5配列と1配列の両方で有意性を持つペプチド(No.52−56)と陰性群(22検体)の平均蛍光強度値にその2SDを加えた値以上のピークもつペプチド(No.2)との組み合わせが、アレルギー症状の誘発に関与している可能性が最も高いことがわかった。
(1)5配列ピーク解析において、少なくとも条件4を充足するとき、一つのエピトープペア片方のエピトープの一つとして好ましく、より好ましくは、条件5又は条件6を充足し、さらに好ましくは条件5及び6を充足するオーバーラップペプチドが挙げられる。
(2)5配列ピーク解析における条件を充足するのに加えて、シングルピーク解析において、少なくとも条件1を充足するものがさらに好ましい。一層好ましくは、条件2又は条件3を充足し、さらに好ましくは条件2及び3を充足するオーバーラップペプチドが挙げられる。
(3)上記(1)、(2)に基づいて、エピトープペアの片方の候補が抽出される。
(1)ペアを構成する片方のエピトープがより高いレベルで条件4等の5配列ピークの要件を充足しているかどうか
(2)ペアを構成する片方のエピトープが、より高いレベルで条件1等のシングルピークの要件を充足しているかどうか
(3)そのエピトープペアに、より多くの陽性患者(絶対数又は全陽性患者に対する割合)が反応しているかどうか
Claims (12)
- 牛乳に対するアレルギー疾患の検査方法であって、
単一アレルゲンに対して脱顆粒を惹起するために有効な2種類以上のアレルゲン特異的エピトープの組み合わせを含む2種類以上のエピトープペプチドに対して、アレルギー疾患の可能性のある個体に由来する抗体を含有する被験試料を供給し、前記2種類以上のエピトープペプチドと前記抗体と接触させる工程と、
前記アレルゲン特異的エピトープの組み合わせを構成する前記2種類以上のエピトープペプチドにつき、前記抗体との特異的結合を検出する工程と、
を備え、
前記単一アレルゲンは、β−ラクトグロブリン、αs1−カゼイン、αs2−カゼイン、β−カゼイン及びκ−カゼインからなる群から選択される1種又は2種以上であり、
前記アレルゲン特異的エピトープの組合せを構成する前記2種類以上のエピトープペプチドは、前記単一アレルゲンに関して、
以下の表1〜表9から選択される組合せである、検査方法。
- 前記接触工程は、前記2種類以上のエピトープペプチドを固定化した固相担体を用いる工程である、請求項1に記載の方法。
- 請求項1又は2に記載の検査方法に用いるためのアレイであって、
前記アレルゲン特異的エピトープの組合せを構成する前記2種類以上のエピトープペプチドは、前記単一アレルゲンに関するプローブとして、前記表1〜前記表9から選択される組合せのエピトープペプチドが固定化されている、アレイ。 - 請求項1又は2に記載のアレルギー検査方法に用いる、単一アレルゲンに対して脱顆粒を惹起するために有効な2種類以上のアレルゲン特異的エピトープの組み合わせ又はその候補を検出する方法であって、以下の工程;
(a)被験試料として、複数のアレルギー陽性個体に由来する抗体を含有する被験試料群と、複数のアレルギー陰性個体に由来する抗体を含有する対照試料群とのそれぞれにつき、
前記単一アレルゲンのタンパク質又はその一部のアミノ酸配列に基づく所定長の複数のオーバーラップペプチドが固定化されたアレイに、前記各群の試料をそれぞれ供給し、前記複数のオーバーラップペプチドと前記1種又は2種以上の抗体とを接触させる工程、
(b)前記複数のオーバーラップペプチドにつき、前記1種類又は2種類以上の抗体との特異的結合を検出する工程、
(c)前記複数のオーバーラップペプチドから選択されるオーバーラップペプチドであって、前記対照試料群から得られる前記オーバーラップペプチドの前記特異的結合の強度に関する平均対照強度情報と前記被験試料群から得られる前記オーバーラップペプチドの前記特異的結合の強度に関する平均被験強度情報とに基づいて、前記特異的結合が肯定される1種類又は2種類以上の前記オーバーラップペプチドを、前記単一アレルゲンにおける前記アレルゲン特異的エピトープの組み合わせを構成する第1のエピトープ又はその候補とする工程、及び
(d)前記被験試料群から選択される被験試料に関し、前記1種類又は2種類以上の第1のエピトープ又はその候補に相当する前記オーバーラップペプチドの個別の被験強度情報と前記平均対照強度情報とに基づいて、前記オーバーラップペプチドを前記第1のエピトープ又はその候補とすることができるとき、当該第1のエピトープ又はその候補以外の他の前記オーバーラップペプチドから、前記平均対照強度情報に基づいて得られる臨界値以上あるいは当該臨界値を超える個別被験強度情報を有する1種類又は2種類以上の前記オーバーラップペプチドを前記アレルゲン特異的エピトープの組み合わせを構成する第2のエピトープ又はその候補とする工程、
を備える、方法。 - さらに、以下の工程;
(e)前記第1のエピトープ又はその候補のそれぞれにつき、前記オーバーラップペプチド毎に当該オーパーラップペプチドを第2のエピトープ又はその候補とする被験試料の個数情報を取得する工程、
を備える、請求項4に記載の方法。 - さらに、以下の工程;
(f)前記第1のエピトープ又はその候補のそれぞれにつき、前記被験試料群中所定割合以上の前記被験試料が特定の前記オーバーラップペプチドを第2のエピトープ又はその候補とするとき、前記第1のエピトープ又はその候補と当該第2のエピトープ又はその候補とを前記アレルゲンにおけるエピトープセット又はその候補とする工程、
を備える、請求項5に記載の方法。 - 前記(c)工程は、前記被験試料群の一つの前記オーバーラップペプチドについて得られる平均被験強度情報と、対応する前記オーバーラップペプチドの平均対照強度情報と、に基づいて、前記一つのオーバーラップペプチドの前記特異的結合が肯定されるとき、前記一つのオーバーラップペプチドを前記第1のエピトープ又はその候補とする工程である、請求項4〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記(c)工程は、前記被験試料群の一つの前記オーバーラップペプチドを含んで所定数連続する複数のオーバーラップペプチドについて得られる複合被験強度情報と、対応する複数のオーバーラップペプチド毎の対照強度情報から得られる複合対照強度情報と、に基づいて、前記所定数連続する複数のオーバーラップペプチド全体として前記特異的結合が肯定されるとき、前記一つのオーバーラップペプチドを前記第1のエピトープ又はその候補とする工程である、請求項4〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記(c)工程は、前記被験試料群の一つの前記オーバーラップペプチドについて得られる平均被験強度情報と、対応する前記オーバーラップペプチドの平均対照強度情報と、に基づいて、前記一つのオーバーラップペプチドの前記特異的結合が肯定され、かつ、
前記一つのオーバーラップペプチドを含んで所定数連続する複数のオーバーラップペプチドについて得られる複合被験強度情報と、対応する前記複数のオーバーラップペプチド毎の平均対照強度情報から得られる複合対照強度情報と、に基づいて、前記所定数連続する複数のオーバーラップペプチド全体として前記特異的結合が肯定されるとき、前記一つのオーバーラップペプチドを前記第1のエピトープ又はその候補とする工程である、請求項4〜6のいずれかに記載の方法。 - 請求項1又は2に記載のアレルギー検査方法に用いる、単一アレルゲンに対して脱顆粒を惹起するために有効な2種類以上のアレルゲン特異的エピトープの組み合わせ又はその候補を検出する方法であって、以下の工程;
(a)アレルギー陽性個体に由来する抗体を含有する被験試料と、複数のアレルギー陰性個体に由来する抗体を含有する対照試料群とのそれぞれにつき、
前記単一アレルゲンのタンパク質又はその一部のアミノ酸配列に基づく所定長の複数のオーバーラップペプチドが固定化されたアレイに、前記各群の試料をそれぞれ供給し、前記複数のオーバーラップペプチドと前記1種類又は2種類以上の抗体とを接触させる工程、
(b)前記複数のオーバーラップペプチドにつき、前記1種類又は2種類以上の抗体との特異的結合を検出する工程、及び
(c)前記アレルギー陽性個体につき、
前記各オーバーラップペプチドについて得られる個別の被験強度情報と、前記対照試料群の前記各オーバーラップペプチドについて得られる前記特異的結合の強度に関する平均対照強度情報とに基づいて、前記特異的結合が肯定される1種類又は2種類以上のオーバーラップペプチドを前記アレルゲン特異的エピトープの組み合わせを構成する第1のエピトープ又はその候補とし、当該第1のエピトープ又はその候補以外の他の前記オーバーラップペプチドから、前記平均対照強度情報に基づいて得られる臨界値以上あるいは当該臨界値を超える個別被験強度情報を有する1種又は2種以上の前記オーバーラップペプチドを前記アレルゲン特異的エピトープの組み合わせを構成する第2のエピトープ又はその候補とする工程、
を備える、方法。 - 前記(c)工程は、前記一つのオーバーラップペプチドについての前記特異的結合を、以下の(1)及び(2)を充足するときに肯定する、請求項10に記載の方法。
(1)前記一つのオーバーラップペプチドにつき、平均被験強度情報が平均対照強度情報よりも高く、t検定を両側検定で行うことより被験試料群と対照試料群で、少なくともp<0.05を充足するとき。
(2)前記一つのオーバーラップペプチドを含む複数の連続するオーバーラップペプチドの平均被験強度情報を平均化した複合被験強度情報が、対照試料についても同様にして得られる複合対照強度情報よりも高く、t検定を両側検定で行うことより被験試料群と対照試料群で、少なくともp<0.05を充足するとき。 - 前記(c)工程における前記臨界値は、前記平均対照強度情報に対して標準偏差(SD)の1又は2の倍数を加算した数値とする、請求項10又は11に記載の方法。
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