EA031518B1

EA031518B1 - Маркерная вакцина против классической чумы свиней

Info

Publication number: EA031518B1
Application number: EA201270794A
Authority: EA
Inventors: Мартин Беер; Сандра Бломе; Иммануэль Ляйфер
Original assignee: Римзер Фарма Гмбх
Priority date: 2010-05-18
Filing date: 2011-05-18
Publication date: 2019-01-31
Also published as: HUE029385T2; CA2801897A1; PT2571519T; KR101845571B1; CY1118060T1; RS55214B1; SI2571519T1; ES2593965T3; KR20130109008A; US9315873B2; BR112012029145B1; ZA201208194B; BR112012029145B8; EA201270794A1; CN102905725B; EP2571519A1; WO2011144360A1; EA201270794A8; MX2012013419A; US20130129762A1

Abstract

Изобретение относится к маркерной вакцине для профилактики классической чумы свиней, включающей модифицированный живой аттенуированный вирус классической чумы свиней, у которого вирусная аминокислотная последовательность TAV-эпитопа белка E2 отличается от последовательности вируса классической чумы свиней дикого типа. Изобретение также относится к применению заявленной маркерной вакцины в качестве лекарственного средства для профилактики (вакцинирования) классической чумы свиней и способу профилактики (вакцинирования) классической чумы свиней посредством заявленной маркерной вакцины. Изобретение также относится к способу получения модифицированного живого аттенуированного вируса классической чумы свиней в виде маркерной вакцины, включающему получение вирусов, не связывающих нейтрализующие антитела.

Description

Изобретение относится к маркерной вакцине для профилактики классической чумы свиней, включающей модифицированный живой аттенуированный вирус классической чумы свиней, у которого вирусная аминокислотная последовательность TAV-эпитопа белка Е2 отличается от последовательности вируса классической чумы свиней дикого типа. Изобретение также относится к применению заявленной маркерной вакцины в качестве лекарственного средства для профилактики (вакцинирования) классической чумы свиней и способу профилактики (вакцинирования) классической чумы свиней посредством заявленной маркерной вакцины. Изобретение также относится к способу получения модифицированного живого аттенуированного вируса классической чумы свиней в виде маркерной вакцины, включающему получение вирусов, не связывающих нейтрализующие антитела.

Область техники

Изобретение относится к маркерной вакцине для профилактической терапии классической чумы свиней, содержащей модифицированный живой аттенуированный вирус классической чумы свиней. В одном варианте изобретения маркерная вакцина характеризуется тем, что нуклеотидная последовательность вируса, кодирующая TAV-эпитоп и/или аминокислотную последовательность TAV-эпитопа, содержит последовательность, отличную от последовательности вызывающего болезнь вируса чумы свиней, таким образом, что животные, инфицированные вирусом, вызывающим чуму свиней, могут быть дифференцированы от животных, вакцинированных маркерной вакциной в соответствии с настоящим изобретением, с помощью серологических методов и/или методов геномного анализа.

Уровень техники

Классическая чума свиней (CSF) является эпизоотическим заболеванием животных, встречающимся по всему миру и обладающим значительной политической и экономической значимостью (Vandeputte и Chappuis, 1999). Классическая чума свиней, также известная как холера свиней или чума свиней, является одним из заболеваний, подлежащим нотификации на национальном уровне, на уровне ЕС и Всемирной Организации по охране здоровья животных (OIE) в Париже при появлении в любом из государств-членов. Классическая чума свиней вызывается маленьким оболочечным РНК-вирусом рода Pestivirus семейства Flaviviridae. Естественными средами обитания вируса чумы свиней являются исключительно домашние и дикие породы свиней (например, европейский дикий кабан).

В рамках Европейского Союза были сделаны попытки искоренить CSF с помощью строгих мер, не предусматривающих профилактической вакцинации, проведение которой запрещено с 1990 года. Несмотря на запрет вакцинация является законно допустимой мерой в рамках проведения экстренного вакцинирования в случаях появления чумы свиней. В данном случае вакцинация должна осуществляться в рамках одного из экстренных планов по вакцинированию, ратифицированных Европейским Союзом (см. ст. 19 Директивы Совета 2001/89/ЕС). До настоящего времени Румыния являлась единственной страной, в которой проводилось экстренное вакцинирование. Причины столь ограниченного применения заключаются в технических ограничениях доступных в настоящее время маркерных вакцин, таких как ограничение эффективности вакцин и торговые барьеры, применяемые по отношению к животным, признанным вакцинированными (ограничение на доступ на национальный рынок). Эффективность лицензированных маркерных вакцин не может быть подвергнута сравнению с модифицированными живыми вакцинами, обладающими значительными преимуществами; кроме того, данные инактивированные вакцины или субъединичные вакцины в любом случае не являются подходящими для проведения экстренного вакцинирования в связи с более поздним появлением иммунитета и необходимостью проведения ревакцинаций.

Учитывая расширение Европейского Союза благодаря присоединению восточно-европейских стран и все более возрастающий уровень глобализации, были обсуждены новые стратегии потенциального проведения экстренного вакцинирования, которые будут играть роль в предотвращении крупной выбраковки животных и связанных с этим экономических потерь (Leifer et al., 2009). Таким образом, существует значительная потребность в высокоэффективной вакцине, которая сделает возможным проведение серологической дифференциации между вакцинированными и невакцинированными животными и, кроме того, будет обладать всеми преимуществами традиционных модифицированных живых вакцин.

В связи с тем, что первое поколение маркерных вакцин, которые были основаны на гликопротеине E2 вируса CSF, находятся в ограниченном доступе и обладают серьезными недостатками, связанными с условиями хранения, стоимостью, эффективностью, существует значительная потребность в новых маркерных вакцинах. Были исследованы различные кандидаты на роль данных вакцин, такие как ДНКвакцины, иммуногенные пептиды, векторные вакцины, мутанты с делецией и химерные вирусы, вызывающие лихорадку (Beer et al., 2007; Dong и Chen, 2007). Большинство из данных маркерных вакцинкандидатов обладают недостатком, заключающимся в использовании современных методов генетической модификации в рамках их получения. В связи со значительными опасениями потребителей в отношении генетически модифицированных продуктов, а также сложными процедурами приема, генетически модифицированные вакцины обладают значительными недостатками.

Традиционные вакцины, направленные против вируса CSF, в свою очередь, включают модифицированные живые вакцины. Данные вакцины обладают высокой эффективностью после единственного применения, но не позволяют осуществлять дифференциацию между вакцинированными и инфицированными животными на основе серологической характеристики. Многие из этих вакцин основаны на классическом вирусном C-штамме или его производном (так называемые вакцины на основе штамма C). Кроме того, существуют вакцины, основанные на японском вирусном штамме GPE, штамме Thiverval и штамме Mexican PAV, все из которых были использованы в региональных и международных условиях (Blome et al., 2006; Greiser-Wilke & Moennig, 2004; van Oirschot, 2003). Существует значительный объем сведений относительно использования вакцин на основе штамма C. Известно, что спустя 4 суток после применения вакцины достигается полная защита животных против контрольной инфекции, вызываемой вирулентным вирусом CSF. Кроме того, спустя семь дней после проведения вакцинирования достигается полная защита против вертикальной трансмиссии контрольного вируса у животных

- 1 031518 носителей (de Smit et al., 2001). Значительным недостатком известных модифицированных живых вакцин является абсолютная невозможность проведения серологического дифференцирования между вакцинированными и инфицированными животными. В свете этого задачей настоящего изобретения является получение модифицированной живой вакцины, которая позволяет осуществлять дифференциацию вакцинированных и инфицированных животных. В области маркерных вакцин известны так называемые субъединичные вакцины из уровня техники, которые основаны на рекомбинантном гликопротеине E2 вируса CSF. Тестом на различение для данных вакцин является иммуноферментный анализ (EIA), при проведении которого используются антитела к гликопротеину E^ms для непрямого обнаружения CSFвирусных инфекций. В настоящее время на рынке доступна только одна E2-субъединичная вакцина; тем не менее, лицензия была приостановлена на несколько месяцев (см. отчет Европейского агентства лекарственных средств по E2-субъединичным вакцинам).

Вне зависимости от недоступности данных продуктов на рынке такие системы обладают серьезнейшими биологическими недостатками. Один из таких недостатков заключается в необходимости проведения хотя бы двух парентеральных иммунизаций до достижения полной защиты, что делает невозможным проведение вакцинаций с помощью приманок, при которых животных кормят приманками, содержащими единичную дозу вакцины. Кроме того, кампании по экстренной вакцинации являются допустимыми исключительно при недостижении защиты против вируса CSF дикого типа в различных экспериментах с использованием субъединичных вакцин E2, полной защиты от вертикальной трансмиссии не достигается. Другой недостаток данных систем заключается в том, что для серологической дифференциации используются антитела к гликопротеину E^ms, a чувствительность и специфичность данных тестовых систем были едва ли на среднем уровне (Floegel-Niesmann, 2003).

Живые аттенуированные CSF вакцины известны из уровня техники, однако до настоящего времени их применение было затруднено из-за различных недостатков. Большинство вакцин, известных из уровня техники, состоят из чужеродной ДНК и получены с помощью методов генной инженерии, иначе известных как технология рекомбинантных ДНК, что связано, таким образом, с проблемой возникновения серьезных рисков в отношении окружающей среды при применении такого продукта. Известны другие CSF варианты, в которых аминокислоты замещены или удалены из дикого типа TAV-эпитопа (WO 2010/074575 A2). Тем не менее, аминокислотные остатки и/или нуклеотиды, подвергающиеся модификации в рамках данного изобретения, не являются ни раскрытыми, ни предсказуемыми из уровня техники.

Для получения вариантов вируса, которые могут быть использованы в качестве вакцин, также использовалось многократное пассирование, хотя блокада антителами до этого не применялась. Многократное пассирование инфицированных вирусом культур для создания вариантов, как следует из уровня техники, таким образом, ограничено потребностью выполнения большого количества пассажей культур и, кроме того, недостатком контроля над определением эпитопа, подлежащего модификации (Hulst et al.).

Kortekaas et al. описывают генетически стабильную живую аттенуированную CSF-вакцину, которая позволяет осуществлять серологическую дифференциацию инфицированных от вакцинированных животных. Мутированный C-штамм был генетически модифицирован с использованием нацеленного подхода, в рамках которого использовалась технология рекомбинантных ДНК для создания делеций в E2 белке вируса CSF. Дальнейшие мутации были последовательно осуществлены в различных участках вирусного генома с помощью многократного пассирования для создания штаммов, обладающих усиленной пролиферацией. Штаммы, описанные у Kortekaas et al., являются сконструированными вирусами, полученными генно-инженерным путем, что является значительным недостатком в свете спорной приемлемости попадания генетически модифицированных продуктов в окружающую среду.

Holinka et al. описывают двойной антигенный маркерный живой аттенуированный штамм вируса CSF FlagT4vn, который был получен путем комбинирования двух генетических детерминант аттенуации. FlagT4v включает позитивный антигенный маркер, синтетический Flag эпитоп, включенный путем инсерции 19 мономерных звеньев в E1 гликопротеин, и негативный маркер, полученный в результате мутаций сайта связывания эпитопа моноклинального антитела WH303 (mAbWH303) в E2 гликопротеине. Интраназальное или внутримышечное введение FlagT4v защитило свиней от вирулентного штамма Brescia вируса CSF в течение раннего (2 или 3 дня) и позднего (28 дней) периода времени после прививки. FlagT4v индуцировал появление антител у свиней с негативной реакцией на Flag эпитоп, однако не был способен ингибировать связывание mAbWH303 с синтетическим пептидом, репрезентирующим WH303 эпитоп. Вакцина, описанная у Holinka, относится к вирусу, полученному с помощью генетической инженерии, геном которого включает чужеродную ДНК (последовательность октопептида FLAG наряду со связанной векторной последовательностью и маркерами). Это представляет собой существенный недостаток по сравнению с настоящим изобретением, в котором не предусматривается использование ни чужеродной, ни рекомбинантной ДНК. Документ WO 2007/143442 A2 описывает эффекты мутаций внутри эпитопа WH303 E2-вируса CSF, которые изменяют аминокислотные последовательности вирулентного вируса CSF Brescia постепенно в сторону гомологичной аминокислотной последовательности BVDVштамма NADL. Животные, инфицированные мутантными вирусами, обладали защитой при контрольном заражении вирулентный вирусом Brescia на 3 и 21 дни после проведения вакцинирования. Модификация эпитопа WH303 в данном сайте также позволяет осуществлять разработку диагностического теста для

- 2 031518 дифференцирования вакцинированных и инфицированных животных. Несмотря на эти эффекты мутации вводились с помощью генной инженерии, что связано, таким образом, с вводом чужеродного генетического материала в вирусную вакцину. Охарактеризованный выше уровень техники раскрывает вакцины, созданные с помощью рекомбинантной генной технологии в целях получения вирусных штаммов. Как описано выше, вакцины, полученные с применением методов генной инженерии, вызывают беспокойство, связанное с их влиянием на окружающую среду, и, таким образом, их применение затрудняется сложными условиями приемлемости и опасениями общественности, что, в свою очередь, представляет значительный недостаток их применения.

Сущность изобретения

В свете уровня техники техническая проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, заключается в получении маркерной вакцины для профилактики классической чумы свиней, позволяющей впоследствии дифференцировать животных, подвергшихся действию данной вакцины, от животных, инфицированных вызывающим заболевание вирусом классической чумы свиней, получаемой предпочтительно с помощью известных технологий. В предпочтительном варианте изобретения маркерную вакцину получают без использования методов рекомбинантной генной модификации. Данная проблема решается с помощью признаков независимых пунктов формулы изобретения. Предпочтительные варианты настоящего изобретения раскрыты в зависимых пунктах формулы изобретения.

Изобретение, таким образом, относится к маркерной вакцине для профилактики классической чумы свиней, позволяющей впоследствии дифференцировать животных, подвергшихся действию данной вакцины, от животных, инфицированных вызывающим заболевание вирусом классической чумы свиней, включающей модифицированный живой аттенуированный вирус классической чумы свиней, характеризующийся тем, что аминокислотная последовательность TAV эпитопа белка E2 модифицированного вируса включает по меньшей мере одну из следующих замен относительно C-штамма Riems дикого типа вируса классической чумы свиней:

замену A830V, замену P833S, замену E839G.

В предпочтительном варианте маркерная вакцина настоящего изобретения характеризуется тем, что нуклеотидная последовательность модифицированного вируса содержит по меньшей мере одну из следующих замен относительно C-штамма Riems дикого типа вируса:

замену C2862T, замену C2870T, замену A2889G.

В предпочтительном варианте маркерная вакцина настоящего изобретения характеризуется тем, что модифицированный вирус дополнительно включает по меньшей мере одну из следующих замен относительно C-штамма Riems дикого типа вируса:

замену I426V в в аминокислотной последовательности белка E^№S, замену Y576H в в аминокислотной последовательности белка E1, замену D583E в в аминокислотной последовательности белка E1, замену T951I в в аминокислотной последовательности белка E2.

замену A1649G в нуклеотидной последовательности, кодирующей белок E^№S, замену T2099C в нуклеотидной последовательности, кодирующей белок E1, замену T2122G в нуклеотидной последовательности, кодирующей белок E1, замену C3225T в нуклеотидной последовательности, кодирующей белок E2.

В предпочтительном варианте маркерная вакцина настоящего изобретения характеризуется тем, что аминокислотная последовательность TAV-эпитопа белка E2 модифицированного вируса включает последовательность SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4.

В предпочтительном варианте маркерная вакцина настоящего изобретения характеризуется тем, что нуклеотидная последовательность модифицированного вируса, кодирующая TAV-эпитоп белка E2, включает последовательность SEQ ID NO: 1.

В другом варианте маркерная вакцина настоящего изобретения характеризуется тем, что животные, подвергшиеся действию данной вакцины согласно описанному здесь, могут быть дифференцированы от животных, инфицированных вызывающим заболевание вирусом классической чумы свиней, с помощью анализа биологических проб, полученных от указанных животных, с помощью серологических методов и/или методов геномного анализа.

В другом варианте маркерная вакцина настоящего изобретения характеризуется тем, что метод геномного анализа основан на полимеразной цепной реакции (PCR), предпочтительно на PCR в реальном времени, при этом используют праймеры и/или зонды, распознающие нуклеотидную последовательность модифицированного вируса, кодирующую TAV-эпитоп белка E2.

- 3 031518

В другом варианте маркерная вакцина настоящего изобретения характеризуется тем, что серологический аналитический метод основан на проведении иммуноферментного анализа (ИФА), предпочтительно твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), при этом используют антитела, которые специфично связываются с аминокислотной последовательностью TAV-эпитопа белка E2 модифицированного вируса. В другом варианте маркерная вакцина настоящего изобретения характеризуется тем, что включает одно или более вспомогательное вещество, выбранное из смачивателей, эмульгирующих агентов, буферирующих pH агентов, адъювантов, гелеобразующих или увеличивающих степень вязкости добавок, консервантов, ароматизаторов и красителей. Следующая особенность изобретения относится к способу получения вакцинного штамма модифицированного живого аттенуированного вируса классической чумы свиней, согласно которому многократно пассируют клетки, инфицированные вирусом классической чумы свиней, в клеточной культуре с антителами, направленными на TAV-эпитоп белка E2, и/или с поликлональной сывороткой кролика, который был иммунизирован с помощью пептида CTAVSPTTLRTEVVK, являющегося TAVэпитопом белка E2, с получением модифицированного живого аттенуированного вируса классической чумы свиней, не связывающего нейтрализующие антитела, причем аминокислотная последовательность TAV-эпитопа белка E2 модифицированного вируса включает по меньшей мере одну из следующих замен относительно C-штамма Riems дикого типа вируса классической чумы свиней:

замену A830V, замену P833S, замену E839G.

В другом варианте пассируемые клетки представляют собой эмбриональные клетки почек поросят.

Изобретение далее относится к применению описываемой здесь маркерной вакцины в качестве лекарственного средства для профилактики классической чумы свиней. Следующая особенность изобретения относится к способу профилактики классической чумы свиней, включающему введение маркерной вакцины, как описано здесь, животному, предпочтительно свинье. В еще одном варианте маркерную вакцину вводят путем внутримышечного инъецирования или перорального приема.

Другой распространенной ситуацией, при которой классическая чума свиней требует проведения вакцинирования, является реагирование на обнаружение природной вирусной инфекции в популяции свиней. При заражении свиней вирусом классической чумы свиней заражены дикие или домашние свиньи, при этом требуется проведение экстренной вакцинации окружающих и/или соседствующих популяций свиней. Последовательно в течение от 1 до 2 лет проводят вакцинирование всех домашних и диких свиней в регионе в целях предотвращения крупной вспышки инфекции вируса чумы свиней. Маркерная вакцина настоящего изобретения идеально подходит для проведения экстренной вакцинации в случае обнаружения или вспышки чумы свиней. Маркерная вакцина позволяет осуществлять быстрый и эффективный оральный прием в дополнение к инъецированию, а также позволяет осуществлять дифференциацию между животными, инфицированными природным вирусом (вызывающим чуму) и вакцинированными.

Подробное описание изобретения

Разработка вакцины в соответствии с настоящим изобретением основана не на методах генетической модификации, а на принципе, заключающемся в том, что вирус самостоятельно модифицируется в целях адаптации при воздействии селективной блокады антителами. Настоящее изобретение, таким образом, относится к негенетически модифицированной живой вакцине, обеспечивающей защиту против вирулентного вируса CSF и соответствующей всем требованиям, предъявляемым к маркерным вакцинам (являясь при этом серологически и генетически отличной). Маркерная вакцина была разработана с помощью применения селективной блокады антителами к различным C-штаммам при культивировании. Полученные варианты имеют предпочтительно три аминокислотные замещения в E2 TAV-эпитопе и два компенсаторные замещения в E1 белке. Стабильность данных вариантов была доказана с помощью более чем десяти пассажей культивирования в роллерных барабанах и, например, внутримышечной вакцинацией свиней, обеспечивающей полную защиту от высоковирулентного контрольного штамма. Далее, проведение прямой дифференциации больных и вакцинированных животных стало возможно благодаря серологическим и/или генетическим методам, например с помощью отчетливого иммунофлюоресцентного окрашивания и систем полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени (rRT-PCR). Кроме того, непрямая дифференциация больных и вакцинированных животных может быть осуществлена с помощью оптимизации коммерческих E2- ELISAs (например, с помощью изменения значений порога отсечения) или с помощью разработки TAV-специфичных ELISA-систем. Таким образом получают представляемую негенетически модифицированную живую маркерную вакцину против вируса CSF.

Получение вакцины в соответствии с настоящим изобретением осуществляют следующим образом.

Встречающиеся в естественных условиях устойчивые варианты C-штамма вируса Riems отбирают из системы культивирования клеточных культур (IFN-эмбриональные клетки почки поросенка) пассированием C-штамма вируса при применении E2-TAV-специфичных антител и поликлональной сыво

- 4 031518 ротки кроликов, иммунизированных пептидом CTAVSPTTLRTEVVK.

Примененные антитела в дополнение к антителам, содержащимся в поликлональной сыворотке кроликов, полученной с помощью пептида, узнают TAV-эпитоп в Е2 белке вируса CSF и благодаря связыванию с этим эпитопом нейтрализуют вирус CSF (C-штамм). Вирус CSF обладает высокой степенью мутирования благодаря своей РНК-природе. Под действием селективной блокады антителами, обеспечивающими нейтрализацию, отбираются вирусы, подвергающиеся мутированию в эпитопе, с которым связываются антитела (в данном случае TAV-эпитоп), при этом нейтрализуются не изменившиеся вирусы дикого типа. Путем многократного пассирования под действием антител и кроличьей сыворотки при различных концентрациях и в составе различных смесей могут быть отобраны различные изоляты мутировавших вирусов. Сначала были отобраны вирусы с замещением в TAV-эпитопе. Путем дальнейшего пассирования данных вирусов при различных типах блокады антителами был отобран изолят, который имел два замещения в TAV-эпитопе и одно компенсаторное замещение в E1 белке (взаимодействие между E1 и E2 важно для структуры вируса). Данные вирусы были подвергнуты дальнейшей блокаде антителами, которая дала выделение вирусов с тремя замещениями в TAV-эпитопе в дополнение к двум компенсаторным замещениям в E1 белке. Полученные в результате этого вирусы (C-штамм вируса Riems Q7, C-штамм вируса Riems S10 и C-штамм вируса Riems O11) обладали замещениями в E2 белке в положениях 2862, 2870 и 2889, 3225 в дополнение к изменениям в E1 белке в положениях 2099 и 2122 в дополнение к замене в E^RNS белке в положении 1649.

Таблица 1

Дальнейшая информация о TAV-устойчивых вариантах

Геномное положение	Замещения нуклеотидов (С-штамм / устойчивый вариант)	Аминокислота	Белок	Аминокислотное замещение (в результате замены аминокислот в С-штамм, что дает устойчивый вариант)
1649	А на G	426	£RNS	Изолейцин на валин
2099	Т на С	576	Е1	Тирозин на гистидин
2122	Т на G	583	Е1	Аспарагиновая кислота на глютаминовую кислоту
2862	С на Т	830	Е2 (TAV-эпитоп)	Аланин на валин
2870	С на Т	833	Е2 (TAV-эпитоп)	Пролин на серин

2889	А на G	839	Е2 (TAV-эпитоп)	Глютаминовая кислота на глицин
3225	С на Т	951	Е2	Треонин на изолейцин

Изменения в нуклеотидной последовательности делают возможным использование RT-PCR системы в реальном времени, способной дифференцировать варианты (Q7, S10, O11) и природные изоляты.

Изменения в аминокислотной последовательности делают возможным дифференцирование вариантов (Q7, S10, O11) и природных изолятов по связыванию антител, при этом антитела, используемые для найтрализации (антитела A18), связываются не с вариантами, а с природными изолятами в связи с наличием высококонсервативного TAV-эпитопа в вирусе CSF. Полученные антитела к модифицированной последовательности TAV-эпитопа (с мутациями, описанными в данном изобретении) могут быть также использованы для осуществления дифференцирования между инфицирующим вирусом и вакциной, при этом антитела к вариантам будут связываться с модифицированной вирусной вакциной настоящего изобретения и позволят идентифицировать вакцинированных животных, но не будут реагировать на природные изоляты.

Таблица 2

Последовательности настоящего изобретения

SEQ ID NO	Штамм	ДНК/белок	Последовательность 5’-3’
SEQ ID NO. 1	Q7/S10/O11	ДНК	TCTTTACCACTCCTGTTCTCAGAGTC GTTGAGCTCACTACTGTGCACTCTAT GACACCCG
SEQ ID NO. 2	С-штамм	ДНК	TCTTTACCACTTCTGTTCTCAGAGTC GTTGGGCTCACTGCTGTGCACTCTAT GACACCCG
SEQ ID NO. 3	B5/2	белок	TAVSSTTLRTGVVK
SEQ ID NO. 4	Q7/S10/O11	белок	TWSSTTLRTGVVK
SEQ ID NO. 5	С-штамм	белок	TAVSPTTLRTEVVK

- 5 031518

Изобретение, таким образом, относится к маркерной вакцине для профилактики классической чумы свиней, включающей модифицированный живой аттенуированный вирус классической чумы свиней.

В предпочтительном варианте изобретение относится к маркерной вакцине для профилактики классической чумы свиней, включающей модифицированный живой аттенуированный вирус классической чумы свиней, характеризующийся тем, что вирусная аминокислотная последовательность TAV-эпитопа E2 белка включает последовательность, отличную от последовательности вируса классической чумы свиней дикого типа, причем аминокислотная последовательность вируса содержит по меньшей мере одну из следующих замен:

замену аминокислоты 830 на валин, замену аминокислоты 833 на серин, замену аминокислоты 839 на глицин.

В предпочтительном варианте маркерная вакцина настоящего изобретения характеризуется тем, что модифицированный вирус получают без использования методов рекомбинантных ДНК.

В предпочтительном варианте маркерная вакцина настоящего изобретения характеризуется тем, что нуклеотидная последовательность вируса содержит одну или более из следующих замен:

замену нуклеотида в положении 2862 на T, замену нуклеотида в положении 2870 на T, замену нуклеотида в положении 2889 на G.

В предпочтительном варианте маркерная вакцина настоящего изобретения характеризуется тем, что вирусная аминокислотная последовательность вируса содержит одну или более из следующих замен:

замену аминокислоты 426; в белке E^№S на валин, замену аминокислоты 576; в белке E1 на гистидин, замену аминокислоты 583; в белке E1 на глютаминовую кислоту, замену аминокислоты 951; в белке E2 на изолейцин.

замену нуклеотида в положении 1649 на G, замену нуклеотида в положении 2099 на C, замену нуклеотида в положении 2122 на G, замену нуклеотида в положении 3225 на T.

В предпочтительном варианте маркерная вакцина настоящего изобретения характеризуется тем, что вирусная аминокислотная последовательность TAV-эпитопа включает последовательность SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4.

В предпочтительном варианте маркерная вакцина настоящего изобретения характеризуется тем, что нуклеотидная последовательность вируса включает последовательность SEQ ID NO: 1.

В другом варианте маркерная вакцина настоящего изобретения характеризуется тем, что животные, подвергнутые терапии с помощью вакцины согласно описанному здесь, могут быть дифференцированы от животных, инфицированных вызывающим заболевание вирусом чумы свиней с помощью анализа биологических проб, полученных от указанных животных, с помощью серологических методов и/или методов геномного анализа. В другом варианте маркерная вакцина настоящего изобретения характеризуется тем, что метод геномного анализа основан на полимеразной цепной реакции (PCR), предпочтительно на PCR в реальном времени, при этом используют праймеры и/или зонды, распознающие нуклеотидную последовательность модифицированного вируса, кодирующую TAV-эпитоп белка E2.

В другом варианте маркерная вакцина настоящего изобретения характеризуется тем, что серологические аналитические методы основаны на проведении иммуноферментного анализа (ИФА), предпочтительно энзимсвязанного иммуносорбентного анализа (ELISA), при этом используют антитела, которые специфично связываются с аминокислотной последовательностью TAV-эпитопа белка E2 модифицированного вируса. В одном варианте осуществления изобретения маркерная вакцина включает одно или более вспомогательное вещество, выбранное из смачивателей, эмульгирующих агентов, буферирующих pH агентов, адъювантов, гелеобразующих или увеличивающих степень вязкости добавок, консервантов, ароматизаторов и красителей.

Следующая особенность изобретения относится к маркерной вакцине, получение которой возможно за счет получения устойчивых вариантов вируса, вызывающих заболевание, или других известных штаммов вируса чумы свиней с применением блокады антителами. Указанная вакцина включает модифицированный живой аттенуированный вирус классической чумы свиней, характеризующийся тем, что аминокислотная последовательность TAV-эпитопа белка E2 модифицированного вируса включает по меньшей мере одну из следующих замен относительно C-штамма Riems дикого типа вируса классической чумы свиней:

замену A830V, замену P833S, замену E839G.

Следующая особенность изобретения относится к способу получения вакцинного штамма модифи

- 6 031518 цированного живого аттенуированного вируса классической чумы свиней, предпочтительно такого, как описано здесь, включающему получение устойчивых вариантов вируса, вызывающих заболевание, или других известных штаммов вируса чумы свиней с помощью применения блокады антителами. Указанная вакцина включает модифицированный живой аттенуированный вирус классической чумы свиней, характеризующийся тем, что аминокислотная последовательность TAV-эпитопа белка E2 модифицированного вируса включает по меньшей мере одну из следующих замен относительно C-штамма Riems дикого типа вируса классической чумы свиней:

замену A830V, замену P833S, замену E839G.

B предпочтительном варианте способ получения, как описано здесь, характеризуется тем, что включает:

многократное пассирование клеток, предпочтительно эмбриональных клеток почек поросят, инфицированных вирусом классической чумы свиней, в клеточной культуре с антителами, направленными на TAV-эпитоп белка E2, и/или с поликлональной сывороткой кролика, который был иммунизирован с помощью пептида CTAVSPTTLRTEVVK, являющегося TAV-эпитопом белка E2, с получением модифицированного живого аттенуированного вируса классической чумы свиней, не связывающего нейтрализующие антитела, причем аминокислотная последовательность TAV-эпитопа белка E2 модифицированного вируса включает по меньшей мере одну из следующих замен относительно C-штамма Riems дикого типа вируса классической чумы свиней:

замену A830V, замену P833S, замену E839G.

Следующая особенность изобретения относится к применению маркерной вакцины, такой как описано здесь, в качестве лекарственного средства для профилактики классической чумы свиней, предпочтительно с помощью внутримышечного инъецирования или перорального применения.

Следующая особенность изобретения относится к способу профилактики классической чумы свиней, включающему введение маркерной вакцины, как описано здесь, животному, предпочтительно свинье, предпочтительно с помощью внутримышечного инъецирования или перорального применения.

Настоящее изобретение относится к модифицированному вирусу чумы свиней, который может состоять из неких или всех возможных комбинаций мутаций и замещений (замен), описанных здесь. Примеры и экспериментальное подтверждение, приводимое здесь, демонстрируют, что были получены вирусные штаммы, обладающие только подмножеством все замещений, перечисленных в табл. 1. Данные вирусные штаммы проявляют протективное действие в дополнение к возможности быть используемыми в качестве маркеров, достигая, тем самым, цели настоящего изобретения. Предпочтительные штаммы настоящего изобретения относятся к штаммам, включающим подмножества описанных замещений в дополнение к тем штаммам, которые включают все описанные замещения.

Было крайне удивительно, что комбинации, состоящие из одного или нескольких специфических генных модификаций (достигнутых в рамках природных процессов, являющихся результатом блокады антителами), способны привести к получению полезных свойств маркерной вакцины, описанной здесь. Некоторые подобные модификации известны из уровня техники, однако ни одна из них не подразумевает, что остатки, модифицированные в настоящем изобретении, способны создавать эффективную защиту, в частности, от заражения вирусом CSF. Их уникальные комбинации обуславливают набор описанных свойств, которые обеспечивают реализацию изобретения, в качестве вакцины, подходящей для проведения дифференциации между инфицированными и вакцинированными животными. Ранее было неизвестно, что селективная блокада, примененная в настоящем изобретении, с помощью обработки антителами может привести к описанной здесь точной модификации. Комбинации генных модификаций, описанных здесь, действуют совместно, создавая синергетический эффект компенсаторных мутаций, которые поддерживают структуру белка, в то же время позволяя TAV-остаткам мутировать и, таким образом, обеспечивают маркерные свойства, что отвечает задаче настоящего изобретения.

Термин генная инженерия относится к генетической модификации или манипуляции с геномом организма, например, путем ввода чужеродного материала, состоящего из нуклеиновой кислоты, такого как ДНК или РНК, или синтетических последовательностей нуклеиновой кислоты в геном хозяина. Данная технология также известна как технология рекомбинантных ДНК.

Термин аттенуированный вирус относится к вирусу, который был модифицирован любым образом так, что вирус является менее вредоносным и/или менее вирулентным по сравнению с вирусом дикого типа (вызывающим заболевание). Например, меньшие симптомы, связанные с заболеванием, проявляются у животных, инфицированных аттенуированным вирусом по сравнению с вирусом дикого типа.

Термин блокада антителами или селективная блокада антителами в рамках настоящего изобретения относится к применению антител в течение культивации клеток, предпочтительно в течение многократных пассажей, которые специфичны к одному или нескольким определенным эпитопам вируса.

- 7 031518

Такие антитела могут являться антителами любого типа, известного из уровня техники, являться моноили поликлональными, могут содержаться в сыворотке животных, иммунизированных представляющим интерес пептидом, например мишеневым эпитопом. Такие антитела часто называют нейтрализующими антителами. При селективной блокаде антителами, обеспечивающими нейтрализацию, вирусы, подвергающиеся мутированию в эпитопе, с которым связываются антитела (в данном случае TAV-эпитоп), отбирают вследствие их преобладания в росте, так как антитела более не связываются с указанным эпитопом и, таким образом, более не обеспечивают ограничивающий или нейтрализующий эффект, при этом неизмененные вирусы дикого типа нейтрализуются антителами и селективно подавляются в культуре.

Данные вирусы, подвергающиеся мутированию в эпитопе, с которым связываются антитела (а данном случае TAV-эпитоп), называют устойчивыми вариантами. Данные варианты являются объектом настоящего изобретения и являются генетически и серологически отличаются от вируса дикого типа.

Термин многократное пассирование относится к способу многократного пассирования клеточных культур (также известному как субкультивирование или отъемно-доливной способ культивирования), при этом небольшое количество клеток переносят в новый сосуд, предпочтительно содержащий свежую питательную среду, или осуществляют его с помощью многократного разведения клеточных культур новой питательной средой, так что клеточным культурам дают возможность продолжать расти без связанных с этим эффектов высокой плотности клеток в культурах.

Что касается маркерной вакцины, изобретение также может относиться к группе изобретений, объединенных на основе единого изобретательского замысла. Маркерная вакцина, сам вирус и фармацевтическая композиция на его основе, их применение при терапии животных в целях вакцинирования и способы продуцирования вируса подпадают под общую изобретательскую концепцию. Новизна и изобретательский уровень маркерной вакцины, описанной здесь, реализуют и объединяют все аспекты настоящего изобретения таким образом, что разнообразные варианты осуществления, описанные здесь, составляют единое целое изобретение.

В случаях, когда в настоящем изобретении приведены нуклеотидные последовательности, перечни последовательностей охватывают соответствующие последовательности РНК и последовательности ДНК. Несмотря на то, что некоторые нуклеотидные последовательности приведены в виде последовательностей ДНК, соответствующие им последовательности РНК (например в тех случаях, при которых геном вируса включает молекулу РНК) также раскрываются в настоящем изобретении. Нуклеотидные последовательности настоящего изобретения также раскрывают комплементарные последовательности перечисленных последовательностей, например комплементарную последовательность, способную связываться с указанной последовательностью в соответствии с правилом комплементарности УотсонаКрика. Соответствующие комплементарные последовательности РНК и/или ДНК не требуют приложения изобретательских навыков для перехода из одного типа в другой и являются легкодостижимыми для специалиста в данной области.

Метод приема вирусной вакцины настоящего изобретения, композиций данного изобретения, таких как фармацевтические, иммунологические, антигенные или вакцинные композиции или терапевтические композиции, может быть назначен как парентеральный прием, например внутрикожные, внутримышечные или подкожные методы введения. Такие методы приема обеспечивают возникновение системного иммунного ответа, или гуморальных, или клеточных иммунных ответов. Вакцина в соответствии с настоящим изобретением также может быть назначена для орального приема таким путем как включение в корм для животных, что обеспечивает простую и эффективную иммунизацию больших популяций, например популяций европейского дикого кабана.

Предпочтительные способы введения относятся к подкожному приему или внутримышечному приему, предпочтительно с помощью инъецирования, и оральному приему.

В целом композиции вакцины данного изобретения или терапевтические композиции могут быть получены в соответствии со стандартными методиками, хорошо известными специалистам в области фармацевтики или ветеринарии.

Терапевтически эффективное количество данных композиций может быть предписано для приема в особых дозировках и с помощью методик, хорошо известных специалистам в области медицины или ветеринарии, с учетом таких факторов, как возраст, пол, вес, порода и состояние конкретного животного, а также способ приема. Композиции могут быть назначены для самостоятельного приема, или могут быть совмещены, или последовательно совмещены с композициями, например с другими иммунологическими, антигенными, или вакцинными, или терапевтическими композициями, образуя, таким образом, мультивалентые, или смешанные, или комбинированные композиции изобретения и способы, предусматривающие их использование. Еще раз обращаем внимание, что ингредиенты и способ приема (последовательный или совместный), а также дозировки могут быть определены с учетом таких факторов, как возраст, пол, вес, порода и состояние конкретного животного и методика приема.

Примеры композиций изобретения включают жидкие препараты для приема внутрь, например для орального, назального, анального, вагинального, перорального, внутрижелудочного и других способов приема, такие как суспензии, сиропы или эликсиры, и препараты для парентерального, подкожного, внутрикожного, внутримышечного или внутривенного приема (например, с помощью инъецирования),

- 8 031518 такие как стерильные суспензии или эмульсии.

В таких композициях варианты вируса CSF могут быть добавлены в фармацевтически приемлемый носитель, растворитель или наполнитель, такой как стерильная вода, физраствор, глюкоза и им подобные. Композиции также могут быть подвергнуты лиофилизированию. Композиции могут содержать вспомогательные вещества, такие как смачиватели или эмульгирующие агенты, буферирующие агенты pH, адъюванты, гелеобразующие или увеличивающие степень вязкости добавки, консерванты, ароматизаторы, красители и им подобные, в зависимости от способа приема и требуемого препарата.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - сравнения последовательностей;

фиг. 2 - непрямой иммунофлюоресцентный анализ;

фиг. 3 - реакция нейтрализации со штаммом Rosrath вируса CSF;

фиг. 4 - исследования на животных 06/10 Idexx E2-ELISA с сывороткой свиньи.

Подробное описание чертежей

Фиг. 1. Сравнения последовательностей. A) Сравнение нуклеотидных последовательностей региона эпитопа TAV вариантов Q7, S10, O11 и природного изолята С-штамма. B) Сравнение аминокислотной последовательности региона TAV-эпитопа вариантов Q7, S10, O11 и природного изолята C-штамма.

Фиг. 2. Непрямой иммунофлюоресцентный анализ. A) Анализ устойчивых Е2-мутантов, B5/2 Пассаж 2 (вирус-предшественник для Q7, S10 и O11, включающий только 2 замещения в TAV-эпитопе). B) Анализ C-штамма вируса.

Фиг. 3. Через три недели после иммунизации все животные, за исключением одного животного в группе S10 и одного животного в группе O11, демонстрировали появление нейтрализующих антител. Спустя 7 дней после инфицирования иммунизированные животные демонстрировали значение титра реакции нейтрализации 640 и более. Нижним значением титра было 320, демонстрированное одним животным из группы, иммунизированной TAV-мутантом. Неиммунизированные контрольные животные не демонстрировали титр в реакции нейтрализации против Rosrath.

Фиг. 4. Животные, иммунизированные С-штаммом, демонстрировали положительные результаты в тесте E2-ELISA спустя 21 день после иммунизации. Спустя 7 дней после инфицирования все иммунизированные животные демонстрировали четко положительные результаты в тесте ELISA. Неиммунизированная контрольная группа демонстрировала отсутствие поддающихся обнаружению антител против инфекции.

Примеры

План и методы эксперимента.

Иммунизация кроликов TAV-пептидом.

Два кролика возрастом 8-10 недель (с метками на ухе 304 и 305) были иммунизираны по следующей схеме с использованием пептида CTAVSPTTLRTEVVK, конъюгированного с гемоцианином фиссурелли в целях получения поликлональной сыворотки, нейтрализующей C-штамм. Иммунизацию выполняли с последующим проведением 6 реиммунизаций с интервалом около месяца.

Изолирование устойчивых вирусных E2 вариантов C-штамма Riems.

Для создания блокады антителами для получения мутаций C-штамма вируса Riems в гликопротеине E2 вирус подвергали воздействию различных антител к TAV-эпитопу E2 белка, применяя различные концентрации. Инфицированные клетки были последовательно культивированы и пассированы несколько раз. Антитела, примененные в настоящих экспериментах, являются моноклинальными E2специфичными антителами, которые являются коммерчески доступными для проведения E2-ELISA теста вируса CSF.

Антитела:

A18I (IDEXX),

A18B (Bommeli),

A18C (Ceditest),

HC34 (CRL, Hannover),

WH303 и WH211 (Weybridge, Great Britain).

Инкубацию вирусных культур выполняли следующим образом. Применяли различные концентрации и смеси антител с различными количествами вируса. Культивирование осуществляли в течение 2-6 ч при комнатной температуре. Суспензию, содержащую вирус и антитела, наносили на чашки с клеточной культурой с конфлюэнтным ростом и далее культивировали. В течение этого времени вирус абсорбировался клетками (клетками PK15) в течение 1-2 ч при температуре 37°C. Наконец добавляли питательную среду, и культивировали чашки в течение 72 ч при температуре 37°C и 5% COT.

Спустя 72 ч супернатанты культуры клеток были отделены и собраны. Затем чашки зафиксировали и подвергли окрашиванию с помощью иммунофлюоресцентного красителя и C16 антитела (специфичного к ИЪ3-белку вируса CSF). Супернатанты клеточной культуры, дающие в лунках слабоположительный результат, затем пассировали с последующей блокадой антителами, как описано выше. Супернатанты клеточной культуры из лунок чашек, содержащих одиночные позитивные клетки или одиночные окрашенные клеточные бляшки, затем пассировали под очень слабым воздействии блокады антителами или

- 9 031518 без него для увеличения титра вируса в течение 1-2 пассажей. Были отобраны различные супернатанты клеточной культуры для секвенирования в E1- и Б2-регионах.

Отслеживание устойчивых вариантов вируса выполняли используя иммунофлюоресцентное окрашивание с помощью C16 антитела или A18 антитела для получения устойчивых вариантов. Варианты вируса, несущие изменение в TAV-эпитопе более не могут быть подвержены окрашиванию с помощью A18 антитела.

История пассирования.

Таблица 3

Истории пассажей C-штамма Riems устойчивых вирусов

Вариант 011	Вариант Q7	Вариант S10
Пассаж	Замеще ние	Пассаж	Замещение	Пассаж	Замещение
SP867/2+ А18(В)/НС34 (0.2 мг/мл)
D5+ А18 (В, С)	2870
16Р1+А18(В,1,С) je 0.25 мг/мл (50 мкл)+ 50 мкл 305	2870 2122
В1А1+0.25 мг/мл А18(С,В,1) (100 мкл) + 100 мкл 305
В5/2	2870, 2122, 2889, 3225
В5/2-Р2 (без блокады)
В5/2-РЗ (без блокады)
В5/2-РЗ+0.1 мг А18(1)+50 мкл 304
В5/2-РЗ* +0.1 мг А18 (I) +50 мл 305
С32+ 50 мкл А18 (I) + 50 мкл 305

СВ32-Р2 (-)	2870, 2122, 2889, 3225, 2862, 2099
CB32-P3 +А18(1,С) каждые 50 мкл, +305(25)
Z2+A18(I,C) 50 мкл, +304/305 25 мкл
F8 +304/305 30 мкл
G18 + 304 30 мкл
Н15 (-)		Н15 (-)	2870, 2122, 2889, 3225, 2862, 2099	Н15 +304 50 мкл	2870, 2122, 2889, 3225, 2862, 2099
116 +А18(1,С) 50 мкл +10 мкл НС34 +304 25 мкл		115 А18(1,С) 30 мкл +304 30 мкл +НС34 15 мкл		114 А18(1,С) 30 мкл +304 30 мкл +НС34 15 мкл
К12 (-)		04 +А18 (I 50 мкл, В 25 мкл) +304/305 25 мкл		N2 +А18(С 30 мкл, I 50 мкл) +304 50 мкл +305 25 мкл +НС34 15 мкл
L7(-)		Р4 +305 50 мкл		Об +А18 (I 50 мкл, В 25 мкл) +304/305 25 мкл
N17 (-)		Q7		Q6 +А18 (I

- 10 031518

ные иммунофлуоресцентные окрашивания с помощью антител A18-idexx, A18-bommeli, A18-ceditest и C16. Устойчивые варианты пассировали в бутылях с клеточными культурами (все) в дополнение к роллерному культивированию (Q7, S10, O11) и затем секвенировали, дифференцированно окрашивали и титровали.

Q7-специфичная RT-PCR в реальном времени.

Для того чтобы исследовать генетические характеристики вируса и, таким образом, проверить одно из маркерных свойств вакцины, выполняли детекцию вирусной РНК после иммунизации устойчивыми вариантами с использованием праймеров и зонда, способных различать устойчивые варианты от оригинального C-штамма Riems и природных изолятов вируса CSF.

Исследование на животных 27/09. Тестирование иммунного ответа на мутанты B5/2-P6 и I16-P2 Cштамма Riems.

В данном исследовании на животных трех поросят иммунизировали 2 мл суспензии вируса (супернатант клеточной культуры) внутримышечно. Определение по группам животных выполняли следующим образом: группа A (B5/2), группа B (I16) и получившая C-штамм Riems контрольная группа (Riemser-вакцина против чумы свиней). Серологическое исследование иммунного ответа выполняли для каждой группы.

Исследование на животных 06/10. Тестирование устойчивых вариантов Q7, S10 и O11.

Следующие исследования на животных выполняли для определения наиболее подходящих устойчивых вариантов для свиней-реципиентов в плане отсутствия опасного эффекта и большей эффективности при внутримышечном введении.

В исследовании использовали 21 поросенка в возрасте 8-9 недель (весом около 15-20 кг). Каждый поросенок был иммунизирован с помощью 2*10⁵’⁰ КГО₅₀/мл, в/м.

Были изучены 5 групп:

Группа 1 (5 свиней): мутанты вариантов Q7-P7 С-штамма (1О⁵⁰ KIDso/мл)

Группа 2 (5 свиней): мутанты вариантов S10-P8 С-штамма (1О⁵⁰ KIDso/мл)

Группа 3 (5 свиней): мутанты вариантов О11-Р8 С-штамма (10⁵⁰ KIDso/мл)

Группа 4 (3 свиньи): Riemser-вакцина против чумы свиней (исходный вирус)

Группа 5 (3 свиньи): неиммунизированная контрольная группа

Иммунизиция и взятие проб крови:

дней после вакцинации Взятие пробы крови (ЭДТА и сыворотка), иммунизация дней после вакцинации Взятие пробы крови (ЭДТА) дней после вакцинации Взятие пробы крови (ЭДТА и сыворотка) дней после вакцинации Взятие пробы крови (ЭДТА и сыворотка) Данные о температуре тела и клинических симптомах получали ежедневно.

Тестирование:

дней после вакцинации Взятие пробы крови (ЭДТА и сыворотка), Носовой мазок

Тестирование с помощью высоковирулентного штамма Koslov вируса CSF(1x 10⁶⁵ KIDso) дней после иммунизации Взятие пробы крови (ЭДТА и сыворотка), Носовой мазок дней после иммунизации Взятие пробы крови (ЭДТА и сыворотка), Носовой мазок

10 дней после иммунизации	Взятие	пробы	крови	(ЭДТА	И	сыворотка),	Носовой
мазок
14 дней после иммунизации	Взятие	пробы	крови	(ЭДТА	и	сыворотка),	Носовой
мазок
21 дней после иммунизации	Взятие	пробы	крови	(ЭДТА	и	сыворотка),	Носовой
мазок
28 дней после иммунизации	Взятие	пробы	крови	(ЭДТА	и	сыворотка),	Носовой

мазок

Исследование на животных 24/10. Тестирование устойчивых вариантов S10 и O11; защита после оральной иммунизации.

В целях проверки эффективности орального применения выполняли следующее исследование на

- 11 031518 животных. В качестве животных для тестирования использовали 15 поросят в возрасте 8-10 недель (весом около 15-20 кг).

Группа 1 (6 свиней): мутанты А С-штамм вариант S10

Группа 2 (6 свиней): мутанты В С-штамм вариант 011

Группа 3 (3 свиньи): контроль инфицирования (невакцинированные)

Иммунизация и взятие проб крови:

дней после вакцинации дней после вакцинации дней после вакцинации дня после иммунизации дней после иммунизации дней после иммунизации дней после иммунизации день после иммунизации дней после иммунизации

Взятие пробы крови

Носовой мазок

Взятие пробы крови

Носовой мазок

Взятие пробы крови

Носовой мазок

Взятие пробы крови

Носовой мазок

Взятие пробы крови

Носовой мазок

Взятие пробы крови

Носовой мазок

Взятие пробы крови

Взятие пробы крови (ЭДТА и сыворотка), (ЭДТА и сыворотка), (ЭДТА и сыворотка), (ЭДТА и сыворотка), (ЭДТА и сыворотка), (ЭДТА и сыворотка),

Данные о температуре тела и клинических симптомах получали ежедневно.

Результаты эксперимента.

Иммунизация кроликов TAV-пептидом.

Сыворотки обоих кроликов (304 и 305) были положительны при использовании коммерчески доступного E2-ELISA теста после третьей реиммунизации (приблизительно спустя 12 недель после первой иммунизации). В тесте нейтрализации вируса обе сыворотки оказались позитивными приблизительно три недели спустя третьей реиммунизации. Титры в тесте нейтрализации были низкими и еще более снижались после проведения 4-6-й реиммунизаций.

Таблица 4

Характеристика сыворотки кроликов 304 и 305 после иммунизации TAV-пептидом

Сы воротка	Е2 ELISA IDEXX Ингибирование в %	NT Alfort	Комментарии
304	6	<5	Иммунизация 1
305	10	<5

304	28	<5	Реиммунизация 1
305	19	<5
304	45	<5	Реиммунизация 2
305	26	<5
304	87	5	Реиммунизация 3
305	60	<5
304	90	10	Реиммунизация 4
305	77	5
304	Не выполняли	5	2 недели после реиммунизации 5
305	Не выполняли	<5
304	Не выполняли	7,5	1 неделя после реиммунизации 6
305	Не выполняли	<5
304	Не выполняли	<5	3 недели после реиммунизации 6
305	Не выполняли	<5

Изолирование устойчивых вариантов E2 C-штамма Riems вируса.

Культивирование C-штамма Riems вируса E2-специфичными антителами вело, после всего лишь нескольких пассажей, к изолированию устойчивых вариантов, включающих одно замещение в регионе E2 в положении 2870. Для изолирования дальнейших вариантов также было важно осуществить компенсаторную замену в E1 белке в положении 2122, например как в изоляте 16P1. При одновременном осу

- 12 031518 ществлении замен требовалось всего лишь несколько пассажей при блокаде антителами и давлении сыворотки для изолирования дополнительных вариантов, включающих дополнительно замещение в положении 2889 в E2 белке. Некоторые из этих устойчивых вариантов показывали дополнительную замену в положении 3225 в E2 белке. Примером такого устойчивого варианта является изолят B5/2.

Схематическое описание TAV-эпитопа варианта B5/2

Дикий тип С-штамма: CTAVSPTTLRTEVVK

Мутант В5/2: CTAVSSTTLRTGWK

Последующее пассирование изолята B5/2 при блокаде антителами вело к выделению изолята CB32. Данный изолят дополнительно включал еще одно замещение в E2 белке (нуклеотид 2862) в дополнение к компенсаторному замещению в E1 белке в положении 2899. Изолят CB32 был получен из смеси вариантов B5/2 и нового варианта с дополнительным замещением. В целях выделения новых вариантов, включающих дополнительные замещения, изолят CB32 многократно пассировали при блокаде антителами. Изоляты Q7, S10 и O11 изолировали из последующего и объединенного пассажа H15.

См. сравнение последовательностей TAV-эпитопа мутантов S10, O11 и Q7 на фиг. 1. См. обзор нуклеотидных и аминокислотных замещений в изолированных устойчивых вариантах в табл. 1.

Описание устойчивых вариантов B5/2, I16, Q7, S10 и O11.

Тестирование устойчивых вариантов на предмет связывания различных E2-специфичных антител выполняли с помощью иммунофлуоресценции.

Таблица 5

Непрямое иммунофлюоресцентное окрашивание отобранных устойчивых вариантов E2 с замещением в E2 белке

Е2 мутанты	С16 CSF-NS3B	A18Bommeli CSF-E2
SNT	положительно	отрицательно
16Р1	положительно	отрицательно
25РЗ	положительно	отрицательно
60РЗ	положительно	отрицательно
12Р5	положительно	отрицательно
34Р5	положительно	отрицательно
50Р5	положительно	отрицательно
51Р5	положительно	отрицательно
5Р6	положительно	отрицательно
48Р6	положительно	отрицательно
59Р7	положительно	отрицательно
60Р7	положительно	отрицательно
С-штамм	положительно	отрицательно
Alfort	положительно	отрицательно

В большинстве случаев единственного аминокислотного замещения в TAV-эпитопе было достаточно для обеспечения отрицательного сигнала при проведении иммунофлуоресценции с использованием антитела A18Bommeli. Устойчивые варианты с двумя TAV-мутациями (такие как B5/2) также показали отрицательные результаты при использовании антител A18Bommeli и A18C (фиг. 2).

Таблица 7 Иммунофлюоресцентное окрашивание определенных пассажей различных устойчивых E2-вариантов, включающих три замещения в TAV-эпитопе

Все протестированные изоляты демонстрировали отрицательные сигналы в отношении выбранных пассажей окрашиваний A18. Тем не менее, на 8-м пассаже изолята S10 небольшая колония оказалась окрашенной при применении антитела WH303. Это подтверждает высокую стабильность замещений в TAV-эпитопе. Дальнейшие тестирования стабильности выполняли для изолятов Q7, S10 и O11 с использованием роллерных культур в течение 10 дополнительных пассажей.

- 13 031518

Таблица 8

Дифференциальное окрашивание выбранных пассажей антителами A18 (idexx, bommeli и

EZ - несколько одиночных клеток.

На 10-м пассаже ни один из вариантов вируса не демострировал реверсии, поэтому окрашивание было возможно только для C16. Вариант Q7 был отрицателен при проведении всех окрашиваний до 14го пассажа, при этом при 16-м пассаже его также было невозможно определить с помощью антитела C16. Данные выводы были подтверждены с помощью OT-PCR в дополнение к секвенирующим протоколам PCR. Является, таким образом, очевидным, что при 16-м пассаже вирус отсутствовал, поэтому вероятность ошибки при проведении пассировании также может быть исключена. Некоторые клетки, тем не менее, были окрашены при 14-м и 16-м пассаже изолята S10 с использованием антитела A18 (idexx). Для мутанта O11 выполняли 16 пассажей перед тем, как некоторые отдельные клетки были окрашены с помощью антител A18 (bommeli) и WH303. Данные результаты демонстрируют высокую стабильность серологических характеристик вирусных вакцин, как описано здесь.

Описание устойчивых вариантов с помощью секвенирования E1 и E2.

Таблица 9

Секвенирование ранних изолятов, включающих замещение в TAV-эпитопе E2 белка

Мутанты	секвенирование - оригинал	секвенирование - 10-й пассаж
48Р6	Замещение 2870	Замещение 2870
2SNTP1	Замещение 2870	Замещение 2870
59Р7	Замещение 2870	Замещение 2870
60Р7	Замещение 2870	Замещение 2870
5Р6Ь	Замещение 2870	Замещение 2870
D9	Замещение 2870	Замещение 2870
Е51	Замещение 2870	Замещение 2870
Е52	Замещение 2870	Замещение 2870
16Р1	Замещение 2870, Замещение 2122	Замещение 2870, Замещение 2122

Замещение в положении 2870 было осуществлено у всех изолятов после 10 пассажей, что представляется очень стабильным. Это подкрепляет заключение о том, что данное замещение не оказывает значительного влияния на структуру белка, поэтому реверсия к последовательности дикого типа не несет пре имуществ.

Таблица 10 Секвенирование изолятов с 3-мя замещениями в TAV-эпитопе белка E2

Е2мутант	Титр вируса /мл	Замещение £RNS	Замещение Е1	Замещение Е2	Стабильные мутации

116-РЗ	10 ^{5 25}	1649	2099 2122	2862 (80%) 2870 2889 3225	I16-P24 1649, (1657,1878) 2122, 2870, 2889
Q7-P8	10⁵	1649	2099 2122	2862 2870 2889 3225	Q7-P17 1649,2099,2122 2862, 2870, 2889, 3225
О11-Р7	10⁵	1649	2099 2122	2862 2870 2889 3225	О11-Р14 1649,2099,2122 2862, 2870, 2889, 3225
S10-P8	10⁵	1649	2099 2122	2862 2870 2889 3225	S10-P15 1649,2099,2122 2862, 2870, 2889, 3225

- 14 031518

Изменения в последовательности у изолятов O11, S10 и Q7 были стабильными при проведении всех тестовых пассажей (14-17).

Таблица 11

Секвенирование изолятов Q7, S10 и O11 после проведения различных пассажей в роллерных культурах

Образец	Q7- Р10	Q7- Р14	Q7-P16	S10- Р10	S10- Р14	S10- Р17	О11-Р9	011- Р14	011- Р16
Е1 белок	2099	2099	не	2099	2099	2099	не определяли	2099	2099
	2122	2122	секвенировали	2122	2122	2122	не определяли	2122	2122

Е2 белок	2862			2862	2862	2862	2862	2862	2862
	2870			2870	2870	2870	2870	2870	2870
	2889			2889	2889	2889	2889	2889	2889

Все секвенированные пассажи трех вариантов вируса содержали замещения в E1 и E2 белках, вызванные иммунным давлением. 16-й пассаж Q7 не мог быть подвергнут секвенированию, скорее всего в связи с тем, что в супернатанте культуры клеток отсутствовал остаток вируса (см. выше). При невозможности исключения появления ревертантых вирусов, основанных на различных окрашиваниях, приведенных на фиг. 2, они способны быть обнаружены исключительно с помощью секвенирования начиная от определенного значения процентного соотношения. Необычно большое количество вирусов, тем не менее, не ревертирует и продолжает включать замещения. Отдельные ревертирующие вирусы не могут быть определены с помощью секвенирования.

Q7-специфичная RT-PCR в реальном времени.

В целях проведения дифференцирования между вакцинированными и инфицированными животными применяли систему RT-PCR. В связи с тем, что TAV-эпитоп является высококонсервативным у всех вирусов CSF, использовали замещения в TAV-эпитопе в качестве основания для праймеров и зондов при проведении PCR в реальном времени.

Таблица 13

Использование RT-PCR в реальном времени для контролирования степени концентрации вируса. Применяли следующие системы PCR: CSF Mix1 (специфична для вируса CSF, распознает все штаммы), Q7-TAV (специфичная для вариантов) и C-штамм-TAV смесь (также способная определять C-штамм дикого типа с намного более низкой чувствительностью). Результаты приведены в виде значений Ct (порога цикла)

познала все штаммы вируса CSF и не позволила осуществить дифференциацию между диким типом Сштамма и новыми устойчивыми вариантами. Система Q7-TAV определила, в частности, все три устойчивых варианта. Система C-strain-TAV определила только дикий тип C-штамма (ни один из устойчивых вариантов) при значении Ct около 14. Очень малое уменьшение разности между значениями Ct систем RT-PCR Q7-TAV и C-штамм-TAV при увеличении количества пассажей является убедительным доказательством для очень малого количества ревертантов после большого количества проведенных пассажей. В целом, разность между двумя системами, составляющая 14 Ct, отражает соотношение между мутантами к ревертантам, равное приблизительно 1:8000, при этом значение Ct 10 отражает соотношение 1:1000.

Исследование на животных 27/09. Оценка иммунного ответа на мутанты B5/2-P6 и I16-P2 Cштамма Riems вируса.

Выполняли внутримышечную иммунизацию 3 поросят, при этом каждому поросенку вводили 2 мл вирусной суспензии (супернатант культуры клеток). Группу A подвергали действию B5/2, группу B подвергали действию I16, а контрольную группу подвергали действию вакцины Riemser против чумы свиней. Данные исследования обеспечивают проведение анализа иммунного ответа после иммунизации, позволяют протестировать маркерные свойства вакцинирования после модифицированного иммунного ответа (ELISA) и свойства вируса у вакцинированных животных (генетическую стабильность и его качества, связанные с репликацией).

Обратное титрование примененных вирусов показало следующие результаты:

- 15 031518

В5/2-Р6: Титр вируса 10^{4 25} вирус/мл

I16-P2: Титр вируса 10^{4 75} вирус/мл

Толерантность животных к вакцине.

Свиньи, подвергшиеся иммунизации, не демонстрировали явных симптомов (повышение температуры или симптомы заболевания отсутствовали). Количество лейкоцитов не было увеличено сверхнормы в течение первых 7 дней после иммунизации.

Вирус не мог быть выделен из крови. Использовали РНК, изолированную из проб крови спустя 4 и 7 дней после иммунизации, для проведения анализа RT-PCR. Продукт PCR являлся, тем не менее, неподходящим для проведения последующего секвенирования. Это демонстрирует крайне низкую степень репликации вируса у животных.

Обратное титрование обнаружило следующие концентрации вируса, использованные в экспериментах

Q7-P8 10⁴⁰ KIDso/мл

S10-P8 10⁴·²⁵ KIDso/мл

О11-Р7 10⁴²⁵ KIDso/мл вакцина против С-штамма вируса CSF 10^{2 25} KIDso/мл

После проведения иммунизации отсутствовали типичные для чумы свиней изменения температуры тела и болезненные симптомы.

Клинический анализ после осуществления тестового инфицирования.

Значение ректальной температуры тела >40°C в течение двух дней расценивалось как лихорадка.

Были исследованы 5 групп:

Группа 1 (5 свиней): мутанты вариантов С-штамма Q7-P7 (10⁵⁰ KIDso/ml)

Группа 2 (5 свиней): мутанты вариантов С-штамма S10-P8 (1О⁵⁰ KIDso/ml)

Группа 3 (5 свиней): мутанты вариантов С- штамма О11-Р8 (1О⁵⁰ KIDso/ml)

Группа 4 (3 свиньи): вакцина против чумы свиней Riemser (исходный вирус)

В группе 1 отмечали единичные повышения температуры между 3-м и 13-м днями после тестового инфицирования, которые, однако, не были связаны ни с каким видимым ухудшением самочувствия животных-субъектов. Только животное № 4 демонстрировало повышение температуры до 4 дней.

В группа 4 отмечали единичные повышения температуры у 3 животных, при этом животное № 9 демонстрировало значительное повышение температуры.

В группе 3 только животное № 14 демонстрировало повышение температуры тела с лихорадкой на 4-й и 5-й день после тестового инфицирования.

Животные из группы 4 не демонстрировали повышение температуры, при этом единичное повышение температуры было отмечено у 2 животных.

Все животные из группы 5 демонстрировали повышение температуры между 2-м и 7-м днем после инфицирования. В связи с ярко выраженными симптомами чумы свиней все животные из группы 5 были усыплены спустя 7 дней после инфицирования. Наиболее частыми симптомами были эффекты, связанные с влиянием на центральную нервную систему (парез задних конечностей и атаксия, диарея, конъюнктивит и сонливость). Одно животное демонстрировало гематому на коже.

Изоляция вируса из носовых мазков иммунизированных животных была невозможна, при этом тест невакцинированных контрольных животных показал позитивный результат спустя 7 дней после инфицирования.

Результаты RT-PCR с использованием образцов сыворотки.

Результаты RT-PCR демонстрировали, что спустя 14 дней после инфицирования при проведении тестирования иммунизированных животных могли быть получены лишь очень слабые сигналы присутствия вирулентного вызывающего заболевание вируса. Тем не менее, невакцинированные контрольные животные демонстрировали явные позитивные сигналы при положительных значениях Ct 30 или менее спустя 3 дня после инфицирования. Значения Ct невакцинированных животных снизились до 17 спустя 7 дней.

Результаты RT-PCR, полученные из носовых мазков.

Результаты RT-PCR иммунизированных животных были исключительно отрицательными. Невакцинированные контрольные животные, тем не менее, демонстрировали явно позитивный сигнал при значениях Ct между 25 и 28 спустя 7 дней после инфицирования.

Тест на нейтрализацию вируса с использованием вируса CSF Alfort.

Тест на нейтрализацию вируса относится к определению наличия антител, способных нейтрализовывать вирулентный вирус, у животных (вакцинированных или невакцинированных). Все иммунизированные группы показали наличие нейтрализующих антител спустя 21 день после иммунизации. Спустя 7 дней после инфицирования значение титра теста на нейтрализацию вируса Alfort составляло ND₅₀ или

- 16 031518 более во всех иммунизированных группах. Одно животное в группе, иммунизированной O11, и одно животное в контрольной группе C-штамма демонстрировали титр 480. Неиммунизированные контрольные животные не демонстрировали наличие вирусного титра против Alfort в реакции нейтрализации вируса (VNT).

Тест на нейтрализацию вируса (VNT) с использованием Rosrath вируса CSF.

См. результаты VNT с использованием штамма Rosrath вируса CSF на фиг. 3. Спустя три недели после иммунизации все животные, за исключением одного животного из группы S10 и одного животного из группы O11, демонстрировали наличие нейтрализующих антител. 7 дней после инфицирования иммунизированные животные, в целом, демонстрировали титр VNT 640 и более. Нижним значением титра было 320, продемонстрированное одним животным из группы, иммунизированной мутантом TAV. Неиммунизированные контрольные животные демонстрировали отсутствие титра против Rosrath при проведении VNT.

E2-ELISA (idexx).

E2-ELISA является коммерчески доступным набором для проведения энзимсвязанного иммуносорбентного анализа (ELISA) для определения на наличие классической чумы свиней. Животные, иммунизированные C-штаммом, демонстрировали, в среднем, позитивные результаты при проведении E2-ELISA спустя 21 день после иммунизации.

Животные, иммунизированные мутантами TAV, также демонстрировали позитивные результаты спустя 7 дней при проведении Idexx E2-ELISA. Неиммунизированная контрольная группа демонстрировала отсутствие определяемых антител после инфицирования.

См. результаты Idexx E2-ELISA с использованием сыворотки свиней на фиг. 4.

При проведении E2-ELISA результаты, относящиеся к TAV-мутантам, до инфицирования были позитивными, но не сильно выраженными, в то время как после инфицирования результаты стали явно позитивными, что говорит о наличии значительного эффекта реиммунизации. Контрольные животные, иммунизированные с помощью С-штамма, были ярко выраженными позитивными при проведении E2ELISA до инфицирования. Результаты животных, иммунизированных TAV-мутантом, сравнимы с результатами животных из контрольной группы, иммунизированной С-штаммом. Выделение вируса после инфицирования дало отрицательный результат, а результаты RT-PCR были сомнительными или слабопозитивными, что также было продемонстрировано в контрольной группе, иммунизированной С-штаммом. Все животные демонстрировали высокий титр в тесте на нейтрализацию вируса против Alfort в дополнение к Rosrath. Все иммунизированные животные демонстрировали наличие полной защиты против инфекционного вирусного штамма Koslov спустя четыре недели после проведения внутримышечной иммунизации.

Исследование на животных 24/10. Тестирование устойчивых вариантов S10 и O11; защита при иммунизации путем орального введения.

В целях тестирования эффективности орального введения выполняли следующие исследования на животных. 15 поросят в возрасте 8-10 недель (весом около 15-20 кг) использовались в качестве тестовых животных.

Доза вакцины и схема эксперимента:

Группа 1 (6 поросят): мутанты А вариант С-штамма S10 (10⁵ КЮ₅о/мл)

Группа 2 (6 поросят): мутанты В вариант С-штамма 011 (10⁴ KIDso/мл)

Группа 3 (3 поросенка): инфекционный контроль (невакцинированные)

Группа 1. Все животные из данной группы были полностью защищены перед осуществлением тестового инфицирования. Симптомы, связанные с заболеванием, не были отмечены. Все животные продемонстрировали наличие нейтрализующих антител, определяемых с помощью тестов VNT и ELISA.

Группа 2. Животные в группе 2 демонстрировали наличие комбинации защиты и инфекции. 2 животных демонстрировали симптомы заболевания, такие как высокая температура и другие типичные симптомы чумы свиней. Пораженные животные были усыплены. Защищенные животные демонстрировали наличие нейтрализующих антител, определяемых с помощью тестов VNT и ELISA.

Группа 3. Все животные были инфицированы и демонстрировали наличие симптомов заболевания. Пораженные животные были усыплены.

Исследование оральной иммунизации демонстрирует, что оральная иммунизация, в особенности с применением мутанта S10, ведет к возникновению эффективной защиты против инфекции. Изолят O11 также демонстрировал успешные результаты с учетом того, что доза вакцины была снижена по сравнению с вариантом вируса S10.

- 17 031518

Список литературы.

Council Directive 2001/89/ЕС of 23 October 2001 on Community measures for the control of classical swine fever (2001): Official Journal of the European Communities L 316, 5-35. Diagnostic Techniques and Vaccines for Foot-and-Mouth Disease, Classical Swine Fever, Avian Influenza and some other important OIE List A Diseases (2003a): Report of the Scientific Committee on Animal Health and Animal Welfare Adopted 24-25th April 2003 , 1-150.

Report on the evaluation of a new classical swine fever discriminatory test(2003/265/EC) (2003b).

Commission Decision of 23 November 2006 approving the plans for the eradication of classical swine fever in feral pigs and the emergency vaccination of those pigs and of pigs in holdings against that disease in Romania (2006/802/EC) (2006): Official Journal of the European Union L329, 34-37.

Beer, M, Reimann, I, Hoffmann, B, Depner, К (2007): Novel marker vaccines against classical swine fever. Vaccine 25 (30): 5665-5670.

Biome, S, Meindl-Bohmer, A, Loeffen, W, Thuer, B, Moennig, V (2006): Assessment of classical swine fever diagnostics and vaccine performance. Rev Sci Tech 25 (3): 1025-1038.

de Smit, AJ, Bouma, A, Van Gennip, HG, de Kluijver, EP, Moormann, RJ (2001): Chimeric (marker) C-strain viruses induce clinical protection against virulent classical swine fever virus (CSFV) and reduce transmission of CSFV between vaccinated pigs. Vaccine 19 (11-12): 14671476.

Dong, XN, Chen, YH (2007): Marker vaccine strategies and candidate CSFV marker vaccines. Vaccine 25 (2): 205-230.

Floegel-Niesmann, G (2003): Marker vaccines and companion diagnostic tests for classical swine fever. Dev Biol (Basel) 114, 185-191.

Greiser-Wilke, I, Moennig, V (2004): Vaccination against classical swine fever virus: limitations and new strategies. Anim Health Res Rev 5 (2): 223-226.

Leifer, I, Lange, E, Reimann, I, Biome, S, Juanola, S, Duran, JP, Beer, M (2009): Modified live marker vaccine candidate CP7_E2alf provides early onset of protection against lethal challenge infection with classical swine fever virus after both intramuscular and oral immunization. Vaccine .

Van Oirschot, JT (2003): Vaccinology of classical swine fever: from lab to field. Vet Microbiol 96 (4): 367-384.

Vandeputte, J, Chappuis, G (1999): Classical swine fever: the European experience and a guide for infected areas. Rev Sci Tech 18 (3): 638-647.

Diagnostic Techniques and Vaccines for Foot-and-Mouth Disease, Classical Swine Fever, Avian Influenza and some other important OIE List A Diseases.: European Commission, Directorate-General for Health and Consumer Protection, Brussels; 2003 p. 1-150.

Koenig P, Lange E, Reimann I, Beer M. CP7_E2alf: a safe and efficient marker vaccine strain for oral immunisation of wild boar against Classical swine fever virus (CSFV). Vaccine 2007 Apr 30;25(17):3391-9.

Floegel-Niesmann G. Classical swine fever (CSF) marker vaccine. Trial III. Evaluation of discriminatory ELISAs. Vet Microbiol 2001 Nov 8;83(2):121-36.

D. Luetticken, C. Drexler, N. Visser and V. Kaden, The relevance of CSF marker vaccines for field use, Proceedings of OIE symposium on classical swine fever (Hog Cholera) Birmingham, U.K., July 9-10(1998).

J. T. van Oirschot, Diva vaccines that reduce virus transmission, J Biotechnol 73 (2- 3) (1999), pp. 195-205.

A. Uttenthal, M.F. Le Potier, L. Romero, G.M. DeMia and G. Floegel-Niesmann, Classical swine fever (CSF) marker vaccine Trial I. Challenge study in weaner pigs, Vet Microbiol 83 (2) (2001), pp. 85-106.

K. R. Depner, A. Bouma, F. Koenen, D. Klinkenberg, E. Lange and H. de Smit et al., Classical swine fever (CSF) marker vaccine Trial II: Challenge study in pregnant sows, Vet Microbiol 83 (2) (2001), pp. 107-120.

A.J. de Smit, H.G. van Gennip, G.K. Miedema, P.A. van Rijn, C. Terpstra and R.J. Moormann, Recombinant classical swine fever (CSF) viruses derived from the Chinese vaccine strain (Cstrain) of CSF virus retain their avirulent and immunogenic characteristics, Vaccine 18 (22) (2000), pp. 2351-2358.

Yan Li et al, A multiplex nested RT-PCR for the detection and differentiation of wild-type viruses from C-strain vaccine of classical swine fever virus.

Y. Qi, et al, Characterization of antibody responses against a neutralizing epitope on the glycoprotein E2 of classical swine fever virus.

Jian-Jun Zhao et al, Evaluation of a multiplex real-time RT-PCR for quantitative and differential detection of wild-type viruses and C-strain vaccine of Classical swine fever virus.

Susana Mendozaa et al, Antigenic differentiation of classical swine fever vaccinal strain PAV250 from other strains, including field strains from Mexico.

J. Kortekaas et al, Rational design of a classical swine fever C-strain vaccine virus that enables the differentiation between infected and vaccinated animals, 2009.

L. G. Holinka et al: Development of live attenuated antigenic marker classical swine fever vaccine, Virology, 2009.

Hulst et al, Passage of Classical Swine Fever Virus in Cultured Swine Kidney Cells

Selects Virus Variants That Bind to Heparan Sulfate due to a Single Amino Acid Change in Envelope Protein Erns, Journal of Virology, Oct. 2000, p. 9553-9561 Vol. 74, No. 20.

- 18 031518

Перечень последовательностей <110> РИМЗЕР АРЦНАЙМИТТЕЛЬ АГ

Мартин, Беер

Иммануэль, Ляйфер

Сандра, Бломе <120> Маркерная вакцина против классической чумы свиней <130> XII 76/11 <150> DE 10 2010 017 006.2 <151> 2010-05-18 <150> ЕР 10075207.0 <151> 2010-05-18 <150> ЕР 10075205.4 <151> 2010-05-18 <150> ЕР 10075206.2 <151> 2010-05-18 <150> ЕР 10075759.0 <151> 2010-12-17 <150> ЕР 10075760.8 <151> 2010-12-17 <150> ЕР 11159207.7 <151> 2011-03-22 <160> 5 <170> Patentin version 3.3 <210> 1 <211> 60 <212> ДНК <213> Flavivirus sp.

<400> 1 cgggtgtcat agagtgcaca gtagtgagct caacgactct gagaacagga gtggtaaaga 60 <210> 2 <211> 60 <212> ДНК <213> Flavivirus sp.

<400>2 cgggtgtcat agagtgcaca gcagtgagcc caacgactct gagaacagaa gtggtaaaga 60 <210>3 <211>14 <212> БЕЛОК <213> Flavivirus sp.

<400>3

Thr Ala Val Ser Ser Thr Thr Leu Arg Thr Gly Val Val Lys 1 510 <210>4 <211>14 <212> БЕЛОК <213> Flavivirus sp.

<400>4

Thr Val Val Ser Ser Thr Thr Leu Arg Thr Gly Val Val Lys

510 <210>5 <211>14 <212> БЕЛОК <213> Flavivirus sp.

<400>5

Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys 1 510

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Маркерная вакцина для профилактики классической чумы свиней, позволяющая впоследствии дифференцировать животных, подвергшихся действию данной вакцины, от животных, инфицированных вызывающим заболевание вирусом классической чумы свиней, включающая модифицированный живой аттенуированный вирус классической чумы свиней, характеризующийся тем, что аминокислотная последовательность TAV-эпитопа белка E2 модифицированного вируса включает по меньшей мере одну из следующих замен относительно C-штамма Riems дикого типа вируса классической чумы свиней:

замену A830V, замену P833S, замену E839G.
2. Маркерная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность модифицированного вируса, кодирующая TAV-эпитоп белка E2, включает по меньшей мере одну из следующих замен относительно C-штамма Riems дикого типа вируса:

замену C2862T, замену C2870T, замену A2889G.
3. Маркерная вакцина по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что модифицированный вирус дополнительно включает по меньшей мере одну из следующих замен относительно C-штамма Riems дикого типа вируса:

замену I426V в аминокислотной последовательности белка E^RNS, замену Y576H в аминокислотной последовательности белка E1, замену D583E в аминокислотной последовательности белка E1, замену Т95П в аминокислотной последовательности белка E2.
4. Маркерная вакцина по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что модифицирован

- 19 031518 ный вирус дополнительно включает по меньшей мере одну из следующих замен относительно C-штамма Riems дикого типа вируса:

замену A1649G в нуклеотидной последовательности, кодирующей белок E^№S, замену T2099C в нуклеотидной последовательности, кодирующей белок E1, замену T2122G в нуклеотидной последовательности, кодирующей белок E1, замену C3225T в нуклеотидной последовательности, кодирующей белок E2.
5. Маркерная вакцина по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что аминокислотная последовательность TAV-эпитопа белка E2 модифицированного вируса включает последовательность SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4.
6. Маркерная вакцина по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность модифицированного вируса, кодирующая TAV-эпитоп белка E2, включает последовательность SEQ ID NO: 1.
7. Маркерная вакцина по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что животные, подвергшиеся действию данной вакцины, могут быть дифференцированы от животных, инфицированных вызывающим заболевание вирусом классической чумы свиней, с помощью анализа биологических проб, полученных от указанных животных, с помощью серологических аналитических методов и/или методов геномного анализа.
8. Маркерная вакцина по п.7, отличающаяся тем, что метод геномного анализа основан на полимеразной цепной реакции (PCR), предпочтительно PCR в реальном времени, с использованием праймеров и/или зондов, распознающих нуклеотидную последовательность модифицированного вируса, кодирующую TAV-эпитоп белка E2.
9. Маркерная вакцина по п.7, отличающаяся тем, что серологический аналитический метод основан на иммуноферментном анализе (ИФА), предпочтительно на твердофазном иммуноферментном анализе (ELISA), с использованием антител, специфично связывающихся с аминокислотной последовательностью TAV-эпитопа белка E2 модифицированного вируса.
10. Маркерная вакцина по любому из предыдущих пунктов, включающая одно или более вспомогательное вещество, выбранное из смачивателей, эмульгирующих агентов, буферирующих pH агентов, адъювантов, гелеобразующих или увеличивающих степень вязкости добавок, консервантов, ароматизаторов и красителей.
11. Способ получения вакцинного штамма модифицированного живого аттенуированного вируса классической чумы свиней, согласно которому многократно пассируют клетки, инфицированные вирусом классической чумы свиней, в клеточной культуре с антителами, направленными на TAV-эпитоп белка E2, и/или с поликлональной сывороткой кролика, который был иммунизирован с помощью пептида CTAVSPTTLRTEVVK, являющегося TAV-эпитопом белка E2, с получением модифицированного живого аттенуированного вируса классической чумы свиней, не связывающего нейтрализующие антитела, причем аминокислотная последовательность TAV-эпитопа белка E2 модифицированного вируса включает по меньшей мере одну из следующих замен относительно C-штамма Riems дикого типа вируса классической чумы свиней:

замену A830V, замену P833S, замену E839G.
12. Способ по п.11, где пассируемые клетки представляют собой эмбриональные клетки почек поросят.
13. Применение маркерной вакцины по любому из пп.1-10 в качестве лекарственного средства для профилактики классической чумы свиней.
14. Способ профилактики классической чумы свиней, включающий введение животному маркерной вакцины по любому из пп.1-10.
15. Способ по п.14, где животным является свинья.
16. Способ по п.14, где маркерную вакцину вводят путем внутримышечного инъецирования или перорального приема.

- 20 031518