EA035480B1 - Антитела, специфические к рецептору инсулиноподобного фактора роста 1 и их применения - Google Patents

Антитела, специфические к рецептору инсулиноподобного фактора роста 1 и их применения Download PDF

Info

Publication number
EA035480B1
EA035480B1 EA201691780A EA201691780A EA035480B1 EA 035480 B1 EA035480 B1 EA 035480B1 EA 201691780 A EA201691780 A EA 201691780A EA 201691780 A EA201691780 A EA 201691780A EA 035480 B1 EA035480 B1 EA 035480B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
fragment
igf1r
vhh
seq
Prior art date
Application number
EA201691780A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201691780A1 (ru
Inventor
Даника Станимирович
Кристин Кеммерич
Арсалан С. Хаккани
Трайан Сули
Меди Арбаби-Гаруди
Бернар Масси
Рено Жильбер
Original Assignee
Нэшнл Рисеч Каунсил Оф Канада
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Нэшнл Рисеч Каунсил Оф Канада filed Critical Нэшнл Рисеч Каунсил Оф Канада
Publication of EA201691780A1 publication Critical patent/EA201691780A1/ru
Publication of EA035480B1 publication Critical patent/EA035480B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0002—General or multifunctional contrast agents, e.g. chelated agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0058—Antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/464—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another
    • C07K16/465—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another with additional modified FR-residues
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2570/00—Omics, e.g. proteomics, glycomics or lipidomics; Methods of analysis focusing on the entire complement of classes of biological molecules or subsets thereof, i.e. focusing on proteomes, glycomes or lipidomes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)

Abstract

Изобретение относится к однодоменному антителу или его антиген-связывающему фрагменту, специфически связывающемуся с рецептором инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1R), содержащему последовательность области, определяющей комплементарность (CDR) 1 GGTVSPTA (SEQ ID NO: 1); последовательность CDR2 ITWSRGTT (SEQ ID NO: 2); и последовательность CDR3 AASTFLRILPEESAYTY (SEQ ID NO: 3). Изобретение также относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей указанное антитело, вектору для экспрессии указанного антитела, композиции для доставки терапевтических и диагностических молекул в фармакологически эффективных дозах в мозг субъекта, содержащей указанное антитело, способам детектирования IGF1R in vitro и детектирования экспрессии IGF1R у субъекта in vivo с помощью заявленного антитела, способу переноса карго-молекулы через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) с помощью заявленного антитела, а также способу количественного определения количества карго-молекулы, доставляемой через ГЭБ субъекта. Изобретение позволяет осуществлять доставку мелких и крупных терапевтических и диагностических молекул в фармакологически эффективных дозах в мозг без нарушения физиологии и гомеостаза ГЭБ.

Description

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к антителам, специфическим к рецептору инсулиноподобного фактора роста 1, их фрагментам, а также их применениям. Более конкретно, настоящее изобретение относится к антителам, специфическим к рецептору инсулиноподобного фактора роста 1 и их фрагментам, которые проходят гематоэнцефалический барьер, и их применениям.
Предшествующий уровень техники
Нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, являются растущим бременем на нашем стареющем обществе, потому что в настоящее время нет эффективных способов лечения этих инвалидизирующих состояний. Лечение, а также ранняя диагностика этих и других заболеваний, которые возникают в головном мозге, остаются сложной задачей, поскольку большинство подходящих терапевтических молекул и диагностик не могут проникнуть через плотный и сильно ограничивающий гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) (Abbott, 2013). ГЭБ представляет собой физический барьер, который образован эндотелиальными клетками головного мозга (ЭКМ), выстилающими кровеносные сосуды и соединяющимися друг с другом посредством плотных контактов (Abbott, 2013). Плотные контакты, образованные между ЭКМ, имеют важное значение для целостности ГЭБ и предотвращения парацеллюлярного переноса молекул размером более 500 дальтон (Да). Поскольку эндотелиальные клетки мозга демонстрируют очень низкий уровень пиноцитоза (Abbott, 2013), трансцеллюлярный перенос больших молекул ограничивается высоко специфическим рецепторно-опосредованным трансцитозом (RMT), и трансцитозом, опосредованным пассивной адсорбцией на основе заряда (Abbott, 2013; Pardridge, 2002). Кроме того, высокая плотность эффлюксных насосов, таких как Р-гликопротеин или белок множественной лекарственной резистентности-1 (MDR-1), способствует удалению нежелательных веществ из головного мозга (Abbott, 2013).
В то время как все эти характеристики защищают мозг от патогенов и токсинов, они в равной степени предотвращают проникновение большинства терапевтических средств. На самом деле, менее 5% малых терапевтических молекул и практически никакие из крупных терапевтических средств могут пересекать ГЭБ в фармакологически значимых концентрациях (то есть достаточных, чтобы поразить мишень в центральной нервной системе (ЦНС) и вызвать фармакологический/терапевтический ответ), если они не являются специфически переносимыми, то есть соединенными с молекулой переносчика. Из-за отсутствия эффективных переносчиков для транспортировки молекул через ГЭБ многочисленные препараты против нейродегенеративных заболеваний были заморожены или исключены из дальнейших разработок, поскольку они не могут быть доставлены в мозг в достаточном количестве.
Различные подходы к введению больших молекул в мозг были исследованы. Например, целостность ГЭБ может быть нарушена, что приводит к негерметичности ГЭБ, что в свою очередь допускает неограниченный парацеллюлярный ввод больших молекул в мозг. Плотные контакты могут быть успешно ослаблены или разрушены различными подходами. Например, инъекция веществ, которые вызывают осмотический шок (например маннит, гипертонические растворы), в кровоток вызывает сжатие и приводит к разрушению плотных контактов, тем самым существенно нарушая ГЭБ (Guillaume, 2010). Другие модуляторы плотных контактов включают алкилглицерины, брадикинин и несколько его аналогов, а также вирусы, которые модулируют экспрессию белков, участвующих в поддержании плотных контактов (Erdlenbruch et al., 2003; Preston et al., 2008; Gan et al., 2013). Более локальное нарушение ГЭБ возможно путем применения ультразвука (Nhan et al., 2013). Тем не менее, временных промежутков, во время которых нарушается ГЭБ, достаточно для изменения гомеостаза мозга, что позволяет вредным химическим веществам, токсинам и патогенным микроорганизмам попадать в мозг; это может привести к серьезным побочным эффектам, например судорогам и отеку мозга, инфекции и, возможно, постоянным нейропатологическим изменениям. Как было бы очевидно специалистам в данной области техники, повторные процедуры с использованием этих способов при хронических и диффузных заболеваниях мозга, влияющих на несколько областей мозга, являются непрактичными. Большинство из этих способов лечения являются дорогостоящими, требуют госпитализации, а также некоторые подходы требуют анестезии.
Другим подходом для обхода ГЭБ является прямой впрыск терапевтических молекул в спинномозговую жидкость (СМЖ), паренхимальное пространство или другие части мозга. Несколько способов доставки были разработаны, в том числе: интрацеребральная (интрапаренхимальная), интравентрикулярная и интратекальная доставка через инфузионный насос или диффузионный насос с усиленной конвекцией (CED). Тем не менее, любой тип прямой инъекции в мозг или нитрацеребрального имплантата является инвазивной и дорогостоящей процедурой, так как она требует госпитализации, анестезии и часто хирургического вмешательства. Кроме того, низкая скорость диффузии терапевтических средств, особенно крупных биологических препаратов, внутри паренхимы мозга ограничивает проникновение терапевтических средств только небольшими участками, окружающими сайт инъекции/имплантации. Правильное размещение инъекций, катетеров и имплантатов является сложной задачей, при этом играя решающее значение для достижения диффузии лекарственного средства в область-мишень мозга. Кроме того, катетеры и имплантаты предоставляют сайт для развития инфекции и/или иммунного ответа против чужеродного материала.
В другой попытке увеличить доставку через ГЭБ лекарства для ЦНС были модифицированы с це- 1 035480 лью увеличения их захвата мозгом. Такие модификации могут включать в себя изменение их поверхностного заряда, уменьшение размера молекулы, а также изменение липофильности лекарственных средств. Тем не менее, любые изменения для увеличения проникновения в мозг также могут изменить общую фармакологию лекарственного средства, в том числе его желаемую активность и/или специфичность. Кроме того, липофильные молекулы более склонны к выведению из мозга через Ргликопротеиновый эффлюксный насос.
Наконец, были разработаны эндогенные механизмы транспорта через ГЭБ. Физиологические механизмы, позволяющие перенос больших молекул через ГЭБ, могут быть разделены на высоко специфический рецепторно-опосредованный трансцитоз (RMT) и неспецифический трансцитоз, опосредованный адсорбцией на основе заряда. Эндоцитоз инициируется при связывании специфического лиганда с его рецептором или при электростатическом взаимодействии между катионным лигандом или лекарственным средством и анионными функциональными группами на поверхности эндотелиальных клеток мозга (на люминальной стороне), соответственно. Впоследствии, вновь сформированные эндосомы подвергаются трансцитозу через клетку к аблюминальной стороне для высвобождения груза.
Поскольку трансцитоз, опосредованный адсорбцией, является неспецифическим зарядоопосредованным взаимодействием, он происходит во всех сосудистых руслах и органах, что ограничивает доступность лекарственного средства для доставки в мозг. Поэтому использование RMT пути остается единственным физиологическим, неинвазивным, при этом высоко рецепторно-специфическим способом доставки в мозг.
В настоящее время известны лишь немногие рецепторы, которые подвергаются RMT в ГЭБ и переносят через него свои природные лиганды: хорошо изученный рецептор трансферрина (TFR), инсулиновый рецептор (IR), белки 1 и 2, связанные с рецепторами липопротеинов низкой плотности (LRP-1 и 2), рецептор дифтерийного токсина и ТМЕМ30А. Были разработаны пептиды, природные лиганды и антитела или фрагменты антител, которые связываются с этими рецепторами (Pardridge et al., 1991; Yu et al., 2011; Muruganandam et al., 2001; Abulrob et al., 2005; Demeule, 2008; Sumbria et al., 2013), функционирующими в качестве переносчиков лекарственных средств в мозг, которые используют эндогенные RMT пути. Тем не менее, на сегодняшний день только один пептид (Angiopep ANG1005, таргетирующий LRP1) был проанализирован на фазе I клинических исследований, в то время как другие кандидаты изучаются в лабораторных условиях. RMT путь представляется наиболее перспективным путем для транспорта лекарственного средства в мозг, но в настоящее время подходы имеют ограничения, включая: неселективную экспрессию рецептора-мишени на ГЭБ, конкуренции между переносчиком и природными лигандами за рецептор, неэффективный трансцитоз рецептора, а также лизосомальную деградацию эндоцитозированных переносчиков (Xiao and Gun, 2013).
Отсутствие высокой производительности и высокой селективности переносчиков через ГЭБ задерживает разработку новых терапевтических и диагностических средств для заболеваний, происходящих в мозге, в том числе опухолей мозга и нейродегенеративных заболеваний. Существует явная необходимость в неинвазивном способе доставки мелких и крупных терапевтических и диагностических молекул в фармакологически эффективных дозах в мозг без нарушения физиологии и гомеостаза ГЭБ.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к антителам, специфическим к рецептору инсулиноподобного фактора роста 1 (IGFIR), и их применениям. Более конкретно, настоящее изобретение относится к антителам, специфическим к рецептору инсулиноподобного фактора роста 1, и их фрагментам, которые проходят гематоэнцефалический барьер, и их применениям.
Настоящее изобретение относится к выделенным или очищенным антителам или их фрагментам, специфически связывающимся с эпитопом рецептора инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1R), где антитело или его фрагмент проходит гематоэнцефалический барьер и где эпитоп специфически связывается с антителом с последовательностью SEQ ID NO: 5. Эпитоп IGF1R может находиться во внеклеточном домене IGF1R.
Настоящее изобретение относится к выделенным или очищенным антителам или их фрагментам, содержащим последовательность области, определяющей комплементарность (CDR) 1 GGTVSPTA(SEQ ID NO: 1);
последовательность CDR2 ITWSRGTT (SEQ ID NO: 2) и последовательность CDR3 AASTFLRILPEESAYTY (SEQ ID NO: 3), где указанное антитело или его фрагмент специфически связывается с рецептором инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1R).
Например, не в рамках какого-либо ограничения, выделенным или очищенным антителом или его фрагментом, специфическим к IGF1R, может являться
JXiVX2LX3ESGGGLVQX4GGSLRLSCX5X6SGGTVSPTAMGWX7RQAPGKX8X9EX1oVX11
HITWSRGTTRX12ASSVKX13RFTISRDX14X15KNTX16YLQMNSLX17X18EDTAVYYCAAS
TFLRILPEESAYTYWGQGTX19VTVSS (SEQ ID NO:4),
- 2 035480 где X1 представляет собой Е или Q; Х2 представляет собой K или Q; Х3 представляет собой V или Е; Х4 представляет собой А или Р; X5 представляет собой А или Е; Х6 представляет собой V или А; Х7 представляет собой V или F; X8 представляет собой G или Е; Х9 представляет собой L или R; Х10 представляет собой F или W; Х11 представляет собой G или S; Х12 представляет собой V или Y; Х13 представляет собой D или G; Х14 представляет собой N или S; X15 представляют собой А или S; X16 представляют собой L или V; Х17 представляют собой K или R; X18 представляют собой А или S; и X19 представляют собой L или Q, или последовательность, по существу идентичная ей.
В более конкретных неограничивающих примерах выделенные или очищенные антитела могут содержать последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCEVSGGTVSPTAMGWFRQAPGKEREFVGHITWSR
GTTRVASSVKDRFTISRDSAKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCAASTFLRILPEESAYTY
WGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:5), упоминается здесь как IGF1R-4;
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGGTVSPTAMGWVRQAPGKGLEWVGHITWSR
GTTRYASSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAASTFLRILPEESAYTYW
GQGTLVTVSS (SEQ ID NO:6), упоминается здесь как IGF1R-4_H2;
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGGTVSPTAMGWFRQAPGKGLEFVGHITWSRG
TTRYASSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAASTFLRILPEESAYTYWG
QGTLVTVSS (SEQ ID NO:7), упоминается здесь как IGF1R-4_H3;
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGGTVSPTAMGWFRQAPGKGLEFVGHITWSRG
TTRYASSVKGRFTISRDSSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAASTFLRILPEESAYTYWG
QGTLVTVSS (SEQ ID NO:8), у упоминается здесь как IGF1R-4_H4;
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGGTVSPTAMGWFRQAPGKEREFVGHITWSR
GTTRYASSVKGRFTISRDSSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAASTFLRILPEESAYTY
WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:9), упоминается здесь как IGF1R-4_H5; и или последовательность, по существу идентичную им.
Выделенное или очищенное антитело или его фрагмент, как описано выше, может быть однодоменным антителом (sdAb); sdAb могут иметь верблюжье происхождение.
Выделенное или очищенное антитело или его фрагмент в рамках настоящего изобретения могут быть представлены в формате мультивалентного отображения.
В формате мультивалентного отображения антитело или его фрагмент могут быть связаны с Fcфрагментом; Fc-фрагмент является мышиным Fc2b или человеческим Fc1. Например, не в рамках какого-либо ограничения, выделенное или очищенное антитело или его фрагмент в мультивалентном отображении могут содержать последовательность SEQ ID NO: 10 (упоминаемую здесь как слияние IGF1R4 консенсус-Fc), SEQ ID NO: 39 (упоминаемую здесь как слияние Fc-IGF1R-4 консенсус) или 11 (упоминаемую здесь как слияние IGF1R-4-Fc).
Выделенное или очищенное антитело или его фрагмент, как описано в данном документе, могут проходить через гематоэнцефалический барьер.
Настоящее изобретение также относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей выделенное или очищенное антитело или его фрагмент, как описано в настоящем документе. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, как описано выше, также предложен.
Выделенное или очищенное антитело или его фрагмент, как описано в настоящем документе, могут быть иммобилизованы на поверхность.
Настоящее изобретение дополнительно относится к выделенному или очищенному антителу или его фрагменту, как описано в данном документе, связанному с карго-молекулой; карго-молекула может иметь молекулярную массу в диапазоне от около 1 кДа до около 200 кДа. Карго-молекулой, связанной с антителом или его фрагментом, может быть детектируемый агент, терапевтическое, лекарственное средство, пептид, фактор роста, цитокин, ловушка рецептора, химическое соединение, углеводный фрагмент, фермент, антитело или его фрагменты, молекулы на основе ДНК, вирусный вектор или цитотоксический агент; одна или несколько липосом или наноносителей, загруженных детектируемым агентом, терапевтическим, лекарственным средством, пептидом, ферментом, антителом или его фрагментом, молекулой на основе ДНК, вирусным вектором или цитотоксическим агентом; или одна или несколько наночастиц, нанопроводов, нанотрубок или квантовых точек.
Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей одно или более чем одно выделенное или очищенное антитело или его фрагмент, как описано в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.
Также предложен способ детектирования IGF1R in vitro, причем способ включает:
a) контактирование образца ткани с одним или более чем одним выделенным или очищенным анти- 3 035480 телом или его фрагментом, как описано в данном документе, связанным с детектируемым агентом; и
b) детектирование детектируемого агента, связанного с антителом или его фрагментом, связанным с
IGF1R, в образце ткани.
В способе, описанном выше, образцом может быть образец сыворотки, образец сосудистой ткани, образец опухолевой ткани или образец ткани мозга из человеческого или животного субъекта. В способе, описанном выше, стадия детектирования (стадия b)) может быть осуществлена с помощью оптической визуализации, иммуногистохимии, молекулярной диагностической визуализацией, ELISA (иммуноферментного анализа), визуализирующей масс-спектрометрии или другого подходящего способа.
Далее приведен способ детектирования экспрессии IGF1R in vivo у субъекта, причем указанный способ включает:
a) введение одного или более чем одного выделенного или очищенного антитела или его фрагмента, как описано в данном документе, связанного с детектируемым агентом, субъекту; и
b) детектирование детектируемого агента, связанного с антителом или его фрагментом, связанным с IGF1R.
В способе, описанном выше, стадия детектирования (стадия b)) может быть осуществлена с использованием PET (позитронно-эмиссионной томографии), SPECT (однофотонной эмиссионной компьютерной томографии), флуоресцентной визуализации или любого другого подходящего способа.
Предложен способ переноса представляющей интерес молекулы через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), причем способ включает:
а) введение одного или более одного выделенного или очищенного антитела или его фрагмента, как описано в данном документе, связанного с представляющей интерес молекулой, субъекту, где антитело или его фрагмент проходит через гематоэнцефалический барьер, где одно или более чем одно антитело или его фрагмент переносит представляющую интерес молекулу через ГЭБ. В способе, как описано выше, представляющая интерес молекула может иметь молекулярную массу в диапазоне от приблизительно 1 кДа до приблизительно 200 кДа; представляющей интерес молекулой может быть детектируемый агент, терапевтическое, лекарственное средство, пептид, фактор роста, цитокин, ловушка рецептора, химическое соединение, углеводный фрагмент, фермент, антитело или его фрагмент, молекула на основе ДНК, вирусный вектор или цитотоксический агент; одна или несколько липосом или наноносителей, загруженных детектируемым агентом, терапевтическим, лекарственным средством, пептидом, ферментом, антителом или его фрагментом, или цитотоксическим агентом; или одна или несколько наночастиц, нанопроводов, нанотрубок или квантовых точек. В описанном способе введение может быть внутривенным (iv), подкожным (sc) или внутримышечным (im).
Изобретение также охватывает способ определения количества карго-молекулы, доставляемой через ГЭБ субъекта, где карго-молекула связана с одним или более чем одним выделенным или очищенным антителом или его фрагментом, как описано в данном документе, причем способ включает:
a) сбор спинномозговой жидкости (СМЖ) от субъекта;
b) использование целевых методов протеомики для определения количества карго-молекулы, связанной с одним или более чем одним выделенным или очищенным антителом или фрагментом, в СМЖ.
Карго-молекула может быть любой желаемой молекулой, включая карго-молекулы, описанные выше; антитело или его фрагмент проходят через ГЭБ; молекула может быть связана с антителом или его фрагментом, как описано ранее. В описанном выше способе СМЖ берут у субъекта с использованием любого подходящего способа, известного в данной области. Количество СМЖ, необходимое для целевого метода протеомики на стадии b), может находиться в диапазоне от приблизительно 1 до 10 мкл. Целевые методы протеомики, используемые для определения количества одного или более чем одного антитела или его фрагмента, связанного с карго-молекулой, могут быть любыми подходящими методами, известным в данной области техники. Например, не в рамках каких-либо ограничений, целевой метод протеомики может быть методом масс-спектрометрии, таким как мониторинг множественных реакций изотипически меченые внутренние стандарты (MRM - ILIS).
Плохая доставка диагностических или лекарственных средств через плотный и высокоселективный ГЭБ компрометирует развитие способов лечения заболеваний мозга, таких как, но не ограничиваясь указанным, опухолей мозга и нейродегенеративных заболеваний. Отсутствие переносчиков для транспортировки молекул через ГЭБ задерживает разработку новых терапевтических и диагностических средств для таких заболеваний. Как описано в данном документе, был спродуцирован IGF1R-связывающий VHH (вариабельный домен тяжелой цепи верблюдовых), который обеспечивает эффективную транспортную платформу для доставки лекарственных средств, конъюгированных с антителом, через ГЭБ до их мишеней в мозге. Описанное в данном документе антитело использует естественный RMT путь IGF1R от люминальной к аблюминальной стороне эндотелиальных клеток мозга, образующих ГЭБ. После связывания антитела с IGF1R инициируется RMT и антитело вместе с конъюгированными молекулами (грузом) подвергается трансцитозу через клетку к аблюминальной стороне, где они оба выпускаются в микросреду мозга. Подтверждено, что анти-IGF1R VHH связывается с IGF1R (фиг. 3С), поглощается клетками ГЭБ (фиг. 4) и переходит на аблюминальную сторону в модели ГЭБ in vitro (фиг. 6В). Исследования доставки лекарственного средства к мозгу in vivo показали также, что IGF1R VHH переносил конъюгированный
- 4 035480 пептид (Галанин, около 3 кДа), а также большой слитый белок (около 80 кДа) через ГЭБ (фиг. 9А и В;
фиг. 9С).
Результаты также показывают, что анти-IGF1R VHH может экспрессироваться в слиянии с Fcфрагментом (кристаллизуемый фрагмент), чтобы пролонгировать циркуляционный период полувыведения примерно в 75 раза (около 25 ч по сравнению с примерно 20 мин для VHH В отдельности). Этот слитый конструкт с высокой молекулярной массой (около 80 кДа) также эффективно может транспортироваться через ГЭБ. Длительный период полувыведения из плазмы значительно увеличивает СМЖ воздействие конъюгата IGF1R VHH-mFc (mFc = мышиный Fc) по сравнению только с VHH и делает его полезным в качестве переносчика через ГЭБ для лечения хронических заболеваний с мишенями в ЦНС. Конъюгат легко обнаруживается в паренхиме мозга с использованием иммуно-флюоресцентного детектирования. Результаты показывают, что переносчик IGF1R VHH может переносить большие молекулы (аналогичные по размеру антителам, ферментам, факторам роста, пептидам, цитокинам, ловушкам рецепторов) через ГЭБ.
Таким образом, антитело-опосредованная доставка может быть не только полезной для краткосрочного лечения (например, эпилептического припадка), но также может быть полезна для среднесрочного (например, рака) и долгосрочного (например, болезни Альцгеймера или болезни Паркинсона) лечения.
Дополнительные аспекты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны в свете следующего описания. Подробные описания и примеры, демонстрирующие предпочтительные варианты осуществления изобретения, даются только в качестве иллюстрации, поскольку различные изменения и модификации в пределах объема настоящего изобретения станут очевидными для специалистов в данной области техники в свете идей настоящего изобретения.
Краткое описание фигур
Эти и другие признаки настоящего изобретения будут теперь описаны посредством примера, со ссылкой на прилагаемые чертежи, на которых:
на фиг. 1 представлена схема рецептора инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1R). IGF1R находится на поверхности клетки и содержит две субъединицы: альфа-субъединицу и бета-субъединицу. Альфа-субъединица (содержащая внеклеточную часть с сайтом связывания с инсулиноподобным фактором роста 1) связана дисульфидной связью с бета-субъединицей (содержащей небольшой внеклеточный домен, трансмембранный участок и внутриклеточную часть). Рецептор IGF1 может образовывать димер. Фрагмент длинной в 933 аминокислоты, содержащий альфа-субъединицу и внеклеточную часть бетасубъединицы, как указано в сером поле (М1 - F933, инвентарный № SwissProt Р08069, см фиг. 2), был рекомбинантно продуцирован и использован для иммунизации ламы;
на фиг. 2 показана последовательность IGF1R (инвентарный № SwissProt P08069). Белковый фрагмент длиной в 933 аминокислоту, используемый для иммунизации и пэннинга, показан жирным шрифтом; полный эктодомен на 2 аминокислоты длиннее. Сайт расщепления фурином, разделяющий альфа и бета субъединицы, показан строчными буквами курсивом. Сигнальный пептид выделен жирным курсивом;
на фиг. 3А показана эксклюзионная хроматограмма IGFrR-связывающего VHH IGF1R-4 и его гуманизированных вариантов (Н1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6), пропущенных через колонку с Superdex 75. Профиль предполагает, что все VHH кроме IGF1R Н1 мономерны и не агрегированы. Фиг. 3В показывает температуру плавления (Tm), определенную с помощью кругового дихроизма (CD) для IGF1R-4 VHH и его гуманизированных вариантов (Н2, Н3, Н4, Н5, Н6). Белки нагревали до температуры выше 90°С и измерения проводили в CD устройстве, чтобы определить кривую плавления (верхняя кривая) и Tm. Впоследствии белки охлаждали до комнатной температуры, нагревали еще раз и анализировали с помощью CD (нижняя кривая для IGF1R-4 VHH; линия или точки около 0% рефолдинга для гуманизированных вариантов). Это позволило определить долю рефолдинга белка, которая составляла ноль для гуманизированных версий и 80% для IGF1R-4. Фиг. 3С показывает перекрывание сенсограммы поверхностного плазмонного резонанса (SPR) для связывания 0,1-5 нМ IGF1R-4 VHH и его гуманизированных вариантов (Н2, Н3, Н4, Н5, Н6) с рекомбинантной внеклеточной частью фрагмента человеческого IGF1R. Эти данные хорошо подходят к модели 1:1. Фиг. 3D показывает сенсограммы SPR связывания IGF1R-4 VHH с рекомбинантной внеклеточной частью фрагмента человеческого IGF1R в присутствии IGF1. IGF1 в 100-кратном избытке не влияет на связывание IGF1R- 4 VHH, что демонстрирует, что они оба связываются с различными эпитопами на рецепторе. Фиг. 3Е показывает, что IGF1R-4 VHH не связывается с рекомбинантной внеклеточной частью человеческого инсулинового рецептора (IR), иммобилизованного на SPR поверхности, в то время как он связывается с контрольной поверхностью человеческого IGF1R;
на фиг. 4 показаны результаты визуализации захвата клеток Су-5.5-меченного IGF1R-4 VHH и контрольного VHH. Су5.5-меченный IGF1R-4 VHH (или FC5 VHH в качестве положительного контроля, Muruganandam et al., 2002; Haqqani et al., 2012) инкубировали с SV40 иммортализованными крысиными эндотелиальными клетками мозга (svARBEC) при температуре 4°С (верхние блоки) или при 37°С (нижние блоки) для оценки того, поглощается ли IGF1R-4 пассивно (4°С) или с помощью активных механизмов (37°С), таких, как рецепторно-опосредованный эндоцитоз. Совместное окрашивание агглютинином за- 5 035480 родышей пшеницы и DAPI (4',6-диамидин-2-фенилиндол) проводили для визуализации поверхности клетки и ядра, соответственно. Верхний блок: при инкубировании при 4°С IGF1R-4 и FC5 VHH были обнаружены вне клеток (стрелки), связанные с клеточной мембраной (солокализуются с агглютинином зародышей пшеницы). Нижний блок: при 37°С и FC5 и IGF1R-4 VHH накапливались внутри клеток в структурах, подобных везикулам (стрелки), вероятно эндосомах, что предполагает поглощение посредством механизма активного транспорта;
на фиг. 5А показана последовательность С-концвого слияния IGF1R-4 VHH С мышиным Fcфрагментом (IGF1R-4-mFc). Схематическое изображение собранного слитого белка показано на фиг. 5В. IGF1R-4 VHH показан черным цветом и мышиный Fc (CH2 и СН3) показан серым цветом на фиг. 5А и В;
на фиг. 6А показана блок-схема, обобщающая использование модели ГЭБ in vitro для оценки способности различных VHH преодолевать гематоэнцефалический барьер. Эквимолярные количества (5,6 мкМ или 1,25 мкМ) положительного (FC5) и отрицательного контроля (А20.1, с Clostridium difficile токсин А-связывающий VHH; и EG2, EGFR (рецептор эпидермального фактора роста) - связывающий VHH) VHH и IGF1R-3 тестировали одновременно на их способность пересекать крысиную модель ГЭБ. SV40иммортализованные эндотелиальные клетки мозга взрослой крысы (svARBEC) выращивали в монослое на мембране вставки в присутствии крысиной астроцитарно-кондиционированной среды в нижней камере и стандартной среды в верхней камере. После совместного добавления эквимолярных количеств различных VHH на люминальную сторону модели ГЭБ, образцы были взяты из нижней камеры через 15, 30 и 60 мин. Концентрации каждого VHH затем количественно измерялись с помощью масс-спектрометрии (мониторинг множественных реакций - изотипически меченные внутренние стандарты; MRM-ILIS) в этих образцах. Значение Рарр [Qr/ DT = общее количество в приемном отделении в зависимости от времени; А = площадь монослоя клеток; С0 = начальная концентрация дозированного раствора] обычно используется для определения способности молекулы к пересечению гематоэнцефалического барьера; на фиг. 6В приведены значения Рарр из четырех совместно введенных VHH. IGF1R-4 имеет значительно большее значение Рарр, чем FC5, в то время как отрицательные контроли имеют очень низкие значения Рарр, что указывает на облегченный перенос FC5 и IGF1R-4 VHH по сравнению с очень низким неспецифическим транспортом или парацеллюлярным транспортом контрольных VHH. Результаты представляют собой средние значения Рарр, полученные в 5-6 независимых экспериментах. Фиг. 6С показывает значения Рарр гуманизированных IGF1R-4 однодоменных антител (Н2, Н3, Н4, Н5, Н6) (черные столбики) по сравнению с А20.1 VHH (серые столбики), которые были протестированы в качестве контроля в той же лунке (среднее значение А20.1 обозначается серой пунктирной линией). Результат четко показывает, что простого связывания IGF1R (как это наблюдается для гуманизированного варианта 6 (Н6)) не достаточно для запуска прохождения через ГЭБ. Фиг. 6D показывает значения Рарр С-терминального слияния IGF1R4 VHH с мышиным Fc (черный) по сравнению с А20.1 - мышиный Fc (A20.1mFc) (серый), которое было протестировано в той же лунке и имело очень низкое значение Рарр. IGF1R-4-mFc имеет существенно более высокое значение Рарр, чем FC5-mFc (обычно около 180 см/мин, как показано серой пунктирной линией). Другой IGF1R-связывающий VHH, IGF1R-1 в слиянии с Fc имеет лишь незначительно более высокое значение Рарр, чем внутренний отрицательный контроль А20.1 VHH. Этот результат также демонстрирует, что не все IGF1R-связывающие антитела проходят через ГЭБ. Данные далее показывают, что IGF1R-4-mFc имеет аналогичную высокую скорость транспорта через ГЭБ по сравнению с моновалентным IGF1R-4 VHH. Результаты представляют собой средние значения Рарр, полученные в 3-6 независимых экспериментах. Средние значения Рарр FC5 (VHH) и А20.1 (VHH) также обозначены пунктирными линиями для сравнения;
фиг. 7 (верхние блоки) показывает изображения всего тела in vivo CD-1 мышей, которым вводили внутривенно PBS (натрий-фосфатный буфер) (интактная) или 2,5 мг/кг Cy5.5-IGF1R-4 VHH или Су5.5А20.1 VHH (схематически введенные молекулы показаны сверху) и сканировали на пространственновременном оптическом визуализаторе explore Optix через 30 мин после инъекции. Нижние блоки показывают ex-vivo изображения мозга тех же животных, полученные через 1 ч после инъекции VHH и после транскардиальной перфузии для удаления антител из крови. Стрелки указывают на высокий оптический сигнал (светлосерый) флуоресцентного индикатора в голове и в ex-vivo головном мозге у животного, которому вводили Cy5.5-IGF1R-4, тогда как у животного, которому вводили контроль Су5.5-А20.1 (черный) он не может быть обнаружен.
На фиг. 8А показана схема химического синтеза конъюгата IGF1R-4 VHH-Галанин. IGF1R-4 сначала конъюгировали с группой NHS сульфо-SMCC (сульфосукцинимидил-4(№малеимидометил)циклогексан1-карбоксилат) кросс-линкера (1); затем малеимид-активированный IGF1R-4-cульфо-SMCC конъюгировали с восстановленным цистеином Галанина (2). На фиг. 8В показан IGF1R-4 (дорожка 2), IGF1R-4SMCC (дорожка 3) и конъюгат IGF1R-4-Галанин (дорожка 4) в SDS-PAGE геле (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия). Характер полос указывает на присоединение 1-2 молекул Галанина на IGF1R-4. Такие же способы конъюгирования были использованы для связывания Галанина с IGF1R-mFc.
На фиг. 9 показана IGF1R-5-опосредованная доставка в мозг химически конъюгированного пептида
- 6 035480
Галанина. На фиг. 9А представлен график, демонстрирующий способность IGF1R-4 доставлять фармакологически эффективные дозы анальгетического пептида Галанина (3,2 кДа) в мозг с использованием болевой модели Харгривса. В этой модели локализованную хроническую боль индуцируют у самцов крыс линии Wistar (4-6 недельного возраста) путем введения 100 мкл полного адъюванта Фройнда (CFA) в поверхность левой стопы, вызывая тем самым в течение нескольких часов местное воспаление. После инъекции в хвостовую вену ГЭБ-переносчика конъюгата VHH-лекарственное средство или только Галанина, крыс помещают в плексигласовые шкафы, установленные на поверхности стекла. Тепловой раздражитель ориентирован на воспаленную или контралатеральную лапу с помощью углового зеркала. Задержка между применением раздражителя и реакцией лапы (облизывание или взмах лапой) интерпретируется как мера анальгетического эффекта (ингибирование тепловой гиперальгезии). Пептид Галанин сам по себе не может проникать через ГЭБ, о чем свидетельствует отсутствие анальгетического эффекта после системной (в хвостовую вену) инъекции 1 мг/кг Галанина (сплошные черные треугольники). Системное введение конъюгата IGF1R-4-Гαланин (3 мг/кг) ингибирует тепловую гиперальгезию, достигая максимального эффекта через 30 мин после введения (сплошные черные круги); эффект был более продолжительным, чем эффект, наблюдаемый после введения 6 мг/кг конъюгата FCS-Галанин (белые открытые квадраты). Фиг. 9В показывает эти результаты в виде площади под кривой (AUC) ответа по сравнению с максимально возможным эффектом (МРЕ, контрольная лапа). На фиг. 9С показано дозозависимое (2 мг/кг и 5 мг/кг) ингибирование тепловой гиперальгезии в модели Харгривса воспалительной боли с помощью конъюгата IGF1R-4-mPc-Галанин, введенного iv. Напротив, А20.1-mPc-Галанин (5 мг/кг) не вызывал какого-либо ингибирования тепловой гиперальгезии. На фиг. 9D показан процент ингибирования тепловой гиперальгезии (Emax) на пике ответа, достигнутого различными дозами А20.1mPc-Галанина и IGF1R-4-mFc-Галαнина.
На фиг. 10 показаны уровни IGF1R-4-mFc в плазме и СМЖ и положительный контроль VHH, FC5 и отрицательный контроль VHH A 20.1 через 30 мин после системного (в хвостовую вену) совместного введении 6 мг/кг каждого антитела. СМЖ собирали из мостомозжечковой цистерны. Уровни IGF1R-4, FC5 и А 20.1 в плазме и СМЖ определяли с помощью метода MRM-ILIS, который отслеживает и количественно определяет специфические белковые пептидные сигнатуры. Уровни альбумина в СМЖ были одновременно определены MRM. Все образцы СМЖ, имеющие соотношение плазмы/СМЖ ниже 1500, были исключены как потенциально загрязненные кровью. Соотношение плазмы/СМЖ составляло 1,2% для IGF1R-4 по сравнению с 0,9% для FC5 и 0,017% для А 20.1.
На фиг. 11 показано иммунодетектирование IGF1R-4mFc в секциях мозга через 24 ч после введения в хвостовую вену дозы 6 мг/кг. Перфузии с PBS проводили на крысах и секции мозга (12 мкм) были получены с использованием вибратома. IGF1R-4mFc был иммунодетектирован с использованием антимышиного Fc антитела (красный, красный канал показан только на вставках). Кровеносные сосуды в секции мозга (дорсальный стриатум, А, лобная кора головного мозга, В) были детектированы с использованием лектина RCA1 (агглютинин Ricinus Communis 1) (зеленый). IGF1R-4mFc может быть детектирован как в обоих сосудах, так и вне сосудов (т.е. в паренхиме головного мозга, перенесенный через ГЭБ), как показано стрелками.
На фиг. 12 показано, что IGF1R-4 не пересекается с инсулиновой или IGF1 передачей сигнала через инсулиновый рецептор или IGF1R. Фиг. 12А представляет собой характерную картину Вестерн блоттинга, демонстрирующую, что ни IGF1R-4, ни какой-либо из других протестированных анти-IGF1R VHH (IGF1R-1, -3, -5 или -6) не индуцирует фосфорилирование протеинкиназы В в прямом направлении по отдельности при 100 нМ концентрации. Также присутствие 100 нМ IGF1R-4 или любого из других антиIGF1R VHH не ингибирует фосфорилирование протеинкиназы В, индуцированное 10 мкг/мл инсулина. Количественное определение плотностей полос Вестерн блоттинга из 3 независимых экспериментов показано на гистограмме (среднее +/- SD (стандартное отклонение)) под изображением геля. На фиг. 12В представлена характерная картина Вестерн блоттинга, показывающая, что ни IGF1R-4, ни любые другие протестированные анти-IGF1R VHH (IGF1R -3, -5 или -6) при 100 нМ не индуцируют фосфорилирование протеинкиназы В сами по себе и не ингибируют IGF-1 индуцированное фосфорилирование протеинкиназы В (т.е. передачу сигнала), вызванное стимуляцией 200 нг/мл IGF-1. Количественное определение плотностей полос Вестерн блоттинга из 3 независимых экспериментов показано на гистограмме (среднее +/- SD) под изображением геля. Фиг. 12С показывает Вестерн блоттинги фосфорилированных IGF1R. Клетки инкубировали либо с 100 нМ или 500 нМ IGF1R-4-mFc, либо любым другим анти-IGFIR VHHmFc слиянием (IGF1R-1, -3 или -4 mFc) по отдельности или стимулировали 200 нг/мл IGF-1 в присутствии соответствующих слитых белков IGF1R-VHH-mFc. Вестерн блоттинги показывают, что ни один из слитых конструктов не ингибировал IGF-1 индуцированное фосфорилирование IGF1R и не индуцировал фосфорилирование рецептора сам по себе.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к антителам, специфическим к рецептору инсулиноподобного фактора роста 1, их фрагментам, а также их применениям. Более конкретно, настоящее изобретение относится к антителам, специфическим к рецептору инсулиноподобного фактора роста 1 и их фрагментам, которые проходят гематоэнцефалический барьер, и их применениям.
- 7 035480
Настоящее изобретение относится к выделенным или очищенным антителам или их фрагментам, специфически связывающимся с эпитопом рецептора инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1R), причем антитело или его фрагмент переносится через гематоэнцефалический барьер, и эпитоп специфически связывается с антителом с последовательностью SEQ ID NO:5. Эпитоп IGF1R может находиться во внеклеточном домене IGF1R.
Настоящее изобретение относится к выделенным или очищенным антителам или их фрагментам, содержащим последовательность области, определяющей комплементарность (CDR) 1 GGTVSPTA(SEQ ID NO: 1);
последовательность CDR2 ITWSRGTT (SEQ ID NO: 2); и последовательность CDR3 AASTFLRILPEESAYTY (SEQ ID NO: 3), где антитело или его фрагмент специфически связывается с рецептором инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1R).
Термин антитело, также называемый в данной области иммуноглобулин (Ig), используемый в данном документе, относится к белку, построенному из спаренных тяжелых и легких полипептидных цепей; существуют различные изотипы Ig, включая IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Когда антитело сложено правильно, каждая цепь укладывается в некоторое число отдельных глобулярных доменов, соединенных более линейными полипептидными последовательностями. Например, легкая цепь иммуноглобулина укладывается в вариабельный (VL) и константный (CL) домен, в то время как тяжелая цепь укладывается в вариабельный (VH) и три константных (CH, CH2, CH3) домена. Взаимодействие вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи (VH и VL) приводит к образованию области связывания антигена (Fv). Каждый домен имеет устоявшуюся структуру, знакомую специалистам в данной области техники.
Вариабельные области легкой и тяжелой цепи отвечают за связывание антигена-мишени и, следовательно, могут демонстрировать значительное разнообразие последовательностей у разных антител. Константные области демонстрируют меньшее разнообразие последовательностей и отвечают за связывание ряда природных белков для выявления важных биохимических событий. Вариабельная область антитела содержит антиген-связывающие детерминанты молекулы и, таким образом, определяет специфичность антитела к его антигену-мишени. Большая часть различий последовательностей связана с шестью гипервариабельными областями, по три в вариабельных областях тяжелой (VH) и легкой (VL) цепи; гипервариабельные области объединяются для формирования антиген-связывающего сайта и вносят свой вклад в связывание и узнавание антигенной детерминанты. Специфичность и аффинность антитела к его антигену определяется структурой гипервариабельных областей, а также их размером, формой и химией поверхности, которую они представляют антигену. Существуют различные схемы для идентификации областей гипервариабельности, двумя наиболее распространенными из которых являются указанные у Kabat и Chothia and Lesk. Kabat et al (1991) определяют области, определяющие комплементарность (CDR) на основе вариабельности последовательности в антиген-связывающих областях доменов VH и VL. Chothia и Lesk (1987) определяют гипервариабельные петли (Н или L) на основе расположения областей структурной петли в доменах VH и VL. Поскольку эти индивидуальные схемы определяют CDR и области гипервариабельной петли, которые являются смежными или перекрывающимися, специалисты в данной области техники, касающейся антител, часто используют термины CDR и гипервариабельная петля взаимозаменяемо, и они могут быть так использованы в данном документе. CDR/петли называются здесь в соответствии с более поздней системой нумерации IMGT (Lefranc, M.-P. et al., 2003), которая была разработана для упрощения сравнения вариабельных доменов. В этой системе консервативные аминокислоты (такие как Cys23, Trp41, Cys104, Phe/Trp118 и гидрофобный остаток в позиции 89) всегда имеют ту же позицию. Кроме того, обеспечивается стандартизированное разграничение каркасных областей (FR1: позиции от 1 до 26; FR2: от 39 до 55; FR3: от 66 до 104; и FR4: 118 до 129) и CDR (CDR1: 27 до 38, CDR2: 56 до 65; и CDR3: от 105 до 117).
Фрагмент антитела, упоминаемый здесь, может включать в себя любой подходящий антигенсвязывающий фрагмент антитела, известный в данной области. Фрагмент антитела может быть фрагментом природного антитела или может быть получен путем обработки природных антител или с помощью рекомбинантных способов. Например, фрагмент антитела может включать в себя, но не ограничивается указанным, Fv, одноцепочечный Fv (ScFv, молекула, состоящая из VH и VL, связанных пептидным линкером), Fab, F(ab')2, однодоменное антитело (sdAb; фрагмент, состоящий из одного VH или VL) и мультивалентные презентации любого из них. Фрагменты антител, такие как только что описанные, могут потребовать линкерных последовательностей, дисульфидных связей или другой тип ковалентной связи для связывания различных частей фрагментов; специалисты в данной области техники знакомы с требованиями различных типов фрагментов и различными подходами к их построению.
В неограничивающем примере фрагмент антитела может быть sdAb, полученным из природных источников. Тяжелые цепи антител верблюжьего происхождения (Hamers-Casterman et al, 1993) не имеют легких цепей и, следовательно, их антиген-связывающие сайты состоят из одного домена, называемого VHH. sdAb также наблюдается у акул и называется VNAR (Nuttall et al, 2003). Другое sdAb может быть сконструировано на основе тяжелой и легкой цепи человеческого Ig (Jespers et al, 2004; To et al, 2005).
- 8 035480
Используемый в данном описании термин sdAb включает sdAb, непосредственно выделенные из источника VH, VHH, VL, или Vnar любого происхождения посредством фагового отображения или других технологий, sdAb, полученные из вышеупомянутых sdAb, рекомбинантные sdAb, a также sdAb, генерируемые посредством дальнейшей модификации таких sdAb гуманизацией, созреванием аффинности, стабилизацией, солюбилизацией, верблюдизацией или другими способами инженерии антител. Также охватываются настоящим изобретением гомологи, производные или фрагменты, которые сохраняют антигенсвязывающую функцию и специфичность sdAb.
SdAb обладают требуемыми свойствами для молекул антител, такими как высокая термостабильность, высокая устойчивость к детергентам, относительно высокая устойчивость к протеазам (Dumoulin et al, 2002) и высокий выход (Arbabi-Ghahroudi et al, 1997); также могут быть созданы высоко аффинные sdAb выделением из иммунной библиотеки (Li et al, 2009) или путем созревания аффинности in vitro (Davies & Riechmann, 1996). Дальнейшие модификации для повышения стабильности, такие как введение неканонических дисульфидных связей (Hussack et al, 2011; Kim et al, 2012), также могут быть применены к sdAb.
Специалист в данной области техники должен быть хорошо знаком со структурой однодоменного антитела (см, например, 3DWT, 2Р42 в Protein Data Bank). SdAb содержит один домен иммуноглобулина, который сохраняет характерную для иммуноглобулина укладку цепи; в первую очередь, три CDR/гипервариабельные петли образуют антиген-связывающий сайт. Тем не менее, и, как должно быть понятно специалистам в данной области техники, не все CDR могут потребоваться для связывания антигена. Например, и не ограничиваясь этим, одна, две, или три CDR могут внести свой вклад в связывание и распознавание антигена с помощью sdAb согласно настоящему изобретению. CDR из sdAb или вариабельного домена упоминаются здесь как CDR1, CDR2 и CDR3 и пронумерованы, как это определено у Lefranc, M.-P. et al. (2003).
Антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению является специфическим к рецептору инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1R), находящемуся на поверхности клеток. IGF1R содержит альфа-субъединицу, которая включает внеклеточную часть, имеющую участок связывания инсулиноподобного фактора роста 1, соединенную дисульфидной связью с бета-субъединицей, которая содержит небольшой внеклеточный домен, трансмембранный участок и внутриклеточную часть. Рецептор IGF1 компонуется в гомодимер или может образовывать гетеродимер с рецептором инсулина. Последовательность IGF1R может быть, но не ограничивается этим, такой, как показано на фиг. 2 (инвентарный № SwissProt P08069; SEQ ID NO: 12), или последовательностью, по существу идентичной ей.
Антитело или его фрагмент, как описано в данном документе, не должны мешать передаче сигналов через инсулиновый рецептор (IR) или IGF1R. В частности, антитела или их фрагменты, описанные в данном документе, не должны ингибировать фосфорилирование протеинкиназы В, индуцированное инсулином, и они не должны индуцировать фосфорилирование IR самостоятельно или ингибировать вызванную инсулином передачу сигнала; кроме того, антитела или их фрагменты, описанные в данном документе, не должны ингибировать IGF-1-индуцированное фосфорилирование IGF1R. К тому же, они не должны связываться с инсулиновым рецептором.
Как было указано выше, антитело или его фрагмент могут являться sdAb. SdAb может иметь верблюжье происхождение или быть полученным из верблюжьих VHH, и, таким образом, могут быть основаны на верблюжьих каркасных областях; В качестве альтернативы, CDR, описанные выше, могут быть привиты на VNAR, VHH, VH или VL каркасные области. В еще одном альтернативном варианте гипервариабельные петли, описанные выше, могут быть привиты на каркасные области других типов фрагментов антител (Fv, ScFv, FAB) из любого источника (например, мышиные) или белки аналогичного размера и характера, на которые может быть привита CDR (например, см. Nicaise et al, 2004).
Настоящее изобретение дополнительно включает антитело или фрагмент, который гуманизирован с использованием любого подходящего способа, известного в данной области техники, например, но не ограничиваясь ими, CDR прививкой и облицовкой. Гуманизация фрагмента антитела или антитела содержит замену аминокислоты в последовательности на ее человеческий аналог, который содержится в человеческой консенсусной последовательности, без потери антиген-связывающей способности или специфичности; такой подход уменьшает иммуногенность антитела или его фрагмента при введении человеку. В процессе прививки CDR одна или более чем одна из CDR, определенных в настоящем документе, может быть слита или привита к вариабельной области человека (VH или VL), другому человеческому антителу (IgA, IgD, IgE, IgG и IgM), другим человеческим каркасным областям фрагментов антител (Fv, ScFv, Fab) или другим белкам аналогичного размера и природы, на которые могут быть привиты CDR (Nicaise et al, 2004). В таком случае конформация указанной одной или более чем одной гипервариабельной петли вероятно сохраняется и аффинность и специфичность sdAb к своей мишени (т.е. IGF1R) вероятно минимально затронуты. CDR-прививка известна в данной области техники и описана по меньшей мере в следующих документах: патент США № 6180370, патент США № 5693761, патент США № 6054297, патент США № 5859205 и Европейский патент № 626390. Облицовка также упоминается в данной области как шлифовка вариабельной области и включает в себя гуманизацию гидрофильных областей антитела или фрагмента; таким образом скрытые негуманизированные остатки, которые могут
- 9 035480 быть важны для конформации CDR, сохраняются, в то время как потенциал для иммунологической реакции против гидрофильных областей сведен к минимуму. Облицовка известна в данной области техники и описана по меньшей мере в следующих документах: в патенте США № 5869619, патенте США № 5766886, патенте США № 5821123 и Европейском патенте № 519596. Специалисты в данной области техники также достаточно знакомы со способами получения таких гуманизированных фрагментов антител и гуманизации аминокислотных позиций.
Например, не в рамках каких-либо ограничений, выделенное или очищенное антитело или его фрагмент, специфические к IGF1R, может иметь последовательность
X1VX2LX3ESGGGLVQX4GGSLRLSCX5X6SGGTVSPTAMGWX7RQAPGKX8X9EX1OVX11
HITWSRGTTRX12ASSVKX13RFTISRDX14X15KNTXi6YLQMNSLX17Xi8EDTAVYYCAAS
TFLRILPEESAYTYWGQGT X19VTVSS (SEQ ID NO:4), где X1 представляет собой Е или Q; Х2 представляет собой K или Q; Х3 представляет собой V или Е; Х4 представляет собой А или Р; Х5 представляет собой А или Е; Х6 представляет собой V или А; Х7 представляет собой V или F; Х8 представляет собой G или Е; Х9 представляет собой L или R; Х10 представляет собой F или W; Х11 представляет собой G или S; X12 представляет собой V или Y; Х13 представляет собой D или G; Х14 представляет собой N или S; X15 представляет собой А или S; X16 представляет собой L или V; X17 представляет собой K или R; X18 представляют собой А или S; и X19 представляют собой L или Q, или по существу идентичную ей последовательность. В качестве альтернативы, выделенное или очищенное антитело может содержать последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCEVSGGTVSPTAMGWFRQAPGKEREFVGHIT
WSRGTTRVASSVKDRFTISRDSAKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCAASTFLRILP
EESAYTYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:5), упоминаемой здесь как IGF1R-4;
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGGTVSPTAMGWVRQAPGKGLEWVGHI
TWSRGTTRYASSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAASTFLRIL PEESAYTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:6), упоминаемой здесь как IGF1R4_Н2;
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGGTVSPTAMGWFRQAPGKGLEFVGHIT
WSRGTTRYASSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAASTFLRILP
EESAYTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:7), упоминаемой здесь как IGF1R4_НЗ;
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGGTVSPTAMGWFRQAPGKGLEFVGHIT
WSRGTTRYASSVKGRFTISRDSSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAASTFLRILP EESAYTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:8), упоминаемой здесь как IGF1R4_Н4;
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGGTVSPTAMGWFRQAPGKEREFVGHI
TWSRGTTRYASSVKGRFTISRDSSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAASTFLRI
LPEESAYTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:9), упоминаемой здесь как IGF1R-4_H5; и или последовательности, по существу идентичной им.
По существу идентичные последовательности могут содержать одну или несколько консервативных аминокислотных мутаций. Известно, что одна или несколько консервативных аминокислотных мутаций в референсной последовательности могут дать мутантный пептид без существенного изменения физиологических, химических, физико-химических или функциональных свойств по сравнению с референсной последовательностью; в таком случае референсная и мутантная последовательности будут считаться по существу идентичными полипептидами. Консервативное аминокислотное замещение определяется здесь как замещение аминокислотного остатка на другой аминокислотный остаток со сходными химическими свойствами (например, размер, заряд или полярность). Эти консервативные аминокислотные мутации могут произойти в каркасных областях sdAb при сохранении последовательностей CDR, перечисленных выше, а также общей структуры CDR антитела или его фрагмента; таким образом специфичность и связывание антитела сохраняются.
В качестве неограничивающего примера, консервативная мутация может быть замещением аминокислоты. Такое консервативное аминокислотное замещение может замещать основную, нейтральную, гидрофобную или кислую аминокислоту на другую из той же группы. Под термином основная аминокислота подразумеваются гидрофильные аминокислоты, имеющие боковую цепь со значением рК больше 7, которые, как правило, положительно заряжены при физиологическом значении рН. Основные
- 10 035480 аминокислоты включают гистидин (His или Н), аргинин (Arg или R ) и лизин (Lys или K). Под термином нейтральная аминокислота (также полярная аминокислота) подразумевают гидрофильные аминокислоты, имеющие боковую цепь, которая не заряжена при физиологическом значении рН, но которая имеет по крайней мере одну связь, в которой пара электронов, общая для двух атомов, находится ближе к одному из атомов. Полярные аминокислоты включают серии (Ser или S), треонин (Thr или Т), цистеин (Cys или С), тирозин (Tyr или Y), аспарагин (Asn или N) и глютамин (Gln или Q). Термин гидрофобная аминокислота (также неполярная аминокислота) включает аминокислоты, проявляющие гидрофобность выше нуля в соответствии с нормированной консенсусной шкалой гидрофобности Айзенберга (1984). Гидрофобные аминокислоты включают пролин (Pro или Р), изолейцин (Ile или I), фенилаланин (Phe или F), валин (Val или V), лейцин (Leu или L ), триптофан (Trp или W), метионин (Met, или М), аланин (Ala или А) и глицин (Gly или G). Кислая аминокислота относится к гидрофильным аминокислотам, имеющим боковую цепь со значением рК меньше 7, которые, как правило, отрицательно заряжены при физиологическом значении рН. Кислые аминокислоты включают глутамат (Glu или Е) и аспартат (Asp или D).
Идентичность последовательности используется для оценки сходства двух последовательностей; она определяется путем вычисления процента остатков, которые являются одинаковыми, когда две последовательности выравнивают для максимального соответствия между позициями остатков. Любой известный способ может быть использован для вычисления идентичности последовательностей; например существует компьютерное программное обеспечение для расчета идентичности последовательности. Не в рамках каких-либо ограничений, идентичность последовательности может быть рассчитана с помощью программного обеспечения, такого как NCBI BLAST2, поддерживаемого Швейцарским институтом биоинформатики (его можно найти по адресу ca.expasy.org/tools/blast/), BLAST-P, Blast-N или FASTA-H или любого другого подходящего программного обеспечения, которое известно в данной области техники.
По существу идентичные последовательности согласно настоящему изобретению могут быть по меньшей мере на 90% идентичны; в другом примере по существу идентичные последовательности могут быть по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, или 100% идентичны, или на любое другое значение между указанными, на уровне аминокислотной последовательности, описанном в данном документе. Важно то, что по существу идентичные последовательности сохраняют активность и специфичность референсной последовательности. В неограничивающем варианте воплощения разница в идентичности последовательностей может быть из-за мутации(й) консервативной аминокислоты. В качестве неограничивающего примера настоящее изобретение может быть направлено на антитело или его фрагмент, содержащий последовательность по меньшей мере на 95, 98 или 99% идентичную последовательности антител, описанных в настоящем документе.
Антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению может также содержать дополнительные последовательности для помощи в экспрессии, детектировании или очистке рекомбинантного антитела или его фрагмента. Могут быть использованы любые такие последовательности или метки, известные специалистам в данной области. Например, не в рамках каких-либо ограничений, антитело или его фрагмент может включать в себя таргетирующую или сигнальную последовательность (например, но не ограничиваясь указанным, OmpA), метку детектирования/очистки (например, но не ограничиваясь указанным, с-Мус, His5 или His6) или их комбинации. В другом примере дополнительная последовательность может быть биотиновым сайтом узнавания как, например, описанный Cronan et al в WO 95/04069 или Cronan et al в WO 2004/076670. Как также известно специалистам в этой области техники, линкерные последовательности могут быть использованы в сочетании с дополнительными последовательностями или метками или могут служить в качестве метки детектирования/очистки.
Антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению также могут быть в формате мультивалентно го отображения, также называемом здесь мультивалентной презентацией. Мультимеризация может быть достигнута любым подходящим способом, известным в данной области техники. Например, не в рамках каких-либо ограничений, мультимеризация может быть достигнута с помощью молекул самосборки, таких, как описаны у Zhang et al (2004a; 2004b) и в WO 2003/046560, где пентатела получают путем экспрессии слитого белка, содержащего антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению, и домен пентамеризации В-субъединицы семейства токсинов АВ5 (Merritt & Hol, 1995). Мультимер также может быть сформирован с использованием доменов мультимеризации, описанных у Zhu et al. (2010); эта форма, называемая здесь combody формой, является слиянием антитела или его фрагмента согласно настоящему изобретению с суперспиральным пептидом, образующим мультимерную молекулу (Zhu et al., 2010). Другие формы мультивалентной презентации также охватываются настоящим изобретением. Например, не в рамках каких-либо ограничений, антитело или его фрагмент могут быть представлены в виде димера, тримера или любого другого подходящего олигомера. Это может быть достигнуто с помощью способов, известных в данной области техники, например, с помощью соединения прямым связыванием (Nielson et al, 2000), c-Jun/Fos взаимодействия (Kruif & Logtenberg, 1996), Выступыво-впадины взаимодействия (Ridgway et al, 1996).
Другим способом, известным в данной области для мультимеризации, является димеризация антитела или его фрагмента с использованием домена Fc, например, но не ограничиваясь указанным, человеческих доменов Fc. Домены Fc могут быть выбраны из различных классов, в том числе, но не ограничи
- 11 035480 ваясь указанным, IgG, IgM или различных подклассов, включая, но не ограничиваясь указанным, IgGl, IgG2 и т.д. При таком подходе ген Fc встраивают в вектор вместе с геном sdAb для создания слитого белка sdAb-Fc (Bell el al, 2010; Iqbal et al, 2010); слитый белок рекомбинантно экспрессируют, затем очищают. Например, не в рамках каких-либо ограничений, форматы мультивалентного отображения могут включать в себя химерные форматы анти-IGF1R-4 VHH, связанного с доменом Fc, или би- или триспецифические слитые антитела с двумя или тремя анти-IGF1R-4 VHH, распознающими уникальные эпитопы. Такие антитела можно легко спроектировать и получить, они могут значительно продлить период полувыведения в сыворотке sdAb и они могут быть подходящими реагентами для визуализации опухолей (Bell et al., 2010).
Домен Fc в мультимерном комплексе, как описано выше, может представлять собой любой подходящий Fc-фрагмент, известный в данной области техники. Fc-фрагмент может быть получен из любого подходящего источника. Например, Fc может быть мышиного или человеческого происхождения. В конкретном неограничивающем примере Fc может быть мышиным Рс2b-фрагментом или человеческим Fc1фрагментом (Bell el al, 2010; Iqbal et al, 2010). Fc-фрагмент может быть слит с N-терминальным или Стерминальным концом анти-IGF1R-4 VHH или гуманизированных вариантов согласно настоящему изобретению. В конкретном неограничивающем примере мультемеризованные выделенные или очищенные антитела или фрагменты, как описано выше, могут содержать последовательность SEQ ID NO: 10, 38, или 11.
Каждая субъединица мультимеров, описанных выше, может содержать одинаковые или различные антитела или их фрагменты согласно настоящему изобретению, которые могут иметь одинаковую или различную специфичность. Кроме того, домены мультимеризации могут быть связаны с антителом или фрагментом антитела с использованием линкера по мере необходимости; такой линкер должен иметь достаточную длину и соответствующий состав, чтобы обеспечить гибкое крепление двух молекул, но он не должен мешать антиген-связывающим свойствам антитела.
Антитело или его фрагмент, как описано в данном документе, могут проходить через гематоэнцефалический барьер. Мозг отделен от остальной части тела посредством специализированной эндотелиальной ткани, известной как гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Эндотелиальные клетки ГЭБ соединены плотными контактами и эффективно предотвращают попадание множества терапевтических соединений в мозг. В дополнение к низкой скорости везикулярного транспорта еще одной особенностью ГЭБ является наличие ферментативного барьера(ов) и высокого уровня(ей) экспрессии АТФ-зависимых транспортеров на аблюминальной (со стороны мозга) стороне ГЭБ, в том числе Р-гликопротеина (Gottesman et al., 1993; Watanabe, 1995), который активно транспортируют различные молекулы из головного мозга в кровоток (Samuels, 1993). Лишь небольшие (менее 500 Да) и гидрофобные (Pardridge, 1995) молекулы могут легко проникать через ГЭБ. Таким образом, способность антитела или его фрагмента, как описано выше, специфически связываться с поверхностным рецептором, поглощаться в эндотелиальных клетках головного мозга и подвергаться трансцитозу через ГЭБ, уклоняясь от лизосомальной деградации, полезна в области неврологии.
Настоящее изобретение охватывает также нуклеотидные последовательности, кодирующие молекулы, как описано в настоящем документе. Учитывая вырожденность генетического кода, некоторое число нуклеотидных последовательностей будет обладать эффектом кодирования полипептида, что будет понятно специалисту в данной области техники. Нуклеотидная последовательность может быть кодон-оптимизирована для экспрессии в различных микроорганизмах. Настоящее изобретение также относится к векторам, содержащим нуклеиновые кислоты, описанные выше. Кроме того, изобретение охватывает клетки, содержащие нуклеиновую кислоту и/или вектор, описанные выше.
Настоящее изобретение дополнительно относится к выделенным или очищенным антителам или их фрагментам, иммобилизованным на поверхность с использованием различных методик; например, не в рамках каких-либо ограничений, антитело или его фрагмент могут быть связаны или спарены с поверхностью с помощью His-метки, биотинового связывания, ковалентного связывания, адсорбции и тому подобное. Иммобилизация антитела или его фрагмента согласно настоящему изобретению может быть полезна в различных применениях для захвата, очистки или выделения белков. Твердая поверхность может представлять собой любую подходящую поверхность, например, но не ограничиваясь указанным, поверхность лунки микротитрационного планшета, каналы сенсорных чипов поверхностного плазмонного резонанса (SPR), мембраны, шарики (такие как магнитные или сефарозные шарики или основанные на других хроматографических смолах), стекло, пластик, нержавеющую сталь, пленку или любую другую полезную поверхность, такую как наночастицы, нанопровода и поверхности кантилевера.
Изобретение также включает антитело или его фрагмент, как описано выше, связанное с каргомолекулой. Карго-молекула может представлять собой любую подходящую молекулу, которая поставляется через ГЭБ антителом или его фрагментом. Карго-молекула может иметь молекулярную массу в диапазоне от около 1 до около 200 кДа; например, карго-молекула может иметь молекулярную массу около 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90,95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 или 200 кДа, или любую массу в промежутке между указанными массами, или любой диапазон масс, определенный с помощью любых двух указанных
- 12 035480 выше масс. В конкретных, неограничивающих примерах карго-молекула может иметь молекулярную массу 1 кДа (например, но не ограничиваясь указанным, малая молекула, такая как Су5.5), 1-10 кДа (например, но не ограничиваясь указанным, пептид, такой как галанин, 3 кДа), около 80 кДа (например, но не ограничиваясь указанным, Fc-фрагмент, фермент, белок, антитело и т.д.) или около 200 кДа (например, но не ограничиваясь указанным, моноклональное антитело).
Например, не в рамках каких-либо ограничений, карго-молекулой может быть детектируемый агент, терапевтический агент, лекарственное средство, пептид, фермент, фактор роста, цитокин, ловушка рецептора, антитело или его фрагмент (например IgG, ScFv, Fab, VHH, VH, VL и т.д.), химическое соединение, углеводный фрагмент, молекулы на основе ДНК (антисмысловой олигонуклеотид, микроРНК, миРНК, плазмида), цитотоксический агент, вирусный вектор (адено-, ленти-, ретро-), одна или более липосом или наноносителей, загруженных любым из ранее перечисленных типов карго-молекул, или одна или несколько наночастиц, нанопроводов, нанотрубок или квантовых точек. Карго-молекула, как это описано выше, может быть детектируемым агентом. Например, IGF1R-специфическое антитело или его фрагмент может быть связано с радиоактивным изотопом, парамагнитной меткой, фторофором, флуоресцентным агентом, ближним инфракрасным (NIR, например Су5.5) фторохромом или красителем, эхогенным микропузырем, аффинной меткой, детектируемой молекулой на основе белка, нуклеотидом, квантовыми точками, наночастицей, нанопроводом или нанотрубкой или любым другим подходящим агентом, который может быть обнаружен с помощью способов визуализации. Антитело или его фрагмент могут быть связаны с карго-молекулой с использованием любого способа, известного в данной области (рекомбинантной технологии, химической конъюгации и т.д.).
Карго-молекула, как описано в настоящем документе, может быть связана, что также названо здесь конъюгирована, с антителом или его фрагментом любым подходящим способом, известным в данной области техники. Например, не в рамках каких-либо ограничений, карго-молекула может быть связана с пептидом посредством ковалентной связи или ионного взаимодействия. Связь может быть достигнута за счет химической реакции сшивки или путем слияния с использованием методологии рекомбинантной ДНК в сочетании с любой системой экспрессии пептидов, такой как бактерии, дрожжи или системы, основанные на клетках млекопитающих. При конъюгации карго-молекулы с антителом или его фрагментом может быть использован подходящий линкер. Способы связывания антитела или его фрагмента с карго-молекулой, такой как терапевтический или детектируемый агент, хорошо известны специалистам в данной области техники.
В одном неограничивающем примере карго-молекулой может быть детектируемая метка, радиоактивный изотоп, парамагнитная метка, такая как гадолиний или оксид железа, фторофор, ближний инфракрасный (NIR) фторохром или краситель, эхогенный микропузырь, аффинная метка (например, биотин, авидин и т.д.), ферменты или любой другой подходящий агент, который может быть обнаружен с помощью диагностических способов визуализации. В конкретном неограничивающем примере анти-IGF1R-4 или его фрагмент может быть связан с красителем ближней инфракрасной флуоресцентной визуализации (NIRF), например, не в рамках каких-либо ограничений, Су5.5, Alexa680, Dylight680 или Dylight800.
Таким образом, настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ in vitro детектирования IGF1R, включающий контактирование образца ткани с одним или более чем одним выделенным или очищенным антителом или его фрагментом согласно настоящему изобретению, связанным с детектируемым агентом. Комплекс IGF1R-антитело можно затем обнаружить с помощью технологий детектирования и/или визуализации, известных в данной области техники. Образец ткани в способе, описанном выше, может представлять собой любой подходящий образец ткани, например, но не ограничиваясь указанным, образец сыворотки, образец ткани сосудов, образец опухолевой ткани или ткани головного мозга; образец ткани может быть из организма человека или животного. Стадия контактирования осуществляется в подходящих условиях для формирования комплекса между антителом или его фрагментом и IGF1R, известных специалистам в этой области техники. Стадия детектирования может быть осуществлена любым подходящим способом, известным в данной области техники, например, но не ограничиваясь указанным, с помощью оптической визуализации, иммуногистохимии, молекулярной диагностической визуализации, ELISA (иммуно-ферментный анализ), визуализирующей масс-спектрометрии или другим подходящим способом. Например, не в рамках каких-либо ограничений, выделенное или очищенное антитело или его фрагмент, связанный с детектируемым агентом, могут быть использованы в иммунологических исследованиях (IA), включая, но не ограничиваясь указанным, ферментативные IA (EIA), ELISA, быстрый захват антигена, быстрые хроматографические IA и быстрые EIA. (Например, см. Planche et al, 2008; Sloan et al, 2008; Russmann et al, 2007; Musher et al, 2007; Turgeon et al, 2003; Fenner et al, 2008).
Настоящее изобретение также описывает способ детектирования экспрессии IGF1R в субъекте in vivo. Способ включает в себя введение одного или более одного выделенного или очищенного антитела или его фрагмента, как описано в данном документе, связанного с детектируемым агентом, субъекту, затем детектирование меченого антитела или его фрагмента, связанного с IGF1R. Стадия детектирования может включать в себя любой подходящий способ, известный в данной области техники, например, но не ограничиваясь указанным, PET, SPECT или флуоресцентную визуализацию или любой другой подхо- 13 035480 дящий способ. Способ, как описано выше, может быть полезным при выявлении экспрессии IGF1R в кровеносных сосудах или тканях, например, но не ограничиваясь указанным, в опухолевых тканей.
Стадия детектирования in vivo способами, описанными выше, может включать визуализацию всего тела для диагностических целей или локальную визуализацию в специфических сайтах, таких как, но не ограничиваясь указанным, сосуды головного мозга или опухоли сосудов головного мозга, в количественном выражении для оценки прогрессирования заболевания или ответа субъекта на режим лечения. Стадией детектирования способами, описанными выше, может быть иммуногистохимия или технология неинвазивной (молекулярной) диагностической визуализации, в том числе, но не ограничиваясь указанным:
оптическая визуализация;
позитронно-эмиссионная томография (PET), в которой детектируемый агент представляет собой изотопы, такие как 11С, 13N, 15O, 18F, 64Cu, 62Cu, 124I, 76Br, 82Rb и 68Ga, причем 18F является наиболее клинически используемым;
однофотонная эмиссионная компьютерная томография (SPECT), в которой детектируемый агент представляет собой радиоиндикатор, такой как 99mTc, 111In, 123I, 201Ti, 133Xe в зависимости от конкретного применения;
магнитно-резонансная томография (MRI), в котором детектируемым агентом может быть, например, но не ограничиваясь указанным, гадолиний, наночастицы оксида железа и наночастицы железакобальта, покрытые углеродом, тем самым повышающие чувствительность MRI для обнаружения бляшек;
контрастная ультразвуковая эхография (CEUS) или ультразвук, где детектируемым агентом является по меньшей мере один акустически активный и газонаполненный микропузырь. Ультразвук является распространенной технологией для скрининга и раннего выявления заболеваний человека. Это дешевле MRI или сцинтиграфии и безопаснее, чем технологии молекулярной визуализации, такие как радионуклидная визуализация, так как не связано с радиацией.
Настоящее изобретение дополнительно относится к способу транспортировки представляющей интерес молекулы через гематоэнцефалический барьер. Способ включает введение молекулы, связанной с антителом или его фрагментом, как описано в настоящем документе, субъекту; антитело или его фрагмент проходят гематоэнцефалический барьер. Молекула может быть любой желаемой молекулой, в том числе карго-молекулой, как было описано ранее; молекула может быть связана с антителом или его фрагментом с использованием любого подходящего способа, включая, но не ограничиваясь указанным, конъюгацию или экспрессию в слитом белке. Введение может быть осуществлено любым подходящим способом, например посредством парентерального введения, включая, но не ограничиваясь указанным, внутривенное (iv), подкожные (sc) и внутримышечное (im) введение. В этом способе антитело или его фрагмент согласно данному изобретению переносят представляющую интерес молекулу через ГЭБ к мишени в мозге.
Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей одно или более выделенное или очищенное антитело или его фрагмент, как описано в настоящем документе. Композиция может содержать одно антитело или фрагмент, как описано выше, или может представлять собой смесь антител или их фрагментов. Кроме того, в композиции, содержащей смесь антител или фрагментов согласно настоящему изобретению, антитела могут иметь такую же специфичность или могут отличаться по своей специфичностью; например, не в рамках каких-либо ограничений, композиция может содержать антитела или их фрагменты, специфические к IGF1R (тот же или другой эпитоп).
Композиция может также содержать фармацевтически приемлемый разбавитель, эксципиент или носитель. Разбавитель, эксципиент или носитель может представлять собой любой подходящий разбавитель, эксципиент или носитель, известный в данной области, и должен быть совместим с другими ингредиентами композиции, со способом доставки композиции и не являться вредным для субъекта. Композиция может быть в любой подходящей форме; например, композиция может находиться в форме суспензии, форме порошка (например, но ограничиваясь лиофилизированной или инкапсулированной), в форме капсул или таблеток. Например, не в рамках каких-либо ограничений, когда композиция находится в форме суспензии, носитель может содержать воду, физиологический раствор, подходящий буфер или добавки для улучшения растворимости и/или стабильности; реконструкция для получения суспензии осуществляется в буфере при подходящем рН, чтобы обеспечить жизнеспособность антитела или его фрагмента. Сухие порошки могут также включать добавки для улучшения стабильности и/или носители для увеличения массы/объема; например, не в рамках каких-либо ограничений, композиция сухого порошка может содержать сахарозу или трегалозу В конкретном неограничивающем примере композиция может быть сформирована таким образом, чтобы доставить антитела или их фрагменты в желудочнокишечный тракт субъекта. Таким образом, композиция может включать в себя инкапсуляцию, высвобождение со временем или другие подходящие технологии для доставки антитела или его фрагмента. В компетенции специалиста в данной области техники приготовить подходящие композиции, содержащие настоящие соединения.
Изобретение также относится к способу количественного определения количества карго-молекулы,
- 14 035480 доставляемой через ГЭБ субъекта, в котором карго-молекула связана с одним или более выделенным или очищенным антителом или его фрагментом, как описано в настоящем документе, причем способ включает стадии
a) сбора спинномозговой жидкости (СМЖ) у субъекта; и
b) использования целевых методов протеомики для определения количества карго-молекулы, связанного с одним или более антителом или его фрагментом, в спинномозговой жидкости.
Карго-молекула может представлять собой любую желаемую молекулу в том числе каргомолекулы, описанные ранее; выделенное или очищенное антитело или его фрагмент проходит через гематоэнцефалический барьер; и молекула может быть связана с антителом или его фрагментом с использованием любого подходящего способа, включая, но не ограничиваясь указанным, конъюгацию или экспрессию в слитом белке, как описано выше. В описанном выше способе СМЖ берут у субъекта с использованием любого подходящего способа, известного в данной области. Количество СМЖ, необходимое для целевого метода протеомики на стадии b), может находиться в диапазоне от приблизительно 1 до 10 мкл; например, количество необходимой спинномозговой жидкости может составлять около 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 или 10 мкл, или любое количество между этими значениями, или любой диапазон, определяемый только что описанными значениями. Антитело или его фрагмент, связанное с карго-молекулой, может быть введено субъекту до сбора спинномозговой жидкости. Может потребоваться подходящая задержка между введением и доставкой антитела или его фрагмента, связанного с карго-молекулой, через ГЭБ. Задержка может составлять по меньшей мере 30 мин после введения антитела или фрагмента, связанного с карго-молекулой; например, не в рамках каких-либо ограничений, задержка может составлять по меньшей мере 30 мин, 1 ч, 1,5 ч, 2 ч, 2,5 ч, 3 ч, 3,5 ч, 4 ч, 4,5 ч или 5 ч. Целевые методы протеомики, используемые для определения количества одного или более антитела или его фрагмента, связанного с карго-молекулой, могут быть любыми подходящими методами, известными в данной области техники. Например, не в рамках каких-либо ограничении, целевой метод протеомики может быть методом масс-спектрометрии, таким как, но не ограничиваясь указанным, мониторинг множественных реакций с использованием изотопически меченных внутренних стандартов (MRM-ILIS; см, например, Haqqani et al., 2013), Преимущество MRM состоит в том, что он позволяет провести быструю, чувствительную и специфическую количественную оценку немеченых целевых аналитов (например, антитела или его фрагмента, как описано в настоящем документе) в биологическом образце. Возможность мультиплексирования анализа позволяет количественно оценить антитела или их фрагменты и карго-молекулу
Настоящее изобретение будет проиллюстрировано на следующих примерах. Тем не менее, следует понимать, что эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны использоваться для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом.
Пример 1. Очистка рекомбинантного фрагмента IGF1R.
Рекомбинантный фрагмент внеклеточного домена IGF1R длиной в 933 аминокислоты (показан серой рамкой на фиг. 1; см. также аминокислоты 1-933 SEQ ID NO: 12) был подготовлен. Фрагмент состоит из N-терминального 30 аминокислотного сигнального пептида, полной альфа-субъединицы, сайта фуринового расщепления (RKRR, SEQ ID NO: 13; отделяющего альфа и бета субъединицы), а также большей части внеклеточной части бета-субъединицы (фиг. 1 и 2).
Клонирование. Последовательность IGF1R эктодомена, представляющего интерес, амплифицировали с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция) с использованием следующих праймеров:
5’-CGGGATCCGCCACCATGAAGTCTGGCTCCGGAG-3’ (прямой; SEQ ID NO: 14)
5’-GCTCTAGATCAGAAGTTTTCATATCCTGTTTTGG-3’ (обратный; SEQ ID NO: 15) и субклонировали в сайт Smal pUC19. Последовательность IGF1R933 затем субклонировали в pCDN4/Myc-His (Invitrogen), чтобы создать р IGF1R933-His для экспрессии His-меченного эктодомена, как описано ранее (Samani et al. 2004).
Переходная трансфекция. Частицы лентивируса, экспрессирующие IGF1R933-His, были получены в пакующей клеточной линии 293SF-PacLV, как подробно описано ранее (Broussau et al., 2008). Вкратце, клетки были трансфицированы вектором с использованием полиэтиленимина. Свежую среду (LC-SFM (бессывороточная среда с низким кальцием)), содержащую 1 мкг/мл доксициклина и 10 мкг/мл кумата, добавляли к клеткам через 5 ч после трансфекции, и супернатант, содержащий LV частицы, был собран после 48-72 ч, его концентрировали с помощью ультрацентрифугирования при 100000 g в течение 2 ч при температуре 4°С на подложке 20% сахарозы (Gaillet В et al. 2007), ресуспендировали в LC-SFM среде, дополненной 1% FBS (фетальная бычья сыворотка), и хранили при -70°С до использования.
Стабильная экспрессия. Стабильная клеточная линия, 293SF-cum2-CR5-IGF1 R-His, была сгенерирована трансдукцией клеточных линий 293SF-Cum2 с соответствующими лентивирусными частицами с использованием протокола, описанного ранее (Gaillet В et al. 2010). Вкратце, 0,5-1,0x105 293SF-Cum2 клеток высевали в 24-луночных планшетах в 200 мкл LC-SFM среды без декстрансульфата. Суспензия LV была получена смешиванием 200-500 мкл LV с 8 мкг/мл полибрена и инкубированием в течение 30 мин при 37°С. Свежеприготовленную суспензию LV добавляли к клеткам через 4 ч после посева. После
- 15 035480 ч 500 мкл среды с добавлением декстрансульфата добавляли к клеткам. Для повышения уровня экспрессии клетки были вновь трансдуцированы до 6 раз с использованием того же протокола после 3-4 суток восстановления клеток. Наконец, клетки были размножены в 6-ти луночных планшетах и колбах шейкерах.
Крупномасштабное производство белка и очистка. Клон, идентифицированный как самый высокопроизводительный, был размножен в колбах шейкерах или центрифужных колбах. Продуцирование белка инициировали добавлением 1 мкг/мл кумата к свежей среде, после чего 24 ч инкубировали при 37°С и 4-8 суток инкубировали при 30°С. Клетки удаляли центрифугированием и супернатант фильтровали и концентрировали (10х) с использованием систем тангентальной поточной фильтрации (кассеты ультрафильтрации Pellicon, EMD Millipore).
IGF1R933-His очищали с использованием колонки HisPrep (GE Healthcare) в соответствии с инструкциями изготовителя. Вкратце, концентрированный образец наносили на His-Prep FF (16/10) колонку (GE Healtcare), калибровали и промывали 50 мМ фосфатом натрия, 300 мМ NaCl, 5 мМ имидазолом с рН 7,5 и элюировали 50 мМ фосфатом натрия, 300 мМ NaCl, 500 мМ имидазолом, рН 7,5. Стадию элюирования с 0,1 М цитратом натрия рН 4,5 - рН 2,5 использовали для элюирования белка и собирали пиковые фракции. Смену буфера осуществляли путем ультрафильтрации с использованием 50 кДа отсекающей мембраны или обессоливающей колонки с буфером, содержащим 50 мМ фосфата натрия, 150 мМ NaCl и 0,01% Tween-80, рН 7,2. Чистоту обоих белков проверяли с помощью SDS-PAGE и хранили их при -80°С до использования (см. последующие примеры).
Пример 2. Иммунизация ламы и сывороточный ответ.
Для выделения VHH, нацеленных на внеклеточный домен IGF1R, лама была иммунизирована рекомбинантным IGF1R933-His фрагментом, полученным в примере 1.
Одного самца ламы (Lama glama) иммунизировали путем подкожной инъекции IGF1R933-His рекомбинантного антигена (пример 1) в нижнюю часть спины. В 1 сутки 200 мкг антигена, разведенного в PBS до 1 мл, вводили вместе с 1 мл полного адъюванта Фройнда (Sigma, St. Louis, МО). Еще три инъекции 100 мкг IGF1R933-His антигена с неполным адъювантом Фройнда (Sigma) были выполнены на 22, 36 и 50 сутки. Окончательную инъекцию 100 мкг антигена без адъюванта проводили на 77 сутки. Преиммунизированная кровь отбирались до первой инъекции на 1 сутки и служила в качестве отрицательного контроля. Пробы крови (10-15 мл) собирали на 29, 43, 57 и 84 сутки. Кровь, взятая на 84 сутки, была обработана немедленно с выделением мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС). Кровь разводили 1:1 с PBS и РВМС выделяли из крови с помощью Lymphoprep Tube (Axis Shield). Клетки подсчитывали и хранили в виде аликвот приблизительно 1 х 107 клеток при температуре -80°С для последующего использования.
Преиммунизированную и постиммунизированную общую сыворотку анализировали на специфический ответ на IGF1R933-His антиген с помощью ELISA на 57 сутки. Сыворотка ламы с 84 суток была фракционирована как описано ранее (Doyle et al, 2008). Полученные фракции А1 (HCAb), A2 (HCAb), G1 (HCAb) и G2 (clgG) анализировали на специфическое связывание с IGF1R933-His антигеном с помощью ELISA. Вкратце, 5 мкг IGF1R933-His рекомбинантного антигена, разведенного в PBS, инкубировали в течение ночи (100 мкл/лунку, 18 ч, 4°С) в 96-луночных планшетах Maxisorp (Nalgene, Nunc) для покрытия планшетов. Планшеты блокировали бычьим сывороточным альбумином (BSA), промывали PBS-T (PBS+0,05% (об/об) Tween-20) и наносили серийные разведения преиммунизированной общей сыворотки, постиммунизированной общей сыворотки (57 сутки) и фракционированной сыворотки (84 сутки). После инкубации при комнатной температуре в течение 1,5 ч планшеты промывали PBS-T перед добавлением козьего анти-лама IgG (1:1,000 в PBS) и инкубацией в течение 1 ч при 37°С. После промывания PBS-T добавляли свиной анти-козий IgG HRP (пероксидаза хрена) конъюгат (1: 3,000 в PBS) и планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Окончательную PBS-T промывку проводили перед добавлением 100 мкл/лунку субстрата ТМВ (тетраметилбензидиновый субстрат) (KPL, Gaithersburg, MD); субстрат инкубировали в течение 10 мин. Реакцию останавливали с помощью 100 мкл/лунку 1 М Н3РО4. Оптическую плотность считывали при длине волны 450 нм.
Пример 3. Построение библиотеки и выбор IGF1R связывающих VHH.
Библиотека VHH гипериммунизированной ламы была построена на основе РНК, выделенной из РВМС в примере 2.
Построение библиотеки и пэннинг проводили по существу как описано ранее (Arbabi-Ghahroudi et al, 2009a, 2009b; Tanha et al, 2003). Общую РНК выделяли из приблизительно 107 РВМС, собранных на 84 сутки постиммунизации (пример 2) с помощью QIAamp мини набора для выделения РНК из крови (Qiagen). Около 5 мкг общей РНК использовали в качестве матрицы для синтеза первой цепи кДНК с олиго dT праймерами с использованием набора для синтеза первой цепи синтеза кДНК (GE Healthcare). кДНК амплифицировали с помощью эквимолярной смеси трех смысловых праймеров, специфичных к вариабельной области:
- 16 035480
МЛ: 5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCSMKGTGCAGCTGGTGGAKTCTGGG
GGA-3’ (SEQ ID NO:16)
MJ2:5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTAAAGCTGGAGGAGTCTGGG
GGA-3’ (SEQ ID NO:17)
MJ3:5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGCTCAGGTACAGCTGGTGGAG
TCT-3’ (SEQ ID NO: 18), и двух антисмысловых СН2-специфичных праймеров:
СН2: 5’-CGCCATCAAGGTACCAGTTGA-3’ (SEQ ID NO: 19
CH2b3: 5’-GGGGTACCTGTCATCCACGGACCAGCTGA-3’ (SEQ ID NQ:20).
Вкратце, реакционная смесь ПЦР была создана в общем объеме 50 мкл со следующими компонентами: 1-3 мкл кДНК, 5 пмоль смеси MJ1-3 праймеров, 5 пмоль СН2 или СН2Ь3 праймеров, 5 мкл 10х реакционного буфера, 1 мкл 10 мМ дНТФ, 2,5 единицы Taq ДНК полимеразы (Hoffmann-La Roche). Протокол ПЦР состоял из (I) начальной стадии при 94°С в течение 3 мин, (II) затем 30 циклов при 94°С в течение 1 мин, 55°С в течение 30 с, 72°С в течение 30 с и (III) конечной стадии элонгации при 72°С в течение 7 мин. Амплифицированные продукты ПЦР прогоняли в 2% агарозном геле и наблюдали две основные полосы: полосу приблизительно 850 п.о. (пара оснований), что соответствует обычному IgG, и вторую полосу около 600 п.о., соответствующую VHH-CH2 области тяжелой цепи верблюжьего антитела. Меньшие полосы вырезали и очищали с использованием набора для гель экстракции QIAquick (Qiagen) и повторно амплифицировали во второй ПЦР в общем объеме 50 мкл с использованием 1 мкл (30 нг) матричной ДНК, 5 пмоль каждого из MJ7 (5'-CATGTGTAGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC-3' SEQ ID NO: 21) и MJ8 праймеров (5'-CATGTGTAGATTCCTGGCCGGCCTGGCCTGAGGAGACGGTGACCT GG-3' SEQ ID NO: 22), 5 мкл 10х реакционного буфера, 1 мкл 10 мМ дНТФ, 2,5 единицы Taq ДНК полимеразы. Протокол ПЦР состоял из (I) начальной стадии при 94°С в течение 3 мин, (II) 30 циклов при 94°С в течение 30 с, 57°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин и (III) конечной стадии элонгации при 72°С в течение 7 мин. Амплифицированные продукты ПЦР в диапазоне от 340 п.о. до 420 п.о., соответствующие VHH фрагментам тяжелой цепи антитела, очищали с использованием набора для очистки ПЦР QiagenQIAquick (Qiagen), расщепляли рестриктазой Sfil (New England Biolabs) и снова очищали с использованием такого же набора.
мкг фагмидного вектора pMED1 (Arbabi-Ghahroudi et al, 2009b) расщепляли с помощью Sfil в течение ночи при 50°С. Для того чтобы свести к минимуму самолигирование, добавляли 20 единиц рестриктаз Xhol и Pstl, чтобы отсечь вырезанные фрагменты, и реакцию расщепления инкубировали в течение еще 2 ч при 37°С. 60 мкг расщепленной фагмидной ДНК лигировали с 6 мкг расщепленных (Sfil в течение 5 ч при 50°С) VHH фрагментов (мольное соотношение 1:1) в течение 3 ч при комнатной температуре с использованием системы быстрого ДНК лигирования LigaFast (Promega) в соответствии с инструкцией изготовителя. Лигированные плазмиды очищали с использованием набора для очистки ПЦР QIAquick (Qiagen), элюировали в конечном объеме 100 мкл и трансформировали в электрокомпетентные TG1 E.coli (Stratagene), используя 5 мкл аликвоты лигированной ДНК на реакцию трансформации, как описано ранее (Arbabi-Ghahroudi et al, 2009b). Размер библиотеки был определен как 5х107, как описано в Arbabi-Ghahroudi et al, 2009b. 20 клонов были секвенированы и содержали все уникальные последовательности VHH. E.coli, содержащие библиотеку, культивировали в течение 2-3 ч при 37°С, 250 об/мин в присутствии 2% (масса/объем) глюкозы. Затем бактерии осаждали, снова суспендировали в 2xYT/Amp/Glu (2xYT среда(экстракт дрожжей + триптон) с 100 мкг/мл ампициллина и 2% (масса/объем) глюкозы) с 35% (об/об) глицерина и хранили при -80°С в небольших аликвотах.
Пэннинг эксперименты по существу проводили как описано у Arbabi et al, 1997. Два миллилитра библиотеки (2,0х 1010 бактерий) размораживали на льду и выращивали в 2xYT/Amp/Glu в течение приблизительно 2 ч при 37°С (А600=0,4-0,5). E.coli были впоследствии инфицированы 20х избытком М13КО7 хелпер-фага (New England Biolabs) в течение 1 ч при 37°С. Затем культуру центрифугировали при 4°С и гранулы инфицированных бактерий повторно суспендировали в 200 мл 2xYT/Amp с 50 мкг/мл канамицина и инкубировали при 37°С и 250 об/мин. Частицы фага в супернатанте культуры инкубировали с 1/5 объема 20% ПЭГ(полиэтиленгликоль) 8000/2,5М NaCl на льду в течение 1 ч и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 15 мин. Гранулы фага повторно суспендировали в 1,5 мл стерильном PBS, титровали и использовали в качестве входного фага для пэннинга. Для раунда пэннинга 1 96-луночные планшеты Maxisorp™ покрывали 10 мкг рекомбинантного IGF1R933-His на лунку в 100 мкл PBS в течение ночи при температуре 4°С. Лунки промывали PBS и блокировали PBS с 1% (масса/объем) казеином в течение 2 ч при температуре 37°С. Приблизительно 1012 фагов были добавлены в лунки после блокировки и инкубированы в течение 2 ч при 37°С. После 10-кратного промывания PBS/0,1% (об/об) Tween-20 связанные фаги элюировали с помощью 0,1 М триэтиламина, нейтрализовали (50 мкл 1М Трис-HCl, рН 7,4) и смешивали с экспоненциально растущей TG1 E.coli. Проводили титрование элюированного фага и инфицированные бактерии повторно инфицировали М13К07 и выращивали в течение ночи при 37°С. Очищенный фаг выращенной в течение ночи культуры использовали в качестве входного для следующе- 17 035480 го раунда пэннинга. Пэннинг продолжали еще в течение трех раундов. Использовали тот же самый протокол, как описано выше, за исключением того, что количество рекомбинантного антигена, использованного для покрытия чашек, было уменьшено до 7 мкг, 5 мкг и 5 мкг для второго, третьего и четвертого раундов пэннинга соответственно.
Отдельные колонии TG1, полученные после четвертого раунда пэннинга, были подвергнуты фаговому ELISA скринингу, по существу, как описано в другом документе (Doyle et al, 2008), за исключением того, что 5 мкг/мл IGF1R933-His рекомбинантного антигена использовали для покрытия микротитрационных планшетов. Все положительные клоны были направлены на секвенирование ДНК. Уникальные клоны, которые давали высокие фаговые ELISA сигналы, были выбраны для крупномасштабной экспрессии и очистки с использованием известных методов (пример 4). Клон с дублированным IGF1R-3 был идентифицирован для дальнейшего изучения; его последовательность показана ниже.
QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCEVSGGTVSPTAMGWFRQAPGKEREFVGHITWSR
GTTRVASSVKDRFTISRDSAKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCAASTFLRILPEESAYTY
WGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:5)
Пример 4. Гуманизация IGF1R-4.
Для того чтобы избежать потенциальной иммуногенности IGF1R-4, полученного от ламы, при применении в качестве переносчика терапевтических агентов через ГЭБ, полученные от верблюда sdAb были гуманизированы мутацией верблюжьих остатков в VHH. Следует отметить, что с целью гуманизации нумерацию по Kabat (Kabat et al, 1991) использовали для идентификации CDR остатков.
3D-моделирование структуры верблюжьих VHH. Матричные структуры, аналогичные IGF1R-4 VHH, были идентифицированы с помощью поиска BLAST в Protein Data Bank (PDB). 3D структура IGF1R-4 была аппроксимирована с помощью моделирования гомологии, основанного на 4KRP|B (код PDB | ID цепи) в качестве основной матрицы, с дополнительными данными от 4FHB|D. Структура IGF1R-4 VHH была затем построена путем введения мутации основной структуры матрицы последовательности IGF1R-4; это включало 35 мутаций в различных позициях. Модель IGF1R-4 VHH была затем усовершенствована путем энергетической минимизации с помощью AMBER силового поля и ступенчатого освобождения ограничений, начиная от CDR петель, которые были ослаблены в первую очередь, и до тяжелых атомов основной цепи каркасной области, которая была полностью расслаблена только на последней стадии. CDR-H3 петля модели VHH затем была доработана путем конформационной выборки МонтеКарло-минимизации (МСМ), в которой двугранные углы в CDR-H3 области отбирались с последующей минимизацией энергии.
Выбор каркаса человеческих тяжелых цепей для верблюжьей CDR. Каркас человеческой тяжелой цепи был выбран стандартным сравнением гомологии последовательностей в базах данных зародышевой линии человека (VBASE), в сравнении с другими базами данных последовательностей (GenBank и SwissProt), а также в сравнении с консенсусными человеческими каркасными последовательностями. Поиски BLAST были проведены, чтобы получить совпадения последовательностей с самой высокой гомологией только в каркасной области (т.е. исключая CDR), с сопоставлением длины CDR. Ближайшие человеческие каркасы, определенные для IGF1R-4 VHH, соответствовали человеческой VH-3 подгруппе. Несколько человеческих зародышевых каркасных VH-3 последовательностей, которые наиболее близки к IGF1R4 VHH, также были сохранены в дополнение к человеческой VH-3 консенсусной последовательности. В IGF1R-4 VHH каркасных последовательностях 18 мутаций необходимо для того, чтобы прийти к человеческой VH-3 консенсусной последовательности для 100% гуманизации каркаса.
Определение каркасных остатков для обратных мутаций. Модель IGF1R-4 VHH и ее полностью гуманизированный аналог характеризовались для оценки индекса человечности, индекса предрасположенности к контакту с антигеном, для определения CDR, канонических остатков, необычных каркасных остатков, потенциальных сайтов гликозилирования, скрытых остатков, остатков зоны Верньера, а также близости к CDR. Анализ этих данных позволил сконструировать несколько гуманизированных вариантов для анти-IGF1R VHH, причем каждый вариант имел различное количество обратных мутаций до родительских верблюжьих остатков в различных позициях. 6 гуманизированных вариантов были разработаны для IGF1R-4 VHH (IGF1R-4_H1 - IGF1R-4_H6), где варианты содержат до 10 обратных мутаций. Некоторые из этих верблюжьих остатков с обратными мутациями были скрыты внутри ядра домена VHH и, следовательно, не индуцировали иммунный ответ.
Пример 5. Экспрессия и очистка выбранных конструктов VHH.
IGF1R-4, определенные в примере 3, и гуманизированные варианты, сконструированные в примере 4 (совместно именуемые здесь VHH конструкты) субклонировали в экспрессирующие плазмиды для белковой экспрессии и очистки.
Очищали р фагмидный вектор, содержащий ДНК VHH IGF1R-4 клона, с использованием набора Miniprep (Qiagen). IGFIR-связывающий VHH IGF1R-4 был амплифицирован путем ПЦР из фагмидного вектора pMED1 с добавлением N-терминального сайта расщепления Bbsl и сайта расщепления BamHI на С-конце, с использованием праймеров:
- 18 035480
5’-TATGAAGACACCAGGCCCAGGTAAAGCTGGAGGAGTCT-3’ (прямой; SEQ
ID NO:23)
5’-TTGTTCGGATCCTGAGGAGACGGTGACCTG-3’ (обратный; SEQ ID NO:24)
ПЦР-фрагмент и экспрессионный вектор pSJF2H расщепляли рестриктазами Bbsl и BamHI (NEB) в соответствии с инструкциями изготовителя. После расщепления каждый расщепленный IGF1R-4 VHH фрагмент лигировали с расщепленным экспрессионным вектором pSJF2H с использованием способов, аналогичных тем, которые описаны у Arbabi-Ghahroudi et al. (2009b); Продукты лигирования были затем трансформированы в электрокомпетентные TG1 E.coli. Клоны были отобраны на LB-чашках с агаром + 100 мкг/мл ампициллина и верифицированы секвенированием ДНК.
Гуманизированные клоны были синтезированы и непосредственно клонированы в pSJF2H аналогично тому, как описано выше, и затем трансформированы в TG1 E.coli и отобраны, как описано выше.
Экспрессия белка. Все конструкты IGF1R-4 VHH экспрессировали в TG1 E.coli. Полученную в течение ночи культуру в LB/Amp/Glu среде (LB среде с добавлением 100 мкг/мл ампициллина и 1% глюкозы) пересевали при разведении 1:100 в 1 л LB/Amp/Glu. Экспрессию белка индуцировали при OD600 (оптическая плотность) 0,8-0,9 добавлением IPTG (изопропилтиогалактозид) до конечной концентрации 0,2 мМ. Культуру выращивали при 220 об/мин в течение ночи при температуре 37°С. Бактерии гранулировали центрифугированием при 6000 об/мин в течение 12 мин; гранулы повторно суспендировали в 35 мл холодного буфера TES (0,2М Трис-CI рН 8,0, 20% сахарозы, 0,5 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота)). Суспензию инкубировали на льду и встряхивали через каждые 10 мин в течение 1 ч. Затем добавляли 45 мл холодного TES (1/8 объема от общего объема) и немедленно встряхивали в течение 1 мин и в течение 15 с каждые 10 мин после этого в течение 1 ч для извлечения белка из периплазмы. Полученный супернатант, содержащий VHH, фильтровали через 0,22 мкм мембрану и диализировали в течение ночи посредством буфера А иммобилизационной металл-аффинной хроматографии (IMAC) (10 мМ HEPES (4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота) рН 7,0, 500 мМ NaCl). Белок очищали с использованием колонки HiTrap Chelating HP (GE Healthcare), как описано ранее (ArbabiGhahroudi 2009b). Элюированные белковые фракции анализировали с помощью SDS-PAGE и вестернблоттинга, прежде чем диализировали против PBS, как описано ранее (Arbabi-Ghahroudi 2009b). Очищенные белковые фракции объединяли и диализировали против PBS + 3 мМ ЭДТА и определяли концентрацию белка.
Пример 6. Биофизическая характеристика анти-IGF1R VHH IGF1R-4.
Анти-IGFIR VHH IGF1R-4 конструкты, экспрессированные и очищенные в примере 4, были охарактеризованы с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC), анализа температуры плавления и поверхностного плазмонного резонанса.
Эксклюзионная хроматография: эксклюзионная хроматография с использованием Superdex™ 75 (GE Healthcare) была проведена для устранения любых возможных агрегатов до начала анализа поверхностного плазмонного резонанса (SPR). В качестве рабочего буфера использовали 10 мМ HEPES, рН 7,4, содержащий 150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА и 0,005% Р20. Концентрации фракций, используемых для SPR анализа, определяли путем измерения оптической плотности при длине волны 280 нм. По результатом анализа SEC все IGF1R-4 VHH конструкты кроме Н1 были мономерными в расчете на элюирующий объем по сравнению со стандартами (фиг. 3А). IGF1R-4 Н1 был исключен из дальнейших оценок.
Температура плавления: термическую стабильность IGF1R-4 VHH и гуманизированных конструктов оценивали с использованием измерения температуры плавления (Tm) с помощью CD-спектроскопии. Спектрополяриметр Jasco J-815, оснащенный термоэлектрической системой контроля температуры типа Peltier (Jasco, Easton, MD, USA), был использован для проведения экспериментов. Использовалась CDкювета с длиной пути 1 мм. Спектры регистрировали в диапазоне длин волн от 180 до 260 нм со скоростью сканирования 50 нм/мин, цифровое время интегрирования (DIT) 4 с, ширина полосы 1 нм, шаг данных 1 нм и время интегрирования 1 с. Для измерения температуры плавления или Tm (Greenfield, 2006a; 2006b) спектры CD были записаны в температурном диапазоне от 30 до 96°С. Все спектры CD были вычтены из бланкового значения, соответствующего спектрам буфера. Измерения проводились с концентрацией 50 мкг/мл VHH в 100 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 7,4. Денатурацию белка, вызванную нагреванием, контролировали при 210 нм для всех вариантов. Фракция фолдинга (ff) была получена по формуле, описанной в (Greenfield, 2006a; 2006b)
1Τ=([θ]τ-[θ]υ)/([θ]Ε-[θ]υ) формула I где [©Η представляет собой молярную эллиптичность при любой температуре, представляет собой молярную эллиптичность полностью уложенного белка при температуре 30°С и
[θ]υ представляет собой молярную эллиптичность развернутого белка при 90°С.
Температуру плавления (Tm) получали в средней точке кривой развертывания (фракция фолдинга (ff) в зависимости от температуры) с помощью подбора кривой нелинейной регрессии (сигмовидное уравнение Больцмана) с использованием графического программного обеспечения GraphPad Prism (вер- 19 035480 сия 4.02 для Windows). Температуры плавления (Tm) VHH были определены на основе данных эллиптичности, предполагающих два состояния системы, что находится в соответствии с наблюдаемыми кривыми денатурации, соответствующими резкому переходу к денатурации. Значения Tm были взяты в средней точке сигмоидальных кривых денатурации фракции фолдинга (ff) в зависимости от температуры.
Результаты показаны на фиг. 3В. Температуры плавления гуманизированных VHH Н3, Н4 и Н5 были улучшены (повышены) по сравнению с IGF1R-4 VHH, что предполагает улучшенные биофизические свойства. Гуманизированные конструкты Н2 и Н6 имели более низкую температуру плавления по сравнению с IGF1R-4 VHH. В отличие от IGF1R-4 VHH ни один из гуманизированных VHH не подвергся рефолдингу после теплового воздействия.
Поверхностный плазмонный резонанс (SPR): связывание мономерных IGF1R-4 VHH конструктов с иммобилизованным рекомбинантным человеческим IGF1R (пример 1) определяли с помощью SPR с использованием BIACORE 3000 (GE Healthcare). Около 3000 резонансных единиц (RU) рекомбинантного человеческого IGF1R иммобилизовали на сенсорном чипе СМ5. Иммобилизацию проводили при концентрации 10 мкг/мл в 10 мМ ацетате при рН 4,0 с использованием набора для связывания амина, поставляемого изготовителем. Оставшиеся сайты связывания блокировали с помощью 1 М этаноламина с рН 8,5. Блокированная этаноламином поверхность была использована в качестве референсной поверхности. Для исследований связывания анализы проводились при 25°С в 10 мМ HEPES, рН 7,4, содержащем 150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА и 0,005% поверхностно-активное вещество Р20 (полиоксиэтиленсорбитан; GE Healthcare). Различные концентрации IGF1R-4 VHH вводили через иммобилизованный человеческий IGF1R и референсные поверхности при скорости потока 20 мкл/мин. Поверхность регенерировали 10 мМ глицином, рН 2,0, со временем контакта 24 с. Данные были проанализированы с помощью программного обеспечения BIAevaluation 4.1 (GE Healthcare). Сенсограммы на фиг 3С показывают, что данные соотносятся с моделью 1:1, что дает KD и скорости диссоциации, показанные в табл. 1. Это указывает на то, что IGF1R-4 и гуманизированные варианты являются высокоаффинными однодоменными антителами, связывающимися с внеклеточным доменом человеческого IGF1R.
Таблица 1. Аффинность IGF1R-4 конструктов к человеческому IGF1R, определенная посредством SPR
Kd(hM) kd(c1)
IGF1R-4 0,32 2,9 х 10’4
IGF1R-4 Н2 1,07 6,1 х10'3
IGF1R-4 НЗ 0,39 3,4x10'4
IGF1R-4 Н4 0,45 3,9x10'4
IGF1R-4 Н5 0,52 4,6 х 10'4
IGF1R-4 Н6 0,52 3,8 х 10’4
Анализы SPR были в дальнейшем использован для демонстрации того, что IGF1R-4 VHH не связывается с тем же эпитопом на рецепторе, что и природный лиганд IGF-1 (фиг. 3D). Эксперимент планировали, проводили и анализировали, как описано выше. Связывание с поверхностью свежеиммобилизованного человеческого IGF1R изучалось путем инъекции человеческого лиганда IGF1 при концентрации 25xKD с последующей совместной инъекцией IGF1R-4 при концентрациях 25xKD при скорости потока 20 мкл/мин и временем инъекции 5 мин. Поверхности регенерировали промывкой рабочим буфером. Природный лиганд IGF1 связывал рецептор с насыщением, достигающим 70RU; IGF1R-4 VHH связывался с комплексом IGF1R - IGF1 с ожидаемым -265RU (в относительных единицах; насыщение связывания). Одновременное связывание IGF1R-4 VHH И IGF1 с рецептором показывает, что они оба связываются с различными эпитопами.
Перекрестную реактивность связывания IGF1R-4 с человеческим инсулиновым рецептором также оценивали с помощью SPR. Эксперимент планировали, проводили и анализировали, как описано выше. Вкратце, кроме человеческого IGF1R, приблизительно 4000 резонансных единиц (RU) рекомбинантного человеческого инсулинового рецептора (R & D Systems) иммобилизовали на отдельной клетке на сенсорном чипе СМ5. Поверхности обрабатывали различными концентрациями IGF1R-4 (0,5-50нМ). В то время как связывание с IGF1R можно было наблюдать уже при 0,5нМ IGF1R-4, связывания с поверхностью инсулинового рецептора не наблюдалось даже при 50 нМ (фиг. 3Е), что предполагает, что IGF1R-4 не может связываться с инсулиновым рецептором.
Пример 7. Поглощение IGF1R-4 эндотелиальными клетками головного мозга.
Для того, чтобы определить, поглощается ли IGF1R-4 клетками, клетки svARBEC инкубировали с Су5-5-меченным IGF1R-4.
IGF1 R-4 VHH метили NHS-Cy5.5. Мечение проводилось через устойчивую аминную связь между первичными аминами (на N-конце и/или на лизиновых боковых цепях белка) и NHS сложного эфира. Как правило, 10% об/об 1М карбонатного/бикарбонатного буфера (759 мМ бикарбоната, 258 мМ карбоната) рН 9,3 добавляли в 4 мг VHH, приготовленного в PBS (1,06 мМ KH2PO4, 154 мМ NaCl, 5,6 мМ Na2HPO4),
- 20 035480 рН 7,4, и доводили до конечной концентрации 4 мг/мл. NHS-Cy5.5, растворенный в DMSO (диметилсульфоксид) при 10 мг/мл, добавляли при 2Х мольном соотношении красителя к белку. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч с несколькими инверсиями в 1,5 мл микроцентрифужной трубке. После инкубации несвязанный краситель и би-продукты реакции фильтровали с помощью обессоливающих колонок для центрифугирования Zeba, 7K MWCO (Pierce) и измеряли с помощью спектрофотометра Beckman DU530 (компании Beckman Coulter). Су5.5-меченные IGF1R-4 или FC5 в качестве положительного контроля (1 мг/мл) инкубировали с SV40 иммортализованными эндотелиальными клетками мозга крысы (svARBEC) при 4°С (фиг. 4, верхние блоки), что позволяло протекать только пассивному, неспецифическому транспортному механизму, или при температуре 37°С (фиг. 4, нижние блоки) для протекания активного транспорта, такого как рецепторно-опосредованный эндоцитоз. Совместное окрашивание агглютинином зародышей пшеницы и DAPI проводили для визуализации поверхности клетки и ядра соответственно. Клетки наблюдали под флуоресцентным микроскопом и получали изображения.
В случае инкубации при 4°С IGF1R-4 был обнаружен вне клеток, совместно локализующийся с клеточной мембраной, окрашенной агглютинином зародышей пшеницы. В противоположность этому при инкубации при 37°С IGF1R-4 накапливался в везикулах внутри клеток, вероятно эндосомах, что предполагает, что поглощение антител клетками происходит путем активного транспортного механизма. Подобное поведение наблюдалось и для FC5, для которого ранее было показано, что он попадает в клетки с помощью энергозависимого эндоцитоза с помощью везикул с клатриновым покрытием (Abulrob ye al.2005).
Пример 8. Получение IGF1R-4-mFc конструкта.
Конструкты, содержащие IGF1R-4 VHH, слитые с кристализуемым фрагментом мышиного антитела (Fc; mFc2b), получали, экспрессировали и выделяли. Последовательность IGF1R-4-mFc конструкта показана на фиг. 5А, схема молекулы показана на фиг. 5В. Слитый белок также содержал N-терминальный сигнальный пептид (MEFGLSWVFLVAILKGVQC; SEQ ID NO: 37), который не показан в последовательности на фиг. 5 А.
IGF1R-4 кДНК клонировали в экспрессионный вектор млекопитающих рТТ5 (Durocher, 2002), содержащий мышиный фрагмент Fc2b. Полиплексы полученного вектора были предварительно получены смешиванием 25 мл раствора плазмидной ДНК, содержащего 187,5 мкг pTT5-IR5mFc2b, 56,25 мкг рТТAKTdd (активированный мутант протеинкиназы В), 18,75 мкг pTTo-GFP (для контроля эффективности трансфекции) и 112,5 мкг ДНК яичек лосося (Sigma-Aldrich); и 25 мл раствора PEI (полиэтиленимин), содержащего 1,125 мг PEIproTM (PolyPlus Transfection), оба сделаны в F17 среде. Смесь инкубировали в течение 10 мин перед добавлением к культуре клеток. 450 мл культуры клеток СНО, стабильно экспрессирующих усеченный белок EBNA1 (СНО-3Е7), выращенных в среде F17 (Invitrogen), трансфицировали с 50 мл полиплексов. Через 24 ч после трансфекции в культуру добавляли 12,5 мл 40% (масса/объем) раствора триптона N1 (Organotechnie) и 1,25 мл 200 мМ раствора вальпроевой кислоты. Культуру собирали через 8 суток после трансфекции и очищали центрифугированием. Очищенную среду фильтровали через 0,22 мкм мембрану перед нанесением на колонку, заполненную 5 мл смолы протеина-А MabSelect SuRe (GE Healthcare). После загрузки колонку промывали 5 объемами натрий-фосфатного буфера рН 7,1 (PBS) и антитела элюировали 100 мМ буфером с цитратом натрия рН 3,0. Фракции, содержащие элюированные антитела, объединяли и смену буфера осуществляли путем загрузки на обессоливающую колонку Econo-Pac (BioRad), калиброванную в PBS. Обессоленные антитела затем стерильно фильтровали при пропускании через Millex GP (Millipore) фильтр (0,22 мкм) и аликвотировали.
Пример 9. Транспорт IGF1R-4 через модель гематоэнцефалического барьера in vitro.
Для того чтобы оценить, проходит ли IGF1R-4 VHH, его гуманизированные версии (Н2-Н6) и IGF1R-4-mFc (пример 8) через гематоэнцефалический барьер, был проведен анализ in vitro, как описано ниже. Блок-схема эксперимента показана на фиг. 6А.
SV40-иммортализованные эндотелиалыные клетки мозга взрослой крысы (Sv-ARBEC) были использованы для создания модели гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) in vitro, как описано ранее (Garberg et al., 2005; Haqqani et al., 2012). Sv-ARBEC (80000 клеток/мембрану) высевали на 0,1 мг/мл вставки культуры ткани, покрытые коллагеном типа I хвоста крыс (размер пор - 1 мкм; площадь поверхности 0,9 см2, Falcon) в 1 мл среды роста. Нижняя камера узла вставки содержала 2 мл среды роста, дополненной кондиционированной средой иммортализованных неонатальных крысиных астроцитов в соотношении 1:1 (об/об). Эквимолярные количества (5,6 мкм) положительных (FC5) или отрицательных контролей (А20.1, Clostridium difficile токсин А связывающий VHH; и EG2, EGFR связывающий VHH), IGF1R-4 VHH, гуманизированные версии (Н2-Н6) или IGF1R-4-mFc тестировали на их способность проникать через эту крысиную модель ГЭБ in vitro. После экспозиции эквимолярных количеств sdAb на люминальной стороне ГЭБ, через 15, 30 и 60 мин с аблюминальной стороны были взяты образцы. Содержание sdAb в каждом образце затем количественно оценивали с помощью масс-спектрометрии (MRM - ILIS), как описано у Haqqani et al.(2012)) (см. описание метода ниже).
Определение коэффициента эффективной проницаемости: количественные значения могут быть
- 21 035480 непосредственно нанесены или значения Рарр (коэффициент эффективной проницаемости) могут быть определены по заданной формуле (фиг. 6А) и нанесены на график. Значение Рарр обычно используется для определения способности молекулы к прохождению гематоэнцефалического барьера. [Qr/dt = общая сумма в приемном отделении в зависимости от времени; А = площадь монослоя клеток; СО = начальная концентрация дозированного раствора], значения Рарр являются мерой удельной проницаемости соединения через эндотелиальный монослой мозга.
Результаты показаны на фиг. 6B-D. Приведенные результаты являются средними значениями Рарр, полученными из нескольких независимых экспериментов. Оба отрицательных контроля имеют очень низкое значение Рарр, указывая, что неспецифический транспорт или парацеллюлярный перенос этих VHH через модель ГЭБ минимальны. IGF1R-4 VHH имеет высокое значение Рарр, что указывает на высокую скорость переноса в in vitro модели ГЭБ. Рарр для IGF1R-4 VHH был в 4 раза выше, чем у положительного контроля - ГЭБ-проницаемого VHH FC5 (WO 02/057445). Результаты показывают, что IGF1R-4 подвергается облегченному межклеточному транспорту через эндотелиальные клетки мозга in vitro и может иметь аналогичные свойства in vivo. Гуманизированные IGF1R-4 VHH варианты Н3, Н4 и Н5 показали схожие (Н3) или слегка пониженные значения Рарр по сравнению с IGF1R-4 VHH; H2 вариант демонстрировал значительное снижение способности проходить ГЭБ модель in vitro, тогда как Н6 варианты полностью потеряли эту способность, демонстрируя значение Рарр как у внутреннего контроля VHH A20.1 (фиг. 6С), и были исключены из дальнейших исследований. Значение Papp для IGF1R-4mFc (фиг. 6D) было схоже с пониженным в 6 раз значением IGF1R-4 VHH (фиг. 6В), свидетельствуя о том, что IGF1R-4 может переносить большие (размером с антитело) молекулы через ГЭБ. Значение Рарр положительного контроля FC5mFc было в 3 раза ниже, чем значение для IGF1R-4 mFc. Стоит отметить, что конструкты, содержащие IGF1R-5 или гуманизированную версию, связанные с карго-молекулой (молекулярная масса ~ 110 кДа или 180 кДа), также пересекали ГЭБ (данные не показаны).
Абсолютное определение количества VHH с использованием способа MRM - ILIS. Эти способы описаны у Haqqani et al. (2012). Вкратце, для проведения SRM (мониторинга селективных реакций, также известного как мониторинг множественных реакций (MRM)) анализа VHH каждый VHH сначала анализировали с помощью nanoLC-MS/MS с использованием зависимого от данных сбора для идентификации всех ионизируемых пептидов. Для каждого пептида были выбраны от 3 до 5 наиболее интенсивных ионных фрагментов. Первоначальный анализ SRM проводили для мониторинга этих фрагментов в аттомольных количествах расщепления (около 100-300 амоль). Фрагменты, которые показали соотношения интенсивности при низких количествах (т.е. имели r2>0,95 по Пирсону по сравнению с более высокими количествами), считались стабильными и были выбраны для конечного анализа SRM. Для дальнейшей оптимизации анализа время элюирования для каждого пептида было также включено, причем пептиды, которые имели близкие m/z (отношение массы к заряду) и время элюирования, не выбирали.
Типичный мультиплексированный анализ SRM VHH в клеточных средах или биологических жидкостях (сыворотке или спинномозговой жидкости (СМЖ)) включал в себя впрыскивание известного количества ILIS (инъекция инсулина лизпро) (0,1-10 нМ) с последующей инъекцией 100-400 нг СМЖ или белков культуральной среды (0,3-1 мкл) или около 50-100 нг сывороточных белков (1-3 нл) в систему nanoLC-MS. Предшественник m/z каждого целевого пептидного иона был выбран из ионной ловушки (а остальные несвязанные ионы были отброшены) в указанное для мишени время элюирования, с последующей индуцированной столкновениями диссоциацией (CID) фрагментацией и выбором только нужных ионных фрагментов в ионной ловушке для мониторинга с помощью детектора. Для количественного анализа необработанные файлы, созданные LTQ (ThermoFisher), преобразовывали встандартный формат данных масс-спектрометрии mzXML и интенсивности извлекали с помощью программного обеспечения Q-MRM (Quantitative-MRM; see Haqqani et al. 2012), которое является модифицированной версией программного обеспечения MatchRx. Для каждого VHH извлеченные ионные хроматограммы генерировали для каждого из его ионных фрагментов, которые состояли из объединенных интенсивностей в пределах 0,25 Да фрагмента m/z в течение всего времени элюирования. Для того чтобы получить окончательное значение интенсивности для каждого фрагмента, были суммированы все интенсивности в течение 0,5 мин ожидаемого времени удерживания. VHH был определен как обнаруживаемый в образце, если фрагменты по меньшей мере одного из его пептидов показали ожидаемые соотношения интенсивности, т.е. конечные значения интенсивности показали сильную корреляцию Пирсона r>0.95 и р менее 0,05 по сравнению с конечными значениями интенсивностей соответствующего чистого VHH.
Образцы, содержащие смеси VHH (среда, сыворотка, СМЖ), восстанавливали, алкилировали и расщепляли трипсином, как описано ранее (Haqqani et al., 2012; Gergov et al., 2003). Продукты расщепления (триптические пептиды) подкисляли уксусной кислотой (конечная концентрация 5%) и анализировали на обратно-фазовом nanoAcquity UPLC (сверхэффективный жидкостный хроматограф) (Waters, Milford, MA) в сочетании с масс-спектрометром LTQ XL ETD или LTQ Orbitrap ETD (ThermoFisher, Waltham, MA). Нужные аликвоты образца инъецировали и загружали в 300 мкм I.D. * 0,5 мм 3 мкм PepMaps C18 ловушку (ThermoFisher), затем элюировали на 100 мкм I.D. * 10 см 1:07 мкм ВЕН130С18 nanoLC колонке (Waters) с использованием градиента 0-20% ацетонитрила (в 0,1% формиате) в течение 1 мин, 20-46% в
- 22 035480 мин и 46-95% в течение 1 мин при скорости потока 400 нл/мин. Элюированные пептиды ионизировали в масс-спектрометре с ионизацией электрораспылением (ESI) для MS/MS и SRM анализов с использованием CID для фрагментации пептидных ионов. CID проводили с гелием в качестве газа столкновения при нормированной энергии столкновения 35% и 30 мс временем активации. Время ионной инъекции в линейную ионную ловушки было скорректировано с помощью инструмента с целевым значением автоматического контроля усиления (AGC) 6х103 и максимальным временем аккумуляции 200 мс.
Эти VHH-специфические пептиды, используемые для детектирования и количественного определения каждого VHH в мультиплексном анализе, приведены в табл. 2.
Таблица 2. Пептиды, используемые при nanoLC-SRM детектировании FC5, FC5-ILIS, EG2, А20.1, IGF-1R-5 и альбумина, (а) в различных описанных исследованиях анализы были мультиплексированы в различных комбинациях для одновременного наблюдения в одном и том же образце; (b) тяжеломеченный пептид; (с) пределы детектирования и количественного определения SRM для каждого пептида составляли 1,5-2,5 нг/мл. 1 нг/мл соответствует приблизительно 60-70 пМ VHH . A20-1, как описано у in Hussack et al, 2011 b; EG2 как описано у Iqbal et al, 2010.
Белбк Сигнатуры SEQ ID NO: Уникальный
IGF1R-4 EFVGH1TWSR 25 Да
LSCEVSGGTVSPTAMGWFR 26 Да
FC5 ITWGGDNTFYSNSVK 27 Да
FC5-ILIS ITWGGDNTFYSNSVK(b| 27 Да
TTYYADSVK 23 Да
А20.1 EFVAAGSSTGR 29 Да
TFSMDPMAWFR 30 Да
DEYAYWGQGTQVTVSSGOAGQGSEQK 31 Да
DFSDYVMGWFR 32 Да
EG2 LEESGGGLVQAGDSLR 33 Да
NMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAVNSAGVrVSPR 34 Да
Альбумин APQVSTPTLVEAAR 35 Да
Пример 10. In vivo и ex-vivo оптическая визуализация.
Для определения того, накапливается ли IGF1R-4 VHH в мозге после внутривенного (iv) введения, IGF1R-4 VHH и отрицательный контроль А20.1 VHH конъюгировали с флуоресцентным индикатором ближней инфракрасной области Су5.5 и очищали как описано в примере 7. 2,5 мг/кг IGF1R-Cy5.5 или А20.1 Су5.5 (в 150 мкл объеме) вводили в хвостовую вену CD-1 голых мышей, и живых животных исследовали в положении лежа на преклиническом визуализаторе eXplore Optix MX2 (Advanced Research Technologies, QC) через 30 мин после инъекции. Через час после инъекций животные были анестезированы 2% изофлураном (Baxter Canada, Mississauga, ON, Canada), была проведена сердечная пункция и 10 мл физиологического раствора (Baxter Canada, Mississauga, ON, Canada), дополненного 1 EU/мл гепарина (Organon, Toronto, ON, Canada), перфузировали из той же иглы со скоростью 2 мл/мин для удаления крови (что было установлено появлением жидкости, свободной от крови, на месте разреза правого желудочка). Мозг после перфузии удаляли и визуализировали ех-vivo с использованием eXplore Optix. Протоколы визуализации подробно описаны в lqbal et al.,2011.
Результаты показаны на фиг 7. Мыши, которым вводили Cy5.5-IGF1R-4, показали повышенный оптический сигнал в области головы in vivo (верхние блоки, стрелка) и ex-vivo в мозге после перфузии (нижние блоки, стрелки), в то время как Су5.5-А20.1-инъецированные мыши показали только низкий фоновый сигнал. Эти данные свидетельствуют о том, что IGF1R-4 VHH может доставлять визуализирующее средство (Су5.5, 1 кДа) через гематоэнцефалический барьер in vivo.
Пример 11. Конъюгация IGF1R-4 с галанином.
Для того чтобы определить, способен ли IGF1R-4 VHH пересекать гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) в in vivo и 'переносить' через ГЭБ молекулу, которая не может пересечь ГЭБ самостоятельно, нейропептид Галанин был химически конъюгирован с IGF1R-4 VHH или с IGF1R-4-mFc и системно введен. Галанин является нейроактивным пептидом, который производит обезболивающее действие путем связывания GalR1 и GalR2, экспрессируемых в ткани головного мозга. При периферическом введении галанин не имеет обезболивающего действия, поскольку он не может пересечь ГЭБ сам по себе (Robertson et al., 2011).
IGF1R-4 VHH был конъюгирован с фрагментом крысиного Галанина (Gal) с модифицированным цистеамидом С-концом (Biomatic) (GWTLNSAGYLLGPHAIDN HRSFSDKHGLT-цистеамид, SEQ ID NO: 36). Схема конъюгации показана на фиг. 8А.
Вкратце, 5 мг IGF1R-4 VHH (пример 4) в 0,5Х PBS, 2,5 мМ ЭДТА при [2 мг / мл] смешивали с 436,4 мкл 2,5 мг/мл сульфосукцинимидил-4-(№малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (сульфо-SMCC) (7,5х избыточное мольное отношение). Затем смесь продували газообразным азотом и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре (RT) для реагирования эфирного NHS остатка сульфо-SMCC с аминогруппами VHH. Впоследствии непрореагировавший сульфо-SMCC был удален из активированного малеимидом IGF1R-4 VHH с использованием 10 мл колонки 7К Zeba (Pierce). До загрузки образца ко- 23 035480 лонку промывали 3 раза 5 мл PBS и центрифугировали при 1000 g в течение 2 мин. После загрузки образца колонку заполняли 200 мкл PBS и центрифугировали в течение 2 мин при 1000 д. Что касается конструктов IGFIR-Fc, 5 мг подвергали взаимодействию с ~ 68 мкл сульфо-SMCC (6,5х избыточное мольное отношение) таким же образом, как описано выше.
Отдельно и одновременно Г аланин с модифицированным цистеамидом С-концом (Gal-cya) получали путем растворения 10 мг лиофилизированного порошка в 10 мл воды без эндотоксинов, чтобы получить 1 мг/мл маточный раствор (порошок Gal-cya содержал небольшое количество DTT (дитиотриетол) для предотвращения образования дисульфидных мостиков во время очистки). Наконец, добавляли 100 мкл 0,5 М ЭДТА (конечная концентрация 5 мМ).
Очищенные активированные малеимидом IGF1R-4 VHH и IGF1R-4-Fc констуркты (2,6 мл) разбавляли до 5 мл 0,5Х PBS, 2,5 мМ ЭДТА, а затем 5 мл или 1 мл Gal-cya, соответственно, был добавлен во время вортексирования. Образцы продували азотом, герметизировали и инкубировали в течение ночи при температуре 4°С. На следующий день непрореагировавший Gal-cya был удален с помощью колонок Amicon-15 10K и 30К (Millipore) соответственно. Образец добавляли в колонку и центрифугировали при 4000 g в течение 7 мин до тех пор, пока объем не был уменьшен до 5 мл. 5 мл 0,5Х PBS, 2,5 мМ ЭДТА добавляли к оставшимся 5 мл образца во вставке колонки и центрифугировали снова, пока объем образца не был уменьшен до 4 мл. Затем конъюгированные образцы добавляли в 10 мл колонку 7К Zeba (Pierce), приготовленную, как описано выше, а затем центрифугировали в течение 2 мин при 1000 g.
Конъюгированные образцы IGF1R-4-Gal и IGF1 R-4-Fc-Gal затем прогоняли в 16% или 10% SDSPAGE невосстанавливающем геле и окрашивали серебром, чтобы подтвердить изменения молекулярной массы после конъюгации. Реакцию титровали до достижения соотношения ~ от 1 до 2 молекул Г аланина на VHH или IGF1R-Fc конструкты. Результаты подтверждали присоединение Галанина к IGF1R-4 VHH (см. фиг. 8 В).
Удаление эндотоксина и определение уровней эндотоксина: эндотоксины были удалены с помощью Amicon Ultra колонок для центрифугирования с целлюлозной мембраной (Millipore), отсекающих молекулярную массу (MWCO). В первую очередь 15 мл образца VHH пропускали через колонку Amicon-1550K MWCO центрифугированием при 4000 g в течение 10 мин; элюировали и собирали. Этот продукт элюирования затем добавляли в колонку Amicon-15-10K MWCO и центрифугировали при 4000 g 7-10 минут, что приводило к уменьшению объема супернатанта с 15 до 7,5 мл. Объем супернатанта в колонке регулировали обратно до 15 мл, добавляя PBS. Колонку центрифугировали снова, как описано выше. Супернатант собирали и уровни эндотоксина измеряли системой EndoSafe-PTS с использованием картриджей с диапазоном чувствительности 10-0,1 EU/мл (единиц эндотоксина на единицу) (Charles River Laboratories International). 25 мкл образца загружали в каждую из 4 лунок на картридже и разбавляли при необходимости. Только образцы с EU менее 1 на 1 мг были использованы для исследований на животных.
Пример 12. Транспорт IGF1R-4-Gal с использованием модели Харгривса.
Для того, чтобы оценить, переносится ли IGF1R-4-Gal или IGF1R-4-mFc-Gal (пример 11) через гематоэнцефалический барьер, был использован ранее описанный в международной патентной публикации WO 2011/127580 анализ in vivo.
Была использована крысиная модель воспалительной гиперальгезии, схожая с описанной у Hargreaves et al. (1988). Животных содержали в группах по три (модель Харгривса) в полипропиленовой клетке и предоставляли свободный доступ к пище и воде. Эксперименты проводились в 12 ч светотемновом цикле при температуре 24°С и относительной влажности 50±5%. Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и находились в соответствии с руководствами Канадского совета по уходу за животными.
В этой модели самцам крыс линии Winstar 6-8 недельного возраста (диапазон веса 230-250 г) вводили небольшие объемы (100 мкл иглой 30-го калибра) адъюванта Фройнда (CFA, убитые нагреванием М. tuberculosis (Sigma), суспендированные в эмульсии масло:физиологический раствор 1:1) в правую заднюю лапу под неглубокой изофлурановой анестезией (3%). CFA индуцировал высвобождение провоспалительных веществ, которые активировали ноцирецепторы и создавали состояние хронической боли и гиперальгезию (повышенная чувствительности к вредному теплу). Задержку отдергивания лапы измеряли с помощью применения теплового раздражителя на плантарной поверхности обеих задних лап (воспаленная и невоспаленная контрольная лапа), используя плантарное устройство Анальгезиометр для стимуляции лапы (IITC Model # 336TG Life Science, Inc.). Время, затраченное животным на ответное облизывание или встряхивание лапы, было интерпретировано как положительный ответ (Задержка отдергивания лапы). Интенсивность света лампы была скорректирована, чтобы выявить базовые задержки отдергивания лапы от 17 до 20 с в обеих задних лапах перед введением CFA. Если ответ не происходил в течение 20 с, световой луч автоматически выключался во избежание повреждения тканей и лапе присваивался максимальный балл.
Через два дня после инъекции CFA и до введения соединений животных акклиматизировали в устройстве анальгезиометра в течение по меньшей мере 60 мин с целью уменьшения стресса и предотвра- 24 035480 щения ложных положительных ответов. Базовые условия были измерены в обеих лапах, чтобы проверить развитую боль (тепловая гиперальгезия); невоспаленная лапа была использована в качестве контроля в сравнении с инъецированной лапой. Животные с задержкой отдергивания лапы более чем 6 с для воспаленной лапы и менее чем 17 с для нормальной лапы, были исключены из эксперимента.
Для того, чтобы определить, переносится ли IGF1R-4-Gal через гематоэнцефалический барьер и может ли связываться с рецепторами-мишенями (GalR1 и 2) в паренхиме головного мозга, крысы получали одну инъекцию в хвостовую вену IGF1R-4-Галанина (3 мг/кг) или IGF1R-4-mPc-Галанина (2 мг/кг или 5 мг/кг) или контрольного соединения через три дня после инъекции CFA. Задержку отдергивания лапы (PWL) тестировали для каждой задней лапы (воспаленных и невоспаленных) каждые 15 мин в течение 3 ч. Увеличение задержки отдергивания лапы указывало на успешную индукцию анальгезии, которая может быть достигнута только путем успешной доставки Галанина в паренхиму головного мозга с помощью IGF1R-4. Галанин может вызвать анальгезию, только когда присутствует в паренхиме головного мозга и сам по себе не может пересечь неповрежденный ГЭБ (Robertson et al., 2011).
Результаты были проанализированы как временные динамики задержек отдергивания лапы (PWL, с) в зависимости от времени (мин или ч) (фиг. 9А и С). Фиг. 9В показывает те же результаты в виде площади под кривой (AUC) и сравнивает их с % от максимально возможного эффекта (% МРЕ). Фиг. 9D показывает результаты в виде процента ингибирования (тепловой гиперальгезии) на пике ответа (Emax).
Результаты показывают, что внутривенное введение Галанина не уменьшало боль по сравнению с PBS. В отличие от этого, одна инъекция FC5-Gal или IGF1R4-Gal производила измеримый анальгетический эффект, давая основание полагать, что VHH переносил Галанин через ГЭБ для создания анальгетического воздействия путем связывания с GalR1 и/или 2 в паренхиме головного мозга. Эффект IGF1R-4Галанина является дозозависимым и значительно более выраженным, чем эффект, индуцированный FC5Gal, что дает основание полагать, что рецептор IGF1R имеет более высокую скорость ГЭБ транспорта, чем предполагаемый FC5 рецептор. Результаты показывают, что IGF1R-3 VHH может переносить молекулы по меньшей мере 3000 Да через ГЭБ с использованием пути рецепторно-опосредованного трансцитоза (комбинированная MW конъюгата антитело-пептид составляет около 18 кДа). Активный рецепторно-опосредованный транспорт необходим, так как известно, что ГЭБ предотвращает прохождение всех гидрофильных молекул больше 0,5 кДа. Аналогично, IGF1R4-mFc-Галанин производит дозозависимое подавление тепловой гиперальгезии, тогда как А20.1-mFc-Галанин является неэффективным. Это дает основание полагать, что IGF1R-4 VHH может переносить молекулы, схожие по размеру с антителами (около 80 кДа) через ГЭБ. IGF1R4-mFc-Галанин был примерно в 5 раз более активен в подавлении тепловой гиперальгезии, чем IGF1R4-Галанин, что указывает на то, что бивалентное отображение и увеличенный период полувыведения из плазмы приводят к улучшенной эффективности доставки в мозг.
Пример 13. Уровни IGF1R-4 в СМЖ и плазме.
Анализ in vivo проводили, чтобы определить, способен ли IGF1R-4-mFc проходить в мозг и в частности в спинномозговую жидкость (СМЖ), а также для количественного определения присутствия в СМЖ и сыворотке.
Животных содержали поодиночке в полипропиленовых клетках и давали свободный доступ к пище и воде. Эксперименты проводились в 12-часовом свето-темновом цикле при температуре 24°С и относительной влажности 50±5%. Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и находились в соответствии с руководствами Канадского совета по уходу за животными.
Использовали самцов крыс линии Wistar 8-10-недельного возраста (диапазон веса 230-250 г). Для получения образца СМЖ мех в области шеи и головы животных выбривали и затем их помещали в камеру из плексигласа и умеренно анестезировали 3% изофлураном; СМЖ была собрана по существу как описано у Nirogi et al (2009). Анестезированных крыс помещали в установку с металлическим каркасом (любезно предоставленную доктором Vinicio Granados-Soto; CINVESTAV, Мексика) и иммобилизовали с использованием ручек для ушей. Положение головы животного поддерживали наклоненным под углом примерно 45°. Поверхность в виде ромба между затылочным бугром и шейным позвонком была сделана видимой путем протирания ватой, пропитанной этанолом (75%), по этой поверхности. 27G игла, покрытая ПЭ-10 трубкой (Becton Dickinson, Mississauga, ON, Canada) 10 см в длину и соединенная со 100 см3 инсулиновым шприцем, была вставлена горизонтально и по центру в мостомозжечковую цистерну для сбора СМЖ без надреза. Две точки сопротивления (щелчки) вдоль пути иглы можно легко ощутить из-за разрыва кожи и разрыхления атланто-затылочной мембраны. Когда игла проходила вторую точку сопротивления, СМЖ собирали (40-100 мкл) через иглу, применяя осторожное всасывание инсулиновым шприцем. После отбора образцов СМЖ соответствующую кровь собирали пункцией сердца после торакотомии и помещали в вакуумные контейнеры-пробирки (Becton Dickinson, Mississauga, ON, Canada) с активатором сгустков и гелем, а затем центрифугировали при 3,000 g в течение 15 мин. Сыворотка была удалена с помощью микропипетки и образец быстро замораживали до -80°С до дальнейшего анализа.
Образцы сыворотки и образцы СМЖ анализировали с помощью масс-спектрометрии и на основе количественной оценки nanoLC-SRM, как описано в примере 9.
- 25 035480
Сбор СМЖ является деликатной процедурой, во время которой СМЖ может легко загрязниться кровью. Так как количества VHH, как ожидается, будут значительно меньше в спинномозговой жидкости (менее 0,1%), чем в крови, даже незначительное загрязнение кровью может поставить под угрозу ценность отдельного образца СМЖ. В связи с этим необходимо было разработать строгие критерии исключения образцов СМЖ, загрязненных кровью. Для оценки соотношения альбумина в крови-СМЖ метод nanoLC-SRM был разработан для количественного определения уровня альбумина в плазме крови и спинномозговой жидкости. Пептид альбумин APQVSTPTLVEAAR (SEQ ID NO: 37) был выбран на основании своего уникального времени удерживания и значения m/z (Mol Pharm) для достижения минимальной интерференции с другими пиками пептидов в мультиплексном анализе. Интенсивность пептида определяли количественно в обоих образцах СМЖ и плазмы с использованием SRM анализа, как описано выше. Соотношение альбумина рассчитывалось следующим образом для каждой крысы:
Соотношение Альбумина = Интенсивность на нл проанализированной плазмы / Интенсивность на нл проанализированной СМЖ
Соотношение 1500 и ниже рассматривалось как загрязнение кровью.
Результаты показаны на фиг. 10. Животным одновременно вводили 6 мг/кг каждого из IGF1R-4, FC5 или А20.1, и СМЖ и сыворотку собирали через 30 мин после инъекции. На фигуре показано, что соотношение СМЖ/сыворотка для IGF1R-4 составляет 1,2% по сравнению с 0,98% для FC5 и 0,017% для А20.1, что дает основание полагать, что оба, IGF1R-4 и FC5, имеют более высокое проникновение в СМЖ и воздействие на мозг по сравнение с совместно введенным контрольным антителом А20.1.
Пример 14. Иммунодетектирование IGF1R-4-mFc.
Для того, чтобы убедиться, что высокие уровни IGF1R-4-mFc, обнаруженные в спинномозговой жидкости после периферического введения, происходят по меньшей мере частично из внеклеточного пространства паренхимы, другими словами, что неповрежденный конструкт пересекает ГЭБ, была проведена иммунодетекция IGF1R-4-mFc в мозге крысы.
Вкратце, мозг животных собирали сразу после перфузиии животных PBS через 24 ч после введения 6 мг/кг в хвостовую вену IGF1R-4-mFc или A20.1mFc. Мозг замораживали и разрезали на криотоме на 12 мкм секции. Секции выдерживали в течение 10 мин при RT в 100% метаноле, отмывали 3 раза в PBS и инкубировали в течение 1 ч в 10% нормальной козьей сыворотке (NGS), содержащей 0,3% Тритон Х-100 в 1х PBS. Козий анти-M-lgG I;cv-cv3 (Cat#115-165-071, Jackson Immuno Reasearch, lot#106360) 1:200 в 5% NGS, содержащей 0,3% Тритон Х-100 в 1х PBS, инкубировали в течение ночи при 4°С. Секции промывали три раза в 1х PBS, затем добавляли лектин для окрашивания сосудистой системы RCAI (Cat # FL1081, Vector) 1:500 в 1xPBS в течение 10 мин. После промывки три раза 1xPBS секции покрывали покровным стеклом во флуоресцентной закрепляющей среде Dako (Cat # S3023, Dako) и к ним добавляли 2 мкг/мл Hoechst (Cat # H3570, Invitrogen) для окрашивания ядер. Фотографии делали с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus 1X81 с использованием 10Х и 60Х объективов и каналов, как показано в табл. 3.
Таблица 3. Объективы и каналы, использованные во флуоресцентной микроскопии
Флуоресцентная молекула Возбуждение (нм) Эмиссия (нм)
RCAI-сосуды FITC 495 518
Hoechst33342 -ядра Hoechst 350 461
IGF1R-4-m-Fc СуЗ 531 593
Результаты показаны на фиг. 11. Иммунодетекция мышиного Fc показала сильное окрашивание сосудов головного мозга в различных участках головного мозга, а также окрашивание периваскулярной паренхимы мозга, что указывает на то, что IGF1R-4-mFc накапливался в сосудах головного мозга, а также переносился через ГЭБ в окружающую паренхиму мозга. Напротив, mFc-специфическое окрашивание не было обнаружено у A20.1mFc инъецированных животных. Полученные результаты подтверждают утверждение, что повышенные уровни IGF1R-4-mFc в СМЖ свидетельствуют о прохождении конструкта через ГЭБ. Это дополнительно существенно подтверждается наблюдением, что Галанин, связанный с IGF1R-4, индуцировал фармакологическую реакцию (анальгезия) на паренхимальных GalR1 и GalR2 рецепторах. В совокупности результаты прохождения через ГЭБ in vitro, результаты фармакокинетики in vivo (уровни в сыворотке/СМЖ) и результаты фармакодинамики (модель Харгривса) показывают, что IGF1R-4 VHH переносится через неповрежденный ГЭБ значительно более высокими темпами, чем другие VHH путем активного рецепторно-опосредованного трансцитоза, вызванного его связыванием с эпитопами IGF1R, и что он может переносить неспособные в ином случае проникать через ГЭБ молекулы (180 кДа).
Пример 15. Влияние IGF1R-4 на физиологическую функцию IGF1R.
С точки зрения безопасности важно показать, что антитела согласно изобретению не мешают физиологической функции рецептора, т.е. передаче сигнала, индуцированной его природным лигандом, IGF-1- при связывании его рецептора для доставки лекарственных средств с помощью рецепторноопосредованного трансцитоза. С учетом этого важно продемонстрировать, что IGF1R-4 VHH или IGF1R4-mFc не мешают физиологической передаче сигналов через IGF1R или инсулиновый рецептор (IR), ин- 26 035480 дуцированной их природными лигандами.
Для того, чтобы определить, индуцирует ли IGF1R-4 передачу сигнала через IGF1R или IR по отдельности или мешает передаче сигнала, стимулируемой природными лигандами рецептора, IGF-1 или инсулином, было определено их влияние на фосфорилирование самих рецепторов или рецепторстимулированной прямой киназы, протеинкиназы В, в SV-ARBEC клетках.
SV-ARBEC клетки выращивали для слияния в основной среде М199, дополненной пептоном, Dглюкозой, ВМЕ (основная питательная среда Игла), аминокислотами, ВМЕ витаминами, раствором антибиотика/антимикотика и фетальной бычьей сывороткой в соответствии с известными способами. Клетки переносили в бессывороточную среду за 18 ч до обработки. IGF1R-4 VHH или IGF1R-4-Fc слияния (100 нМ или 500 нМ) добавляли к клеткам за 1 ч до добавления 200 нг/мл IGF-1, 10 мкл/мл инсулина или носителя. Клетки инкубировали с лигандами или носителем в течение 20 мин, а затем дважды промывали в сбалансированном солевом растворе Хэнка. Затем клетки лизировали с использованием буфера 1х RIPA (буфер для радиоиммунопреципитации) (Cell Signaling Technology), дополненного 1% Тритоном-Х 100 и ингибиторами протеаз (Sigma). Клетки подвергали 2x20 с импульсам в водяной бане ультразвуковом и лизаты очищали центрифугированием при 14,000 об/мин в течение 10 мин. Концентрацию белка определяли с помощью системы анализа белка DC (Bio-Rad Laboratories). Равные по мкм образцы белка разделяли в 4-20% градиентном SDS полиакриламидном геле при 125 В и переносили на PVDF (поливинилиден фторид) мембрану. Фосфопротеинкиназу В (Ser 473) определяли с помощью инкубации в течение ночи при разведении 1:1000 первичного антитела против данной мишени (технология клеточной передачи сигнала) с последующей инкубацией со вторичным козьим антителом против кроличьего IgG-HRP, с последующим взаимодействием с ECL Plus реагентом и визуализацией на авторадиографической пленке. Значения денситиометрии были определены с использованием программного обеспечения Un-Scan-LT (Silk Scientific Inc.).
Результаты показаны на фиг. 12. Вестерн-блоттинг фосфорилирования протеинкиназы В показал, что IGF1R-4 не ингибирует фосфорилирование протеинкиназы В, индуцированное 10 мкг/мл инсулина или 200 нг/мл IGF-1 при совместном применении с 100 нМ IGF1R-4 или IGF1R-4-mFc или 500 нм IGF1R4-mFc. VHH или Fc слияния также не индуцировали сами по себе передачу сигнала протеинкиназой В (фиг. 12А, 12В и 12С, с надписью -4). Результаты показывают, что даже в бивалентном отображении в формате Fc слияния IGF1R-4 не вызывает димеризацию рецептора и прямую передачу сигнала и, следовательно, не нарушает функцию рецептора в присутствии природного лиганда. Эта особенность IGF1R-4 (молчаливое связывание) имеет важное значение для его применения в качестве переносчика терапевтических агентов через ГЭБ, так как она обеспечивает благоприятный профиль безопасности.
Варианты осуществления и примеры, описанные здесь, являются иллюстративными и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения, как заявлено. Вариации вышеописанных вариантов осуществления, включая альтернативы, модификации и эквиваленты, охватываются, по намерению авторов изобретения, формулой изобретения. Кроме того, описанная совокупность признаков может не являться необходимой для изобретательского решения.
Ссылки
Все патенты, патентные заявки и публикации, упомянутые в настоящем документе и во всей заявке, включены в данное описание в качестве ссылки.
- 27 035480
Abbott NJ (2013) Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery. J Inherit Metab Dis. 36(3):437-49.
Abulrob A, Sprang H, Van Bergen en Henegouwen P, Stanimirovic D (2005) The bloodbrain barrier transmigrating single domain antibody: mechanisms of transport and antigenic epitopes in human brain endothelial cells. J Neurochem. 2005 Nov;95(4):1201-14.
Arbabi-Ghahroudi, M. Desmyter A, Wyns L, Hamers R., and Muyldermans S (1997) Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavychain antibodies, FEBS Lett 414, 521-526
Arbabi-Ghahroudi, M., To, R., Gaudette, N., Hirama, T, Ding, W., MacKenzie, R., and Tanha, J. (2009a) Protein Eng. Des. Sei. 22, 59-66.
Arbabi-Ghahroudi, M., MacKenzie, R., and Tanha, J. (2009b) Methods Mol. Biol. 525, 187-216.
Bell, A., Wang, Z.J., Arbabi-Ghahroudi, M., Chang, T.A., Durocher, Y, Trojahn, II., Baardsnes, J., Jaramillo, M.L., Li, S., Baral, T.N., O'Connor-McCourt, M., Mackenzie, R., and Zhang, J. (2010) Cancer Lett. 289, 81-90.
Broussau, s., Jabbour, N., Lachapelle, G., Durocher, Y, Tom, R., Transfiguracion, J., Gilbert, R. and Massie, B. (2008) Mol Ther 16, 500-507.
Chothia, C„ and Lesk, A.M. (1987) J. Mol. Biol. 196, 901-917.
- 28 035480
Davies J., and L. Riechmann, Affinity improvement of single antibody VH domains:
residues in all three hypervariable regions affect antigen binding. Immunotechnology 2 (1996) 169-179
De Kruif, J., and Logtenberg, T. (1996) J. Biol. Chem. 271, 7630-7634.
Demeule, M.; Currie, J. C.; Bertrand, Y; Che, C.; Nguyen, T; Regina, A.; Gabathuler, R.; Castaigne, J. R; Beliveau, R. Involvement of the low-density lipoprotein receptorrelated protein in the transcytosis of the brain delivery vector angiopep-2, J. Neurochem. 2008, 106, 1534-1544.
Dumoulin, M., Conrath, K., Van Meirhaighe, A., Meersman, F., Heremans, K., Frenken, L.G., Muyldermans, S., Wyns, L., and Matagne, A. (2002) Protein Sci 11, 500-515.
Durocher, Y, S. Perret, et al. (2002). High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic Acids Res 30(2): E9.
Doyle, P.J., Arbabi-Ghahroudi, M., Gaudette, N., Furzer, G., Savard, M.E., Gleddie, S., McLean, M.D., MacKenzie, C.R., and Hall, J.C. (2008) Mol. Immunol. 45, 3703-3713.
Eisenberg, D., Schwarz, E., Komaromy, M., and Wall, R. (1984) J. Mol. Biol. 179, 125142
Erdlenbruch B, Alipour M, Fhcker G, Miller DS, Kugler W, Eibl H, Lakomek M (2003) Alkylglycerol opening of the blood-brain barrier to small and large fluorescence markers in normal and C6 glioma-bearing rats and isolated rat brain capillaries. Br J Pharmacol. 140(7): 1201 -10.
Fenner, L., Widmer, A.F., Goy, G., Rudin, S., and Frei, R. (2008) J. Clin. Microbiol. 46, 328- 330.
Gaillet, B., Gilbert, R., Broussau, S., Pilotte, A., Malenfant, F., Mullick, A., Gamier, A., and Massie, B. (2010) Biotechnol Bioeng 106, 203-215.
Gan Y, Jing Z, Stetler RA, Cao G (2013) Gene delivery with viral vectors for cerebrovascular diseases. Front Biosci (Elite Ed). 5:188-203. Review.
Garberg, P; Ball, M.; Borg, N.; Cecchelli, R.; Fenart, L.; Hurst, R. D.; Lindmark, T; Mabondzo, A.; Nilsson, J. E.; Raub, T. J.; Stanimirovic, D.; Terasaki, T; Oberg, J. O.; Osterberg, T. In vitro models for the blood-brain barrier, Toxicol. In Vitro 2005, 19, 299334.
Gergov, M.; Ojanpera, I.; Vuori, E. Simultaneous screening for 238 drugs in blood by liquid chromatography-ion spray tandem mass spectrometry with multiple-reaction monitoring, J. Chromatogr. В Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2003, 795, 41-53.
Gaillet B, Gilbert R, Amziani R, Guilbault C, Gadoury C, Caron AW, Mullick A, Gamier A,
- 29 035480
Massie В (2007) High-level recombinant protein production in CHO cells using an adenoviral vector and the cumate gene-switch. Biotechnol Prog. Jan-23(1 ):200-9
Gottesman et al., Ann. Rev. Biochem., 62, 385-427 (1993)
Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T, Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C.,
Songa, E.B., Bendahman, N., and Hamers, R. (1993) Nature 363, 446-448.
Haqqani AS, Caram-Salas N, Ding W, Brunette E, Delaney CE, Baumann E, Boileau E, Stanimirovic D (2012) Multiplexed evaluation of serum and CSF pharmacokinetics of braintargeting single-domain antibodies using a NanoLC-SRM-ILIS method. Mol Pharm. 2013 May 6; 10(5): 1542-56.
Hargreaves KM, Troullos ES, Dionne IRA, Schmidt EA, Schafer SC, Jons JL (1988) Bradykinin is increased during acute and chronic inflammation: therapeutic implications. Clin Pharmacol Ther. 44(6):613-21.
Huang YL, Saljo A, Suneson A, Hansson HA (1995) A new approach for multiple sampling of cisternal cerebrospinal fluid in rodents with minimal trauma and inflammation. J Neurosci Methods. 63(1-2): 13-22.
Hussack, G., Hirama, T, Ding, W., MacKenzie, R., and Tanha, J. (2011) PLoS ONE 6, e28218.
Hussack G, Arbabi-Ghahroudi M, van Faassen H, Songer JG, Ng KK, MacKenzie R, Tanha J (2011b) Neutralization of Clostridium difficile toxin A with single-domain antibodies targeting the cell receptor binding domain. J Biol Chem. 286(11): 8961-76.
Iqbal U. Abulrob A. Stanimirovic D В (2011) Integrated platform for brain imaging and drug delivery across the blood-brain barrier. Methods Mol. Biol. 686, 465-481.
Iqbal, U., Trojahn, U., Albaghdadi, H., Zhang, J., O’Connor, M., Stanimirovic, D., Tomanek, B., Sutherland, G., and Abulrob, A. (2010) Br. J. Pharmacol. 160, 1016-1028. Jespers, L., Schon, 0., Famm, K., and Winter, G. (2004) Nat. Biotechnol. 22, 1161 1165.
Kabat EA, Wu TT. Identical V region amino acid sequences and segments of sequences in antibodies of different specificities. Relative contributions of VH and VL genes, minigenes, and complementarity-determining regions to binding of antibody-combining sites. J Immunol. 1991;147:1709-19.
Kim, D.Y, Kandalaft, H., Ding, W., Ryan, S., van Fassen, H., Hirama, T, Foote, S.J., MacKenzie, R., and Tanha, J. (2012) PEDS advance access August 30, 2012, 1-9.
Kornhuber ME, Kornhuber J, Cimniak U (1986) A method for repeated CSF sampling in the freely moving rat. J Neurosci Methods. 17(1 ):63-8.
Lefranc, M.-P. etal.,(2003) Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77.
- 30 035480
Li S, Zheng W, Kuolee R, Hirama T, Henry M, Makvandi-Nejad S, Fjallman T, Chen W,
Zhang J. Pentabody-mediated antigen delivery induces antigen-specific mucosal immune response. Mol Immunol 2009;46:1718-26.
Merritt, E.A., and Hoi, W.G. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 165-171.
Muruganandam A, Tanha J, Narang S, Stanimirovic D (2001) Selection of phagedisplayed llama single-domain antibodies that transmigrate across human blood-brain barrier endothelium. FASEB J. 2002 Feb; 16(2):240-2.
Musher, D.M., Manhas, A., Jain, P., Nuila, F, Waqar, A., Logan, N., Marino, B., Graviss, E.A. (2007) J. Clin. Microbiol. 45, 2737-2739.
Nhan T, Burgess A, Cho EE, Stefanovic B, Lilge L, Hynynen K.(2013) Drug delivery to the brain by focused ultrasound induced blood-brain barrier disruption: Quantitative evaluation of enhanced permeability of cerebral vasculature using two-photon microscopy. J Control Release. 172(1 ):274-280.
Nicaise M, Valeio-Lepiniec M, Minard P, Desmadril M. (2004) Affinity transfer by CDR grafting on a nonimmunoglobulin scaffold. Protein Sci. 13(7): 1882-1891.
Nielsen, U.B., Adams, G.P., Weiner, L.M., and Marks, J.D. (2000) Cancer Res. 60, 6434-6440.
Nirogi, R.; Kandikere, V.; Mudigonda, K.; Bhyrapuneni, G.; Muddana, N.; Saralaya, R.; Benade, V. (2009) A simple and rapid method to collect the cerebrospinal fluid of rats and its application for the assessment of drug penetration into the central nervous system, J, Neurosci. Methods, 178, 116-119.
Nuttall, S.D., Krishnan, U.V., Doughty, L., Pearson, K., Ryan, M.T., Hoogenraad, N.J., Hattarki, M., Carmichael, J.A., Irving, R.A., and Hudson, P.J. (2003) Eur. J. Biochem. 270, 3543-3554.
Pardridge, W. M.; Buciak, J. L.; Fhden, Ρ. M. Selective transport of an anti-transferrin receptor antibody through the blood-brain barrier in vivo, J. Pharmacol. Exp. Ther. 1991, 259, 66-70.
Pardridge, W.M., Adv. Drug Delivery Reviews, 15, 5-36 (1995)
Pardridge, W. M. Drug and gene delivery to the brain: the vascular route, Neuron. 2002, 36, 555-558.
Planche, T, Aghaizu, A., Holliman, R., Riley, P., Poloniecki, J., Breathnach, A., and Krishna,
S. (2008) Lancet Infect. Dis. 8, 777-784.
Preston E, Slinn J, Vinokourov I, Stanimirovic D. (2008) Graded reversible opening of the rat blood-brain barrier by intracarotid infusion of sodium caprate. J Neurosci
- 31 035480
Methods. 168(2):443-9.
Ridgway, J.В., Presta, L.G., and Carter, P. (1996) Protein Eng. 9, 617-621.
Robertson CR, Flynn SP, White HS, Bulaj G (2011) Anticonvulsant neuropeptides as drug leads for neurological diseases. Nat Prod Rep. 28(4):741-62.
Russmann, H., Panthel, K., Bader, R.C., Schmitt, C., and Schaumann, R. (2007) Eur. J.
Clin. Microbiol. Infect. Dis. 26, 115-119.
Samani, A.A., Chevet, E., Fallavollita, L., Galipeau, J., and Brodt, P. (2004) Cancer Research 64, 3380-3385.
Samuels B.L., J. Clin. Pharmacol. Ther., 54, 421-429 (1993)
Sloan, L.M., Duresko, B.J., Gustafson, D.R., and Rosenblatt, J.E. (2008) J. Clin. Microbiol. 46, 1996-2001.
Sumbria RK, Zhou QH, Hui EK, Lu JZ, Boado RJ, Pardhdge WM.(2013) Pharmacokinetics and brain uptake of an IgG-TNF decoy receptor fusion protein following intravenous, intraperitoneal, and subcutaneous administration in mice. Mol Pharm. 10(4): 1425-31.
Tanha, J., Muruganandam, A., and Stanimirovic, D. (2003) Methods Mol. Med. 89, 435449.
To, R., Hirama, T, Arbabi-Ghahroudi, M., MacKenzie, R., Wang, P, Xu, P, Ni, F., and Tanha, J. (2005) J. Biol. Chem. 280, 41395-41403.
Turgeon, D.K., Novicki, T.J., Quick, J., Carlson, L., Miller, R, Illness, B., Cent, A., Ashley, R., Larson, A., Coyle, M., Limaye, A.P., Cookson, B.T., and Fritsche, T.R. (2003) J. Clin. Microbiol. 41, 667-670.
Watanabe, T, Acta Oncol., 34, 235-241 (1995)
Xiao G, Gan LS.(2013) Receptor-mediated endocytosis and brain delivery of therapeutic biologies. Int J Cell Biol, doi: 10.1155/2013/703545. Epub 2013 Jun H.Yaksh TL, Rudy TA (1976) Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space. Physiol Behav. 17(6): 1031-6.
Yu, Y. J.; Zhang, Y; Kenrick, M.; Floyte, K.; Luk, W; Lu, Y; Atwal, J.; Elliott, J. M.; Prabhu, S.; Watts, R. J.; Dennis, M. S. Boosting brain uptake of a therapeutic antibody by reducing its affinity for a transcytosis target, Sci. Transl. Med. 2011, 3, 84ra44.
Zhang, J., Li, Q., Nguyen, T.-D., Tremblay, T.-L., Stone, E., To, R., Kelly, J., and MacKenzie, C.R. (2004a) J. Mol. Biol. 341, 161-169.
Zhang, J., Tanha, J., Hirama, T, Khiew, N.H., To, R., Tong-Sevinc, H., Stone, E., Brisson, J.R., and MacKenzie, C.R. (2004b) J. Mol. Biol. 335, 49-56.
Zhu et al., Immunology and Cell Biology (2010) 88:667-675.
- 32 035480
Европейский патент № 519596
Европейский патент № 626390
Патент США № 5693761
Патент США № 5766886
Патент США № 5821123
Патент США № 5859205
Патент США № 5869619
Патент США № 6054297
Патент США №6180370

Claims (19)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Однодоменное антитело или его антиген-связывающий фрагмент, специфически связывающееся с рецептором инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1R), содержащее последовательность области, определяющей комплементарность (CDR) 1 GGTVSPTA (SEQ ID NO: 1); последовательность CDR2 ITWSRGTT (SEQ ID NO: 2) и последовательность CDR3 AASTFLRILPEESAYTY (SEQ ID NO: 3).
  2. 2. Антитело или его фрагмент по п.1, содержащее последовательность
    JX1VX2LX3ESGGGLVQX4GGSLRLSCX5X6SGGTVSPTAMGWX7RQAPGKX8X9EX10VX11
    HITWSRGTTRX12ASSVKX13RFTISRDX14X15KNTX16YLQMNSLX17X18EDTAVYYCAAS
    TFLRILPEESAYTYWGQGTX19VTVSS (SEQ ID NO:4), где X1 представляет собой Е или Q; Х2 представляет собой K или Q; Х3 представляет собой V или Е; Х4 представляет собой А или Р; X5 представляет собой А или Е; Х6 представляет собой V или А; Х7 представляет собой V или F; X8 представляет собой G или Е; Х9 представляет собой L или R; Х10 представляет собой F или W; Х11 представляет собой G или S; X12 представляет собой V или Y; Х13 представляет собой D или G; Х14 представляет собой N или S; Х15 представляет собой А или S; Х16 представляет собой L или V; Х17 представляет собой K или R; Х18 представляют собой А или S; Х19 представляют собой L или Q, или последовательность, идентичную указанной на 90%.
  3. 3. Антитело или его фрагмент по п.1 или 2, содержащее последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
    QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCEVSGGTVSPTAMGWFRQAPGKEREFVGHIT
    WSRGTTRVASSVKDRFTISRDSAKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCAASTFLRILP
    EESAYTYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:5),
    QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGGTVSPTAMGWVRQAPGKGLEWVGHI TWS RGTTRYAS S V KG RFTIS RD N S KNTVYLQ Μ N S L RAE DTAVYYC AAST F L RIL
    - 33 035480
    PEESAYTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:6),
    QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGGTVSPTAMGWFRQAPGKGLEFVGHIT
    WSRGTTRYASSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAASTFLRILP
    EESAYTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:7),
    QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGGTVSPTAMGWFRQAPGKGLEFVGHIT WSRGTTRYASSVKGRFTISRDSSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAASTFLRILP EESAYTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:8),
    QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGGTVSPTAMGWFRQAPGKEREFVGHIT WSRGTTRYASSVKGRFTISRDSSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAASTFLRILP EESAYTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:9), или последовательности, на 90% идентичной любой из SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8 или 9.
  4. 4. Антитело или его фрагмент по любому из пп.1-3, где антитело имеет верблюжье происхождение.
  5. 5. Антитело или его фрагмент по любому из пп.1-4, где антитело или его фрагмент находятся в мультимерной форме.
  6. 6. Антитело или его фрагмент по п.5, где антитело или его фрагмент связаны с Fc-фрагментом.
  7. 7. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его фрагмент по любому из пп.1-6.
  8. 8. Вектор для экспрессии антитела или его фрагмента по любому из пп.1-6, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.7.
  9. 9. Антитело или его фрагмент по любому из пп.1-6, где антитело или его фрагмент иммобилизованы на твердую поверхность.
  10. 10. Антитело или его фрагмент по любому из пп.1-6, где антитело или его фрагмент связаны с карго-молекулой.
  11. 11. Антитело или его фрагмент по п.10, где карго-молекула имеет молекулярную массу в диапазоне от приблизительно 1 кДа до приблизительно 200 кДа.
  12. 12. Антитело или его фрагмент по п.11, где карго-молекула представляет собой детектируемый агент, лекарственное средство, пептид, фактор роста, цитокин, ловушку рецептора, углеводный фрагмент, фермент, антитело или его фрагмент, молекулу на основе ДНК, вирусный вектор или цитотоксический агент; липосому или наноноситель, загруженные детектируемым агентом, лекарственным средством, пептидом, ферментом, антителом или его фрагментом, молекулой на основе ДНК, вирусным вектором или цитотоксическим агентом; или наночастицу, нанопровод, нанотрубку или квантовую точку.
  13. 13. Композиция для доставки терапевтических и диагностических молекул в фармакологически эффективных дозах в мозг субъекта, содержащая антитело или его фрагмент по любому из пп.9-12 и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.
  14. 14. In vitro способ детектирования IGF1R, включающий
    a) контактирование образца ткани с антителом или его фрагментом по любому из пп.1-6, связанными с детектируемым агентом; и
    b) выявление формирования комплекса антитела или его фрагмента, связанного с детектируемым агентом, и IGF1R в образце ткани, причем формирование комплекса свидетельствует о наличии IGF1R в образце.
  15. 15. In vivo способ детектирования экспрессии IGF1R у субъекта, включающий:
    a) введение антитела или его фрагмента по любому из пп.1-6, связанных с детектируемым агентом, субъекту; и
    b) выявление формирования комплекса антитела или его фрагмента, связанного с детектируемым агентом, и IGF1R, причем формирование комплекса свидетельствует о наличии экспрессии IGF1R у субъекта.
  16. 16. Способ переноса карго-молекулы через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), включающий введение антитела или его фрагмента по п.1, связанных с карго-молекулой, субъекту.
  17. 17. Способ по п.16, где карго-молекула имеет молекулярную массу в диапазоне от приблизительно 1 кДа до приблизительно 200 кДа.
  18. 18. Способ по п.17, где карго-молекула представляет собой детектируемый агент, лекарственное средство, пептид, фактор роста, цитокин, ловушку рецептора, углеводный фрагмент, фермент, антитело или его фрагмент, молекулу на основе ДНК, вирусный вектор или цитотоксический агент; липосому или наноноситель, загруженные детектируемым агентом, лекарственным средством, пептидом, ферментом, антителом или его фрагментом, молекулой на основе ДНК, вирусным вектором или цитотоксическим агентом; или наночастицу, нанопровод, нанотрубку или квантовую точку.
  19. 19. Способ определения количества карго-молекулы, доставляемой через ГЭБ субъекта, где карго-
    - 34 035480 молекула связана с антителом или его фрагментом по п.1, включающий
    а) сбор спинно-мозговой жидкости (СМЖ) у субъекта; и
    b) определение количества карго-молекулы, связанной с антителом или его фрагментом, в СМЖ.
EA201691780A 2014-03-06 2014-12-04 Антитела, специфические к рецептору инсулиноподобного фактора роста 1 и их применения EA035480B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461948818P 2014-03-06 2014-03-06
PCT/CA2014/000861 WO2015131257A1 (en) 2014-03-06 2014-12-04 Insulin-like growth factor 1 receptor -specific antibodies and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201691780A1 EA201691780A1 (ru) 2017-01-30
EA035480B1 true EA035480B1 (ru) 2020-06-23

Family

ID=54054287

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201691780A EA035480B1 (ru) 2014-03-06 2014-12-04 Антитела, специфические к рецептору инсулиноподобного фактора роста 1 и их применения

Country Status (16)

Country Link
US (1) US10112998B2 (ru)
EP (1) EP3114141B1 (ru)
JP (1) JP6541237B2 (ru)
KR (1) KR102355310B1 (ru)
CN (1) CN106559993B (ru)
AU (1) AU2014385800B2 (ru)
CA (1) CA2942154C (ru)
DK (1) DK3114141T3 (ru)
EA (1) EA035480B1 (ru)
IL (1) IL247606B (ru)
MX (1) MX2016011561A (ru)
NZ (1) NZ724868A (ru)
PE (1) PE20161311A1 (ru)
UA (1) UA121028C2 (ru)
WO (1) WO2015131257A1 (ru)
ZA (1) ZA201606211B (ru)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8164343B2 (en) 2003-09-05 2012-04-24 Midtronics, Inc. Method and apparatus for measuring a parameter of a vehicle electrical system
DE112006002329B4 (de) 2005-08-29 2022-06-09 Midtronics, Inc. Diagnosevorrichtung für elektrische Anlagen von Kraftfahrzeugen
EP3114140B1 (en) 2014-03-06 2019-02-27 National Research Council of Canada Insulin-like growth factor 1 receptor -specific antibodies and uses thereof
UA120048C2 (uk) * 2014-03-06 2019-09-25 Нешнл Рісеч Каунсіл Оф Канада Антигензв'язуючий фрагмент антитіла, який специфічно зв'язується з рецептором інсуліноподібного фактора росту 1 (igf1r)
MX2016011561A (es) 2014-03-06 2017-04-13 Nat Res Council Canada Anticuerpos especificos para el receptor del factor de crecimiento similar a insulina 1 y usos de los mismos.
AU2018212860A1 (en) * 2017-01-30 2019-08-15 National Research Council Of Canada Blood-brain barrier transmigrating compounds and uses thereof
BR112020001970A2 (pt) 2017-08-02 2020-08-04 Stressmarq Biosciences Inc. anticorpo que se liga à alfa-sinucleína ativa
WO2019117684A1 (ko) * 2017-12-14 2019-06-20 에이비엘바이오 주식회사 a-syn/IGF1R에 대한 이중 특이 항체 및 그 용도
EP3985022A4 (en) * 2019-06-14 2023-08-02 ABL Bio, Inc. BISPECIFIC ANTIBODIES AGAINST A-SYN/IGF1R AND ITS USE
TWI766512B (zh) 2020-01-02 2022-06-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 用於判定腦中的治療性抗體量之方法
KR102302965B1 (ko) * 2020-04-14 2021-09-27 머티어리얼사이언스 주식회사 유기 화합물 및 이를 포함하는 유기전계발광소자
WO2022133351A1 (en) * 2020-12-18 2022-06-23 Usmedigene Inc. Vectors for delivery of human growth hormone gene and multiple therapeutic genes into central nervous system by crossing blood brain barrier
WO2024030341A1 (en) 2022-07-30 2024-02-08 Pinetree Therapeutics, Inc. Compositions for targeted lysosomal degradaton and methods of use thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011044542A1 (en) * 2009-10-09 2011-04-14 Armagen Technologies, Inc. Methods and compositions for increasing iduronate 2-sulfatase activity in the cns
WO2011150061A1 (en) * 2010-05-27 2011-12-01 Centocor Ortho Biotech Inc. Insulin-like growth factor 1 receptor binding peptides

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5766886A (en) 1991-12-13 1998-06-16 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
US5869619A (en) 1991-12-13 1999-02-09 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
DE69434520T3 (de) 1993-07-30 2009-10-15 Affymax, Inc., Palo Alto Biotinylierung von proteinen
WO2001007084A1 (en) 1999-07-23 2001-02-01 Regents Of The University Of California Anti-growth factor receptor avidin fusion proteins as universal vectors for drug delivery
CA2441903C (en) 2000-05-26 2012-07-31 National Research Council Of Canada Single-domain brain-targeting antibody fragments derived from llama antibodies
AU2001268855A1 (en) * 2000-05-26 2001-12-03 National Research Council Of Canada Single-domain antigen-binding antibody fragments derived from llama antibodies
EP1456651B1 (en) 2001-11-30 2008-05-07 National Research Council Of Canada Self-assembly molecules
US7388079B2 (en) * 2002-11-27 2008-06-17 The Regents Of The University Of California Delivery of pharmaceutical agents via the human insulin receptor
US20050142141A1 (en) * 2002-11-27 2005-06-30 Pardridge William M. Delivery of enzymes to the brain
EP1452601A1 (en) 2003-02-28 2004-09-01 Roche Diagnostics GmbH Enhanced expression of fusion polypeptides with a biotinylation tag
WO2007000328A1 (en) * 2005-06-27 2007-01-04 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa Antibodies that bind to an epitope on insulin-like growth factor 1 receptor and uses thereof
JP5269597B2 (ja) 2005-09-27 2013-08-21 ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ 血液―脳隔壁エピトープとその利用
CA2624781A1 (en) * 2005-10-11 2007-04-19 Ablynx N.V. Nanobodies tm and polypeptides against egfr and igf-ir
US20090252681A1 (en) * 2005-10-11 2009-10-08 Ablynx N.V. Nanobodies and Polypeptides Against EGFR and IGF-IR
CA2653444A1 (en) 2006-06-07 2007-12-13 Wisconsin Alumni Research Foundation Blood-brain barrier targeting antibodies
US7981417B2 (en) 2006-06-07 2011-07-19 Wisconsin Alumni Research Foundation Blood-brain barrier targeting anti-bodies
CA2661042C (en) 2006-08-18 2012-12-11 Armagen Technologies, Inc. Agents for blood-brain barrier delivery
JP2010538012A (ja) 2007-08-28 2010-12-09 バイオジェン アイデック マサチューセッツ インコーポレイテッド Ｉｇｆ−１ｒの複数のエピトープに結合する組成物
US8444976B2 (en) * 2008-07-02 2013-05-21 Argen-X B.V. Antigen binding polypeptides
US8444982B2 (en) 2009-12-04 2013-05-21 The University Of Hong Kong Anti-IGF-IR antibodies and uses thereof
WO2011127580A1 (en) 2010-04-14 2011-10-20 National Research Council Of Canada Compositions and methods for brain delivery of analgesic peptides
EP3208282A1 (en) * 2010-11-30 2017-08-23 F. Hoffmann-La Roche AG Low affinity anti transferrin receptor and their use to transfer therapeutic scfv across the blood brain barrier
WO2013106577A2 (en) * 2012-01-10 2013-07-18 Biogen Idec Ma Inc. Enhancement of transport of therapeutic molecules across the blood brain barrier
KR102115438B1 (ko) * 2012-05-21 2020-05-27 제넨테크, 인크. 혈액-뇌 장벽 수송의 안전성을 개선하는 방법
MX2016011561A (es) 2014-03-06 2017-04-13 Nat Res Council Canada Anticuerpos especificos para el receptor del factor de crecimiento similar a insulina 1 y usos de los mismos.
UA120048C2 (uk) 2014-03-06 2019-09-25 Нешнл Рісеч Каунсіл Оф Канада Антигензв'язуючий фрагмент антитіла, який специфічно зв'язується з рецептором інсуліноподібного фактора росту 1 (igf1r)
EP3114140B1 (en) 2014-03-06 2019-02-27 National Research Council of Canada Insulin-like growth factor 1 receptor -specific antibodies and uses thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011044542A1 (en) * 2009-10-09 2011-04-14 Armagen Technologies, Inc. Methods and compositions for increasing iduronate 2-sulfatase activity in the cns
WO2011150061A1 (en) * 2010-05-27 2011-12-01 Centocor Ortho Biotech Inc. Insulin-like growth factor 1 receptor binding peptides

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Gabathuler R. Approaches to transport therapeutic drags across the blood-brain barrier to treat brain diseases. Neurobiol Dis. Vol. 37, Pages 48-57, January 2010 (01-2010), ISSN 0969-9961, Page 54, section bridging left and right columns *

Also Published As

Publication number Publication date
EA201691780A1 (ru) 2017-01-30
JP6541237B2 (ja) 2019-07-10
US10112998B2 (en) 2018-10-30
PE20161311A1 (es) 2016-11-25
EP3114141A1 (en) 2017-01-11
CN106559993B (zh) 2020-12-15
AU2014385800B2 (en) 2020-10-22
US20170022277A1 (en) 2017-01-26
CN106559993A (zh) 2017-04-05
WO2015131257A1 (en) 2015-09-11
DK3114141T3 (da) 2020-08-10
NZ724868A (en) 2022-07-01
EP3114141B1 (en) 2020-05-06
UA121028C2 (uk) 2020-03-25
BR112016020628A2 (pt) 2018-01-23
JP2017512464A (ja) 2017-05-25
MX2016011561A (es) 2017-04-13
KR20160130435A (ko) 2016-11-11
CA2942154A1 (en) 2015-09-11
IL247606B (en) 2020-04-30
ZA201606211B (en) 2019-01-30
EP3114141A4 (en) 2017-08-16
CA2942154C (en) 2023-06-27
AU2014385800A1 (en) 2016-10-20
KR102355310B1 (ko) 2022-01-24
IL247606A0 (en) 2016-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10112998B2 (en) Insulin-like growth factor 1 receptor-specific antibodies and uses thereof
US10106614B2 (en) Insulin-like growth factor 1 receptor-specific antibodies and uses thereof
JP6541236B2 (ja) インスリン様成長因子１受容体特異的抗体及びそれらの使用
KR102406610B1 (ko) 혈액-뇌 장벽을 통과이동하는 인간화 항체 및 그의 용도
BR112016020628B1 (pt) Anticorpos específicos para receptor de fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 e uso dos mesmos