KR101845571B1 - 전통적 돼지열에 대한 마커 백신 - Google Patents

전통적 돼지열에 대한 마커 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 변형된 생 약독화된 전통적 돼지열 바이러스를 포함하는, 전통적 돼지열의 예방적 처치를 위한 마커 백신에 관한 것이다. E2 단백질의 TAV-에피토프의 바이러스 아미노산 서열은 야생형의 전통적 돼지열 바이러스와는 상이한 서열을 포함한다. 본 발명은 마커 백신의 제약 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 선택적인 항체 압력을 사용하여 전통적 돼지열의 예방을 위한 마커 백신의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

전통적 돼지열에 대한 마커 백신{MARKER VACCINE FOR CLASSICAL SWINE FEVER}
본 발명은 변형된 생 약독화된 전통적 돼지열 바이러스를 포함하는, 전통적 돼지열의 예방적 처치를 위한 마커 백신에 관한 것이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 마커 백신은 질환-연관 돼지열 바이러스에 의한 감염을 보이는 대상체가 혈청학적 및/또는 게놈 분석 방법에 의해 본 발명의 마커 백신으로 예방접종한 대상체로부터 구분될 수 있도록, TAV-에피토프를 코딩하는 바이러스 뉴클레오티드 서열, 및/또는 TAV-에피토프의 아미노산 서열이 질환-연관 돼지열 바이러스와 상이한 서열을 포함한다는 점을 특징으로 한다.
전통적 돼지열 (CSF)은 전세계적으로 발생하고 유의한 정치적 및 경제적 관련성을 갖는 유행성 동물 질환이다 (Vandeputte and Chappuis, 1999). 돼지 콜레라 또는 돼지 전염병으로도 알려진 전통적 돼지열은 어느 회원국에서 발생시에 전국적으로, EU-수준에서 및 파리 소재의 세계 동물 보건 기구 (World Organization for Animal Health) (OIE)에 통보해야하는 질환 중의 하나이다. 전통적 돼지열은 플라비비리대 (Flaviviridae) 과의 페스티바이러스 (Pestivirus) 속의 작은 외피 보유 RNA-바이러스에 의해 야기된다. 돼지열 바이러스의 자연 숙주는 오직 사육 및 야생 돼지 종 (예를 들어, 유럽 야생 돼지)이다.
1990년 이후에 금지된 예방을 위한 예방접종 없이 엄격한 방법을 통해 CSF를 규명하기 위한 시도가 유럽 연합 내에서 이루어지고 있다. 금지에도 불구하고, 예방접종은 돼지열이 발생한 경우에 긴급 예방접종으로서 법적으로 승인된 선택 사항이다. 이러한 경우에, 예방접종은 유럽 연합 (Counsel Directive 2001/89/EC의 Art. 19 참조)에 의해 비준된 긴급 예방접종 계획 중의 하나를 통해 실시되어야 한다. 지금까지, 루마니아만이 긴급 예방접종이 실시된 유일한 국가이었다. 이와 같이 적용이 제한된 이유는 통상적으로 예방접종한 동물에 관한 무역 장벽 (국내 마케팅에 대한 제한) 이외에, 현재 이용가능한 마커 백신의 기술적 제한, 예컨대 백신 효율의 제한이다. 인가된 (licensed) 마커 백신의 효율은 유의한 이점을 보이는 변형된 생 백신과 비교될 수 없고, 이러한 불활성화된 백신 또는 하위단위 (subunit) 백신은 보다 늦은 면역 개시 및 재예방접종의 필요성 때문에 긴급 예방접종에 적합하지 않다.
동부 유럽 국가에 대한 유럽 연합의 팽창 및 지속적으로 증가하는 세계화를 고려할 때, 동물의 대규모 도태 및 이와 연관된 경제적 손실을 방지하는데 기능할 잠재적인 긴급 예방접종에 대한 새로운 전략이 논의되고 있다 (Leifer et al., 2009). 따라서, 예방접종한 동물과 비-예방접종한 동물 사이의 혈청학적 구분이 가능하고 또한 전통적인 변형된 생 백신의 모든 이점을 보이는 고효율 백신에 대한 유의한 필요성이 존재한다.
CSF 바이러스의 E2 당단백질을 기초로 한 제1 세대의 마커 백신은 단지 제한된 이용가능성, 및 저장 조건, 비용, 효율과 같은 큰 단점을 갖기 때문에, 신규한 마커 백신에 대한 큰 필요성이 존재한다. 상기 백신에 대한 다양한 후보, 예컨대 DNA 백신, 면역원성 펩티드, 벡터 백신, 결실 돌연변이체 및 키메라 열 바이러스가 조사되었다 ([Beer et al., 2007]; [Dong and Chen, 2007]). 대부분의 이들 마커 백신 후보는 현재의 유전자 변형 방법을 통해 생산된다는 단점을 보인다. 복잡한 승인 절차 이외에, 유전자 변형 제품에 대한 소비자의 유의한 공포 때문에, 유전자 변형 백신은 유의한 단점을 보인다.
CSFV에 대한 전통적인 백신은 변형된 생 백신을 포함한다. 상기 백신은 1회 적용 후에 효율이 높지만, 혈청학적 프로파일을 기초로 하여 예방접종한 동물과 감염된 동물을 구분하는 것을 허용하지 않는다. 이들 백신 중 많은 백신이 전통적인 바이러스 균주 (strain) "C" 또는 그의 유도체를 기초로 한 것이다 (소위 "C-균주 백신"). 추가로, 일본 바이러스 균주 "기니피그 병리앙진 (exultation)-음성 (GPE-)", "티베르발 (Thiverval)" 균주 및 "멕시코 (Mexican) PAV" 균주를 기초로 한 백신이 존재하고, 이들은 모두 지역 및 세계적 환경에서 모두 사용되었다 ([Blome et al., 2006]; [Greiser-Wilke & Moennig, 2004]; [van Oirschot, 2003]). C-균주-기반 백신의 사용에 대한 광범한 데이터가 존재한다. 백신 적용 4일 후에, 병독성 CSFV 접종 (challenge) 감염에 대한 동물의 완전한 보호가 제시될 수 있음이 알려져 있다. 추가로, 예방접종 7일 후에, 보균 동물에서 접종 바이러스의 수직 감염으로부터 완전한 보호가 제공된다 (de Smit et al., 2001).
알려진 변형된 살아있는 백신의 유의한 단점은 예방접종한 동물과 감염된 동물을 혈청학적으로 완전히 식별할 수 없다는 것이다. 이에 비추어, 본 발명의 목표의 하나는 예방접종한 동물과 감염된 동물의 식별을 가능하게 하는 변형된 생 백신을 제공하는 것이다.
마커 백신의 분야에서, CSFV의 재조합 E2 당단백질을 기초로 한 소위 하위단위 백신이 선행 기술에 공지되어 있다. 상기 백신에 대한 식별 시험은 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)으로서, 여기서 Ems 당단백질에 대해 작용하는 항체가 CSF 바이러스 감염을 간접적으로 검출하기 위해 사용된다. 현재에는, 단지 하나의 E2-하위단위 백신만이 시장에서 이용가능하지만, 허가는 수개월 동안 유예되었다 (E2 하위단위 백신에 대해서는 EMA 보고서 참조).
상기 제품의 시판 불가와는 상관없이, 상기 시스템은 생물학적 단점을 제시한다. 한가지 단점은 완전한 보호가 달성되기 전에 적어도 2개의 비경구 면역화가 필요하고, 이것은 상기 백신을, 동물에게 백신 베이트 (bait)를 단일 용량으로 공급하는 "베이트-예방접종"에 부적합하게 만든다는 것이다. 또한, 긴급 예방접종 활동은 E2 하위단위 백신을 사용한 다양한 실험에서 야생형 CSFV에 대한 보호, 수직 감염으로부터 완전한 보호가 달성되지 않았을 때에만 합당한 것이다. 상기 시스템의 추가의 단점은 당단백질 Ems에 대해 작용하는 항체가 혈청학적 구분을 위해 사용되고 상기 시험 시스템의 감도 및 특이성이 단지 중간 정도라는 것이다 (Floegel-Niesmann, 2003).
생 약독화 CSF 백신들이 당업계에 공지되어 있지만, 다양한 단점 때문에 지금까지 제한되고 있다. 선행 기술에 개시된 대부분의 백신은 외래 DNA를 포함하고, 유전공학 방법 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생산되고, 따라서 제품에는 심각한 환경 위험 평가 문제가 결부된다. 아미노산이 야생형 TAV 에피토프로부터 치환되거나 결실된 다른 CSFV 변이체가 공지되어 있다 (WO 2010/074575 A2). 그러나, 본 발명에서 변형된 아미노산 잔기 및/또는 뉴클레오티드는 선행 기술에서 개시되거나 제안된 바 없다.
또한, 항체 압력이 이전에 인가되지 않았지만 백신으로서 사용될 수 있는 바이러스 변이체를 생성하기 위해 다수회의 계대배양도 사용되었다. 따라서, 선행 기술에 개시된 변이체를 생성하기 위한 바이러스-감염된 배양액의 다수회의 계대배양은 매우 많은 계대배양을 수행해야 하고 또한 어느 에피토프가 변형되어야 하는지에 대한 제어가 결여되기 때문에 제한된다 (Hulst et al.).
코르테카아스 (Kortekaas) 등은 예방접종한 동물로부터 감염된 동물을 혈청학적으로 구분할 수 있도록 하는 유전적으로 안정한 생 약독화 CSF 백신을 설명하였다. 돌연변이된 C-균주는 재조합 DNA 기술이 CSFV의 E2 단백질 내에 결실을 도입하기 위해 사용되는 표적화 방안에 의해 유전적으로 변형되었다. 추가의 돌연변이는 향상된 증식을 보이는 균주를 생성하기 위해 다수회의 계대배양을 통해 바이러스 게놈 내의 다양한 위치에서 후속적으로 얻어졌다. 코르테카아스 등에 의해 개시된 균주는 유전자 조작된 바이러스로서, 유전자 변형 제품을 환경에 방출하기 위한 복잡한 승인 과정에 비추어 유의한 단점이 존재한다.
홀링카 (Holinka) 등은 2개의 유전적 약독화 결정자의 조합에 의해 얻은 이중 항원 마커 생 약독화 CSFV 균주 "FlagT4vn"을 개시하였다. FlagT4v는 E1 당단백질 내의 19량체 삽입을 통해 도입된 양성 항원 마커인 합성 플래그 (Flag) 에피토프; 및 E2 당단백질 내의 모노클로날 항체 WH303 (mAbWH303) 에피토프의 결합 부위의 돌연변이에 의한 음성 마커를 보유한다. FlagT4v의 비내 또는 근육내 투여는 접종 후 초기 (2 또는 3일), 및 후기 (28일)에 병독성 CSFV 브레시아 (Brescia) 균주에 대해 돼지를 보호하였다. 돼지에서 FlagT4v 유도 항체 반응은 플래그 에피토프에 대해 강하게 반응하였지만, WH303 에피토프를 나타내는 합성 펩티드에 대한 mAbWH303의 결합은 억제하지 못하였다. 홀링카에 의해 개시된 백신은 그의 게놈 내에 외래 DNA (관련 벡터 서열 및 마커 이외의 플래그-태그 (Tag) 서열)를 보이는 유전자 조작된 바이러스에 관한 것이다. 이것은 외래 또는 재조합 DNA를 보이지 않는 본 발명에 비해 유의한 단점을 나타낸다.
WO 2007/143442 A2에는 병독성 브레시아 CSFV의 아미노산 서열을 BVDV 균주 NADL의 상동성 아미노산 서열을 향해 점진적으로 변경하는, CSFV E2의 WH303 에피토프 내의 돌연변이의 효과가 기재되어 있다. 바이러스 돌연변이체로 감염된 동물은 예방접종 3일 및 21일 후에 병독성 브레시아 바이러스로 접종될 때 보호되었다. 또한, WH303 에피토프 내의 상기 부위의 변형은 예방접종한 동물을 감염된 동물로부터 구분하기 위한 진단 시험의 개발을 가능하게 한다. 상기 효과에도 불구하고, 돌연변이가 유전공학을 사용하여 도입되었고, 따라서 외래 유전 물질이 바이러스 백신 내로 도입되었다.
상기한 최신 기술은 바이러스 균주를 생산하기 위해 재조합 유전자 기술을 통해 조작된 백신을 개시하고 있다. 상기한 바와 같이, 유전자 조작된 백신은 환경 안전성에 대한 우려를 낳고 있고, 따라서 복잡한 승인 프로토콜 및 일반 공중의 공포 때문에 제한되고, 따라서 그 사용에 대해 유의한 단점을 제공한다.
발명의 개요
선행 기술에 비추어, 본 발명의 기저를 이루는 기술적 문제는 예방접종한 동물과 감염된 동물 사이의 구분을 가능하게 하고, 바람직하게는 통상적인 기술에 의해 생산되는, 전통적 돼지열 바이러스에 대한 보호를 제공하는 사육 및 야생 돼지에 대한 마커 백신을 제공하는 것이다. 바람직한 실시양태에서, 마커 백신은 재조합 유전자 변형 기술을 통해 생산되지 않는다.
상기 문제는 청구의 범위의 독립항의 특징에 의해 해결된다. 본 발명의 바람직한 실시양태는 청구의 범위의 종속항에 의해 제시된다.
따라서, 본 발명은 변형된 생 약독화된 전통적 돼지열 바이러스를 포함하는, 전통적 돼지열의 예방적 처치를 위한 마커 백신에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 또한 E2 단백질의 TAV-에피토프의 바이러스 아미노산 서열이 야생형의 전통적 돼지열 바이러스와 상이한 서열을 포함하고, 이에 의해 바이러스 아미노산 서열이
- 아미노산 830의 발린으로의 치환,
- 아미노산 833의 세린으로의 치환, 및
- 아미노산 839의 글리신으로의 치환
중 적어도 하나의 치환을 나타내는 것을 특징으로 하고, 변형된 생 약독화된 전통적 돼지열 바이러스를 포함하는, 전통적 돼지열의 예방적 처치를 위한 마커 백신에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 마커 백신은 변형된 바이러스가 재조합 핵산 서열을 나타내지 않는 것을 특징으로 한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 마커 백신은 바이러스 뉴클레오티드 서열이
- 뉴클레오티드 위치 2862에서 T로의 치환,
- 뉴클레오티드 위치 2870에서 T로의 치환, 및
- 뉴클레오티드 위치 2889에서 G로의 치환
중 하나 이상의 치환을 나타내는 것을 특징으로 한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 마커 백신은 바이러스 아미노산 서열이
- 단백질 ERNS에서 아미노산 426의 발린으로의 치환,
- 단백질 E1에서 아미노산 576의 히스티딘으로의 치환,
- 단백질 E1에서 아미노산 583의 글루탐산으로의 치환, 및
- 단백질 E2에서 아미노산 951의 이소류신으로의 치환
중 하나 이상의 치환을 나타내는 것을 특징으로 한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 마커 백신은 바이러스 뉴클레오티드 서열이
- 뉴클레오티드 위치 1649에서 G로의 치환,
- 뉴클레오티드 위치 2099에서 C로의 치환,
- 뉴클레오티드 위치 2122에서 G로의 치환, 및
- 뉴클레오티드 위치 3225에서 T로의 치환
중 하나 이상의 치환을 나타내는 것을 특징으로 한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 마커 백신은 TAV-에피토프의 바이러스 아미노산 서열이 서열 3 또는 서열 4에 따른 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 마커 백신은 바이러스 뉴클레오티드 서열이 서열 1에 따른 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 마커 백신은 본원에 기재된 백신으로 처치된 대상체가, 혈청학적 및/또는 게놈 분석 방법을 사용하여 수행한 해당 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플의 분석을 통해 질환-연관 돼지열 바이러스로 감염된 대상체로부터 구분될 수 있음을 특징으로 한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 마커 백신은 게놈 분석 방법이, 변형된 및/또는 질환-연관 바이러스 뉴클레오티드 서열을 인식하는 프라이머 및/또는 프로브가 사용되는 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 바람직하게는 실시간 PCR을 기초로 하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 마커 백신은 혈청학적 분석 방법이, 변형된 및/또는 질환-연관 TAV-에피토프에 특이적으로 결합하는 항체가 사용되는 효소 면역검정 (EIA), 바람직하게는 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)을 기초로 하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 추가의 측면은 항체 압력의 인가에 의해 질환-연관 또는 다른 공지의 돼지열 바이러스 균주의 바이러스 탈출 (escape) 변이체의 생성에 의해 얻을 수 있는, 바람직하게는 본원에 기재된 바의 마커 백신에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 항체 압력의 인가에 의해 질환-연관 또는 다른 공지의 돼지열 바이러스 균주의 탈출 변이체의 생성을 포함하는, 바람직하게는 본원에 기재된 바의 변형된 생 약독화된 전통적 돼지열 바이러스 백신 균주의 제조 방법에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본원에 기재된 제조 방법은
- 세포 배양에서 질환-연관 돼지열 바이러스로 감염된 세포, 바람직하게는 배아 새끼돼지 신장 세포의 다수회의 계대배양, 및
- 질환-연관 돼지열 바이러스의 E2 단백질의 TAV-에피토프에 대해 작용하는 항체 및/또는 폴리클로날 CTAVSPTTLRTEVVK-펩티드 면역화된 토끼 혈청의 동시 적용
을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 추가로 본원에 기재된 바의 마커 백신을 제약상 허용되는 담체와 함께 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은, 바람직하게는 근육내 주사 또는 경구 적용을 통한 전통적 돼지열의 예방적 처치 (예방접종)에서 의약으로서 사용하기 위한 본원에 기재된 바의 마커 백신에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은, 대상체, 바람직하게는 돼지에게, 바람직하게는 근육내 주사 또는 경구 적용을 통해 본원에 기재된 마커 백신을 투여하는 것을 포함하는, 전통적 돼지열의 예방적 처치 (예방접종) 방법에 관한 것이다.
전통적 돼지열의 예방접종이 필요한 또 다른 통상적인 상황은 돼지 집단에서 야생 바이러스 감염의 검출이다. 돼지 감염이 발생하여, 전통적 돼지열 바이러스가 야생 또는 사육 돼지에 존재하게 될 때, 주위 및/또는 이웃 돼지 집단에 대한 긴급 예방접종이 필요하다. 돼지열 바이러스의 창궐 또는 대규모 감염을 방지하기 위해, 야생이든 사육 돼지이든 주위 구역 내의 모든 돼지에 대해 1 내지 2년까지 동안 예방접종을 후속적으로 수행한다. 본 발명의 마커 백신은 돼지열 검출 또는 창궐의 경우에 긴급 예방접종을 위해 이상적으로 적합하다. 마커 백신은 주사를 통한 투여 이외에 경구 경로를 통한 신속하고 효과적인 투여를 용이하게 하고, 야생 바이러스 (열-연관) 및 백신으로 감염된 동물간의 식별을 가능하게 한다.
발명의 상세한 설명
본 발명에 따른 백신의 개발은 유전자 변형 방법을 기초로 하지 않고, 바이러스가 선택적인 항체 압력 하에 놓일 때 그 자신을 적응 방식으로 변경할 것이라는 원리를 기초로 한다. 본 발명은 따라서 마커 백신 (혈청학적으로 및 유전적으로 구별되는)에 대한 모든 요건을 나타내는, 병독성 CSFV에 대한 보호를 제공하는 비-유전자 변형 생 백신에 관한 것이다. 마커 백신은 세포 배양액 내의 상이한 C-균주에 선택적인 항체 압력을 인가함으로써 조작되었다. 생성된 변이체는 바람직하게는 E2 TAV 에피토프 내의 3개의 아미노산 교환 및 E1 단백질 내의 2개의 보상적 (compensatory) 교환을 보유한다. 상기 변이체의 안정성은 롤러 드럼 (roller drum)에서 10회 초과의 세포 계대배양에 의해 입증되었고, 예를 들어 돼지의 근육내 예방접종은 고병독성 접종 균주에 대한 완전한 보호를 제공하였다. 또한, 직접적인 DIVA는 혈청학적 및/또는 유전적 기술에 의해, 예를 들어 별개의 면역형광 염색 및 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응 (rRT-PCR) 시스템에 의해 실시될 수 있다. 또한, 간접적인 DIVA는 시판되는 E2-ELISA를 최적화함으로써 (예를 들어, 컷오프 (cut off) 값을 변경함으로써) 또는 TAV-특이적 펩티드-ELISA 시스템을 개발함으로써 수행할 수 있다. 따라서, CSFV에 대한 비-유전자 변형 생 마커 백신이 제공된다.
본 발명에 따른 백신의 생산은 다음과 같이 이루어진다:
천연에서 보이는 C-균주 "리엠스 (Riems)" 탈출 변이체가, E2-TAV 특이적 항체 및 폴리클로날 CTAVSPTTLRTEVVK-펩티드 면역화된 토끼 혈청의 적용 동안 C-균주 바이러스의 계대배양을 통해 세포 배양 시스템 (IFN-배아 새끼돼지 신장 세포)에서 선택된다.
펩티드-처리된 폴리클로날 토끼 혈청에 함유된 항체에 추가하여 적용된 항체는 CSF 바이러스의 E2 단백질 내의 TAV-에피토프를 특이적으로 인식하고, 상기 에피토프에 대한 결합을 통해 CSF (C-균주) 바이러스를 중화시킨다. CSFV는 그의 RNA 특성 때문에 높은 돌연변이 비율을 보인다. 중화 항체를 제공하는 선택 압력 하에서, 항체가 결합하는 에피토프 (본 경우에는 TAV-에피토프) 내에서 돌연변이를 겪는 바이러스가 선택되고, 이에 의해 비변경된 야생형 바이러스는 중화된다. 다양한 항체 및 토끼 혈청 농도 및 혼합물의 다수회의 계대배양을 통해, 다양한 돌연변이된 바이러스 단리물이 선택될 수 있다.
TAV-에피토프에 치환을 갖는 바이러스를 먼저 선택하였다. 다양한 종류의 항체 압력 하에서 상기 바이러스의 추가의 계대배양을 통해, TAV-에피토프 내의 2개의 치환 및 E1 단백질 내의 단일 보상적 치환을 나타낸 단리물을 선택하였다 (E1과 E2의 상호작용은 바이러스 구조에 중요하다). 이들 바이러스를 추가의 항체 압력 하에 유지하여, E1 단백질 내의 2개의 보상적 치환 이외에 TAV-에피토프 내의 3개의 치환을 갖는 바이러스의 단리를 유도하였다. 생성되는 바이러스 (C-균주 "리엠스" Q7, C-균주 "리엠스" S10 및 C-균주 "리엠스" O11)는 E1 단백질 내의 위치 2099 및 2122에서의 변경, ERNS 단백질 내의 위치 1649에서의 치환에 추가하여 위치 2862, 2870 및 2889, 3225에서 E2 단백질의 치환을 나타냈다.
TAV 탈출 변이체에 대한 추가의 정보
게놈
위치		 뉴클레오티드 치환
(C-균주에서 탈출
변이체로의)		 아미노산 단백질 아미노산 치환 (C-균주에서 탈출 변이체로의 생성되는 아미노산 교환)
1649 A에서 G 426 ERNS 이소류신에서 발린
2099 T에서 C 576 E1 티로신에서 히스티딘
2122 T에서 G 583 E1 아스파르트산에서 글루탐산
2862 C에서 T 830 E2 (TAV 에피토프) 알라닌에서 발린
2870 C에서 T 833 E2 (TAV 에피토프) 프롤린에서 세린
2889 A에서 G 839 E2 (TAV 에피토프) 글루탐산에서 글리신
3225 C에서 T 951 E2 트레오닌에서 이소류신

뉴클레오티드 서열의 변화는 변이체 (Q7, S10, O11)와 야생 단리물 (field isolate) 사이를 구분할 수 있는 실시간 RT-PCR 시스템을 가능하게 한다.
삭제
아미노산 서열의 변화는 항체 결합을 기초로 하여 변이체 (Q7, S10, O11)와 야생 단리물 사이의 구분을 가능하게 하고, 여기서 중화를 위해 사용되는 항체 (A18 항체)는 더 이상 변이체에는 결합하지 않지만 CSFV 내의 고도로 보존된 TAV 에피토프 때문에 모든 야생 단리물에는 결합한다. 또한, 변형된 TAV 펩티드 서열에 대해 생성된 항체 (본 발명의 돌연변이를 나타냄)는 감염성 바이러스와 백신 사이의 구분을 위해 사용될 수 있고, 여기서 변이체에 대해 작용하는 항체는 본 발명의 변형된 바이러스 백신에 결합하여 예방접종한 동물의 양성 확인을 제공하지만, 야생 단리물에는 결합하지 않을 것이다.
Figure 112012104784483-pct00020
본 발명은 본원에 개시된 돌연변이 및 치환의 가능한 임의의 또는 모든 조합을 포함할 수 있는 변형된 돼지열 바이러스에 관한 것이다. 본원에서 제시되는 실시예 및 실험 지지 내용은 표 1에 나열된 모든 치환의 하위-세트만을 나타내는 바이러스 균주가 생성됨을 입증한다. 이들 바이러스 균주는 마커로서 사용될 수 있는 능력 이외에 보호 효과를 보이고, 따라서 본 발명의 목적을 달성한다. 본 발명의 바람직한 균주는 개시된 모든 치환을 나타내는 균주 이외에, 개시된 치환의 하위-세트를 포함하는 균주에 관한 것이다.
(항체 압력의 결과로서 천연 과정을 통해 유도되는) 하나 이상의 특이적 유전자 변형의 조합이 본원에 기재된 마커 백신의 유익한 특성을 유도한다는 것은 매우 놀라운 것이었다. 선행 기술이 일부 유사한 변형을 보여주었지만, 선행 기술에서 알려진 그 어느 것도, 본 발명에서 변형된 특정 잔기가 CSFV 감염에 대해 특히 효과적인 보호를 제공할 것이라는 사실은 제안하지 않았다. 이들의 특유한 조합은 본 발명이 감염된 동물과 예방접종한 동물을 구분할 수 있는 백신으로서 작용하도록 할 수 있는, 설명된 특성의 세트를 생성한다.
항체 처리를 통해 본원에서 인가된 상기 선택적인 압력이 본원에 기재된 엄밀한 변형을 유도할 것임은 알려지지 않았다. 본원에 기재된 유전자 변형의 조합은 함께 기능하여, TAV 잔기의 돌연변이를 허용하면서 단백질 구조를 유지하는 보상적 돌연변이의 상승 효과를 제공하고, 따라서 본 발명의 과제에 의해 요구되는 마커 특징을 제공한다.
용어 유전자 조작은 예를 들어 외래 핵산 물질, 예컨대 DNA 또는 RNA, 또는 합성 핵산 서열을 숙주 게놈 내로 도입함에 의한, 유전자 변형 또는 유기체의 게놈의 조작에 관한 것이다. 상기 기술은 또한 재조합 DNA 기술로서 공지되어 있다.
용어 약독화 바이러스는 바이러스가 야생형 (질환-연관) 바이러스에 비해 덜 유해하고/하거나 덜 병독성이도록 임의의 방식으로 변형된 바이러스를 의미한다. 예를 들어, 야생형 바이러스에 비해 약독화 바이러스로 감염시킨 대상체에서 보다 적은 질환 연관 증상이 나타난다.
본 발명의 측면에서 용어 항체 압력 또는 선택적인 항체 압력은 세포 배양 동안, 바람직하게는 다수회의 계대배양에 걸쳐 바이러스의 하나 이상의 특이적 에피토프에 대해 작용하는 항체의 적용을 의미한다. 그러한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날인 당업계에 공지된 임의의 종류의 항체일 수 있거나, 또는 관심있는 펩티드, 예를 들어 표적 에피토프로 처리된 동물로부터의 혈청에 함유될 수 있다. 그러한 항체는 종종 중화 항체로 칭해진다. 중화 항체를 제공하는 선택 압력 하에서, 항체가 결합하는 에피토프 (본 경우에는 TAV-에피토프) 내에 돌연변이를 겪는 바이러스가 그의 성장 이점에 의해 선택되는데, 그 이유는 항체가 더 이상 상기 에피토프에 결합하지 않고 따라서 더 이상 제한 또는 중화 효과를 제공하지 않고, 비변경된 야생형 바이러스가 항체에 의해 중화되고 배양시에 후속적으로 선택상 불리하게 되기 때문이다.
항체가 결합하는 에피토프 (본 경우에는 TAV-에피토프) 내에서 돌연변이를 겪는 바이러스는 일반적으로 탈출 변이체로서 칭해진다. 이들 변이체가 본 발명의 주제 대상이고, 야생형 바이러스와 유전적으로 및 혈청학적으로 구별된다.
용어 다수회의 계대배양은 많은 회수에 걸쳐 세포 계대배양의 실시 (서브컬쳐 (subculture) 또는 세포의 분할 (splitting)로도 공지됨)를 의미하고, 여기서 적은 수의 세포가, 바람직하게는 신선한 배지가 있는 새로운 용기로, 또는 새로운 배지 내로 세포 배양액의 희석에 의해 다수회 이송되어, 세포 배양액은 배양액 내의 높은 세포 밀도의 관련 효과를 보이지 않으면서 계속 성장할 수 있게 된다.
마커 백신의 면에서, 본 발명은 또한 단일 발명의 개념에 의해 조합되는 일군의 발명에 관한 것이다. 마커 백신, 바이러스 자체 및 그의 제약 조성물, 예방접종을 위해 동물을 처치할 때 그의 용도 및 바이러스의 생산 방법 전부가 총괄적인 발명의 개념에 속한다. 본원에 기재된 신규하고 독창적인 마커 백신은 본 발명의 모든 측면을 가능하게 하고 통일하여, 본원에 기재된 각종 실시양태는 통일적인 단일 발명에 포함된다.
뉴클레오티드 서열이 본원에서 제공되는 경우에, 서열 목록은 상응하는 RNA 및 DNA 서열을 모두 포함하는 것으로 의도된다. 일부 뉴클레오티드 서열이 DNA 서열로서 제공되지만, 상응하는 RNA 서열 (예를 들어 바이러스 게놈이 RNA 분자를 나타내는 경우)도 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 또한 나열된 서열의 상보성 서열, 예를 들어 왓슨-크릭 (Watson-Crick) 염기쌍 형성을 통해 나열된 서열에 결합할 수 있는 상보성 서열을 포함한다. 상응하는 상보성 RNA 및/또는 DNA 서열은 한 서열을 다른 서열로부터 전환하기 위해 어떠한 독창적인 노력을 필요로 하지 않고, 당업자의 기술 수준에서 쉽게 실시할 수 있다.
본 발명의 바이러스 백신, 본 발명의 조성물, 예컨대 제약, 면역학적, 항원 또는 백신 조성물 또는 치료 조성물은 비경구 경로, 예컨대 피내, 근육내 또는 피하 적용 방법을 통해 투여될 수 있다. 그러한 투여는 전신 면역 반응, 또는 체액 또는 세포-매개 면역 반응을 가능하게 한다. 본 발명에 따른 백신은 또한 경구 경로에 의해 투여될 수 있고, 예컨대 동물 사료에 혼입되어, 큰 집단, 예를 들어 유럽 야생 돼지의 간단하고 효과적인 면역화를 가능하게 한다.
바람직한 적용 방법은 바람직하게는 주사에 의한 피하 적용 또는 근육내 적용, 및 경구 적용이다.
보다 일반적으로, 본 발명의 바이러스 백신 조성물 또는 치료 조성물은 제약 또는 수의 분야의 숙련가에게 공지된 표준 기술에 따라 제조할 수 있다.
상기 조성물의 치료 유효량은 특정 대상체의 연령, 성별, 체중, 종 및 상태, 및 투여 경로와 같은 인자를 고려하여 의료 또는 수의 분야의 숙련가에게 공지된 투여량 및 기법으로 투여될 수 있다. 조성물은 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 조성물, 예를 들어 "다른" 면역학적, 항원 또는 백신 또는 치료 조성물과 함께 동시 투여되거나 순차적으로 투여될 수 있어, 본 발명의 다가 또는 "칵테일 (cocktail)" 또는 조합 조성물 및 그를 사용하는 방법을 제공한다. 다시, 성분 및 투여 방식 (순차적인 또는 동시-투여), 및 투여량은 특정 대상체의 연령, 성별, 체중, 종 및 상태, 및 투여 경로와 같은 인자를 고려하여 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물의 예는 구멍, 예를 들어, 경구, 비내, 항문, 질, 경구적 (peroral), 위내 등의 투여를 위한 액체 제제, 예컨대 현탁액, 시럽 또는 엘릭시르; 및, 비경구, 피하, 피내, 근육내 또는 정맥내 투여 (예를 들어, 주사가능한 투여)를 위한 제제, 예컨대 멸균 현탁액 또는 에멀젼을 포함한다.
그러한 조성물에서, CSFV 변이체는 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제, 예컨대 멸균수, 생리적 염수, 글루코스 등과 혼합될 수 있다. 조성물은 동결건조될 수 있다. 조성물은 투여 경로 및 요구되는 제제에 따라 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 보조제, 겔화 또는 점도 향상 첨가제, 보존제, 향미제, 착색제 등을 함유할 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1: 서열 비교.
도 2: 간접적 면역형광 분석.
도 3: CSFV 균주 뢰스라트 (Roesrath)를 사용한 VNT.
도 4: 06/10 동물 연구로부터의 돼지 혈청을 사용한 이덱스 (Idexx) E2-ELISA.
도면의 상세한 설명
도 1: 서열 비교. A) Q7, S10, O11 변이체 및 C-균주 야생 단리물 사이의 TAV-에피토프 영역의 뉴클레오티드 서열 비교. B) Q7, S10, O11 변이체 및 C-균주 야생 단리물 사이의 TAV-에피토프 영역의 아미노산 서열 비교.
도 2: 간접적 면역형광 분석. A) E2 탈출 돌연변이체, B5/2 계대배양 2 (TAV-에피토프에 단지 2개의 치환만을 나타내는, Q7, S10 및 O11에 대한 전구체 바이러스)의 분석. B) C-균주 바이러스의 분석.
도 3: 면역화 3주 후에, S10 군 내의 한 동물 및 O11 군 내의 한 동물을 제외한 모든 동물은 중화 항체를 보였다. 감염 7일 후에, 면역화된 동물은 640 이상의 VNT 역가를 보였다. 최저 역가는 320이었고, 이것은 TAV 돌연변이체 면역화 군의 한 동물에서 나타났다. 비-면역화된 대조 동물은 뢰스라트에 대한 VNT에서 역가를 나타내지 않았다.
도 4: C-균주 면역화된 동물은 면역화 21일 후에 E2-ELISA에서 양성 결과를 보였다. 감염 7일 후에, 모든 면역화된 동물은 ELISA에 분명하게 양성 결과를 보였다. 비-면역화된 대조군은 감염 후에 검출가능한 항체를 보이지 않았다.
실시예
실험 설계 및 방법
TAV 펩티드를 사용한 토끼의 면역화
2마리의 8-10주령 토끼 (귀 태그 304 및 305)를 폴리클로날 C-균주 중화 혈청을 생성하기 위해서 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)-접합된 CTAVSPTTLRTEVVK-펩티드를 사용하여 다음 방식에 따라 면역화하였다. 면역화를 수행하고, 각각 대략 1개월 간격으로 6회의 부스트 (boost)를 실시하였다.
C-균주 " 리엠스 " 바이러스의 E2 탈출 변이체의 단리
당단백질 E2에서 C-균주 "리엠스" 바이러스의 돌연변이를 생성하기 위한 항체 압력을 생성하기 위해, 바이러스를 E2 단백질의 TAV-에피토프에 대해 작용하는 다양한 항체로 다양한 농도에서 처리하였다. 감염된 세포를 후속적으로 인큐베이션하고, 다수회 계대배양하였다. 본 실험에서 적용된 항체는 모노클로날 E2 특이적 항체로서, 이것은 E2 특이적 CSFV ELISA 시험을 위해 상업적으로 입수가능하다.
항체:
A18I (이덱스)
A18B (봄멜리 (Bommeli))
A18C (세디테스트 (Ceditest))
HC34 (CRL, 하노버)
WH303 및 WH 211 (웨이브리지 (Weybridge), 영국)
바이러스 배양물의 인큐베이션을 다음과 같이 수행하였다. 다양한 농도의 항체 및 항체 혼합물을 다양한 양의 바이러스에 적용하였다. 인큐베이션을 2-6시간 동안 실온에서 수행하였다. 바이러스-항체 현탁액을 유합성 (confluent) 세포 성장시에 세포 배양 플레이트에 제공한 후, 인큐베이션하였다. 그 동안, 바이러스는 1-2시간 동안 37℃에서 세포 (PK15-세포) 내로 흡수되었다. 마지막으로, 세포 배양 배지를 첨가하고, 플레이트를 72시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다.
72시간 후에, 세포 배양 상청액을 개별적으로 분리하여 보관하였다. 이어서, 플레이트를 면역형광 염색 및 C16-항체 (CSFV로부터의 NS3 단백질에 특이적)를 사용하여 고정시키고 염색하였다. 이어서, 세포 배양 상청액의 약한 양성 웰을 상기한 바와 같은 추가의 항체 압력 하에서 계대배양하였다. 이어서, 단일 양성 세포 또는 단일 염색 세포 플라크가 존재하는 웰로부터의 세포 배양 상청액을, 1-2회의 계대배양에 대한 바이러스 역가를 증가시키기 위해서 매우 약한 항체 압력 하에서 또는 항체 압력 없이 계대배양하였다. 다양한 세포 배양 상청액을 E1 및 E2 영역의 서열결정을 위해 선택하였다.
C16 항체 또는 A18 항체 (탈출 변이체 생성에 사용됨)를 사용한 면역형광 염색을 사용하여 탈출 변이체 바이러스의 제어를 수행하였다. 더 이상 TAV-에피토프의 변화를 나타내지 않는 바이러스 변이체는 A18 항체를 사용하여 염색할 수 있다.
계대배양 이력
Figure 112012104780658-pct00002
Figure 112012104780658-pct00003
Figure 112012104780658-pct00004
탈출 변이체 B5/2, I16 , Q7 , S10 및 O11 의 특성결정
단리된 탈출 변이체를 E1 및 E2 단백질의 영역에서 서열결정하였다. 항체 A18-이덱스, A18-봄멜리, A18-세디테스트 및 C16 항체를 사용하여 다양한 면역형광 염색을 수행하였다. 탈출 변이체를 롤러 배양 (Q7, S10, O11)에 추가로 세포 배양병 (전부)에서 계대배양하고, 후속적으로 서열결정하고, 차별적으로 염색하고, 적정하였다.
Q7 특이적 실시간 RT - PCR
바이러스의 유전자 특성을 시험하고, 이에 의해 백신의 마커 특성 중의 하나를 시험하기 위해서, 탈출 변이체를 사용한 면역화 후에 바이러스 RNA의 검출을, 본래의 C-균주 "리엠스"로부터의 탈출 변이체 및 CSFV 야생 단리물을 구별할 수 있는 프라이머 및 프로브를 사용하여 수행하였다.
동물 연구 27/09 - C-균주 리엠스 돌연변이체 B5/2- P6 및 I16 - P2 의 면역 반응 시험
본 동물 연구에서, 3마리의 새끼돼지를 각각 근육내 적용을 통해 2 ml의 바이러스 현탁액 (세포 배양 상청액)으로 면역화시켰다. 동물의 분류는 다음과 같이 수행하였다: 군 A (B5/2), 군 B (I16) 및 대조군 C-균주 리엠스 (리엠서 (Riemser) 돼지열 백신). 면역 반응의 혈청학 시험을 각각의 군에 대해 수행하였다.
동물 연구 06/10 - 탈출 변이체 Q7 , S10 및 O11 의 시험
어떤 탈출 변이체가 근육내 적용 후의 위험한 효과의 부재 및 유효성에 있어서 수용자 돼지에서 가장 유망할 것인지 시험하기 위해 다음 동물 연구를 수행하였다.
8-9주령의 21마리의 새끼돼지 (약 15-20 kg)를 연구에 사용하였다. 각각의 새끼돼지를 2 x 105.0 KID50/ml (i.m.)로 면역화시켰다.
5개의 군을 시험하였다:
군 1 (5마리의 돼지): C-균주 변이체 Q7-P7의 돌연변이체 (105.0 KID50/ml)
군 2 (5마리의 돼지): C-균주 변이체 S10-P8의 돌연변이체 (105.0 KID50/ml)
군 3 (5마리의 돼지): C-균주 변이체 O11-P8의 돌연변이체 (105.0 KID50/ml)
군 4 (3마리의 돼지): 리엠서 돼지열 백신 (미처리 바이러스)
군 5 (3마리의 돼지): 비면역화된 대조군
면역화 및 혈액 샘플 채취:
0dpv 혈액 샘플 채취 (EDTA 및 혈청), 면역화
7dpv 혈액 샘플 채취 (EDTA)
14dpv 혈액 샘플 채취 (EDTA 및 혈청)
21dpv 혈액 샘플 채취 (EDTA 및 혈청)
체온 및 임상 증상에 대한 데이터는 매일 얻었다.
접종:
28dpv 혈액 샘플 채취 (EDTA 및 혈청), 코 면봉
고병독성 KSPV 균주 코슬로프 (Koslov) (1x106.5 KID50)의 접종-감염
4dpi 혈액 샘플 채취 (EDTA 및 혈청), 코 면봉
7dpi 혈액 샘플 채취 (EDTA 및 혈청), 코 면봉
10dpi 혈액 샘플 채취 (EDTA 및 혈청), 코 면봉
14dpi 혈액 샘플 채취 (EDTA 및 혈청), 코 면봉
21dpi 혈액 샘플 채취 (EDTA 및 혈청), 코 면봉
28dpi 혈액 샘플 채취 (EDTA 및 혈청), 코 면봉
동물 연구 24/10 - 탈출 변이체 S10 및 O11 의 시험; 경구 면역화 후의 보호
경구 적용의 유효성을 시험하기 위해, 다음 동물 연구를 수행하였다. 15마리의 새끼돼지를 시험 동물로서 사용하였고, 이것들은 8-10주령 (약 15-20 kg)이었다.
군 1 (6마리의 돼지): 돌연변이체 A C-균주 변이체 S10
군 2 (6마리의 돼지): 돌연변이체 B C-균주 변이체 O11
군 3 (3마리의 돼지): 감염성 대조군 (비예방접종한)
면역화 및 혈액 샘플 채취:
0 dpv 혈액 샘플 채취 (EDTA 및 혈청), 코 면봉
14 dpv 혈액 샘플 채취
28 dpv 혈액 샘플 채취 (EDTA 및 혈청), 코 면봉
4 dpi 혈액 샘플 채취 (EDTA 및 혈청), 코 면봉
7 dpi 혈액 샘플 채취 (EDTA 및 혈청), 코 면봉
10 dpi 혈액 샘플 채취 (EDTA 및 혈청), 코 면봉
14 dpi 혈액 샘플 채취 (EDTA 및 혈청), 코 면봉
21 dpi 혈액 샘플 채취
28 dpi 혈액 샘플 채취
체온 및 임상 증상에 대한 데이터는 매일 얻었다.
실험 결과
TAV -펩티드를 사용한 토끼의 면역화
두 토끼 혈청 (304 및 305)은 모두 제3 부스트 처리 (제1 면역화 약 12주 후) 후에 상업적으로 입수가능한 E2-ELISA 시험에서 양성이었다. 바이러스 중화 시험에서, 두 혈청은 제3 부스트 약 3주 후에 양성으로 시험되었다. 중화 시험에서의 역가는 낮았고, 제4 내지 제6 부스트 후에 더욱 저하되었다.
Figure 112012104780658-pct00005
C-균주 리엠스 바이러스의 E2 탈출 변이체의 단리
C-균주 리엠스를 E2 특이적 항체와 인큐베이션하면, 단지 몇 회의 계대배양 후에, 위치 2870에서 E2 영역의 하나의 치환을 나타낸 탈출 변이체가 단리되었다. 예를 들어 단리물 16P1에서와 같이 위치 2122에서 E1 단백질의 보상적 변화가 또한 발생하는 것이 추가의 변이체의 단리를 위해 중요하였다. 두 변화가 동시에 발생할 경우, E2 단백질 내의 위치 2889에서 치환을 추가로 나타낸 변이체를 추가로 단리하기 위해 단지 몇 회의 계대배양만이 항체 및 혈청 압력 하에 필요하였다. 이들 탈출 변이체 중 일부는 E2 단백질 내의 위치 3225에서 변화를 추가로 나타내었다. 그러한 탈출 변이체의 예는 단리물 B5/2이다.
변이체 B5/2의 TAV-에피토프에 대한 도식적인 표현:
야생형 C-스탐 (Stamm): CTAVSPTTLRTEVVK
돌연변이체 B5/2: CTAVSSTTLRTGVVK
항체 압력 하에서 B5/2 단리물의 추가의 계대배양에 의해 CB32 단리물이 단리되었다. 상기 단리물은 위치 2899에서 E1 단백질의 보상적 치환 이외에 E2 단백질 내의 추가의 치환 (뉴클레오티드 2862)을 추가로 나타냈다. 단리물 CB32는 변이체 B5/2와 추가의 치환을 갖는 새로운 변이체의 혼합물로부터 생성되었다. 추가의 치환을 나타낸 새로운 변이체를 단리하기 위해, 단리물 CB32를 항체 압력 하에 다수회의 계대배양을 위해 계대배양하였다. 후속적인 일련의 계대배양 H15로부터, 단리물 Q7, S10 및 O11을 단리하였다.
S10, O11 및 Q7 돌연변이체의 TAV-에피토프의 서열 비교에 대해서는 도 1을 참조한다. 단리된 탈출 변이체 내의 뉴클레오티드 및 아미노산 치환에 대한 검토에 대해서는 표 1을 참조한다.
탈출 변이체 B5/2, I16 , Q7 , S10 및 O11 의 특성결정
다양한 E2 특이적 항체의 결합에 대한 탈출 변이체의 시험은 면역형광을 이용하여 수행하였다.
Figure 112012104780658-pct00006
대부분의 경우에, TAV-에피토프 내의 단일 아미노산 치환이 A18봄멜리 항체를 사용한 면역형광을 사용할 때 음성 신호를 제공하기에 충분하였다. 2개의 TAV 돌연변이를 갖는 탈출 변이체 (예컨대 B5/2)도 A18봄멜리 및 A18C 항체 둘다를 사용할 때 음성 결과를 보였다 (도 2).
Figure 112012104780658-pct00007
시험된 모든 단리물은 A18 염색에 대해 선택된 계대배양에서 음성 신호를 보였다. 그러나, S10 단리물의 제8 계대배양에서, 작은 콜로니가 항체 WH303을 사용하여 염색가능하였다. 이것은 TAV-에피토프 내의 치환의 높은 안정성을 지지한다. 10회의 추가의 계대배양에 걸쳐 롤러 배양을 사용하여 Q7, S10 및 O11 단리물에 대한 추가의 안정성 시험을 수행하였다.
Figure 112012104780658-pct00008
제10 계대배양에서, 복귀를 보인 바이러스 변이체는 존재하지 않았고, 따라서 염색은 C16의 경우에만 가능하였다. 변이체 Q7은 제14 계대배양까지 모든 염색에 대해 음성이었고, 제16 계대배양도 C16 항체로 검출될 수 없었다. 이들 발견은 서열결정 PCR 프로토콜 이외에 RT-PCR을 사용하여 확증되었다. 따라서, 바이러스가 제16 계대배양에 존재하지 않음이 분명하고, 따라서 계대배양 오류를 또한 배제할 수 있다. 그러나, 일부 세포는 A18 (이덱스) 항체를 사용하여 S10 단리물의 제14 및 제16 계대배양에서 염색될 수 있었다. 돌연변이체 O11의 경우, 16회의 계대배양을 수행한 후, 일부 단일 세포를 A18 (봄멜리) 및 WH303 항체를 사용하여 염색할 수 있었다. 이들 결과는 본원에 기재된 바이러스 백신의 혈청학적 특징의 높은 안정성을 입증한다.
E1 및 E2 의 서열결정을 통한 탈출 변이체의 특성결정
Figure 112012104780658-pct00009
위치 2870의 치환은 10회의 계대배양 후에 모든 단리물에서 유지되었고, 이는 매우 안정한 것으로 보인다. 이것은 상기 특정 치환이 단백질의 구조에 대해 큰 효과를 갖지 않는다는 결론을 지지하고, 따라서 야생형 서열로의 복귀는 이점을 제공하지 않는다.
Figure 112012104780658-pct00010
단리물 O11, S10 및 Q7에서 서열의 변화는 시험된 모든 계대배양물에 대해 안정하였다 (14-17).
Figure 112012104780658-pct00011
3개의 변이체의 모든 서열결정된 바이러스 계대배양물은 면역 압력에 의해 유도된 E1 및 E2 단백질에 치환을 보유하였다. Q7의 제16 계대배양물은 서열결정될 수 없었는데, 이는 아마도 바이러스가 세포 배양 상청액에 잔류하지 않았기 때문일 것이다 (위 참조). 도 2의 다양한 염색을 기초로 하여 배제될 수 없는 복귀돌연변이체 (revertant) 바이러스가 나타나는 경우에, 이들은 오직 결정된 백분율로서 서열결정함으로써 검출가능하다. 그러나, 대다수의 바이러스는 복귀되지 않고, 치환 상태로 유지되었다. 개개의 복귀된 단일 바이러스는 서열결정에 의해 검출될 수 없었다.
Q7 특이적 실시간 RT - PCR
예방접종한 동물과 감염된 동물을 구분하기 위해, RT-PCR 시스템을 적용하였다. TAV-에피토프는 모든 CSF 바이러스에서 고도로 보존되기 때문에, TAV-에피토프 내의 치환을 실시간 PCR 검정에서 프라이머 및 프로브에 대한 기초로서 사용하였다.
Figure 112012104780658-pct00012
바이러스 부하는 실시간 RT-PCR을 사용하여 결정하였다. CSF-믹스 1 시스템은 모든 CSFV 균주를 인식하였고, C-균주 야생형과 새로운 탈출 변이체를 구분하지 못하였다. Q7-TAV 시스템은 3개의 모든 탈출 변이체를 특이적으로 인식하였다. C-균주-TAV 시스템은 C-균주 야생형만을 인식하였고 (탈출 변이체는 전혀 인식하지 않음), 그 ct 값은 대략 14이었다.
계대배양 횟수가 증가함에 따라 Q7-TAV RT-PCR 시스템과 C-균주-TAV 시스템 사이의 Ct 값 차이의 매우 작은 감소는 많은 횟수의 계대배양 후에 매우 소량의 복귀돌연변이체에 대한 강력한 증거를 제공한다. 일반적으로, 2개의 시스템 사이의 14 Ct 값의 차이는 약 1:8000의 돌연변이체 대 복귀돌연변이체의 비율을 나타내고, 10의 Ct 값은 1:1000의 비율을 나타낸다.
동물 연구 27/09 - C-균주 리엠스 돌연변이체 B5/2- P6 및 I16 - P2 의 면역 반응의 검사
근육내 면역화를 3마리의 새끼돼지를 사용하여 수행하였고, 여기서 각각의 새끼돼지에게 2 ml의 바이러스 현탁액 (세포 배양 상청액)을 투여하였다. 군 A는 B5/2로 처리하고, 군 B는 I16으로 처리하고, 대조군은 리엠서 돼지열 백신으로 처리하였다. 이들 연구는 면역화 후의 면역 반응에 대한 분석을 제공하고, 변형된 면역 반응 (ELISA) 후의 예방접종의 마커 특성을 시험하고, 예방접종한 동물에서 바이러스의 특성 (유전적 안정성 및 복제 특성)을 시험한다.
적용된 바이러스의 역적정은 다음 결과를 제시하였다:
B5/2-P6: 바이러스 역가 104.25 바이러스/ml
I16-P2: 바이러스 역가 104.75 바이러스/ml
백신에 대한 동물의 허용성
처리한 돼지는 면역화 후에 분명한 증상을 보이지 않았다 (열 또는 질병의 증상 미발생). 백혈구의 수는 면역화 후에 처음 7일 동안 정상 수준을 초과하여 증가하지 않았다.
바이러스는 혈액으로부터 단리할 수 없었다. 면역화 4일 및 7일 후에 혈액 샘플로부터 단리된 RNA를 RT-PCR 분석을 위해 사용하였다. 그러나, PCR 생성물은 후속 서열결정에 적합하지 않았다. 이것은 동물에서 바이러스의 매우 낮은 복제율을 입증한다.
동물 연구 06/10 - 탈출 변이체 Q7 , S10 및 O11 의 시험
역-적정은 실험에 사용된 다음 농도의 바이러스를 보여주었다:
Figure 112012104780658-pct00013
면역화 후에, 돼지열에 전형적인 체온 변화나 질병 증상이 존재하지 않았다.
접종 감염 후의 임상 분석
열은 적어도 2일 연속으로 >40℃의 직장 체온으로서 규정되었다. 5개의 군을 시험하였다:
군 1 (5마리의 돼지): C-균주 변이체 Q7-P7의 돌연변이체 (105.0 KID50/ml)
군 2 (5마리의 돼지): C-균주 변이체 S10-P8의 돌연변이체 (105.0 KID50/ml)
군 3 (5마리의 돼지): C-균주 변이체 O11-P8의 돌연변이체 (105.0 KID50/ml)
군 4 (3마리의 돼지): 리엠서 돼지열 백신 (미처리 바이러스)
군 5 (3마리의 돼지): 비면역화된 대조군
군 1에서, 접종 감염 후 제3일 내지 제13일에 측정된 온도가 신발적으로 증가하였지만, 이것은 동물 대상체의 복지에서의 임의의 다른 가시적인 파괴와 관련되지 않았다. 동물 번호 4만이 4일에 걸쳐 열을 나타내었다.
군 2는 3마리의 처리된 동물에서 신발적인 온도 증가를 보였고, 동물 번호 9가 유의한 높은 온도을 보였다.
군 3에서는, 동물 번호 14만이 접종 감염 후 제4일 및 제5일에 열을 보이면서 증가된 체온을 나타내었다.
군 4의 동물은 열을 나타내지 않았고, 신발적인 온도 증가가 2마리의 처리된 동물에서 측정되었다.
군 5의 모든 동물은 감염 후 제2일과 제7일 사이에 열을 보였다. 유의한 돼지열 증상 때문에, 군 5의 모든 동물을 감염 7일 후에 희생시켰다. 가장 흔한 증상은 중추 신경계에 대한 효과이었다 (뒷다리 부전마비 및 운동실조, 설사, 결막염 및 졸음). 한 동물은 피부의 혈종을 보였다.
바이러스는 코 면봉에 의해서는 면역화된 동물로부터 단리할 수 없었고, 비예방접종한 대조 동물은 감염 7일 후에 양성으로 시험되었다.
혈청 샘플을 사용한 RT - PCR 결과
RT-PCR 결과는 감염 14일 후에 병독성 질환-연관 바이러스의 존재에 대해 시험할 때 면역화된 동물로부터 매우 약한 신호만을 얻을 수 있음을 보여주었다. 그러나, 비-예방접종한 대조 동물은 감염 3일 후에 30 이하의 양성 Ct 값으로서 강한 양성 신호를 보였다. 비-예방접종한 동물로부터의 Ct 값은 7일 후에 17로 저하되었다.
코 면봉으로부터의 RT - PCR 결과
면역화된 동물로부터의 RT-PCR 결과는 오직 음성이었다. 그러나, 비-예방접종한 대조 동물은 감염 7일 후에 25 내지 28의 Ct 값으로서 강한 양성 신호를 보였다.
CSFV 알포트를 사용한 바이러스 중화 시험
바이러스 중화 시험은 동물 (예방접종 또는 비-예방접종한)이 병독성 바이러스를 중화시킬 수 있는 항체를 나타내는지 결정하는 것에 관한 것이다. 모든 면역화된 군이 면역화 21일 후에 중화 항체를 보였다. 감염 7일 후에, 알포트에 대한 바이러스 중화 시험 역가는 모든 면역화된 군에서 640 ND50 이상이었다. O11 면역화된 군의 1마리의 동물 및 C-균주 대조군의 1마리의 동물은 480의 역가를 나타냈다. 비-면역화된 대조 동물은 VNT에서 알포트에 대한 바이러스 역가를 나타내지 않았다.
CSFV 뢰스라트를 사용한 바이러스 중화 시험 ( VNT )
CSFV 균주 뢰스라트를 사용한 VNT에 대해서는 도 3을 참조한다.
면역화 3주 후에, S10 군의 1마리의 동물 및 O11 군의 1마리의 동물을 제외한 모든 동물이 중화 항체를 보였다. 감염 7일 후에, 면역화된 동물은 일반적으로 640 이상의 VNT 역가를 보였다. 최저 역가는 TAV 돌연변이체 면역화 군의 1마리의 동물에서 제시된 320이었다. 비-면역화된 대조 동물은 뢰스라트에 대해 VNT에서 역가를 나타내지 않았다.
E2 - ELISA ( 이덱스 )
E2-ELISA는 전통적 돼지열의 존재에 대해 시험하기 위한 상업적으로 입수가능한 ELISA-키트이다. 평균적으로, C-균주 면역화 동물은 면역화 21일 후에 E2-ELISA에서 양성 결과를 보였다. TAV 돌연변이체로 면역화시킨 동물도 또한 7일 후에 이덱스 E2-ELISA에서 양성 결과를 보였다. 비-면역화된 대조군은 감염 후에 검출가능한 항체를 보이지 않았다.
돼지 혈청을 사용한 이덱스 E2-ELISA에 대해서는 도 4를 참조한다.
E2-ELISA에서, 감염 전에 TAV 돌연변이체에 대한 결과는 양성이지만 강하지 않은 반면, 감염 후에 결과는 강한 양성으로 되었고, 이것은 강한 부스터 효과를 시사한다. C-균주 면역화 대조 동물은 감염 전에 E2-ELISA에서 강한 양성이었다.
TAV 돌연변이체로 면역화시킨 동물의 결과는 C-균주 대조군으로 면역화시킨 동물과 필적한다. 감염 후에 바이러스의 단리물은 음성이었고, RT-PCR 결과는 불확실하거나 약한 양성이었으며, 이것은 C-균주 대조군에서도 나타났다. 모든 동물은 뢰스라트 이외에 알포트에 대한 바이러스 중화 시험에서 높은 역가를 나타냈다. 모든 면역화된 동물은 근육내 면역화 4주 후에 감염성 바이러스 균주 코슬로프에 대한 완전한 보호를 나타냈다.
동물 연구 24/10 - 탈출 변이체 S10 및 O11 의 시험; 경구 면역화 후의 보호
경구 적용의 유효성을 시험하기 위해, 다음 동물 연구를 수행하였다. 8-10주령 (약 15-20 kg)의 15마리의 새끼돼지를 시험 동물로서 사용하였다.
예방접종 용량 및 실험 설계:
군 1 (6마리의 돼지): 돌연변이체 A C-균주 변이체 S10 (105 KID50/ml)
군 2 (6마리의 돼지): 돌연변이체 B C-균주 변이체 O11 (104 KID50/ml)
군 3 (3마리의 돼지): 감염성 대조군 (비예방접종)
군 1: 이 군의 모든 동물은 접종 감염 전에 완전히 보호되었다. 질병-연관 증상이 검출되지 않았다. 모든 동물은 VNT 및 ELISA 시험 모두에 의해 검출가능한 중화 항체를 보였다.
군 2: 군 2의 동물은 보호 및 감염의 혼합을 보였다. 2마리의 동물이 질병 증상, 예컨대 고열 및 다른 전형적인 돼지열 증상을 나타냈다. 이환된 동물을 안락사시켰다. 보호된 동물은 VNT 및 ELISA 시험 모두에 의해 검출가능한 중화 항체를 보였다.
군 3: 모든 동물은 감염되었고 질병 증상을 보였다. 이환된 동물을 안락사시켰다.
경구 면역화 연구는 특히 S10 돌연변이체를 사용한 경구 면역화가 감염으로부터 효과적인 보호를 유도함을 입증한다. O11 단리물도, 예방접종 용량이 S10 투여 바이러스에 비해 감소됨을 고려할 때 유익한 결과를 나타냈다.
문헌:
Figure 112012104780658-pct00014
Figure 112012104780658-pct00015
SEQUENCE LISTING <110> RIEMSER ARZNEIMITTEL AG Martin, BEER Immanuel, LEIFER Sandra, BLOME <120> Marker vaccine for classical swine fever <130> XII 76/11 <150> DE 10 2010 017 006.2 <151> 2010-05-18 <150> EP 10075207.0 <151> 2010-05-18 <150> EP 10075205.4 <151> 2010-05-18 <150> EP 10075206.2 <151> 2010-05-18 <150> EP 10075759.0 <151> 2010-12-17 <150> EP 10075760.8 <151> 2010-12-17 <150> EP 11159207.7 <151> 2011-03-22 <160> 5 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Flavivirus sp. <400> 1 cgggtgtcat agagtgcaca gtagtgagct caacgactct gagaacagga gtggtaaaga 60 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> Flavivirus sp. <400> 2 cgggtgtcat agagtgcaca gcagtgagcc caacgactct gagaacagaa gtggtaaaga 60 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Flavivirus sp. <400> 3 Thr Ala Val Ser Ser Thr Thr Leu Arg Thr Gly Val Val Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Flavivirus sp. <400> 4 Thr Val Val Ser Ser Thr Thr Leu Arg Thr Gly Val Val Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Flavivirus sp. <400> 5 Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys 1 5 10

Claims (16)

  1. E2 단백질의 TAV-에피토프의 바이러스 아미노산 서열이 야생형의 전통적 돼지열 바이러스와 상이한 서열을 포함하고, 이에 의해 바이러스 아미노산 서열은 C-균주 "리엠스 (Riems)" 바이러스에 대해
    - 아미노산 830의 발린으로의 치환,
    - 아미노산 833의 세린으로의 치환, 및
    - 아미노산 839의 글리신으로의 치환
    중 적어도 하나의 치환을 나타내는 것을 특징으로 하고, 변형된 생 약독화된 전통적 돼지열 바이러스를 포함하는, 전통적 돼지열의 예방적 처치를 위한 마커 백신.
  2. 제1항에 있어서, 변형된 생 약독화된 전통적 돼지열 바이러스가 재조합 핵산 서열을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 마커 백신.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 바이러스 뉴클레오티드 서열이 C-균주 "리엠스" 바이러스에 대해
    - 뉴클레오티드 위치 2862에서 T로의 치환,
    - 뉴클레오티드 위치 2870에서 T로의 치환, 및
    - 뉴클레오티드 위치 2889에서 G로의 치환
    중 하나 이상의 치환을 나타내는 것을 특징으로 하는 마커 백신.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 바이러스 아미노산 서열이 C-균주 "리엠스" 바이러스에 대해
    - 단백질 ERNS에서 아미노산 426의 발린으로의 치환,
    - 단백질 E1에서 아미노산 576의 히스티딘으로의 치환,
    - 단백질 E1에서 아미노산 583의 글루탐산으로의 치환, 및
    - 단백질 E2에서 아미노산 951의 이소류신으로의 치환
    중 하나 이상의 치환을 나타내는 것을 특징으로 하는 마커 백신.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 바이러스 뉴클레오티드 서열이 C-균주 "리엠스" 바이러스에 대해
    - 뉴클레오티드 위치 1649에서 G로의 치환,
    - 뉴클레오티드 위치 2099에서 C로의 치환,
    - 뉴클레오티드 위치 2122에서 G로의 치환, 및
    - 뉴클레오티드 위치 3225에서 T로의 치환
    중 하나 이상의 치환을 나타내는 것을 특징으로 하는 마커 백신.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, TAV-에피토프의 바이러스 아미노산 서열이 서열 3 또는 서열 4에 따른 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 마커 백신.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 바이러스 뉴클레오티드 서열이 서열 1에 따른 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 마커 백신.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 백신으로 처치된 대상체가, 혈청학적 분석 방법 또는 게놈 분석 방법 또는 둘 모두를 사용하여 수행한 해당 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플의 분석을 통해 질환-연관 돼지열 바이러스로 감염된 대상체로부터 구분될 수 있는 것을 특징으로 하는 마커 백신.
  9. 제8항에 있어서, 게놈 분석 방법이, 변형된 또는 질환-연관 바이러스 뉴클레오티드 서열을 인식하는 프라이머 또는 프로브 또는 이들 둘 모두를 사용하는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 기초로 하는 것을 특징으로 하는 마커 백신.
  10. 제8항에 있어서, 혈청학적 분석 방법이, 변형된 또는 질환-연관 TAV-에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하는 효소 면역검정 (EIA)을 기초로 하는 것을 특징으로 하는 마커 백신.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 압력의 인가에 의한 질환-연관 또는 다른 공지의 돼지열 바이러스 균주의 바이러스 탈출 변이체의 생성에 의해 얻을 수 있는 마커 백신.
  12. 항체 압력의 인가에 의한 질환-연관 또는 다른 공지의 돼지열 바이러스 균주의 탈출 변이체의 생성을 포함하는, 변형된 생 약독화된 전통적 돼지열 바이러스 백신 균주의 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    - 세포 배양에서 질환-연관 돼지열 바이러스로 감염된 세포의 다수회의 계대배양, 및
    - 질환-연관 돼지열 바이러스의 E2 단백질의 TAV-에피토프에 대해 작용하는 항체 또는 폴리클로날 CTAVSPTTLRTEVVK-펩티드 면역화된 토끼 혈청 또는 이들 둘 모두의 동시 적용
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 따른 마커 백신을 제약상 허용되는 담체와 함께 포함하는 제약 조성물.
  15. 전통적 돼지열의 예방적 처치 (예방접종)에서 의약으로서 사용하기 위한, 제1항 또는 제2항에 따른 마커 백신.
  16. 삭제
KR1020127032927A 2010-05-18 2011-05-18 전통적 돼지열에 대한 마커 백신 KR101845571B1 (ko)

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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103159858B (zh) * 2013-02-26 2014-06-04 中国农业科学院上海兽医研究所 猪瘟分支肽及其应用
DK3146042T3 (da) * 2014-05-23 2019-09-30 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Rekombinant klassisk svinepestvirus (CSFV) med substitution i E2-proteinets TAV-epitop

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995035380A1 (en) * 1994-06-17 1995-12-28 Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid Nucleotide sequences of pestivirus strains, polypeptides encoded by these sequences and use thereof for diagnosis and prevention of pestivirus infections
US8846055B2 (en) * 2006-05-30 2014-09-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Virulence determinant within the E2 structural glycoprotein of classical swine fever virus
US8133495B2 (en) * 2007-05-22 2012-03-13 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Live attenuated antigenically marked classical swine fever virus
EP2202298A1 (en) * 2008-12-23 2010-06-30 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Recombinant classical swine fever virus (CSFV) comprising a modified E2 protein and methods for generating said recombinant CSFV

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Veterinary Microbiology 142 (2010) 26-33
VIROLOGY, vol. 384(2009), 106-113

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