CN108064165A - 猪流行性腹泻病毒株和由其产生的免疫原性组合物 - Google Patents

猪流行性腹泻病毒株和由其产生的免疫原性组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus；“PEDV”)的新型核苷酸和氨基酸序列，包括其新型基因型，其皆适用于制备用以治疗和预防猪和其它动物中的疾病的疫苗。根据本发明的实践提供的疫苗可有效针对多种猪PEDV基因型和分离物。诊断性和治疗性多克隆和单克隆抗体也是本发明的特征，如适用于传播病毒和制备疫苗的感染性纯系。本发明的尤其重要方面包括在组织培养物和宿主猪中复制的聚核苷酸构筑体。本发明还提供可在宿主动物和组织培养物中有效复制的新型全长PEDV基因组。

Description

猪流行性腹泻病毒株和由其产生的免疫原性组合物
相关申请的交叉引用
本申请案要求2015年2月27日申请的临时专利申请案第62/121,955号、2015年8月24日申请的临时专利申请案第62/209,119号、2015年11月4日申请的临时专利申请案第62/250,961号以及2016年1月7日申请的临时专利申请案第62/276,022号在35U.S.C§119下的优先权，其以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及新型免疫原性组合物，其保护猪免患由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的疾病。
背景技术
猪流行性腹泻(PED)在猪，尤其幼小猪崽中具有高传染性并且其特征在于脱水、腹泻以及高死亡率。病原体，猪流行性腹泻病毒(PEDV)是单股、阳性有义RNA病毒，其属于冠状病毒科(Coronaviridae)中的甲型冠状病毒(Alphacoronavirus)属。PEDV的总基因体尺寸是约28kb并且含有7个开放阅读框架。PEDV感染的症状通常与由传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus；PDCoV)引起的症状类似，这两种病毒也是冠状病毒科的成员。应注意，通常并不观察到PEDV与TGEV之间的交叉保护，整体病毒核苷酸序列最多约60％相似。
PED可能在约1970年在欧洲首先观察到，并且随后表征致病病毒(参见例如M.Pensaert等人,《病毒学文献(Arch.Virol)》,第58卷,第243-247页,1978和D.Chasey等人,《兽医科学研究(Res.Vet Sci)》,第25卷,第255-256页,1978)。PEDV直到2013年才在北美发现，在那时开始广泛爆发，并且对猪产业造成严重的经济损失。病毒在数天内在多个广泛分布的母猪群中出现，并且其传播到至少32个州。生产商可预计在未经处理的新生猪崽中的损失高达100％。当前用于管理感染的建议包括实施严格的生物安全措施和/或故意使整个畜群暴露于PEDV以实现免疫性。
PEDV在1970年代和1980年代期间在若干个欧洲国家引起分布广泛的流行；但从1990年代起，PED在欧洲变得罕见，仅偶尔爆发。接着，这种经典的PEDV菌株传播到亚洲国家，如日本、中国、韩国等。从2010年起，已经在中国报道严重的PED流行性爆发，并且从这些爆发回收的PEDV在遗传学上与经典的PEDV菌株不同。美国猪类中的最初PED爆发与在中国观察到的爆发具有类似的临床表现。序列分析表明原始美国PEDV(下文称为美国PEDV原型菌株)在遗传学上与2011-2102年在中国循环的一些PEDV最类似。在2014年1月，在美国猪群中发现PEDV变异型菌株，其与美国PEDV原型菌株相比在刺突蛋白基因中具有***和缺失(INDEL)。这种变异型菌株称为美国PEDV S-INDEL-变异体菌株。在美国爆发PED之后，加拿大、墨西哥、台湾、韩国和日本报道检测到美国原型样PEDV；韩国、日本、德国、比利时、法国和葡萄牙已报道检测到美国S-INDEL-变异体样PEDV。当前，PEDV仍然是全球猪产业的重大威胁。
PEDV通常在培养物中生长不充分，并且需要鉴别适合于培养足够用于市售疫苗制备的病毒的两种具体菌株。此外，需要研发可提供针对PEDV的已知分离物的有效交叉保护的疫苗，并且预期其可提供针对全世界范围内正在进化的PEDV菌株的有效交叉保护。
发明内容
本发明涵盖免疫原性组合物，其包含从原型菌株和***缺失菌株传代的变异型PEDV菌株。美国PEDV S-INDEL-变异体菌株在遗传学上与美国PEDV原型样菌株不同，其在刺突蛋白S1结构域区域，具体地说，其第一个1170个碱基中包括特征***和缺失。***和缺失包括3个缺失(位置167处的1-nt缺失、位置176处的11-nt缺失和位置416处的3-nt缺失)、位置474与475之间的6-nt***和主要位于S1区域的第一个1,170个核苷酸中的若干其它突变。美国PEDV S-INDEL-变异体菌株的毒性低于美国PEDV原型菌株，并且在一个实施例或完整病毒中可用作经灭毒的活疫苗。当给予猪崽时，感染本发明的活的、经灭毒的连续传代S-INDEL-变异体菌株的猪不引起疾病，并且重要的是，呈现针对用毒性原型PEDV菌株或S-INDEL-变异体菌株进行的攻击的交叉保护。
因此，本发明包含适于用作疫苗的免疫原性组合物，其包含可有效引发猪中产生中和抗体的量的本发明的S-INDEL-变异体PEDV菌株(优选是活的并且经灭毒的)或其免疫原性片段、一种或多种佐剂和任选的一种或多种赋形剂。佐剂优选提供具有其它成分的水包油乳液。本发明的免疫原性组合物保护猪免受由PEDV引起的感染，并且在单次给药、两次给药程序或涉及多次给药的疫苗接种程序中有效，所述多次给药可间隔至少一周，并且任选地以更大的时间间隔进行，如一至若干个月。应注意，视具体猪群体中的传染病威胁程度而定，可作为预防措施不时地重复一次、两次或多次给药的疫苗给药程序。此外，应注意，在怀孕期间对母体猪进行接种将经由初乳和乳汁中抗体和T细胞的母体转移对幼小猪崽提供保护，但这类保护可能需要通过对猪崽进行额外的疫苗接种给药来维持。涵盖所有猪(包括猪崽和成年猪)的疫苗接种。
意外发现本发明的美国PEDV S-INDEL-变异体菌株提供针对其它PEDV菌株的交叉反应性/保护，并且预期通常将提供针对欧洲菌株且更具体地说，针对最近在欧洲出现的在完全基因组序列级方面与美国S-INDEL-变异体菌株具有极高遗传类似性(>99％)的分离物的保护。相应地，本发明的接种组合物适用于保护猪免受由PEDV的欧洲菌株(通常包括现有分离物)引起的疾病或攻击。
本发明包括PEDV的新型核苷酸和氨基酸序列，包括其新型基因型，其皆适用于制备用以治疗和预防猪和其它动物中的疾病的疫苗。根据本发明的实践提供的疫苗可有效针对多种猪PEDV基因型和分离物。诊断性和治疗性多克隆和单克隆抗体也是本发明的特征，如适用于传播病毒和制备疫苗的感染性纯系。尤其重要的是，存在所公开的疫苗，其包含作为抗原的完全病毒(活的或经灭毒的)或PEDV开放阅读框架的单一抗原蛋白质(最具体地说，来自刺突蛋白基因的第一个2.2kb，更具体地说，S1结构域)，以及编码PEDV蛋白质的全长序列的片段。本发明还提供细胞培养物中不同传代的PEDV菌株的全长基因组序列，其可在宿主动物和组织培养物中有效复制。
本发明提供治疗或预防动物中由PEDV感染引起的疾病或病症(包括直接由PEDV引起的疾病病况和由PEDV促成或增强的疾病病况)的方法。猪中可由PEDV增强并且也可根据本发明的实践治疗或预防的疾病病况包括由传染性胃肠炎病毒、PHEV和PRCV引起或与其相关的疾病病况。本发明还包括给予组合疫苗(即抗原的二价或多价组合)的方案，所述组合疫苗可包括针对非PEDV病原体的活的、经修饰的活的或不活化的抗原，以及适当选择的佐剂。
部分基于如本文中所公开的独特PEDV序列，本发明还提供用于区分用上述PEDV疫苗进行疫苗接种的猪动物与感染PEDV的野生株的猪动物的诊断试剂盒。
本发明的代表性实施例包括经分离的聚核苷酸序列，其包括编码变异型PEDV蛋白质的基因组聚核苷酸，所述变异型PEDV蛋白质是经灭毒的并且可用作免疫原性组合物。这可包括选自以下组成的组的完全基因组序列：
(a)SEQ ID NO 8-16和35-39或其编码PEDV病毒变异体的免疫原性片段；
(b)(a)中任何序列的补体；
(c)聚核苷酸，其在严格条件下与(a)或(b)的序列杂交，所述条件定义为在65℃下，在0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中与过滤器结合的DNA杂交，并且在68℃下，在0.1×SSC/0.1％SDS中洗涤；
(d)聚核苷酸，其与(a)或(b)的聚核苷酸至少70％一致；
(e)聚核苷酸，其与(a)或(b)的聚核苷酸至少80％一致；
(f)聚核苷酸，其与(a)或(b)的聚核苷酸至少90％一致；以及
(g)聚核苷酸，其与(a)或(b)的聚核苷酸至少95％一致。
优选与第二异源序列组合。
本发明还提供RNA和DNA分子、其补体、片段，以及用于任何这类RNA或DNA聚核苷酸的表达和用于由这类核苷酸序列表达的PEDV病毒的载体和质体，其中所述病毒是活的，或经完全或部分灭毒的。
本发明还提供疫苗，其包含前述聚核苷酸序列和相应的可充当感染性纯系的核苷酸序列。
本发明还包括核酸ORF，其编码来自PEDV的变异型蛋白质，如本文中的表1中所反映。表1变异作用是参考PEDV USA/IL20697/2014第5代来描述。
表1.在细胞培养物中连续传代期间，PEDV分离物IL20697/2014的核苷酸和氨基酸变化
表1.(续)在细胞培养物中连续传代期间，PEDV分离物IL20697/2014的核苷酸和氨基酸变化
a核苷酸是根据PEDV USA/IL20697/2014P3序列编号。
b仅显示非同义突变且未显示沉默突变。复制酶蛋白质的氨基酸是根据其在复制酶多蛋白pp1ab中的位置来编号。
结构蛋白质中的氨基酸是根据其在各别结构蛋白质中的位置来编号。
c*，终止密码子。
d与P3、P5、P7、P18和P30病毒以及P3R1、P5R1、P7R1、P8R1和P18R1病毒相比，P45和P60病毒在核苷酸位置24,808-24,823处具有16-核苷酸缺失，引起P45和P60病毒的ORF3翻译的早期终止。基本上，所推论的P4 5和P60 ORF3蛋白质的长度仅为7个氨基酸。
与P5病毒相比，P7、P8和P18病毒在核苷酸位置25,197-25,200处具有4-核苷酸缺失(ATTA)，引起P7、P8和P18病毒的ORE 3翻译的早期终止。
基本上，所推论的P7、P8和P18ORF3蛋白质的长度是143aa。
与P3、P5、P7、P18和P30病毒相比，P45和P60病毒在核苷酸位置25,199-25,201处具有3-核苷酸缺失(TAT)。
与P3R1病毒相比，P5R1病毒在核苷酸位置25,199-25,201具有3-核苷酸缺失(TAT)。
与P3R1病毒相比，P5R1、P7R1、P8R1和P18R1病毒在核苷酸位置25,197-25,200处具有4-核苷酸缺失(ATTA)。
与P3和P5病毒以及P3R1、P5R1、P7R1、P8R1和P18R1病毒相比，P7、P18、P30、P45和P60病毒在核苷酸位置25,304-25,35处具有56-核苷酸缺失。
本发明还提供核酸序列和所得蛋白质变异体，其具有氨基酸取代并且降低毒性，引起灭毒并且使组合物可安全地用作免疫原性组合物和疫苗。
氨基酸序列和变异型蛋白质再次显示于本文中的表2中，氨基酸引用是关于第5代PEDV/USA/IL20697/2014进行。
表2.在细胞培养物中连续传代期间，PEDV分离物IL 20697/2014的核苷酸和氨基酸变化
表2.(续)在细胞培养物中连续传代期间，PEDV分离物IL20697/2014的核苷酸和氨基酸变化
在另一优选实施例中，并且利用本文中所公开的大量多肽序列信息，还提供多肽疫苗，其中抗原是由(a)刺突蛋白；或(b)与其至少90％一致的氨基酸序列；或(c)其富含精氨酸的区域定义。
在另一实施例中，本发明包括疫苗组合物，其包含活的、经灭毒的变异型猪流行性腹泻病毒(PEDV)菌株和载体，其中所述组合物能够保护猪免受PEDV的变异型和原型菌株的攻击以及预防或治疗与PEDV感染相关的一种或多种症状，并且其中保护的实现是通过选自以下组成的组的终点测定：预防或控制脱水、发热、腹泻、呕吐、泌乳性能不良、繁殖性能不良、死亡等PEDV感染症状中的任一种，以及预防或控制体重减轻或增重失败，其中所述菌株编码具有以下氨基酸取代和其保守性变异体的蛋白质以及具有特异性取代且与序列的其余部分99％同源的蛋白质：酸取代包括以下或其保守性变异体：
A)后代P18R1 F6a
多蛋白1a/1b(SEQ ID NO:46)：位置551处的P(紧接在DEDAT之后的P)；
刺突蛋白(SEQ ID NO:47)：位置1009处的P(紧接在IGNIT之后的P)、位置973处的H(紧接在ALPFS之后的H)、位置48处的L(紧接在APAVV之后的L)、位置345处的V(紧接在TNLSF之后的A)；
ORF 3(SEQ ID NO:48)：缺失位置144处的I(紧接在YDGKS之后的I)、缺失174-189(紧接在LYLAI之后)、位置138-143处的LTANPL(紧接在NGKAA之后)，以及，
核衣壳蛋白(SEQ ID NO:51)：位置27处的H(紧接在LRVTN之后的H)。
B)后代P18R1 Gb8
刺突蛋白(SEQ ID NO:47)：位置1009处的P(紧接在IGNIT之后的P)、位置973处的H(紧接在ALPFS之后的H)、位置48处的L(紧接在APAVV之后的L)、位置345处的V(紧接在TNLSF之后的A)；
ORF 3(SEQ ID NO:48)：缺失位置144处的I(紧接在YDGKS之后的I)、缺失174-189(紧接在LYLAI之后)、位置138-143处的LTANPL(紧接在NGKAA之后)，以及，
核衣壳蛋白(SEQ ID NO:51)：位置27处的H(紧接在LRVTN之后的H)。
C)后代P7
刺突蛋白(SEQ ID NO:47)：位置633处的K(紧接在TPKPL之后的K)；
ORF 3(SEQ ID NO:48)：缺失位置189处的L(紧接在TANPL之后的L)。
D)后代P18
刺突蛋白(SEQ ID NO:47)：位置633处的K(紧接在TPKPL之后的K)、位置884处的R(紧接在VYDPA之后的R)；
ORF 3(SEQ ID NO:48)：缺失位置189处的L(紧接在TANPL之后的L)。
E)后代P30
刺突蛋白(SEQ ID NO:47)：位置884处的R(紧接在VYDPA之后的R)、位置959处的A(紧接在LIGGM之后A)；
ORF 3(SEQ ID NO:48)：缺失位置189处的L(紧接在TANPL之后的L)。
F)后代P38
刺突蛋白(SEQ ID NO:47)：位置48处的L(紧接在APAVV之后的L)、位置345处的V(紧接在TNLSF之后)、位置884处的R(紧接在VYDPA之后的R)、位置959处的A(紧接在LIGGM之后的A)，
ORF 3(SEQ ID NO:48)：缺失138-144(紧接在NGKAA之后)、缺失189处的L(紧接在TANPL之后的L)，
核衣壳(SEQ ID NO:51)：位置27处的H(紧接在LRVTN之后的H)。
G)后代P45
多蛋白1a/1b(SEQ ID NO:46)：位置1591处的M(紧接在VVKVS之后的M)、位置5087处的S(紧接在YLFST之后的S)、位置6138处的S(紧接在WQTFS之后的S)；
刺突蛋白(SEQ ID NO:47)：位置884处的R(紧接在VYDPA之后的R)、位置959处的A(紧接在LIGGM之后的A)、位置1225处的D(紧接在IESLV之后的D)；
ORF 3(SEQ ID NO:48)：缺失位置8处的Y(紧接在LGLFO之后的Y)、缺失138-144(紧接在NGKAA之后)以及缺失174到189 189(紧接在LYLAI之后)，
包膜蛋白(SEQ ID NO:49)：位置62处的F(紧接在YRVYK之后的F)；
位置183处的膜蛋白I(紧接在IVYGG之后的I)。
H)后代P60
多蛋白1a/1b(SEQ ID NO:46)：位置1591处的M(紧接在VVKVS之后的M)、位置5087处的S(紧接在YLFST之后的S)、位置6138处的S(紧接在WQTFS之后的S)；
刺突蛋白(SEQ ID NO:47)：位置884处的R(紧接在VYDPA之后)、位置959处的A(紧接在LIGGM之后)、位置973处的H(紧接在ALPFS之后的H)、位置1225处的D(紧接在IESLV之后的D)；
ORF 3(SEQ ID NO:48)：缺失位置8处的Y(紧接在LGLFO之后的Y)、缺失138-144(紧接在NGKAA之后)以及缺失174到189(紧接在LYLAI之后)，
包膜蛋白(SEQ ID NO:49)：位置62处的F(紧接在YRVYK之后的F)；
膜蛋白：位置5处的A(紧接在MSNG之后的A)、位置183处的I(紧接在IVYGG之后的I)。
I)后代P3R1
刺突蛋白(SEQ ID NO:47)：位置48处的L(紧接在APAVV之后)、位置345处的V(紧接在TNLSF之后)、位置1272处的T(紧接在DVFNA之后的T)
包膜蛋白(SEQ ID NO:49)：位置62处的S(紧接在YRVYK之后的S)；
核衣壳蛋白(SEQ ID NO:51)：位置27处的H(紧接在LRVTN之后的H)。
本发明还包括由对保藏在Accesssion KF650371第3代的原型病毒进行传代而获得的后代和氨基酸取代。氨基酸中的变化反映如下：
多蛋白1a/1b(SEQ ID NO:52)：814处的V、1076处的A、1564处的F、1896处的I、2310处的H、2600处的Y、3247处的F、3473处的V或3522处的R；
刺突蛋白(SEQ ID NO:54)：257处的N、326处的I、375处的F、491处的Y、881处的R、888处的R、1277处的F、1339处的T或1358处的L；
ORF 3(SEQ ID NO:55)在39或更靠后位置处终止；
包膜蛋白(SEQ ID NO:56)位置：69处的I；
膜蛋白(SEQ ID NO:57)位置：208处的T；
核衣壳蛋白(SEQ ID NO:58)位置：141处的L、418处的Q、424处的N或439处的I。
在本文中所描述的任何PEDV后代中进行其它修饰也属于本发明的范围内，其中所述修饰包括使用根据所属领域的技术人员已知的方法(例如同源重组)引入本文中所描述的另一后代(原型、INDEL谱系1或***缺失谱系2以及其组合)的突变。
是公认的美国-NIH基因序列资料库，其包含带标注的公开可用的DNA序列的集合，并且其还合并有来自欧洲分子生物学实验室(European Molecular BiologyLaboratory；EMBL)和日本DNA资料库(DNA DataBank of Japan；DDBJ)的提交物，关于讨论，参见《核酸研究(Nucleic Acids Research)》,2013年1月,第41卷(D1)D36-42。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分且为了进一步说明本发明的某些实施例或各种方面而包括在内。在一些情况下，本发明的实施例可通过参考随附图式与本文中呈现的详细描述的组合而最佳理解。说明和随附图式可能强调本发明的某一具体实例或某一方面。然而，所属领域的技术人员将理解，一部分实例或方面可与本发明的其它实例或方面组合使用。
图1显示当我们的团队首次发现美国PEDV S-INDEL-变异体菌株时，来自2014年1月的临床病例的PEDV S1部分核苷酸序列的***发生分析。使用软件MEGA 5.2的基于距离的相邻接合方法构筑树形图。对1,000个重复资料集进行靴带式分析，并且在分支点附近指示值。最近发现的美国PEDV S-INDEL-变异体菌株(ISU病例1-5)用实心圆表示，其具有与用三角形表示的在2013年在美国发现的PEDV(美国PEDV原型菌株)不同的序列。
图2显示基于S1部分序列和完全基因组序列的***发生树。参见附件。可发现，除在美国的猪中以外，已经在韩国、加拿大和墨西哥检测到美国原型样菌株；已经在韩国、墨西哥和德国检测到美国变异体-INDEL样菌株。
图3A显示本发明的菌株的S1序列(SEQ ID NO:1)。图3B显示S-INDEL-变异体PEDV细胞培养物分离物2014020697-P5第5代、谱系1的完全基因组序列(SEQ ID NO:8)。
图4是一种比对，其比较PEDV US S-INDEL-变异体分离物2014020697-P5第5代、谱系1的刺突蛋白基因序列(SEQ ID NO:2)与PEDV US原型分离物2013019338-P3第3代(SEQID NO:3)、2013022038-P3第3代(SEQ ID NO:4)、2013035140-P3第3代(SEQ ID NO:5)、2013049379-P3第3代(SEQ ID NO:6)以及2013049469-P1第1代(SEQ ID NO:7)，一致碱基用圆点表示。
图5是PEDV US变异型分离物2014020697-P5第5代、谱系1(SEQ ID NO:8)的完全基因组与PEDV US原型分离物2013019338-P3第3代(SEQ ID NO:9)、2013022038-P3第3代(SEQID NO:10)、2013035140-P3第3代(SEQ ID NO:11)、2013049379-P3第3代(SEQ ID NO:12)以及2013049469-P1第1代(SEQ ID NO:13)的对比，一致碱基用圆点表示。
图6A-6D是全长基因体和S1部分核苷酸序列的***发生分析。三种在这一研究中获得的美国原型PEDV分离物(USA/NC35140/2013、USA/IA49379/2013以及USA/NC49469/2013)和两种预先分离但在这一研究中评估的分离物(美国PEDV原型分离物USA/IN19338/2013和美国S-INDEL-变异体分离物USA/IL20697)用子弹点或三角形表示。还包括选自的四十五个PEDV序列以用于分析。使用MEGA6软件的基于距离的相邻接合方法(6A和6C)和最大似然法(图6B和图6D)构筑树形图。美国原型样PEDV用蓝色字体显示，其中指示进化枝1和进化枝2。美国S-INDEL-变异体样PEDV用红色字体显示。
图7A-7D显示用美国PEDV原型和S-INDEL-变异体分离物接种的5日龄猪的临床评估和病毒排出。图7A显示接种后(DPI)7天的过程中的平均腹泻分数。图7B显示平均每日体重增长(ADG)。分别对来自(-1)到3DPI和来自(-1)到7DPI的组进行关于ADG的统计分析。图7C中显示经接种的猪的直肠拭子并且图7D中显示血清中的病毒排出，其是通过基于定量PEDV N基因的实时RT-PCR测定。每个时间点的病毒效价(Log10基因组复本/毫升)是每个组中所有可用的猪(PCR阳性和阴性猪)的平均病毒效价。每个图中显示标准误差柱。在图7D中，分别在3DPI和7DPI时以统计方式分析各组中的病毒血症程度。不具有相同字母的标记表示显著差异，例如A与B具有显著差异，但A与AB不具有显著差异，
图8A-8B显示在3DPI和7DPI尸检时，经接种的猪的肉眼损害(gross lesions)的检验。小肠、盲肠和结肠的内含物的平均分数显示于图8A中。小肠、盲肠和结肠的病灶的平均分数显示于图8B中。评分准则描述于材料和方法实例2中。对多种经接种的组进行统计分析，但每次对一种组织类型并且在一个时间点时进行。不具有相同字母的标记表示显著差异。
图9A-9T显示在3DPI时进行尸检的经接种的猪的微观病灶和IHC染色。来自不同接种组的经苏木精和曙红染色的小肠(回肠)组织切片(图9A-9E)。来自不同接种组的经免疫组织化学染色的回肠(图9F-9J)、盲肠(图9K-9O)和结肠(图9P-9T)组织切片。所有图像都是100倍放大率。
图10A-10D显示在3DPI时进行尸检的猪的平均绒毛高度(μm)、隐窝深度(μm)、绒毛/隐窝比率以及免疫组织化学分数。对多种经接种的组进行统计分析，但每次对一种组织类型进行。不具有相同字母的标记表示显著差异。
图11A-11D显示在7DPI进行尸检的猪的平均绒毛高度(μm)、隐窝深度(μm)、绒毛/隐窝比率以及免疫组织化学分数。对多种经接种的组进行统计分析，但每次对一种组织类型进行。不具有相同字母的标记表示显著差异。
图12是病毒蛋白质的PEDV基因体组织和假设功能的示意图。描绘PEDV完全基因体组织(上部)。显示5'前导子、编码复制酶多蛋白的ORF 1a和1b、刺突蛋白(S)、ORF3、包膜(E)、细胞膜(M)以及核衣壳(N)基因，其中指示核糖体移码位点。描绘复制酶多蛋白的所预测的裂解产物(nsp1-nsp16)和假设功能结构域(下部)。nsp1可能抑制先天性免疫应答和宿主蛋白质合成。nsp2的确切功能仍不清楚。nsp3包括番木瓜酶样蛋白酶(PL1pro和PL2pro，裂解位点＝白色箭头)和腺苷二磷酸-核糖1”-磷酸酶(ADRP，X结构域)活性。PL2pro也是干扰素拮抗剂。nsp5是主要蛋白酶或3C样蛋白酶(3CLpro，裂解位点＝黑色箭头)。nsp3、nsp4和nsp6含有跨膜域(TM)并且充当膜锚蛋白。nsp7和nsp8形成十六聚复合物，其具有中心通道以用于与双股RNA结合并且引发RNA合成。nsp9是单股RNA结合蛋白(RBP)。nsp10是nsp14和nsp16的辅因子(活化因子)。nsp14具有N端处的3'-5'外切核酸酶(ExoN)和C端处的7-甲基转移酶(7MT)。nsp16充当2'-O-甲基转移酶(2'-O-MT)。nsp10、nsp14和nsp16之间的相互作用在病毒的复制保真性和甲基化中起重要作用。尚未完全理解nsp11功能。nsp12是病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)。nsp13具有锌结合域(ZBD)和病毒解螺旋酶。nsp13还具有NTPase和RNA 5'三磷酸酶活性。nsp15含有称为巢状病毒尿苷酸特异性核糖核酸内切酶(NendoU)的主结构。S蛋白质发挥与细胞受体相互作用的病毒连接蛋白质的功能。此外，假设S蛋白质具有中和抗原决定基并且也与病毒毒性/灭毒相关联。M蛋白质和E蛋白质在病毒组装中起重要作用。N蛋白质结合于病毒基因组RNA并且封装到核衣壳中。还显示N蛋白质拮抗干扰素-β产生。由ORF3编码的辅助蛋白可能与细胞培养物适应性相关联并且也可对细胞周期和亚细胞结构产生影响。
图13是显示针对美国PEDV原型和S-INDEL-变异体菌株的抗血清的IFA抗体测试的图像。在上部显示平均IFA抗体效价并且在下部显示IFA抗体阳性样品的数目。Pro抗血清：从用美国PEDV原型菌株接种的猪收集的抗血清；Var抗血清：从用美国PEDV S-INDEL-变异体菌株接种的猪收集的抗血清；Neg抗血清：从阴性对照猪收集的抗血清；Pro IFA：基于美国PEDV原型菌株的IFA；Var IFA：基于美国PEDV S-INDEL-变异体菌株的IFA。
图14A-14C显示通过ProWV ELISA(图14A)、ProS1 ELISA(图14B)和VarS1 ELISA(图14C)进行的针对美国PEDV原型和S-INDEL-变异体菌株的抗血清的测试。对于每次分析，黑色实线表示样品在高于其时为阳性的S/P比率；黑色点线表示样品在低于其时为阴性的S/P比率；具有黑色实线与黑色点线之间的S/P比率的样品是可疑的。ProWV ELISA：基于美国PEDV原型菌株完全病毒的ELISA；ProS1 ELISA：基于美国PEDV原型菌株S1的ELISA；VarS1ELISA：基于美国PEDV S-INDEL-变异体菌株S1的ELISA。
图15显示针对美国PEDV原型和S-INDEL-变异体菌株的抗血清的病毒中和抗体测试。在上部显示平均VN抗体效价并且在下部显示VN抗体阳性样品的数目。Pro VN：基于美国PEDV原型菌株的VN；Var VN：基于美国PEDV S-INDEL-变异体菌株的VN。
图16显示比较在细胞培养物中连续传代期间，美国原型PEDV分离物USA/IN19338/2013的核苷酸和氨基酸变化的表格。
图17显示Vero细胞中美国PEDV原型分离物USA/IN19338/2013 P7、P25、P50、P75和P100的生长曲线。
图18是显示在接种后(DPI)0-7天期间，多种接种组的直肠拭子中的病毒排出的图。不同字母表示显著差异。
图19显示在接种后第3天，多种用PEDV USA/IN19338/2013 P7、P25、P50、P75和P100接种的猪崽组中的小肠微观病灶严重度分数。不具有相同字母的标记表示显著差异，例如A与B具有显著差异，但A与AB不具有显著差异，
图20显示在接种后第3天，多种用PEDV USA/IN19338/2013 P7、P25、P50、P75和P100接种的猪崽组中小肠的平均绒毛高度与隐窝深度比率。不同字母表示显著差异。
图21显示在接种后第3天，多种用PEDV USA/IN19338/2013 P7、P25、P50、P75和P100接种的猪崽组中小肠、盲肠和结肠中的平均免疫组织化学分数。
图22A-22C显示根据本发明的例示性实施例的序列。图22A显示2014020697-P8R1第8代、谱系2ORF1a/1b多蛋白(SEQ ID NO:17)；2014020697-P8R1第8代、谱系2刺突蛋白(SEQ ID NO:18)、2014020697-P8R1第8代、谱系2ORF 3蛋白质(截短型)(SEQ ID NO:19)、2014020697-P8R1第8代、谱系2包膜蛋白(SEQ ID NO:20)、2014020697-P8R1第8代、谱系2膜蛋白(SEQ ID NO:21)以及2014020697-P8R1第8代、谱系2核衣壳蛋白(SEQ ID NO:22)的序列。图22B显示2014020697-P18R1第18代、谱系2纯系G8b ORF1a/1b多蛋白(SEQ ID NO:23)；2014020697-P18R1第18代、谱系2纯系G8b刺突蛋白(SEQ ID NO:24)；2014020697-P18R1第18代、谱系2纯系G8b ORF3蛋白质(截短型)(SEQ ID NO:25)；2014020697-P18R1第18代、谱系2纯系G8b包膜蛋白(SEQ ID NO:26)；2014020697-P18R1通道18、谱系2纯系G8b膜蛋白(SEQ ID NO:27)以及2014020697-P18R1第18代、谱系2纯系G8b核衣壳蛋白(SEQ ID NO:28)。图22C是2014020697-P18R1第18代、谱系2纯系F6a ORF1a/1b多蛋白(SEQ ID NO:29)；2014020697-P18R1第18代、谱系2纯系F6a刺突蛋白(SEQ ID NO:30)；2014020697-P18R1第18代、谱系2纯系F6a ORF 3蛋白质(截短型)(SEQ ID NO:31)；2014020697-P18R1第18代、谱系2纯系F6a包膜蛋白(SEQ ID NO:32)；2014020697-P18R1第18代、谱系2纯系F6a膜蛋白(SEQ ID NO:33)以及2014020697-P18R1第18代、谱系2纯系F6a核衣壳蛋白(SEQ ID NO:34)。
图23A-23C显示根据本发明的例示性实施例的序列。图23A显示2014020697-P8R1第8代、谱系2的基因组核苷酸序列(SEQ ID NO:35)，图23B显示2014020697-P18R1第18代、谱系2纯系G8b完整基因组的核苷酸序列(SEQ ID NO:36)；图23C显示2014020697-P18R1第18代、谱系2纯系F6a完整基因组核苷酸序列(SEQ ID NO:37)。
图24是显示多个后代的INDEL序列对比的图表。
图25是2014020697-P45第45代、谱系1的基因组核苷酸序列(SEQ ID NO:39)。
图26是2014020697-P5第5代、谱系1(P5)(SEQ ID NO:8)；2014020697-P7R1第7代、谱系2(SEQ ID NO:15)；2014020697-P8R1第8代、谱系2(SEQ ID NO:35)；2014020697-P18R1第18代、谱系2纯系G8b(SEQ ID NO:36)；2014020697-P18R1第18代、谱系2纯系F6a(SEQ IDNO:37)以及2014020697-P45第45代、谱系1(SEQ ID NO:39)的基因组核苷酸序列的对比。
图27显示根据本发明的例示性实施例的序列。显示2014020697-P45第45代、谱系1ORF1a/1b多蛋白(SEQ ID NO:40)；2014020697-P45第45代、谱系1刺突蛋白(SEQ ID NO:41)；2014020697-P45第45代、谱系1 ORF3蛋白质(SEQ ID NO:42)；2014020697-P45第45代、谱系1包膜蛋白(SEQ ID NO:43)；2014020697-P45第45代、谱系1膜蛋白(SEQ ID NO:44)；以及2014020697-P45第45代、谱系1核衣壳蛋白(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列。
图28A-28B显示粪便病毒排出效价。图28A显示每个组的每个时间点的粪便病毒排出效价，其中显示上部标准误差柱。图28B显示在D0-D28和D28-D56期间直肠拭子中整体病毒排出效价的统计分析。在D0-D28期间，N/N、N/V和N/P组接收相同接种物并且在相同的处理情况下进行分析，V/V和V/P组以及P/V和P/P组类似。不同字母表示各组之间的病毒排出量的统计显著差异。
图29A-29B宏观病理学分数。图29A是在D4(第1次接种后第4天)时的组平均宏观病理学分数，其中显示标准误差柱。图29B是在D34(在D28攻击后第6天)时的组平均宏观病理学分数，其中显示标准误差柱。显示小肠、盲肠和结肠内含物分数以及小肠、盲肠和结肠器官的肉眼损害分数。不同字母表示各组之间在相同参数下观察到的统计显著差异。黄色突出显示是用V菌株攻击的猪的统计资料，并且绿色突出显示是用P菌株攻击的猪的统计资料。
图30A-30B显示在D4时的组织病理学测量值。图30A显示远端空肠和回肠的绒毛高度/隐窝深度比率的组平均值，其中显示标准误差柱。图30B显示远端空肠、回肠、盲肠和结肠中PEDV IHC分数的组平均值，其中显示标准误差柱。不同字母表示各组之间在相同组织中观察到的统计显著差异。
图31A-31B显示在D34时的组织病理学测量值。图31A显示远端空肠和回肠的绒毛高度/隐窝深度比率的组平均值，其中显示标准误差柱。图31B显示远端空肠、回肠、盲肠和结肠中PEDV IHC分数的组平均值，其中显示标准误差柱。不同字母表示各组之间在相同组织中观察到的统计显著差异。黄色突出显示是用V菌株攻击的猪的统计资料，并且绿色突出显示是用P菌株攻击的猪的统计资料。
图32A-232B显示针对P菌株病毒或V菌株病毒的血清IFA抗体效价。图32A显示针对P菌株病毒的血清IFA效价的组平均值，其中显示标准误差柱。图32B显示针对V菌株病毒的血清IFA效价的组平均值，其中显示标准误差柱。
图33A-33B显示针对P菌株病毒或V菌株病毒的血清VN抗体效价。图33A显示针对P菌株病毒的血清VN效价的组平均值，其中显示标准误差柱。图33B显示针对V菌株病毒的血清VN效价的组平均值，其中显示标准误差柱。
具体实施方式
以下定义和介绍性内容可适用于本说明书。
除非以其它方式明确指出，否则单数术语“一”和“所述”包括多个指示物。类似地，除非以其它方式明确指出，否则词语“或”意图包括“和”。词语“或”意指具体清单中的任何一个成员并且还包括所述清单中的成员的任何组合。
术语“佐剂”是指可以增强疫苗效果的化合物，并且可以添加到包括免疫剂的配制物中。即使在给予仅单次剂量的疫苗之后，佐剂仍提供增强的免疫应答。佐剂可包括例如胞壁酰基二肽、吡啶、氢氧化铝、二甲基二(十八基)溴化铵(DDA)、油、水包油乳液、皂苷、细胞介素以及所属领域中已知的其它物质。适合的佐剂的实例描述于美国专利申请公开案第US2004/0213817 A1号中。“佐剂化”是指合并有佐剂或与佐剂组合的组合物。
“抗体”是指多克隆和单克隆抗体、嵌合和单链抗体，以及Fab片段，包括Fab或其它免疫球蛋白表达文库的产物。关于抗体，术语“免疫特异性”是指抗体结合于相关蛋白质的一个或多个抗原决定基，但其基本上不识别和结合含有抗原生物分子的混合群体的样品中的其它分子。
如本文所使用，“经灭毒的”PEDV是指能够在敏感宿主中感染和/或复制，但对敏感宿主呈非病原性或病原性较低的PEDV。举例来说，经灭毒的病毒可能引起不可观察/不可检测的临床表现，或不太明显的临床表现，或不太严重的临床表现，或与相关领域经分离的菌株相比，呈现病毒复制功效和/或感染性的降低。PEDV感染的临床表现可包括(但不限于)临床腹泻、呕吐、嗜睡、掉膘和脱水。
“抗原决定基”是具有有义免疫活性的抗原决定子，其在给予宿主后能够引起体液(B细胞)和/或细胞类型(T细胞)的免疫反应。这些是分子上作为抗原的具体化学基团或肽序列。抗体特异性结合多肽上的具体抗原决定基。在动物中，大部分抗原将同时呈现若干或甚至许多抗原决定子。这类多肽还能够作为免疫原性多肽并且可如进一步描述来鉴别抗原决定基。
如本文所使用，术语“免疫原性片段”是指多肽或多肽片段，或编码多肽或多肽片段的核苷酸序列，其包含等位基因特异性主结构、抗原决定基或其它序列使得多肽或片段将结合MHC分子并且诱导针对衍生免疫原性多肽或免疫原性片段的抗原的细胞毒性T淋巴细胞(“CTL”)应答，和/或B细胞应答(例如抗体产生)，和/或T-辅助淋巴细胞应答，和/或延迟型过敏(DTH)应答。DTH应答是一种免疫反应，其中T细胞依赖性巨噬细胞活化和炎症引起组织损伤。通常使用对抗原的皮下注射的DTH反应作为细胞介导的免疫性的分析法。
术语“诱导免疫保护性应答”意指(体液和/或细胞)免疫应答，其降低或消除一种或多种疾病症状，即与健康对照物相比，受感染个体中的组织中的临床症状、病灶、细菌分泌和细菌复制。优选所述症状减少在与对照物相比时是统计显著的。
出于本发明的目的，“感染性DNA分子”是将病毒复制、转录和翻译所必需的元件编码到适合的宿主细胞中的功能性病毒粒子中的DNA分子。
术语“经分离的”用于表示细胞、肽或核酸从其原生环境分离。经分离的肽和核酸可以是基本上纯的，即基本上不含其可能在自然界中结合的其它物质。
出于本发明的目的，第二聚核苷酸分子(RNA或DNA)的核苷酸序列是与第一聚核苷酸分子的核苷酸序列“同源”的，或与所述第一聚核苷酸分子具有“一致性”，其中如基于遗传密码的简并，或当第二聚核苷酸分子的核苷酸序列编码足够类似于由第一聚核苷酸分子的核苷酸序列编码的聚氨基酸的聚氨基酸以便适用于实践本发明时，其编码与第一聚核苷酸分子的核苷酸序列相同的聚氨基酸。同源聚核苷酸序列也是指有义链和反义链，并且在所有情况下是指任何这类链的补体。出于本发明的目的，聚核苷酸分子适用于实践本发明，并且因此是同源的或具有一致性，其中其可以用作用于检测被感染的猪的体液或组织样品中PEDV或病毒聚核苷酸的存在的诊断探针，例如通过标准杂交或扩增技术。通常，如基于BLASTN算法(美国国立卫生研究院(United States National Institute of Health)的美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)，另被称为NCBI，(美国马里兰州贝塞斯达(Bethesda,Maryland,USA)))，如果第二聚核苷酸分子的核苷酸序列与第一聚核苷酸分子的核苷酸序列具有至少约70％核苷酸序列一致性，那么其与第一聚核苷酸分子的核苷酸序列同源。在用于根据本发明实践计算的具体实例中，提到了BLASTP 2.2.6[Tatusova TA和TL Madden,“BLAST 2序列-一种用于比较蛋白质和核苷酸序列的新工具(BLAST 2sequences-a new tool for comparing protein and nucleotidesequences)”(1999)《FEMS微生物学快报(FEMS Microbiol Lett.)》174:247-250.]。简单来说，使用空位开放罚分10、空位延伸罚分0.1以及Henikoff和Henikoff(《美国国家科学院院刊》325 89:10915-10919.1992)的“blosum62”评分矩阵比对两种氨基酸序列以优化比对评分。接着如下计算一致性百分比：一致匹配的总数×100/除以较长序列的长度+为了比对两个序列而引入到较长序列中的空位的数量。
优选地，同源核苷酸序列具有至少约75％核苷酸序列一致性，甚至更优选至少约80％、85％、90％和95％核苷酸序列一致性。由于遗传密码是简并的，所以同源核苷酸序列可以包括任何数量的“沉默”碱基改变，即仍然编码相同氨基酸的核苷酸取代。
同源核苷酸序列可以进一步含有非沉默突变，即在所编码的聚氨基酸中产生氨基酸差异的碱基取代、缺失或添加，只要所述序列保持与由第一核苷酸序列编码的聚氨基酸至少约70％一致性或以其它方式适用于实践本发明即可。在此方面，可以进行公认为不使整体蛋白质功能失活的某些保守性氨基酸取代：例如关于带正电荷的氨基酸(且反之亦然)赖氨酸、精氨酸和组氨酸；关于带负电荷的氨基酸(且反之亦然)天冬氨酸和谷氨酸；以及关于某些不带电氨基酸的群组(并且在所有情况下，也反之亦然)，(1)丙氨酸和丝氨酸，(2)天冬酰胺、谷氨酰胺和组氨酸，(3)半胱氨酸和丝氨酸，(4)甘氨酸和脯氨酸，(5)异白氨酸、白氨酸和缬氨酸，(6)甲硫氨酸、白氨酸和异白氨酸，(7)苯丙氨酸、甲硫氨酸、白氨酸和酪氨酸，(8)丝氨酸和苏氨酸，(9)色氨酸和酪氨酸，(10)以及例如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。可以根据物理性质和对二级与三级蛋白质结构的贡献对氨基酸进行分类。因此，在所属领域中将保守性取代视为一个氨基酸对另一个具有类似特性的氨基酸的取代，并且例示性保守性取代可见于1997年3月13日公开的WO 97/09433，第10页(1996年9月6日申请的PCT/GB96/02197)中。或者，保守性氨基酸可以如Lehninger(《生物化学(Biochemistry)》,第二版；Worth Publishers,Inc.NY:NY(1975),第71-77页)中所述进行分组。蛋白质序列可使用Vector NTI Advance 11.5和CLUSTAL 2.1多序列比对来比对。如本文所使用，具体氨基酸或核苷酸序列的引述应包括相对于核酸序列的所有沉默突变，以及相对于氨基酸序列的任何和所有保守性修饰变异体。
可以通过比较核苷酸序列，例如通过使用上文的BLASTN来测定同源核苷酸序列。或者，可以通过在选定条件下杂交来测定同源核苷酸序列。举例来说，如果第二聚核苷酸分子的核苷酸序列与SEQ ID NO:1的补体在适当的严格条件(例如与过滤器结合的DNA在0.5MNaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中在65℃下杂交，并且在0.2×SSC/0.1％SDS中在42℃下洗涤(参见Ausubel等人编辑,《分子生物学方案(Protocols in MolecularBiology)》,Wiley and Sons,1994,第6.0.3到6.4.10页))或将以其它方式引起编码如下文所定义的PEDV病毒的序列杂交的条件下杂交，那么其与SEQ ID NO:1(或任何其它具体聚核苷酸序列)同源。可以凭经验确定或基于探针的长度和鸟苷/胞嘧啶(GC)碱基配对的百分比准确计算杂交条件的修改。可以如Sambrook等人(编),《分子克隆实验指南(MolecularCloning:A Laboratory Manual)》,Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold SpringHarbor,New York(1989),第9.47到第9.51页中所描述来计算杂交条件。
在另一实施例中，如所属领域中已知，如果第二核苷酸序列与SEQ ID NO:1的补体在高度严格条件(例如与过滤器结合的DNA在0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中在65℃下杂交，并且在0.1×SSC/0.1％SDS中在68℃下洗涤)下杂交，那么其与SEQ ID NO:1(或本发明的任何其它序列)同源。
此外应了解，本发明的经分离聚核苷酸分子和经分离的RNA分子包括合成分子和通过重组技术，如通过活体外克隆和转录获得的分子。
应注意，许多本发明的具有疫苗功能的经灭毒的PEDV病毒含有由ORF3核苷酸序列中的灭毒突变引起的ORF3蛋白质的显著缺失，其引起显著内部缺失和/或最典型地，出现由移框产生的经截短的翻译所得物以及出现终止密码子。因此，应注意，在本发明的实践内，比对和一致性百分比计算以及所陈述的一致性结果(无论核苷酸或氨基酸序列)可在参考或不参考缺失的ORF3序列的情况下计算。
“哺乳动物”包括哺乳纲的任何温血脊椎动物，包括人类。
“医药学上可接受的载剂”意指在所属领域中用于疫苗的制备和给药的任何常规医药学上可接受的载剂、媒剂或赋形剂。药物学上可接受的载剂通常是无毒性、惰性、固体或液体载剂。
术语“猪(Porcine)”和“猪(swine)”在本文中可互换地使用并且是指作为猪科(Suidae)的成员的任何动物，例如猪(pig)。
如本文所使用，“敏感”宿主是指可被PEDV感染的细胞或动物。当引入敏感动物中时，经灭毒的PEDV还可以诱导针对PEDV或其抗原的免疫应答，并且由此显现针对PEDV感染的动物免疫性。
术语“疫苗”是指一种抗原制剂，其用于产生针对疾病的免疫性，以预防或改善感染作用。疫苗通常是使用免疫有效量的免疫原与可有效增强经疫苗接种的个体针对免疫原的免疫应答的佐剂的组合来制备。
疫苗配制物将含有“治疗有效量”的活性成分，也就是说，能够引起诱导被给予组合物的个体中的免疫保护性应答的量。举例来说，在PEDV疾病的治疗和预防中，“治疗有效量”将优选是可增强经疫苗接种的个体对新感染的抵抗性和/或降低疾病的临床严重性的量。这类保护将由减少或不存在被PEDV感染的个体通常所显示的症状、更快速的恢复时间和/或降低的病毒颗粒计数证明。疫苗可作为针对PEDV的预防性手段在感染之前给予。或者，疫苗可在个体已经感染疾病之后给予。与天然感染本身相比，在暴露于PEDV之后给予的疫苗能够缓解疾病，引起优良的免疫应答。
出于本发明的所有方面的实践目的，如所属领域的技术人员众所周知，在关于暴露于具体抗原或病原体时血清反应呈阴性的动物和血清反应呈阳性(暴露于疫苗或病原体)的动物的免疫分析法中不存在绝对免疫边界。然而，所属领域的技术人员将认识到，在血清中和分析法中，血清反应呈阳性的动物通常将检测到至少高达1:1000血清稀释，而预期血清反应呈阴性的动物将不会在如约1:20或1:10的较高稀释度下中和。
疫苗配制物/免疫原性组合物
本发明还涉及适合用作疫苗的免疫原性组合物，其包含本发明的变异型PEDV菌株。本发明的免疫原性组合物引起针对包含中和抗体的PEDV的特异性体液免疫应答。
本文中所公开的基于变异型菌株的优选免疫原性组合物可提供活的、经灭毒的病毒，其呈现高免疫原性，同时不会产生危险的病原性或致死性作用。
然而，本发明的免疫原性组合物不限于任何具体类型或制备方法。这些组合物包括(但不限于)感染性DNA疫苗(即，使用质体、载体或其它常规载剂将DNA直接注射到猪中)、活疫苗、经修饰的活疫苗、失活疫苗、子单元疫苗、经灭毒的疫苗、经遗传工程改造的疫苗等。这些疫苗是通过所属领域中已知的标准方法制备。
本发明优选包括疫苗组合物，其包含本发明的活的、经灭毒的变异型PEDV和医药学上可接受的载剂。如本文中所使用，表述“本发明的活的、经灭毒的PEDV”涵盖任何活的、经灭毒的PEDV菌株，其包括本文中所描述的变化形式中的一个或多个。医药学上可接受的载剂可以是例如水、稳定剂、防腐剂、培养基或缓冲液。包含本发明的经灭毒的PEDV的疫苗配制物可按悬浮液形式或冻干形式或冷冻形式制备。如果冷冻，那么可以在冷冻时添加甘油或其它类似试剂以增强稳定性。一般来说，活的、经灭毒的疫苗的优点包括将传染剂的所有相关免疫原性决定子以其天然形式呈现于宿主的免疫***，和由于药剂在经疫苗接种的宿主中的繁殖能力而需要相对较小量的免疫剂。
用于活疫苗的病毒的灭毒(使得病毒的病原性不足，从而不能显著伤害经疫苗接种的目标动物)可以通过已知的程序实现，包括优选通过连续传代实现。以下参考文献提供用于冠状病毒的灭毒的多种一般方法，并且适用于在本发明的实践中适用的菌株中的任一种的灭毒或进一步灭毒：B.Neuman等人,《病毒学杂志(Journal of Virology)》,第79卷,第15号,第9665-9676页,2005；J.Netland等人,《病毒学(Virology)》,第399(1)卷,第120-128页,2010；Y-P Huang等人,“《受精卵中在灭毒传代之后3'7.3kb基因体中感染性支气管炎病毒分离物的序列变化，禽类病变》(Sequence changes of infectious bronchitis virusisolates in the 3'7.3 kb of the genome after attenuating passage inembryonated eggs,Avian Pathology)”,第36(1)卷,(摘要),2007；以及S.Hingley等人,《病毒学(Virology)》,第200(1)卷,1994,第1-10页；参见美国专利3,914,408；以及Ortego等人,《病毒学》,第308(1)卷,第13-22页,2003。
其它经遗传工程改造的疫苗(其在本发明中合乎需要)是通过所属领域中已知的技术产生。这类技术涉及(但不限于)重组型DNA的进一步操作、对重组型蛋白质的氨基酸序列的修饰或取代等。
基于重组型DNA技术的经遗传工程改造的疫苗是例如通过鉴别病毒基因编码蛋白质(例如来源于M、GP2、GP3、GP4或GP5等的蛋白质)中负责诱导猪中更强的免疫或保护性应答的替代性部分而制得。病毒蛋白质基因的多种亚型或分离物可经历DNA改组方法。所得异质性嵌合病毒蛋白质可广泛用于保护子单元疫苗。或者，可将这类嵌合病毒基因或免疫显性片段选殖到标准蛋白质表达载体中，如杆状病毒载体，并且用于感染适合的宿主细胞(参见例如O'Reilly等人,“《杆状病毒表达载体：实验指南(Baculovirus ExpressionVectors:A Lab Manual)》”,Freeman&Co.,1992)。培养宿主细胞，由此表达所需疫苗蛋白质，所述蛋白质可纯化到所需程度并且配制成适合的疫苗产物。
如果纯系保留任何不合需要的天然的引起疾病的能力，也有可能查明病毒基因组中引起任何残余毒性的核苷酸序列，并且通过例如定点突变诱发来遗传工程改造病毒使其无毒性。定点突变诱发能够添加、删除或改变一个或多个核苷酸(参见例如Zoller等人,《DNA》3:479-488,1984)。合成含有所需突变的寡核苷酸并且粘接到一部分单股病毒DNA。杂交分子(其由所述程序产生)用于使细菌转型。接着，使用双股DNA(其以含有适合的突变的形式分离)通过与后者的限制性片段接合来产生全长DNA，接着将全长DNA转染到适合的细胞培养物中。将基因体接合到适合的载体中以用于转移可以通过所属领域的技术人员已知的任何标准技术实现。将载体转染到宿主细胞中以用于产生病毒后代可以使用任何常规方法进行，如磷酸钙或DEAE-聚葡萄糖介导的转染、电致孔、原生质体融合以及其它众所周知的技术(例如Sambrook等人,“《分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)》”,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。接着，经克隆的病毒呈现所需突变。或者，可合成含有适合的突变的两个寡核苷酸。可使这些寡核苷酸粘接以形成双股DNA，可将所述双股DNA***病毒DNA中以产生全长DNA。
给予需要预防病毒感染的猪免疫有效量的本发明的疫苗。用于对猪进行接种的免疫有效量或免疫原性量可通过常规试验容易地测定或容易地滴定。有效量是其中实现足够的针对疫苗的免疫应答以保护暴露于PEDV病毒的猪的量。优选地，保护猪达到其中病毒疾病的一个到所有不良生理学症状或作用显著减少、改善或完全预防的程度。
本发明的疫苗可根据公认的惯例配制以包括用于动物的可接受的载剂，如标准缓冲液、稳定剂、稀释剂、防腐剂和/或增溶剂，并且还可以经配制以促进持续释放。稀释剂包括水、生理食盐水、右旋糖、乙醇、甘油等。用于等张性的添加剂尤其包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇以及乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白。其它适合的疫苗媒剂和添加剂，包括尤其适用于配制经修饰的活疫苗的那些，是所属领域的技术人员已知的或将显而易见的。参见例如《雷明顿的药物科学(Remington's Pharmaceutical Science)》,第18版,1990,MackPublishing，其以引用的方式并入本文中。
本发明的疫苗可以进一步包含一种或多种其它免疫调节组分，尤其例如佐剂或细胞激素。可以用于本发明的疫苗中的佐剂的非限制性实例包括RIBI佐剂***(Ribi Inc.,Hamilton,Mont.)、明矾、矿物凝胶(如氢氧化铝凝胶)、水包油型乳液、油包水乳液(例如弗氏(Freund's)完全和不完全佐剂)、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta Ga.)、QS-21(CambridgeBiotech Inc.,Cambridge Mass.)、SAF-M(Chiron,Emeryville Calif.)、佐剂、皂苷、Quil A或其它皂苷部分、单磷酰基脂质A、离子型多糖以及阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂。适用本发明的疫苗中的水包油乳液的非限制性实例包括经修饰的SEAM62和SEAM 1/2配制物。经修饰的SEAM62是水包油乳液，其含有5％(v/v)角鲨烯(Sigma)、1％(v/v)85清洁剂(ICI Surfactants)、0.7％(v/v)80清洁剂(ICISurfactants)、2.5％(v/v)乙醇、200μg/ml Quil A、100μg/ml胆固醇以及`0.5％(v/v)卵磷脂。经修饰的SEAM 1/2是一种水包油乳液，其包含5％(v/v)角鲨烯、1％(v/v)85清洁剂、0.7％(v/v)Tween 80清洁剂、2.5％(v/v)乙醇、100μg/ml Quil A以及50μg/ml胆固醇。可以包括在疫苗中的其它免疫调节剂包括例如一种或多种白介素、干扰素或其它已知的细胞介素。
其它佐剂***可实现T-辅助子与B细胞抗原决定基的组合，产生一种或多种类型的共价T-B抗原决定基连接结构，并且可能额外经脂化，如WO2006/084319、WO2004/014957和WO2004/014956中所描述。
在本发明的一个优选实施例中，配制具有5％的ORFI PEDV蛋白质或其它PEDV蛋白质或其片段，如下文所讨论。
佐剂组分
本发明的疫苗组合物可包含或可不包含佐剂。具体来说，如基于经口感染的病毒，本发明的经修饰的活疫苗可在无佐剂情况下与无菌载剂一起使用。可用于口服给药的佐剂包括基于CT类免疫调节剂的佐剂(rmLT、CT-B，即大肠杆菌的重组型突变体热不稳定毒素，霍乱毒素-B子单元)；或通过用聚合物和海藻酸盐或粘膜粘着剂(如聚氨基葡萄糖)或通过脂质体封装。通过疫苗释放按最小保护性剂量给药的优选佐剂化或非佐剂化疫苗每次给药可提供约10与约106log10TCID50之间或更高的病毒。“TCID50”是指“组织培养物感染性剂量”并且被定义为感染50％给定批次接种细胞培养物所需的病毒稀释度。多种方法可用于计算TCID50，包括在整个本说明书中利用的斯皮尔曼-卡勃方法(Spearman-Karber method)。斯皮尔曼-卡勃方法的描述参见B.W.Mahy和H.O.Kangro,《病毒学方法指南(VirologyMethods Manual)》,第25-46页(1996)。佐剂(如果存在)可按乳液形式提供，在选择非口服给药的情况下更常见，但不应使起始效价降低超过0.7倍对数值(降低80％)。
在一个实例中，由含卵磷脂的轻矿物油的组合以及氢氧化铝组分提供佐剂组分。关于(如代表性卵磷脂/矿物油组分)的组成和配制的细节如下。
优选佐剂化可按在缓冲溶液中的2ML剂量提供，其进一步包含约5％(v/v)(氢氧化铝凝胶)和最终约25％(v/v)“20％Amphigen” 通常描述于美国专利5,084,269中并且提供溶解于轻油中的去油化卵磷脂(优选大豆)，其接着以水包油乳液形式分散于抗原的水性溶液或悬浮液中。Amphigen已根据美国专利6,814,971(参见其第8-9栏)的方案改良，以提供所谓的“20％Amphigen”组分以便用于本发明的最终佐剂化疫苗组合物。因此，用0.63％磷酸盐缓冲生理食盐水溶液按1:4稀释10％卵磷脂和90％载剂油的储备混合物(Penreco,Karns City,PA)，由此使卵磷脂和DRAKEOL组分分别降低到2％和18％(即其原始浓度的20％)。向组合物中添加Tween 80和Span 80表面活性剂，其中代表性和优选最终含量是5.6％(v/v)Tween 80和2.4％(v/v)Span 80，其中Span最初在储备液DRAKEOL组分中提供，并且Tween最初由缓冲生理食盐水组分提供，使得生理食盐水和DRAKEOL组分的混合物产生最终所需表面活性剂浓度。DRAKEOL/卵磷脂和生理食盐水溶液的混合物可使用405型In-Line Slim Emulsifier装置(CharlesRoss and Son,Hauppauge,NY,USA)获得。
疫苗组合物还包括LV(储备液材料中约2％氢氧化铝含量)，以及其它佐剂组分(可从Reheis,NJ,USA,and ChemTrade Logistics,USA购得)。当使用0.63％PBS进一步稀释时，最终疫苗组合物每2ML剂量含有以下组成量；5％(v/v)LV；25％(v/v)“20％Amphigen”(即其进一步稀释4倍)；以及0.01％(w/v)硫柳汞。
如在所属领域中理解，可改变组分的添加次序以提供等效最终疫苗组合物。举例来说，可制备适合的病毒于缓冲液中的稀释物。接着可一边掺合一边添加适量的LV(约2％氢氧化铝含量)储备溶液，以便实现实际最终产物中所需5％(v/v)浓度的LV。在制备后，使这一中间物储备液材料与适量的“20％Amphigen”储备液(如上文一般描述，并且已含有所需量的Tween 80和Span 80)以再次获得具有25％(v/v)“20％Amphigen”的最终产物。可最终添加适量的10％硫柳汞。
本发明的接种组合物实现所有成分的变化，使得与上文陈述的抗原剂量相比，抗原的总剂量可优选变化达到因子是100(向上或向下)，并且最优选达到因子是10或更低(向上或向下)。类似地，表面活性剂浓度(无论Tween或Span)可彼此独立地变化达到最多因子是10，或其可完全删除，用适合浓度的类似材料置换，如所属领域中良好理解。
可改变最终产物中的浓度，首先通过使用可从许多其它制造商购得的等效材料(即Brenntag；Denmark)，或通过使用系列产物(如CG、HPA或HS)中的其它变化。使用LV作为实例，其最终适用浓度包括0％到20％，其中更优选是2-12％，并且最优选是4-8％。类似地，尽管Amphigen的最终浓度(表示为“20％Amphigen”的百分比)优选是25％，但这一含量可在5-50％，优选20-30％并且最优选约24-26％的范围内变化。
根据本发明的实践，本发明的佐剂配制物中使用的油优选是矿物油。如本文所使用，术语“矿物油”是指经由蒸馏技术从矿脂获得的液态烃的混合物。所述术语与“液化链烷烃”、“液体矿脂”和“白色矿物油”同义。所述术语还试图包括“轻矿物油”，即类似地通过蒸馏矿脂而获得但比重比白色矿物油略低的油。参见例如《雷明顿的药物科学》,第18版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1990,第788和1323页)。矿物油可从各种商业来源获得，例如J.T.Baker(Phillipsburg,PA)、USB Corporation(Cleveland,OH)。优选的矿物油是可按名称商购的轻矿物油。
通常，以体积计，油性相以50％到95％的量存在；优选地，以大于50％到85％的量存在；更优选以大于50％到60％的量存在，并且更优选以大于疫苗组合物的50-52％v/v的量存在。油性相包括油和乳化剂(例如80、80等)(如果存在任何这类乳化剂)。
适用于本发明的佐剂配制物中的非天然、合成乳化剂还包括基于脱水山梨糖醇的非离子型表面活性剂，例如经脂肪酸取代的脱水山梨糖醇表面活性剂(可以名称或商购)、聚乙氧基化山梨醇的脂肪酸酯来自如蓖麻油的来源的脂肪酸的聚乙二醇酯聚乙氧基化脂肪酸(例如可以名称M-53获得的硬脂酸)、聚乙氧基化异辛基苯酚/甲醛聚合物聚氧乙烯脂肪醇醚聚氧乙烯非苯基醚(N)、聚氧乙烯异辛基苯基醚(X)。优选合成表面活性剂是可以名称和获得的表面活性剂，如-80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)和-80(脱水山梨糖醇单油酸酯)。一般来说，以体积计，乳化剂可按0.01％到40％，优选0.1％到15％，更优选2％到10％的量存在于疫苗组合物中。
在本发明的替代实施例中，最终疫苗组合物含有和LV作为佐剂(或其它或产品)，其中优选量是约5-20％SP-Oil(v/v)和约5-15％Rehydragel LV(v/v)，并且最优选量分别是5％和12％。在这一方面，应理解，％Rehydragel是指来自储备液市售产品的稀释物百分比。(是流体化油乳液，其包括聚氧乙烯-聚环氧丙烷嵌段共聚物(L121，BASF Corporation)、角鲨烯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(80，ICI Americas)以及缓冲盐溶液)。
应注意，本发明还可以使用其中佐剂组分仅是来成功地实践。
在本发明的另一实施例中，最终疫苗组合物含有TXO作为佐剂；TXO通常描述于WO2015/042369中。其中所公开的所有组合物皆适用于制备本发明的疫苗。在TXO中，免疫刺激性寡核苷酸(“T”，优选是ODN，优选含有倒序序列并且任选地具有经修饰的主链)以每50μl疫苗组合物0.1到5μg的量存在(例如每50μl组合物0.5-3μg，或更优选每50μl组合物0.09-0.11μg)。其优选种类是SEQ ID NO:8，如WO2015/042369公开案(PCT/US2014/056512)中列举(第17页)。聚阳离子性载剂(“X”)以1-20μg/50μl的量存在(例如3-10μg/50μl，或约5μg/50μl)。轻矿物油(“O”)也是TXO佐剂的组分。
在某些实施例中，TXO佐剂制备如下：
a)使脱水山梨糖醇单油酸酯、MPL-A和胆固醇溶解于轻矿物油中。将所得油溶液无菌过滤；
b)使免疫刺激性寡核苷酸、Dextran DEAE和聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯溶解于水相中，由此形成水溶液；以及
c)在连续均匀化下将水溶液添加到油溶液中，由此形成佐剂配制物TXO。
本发明的所有佐剂组合物皆可以与由本发明涵盖的PEDV菌株和分离物中的任一种一起使用。
适用实践本发明的其它佐剂包括Prezent-A(通常参见美国公开专利申请案US20070298053)；和“QCDCRT”或“QCDC”型佐剂(通常参见美国公开专利申请案US20090324641)。
赋形剂
本发明的免疫原性和疫苗组合物可进一步包含呈冻干配制物或水性溶液形式的药物学上可接受的载剂、赋形剂和/或稳定剂(参见例如《雷明顿：医药科学和实践(Remington:The Science and practice of Pharmacy)》,2005,Lippincott Williams)。可接受载剂、赋形剂或稳定剂在所述剂量和浓度下对受体无毒性，并且可包含缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如汞((邻羧基苯基)硫基)乙基钠盐(THIOMERSAL)、十八烷基二甲基苯甲基氯化铵、氯化六羟季铵；苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、苄索氯铵(benzethonium chloride)；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸；谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或聚葡萄糖；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐相对离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)、TWEEN或PLURONICS。
本发明的疫苗可以任选地经配制用于持续释放本发明的病毒、感染性DNA分子、质体或病毒载体。这类持续释放配制物的实例包括与生物相容性聚合物的复合物组合的病毒、感染性DNA分子、质体或病毒载体，所述生物相容性聚合物例如聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、甲基纤维素、玻尿酸、胶原蛋白等。药物传递媒剂中可降解聚合物的结构、选择和使用已经在若干出版物中有所综述，这些出版物包括A.Domb等人,1992,《先进技术聚合物(Polymers for Advanced Technologies)》3:279-292，其以引用的方式并入本文中。关于医药学配制物中聚合物的选择和使用的其它指导可见于所属领域中已知的文本中，例如M.Chasin和R.Langer(编),1990,“《作为药物传递***的生物可降解聚合物(Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems)》”《药物与制药科学(Drugs andthe Pharmaceutical Sciences)》,第45卷,M.Dekker,NY，其也以引用的方式并入本文中。或者或另外，可以对病毒、质体或病毒载体进行微封装以改良给药和功效。用于微封装抗原的方法是所属领域中众所周知的，并且包括例如以下文献中描述的技术：美国专利第3,137,631号；美国专利第3,959,457号；美国专利第4,205,060号；美国专利第4,606,940号；美国专利第4,744,933号；美国专利第5,132,117号；以及国际专利公开案WO 95/28227，其皆以引用的方式并入本文中。
脂质体还可以用于实现病毒、质体、病毒蛋白质或病毒载体的持续释放。关于如何制造和使用脂质体配制物的细节尤其可见于美国专利第4,016,100号；美国专利第4,452,747号；美国专利第4,921,706号；美国专利第4,927,637号；美国专利第4,944,948号；美国专利第5,008,050；以及美国专利第5,009,956中，其皆以引用的方式并入本文中。
上述疫苗中的任一种的有效量可以通过常规手段确定，以低剂量的病毒、病毒蛋白质质体或病毒载体开始，并且随后增加剂量同时监测作用。可以在单次投与疫苗之后或在多次投与疫苗之后获得有效量。当确定每种动物的最佳剂量时，可以考虑已知因素。这些因素包括所述动物的物种、尺寸、年龄以及一般状况、所述动物中其它药物的存在情况等。优选在考虑来自其它动物研究的结果之后选择实际剂量。
一种检测是否已经实现了足够的免疫反应的方法是测定在接种之后动物中的血清转化和抗体效价。疫苗的时间安排和辅助剂(如果存在)的数量优选地将基于所有相关因素的分析由医生或兽医确定，所述因素中的一些在上文已有描述。
本发明的病毒、蛋白质、感染性核苷酸分子、质体或病毒载体的有效剂量可以使用已知的技术，考虑可由所属领域的一般技术人员测定的因素(如待接种的动物的体重)来测定。本发明的疫苗中本发明的病毒的剂量优选在约101到约109pfu(空斑形成单位)，更优选约102到约108pfu，并且最优选约103到约107pfu的范围内。本发明的疫苗中本发明的质体的剂量优选在约0.1μg到约100mg，更优选约1到约10mg，甚至更优选约10μg到约1mg范围内。本发明的疫苗中本发明的感染性DNA分子的剂量优选在约0.1μg到约100mg，更优选约1μg到约10mg，甚至更优选约10μg到约1mg范围内。本发明的疫苗中本发明的病毒载体的剂量优选在约101pfu到约109pfu，更优选约102pfu到约108pfu，并且甚至更优选约103到约107pfu的范围内。适合的剂量大小在约0.5ml到约10ml，并且更优选约1ml到约5ml范围内。
根据本发明的实践，病毒蛋白质或肽疫苗的适合的剂量的范围通常是1到50微克/剂量或更高的量，如可以通过标准方法测定，其中关于每种这类物质的佐剂的量是通过公认方法测定。在关于猪的接种的一个本发明优选实例中，动物的最佳年龄目标是在约1与21天之间，在断奶之前，还可以与安排的其它接种一致，例如抗猪肺炎支原体。此外，育种大母猪的接种的优选安排将包括类似剂量与每年再接种安排。
给药
优选临床指示是用于在猪崽接种之后治疗、控制和预防大母猪和小母猪(生育之前)。在代表性实例(适用于大母猪和小母猪)中，将使用两份2ML剂量的疫苗，但实际剂量体积当然是如何配制疫苗的函数，其中实际给药量在0.1到5ML范围内，也考虑动物的尺寸。单次给药接种也是适合的。
第一次给药可早在育种前到生育前5周给予，并且第二次给药优选在生育前约1-3周给予。疫苗剂量优选提供对应于在约106与108之间，更优选在约107与107.5之间的TCID50(组织培养物感染性剂量)的病毒材料量，并且可进一步变化，如在所属领域中认识到。辅助剂给药可在任何后续生育之前两到四周进行。优选是肌肉内接种(所有剂量)，但一次或多次给药也可以按皮下方式进行。也优选是口服给药。接种也可以在原生动物和非原生动物中有效，如通过计划的或天然的感染实现。
在另一个优选实例中，大母猪或小母猪在生育前第5周并且接着在生育前第2周以肌肉或经口方式接种。在这些条件下，保护性免疫应答可以在经PEDV阴性接种的大母猪中显现，其中其显示具有中和活性的抗体(经由荧光病灶中和效价样品测量)，并且这些抗体被动地转移到其猪崽中。本发明的方案还适用于治疗血清反应已经呈阳性的大母猪和小母猪，以及猪崽和公猪。还可以进行辅助剂接种并且这些可以经由不同给药途径进行。尽管优选在任何后续生育之前再次接种母体猪，但本发明的疫苗组合物仍可以经由正在进行中的抗体的被动转移来提供保护，即使母体猪仅在生育之前接种。
应注意，猪崽接着可以早在生命中第1天经接种。举例来说，猪崽可在第1天经接种，在3周龄时进行或不进行辅助剂给药，尤其在母体猪(尽管在育种前经接种)在生育前未经接种时。如果母体猪由于天然或计划的感染而事先不是原生的，那么猪崽接种也可以是有效的。当母体既未预先暴露于病毒也未在生育前经接种时，猪崽的接种也可以是有效的。公猪(典型地保持用于育种目的)应每6个月接种一次。剂量变化完全在所属领域的实践范围内。应注意，本发明的疫苗对于用于怀孕动物(所有三月期)和新生猪中来说是安全的。本发明的疫苗被灭毒到即使最敏感的动物(再次包括新生猪)也可接受的安全性程度(即，无死亡率，仅短暂的轻度临床症状或对新生猪来说正常的症状)。当然，从保护猪群避免PEDV流行和持续性低程度PEDV出现来看，持续大母猪接种程序是极重要的。应了解，经PEDV MLV免疫的大母猪或小母猪将被动地转移免疫性给猪崽，包括PEDV特异性IgA，其将保护猪崽免患PEDV相关疾病和死亡。此外，通常，经PEDV MLV免疫的猪将在其大便中具有降低量和/或持续时间的PEDV或避免在其大便中排出PEDV，并且此外，经PEDV MLV免疫的猪将避免由PEDV引起的体重减轻和增重失败，并且此外，PEDV MLV将帮助停止或控制PEDV感染循环。
还应注意，用本发明的疫苗接种的动物对于人类使用也是立即安全的，无需任何显著屠宰保留，如21天或更短时间。
当在治疗学上提供时，当检测到实际感染迹象时，提供有效量的疫苗。用于治疗现有感染的适合的剂量包括每次给药约10与约106log10TCID50之间或更高的病毒。如果组合物的给药可由受体耐受，那么称为“药理学可接受”。如果给药量是生理学上显著的，那么这类组合物称为以“治疗学或预防有效量”给予。
至少一种本发明的疫苗或免疫原性组合物可以使用如本文中所描述的医药组合物通过任何可实现所需目的的手段给予。举例来说，这类组合物的给药途径可以是通过非经肠、经口、口鼻、鼻内、气管内、局部、皮下、肌肉内、经皮、皮内、腹膜内、眼内和静脉内给药。在本发明的一个实施例中，组合物是通过肌肉内给药。非经肠给药可以通过快速注射或通过随时间推移进行的逐步灌注来进行。任何适合的装置可用于给予组合物，包括针筒、滴管、无针注射装置、贴片等。所选择的供使用的途径和装置将取决于佐剂的组成、抗原和个体，并且这些是所属领域的技术人员众所周知的。优选是经口或皮下给药。口服给药可以直接、经由水或经由进食(固体或液体饲料)进行。当以液体形式提供时，疫苗可以冻干和复原，以浆料形式提供，以用于直接添加到饲料中(混合或顶肥)或以其它方式添加到水或液体饲料中。
产生适用于大规模病毒制备的猴肾细胞Vero细胞
本发明的病毒宜在批准用于疫苗制备的Vero细胞储备液中生长。为了产生安全和被认可的细胞储备液，一小瓶Vero细胞经历额外传代。细胞在PMEM中与小麦一起传代四次以产生主要细胞储备液(MCS)批料“1834430”。根据PGM生物质检(PGM-Biological QualityControl)；Lincoln,NE中的9CFR和EP要求测试MCS。所测试的MCS在无菌性方面令人满意、不含霉浆菌和额外的试剂。因此，认为PF-Vero MCS批料“1834430”符合提交到兽医生物制剂实验室中心(Center for Veterinary Biologics Laboratories；CVB-L)以用于验证测试的条件。
种子来源和船代历史如下。预先冷冻全球Vero细胞的前主要细胞储备液。对于制备细胞储备液，细胞在含有1％牛血清(项目编号00-0710-00，BSE适应性)和3mM L-谷氨酰胺的PMEM(Lincoln项目编号00-0779-00)中生长。其来源于Vero WCS后代编号136，批号071700MCS+3，28-Jul-00。新的前主要细胞储备液在第166代时冷冻，其是来自原始全球Vero主要细胞储备液的MCS+33。MCS“1833440”是由鉴别为Vero KZO preMaster,Lot的前主要储备液产生。所有培养物在PMEM中与小麦、1.0％L-谷氨酰胺和1.0％小牛血清一起生长。细胞在2008年8月14日在150cm2T型烧瓶中种植(第167代)。烧瓶在5.0％CO2中、在361℃下培育7天，接着扩增(第168代)。在4天后烧瓶达到100％汇合之后，培养物在850cm2滚筒瓶中传代(第169代)。滚筒在361℃下，在0.125-0.250rpm下，在不含CO2的情况下培育。滚筒的最终传代(第170代)在4天后完成。通过在2008年9月2日向浓缩的细胞悬浮液中添加10.0％小牛血清和10.0％二甲亚砜(DMSO)来实现低温保存。小瓶标记为第170代。将总共231个含有4.2ml的容器置放于受控速率冷冻器中，接着转移到液氮箱中用于在气相下长期储存。在不使用抗生素的情况下产生MCS。MCS制剂中使用的所有试剂皆来源于Pfizer GlobalManufacturing，其用于国内和全球市场的核准的抗原制备。由Pfizer's Master SeedFacility,Lincoln,Nebraska生产MCS。
无菌性测试如下。根据9CFR(026-ST0)和EP 2.6.1从2008年9月29日到2008年10月13日测试主要细胞储备液。发现MCS不含细菌和真菌污染物。
如下实现霉浆菌测试和额外的测试。根据9CFR(028-PU0)和EP 2.6.7测试MCS。发现MCS不含任何霉浆菌污染物。使用NL-BT-2(牛)、Vero、NL-ED-5(马)、NL-ST-1(猪)、NL-DK(犬)、NL-FK(猫)细胞根据9CFR113.52完成额外的测试。MCS对于MGG、CPE和HAd呈阴性，并且通过FA对于BVD、BRSV、BPV、BAV-1、BAV-5、狂犬病、Reo、BTV、ERV、马动脉炎、PPV、TGE、PAV、HEV、CD、CPV、FPL和FIP测试呈阴性。通过ELISA关于FIV测试MCS并且发现是令人满意的。
根据5.2.4(52-2002)进行EP额外的测试。使用牛NL-BT-2和EBK(初代)、Vero、NL-ED-5(马)、NL-ST-1(猪)、MARC MA 104、NL-DK(犬)、NL-FK(猫)细胞的额外的测试对MGG、CPE、HAd呈阴性，并且通过FA对BVD、BPV、BAV-1、BAV-5、牛冠状病毒、牛轮状病毒、BHV-3、PI3、IBR、BRSV和BEV-1、Reo、BTV、ERV、马动脉炎、PPV、PRV、TGE、HEV、PAV、P.rota A1、rotaA2、PRRSV、CD、CPI、CAV-2、麻疹、C.rota、狂犬病、CCV、FP、FCV、FVR、FIP和FeLV测试呈阴性。
本发明的多肽和聚核苷酸
本发明的代表性实施例包括经分离的聚核苷酸序列，其包含选自以下组成的组的聚核苷酸：(a)(SEQ ID NO:1、2、3、8、15、35、36、37、39和/或59-77)；或其片段，其编码ORF1a/1b多蛋白、PEDV刺突蛋白(优选结构域1)、ORF3蛋白质、包膜蛋白、膜蛋白、核衣壳蛋白或所述蛋白质的片段；(b)(a)中任何序列的补体；(c)聚核苷酸，其与(a)或(b)的序列在严格条件下杂交，所述严格条件定义为与过滤器结合的DNA在0.5M NaHPO4、7％SDS、1mMEDTA中，在65℃下杂交，并且在0.1×SSC/0.1％SDS中在68℃下洗涤；(d)与(a)或(b)的聚核苷酸至少70％一致的聚核苷酸；(e)与(a)或(b)的聚核苷酸至少80％一致的聚核苷酸；(f)与(a)或(b)的聚核苷酸至少90％一致的聚核苷酸；以及(g)与(a)或(b)的聚核苷酸至少95％一致的聚核苷酸。在优选实施例中，聚核苷酸包括第二异源聚核苷酸序列。
本发明还提供由SEQ ID NO:1、2、3、8、15、35、36、37、39、59-78、其组合的基因型的开放阅读框架中的任一个编码的多肽，或与其、其结构域或其片段至少90％一致的多肽，包括通过保守性取代置换其它的以其它方式一致的氨基酸的方案。
本发明还提供由本发明的变异型PEDV菌株的开放阅读框架中的任一个编码的多肽，优选刺突蛋白，或更优选刺突蛋白S1结构域，或与其或其片段至少90％一致的多肽，包括通过保守性取代置换其它的以其它方式一致的氨基酸的方案。
在优选实施例中，多肽从本发明的变异型PEDV菌株的刺突蛋白的S1区域的最先的1170个核苷酸被表达。
在另一优选实施例中，还提供基于PEDV多肽的疫苗，其中抗原由以下定义：由SEQID NO:1、2、3、8、15、35、36、37、39、59-77的开放阅读框架编码的蛋白质、其组合或其免疫原性片段。其它实施例包括其中抗原满足以下条件的氨基酸序列：由SEQ ID NO:23-34、40-58的核苷酸编码。
其它遗传操作
由本发明提供的聚核苷酸和氨基酸序列信息还使得病毒基因和其编码的基因产物的结构和功能的***性分析成为可能。本发明的编码病毒基因产物的聚核苷酸的知识还使得可获得反义聚核苷酸，其识别编码本发明的多肽的聚核苷酸或其片段并且与其杂交。在这方面，全长和片段反义聚核苷酸是适用的。所属领域的工作人员将了解，本发明的片段反义分子包括(i)特异性识别特异性RNA并且与其杂交的片段反义分子(如通过编码本发明的病毒多肽的DNA的序列对比测定)，以及(ii)识别编码经编码的蛋白质的变异体的RNA并且与其杂交的片段反义分子。与编码其它PEDV肽的RNA/DNA杂交的反义聚核苷酸还可以通过序列比较来鉴别，以鉴别特征或分子家族的标志性序列，进一步用于研究PEDV多肽中的抗原结构域，并且还可以用于区分宿主动物中由环病毒科(Circoviridae)的远端相关非PEDV成员引起的感染。
关于本发明的构筑体的酵母和大肠杆菌中增强的表达的有效密码子最佳化的引导通常是所属领域的技术人员已知的。
抗体
本发明还涵盖抗PEDV抗体(例如单克隆和多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、人类化、人类、猪和CDR移植抗体)，包括化合物，其包括特异性识别本发明的PEDV多肽的CDR序列。术语“对……具有特异性”指示本发明的抗体的可变区排他性地识别和结合PEDV多肽(即，能够区分单个PEDV多肽与在多肽家族中发现的相关多肽，与序列一致性、同源性或类似性无关)，并且准许(任选地)通过与抗体的可变区外部，并且具体来说，Ab分子的恒定区中的序列的相互作用来与其它蛋白质(例如金黄色葡萄球菌蛋白质A(S.aureus proteinA)或ELISA技术中的其它抗体)相互作用。用于测定本发明的抗体的结合特异性的筛检分析法在所属领域中是众所周知的并且常规地实践。关于这类分析法的综合讨论，参见Harlow等人(编),《抗体：实验室手册(Antibodies A Laboratory Manual)》；Cold Spring HarborLaboratory；Cold Spring Harbor,N.Y.(1988),第6章。还涵盖识别和结合本发明的PEDV多肽的片段的抗体，限制条件是如上文所定义，抗体首先并且最先对衍生所述片段的本发明的PEDV多肽具有特异性。
出于清楚的目的，“抗体”是指由于对特异性抗原的免疫应答而可结合于所述抗原的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白是由具有“恒定”区和“可变”区的“轻”和“重”多肽链组成的血清蛋白，并且基于恒定区的组成而分类(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。抗体可以多种形式存在，包括例如Fv、Fab'、F(ab')2以及单链，并且包括合成多肽，其含有所有或一部分一种或多种抗体单链多肽序列。
诊断试剂盒
本发明还提供诊断试剂盒。试剂盒可对区分由PEDV病毒的野生株自然感染的猪动物与用本文中所描述的PEDV疫苗中的任一种接种的猪动物有价值。试剂盒还可以因为可在出现临床症状之前检测到被PEDV病毒的野生株潜在感染的动物并且将其从畜群中移出，或保持与未经处理或经接种的动物隔离而具有价值。试剂盒包括用于分析来自猪科动物的样品中是否存在针对指定PEDV病毒的具体组分的抗体的试剂。本发明的诊断试剂盒可包括来自本发明的变异型PEDV菌株(其存在于野生株而非相关疫苗中，或反之亦然)的肽作为组分，并且可通过广泛氨基酸测序使得选择这类适合的肽结构域成为可能。如所属领域中已知，本发明的试剂盒可替代性包括由融合蛋白提供的肽作为组分。出于本发明的目的，术语“融合肽”或“融合蛋白”意指由至少一部分PEDV病毒蛋白质，优选ORF1，或ORF3和异源肽或蛋白质组成的单个多肽链。
以下实例意图说明上述本发明并且不应被理解为缩小其范围。所属领域的技术人员将容易地认识到实例提出许多其它可以实践本发明的方式。应理解，可进行许多变化和改变同时保持在本发明的范围内。
本文中所公开的所有发明是在发明人的各别受让人、Iowa State University和Zoetis Services LLC之间存在的联合研究协议(Joint Research Agreement)(如由35USC100(h)，37CFR 1.9(e)定义)下进行，并且本发明因此符合由37CFR 1.104(C)(4)(5)赋予的检查保护的条件。
实例
实例1
进行PEDV S1(刺突蛋白基因的第一个2.2kb部分)测序以帮助测定美国猪中PEDV的遗传相关性和分子流行病学。在2014年1月，在ISU VDL对15个PEDV病例进行测序。其中，来自10个病例(ISU病例6-15)的PEDV S1序列彼此类似并且与2013年在美国猪中发现的PEDV菌株类似(99.1-100％核苷酸一致性)。在不同对比中，来自其它5个病例(ISU病例1-5)的PEDV S1序列仅与先前在2013年在美国猪中发现的PEDV菌株具有93.9-94.6％核苷酸一致性。
然而，基于S1序列，这5个PEDV病例彼此共有99.6-100％核苷酸一致性。基于S1序列的***发生分析表明前述10个PEDV病例(ISU 6-15)与从2013年4月在美国发现的PEDV菌株属于同一丛集。然而，前述5个PEDV病例(ISU病例1-5)与先前在美国猪中发现的PEDV菌株(图1)显然属于不同丛集。序列比对表明这5个PEDV病例的S1序列与先前在美国发现的PEDV病毒相比具有一些缺失和***。
已测定这种新病毒分离物的S1基因并且在本文中报道为SEQ ID NO:1。基于当前可用资料，这种菌株似乎不大可能是由先前在美国猪中发现的PEDV进化的突变体。ISU VDL提供的PEDV实时RT-PCR靶向核衣壳(N)基因。已知N-基因是PEDV基因体的保守性部分。迄今为止，ISU VDL进行的PEDV N-基因实时RT-PCR似乎可容易地检测这些新型PEDV。已经测定新型PEDV的全长N基因序列并且与先前在美国发现的PEDV类似。
图2显示基于S1部分序列和完全基因组序列的***发生树。参见附件。可发现，除在美国的猪中以外，已经在韩国、加拿大和墨西哥检测到美国原型样菌株；已经在韩国、墨西哥和德国检测到美国变异体-INDEL样菌株。
实例2
已经在美国发现至少两种遗传学上不同的猪流行性腹泻病毒(PEDV)菌株：美国PEDV原型和S-INDEL-变异体菌株。本研究的目标在于比较在实验感染下，常规新生猪崽中美国PEDV原型和S-INDEL-变异体菌株的致病性差异。将五十只PEDV阴性、5日龄猪分成5个组，每组10只猪，并且分别用三种美国PEDV原型分离物(IN19338/2013-P7、NC35140/2013-P7和NC49469/2013-P7)、S-INDEL-变异体分离物(2014020697-P7)和病毒阴性培养基以口胃方式接种，其中病毒效价是104TCID50/ml，每只猪10ml。在这一研究中测试的所有三种PEDV原型分离物(与其***发生进化枝无关)在5日龄猪中具有类似的致病性并且引起严重的肠道疾病，如由临床症状、粪便病毒排出以及肉眼损害和组织病理学病灶证明。与用三种美国PEDV原型分离物接种的猪相比，用S-INDEL-变异体分离物接种的猪具有显著减弱的临床症状、大便中的病毒排出、小肠、盲肠和结肠中的肉眼损害、小肠中的组织病理学病灶以及回肠中的免疫组织化学染色。美国PEDV原型和S-INDEL-变异体菌株在经接种的猪中引起类似程度的病毒血症。测定PEDV原型和S-INDEL-变异体菌株的完全基因组序列，但仍需使用反向遗传方法阐明这些PEDV菌株之间的毒性差异的分子基础。本发明研究提供对可促进PEDV毒性和疫苗灭毒的分子机制的理解的坚实基础。
结果
美国PEDV的分离和序列比较
在Vero细胞中分离三种美国PEDV原型分离物USA/NC35140/2013、USA/IA49379/2013和USA/NC49469/2013。观察到包括合胞体形成和细胞脱落的典型PEDV细胞变性作用，并且通过免疫荧光染色证实病毒生长。所有分离物在Vero细胞中有效生长并且对于最先的十代，感染性效价在103-106TCID50/ml范围内。
测定三种美国PEDV原型分离物USA/NC35140/2013-P7、USA/IA49379/2013-P7和USA/NC49469/2013-P7的完全基因组序列，并且与先前描述的美国PEDV原型分离物USA/IN19338/2013和美国PEDVS-INDEL-变异体分离物USA/IL20697/2014的完全基因组序列进行比较，结果概述于表3中。病毒蛋白质的PEDV基因体组织和假设功能的示意图描述于图12中。原型分离物USA/IN19338/2013-P7、USA/NC35140/2013-P7、USA/IA49379/2013-P7和USA/NC49469/2013-P7皆具有长度是28,038个核苷酸的基因体，并且在完全基因组层面上彼此具有99.75-99.91％核苷酸(nt)一致性(26-69个nt差异)。这些原型分离物的刺突蛋白基因的长度皆是4,161个核苷酸，并且彼此具有99.54-99.88％nt一致性(5-19个nt差异)。S-INDEL-变异体分离物2014020697-P7具有长度是28,029个核苷酸的基因体，并且在完全基因组层面上与在这一研究中评估的四种原型分离物具有99.08-99.22％nt一致性(220-259个nt差异)。其中，约64-96个nt差异位于ORF1a/1b区域，尤其nsp12和nsp16区域中；然而，在氨基酸层面上，nsp12和nsp16上的大部分这些nt变化是同义(沉默)变化(表3)。美国PEDV原型和S-INDEL-变异体分离物之间的刺突蛋白差异位于刺突蛋白基因(96.25-96.37％nt一致性；151-156个nt差异)，尤其S1部分(93.14-93.32％nt一致性；148-152个nt差异)中；S1部分处的核苷酸变化引起所推论的氨基酸的变化(表3)。与原型分离物相比，变异体分离物2014020697-P7的S基因具有三个特征缺失(位置167处G的1-nt缺失、位置176-186处AGGGTGTCAAT的11-nt缺失和位置416-418处ATA的3-nt缺失)和一个***(位置474与475之间CAGGAT的6-nt***)。
在这一研究中描述的PEDV分离物的***发生分析和45个PEDV参考序列提供于图6中。在基于完全基因组序列的相邻接合树图6A中，美国PEDV原型样菌株属于同一丛集，其可进一步分成进化枝1和进化枝2；然而，美国PEDV S-INDEL-变异体样菌株属于单独丛集。在基于完全基因组序列的最大似然树图6B中，美国PEDV原型样菌株也属于进化枝1和进化枝2的丛集；然而，S INDEL-变异体样菌株形成进化枝2内的单独子谱系。相比之下，基于S1序列的相邻接合树图6C和最大似然树图6D中的***发生丛集是类似的。在图6C和图6D中，美国PEDV原型样菌株属于同一丛集，其可进一步分成进化枝1和进化枝2，与基于完全基因组序列的相邻接合树图6A类似；美国PEDV S-INDEL-变异体样菌株形成单独的分支，其与一些经典的PEDV分离物(如欧洲/CV777、韩国/SM98和中国/SD-M，其在S基因中具有与美国PEDV S-INDEL-变异体样菌株相同的***和缺失模式)更加紧密相关。
与基于完全基因组的树图6A、6B或基于S1的树图6C、6D无关，原型分离物IN19338和IA49379属于进化枝1并且分离物NC35140属于进化枝2。然而，原型分离物NC49469在基于完全基因组的树图6A、6B中属于进化枝1，但在基于S1的树图6C、6D中属于进化枝2。选择三种原型分离物USA/IN19338/2013-P7(SEQ ID NO:59)、USA/NC35140/2013-P7(SEQ ID NO:60)和USA/NC49469/2013-P7(SEQ ID NO:61)以及一种S-INDEL-变异体分离物2014020697至P7(SEQ ID NO:62)以比较其在猪中的发病机理(表4)。
表3.美国PEDV原型和S-INDEL-变异体分离物之间的核苷酸和氨基酸差异
*核苷酸是根据美国PEDV原型分离物USA/IN19338/2013(GenBank寄存编号KF650371)的序列编号。
在各基因或蛋白质层面上计算核苷酸(nt)和氨基酸(aa)差异百分比。N/A：不适用。
表4.用多种PEDV分离物接种的5日龄的猪的实验设计
临床评估
G1(USA/IN19338/2013-P7)、G2(USA/NC35140/2013-P7)和G3(USA/NC49469/2013-P7)中的所有猪从1DPI开始显示软性腹泻到水泻，并且持续到6或7DPI。相比之下，在G4(IL20697)中，仅1只猪在1DPI时具有轻度腹泻和软粪便。平均腹泻分数概述于图7A中。总的来说，当分析0-7DPI腹泻分数时，G1(P＝0.001)和G3(P<0.0001)中的猪与G2中的猪相比具有显著更高的平均腹泻分数，如以下‘材料和方法’章节中所描述。用原型PEDV分离物接种的G1-G3中的猪与用PEDV变异体分离物接种的G4(P<0.0001)和G5(阴性对照，P<0.0001)相比整体具有显著更高的平均腹泻分数。G4与G5之间不存在平均腹泻分数的显著差异(P＝1)。
在整个研究期间，未观察到任何猪呕吐。在用原型分离物接种的G1-G3中：1)几乎所有的猪在研究周期期间丧失其食欲并且被给予管灌食物；2)在所有的猪中观察到严重的脱水、毛发粗燥、扁平或薄侧腹，其中在约4DPI时出现最严重的身体病状；3)从1DPI到研究结束观察到多种程度的嗜睡，包括头部向下和伏卧。相比之下，在用变异体分离物接种的G4中：1)所有猪具有正常食欲；2)未观察到脱水或嗜睡；3)90％的猪在1DPI或2DPI时具有轻度扁平侧腹，但在4DPI之后恢复正常。所有G5猪在研究周期期间有活力而无腹泻、脱水、嗜睡或厌食。
从(-1)到3DPI，PEDV接种的猪(G1-G4)与G5中的猪(阴性对照)相比具有显著较低的平均日增重(ADG，P≤0.0001)，但G1-G4中不存在ADG的显著差异(在0.089-1范围内)(图7B)。从(-1)到7DPI，G1-G3(原型分离物)与G4(变异体分离物)相比具有显著较低的ADG(P值在0.01-0.037范围内)，但与G5(阴性对照)相比，G1、G2、G3或G4中不存在ADG的显著差异(P值在0.078-0.847范围内)(图7B)。
病毒排出和分布
在1DPI到研究结束，在来自G1-G3(原型分离物)中的所有猪的直肠拭子样品中检测到PEDV RNA。在G4(变异体分离物)中，分别在1、2、3、4、5、6和7DPI时在来自5/10、8/10、10/10、5/5、5/5、3/5和2/5的猪的直肠拭子中检测到PEDV RNA。直肠拭子中病毒排出的每毫升平均基因组复本概述于图7C中。G1和G2中的猪从1-7DPI具有类似的粪便病毒排出程度(P＝0.601)，其中数量在107.2-9.0个基因组复本/毫升范围内，对应于Ct值16-22。G3中的猪在1-2DPI时具有最高粪便病毒排出程度(约109个基因组复本/毫升和Ct 16)，并且粪便病毒排出在7DPI时逐渐下降到约105.4个基因组复本/毫升，对应于Ct值28。相比之下，G4中的猪在1DPI时具有约102.3个基因组复本/毫升(Ct 31.8)粪便病毒排出；粪便病毒排出逐渐增加并且在5DPI时达到峰值(105.4个基因组复本/毫升和Ct 28.8)，并且接着在7DPI时下降到约101.3个基因组复本/毫升(Ct 36.3)。
统计分析指示G1-G3(原型分离物)与G4(变异体分离物)相比在直肠拭子中具有显著更大量的病毒RNA排出(P<0.0001)。
在来自在3DPI时尸检的G1-G4中的所有猪的血清样品中检测到PEDVRNA，其中平均Ct值是33.2(G1)、30.5(G2)、31.9(G3)和28.4(G4)。在3DPI时，G1-G4的血清中平均PEDV基因组复本之间不存在显著差异[P值在0.077-0.646范围内，图7D]。在7DPI时，在来自G1-G4中的5只猪中的3-4只猪的血清样品中检测到PEDV RNA，其中平均Ct值(仅PCR阳性猪)是33.5(G1)、34.2(G2)、37.4(G3)和35.8(G4)。在7DPI时，与G1-G3(原型分离物)相比，G4(变异体分离物)的血清中PEDV的平均基因组复本不存在显著差异(P值在0.050-0.717范围内)，图7D。
组织中的病毒分布概述于表5中。在3DPI时，无论G1、G2、G3或G4，回肠、盲肠、结肠和肠系膜***中的平均PEDV RNA浓度高于相同接种组内其它组织中的浓度。当在3DPI时跨越四个接种组比较各组织类型中的病毒RNA浓度时，G4(变异体分离物)的盲肠和结肠中的病毒RNA浓度整体上显著低于G1-G3(原型分离物)的盲肠和结肠；然而，G4的其它组织中的病毒RNA浓度与G1-G3的相应组织类似；G1-G3中相同类型的组织具有类似的病毒RNA含量。除了盲肠和结肠中的病毒基因组复本显著低于G4中回肠和肠系膜***中的基因组复本以外，7DPI时的资料整体上支持与3DPI时类似的结论。
在整个研究周期期间，通过PEDV实时RT-PCR测定所有来自G5(阴性对照)的直肠拭子、血清和组织样本呈阴性。
表5.在3DPI和7DPI时，来自用四种PEDV接种的猪的多种组织中PEDV RNA的PCR检测。
缩写：DPI，接种后天数；MLN，肠系膜***；PCR聚合酶链反应；Ct，循环临界值。
*腿后肌。+平均Ct意指PCR阳性猪(PCR Ct<45的猪)的Ct值。
基因组复本/毫升是所有猪(PCR阳性和阴性猪)的以每毫升计的基因组复本的几何平均值。关于G1-G4组，对相同组织类型进行统计分析并且不同字母指示显著差异。
肉眼病理学
在3DPI时，在大部分用PEDV原型分离物(G1-G3)接种的猪中的小肠、盲肠和结肠组织中观察到薄和透明的肠壁，有时被气体和/或淡黄色流体扩张。此外，G1-G3中几乎所有的猪在小肠、盲肠和结肠中含有水样内含物。相比之下，在3/5的用PEDV变异体分离物(G4)接种的猪的小肠中观察到仅轻度的薄肠壁；未在G4中的猪的盲肠或结肠中观察到显而易见的肉眼损害。并且，在G4中，仅1/5的猪在小肠、盲肠和结肠中具有水样内含物；另两只猪在盲肠中具有半水样内含物。以统计方式，与G4(变异体分离物)和G5(阴性对照)相比，所有G1-G3(原型分离物)具有显著更高的小肠、盲肠和结肠内含物分数(P值在<0.0001到0.0127范围内)，图8A。关于小肠、盲肠和结肠内含物分数，未在G1-G3中观察到显著差异(P值在0.3722-1范围内)，图8A。对于G4，仅盲肠内含物分数显著高于G5(P＝0.003)，但不小肠或结肠内含物分数不是[P值在0.5259-1范围内；图8A]。与变异体分离物接种的组(G4)和阴性对照组(G5)相比，所有原型分离物接种的组(G1-G3)在小肠、盲肠和结肠上具有显著更高的组织病灶分数(P值在0.0012-0.049范围内)，图8B。在G1-G3(P值在0.1585-1范围内)中或G4与G5[P值在0.4766-1范围内；图8B]之间未观察到小肠、盲肠和结肠病灶分数的显著差异。
在7DPI时，G1-G3中的大部分猪仍具有薄壁和/或气体膨胀的小肠，但G1-G3中仅约50％的猪具有薄壁和/或气体膨胀的盲肠和结肠。G1和G2中所有的猪以及G3中4/5的猪具有水样小肠内含物。G1-G3中约60-100％的猪在盲肠和结肠中具有半水样或水样内含物。在G4中，仅1/5的猪具有薄壁小肠并且没有猪在盲肠和结肠中具有肉眼损害。在G4中，5/5、1/5和0/5的猪分别在小肠、盲肠和结肠中具有半水样或水样内含物。在G5中，1/5的猪具有薄壁小肠、盲肠和结肠；3/5的猪在小肠、盲肠和结肠中具有半水样或水样内含物。在一些组之间观察到组织内含物分数和组织病灶分数的显著差异(图8)。
证实在3DPI和7DPI时收集的直肠拭子对PDCoV、TGEV和猪轮状病毒呈阴性(组A、B和C)并且对溶血性大肠杆菌和沙门氏菌属(Salmonella spp.)呈阴性。
组织病理学
在3DPI或7DPI时，未在所有猪崽(G1-G5)的胃、盲肠、结肠、扁桃体、肠系膜***、心脏、肺、肝、脾和肾脏切片中观察到显著的微观病灶。
在3DPI和7DPI时尸检的G1-G3(原型分离物)中所有的猪的小肠切片(十二指肠、空肠和回肠)中观察到符合病毒性肠炎的严重病灶(例如绒毛上皮细胞膨胀、绒毛萎缩、固有层崩溃等)。在3DPI时尸检的G4(变异体分离物)中猪的小肠切片中观察到符合病毒性肠炎的轻度微观病灶；然而，在7DPI时尸检的G4中猪的小肠切片中的微观病灶不显著。在3DPI或7DPI时，G5(阴性对照)中猪的小肠切片中的微观病灶不显著。来自G1-G5的在3DPI时尸检的猪的H&E染色的回肠切片的代表性图像显示于图9A-9E中。
关于5个接种组的小肠切片，测量和比较绒毛高度、隐窝深度以及绒毛高度与隐窝深度比率。在3DPI时，与G4(变异体分离物)和G5(阴性对照)中的猪相比，G1-G3(原型分离物)中的猪在十二指肠、近端空肠、中间空肠、远端空肠和回肠中具有显著降低的平均绒毛高度、增加的平均隐窝深度和更低的平均绒毛/隐窝比率，但具有一些例外(图10)；例外包括G2和G4的十二指肠中的绒毛高度和绒毛/隐窝比率以及G1和G4的中间空肠中的隐窝深度。在3DPI时，在用原型分离物接种的三个组G1-G3中，小肠切片的平均绒毛高度、隐窝深度和绒毛/隐窝比率整体上类似(图10)。在3DPI时，G4(变异体分离物)欲G5(阴性对照)之间所有小肠切片的平均隐窝深度不存在显著差异；然而，在3DPI时，G4中的猪与G5中的猪相比在十二指肠、中间和远端空肠以及回肠中具有显著降低的平均绒毛高度和更低的平均绒毛/隐窝比率(图10)。
在7DPI时，在三个组G1-G3中，小肠切片的平均绒毛高度和绒毛/隐窝比率整体上类似，图11A-11D。在7DPI时，G1-G3中的猪与G4和G5中的猪相比在小肠切片中整体上具有显著降低的平均绒毛高度和更低的平均绒毛/隐窝比率(图11A、11C)。有趣的是，在7DPI时，G4(变异体分离物)与G5(阴性对照)之间不存在平均绒毛高度的显著差异，或G4中的平均绒毛高度显著高于G5(图11A)。在7DPI时，G4与G5之间不存在近端、中间和远端空肠以及回肠中平均绒毛/隐窝比率的显著差异，但G4与G5之间存在十二指肠中平均绒毛/隐窝比率的显著差异(图10C)。在7DPI时的平均隐窝深度的对比呈现于图11B中。在原型分离物接种的组G2和G3之间，所有小肠切片中的平均隐窝深度类似；G2和G3与阴性对照组G5相比皆具有显著更长的隐窝深度。另一个原型分离物接种的组G1具有介于阴性对照组G5与原型分离物接种的组G2和G3之间的平均隐窝深度值。与阴性对照组G5相比，变异体分离物接种的组G4在十二指肠、近端和远端空肠中具有显著增加的平均隐窝深度，而G4在大部分小肠切片中具有与G1、G2和G3类似的平均隐窝深度。
免疫组织化学(IHC)
在3DPI时，对所有5个接种组的回肠、盲肠和结肠的连续切片进行PEDV特异性IHC染色。G5(阴性对照)中的5只猪在回肠、盲肠或结肠中皆不呈IHC阳性。G1-G4中的每一个中的全部5只猪在回肠中呈IHC阳性，其中平均IHC分数是3.9(G1)、3.7(G2)、3.8(G3)和2.5(G4)。G1-G3的回肠的平均IHC分数类似，但显著高于G4(图10D)。关于盲肠的IHC染色，5/5(G1)、4/5(G2)、5/5(G3)和3/5(G4)的猪呈阳性，G1-G4中不存在平均IHC分数的显著差异(图10D)。对于结肠，5/5(G1)、4/5(G2)、4/5(G3)和2/5(G4)的猪IHC染色呈阳性，但G1-G4中不存在平均IHC分数的显著差异(图10D)。代表性PEDV IHC染色图像显示于图9F-9T中。
在7DPI时，仅对回肠的连续切片进行PEDV IHC染色。在G1和G2中观察到轻度/有限的IHC染色，但未在G3、G4和G5中观察到染色(图11D)。
讨论
序列分析表明至少两种遗传学上不同的PEDV菌株已经在美国循环(Vlasova等人,2014；Wang等人,2014)，并且其被称为美国PEDV原型菌株和美国PEDV S-INDEL-变异体菌株。美国原型PEDV可以***发生学方式进一步分成进化枝1和进化枝2。在基于完全基因组序列的***发生分析中，美国S-INDEL-变异体样PEDV在相邻接合树中单独地从进化枝1和进化枝2集群，但其在最大似然树中的进化枝2内形成单独子谱系(图6A、6B)。这表明***发生分析工具和树构筑方法可在分析结果中产生一些差异；因此，应通过明确指示用于***发生分析的工具和方法来小心地得出结论。在美国原型PEDV中，一些始终属于进化枝1或进化枝2而与基于完全基因组的树或基于S1的树无关；然而，一些(例如NC49469和Minnesota62)在基于完全基因组的树中属于进化枝1，但在基于S1的树中属于进化枝2(图6)。这可能是因为NC49469和Minnesota62PEDV的S1序列与进化枝2更紧密相关，但其余基因组序列与进化枝1PEDV更紧密相关。我们的团队已经在细胞培养物中分离多种属于上述各类别的PEDV，是的我们可以比较多种美国原型和S-INDEL-变异体PEDV的发病机理。
研究表明新生猪崽与断奶猪相比对PEDV感染更加敏感，并且与断奶猪相比，PEDV感染在新生猪崽中更大的疾病严重程度(Jung等人,2015a；Thomas等人,2015)。因此，在这一研究中，选择敏感性、5日龄新生猪崽模型用于发病机理比较。在三种美国PEDV原型分离物(USA/IN19338/2013、USA/NC35140/2013和USA/NC49469/2013)中，由USA/NC35140/2013-P7分离物产生的平均腹泻分数低于USA/IN19338/2013-P7和USA/NC49469/2013-P7分离物；然而，三种原型分离物具有类似的病毒排出、肉眼损害、组织病理学病灶和IHC染色。整体上，我们得出在这一研究中评估的三种美国PEDV原型分离物在新生猪崽中具有类似致病性而与其***发生进化枝无关的结论。相比之下，当前研究中的资料明确表明与三种美国PEDV原型分离物USA/IN19338/2013-P7、USA/NC35140/2013-P7和USA/NC49469/2013-P7相比，美国PEDV S-INDEL-变异体分离物2014020697-P7具有显著减弱的临床症状、粪便中的病毒排出、小肠盲肠和结肠中的肉眼损害、小肠中的组织病理学病灶以及回肠中的IHC分数。其它组的当前实验研究也表明在3-4日龄猪或1周龄的猪中，S-INDEL PEDV与美国原型菌株相比整体上具有更低的致病性(Lin等人,2015a；Yamamoto等人,2015)。然而，在Lin等人的研究中，其观察到用美国S-INDEL Iowa106菌株接种的猪崽中的三个同窝仔具有零死亡率，但用相同病毒株接种的猪崽中的一个同窝仔具有75％死亡率(Lin等人,2015a)。其假设大母猪的健康状况可对初乳/乳汁产生具有直接影响，并且因此影响其猪崽的感染结果(Lin等人,2015a)。在农场和国家中，在牧场观察到的S-INDEL PEDV的毒性具有变化。在美国，S-INDEL变异体菌株OH851感染在农场的哺乳猪崽中仅引起最小的临床症状或无临床症状(Wang等人,2014)。在德国，两个母猪农场被在完全基因组层面上与美国S-INDEL变异体OH851具有99.4％核苷酸一致性的S-INDEL PEDV感染；然而，两个农场之间的哺乳猪崽中临床症状的严重度和死亡率显著不同(Stadler等人,2015)。尚未明确鉴别对矛盾结果产生贡献的因素。但S-INDEL PEDV中的病毒来源(野生型或适应细胞培养物的病毒)、接种/感染剂量、动物/环境条件以及核苷酸/氨基酸变化可有助于在多种实验研究和牧场爆发中观察到的矛盾。此外，PEDV致病性可具有年龄依赖性。批准断奶猪、育肥猪、小母猪和大母猪中S-INDEL PEDV变异体的致病性的进一步研究。
研究表明在由美国PEDV原型分离物引起的感染的急性期中可存在病毒血症(Jung等人,2014；Madson等人,2016)。在本发明研究中，我们还在血清样品中检测到PEDV RNA。此外，PEDV变异体分离物和三种原型分离物在本研究的条件下具有类似的病毒血症程度。PEDV是肠病原体冠状病毒，其感染绒毛上皮细胞，引起绒毛萎缩和吸收不良性腹泻。一定量的PEDV可通过尚未完全理解的机制被吸收到血流中。但相信PEDV不会在血液中主动复制，并且病毒血症程度可能未必与毒性/致病性相关。在当前研究中，在来自用原型或S-INDEL-变异体PEDV接种的猪的小肠、盲肠、结肠和肠系膜***中检测到大量PEDV RNA，而在非肠道组织(扁桃体、心脏、肺、肝、脾、肾脏和肌肉)中检测到少量PEDV RNA。初步研究表明可在小肠、肠系膜***以及一些结肠和脾组织中检测到PEDV病毒抗原(美国原型分离物)(Jung等人,2015b；Jung等人,2014；Madson等人,2016)，但其它非肠道组织(如肺、心脏、肾脏和肝)皆对PEDV抗原呈阴性(Madson等人,2016)。因此，检测到PEDV RNA未必意味着PEDV在所有这些非肠道组织中复制。考虑到在收集各器官之前血液未流尽，不能排除这些组织中的病毒是来自血液的可能性。
在当前研究中，仅对经接种的猪的回肠、盲肠和结肠进行PEDV IHC染色。在用PEDV(三种原型分离物和一种变异体分离物)接种的四个组中，在3DPI时，在100％的回肠、60-100％的盲肠和40-100％的结肠中观察到PEDV IHC染色。与经原型分离物接种的猪相比，经变异体分离物接种的猪中的回肠中的平均IHC分数显著较低，符合对小肠的肉眼病理学和组织病理学病灶的观察结果。尽管与用三种原型分离物接种的猪相比，用变异体分离物接种的猪中的盲肠和结肠中的平均IHC分数在数值上较低，但差异并不显著。然而，与经原型分离物接种的猪相比，经PEDV变异体分离物接种的猪在盲肠和结肠中具有较少的肉眼变化。因此，可能需要进一步阐明盲肠和结肠变化与PEDV毒性/致病性的相关性。
所有四个用PEDV(三种原型分离物和一种变异体分离物)接种的组G1-G4在3DPI时与阴性对照组G5相比具有显著缩短的绒毛高度，并且G1-G3(原型分离物)与G4(变异体分离物)相比具有显著缩短的绒毛高度。这些结果表明美国原型和变异体PEDV分离物可感染和破坏小肠的绒毛上皮，但美国PEDV变异体分离物与原型分离物相比引起严重度较低的绒毛萎缩。肠隐窝上皮细胞用于置换被毁坏的绒毛上皮细胞。在3DPI时，G4(变异体分离物)的平均隐窝深度与G5(阴性对照)不存在显著差异，但G1-G3(原型分离物)的平均隐窝深度显著长于G4和G5。这些结果可表明在3DPI时，由美国PEDV变异体分离物引起的轻度绒毛萎缩尚未触发肠隐窝的显著增殖和延伸；然而，在经原型分离物接种的组G1-G3中，肠隐窝已经在一定程度上开始延伸以修复严重的绒毛萎缩。在7DPI时，经原型分离物接种的组与阴性对照组相比具有更长的平均隐窝深度，表明隐窝继续延伸以置换被破坏的绒毛上皮细胞，但绒毛上皮尚未恢复正常。在7DPI时，小肠的一些G4(变异体分离物)切片的平均隐窝深度显著长于G5(阴性对照)，表明与经原型分离物接种的组G1-G3相比，隐窝延伸在G4中更晚发生。在G4中，在3DPI时，经增殖的隐窝最终明显恢复被毁坏的绒毛上皮细胞。IHC染色也支持这些观察结果。
研究表明针对美国PEDV原型和S-INDEL-变异体菌株的抗体可活体外交叉反应并且交叉中和两种菌株(Chen等人,2016；Lin等人,2015b)。活体内研究(Goede等人,2015)表明7个月前暴露于S-INDEL-变异体PEDV感染的大母猪可对受到美国PEDV原型菌株攻击的初生猪崽提供部分保护。另一活体内研究(Lin等人,2015a)表明暴露于S-INDEL-变异体PEDV的3-4日龄猪崽可被部分保护避免美国原型PEDV的后续攻击。申请人还具有可证明美国PEDV原型和S-INDEL-变异体菌株可在断奶猪模型中提供针对两种病毒株的同源和异源保护的资料。在当前研究中，证明美国PEDV S-INDEL-变异体菌株在新生猪中的毒性低于美国PEDV原型菌株。这些资料共同表明美国PEDV S-INDEL-变异体菌株可以潜在地是针对PED的经改良的活病毒疫苗候选物，但需要进行其它评估工作以测定整体功效(关于其它工作，参见实例5和6)。
美国原型与S-INDEL-变异体PEDV之间的显著序列差异位于刺突蛋白基因，尤其S1部分中。刺突蛋白基因中的序列差异可部分引起美国原型与S-INDEL-变异体PEDV之间的毒性差异。
材料和方法
病毒分离物和细胞
已描述美国PEDV原型分离物USA/IN19338/2013和S-INDEL-变异体分离物USA/IL20697/2014的分离和表征(Chen等人,2014；Chen等人,2016)。获得三种其它美国PEDV原型分离物USA/NC35140/2013、USA/IA49379/2013和USA/NC49469/2013以用于本研究，其皆来自提交到爱荷华州大学兽医学诊断实验室(Iowa State University VeterinaryDiagnostic Laboratory；ISU VDL)的用于根据先前描述的病毒分离程序(Chen等人,2014)进行常规诊断的所存档的猪崽粪便。如所描述在Vero细胞(ATCCCCL-81)中进行所有PEDV分离、传播和滴定(Chen等人,2014)。证实在这一研究中使用的所有分离物对猪δ冠状病毒(PDCoV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)以及猪轮状病毒(组A、B和C)、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒呈阴性。
病毒测序、比较性序列分析和***发生分析
如先前所描述(Chen等人,2014)，在这一研究中描述的PEDV分离物的完全基因组序列是使用Illumina MiSeq平台和装配有SeqMan Pro版本11.2.1(DNAstar Inc,Madison,WI)的下一代测序技术测定。这些PEDV分离物的序列资料按以下寄存编号保藏在GenBank：USA/IN19338/2013[KF650371]、USA/NC35140/2013-P7[KM975735]、USA/IA49379/2013[KM975736]、USA/NC49469/2013-P7[KM975737]以及2014020697-P7[KT860508]。
使用ClustalX版本2.0(Larkin等人,2007)和BioEdit版本7.0.4.1(Hall,1999)比对在这一研究中使用的所有PEDV分离物的完全基因组序列和个别基因序列(核苷酸和氨基酸序列)，以便比较遗传类似性。使用在这一研究中描述的PEDV分离物的整个基因组和S1部分(S基因核苷酸1到2205，根据序列KF650371)核苷酸序列以及代表性全球PEDV(总共50个序列)进行***发生分析。分别使用MEGA版本6的基于距离的相邻接合法和最大似然法构筑***发生树(Tamura等人,2013)。对1,000个重复资料集进行靴带式分析。
实验设计
动物研究方案由爱荷华州大学机构动物护理及使用委员会(Iowa StateUniversity Institutional Animal Care and Use Committee)批准(批准编号6-14-7821-S；2014年7月10日批准)。从常规饲养农场购买五十只5日龄猪崽并且运送到爱荷华州大学实验室动物来源机构。在到达时，向所有猪肌肉内注射一定剂量的(Zoetis,Florham Park,New Jersey,USA)，并且在ISU VDL通过直肠拭子上的病毒特异性PCR确认对PEDV、PDCoV、TGEV和猪轮状病毒(组A、B和C)呈阴性，并且通过对血清样品的病毒特异性间接荧光抗体(IFA)分析法确认对PEDV抗体呈阴性。猪按体重分批，并且接着随机分成5个组，每组10只猪，在实心楼板上每个房间一个组。向猪供应Esbilac(Hampshire,IL)液体乳汁替代物与酸乳酪的混合物并且自由饮水。在1天环境适应之后(猪崽年龄是6天)，组1到5(G1-G5)中的猪分别用三种美国PEDV原型分离物USA/IN19338/2013-P7(G1)、USA/NC35140/2013-P7(G2)、USA/NC49469/2013-P7(G3)、一种美国S-INDEL-变异体分离物2014020697-P7(G4)或病毒阴性培养基(G5)以口胃方式接种(10毫升/猪；所有病毒是细胞培养物中的第7代，效价是104TCID50/毫升)(表4)。
针对是否存在呕吐和腹泻的临床症状、嗜睡以及身体状况每天评估猪崽。根据以下准则对腹泻严重度进行评分：0＝正常，1＝软(牛粪)，2＝具有一些固体内含物的液体，3＝不具有固体内含物的水样。嗜睡程度分类为正常、轻度嗜睡(移动缓慢，头部向下)、中度嗜睡(站立但想要躺下)或重度嗜睡(倚躺、垂死)。身体状况分类为：正常、轻度损耗(扁平侧腹)、中度(侧腹紧缩)或重度(骨架/肋骨明显)。
在接种之前并且接着在接种后(DPI)第3天和第7天记录体重。从(-1)到3DPI和(-1)到7DPI计算猪的平均日增重(ADG)。在0、3和7DPI时收集血清样品。从0DPI到尸检，每天从每只猪收集直肠拭子并且在收集之后立即浸没于1ml PBS中。在3DPI时随机选择来自每个组的五只猪进行尸检，并且剩余的猪在7DPI时进行尸检。在尸检时收集的新鲜和福马林固定的样品包括：扁桃体、心脏、肺、肝、脾、肾脏、来自后腿的骨骼肌、胃、肠系膜***、十二指肠、近端空肠、中间空肠、远端空肠、回肠、盲肠和结肠。如先前描述进行不同的肠区段的收集(Madson等人,2014)。
在尸检时，由兽医学病理学家在无视处理组的情况下检验小肠、盲肠和结肠的肉眼损害。组织病灶分类为正常、薄壁和/或气体膨胀。存在薄壁肠或气体膨胀器官分别计数为1分；同时存在薄壁和气体膨胀计数为2分。检验小肠、盲肠和结肠的内含物并且根据以下准则评分：0＝正常，1＝具有一些固体的液体(半水样)，2＝水样。
为了排除由其它病原体引起的并发性感染的可能性，在尸检之前在3DPI和7DPI时收集的直肠拭子在ISU VDL通过病毒特异性PCR测试PDCoV、TGEV和猪轮状病毒(组A、B和C)并且通过常规细菌培养物测试溶血性大肠杆菌和沙门氏菌属。
如通过定量的基于PEDV N基因的实时RT-PCR检验的病毒排出
如先前描述从直肠拭子、血清和10％组织匀浆提取病毒RNA(Chen等人,2014)。使用Path-IDTM多元单步骤RT-PCR试剂盒(Thermo Fisher Scientific)，在PCR设置中在25μl总反应物中使用五微升各RNA模板。已描述用于产生定量的基于PEDV N基因的实时RT-PCR的标准曲线的引物、探针和活体外经转录的RNA(Lowe等人,2014；Madson等人,2014；Thomas等人,2015)。基于标准曲线，以基因组复本/毫升为单位计算测试样品中的病毒浓度。基于PCR阳性样品计算平均循环临界(Ct)值，并且基于组内的所有猪(PCR阳性和阴性猪)计算平均病毒浓度。
组织病理学
扁桃体、心脏、肺、肝、脾、肾脏、肠系膜***、胃、十二指肠、近端空肠、中间空肠、远端空肠、回肠、盲肠和结肠组织固定在10％福马林中，包埋，切片并且用苏木精和曙红(H&E)染色，并且由不知道个别动物标识和处理组的兽医学病理学家检验。根据先前描述的程序使用计算机化图像***，由十二指肠、近端空肠、中间空肠、远端空肠和回肠的***性绒毛和隐窝测量绒毛长度和隐窝深度(Madson等人,2014)。各组织的绒毛高度与隐窝深度(绒毛/隐窝)比率计算为平均绒毛长度除以平均隐窝深度的商。
免疫组织化学
如先前描述(Madson等人,2014)使用PEDV特异性单克隆抗体(BioNote，Hwaseong-si,Gyeonggi-do,Korea)，通过免疫组织化学(IHC)针对PEDV抗原评估在3DPI尸检时回肠、盲肠和结肠的连续切片。在7DPI尸检时，仅对回肠的连续切片进行IHC染色。根据以下准则如先前描述(Chen等人,2015)对IHC抗原检测以半定量方式评分：0＝无染色；1＝约1-10％上皮细胞具有阳性染色；2＝约10％-25％上皮细胞具有阳性染色；3＝约25％-50％上皮细胞具有阳性染色；4＝约50％-100％上皮细胞具有阳性染色。
统计分析
用统计分析***(Statistical Analysis System；SAS)版本9.3(SAS institute,Cary,NC)，使用一般化线性混合(GLIMMIX)模型进行所有统计比较。P值<0.05定义为统计显著。从0-7DPI在各处理中评估整体粪便病毒排出含量的P值[Log10(基因组复本/毫升)]，其中DPI和处理作为相互作用变量，并且与腹泻分数的分析类似。
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实例3
已经在美国发现至少两种遗传学上不同的猪流行性腹泻病毒(PEDV)菌株(美国PEDV原型和S-INDEL-变异体菌株)。兽医学诊断实验室提供的用于检测PEDV特异性抗体的当前血清学分析法是基于美国PEDV原型菌株。本研究的目标是：1)在细胞培养物中分离美国PEDV S-INDEL-变异体菌株；2)通过以实验方式感染断奶猪来产生针对美国PEDV原型和S-INDEL-变异体菌株的抗血清；3)测定多种PEDV血清学分析法是否可检测针对美国PEDVS-INDEL-变异体菌株的抗体且反之亦然。在本研究中，在细胞培养物分离美国PEDV S-INDEL-变异体菌株。三组PEDV阴性、3周龄猪(每组五只猪)用美国PEDV原型分离物(预先在我们的实验室中分离)、S-INDEL-变异体分离物或病毒阴性培养基经口接种。通过以下PEDV血清学分析法评估在接种后第0、7、14、21和28天收集的血清样品：1)间接荧光抗体(IFA)分析法，其使用原型和S-INDEL-变异体菌株作为指示剂病毒；2)针对原型和S-INDEL-变异体病毒的病毒中和(VN)测试；3)基于PEDV原型菌株完全病毒的ELISA；4)基于PEDV原型菌株S1的ELISA；以及5)基于PEDV S-INDEL-变异体菌株S1的ELISA。针对原型菌株的阳性抗血清与原型和S-INDEL-变异体病毒反应且将其中和，并且针对S-INDEL-变异体菌株的阳性抗血清也与原型和S-INDEL-变异体病毒反应且将其中和，替通过IFA抗体分析法和VN测试检验。可通过所有三种ELISA检测针对两种PEDV菌株的抗体，但检测率在一定程度上不同。
申请人证实针对美国PEDV原型和S-INDEL-变异体菌株的抗体可与两种菌株活体外交叉反应且交叉中和。基于美国PEDV原型菌株的当前血清学分析法可检测针对两种美国PEDV菌株的抗体。
由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的猪流行性腹泻(PED)首先在1970年代早期的英格兰被记载，并且从此传播到其它欧洲和亚洲国家[1]。在北美，在2013年4月在美国(U.S.)首次检测到PEDV[2]并且接着在加拿大[3]和墨西哥[4]报道PEDV。PEDV是包膜、单股、阳性有义RNA病毒，其属于套式病毒目(order Nidovirale)，冠状病毒科(familyCoronaviridae)，冠状病毒亚科(subfamily Coronavirinae)，甲型冠状病毒属(genusAlphacoronavirus)[5]。PEDV基因体的长度是约28kb并且包括编码复制酶多蛋白的ORF1a和ORF1b以及编码四个结构蛋白质[刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳(N)]和一个非结构蛋白质NS3B(由ORF3编码)的其它开放阅读框架(ORF)[1]。
在美国，在初始PED爆发期间发现高毒性PEDV菌株(美国PEDV原型菌株)[2、6、7]。近来，基于牧场观察，在具有轻度临床症状的美国猪中发现与美国原型菌株相比在刺突蛋白基因中具有***和缺失的PEDV变异体菌株(INDEL)[8]。这种美国PEDV变异体菌株，也称为S INDEL菌株[4]，与美国PEDV原型菌株相比形成不同的***发生丛集[4、8、9]。在细胞培养物中，在PEDV分离期间发现一种在N端S蛋白质中具有197-aa缺失的PEDV分离物(PC177)；然而，这种PEDV分离物仍与美国PEDV原型菌株属于同一***发生丛集并且不被视为S-INDEL-变异体菌株之一[10]。Marthaler等人[11]报道美国猪中PEDV的‘第三’菌株(Minnesota188)，其在刺突蛋白基因中具有6个核苷酸缺失(2个氨基酸缺失)(与美国S-INDEL-变异体菌株不同)。然而，PEDV Minnesota188在遗传学上与美国PEDV原型菌株紧密相关并且在美国存在其是否应被称为PEDV的‘第三’菌株的疑义。PEDV PC177和Minnesota188可能是美国PEDV原型菌株的突变体。因此，当前存在至少两种遗传学上不同的PEDV菌株在美国猪中循环：美国PEDV原型菌株和S-INDEL-变异体菌株。
若干团队已经成功地在细胞培养物中分离和繁殖美国PEDV原型菌株[7、10、12、13]。已研发许多血清学分析法用于检测PEDV特异性抗体，包括间接荧光抗体(IFA)分析法、病毒中和(VN)测试、基于完全病毒的酶联免疫吸附分析(ELISA)、基于重组型S1蛋白质的ELISA以及基于重组型核衣壳蛋白的ELISA[14-18]。所有这些血清学分析法是基于美国PEDV原型菌株。
在本研究中，申请人在细胞培养物中分离美国PEDV S-INDEL-变异体菌株。分别用美国PEDV原型菌株和新近分离的美国PEDV S-INDEL-变异体菌株以实验方式对猪进行接种，以产生菌株特异性抗血清。接着，所产生的猪抗血清经历关于两种菌株之间的血清学交叉反应性和交叉中和的活体外评估。具体地说，1)进行PEDV IFA抗体分析法(分别使用原型和S-INDEL-变异体菌株作为指示剂病毒)和ELISA(基于PEDV原型菌株完全病毒的ELISA、基于PEDV原型菌株S1的ELISA以及基于PEDV S-INDEL-变异体菌株S1的ELISA)以评估两种美国菌株的抗体交叉反应性；和2)进行使用原型和S-INDEL-变异体菌株作为指示剂病毒的VN测试以评估两种美国菌株的活体外交叉中和。
材料和方法
在细胞培养物中分离美国PEDV S-INDEL-变异体菌株
选择六十八份临床样品(27份粪便拭子、24份粪便、13份小肠和4份口腔流体)，其在爱荷华州大学兽医学诊断实验室(Iowa State University Veterinary DiagnosticLaboratory；ISU VDL)通过基于PEDV N基因的实时RT-PCR测试呈阳性[17、19]并且通过S1测序证实对美国PEDV S-INDEL-变异体菌株呈阳性，但对美国原型菌株呈阴性，以根据先前描述的程序尝试在Vero细胞(ATCC CCL-81)中的病毒分离[7]。
在前述对美国PEDV S-INDEL-变异体菌株呈阳性的68份临床样品中，将一份来自位于伊利诺伊州(Illinois)的猪的小肠匀浆(基于PEDV N基因的实时RT-PCR循环临界(Ct)值是16.1)[17、19]在3周龄时以口胃方式接种到三只未经PEDV处理的断奶猪中(每只猪10ml)。在ISU VDL通过病毒特异性RT-PCR证实用于接种的匀浆对传染性胃肠道病毒(TGEV)、猪轮状病毒组A、B、C和猪δ冠状病毒(PDCoV)呈阴性。一天两次从每只经接种的猪收集直肠拭子和粪便并且在同一天通过PEDV实时RT-PCR进行测试。一旦直肠拭子的RT-PCRCt值<15，将猪处死并且在24小时内尸检。如先前描述，收集小肠组织和盲肠内含物以用于尝试在细胞培养物中进行病毒分离[7]。这项动物研究是根据由爱荷华州大学机构动物护理及使用委员会(IACUC，批准编号3-14-7766-S)批准的程序进行。
如先前所描述，使用Illumina MiSeq平台通过下一代测序(NGS)技术测定在本研究中获得的美国PEDV S-INDEL-变异体菌株细胞培养物分离物USA/IL20697/2014的完全基因组序列[7]。根据先前描述的程序通过桑格测序(Sanger sequencing)来测定分离物USA/IL20697/2014和衍生病毒分离物临床样品的PEDV S1部分序列[7]。
产生针对美国原型和S-INDEL-变异体PEDV的抗血清
十五只3周龄猪(通过直肠拭子上的实时RT-PCR和血清上的IFA抗体分析法确认对PEDV呈阴性)根据体重随机分成3个组，每组5只猪，并且每组具有类似平均体重。在3天环境适应之后，三组猪分别用美国PEDV原型细胞培养物分离物USA/IN19338/2013-P7(Pro组)(SEQ ID NO:59)[7]、美国PEDV S-INDEL-变异体细胞培养物分离物USA/IL20697/2014-P7(SEQ ID NO:62)(Var组)和病毒阴性培养基(Neg组)以口胃方式接种，其中病毒效价是104TCID50/毫升，每只猪10毫升。在0与7DPI之间且接着在10、14、21和28DPI每天从所有猪收集直肠拭子，并且通过基于PEDV N基因的定量实时RT-PCR[20]进行测试以确认感染。在接种后第0、7、14、21和28天从所有猪收集血清样品以用于交叉反应性和交叉中和评估。这项动物研究是根据由爱荷华州大学IACUC委员会批准的程序进行(批准编号6-14-7809-S)。
在这一研究中，通过多种血清学分析法测试在0、7、14、21和28DPI从Pro组收集的二十五份血清样品(Pro抗血清)，从Var组收集的25份血清样品(Var抗血清)和从Neg组收集的25份血清样品(Neg抗血清)。此外，在本研究中包括一种针对欧洲PEDV CV777菌株的猪抗血清、一种针对TGEV菌株的猪抗血清、一种针对猪红细胞凝聚脑脊髓炎病毒(PHEV)的猪抗血清、一种针对猪呼吸道冠状病毒(PRCV)的猪抗血清以及一种针对PDCoV的猪抗血清以用于评估。针对PEDV CV777、TGEV Purdue和PHEV菌株的抗血清是购自National VeterinaryService Laboratory,Ames,IA。针对PRCV和PDCoV的抗血清是从ISU VDL获得的阳性对照血清。
间接荧光抗体(IFA)分析法
根据先前描述的程序，通过基于PEDV原型菌株的IFA(Pro IFA)和基于S-INDEL-变异体菌株的IFA(Var IFA)测试八十份血清样品[20]。Pro IFA分析法中使用PEDV原型分离物USA/IN19338/2013作为指示剂病毒并且Var IFA分析法中使用S-INDEL-变异体分离物USA/IL20697/2014作为指示剂病毒。在1:40或更高的血清稀释度下的阳性信号视为IFA抗体阳性。
抗体检测的PEDV ELISA
在ISU VDL研究和验证基于美国PEDV原型菌株完全病毒的间接ELISA(ProWVELISA)以用于检测PEDV特异性IgG抗体[15、16]。根据已经详细描述的程序，通过这一ProWVELISA测试所有血清样品[20]。样品与阳性(S/P)比率>0.8视为抗体阳性，S/P比率在0.6-0.8之间视为疑似，并且S/P比率<0.6视为阴性。
在这一研究中，根据先前描述的程序使用公开的基于美国PEDV原型菌株S1的间接ELISA(ProS1 ELISA)测试所有血清样品[14]。S/P比率>0.2视为抗体阳性，0.14-0.2视为疑似，并且S/P比率<0.14视为阴性。
在本研究中研发基于美国PEDV S-INDEL至变异体菌株S1的间接ELISA(VarS1ELISA)。通过基因合成，借助于添加5'Kozac序列、5'真核信号序列和3'6×-His标签来密码子最佳化和合成编码美国PEDV S-INDEL-变异体菌株的S1部分(aa 1-735)的区域(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)。将所得2,358碱基对DNA片段克隆到Zoetis专用真核表现载体(pZOE15)中。通过测序确认重组型质体中***物的真实性和定向。使用Zoetis专用PEI转染方法将重组型质体短暂转染到人类胚胎肾脏(HEK)293细胞中。在转染后第7天，收集培养物上清液并且过滤灭菌。通过Ni-NTA纯化***(Thermo FisherScientific)纯化重组型蛋白质。使用棋盘滴定测定用于VarS1 ELISA的最佳抗原浓度和最佳血清稀释度。用PEDV变异体S1蛋白质涂布(100微升/孔)聚苯乙烯96孔微量滴定盘(Thermo Fisher Scientific)并且在4℃下培育隔夜。在用PBS洗涤5次之后，滴定盘在25℃下用含有1％牛血清白蛋白的PBS(Jackson ImmunoResearch Inc.,West Grove,PA,USA)阻断(300微升/孔)2小时。滴定盘在37℃下干燥4小时并且在密封包中与干燥剂包一起在4℃下储存直到使用。血清样品以1:50稀释并且添加到经涂布的盘中(100微升/孔)。盘在25℃下培育1小时并且接着用PBS洗涤5次。接着，添加以1:25,000稀释的100μl过氧化酶结合的山羊抗猪IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch Inc.,West Grove,PA,USA)并且盘在25℃下培育1小时。在清洗步骤之后，添加100μl四甲基联苯胺-过氧化氢底物(TMB，DakoNorth America Inc.,Carpinteria,CA,USA)。培养盘在室温下培育5分钟并且通过添加50μl停止溶液(1M硫酸)来停止反应。使用由市售软件操作的ELISA盘读取器(Instruments Inc.,Winooski,VT,USA)在450nm下以光学密度(OD)测量反应。血清抗体应答呈现为样品与阳性(S/P)比率，其计算为：S/P比率＝(样品OD-阴性对照物平均OD)/(阳性对照物平均OD-阴性对照物平均OD)。使用有记录暴露于美国PEDV S-INDEL-变异体菌株的从农场收集的29份牧场血清样品(在通过PCR发现对S-INDEL-变异体菌株呈之后一个月从29只断奶猪收集的血清样品)和20份PEDV阴性牧场血清样品验证PEDV VarS1 ELISA。S/P比率>0.3视为抗体阳性，0.2-0.3视为疑似，并且<0.2视为阴性。
病毒中和(VN)测试
根据先前描述的程序，通过基于美国PEDV原型菌株的VN(Pro VN)和基于美国PEDVS-INDEL-变异体菌株的VN(Var VN)测试血清样品[20]。Pro VN分析法中使用PEDV原型分离物USA/IN19338/2013作为指示剂病毒并且Var VN分析法中使用S-INDEL-变异体分离物USA/IL20697/2014作为指示剂病毒。引起染色与阴性血清对照物相比降低>90％的最高血清稀释度的倒数定义为血清样品的VN效价。VN效价≥8视为阳性。
统计分析
在一般化线性混合模型(GLIMMIX)中分析由Pro IFA和Var IFA测试的Pro抗血清和Var抗血清的Log2(IFA效价/10)。使用接种后天数和抗原作为自变量，并且猪ID和猪ID与抗原的相互相用设定为随机作用。以类似方式分析由Pro VN和Var VN测试的Pro抗血清和Var抗血清的Log2(VN效价)。关于ELISA分析，使用ELISA抗原、猪ID和DPI作为自变量。用统计分析***(SAS)版本9.3(SAS institute,Cary,NC,USA)进行所有统计分析，其中p值<0.05视为显著差异。
结果
在细胞培养物中分离美国PEDV S-INDEL-变异体菌株
首先对在ISU VDL接收的68份临床样品尝试病毒分离，所述样品对美国PEDV S-INDEL-变异体菌株测试呈阳性，但在细胞培养物中的病毒分离尝试未成功。接着，使用PEDVS-INDEL-变异体菌株阳性肠匀浆接种三只3周龄的猪。一只猪的直肠拭子在2DPI时的PEDVRT-PCR Ct<15并且所述猪在3DPI时被处死并且尸检。另两只猪的直肠拭子在3DPI时的PEDVRT-PCR Ct<15并且这两只猪在4DPI时被处死并且尸检。使用在尸检时收集的小肠组织和盲肠内含物尝试在Vero细胞中进行病毒分离。成功地从所有3只猪收集的小肠匀浆和盲肠内含物分离美国PEDV S-INDEL-变异体菌株。观察到典型PEDV细胞变性作用，包括合胞体形成和细胞脱落，并且使用PEDV特异性单克隆抗体SD6-29通过免疫荧光染色来证实病毒生长。
选择一种称为USA/IL20697/2014的美国PEDV S-INDEL-变异体分离物用于进一步传播和表征。这一分离物在Vero细胞中连续传代并且第一批十代的感染性效价在103-105TCID50/毫升范围内。分离物2014020697-P5第5代，谱系1的完全基因组序列(SEQ ID NO:8)与GenBank中可获得的其它美国PEDV S-INDEL-变异体序列具有99.3-99.9％核苷酸一致性。USA/IL20697/2014细胞培养物分离物P5的S1序列与衍生病毒分离物的原始肠匀浆具有99.8％核苷酸一致性(仅4个核苷酸差异)。在ISU VDL测试USA IL20697/2014分离物并且通过病毒特异性PCR证实对TGEV、PRCV、PDCoV、猪轮状病毒A、B、C、A型流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒以及猪圆环病毒2呈阴性。
产生针对美国原型和S-INDEL-变异体PEDV的抗血清
美国PEDV原型分离物USA/IN19338/2013-P7(SEQ ID NO:59)和S-INDEL-变异体分离物2014020697-P7(SEQ ID NO:62)变成在所有经接种的猪中存在，如通过直肠拭子的PCR测试证明。在原型组中，4/5、5/5、5/5、5/5、5/5、5/5和3/5的猪分别在2、4、7、10、14、21和28DPI时在直肠拭子中排出病毒，如通过PEDV实时RT-PCR测试。在S-INDEL-变异体组中，3/5、5/5、5/5、5/5、4/5、3/5和1/5的猪分别在2、4、7、10、14、21和28DPI时在直肠拭子中排出病毒。阴性对照猪的直肠拭子在整个研究周期期间保持PEDV PCR阴性。总体上，在0、7、14、21和28DPI时从原型菌株接种的猪收集25份抗血清(Pro抗血清)、从变异体菌株接种的猪收集25份抗血清(Var抗血清)并且从阴性对照组收集25份抗血清(Neg抗血清)。
通过PEDV IFA抗体分析法评估针对美国PEDV原型菌株和S-INDEL-变异体菌株的抗体的交叉反应性
如图13中所示，通过基于原型菌株的IFA抗体分析法(Pro IFA)，Pro抗血清在0和7DPI时测试呈抗体阴性(0/5)并且在14、21和28DPI时是100％阳性(5/5)。通过Var IFA分析法，除了在14DPI时收集的一份血清是阴性以外，基于变异体菌株的IFA(Var IFA)对Pro抗血清产生类似结果。当比较抗体效价时，阳性Pro抗血清对Pro IFA分析法的反应整体优于对Var IFA分析法的反应，其中效价平均值高1.4log2(图13)。
通过Pro IFA和Var IFA抗体分析法，Var抗血清在0和7DPI时测试呈阴性(0/5)并且在14、21和28DPI时测试呈100％阳性(5/5)。当比较抗体效价时，阳性Var抗血清对ProIFA和Var IFA分析法的反应类似，其中效价平均值差异小于0.1log2(图13)。
通过PEDV Pro IFA和Var IFA分析法，在整个研究期间，从阴性对照组收集的抗血清(Neg抗血清)是抗体阴性。通过Pro IFA分析法(效价320)和Var IFA分析法(效价160)，针对欧洲PEDV CV777菌株的猪抗血清具有类似抗体效价。通过PEDV Pro IFA和Var IFA分析法，针对TGEV Purdue、PHEV、PDCoV和PRCV病毒的抗血清皆是阴性。
通过多种PEDV ELISA评估针对美国PEDV原型菌株和S-INDEL-变异体菌株的抗体的交叉反应性
如图14所示，通过ProWV ELISA、ProS1 ELISA和VarS1 ELISA，在0和7DPI时收集的Pro抗血清皆是抗体阴性。对于在14DPI时收集的Pro抗血清，通过ProWV ELISA，2份血清是阳性并且3份属于疑似范围；通过ProS1 ELISA，3份是阳性并且1份疑似；通过VarS1 ELISA，2份是阳性并且1份疑似。通过三种ELISA，在21和28DPI时收集的Pro抗血清皆是阳性。当在14、21和28DPI时通过各ELISA比较阳性Pro抗血清的总数时，用于检测针对美国PEDV原型菌株的抗体的三种ELISA中不存在显著差异。
通过所有三种ELISA，除了在7DPI时一份血清属于疑似范围(通过ProS1 ELISA)以外，在0和7DPI时收集的Var抗血清是抗体阴性(图14)。通过三种ELISA，在14、21和28DPI时收集的Var抗血清具有可变数目的阳性、疑似和阴性结果(图14)。整体上，对于Var抗血清，ProWV ELISA检测到14份血清呈抗体阳性，1份疑似并且10份呈阴性；ProS1 ELISA检测到8份血清呈阳性，5份疑似并且12份呈阴性；VarS1 ELISA检测到12份血清呈阳性，3份疑似并且10份呈阴性。当在14、21和28DPI时通过各ELISA比较阳性Var抗血清的总数时，与ProS1ELISA相比，ProWV ELISA在检测针对美国PEDV S-INDEL-变异体菌株的抗体方面显著更好(p＝0.0079)。然而，对于检测针对美国PEDV S-INDEL-变异体菌株的抗体，ProWV ELISA与VarS1 ELISA之间(p＝0.3643)或ProS1 ELISA与VarS1 ELISA之间(p＝0.0723)不存在显著差异。
在整个研究周期0-28DPI期间，通过所有三种PEDV ELISA，从阴性对照组收集的抗血清(Neg抗血清)是抗体阴性。通过所有三种PEDV ELISA，针对欧洲PEDV CV777菌株的猪抗血清是抗体阳性。通过三种PEDV ELISA，针对TGEV Purdue、PHEV、PDCoV和PRCV病毒的抗血清皆是阴性。
通过病毒中和测试评估针对美国PEDV原型菌株和S-INDEL-变异体菌株的抗体的交叉中和
如图15中所示，无论通过前VN或Var VN分析法测试，早在7DPI时便在大部分用原型菌株或S-INDEL-变异体菌株接种的猪的血清中检测到VN抗体。通过Pro VN和Var VN分析法，在14、21和28DPI时从所有用PEDV原型菌株或S-INDEL至变异体菌株接种的猪收集的血清样品是VN抗体阳性。
通过Pro VN和Var VN分析法，阳性Pro抗血清具有类似VN抗体效价，并且两种分析法之间不存在显著差异。通过Pro VN和Var VN分析法，阳性Var抗血清具有类似VN抗体效价，并且两种分析法之间整体上不存在显著差异(p＝0.42)，但在21和28DPI时，Var抗血清的平均VN抗体效价在Var VN分析法情况下略微高于Pro VN分析法(图15)。
通过同源Pro VN分析法测试的阳性Pro抗血清的平均VN抗体效价比通过同源VarVN分析法测试的阳性Var抗血清的VN抗体效价高0.8log2(图15)。
在整个研究周期0-28DPI期间，通过Pro VN和Var VN分析法，从阴性对照组收集的抗血清(Neg抗血清)是抗体阴性。通过Pro VN分析法(效价64)和Var VN分析法(效价16)，针对欧洲PEDV CV777菌株的猪抗血清是抗体阳性。通PEDV Pro VN和Var VN分析法，针对TGEVPurdue、PHEV、PDCoV和PRCV病毒的抗血清皆是阴性。
讨论
申请人预先在Vero细胞中分离美国PEDV原型菌株[7]。为了获得美国PEDV S-INDEL-变异体菌株的细胞培养物分离物以产生用于评估的菌株特异性抗血清，首先使用提交到ISU VDL的68份PEDV S-INDEL-变异体菌株阳性临床样品在Vero细胞中尝试病毒分离。然而，未在细胞培养物中成功地从这些样品分离S-INDEL-变异体病毒。这可归因于多种因素，如样品中病毒的低浓度、一些样品的细胞毒性以及在收集之后临床样品的可变储存条件。随后，在68份临床样品中，将一份含有S-INDEL-变异体PEDV的肠匀浆接种到猪中以产生具有充足的病毒载量的更新鲜的材料，以用于细胞培养物中的分离尝试。使用这种方法，在Vero细胞中成功地分离美国S-INDEL-变异体PEDV。推测样品中病毒的高浓度和对新鲜样品的立即病毒分离尝试是细胞培养物中成功的病毒分离的关键。对于其它病毒(在细胞培养物中难以直接从自然感染的动物的临床样品分离这些病毒)，可考虑本研究中描述的方法，即在宿主动物中扩增病毒以获得具有高病毒浓度的新鲜样品以用于细胞培养物中的病毒分离尝试。
从养猪场收集的一些牧场血清样品提交到ISU VDL以用于PEDV抗体检测。然而，归因于缺乏这些病例的清晰暴露历史以及感染多种病原体或超过一种PEDV菌株的可能性，这些牧场血清样品对于评估不同PEDV菌株的血清学交叉反应性是不理想的。因此，在本研究中，在严格实验条件下，在断奶猪中产生针对美国PEDV原型和S-INDEL-变异体菌株的抗血清，以用于通过多种血清学分析法评估交叉反应性。
针对原型菌株的阳性抗血清与原型和S-INDEL-变异体病毒反应，并且针对S-INDEL-变异体菌株的阳性抗血清也与原型和S-INDEL-变异体病毒反应，如通过IFA抗体分析法检验。当考虑抗体效价时，针对原型菌株的抗体对Pro IFA分析法的反应优于Var IFA分析法，而针对S-INDEL-变异体菌株的抗体对Var IFA的反应与Pro IFA分析阀类似。因此，兽医学诊断实验室提供的当前基于美国PEDV原型菌株的IFA抗体分析法可用于可靠地检测针对两种美国PEDV菌株的抗体。
先前已研发和验证ProWV ELISA和ProS1 ELISA以检测PEDV特异性抗体[14-16]。在本研究中研发PEDV VarS1 ELISA。然而，在本研究中测试以实验方式产生的抗血清之前，这种VarS1 ELISA仅使用有限数目的针对美国PEDV S-INDEL-变异体菌株的牧场抗血清验证。将需要使用大量血清样品进行的这种VarS1 ELISA的进一步验证以测定这种分析法的性能。所有三种PEDV ELISA与Pro抗血清和Var抗血清反应。三种ELISA类似地检测Pro抗血清。然而，似乎在本研究中使用的ProS1 ELISA在本研究的条件下检测针对美国PEDV S-INDEL-变异体菌株的抗体方面不如ProWV ELISA和VarS1 ELISA有效。
针对美国原型菌株的抗体和针对美国S-INDEL-变异体菌株的抗体中和两种病毒株达到类似效价。当前在实验室中操作的基于美国PEDV原型菌株的VN测试可用于检测针对两种美国PEDV菌株的抗体。
在本研究中，从14DPI开始，原型和S-INDEL-变异体PEDV接种的猪在血清中出现可检测的IFA和ELISA抗体。相比之下，从7DPI开始，两组猪显示少量的血清中和抗体。在本研究中，IFA和ELISA分析法检测到IgG抗体；VN测试可潜在地检测任何具有中和活性的抗体同型。尚不明确这是否有助于观察少量VN抗体的早期检测。在先前研究中，还报道可早在7DPI时检测到PEDV VN抗体[20]。
美国原型和S-INDEL-变异体PEDV之间的不同遗传差异位于S1区域(对应于aa 1-738的核苷酸1-2214，根据原型菌株USA/IN19338/2013中的位置，GenBank寄存编号KF650371)，尤其S基因的N端区域(对应于aa 1-390的核苷酸1-1170)中，而基因组的其余部分在两种美国菌株之间相对保守[4、8、10]。用于ProS1 ELISA的PEDV原型菌株S1蛋白质和用于VarS1 ELISA的PEDV S-INDEL-变异体菌株S1蛋白质具有92％氨基酸一致性。所报道的PEDV中和抗原决定基位于S蛋白质氨基酸残基499-638、744-759、756-771和1368-1374中[1、21]。这些位置中具有中和抗原决定基的蛋白质序列在美国原型和S-INDEL-变异体PEDV之间具有保守性。这可说明为何针对两种PEDV菌株的抗体能够交叉中和两种病毒株。使用重组型PEDV S1蛋白质(aa 1-738)研究ProS1和VarS1 ELISA。尽管美国原型和S-INDEL-变异体PEDV在aa 1-390中具有显著差异，但两种菌株在这一区域中仍具有一些共同抗原决定基。此外，两种PEDV菌株的重组型S1蛋白质从aa 390-738具有相对保守序列，包括这一区域中的中和抗原决定基。这些可能是为何ProS1和VarS1 ELISA可无关于各分析法之间敏感性的可能差异而检测针对两种美国PEDV菌株的抗体的原因。提出IFA抗体分析法和ProWVELISA检测针对PEDV的多种抗原蛋白质的抗体并且因此预期其检测针对美国原型和S-INDEL-变异体PEDV的抗体。考虑核衣壳蛋白在PEDV中实际上是保守性，预期基于核衣壳蛋白的ELISA应检测针对两种美国PEDV菌株的抗体。申请人还具有一份用于评估的针对经典欧洲PEDV CV777菌株的猪抗血清并且在本研究中通过所有血清学分析法检测PEDV CV777抗体。然而，针对TGEV Purdue、PHEV、PDCoV和PRCV的抗血清与在本研究中评估的PEDV血清学分析法不具有交叉反应性。
Lin等人[22]，产生针对美国PEDV原型菌株、美国PEDV S-INDEL-变异体菌株、TGEVPurdue菌株和TGEV米勒菌株的超免疫猪抗血清并且通过细胞培养物免疫荧光(CCIF)分析法(与我们的IFA抗体分析法类似)和荧光病灶减少病毒中和(FFRVN)分析法(与我们的VN测试类似)测试。通过CCIF和FFRVN分析法，发现针对美国PEDV原型菌株、S-INDEL-变异体菌株和欧洲CV777菌株的抗血清皆具有交叉反应性。我们的发现结果与其结果相符。除由Lin等人使用的类似血清学分析法以外，我们还通过三种PEDV ELISA评估PEDV血清学反应性。并且，我们测试来自用两种美国PEDV菌株以实验方式感染的猪的连续血清样品(0-28DPI)，提供关于断奶猪中PEDV抗体产生的动力学的有效信息。Lin等人研究中的一个有趣发现是通过CCIF分析法但非通过FFRVN分析法，针对TGEVMiller菌株而非TGEV Purdue菌株的的超免疫抗血清与所有PEDV菌株交叉反应。
结论
本研究中的资料表明针对美国PEDV原型和S-INDEL-变异体菌株的抗体与两种菌株活体外交叉反应和交叉中和。基于美国PEDV原型菌株的当前血清学分析法可检测针对两种美国PEDV菌株的抗体。然而，需要通过活体内猪研究测定这两种PEDV菌株的交叉保护功效。Goede等人[23]证实7个月前暴露于S-INDEL-变异体PEDV感染的大母猪可对用美国PEDV原型菌株攻击的初生儿猪崽提供部分保护。但在这方面，需要更多的活体内研究以揭露是否应使用美国PEDV原型菌株或S-INDEL-变异体菌株或这两种研究疫苗，以提供针对在美国猪中循环的两种PEDV菌株的保护(关于这方面的其它工作，参见实例5和6)。
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实例4
响应于当前PEDV的大范围流行和缺乏有效疫苗，本发明提供一项主要成就，提供基于INDEL型变异体(其另一个实例是OH851，如由俄亥俄州农业部(Ohio Department ofAgriculture),L.Wang等人,《新发传染性疾病(Emerg.Infect.Dis.)》,2014,第20卷,第917-919页首先描述)的经修饰的活疫苗，其可有效针对当前全世界流行的系列，并且尤其是针对所谓的原型病毒(众所周知的实例是USA/Colorado/2013，其序列可在GenBank寄存编号KF272920下获得)的交叉保护，皆如上文一般描述，其已经在猪畜群中引起毁灭性损失。本发明的完全新型、首创疫苗还符合显著的灵活性，如给药和给药时间，可在怀孕之前和怀孕期间有效给予例如大母猪，和用于给予猪崽，包括由未经处理的大母猪生产的猪崽。还提供关于公猪的效用。因此，这类疫苗，呈佐剂化和非佐剂化形式，向大母猪、小母猪、猪崽、肉猪和公猪提供针对PEDV(包括原型和新出现的INDEL型分离物)攻击的保护。因此，本发明的疫苗将提供先前未获得的保护优势，以包括成功实现(1)用于保护、预防、帮助预防或帮助控制由PEDV引起的疾病(厌食、体重减轻、脱水、发热、腹泻、呕吐、哺乳性能不良、繁殖性能不良)的怀孕大母猪和小母猪的疫苗接种；(2)用于保护、预防、帮助预防或帮助控制猪崽中由PEDV引起的疾病和死亡的怀孕大母猪和小母猪的疫苗接种；(3)用于保护、预防、帮助预防或帮助控制由PEDV引起的疾病的1日龄或更大的猪的疫苗接种；(4)在后续产仔之前或每年给予大母猪的辅助剂疫苗接种；(5)健康的猪可用PEDV MLV接种并且接着用PEDV失活疫苗强化；以及(6)通常用于保护猪避免体重减轻或由PEDV引起的增重失败，以及所有类似作用。
原型菌株USA/IN19338/2013的灭毒
自从其在2013年4月在美国出现，猪流行性腹泻病毒(PEDV)在整个国家快速传播并且估算在第一年引起8百万只猪死亡，造成9亿到18亿美元的经济损失[1]。此外，PEDV最近在许多国家出现或重新出现，包括中国、日本、韩国、菲律宾、泰国、越南、加拿大、墨西哥、德国、比利时、法国和葡萄牙[2-10]。因此，PEDV仍然是对全球猪产业的显著挑战。当前在美国，存在两种市售PEDV疫苗(经杀灭的疫苗和RNA粒子疫苗)。然而，一些研究表明这些PEDV疫苗在先前暴露于PEDV的畜群中诱导良好的IgG和IgA免疫反应，但并不在接种之后在未经处理的猪中诱导良好的IgA应答[11-12]。对于诱导粘膜免疫性，经修饰的活病毒(MLV)PEDV疫苗比经杀灭或子单元疫苗更有效。然而，当前并不存在针对新出现的美国菌株的这类安全和有效的MLV PEDV疫苗。本研究的目标是表征在细胞培养物中连续传代之后，美国毒性PEDV原型分离物的基因组和病原性变化，以及测定任何所得病毒是否可以是潜在的针对PED的MLV疫苗候选物。
材料和方法
美国PEDV原型菌株细胞培养物分离物USA/IN19338/2013，在我们的实验室中预先分离[13]，在Vero细胞中连续传代100代。在新生猪模型中评估所选择的病毒的病原性变化。六十只猪崽(5日龄)，无PED病毒和抗体，随机分成6个组，每组10只猪。猪用乳汁替代物喂养。组1到5(G1-5)分别用第7代(SEQ ID NO:59)、第25代(SEQ ID NO:71)、第50代(SEQ IDNO:72)、第75代(SEQ ID NO:74)和第100代(SEQ ID NO:75)PEDV USA/IN19338/2013经口接种(104TCID50/ml，10毫升/猪)，并且组6(G6)接收相同体积的无病毒培养基作为阴性对照(表6)。记录临床观察结果。在到达时和每天收集直肠拭子并且通过基于PEDV核衣壳基因的定量实时RT-PCR14测试。来自每个组的五只猪分别在接种后(DPI)第3天和第7天尸检。检验小肠、盲肠和结肠的肉眼损害和微观病灶并且进行免疫组织化学(IHC)染色。微观病灶严重度分类为：0＝无病灶，1＝最小绒毛萎缩，2＝轻度绒毛萎缩，3＝中度绒毛萎缩和4＝严重绒毛萎缩。IHC染色评分为：0＝无信号，1＝最小染色，2＝轻度染色，3＝中度染色和4＝重度染色。使用下一代测序技术测定原始组织匀浆中以及在第P3、P7、P9、P25、P50、P65、P75和P100代时病毒的完全基因组序列[13]。
表6.动物研究设计.在不同细胞培养物后代下用PEDVUSA/IN19338/2013进行的5日龄猪崽的实验感染。
组 病毒后代 接种物 尸检(3DPI) 尸检(7DPI)
G1(n＝10) PEDV P7 105TCID50/猪 n＝5 n＝5
G2(n＝10) PEDV P25 105TCID50/猪 n＝5 n＝5
G3(n＝10) PEDV P50 105TCID50/猪 n＝5 n＝5
G4(n＝10) PEDV P75 105TCID50/猪 n＝5 n＝5
G5(n＝10) PEDV P100 105TCID50/猪 n＝5 n＝5
G6(n＝10) 病毒阴性培养基 培养基 n＝5 n＝5
DPI：接种后天数。
结果和讨论
在连续传代后，病毒变得更加适应细胞培养物。PEDV USA/IN19338/2013在P50、P75和P100时的更高级后代更高效地生长并且实现更高的感染效价(图17)。
阴性对照猪崽在整个研究周期期间保持阴性。用P7、P25、P50、P75或P100病毒接种的猪崽在1-4DPI时皆出现水泻并且在5-7DPI时出现轻度到中度腹泻。用P7、P25、P50、P75或P100病毒接种的猪崽皆在直肠拭子中排出病毒，具有用传代数越高的病毒接种的猪崽排出的病毒量越低的趋势(图18)。具体地说，病毒排出量是：P7>P25>P50、P75、P100>阴性对照(>意指显著高于；但P50、P75和P100组中不存在显著差异)。存在用传代数越低的病毒接种的猪崽出现越严重的绒毛萎缩的趋势。如图19中所示，在3DPI时，微观病灶的严重度是十二指肠中P7、P25>P50、P75、P100、阴性对照；空肠中P7、P25、P50>P75、P100>阴性对照；以及回肠中P7、P25、P50>P75、P100、阴性对照。在3DPI时，绒毛高度与隐窝深度比率是：空肠中P7、P25、P50<P75、P100<阴性对照以及回肠中P7、P25、P50<P75、P100、阴性对照(图20)。在3DPI时，空肠中的IHC染色是：P7、P25、P50、P75>P100>阴性对照；回肠中IHC染色是：P7、P25、P50>P75、P100、阴性对照；盲肠或结肠中的多种病毒之间不存在分数的显著差异(图21)。在7DPI时，各组之间的差异并不明显。
不仅在第P7、P25、P50、P75、P100代时测定病毒的完全基因组序列，而且测定原始组织匀浆中以及第P3、P9和P65代时病毒的完全基因组序列。如图16中所示，完全基因组序列的比较表明在多达P100的连续传代期间，核苷酸和推论的氨基酸变化主要位于复制酶非结构蛋白质(nsp)2、nsp3、nsp4、nsp5、nsp6、nsp15、刺突蛋白(S)、ORF3、包膜(E)、膜(M)和核衣壳(N)蛋白质中。应注意，从P25开始，ORF3中24908A>T处的点突变，其由于所推论的氨基酸翻译的早期终止密码子而产生截短的ORF3蛋白质；这一点突变在P100时传承给病毒。考虑到在连续传代期间的序列变化和病毒毒性变化，15个位置处的氨基酸变化可潜在地与细胞培养物中连续传代期间的病毒灭毒相关联。这15个位置包括：pp1a蛋白质1564Ser>Phe、1896Thr>Ile、2600Asn>Tyr、3247Leu>Phe和3473Ala>Val；S蛋白质326Thr>Ile、491Asn>Tyr、888Gly>Arg、1277Leu>Phe、1399Ile>Thr和1358Cys>Leu；截短的ORF3翻译；E蛋白质69Leu>Ile；M蛋白质208Ala>Thr；以及N蛋白质439Thr>Ile。
总体说来，毒性美国PEDV原型分离物USA/IN19338/2013在细胞培养物中的连续传代期间明显变得病原性较低。临床观察结果、直肠拭子中的病毒排出、组织病理学病灶以及IHC染色资料表明P75和P100病毒的灭毒程度高于P7、P25和P50病毒。然而，P75和P100病毒仍可引起腹泻并且可能尚未灭毒到足以成为MLV疫苗候选物。需要细胞培养物中病毒的连续传代以获得完全灭毒的疫苗候选病毒。在本研究的条件下，十六个氨基酸变化似乎与病毒灭毒相关联。本研究提供用于研发MLV PEDV疫苗和理解病毒灭毒的分子机制的强有力依据。
所属领域的技术人员将立即意识到，尽管不同分离物中的核苷酸和氨基酸序列中存在变化，并且可能出现缺失和***，然而，序列比对技术是众所周知的，使得可将PEDV蛋白质中的任何氨基酸位置映射到其它分离物中的适合的氨基酸位置。用于这一目的的优选算法和比对程序包括ClustalX版本2.0(Larkin等人,《生物信息学》23,2947-2948(2007))、BioEdit版本7.0.4.1(Hall,《核酸研讨会丛刊》41,95-98(1999))和Lasergene软件套件(DNASTAR Inc,Madison WI)，其包括用于多序列比对以比对序列和比较序列类似性和差异的Clustal W算法。
图16显示以下氨基酸变化属于优选用于产生经适当灭毒的PEDV分离物的变化，其提供疫苗功效，同时呈现显著安全性：从ORF1a和b，氨基酸位置814(Val)、1076(Val)、1564(Phe)、1896(Ilu)、2310(His)、2600(Tyr)、3247(Phe)、3473(Val)、3522(Arg)；从刺突蛋白基因，氨基酸位置257(Asn)、326(Ile)、375(Phe)、491(Tyr)、881(Arg)、888(Arg)、1277(Phe)、1339(Thr)、1358(Leu)；从ORF3，对应于氨基酸位置39或在其之后的位置，任何提供终止密码子的核苷酸变化；从基因体区域E，对于经编码的包膜蛋白，69(Ile)；对于基因体区域M，对于经编码的膜蛋白，208(Thr)；以及对于基因体区域N，对于经编码的核衣壳蛋白，141(Leu)、418(Glu)、424(Asp)和439(Ile)。除这些变化以外，其可单独或以组合形式使用，所属领域的技术人员将认识到，通常可使用等效氨基酸变化，例如带正电的残基可取代带正电的残基(Arg、LYS、His)、带负电的残基可取代带负电的残基(Glu、Asp)，或可基于极性或官能团进行等效取代(如Thr取代Ser且反之亦然；Try取代Trp且反之亦然；Ileu、Val、Leu彼此取代等)。
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美国S-INDEL-变异体菌株USA/IL20697/2014(2014020697)的灭毒
图24以及表1和2提供关于氨基酸变化的某些信息，所述氨基酸变化对应于变异体菌株USA/IL20697/2014的灭毒物。变异体分离物USA/IL20697/2014在两个独立谱系中在细胞培养物中连续传代。
在第一谱系中，病毒在细胞培养物中传代多达60代(P60)；不同后代的病毒命名为2014020697-P1、2014020697-P2、2014020697-P3……2014020697-P60。其中，测定和比较病毒2014020697-P3(SEQ ID NO:63)、2014020697-P5(SEQ ID NO:8)、2014020697-P7(SEQ IDNO:62)、2014020697-P18(SEQ ID NO:64)、2014020697-P30(SEQ ID NO:65)、2014020697-P45(SEQ ID NO:39)和2014020697-P60(SED ID NO:66)的完全基因组序列。
在第二谱系中，病毒在细胞培养物中连续传代并且一些后代的病毒还经斑(群落)纯化。其中，测定和比较病毒2014020697-P3R1(SEQ ID NO:67)、2014020697-P5R1(SEQ IDNO:68)、2014020697-P7R1(SEQ ID NO:15)、2014020697-P8R1(SEQ ID NO:35)、2014020697-P18R1纯系89G8b(SEQ ID NO:36)、2014020697-P18R1纯系94F6a(SEQ ID NO:37)和2014020697-P18R1纯系92F6a(SED ID NO:37)的完全基因组序列(应注意，P18R194F6a和P18R1 92F6a(SEQ ID NO:37)是用于验证目的的相同纯系操作的复制品，参见表1和2)。此外，2014020697-P18R1 G8b和2014020697-P18R1 F6a传代到第19和20代保持其在第18R1代时各别纯系的遗传一致性。根据所有识别的试验终点，所得病毒提供所需的临床安全性，并且保持关于类似变异体(INDEL)菌株攻击的高保护和关于高病理性原型菌株的交叉保护。
参考图24的“氨基酸变化”部分和表2，可发现在经编码的氨基酸位置551处的ORF1a/1b提供白氨酸。实际上，白氨酸似乎在PEDV分离物(原型或变异体-INDEL)中在这一位置几乎恒定，因为发现白氨酸在约500个随机选择的比较公开序列中代表残基551。尽管2014020697-P18R1 F6a(SEQ ID NO:37)和2014020697-P18R1 G8b(SEQ ID NO:36)的临床数据皆显示显著安全性和功效程度，但应注意，2014020697-P18R1 F6a确实提供安全性和功效的进一步增强，使其成为可高度商业化的材料。2014020697-P18R1 F6a提供位置551处的脯氨酸，一种众所周知可破坏或界定肽二级结构域类型之间的边界的氨基酸，并且因此预期Pro 551对最终表现型的贡献。鉴于PEDV基因组中Leu在这一位置的恒定用途，本发明的另一实施例在位置551或紧邻其(如在其上游或下游的约2-3氨基酸残基内，)处的***Pro残基。使用众所周知的算法(参见P.Y.Chou等人,“预测蛋白质构形(Prediction ofProtein Conformation)”,《Biochemistry(Biochemistry)》,13(2),第222-245页,1974；J.Garnier等人,《分子生物学杂志》,第120卷,第97-120页,1978；以及J.Garnier等人,《发酵学方法(Methods Enzymology)》,第266卷,第540-543页,1996)预测α螺旋结构域至少涉及紧邻551位置L上游的残基DEDAT，其中L落入(但仍有助于)这一第二结构域结构特征的大致C端末端。脯氨酸的***可显著破坏这种α螺旋特征。本发明的练习还包括***甘氨酸残基作为ORF1a/b的氨基酸551，同样具有获得高度灭毒但安全的疫苗的期望，并且甘氨酸残基可类似地位于位置551上游或下游的约2-3个氨基酸残基内。所有这类取代适用于所有PEDV纯系，无论原型或变异体(INDEL)。
现转向2014020697-P18R1 G8b和2014020697 P18R1 F6a在刺突蛋白中位置973处反映的氨基酸变化，可发现野生型氨基酸酪氨酸已由组氨酸置换，所述组氨酸显著与有助于这些纯系的有价值的表现型。因此，本发明的一个实施例在这一基因座处提供组氨酸，通常在PEDV的所有基因组中，其经修饰或选择用于提供安全和有效的疫苗，无论原型或变异体(INDEL)菌株。
再转向2014020697-P18R1 G8b和2014020697-P18R1 F6a在刺突蛋白中位置1009处反映的重要氨基酸变化(即紧接在SEQ ID NO:47中的NIT之后)，可发现野生型氨基酸丝氨酸已由脯氨酸置换。这一突变在2014020697-P5R1(SEQ ID NO:68)与2014020697-P7R1(SEQ ID NO:15)之间的更早的灭毒传代期间出现。与上文关于ORF1a/1b位置551提到的白氨酸到脯氨酸突变的情况类似，脯氨酸的出现是二级和三级蛋白质结构的高度***，并且显著有助于本发明的疫苗菌株的灭毒特性。本发明的实践还包括提供位置1009或任何PEDV疫苗病毒的刺突蛋白中相应位置处的脯氨酸残基。在任何PEDV菌株中的这一位置处，甘氨酸也可以被脯氨酸取代，以便改良疫苗安全性。因此，本发明的一个实施例在这一基因座处提供脯氨酸或甘氨酸，通常在PEDV的所有基因组中，其经修饰或选择用于提供安全和有效的疫苗，无论原型或变异体(INDEL)菌株。还应注意，脯氨酸/甘氨酸置换还可以紧邻位置1009(如在其上游或下游的约2-3个氨基酸残基内)进行。
适用作疫苗的许多本发明的病毒(包括例如G8b和F6a第18R1代纯系、SEQ ID NO:36和37以及由第38代，SEQ ID NO:78表示的单独谱系病毒)的其它特征是其中仅一个截短的ORF3蛋白质的表达，通常由ORF3阅读框架中的移码突变引起(参见表2)，并且因此终止密码子的出现或其它特征(如缺失的氨基酸，再次参见表2)的出现可产生部分或完全不可操作的ORF3蛋白质。我们观察到，ORF3蛋白质中的缺失和/或移码似乎与适应组织培养条件相关，并且因此ORF3可能对于克服宿主免疫防来说是必需的，在活体外培养条件下变成非必需。同样，ORF3缺失对于疫苗病毒来说是重要的，对其用于猪中的安全性产生贡献。参考由2014020697-P18R1 G8b和2014020697-P18R1 F6a(SEQ ID NO:31)表达的截短的ORF3蛋白质，应注意(表2)，这一突变已由第P8R1代成功实现(参见SEQ ID NO:18)，其中所得蛋白质序列是：
MFLGLFQYTIDTVVKDVSKSANLSLDAVQELELNVVPIRQASNVTGFLFTSVFIYFFALFKASSLRRNYIMLAARFAVIVLYCPLLYYCGAFLDATIICCTLIGRLCLVCFYSWRYKNALFIIFNTTTLSFLNGKAALTANPL
因此，本发明的实践包括提供含有ORF3阅读框架的任何截短的疫苗病毒，其适于限制ORF3功能，如上文关于疫苗病毒2014020697-P38(SEQ ID NO:78)和其更早后代(再次参见表2)所讨论的功能，或与病毒序列SEQ ID NO:36和37相关的功能。参考序列的直接对比和用于比对序列的算法，所属领域的技术人员能够容易地提供任何原型菌株或变异体INDEL菌株的任何ORF3蛋白质的截短物，以含有相应的截短物。因此，本发明的疫苗病毒包括具有SEQ ID NO:18作为所得ORF3蛋白质，或其任何片段(10、20、30、40、50、60个氨基酸残基等)或不太能够抑制宿主免疫功能的全长ORF3蛋白质的任何片段的疫苗病毒。
这些突变显著有助于本发明的疫苗灭毒物的最终临床有效表现型，并且如前文所述，参考常见比对程序和算法，可容易地复制到所有原型和变异体(INDEL)菌株中相应蛋白质的氨基酸序列中。代替专门命名的残基变化，保守性氨基酸置换在所有情况下也是适合的，并且所观察到的本发明的原型和变异体(INDEL)病毒中的任一种的所有氨基酸变化(和其保守性取代)可有效地安置在任何PEDV病毒(无论原型或)中以用于改良任何这类所得病毒作为疫苗的有效性的目的。
本文中关于传代的其它信息如下。从2014020697-P7R1(SED ID NO:15)材料进行后续传代(8到19)。与2014020697-P7R1相比，2014020697-P8R1共同序列在氨基酸层面未显示任何变化。接着，2014020697-P8R1进一步传代到2014020697-P11R1，在后代11到14之间的各步骤处进行纯系选择，接着传代到2014020697-P18R1，同时收集大量材料以进行临床试验。2014020697-P18R1 G8b和2014020697-P18R1 F6a的开放阅读框架氨基酸序列分别显示为图22B(SEQ ID NO:23-28)和22C(SEQ ID NO:29-34)，并且2014020697-P18R1 G8b和201402697-P18R1 F6a的相应全长核苷酸序列分别显示为图23B(SEQ ID NO:36)和23C(SEQID NO:37)。报道2014020697-P18R1 F6a的重大和成功的临床结果。在这方面，参见实例5和6，其显示这些疫苗材料的显著安全性和交叉保护功效。
还应注意，图24和表2中还报道“第7代”2014020697-P7，谱系1(SEQ ID NO:62)和“第60代”2014020697-P60第60代，谱系1(SEQ ID NO:39)氨基酸序列突变信息，并且其中公开负责这种材料的安全性和功效的突变。关于2014020697-P38(SEQ ID NO:78)，2014020697-P60的前驱体，由实例5和6中报道的临床数据以及来自比较引起灭毒的2014020697-P7变异体菌株内的突变的实例2的临床数据和讨论，还可以显而易见所述材料也是安全和有效的交叉保护疫苗的极佳候选物。
实例5
(双剂量研究)在毒性PEDV攻击后在约1日龄和21日龄经口给予的PEDV INDEL病毒 的安全性和交叉保护
本研究的目标是测定当在3(+/-2)日龄(第0天)和第21天经口给予猪崽，接着在第35(+/-2)天进行毒性PEDv攻击时，来源于PED的变异体(INDEL)菌株USA/IL/2014-20697的PEDV分离物的特异性灭毒后代的安全性和交叉保护。通过在第0天和第21天接种后的死亡和与PEDv相关的临床症状的发生率来测定安全性。通过攻击后与毒性PEDv相关的死亡和临床症状的发生率来测定交叉保护的迹象。所测试的病毒是由以下DNA序列编码的病毒：(a)SEQ ID NO:36(称为纯系G6b，其在其第18代与第19代之间保持不变化)；(b)SEQ ID NO:37(称为纯系F6，其在其第18代与第19代之间保持不变化)；以及(c)来自其USA/IL/2014-2069祖先，第38代(SEQ ID NO:78)的后代的不同集合。应注意，SEQ ID NO:36和37仅在多蛋白1a/1b的编码氨基酸位置551处彼此不同，在位置551处是L或P(参见SEQ ID NO:46中紧接在DAT之后)。
活的灭毒物的接种剂量(对照物是仅培养基)是1×104TCID50，使用每次经口给药2ML。“TCID50”是指“组织培养物感染性剂量”并且被定义为感染50％给定批次接种细胞培养物所需的病毒稀释度。多种方法可用于计算TCID50，包括在整个本说明书中利用的斯皮尔曼-卡勃方法。斯皮尔曼-卡勃方法的描述参见B.W.Mahy和H.O.Kangro,《病毒学方法指南》,第25-46页(1996)。
实际攻击材料(具有1×105TCID50/5ML剂量的浓度)与USA/科罗拉多/2013，GenBank寄存编号KF272920紧密相关，尤其是来自明尼苏达大学兽医学诊断实验室(University of Minnesota Veterinary Diagnostic Laboratory)的当代北美传染病分离物，寄存号D13-031630，其来自爱荷华州的农场，是活的材料。样品对轮状病毒A、B和C、TGE、艰难梭菌(Clostridium difficile)毒素和产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)呈阴性。
通过RTqPCR分析进行粪便排出的PCR评估，其中对于排出病毒，报道值是35时为阴性(与对照物相同)，并且小于35的值是阳性。报道的数目是用于检测的循环的数目，其中35是声明无检测结果的最大数字。所遵循的方案通常以其它方式在说明书中陈述，并且如下类似地实现。在3毫升DMEM培养基中收集粪便拭子并且在-80℃下储存直到使用。样品在4℃下解冻并且通过涡旋5秒来混合。从试管移出一毫升样品并且置放于96孔方块中，并且在3200rpm下离心10分钟以使粪便颗粒材料沉降。根据制造商说明，在Qiagen QIAsymphonyAutomated Robot上使用Qiagen DSP病毒/病原体微型试剂盒或在QIA cube HT机器上使用Qiagen cador Pathogen 96试剂盒，使用两百微升粪便样品上清液进行核酸提取。使用Path-ID多工单步骤RT-PCR试剂盒(Applied Biosystems/Life Technologies)和PEDV N-基因引物和探针，通过RT-QPCR分析测定循环临界值。PEDV正向引物：PEDV N基因-F 5'-GAATTCCCAAGGGCGAAAAT-3'，在[100μM]下，反向引物：PEDV N基因-R 5'-TTTTCGACAAATTCCGCATCT-3'，在[100μM]下，PEDV探针6FAM 5'-CGTAGCAGCTTGCTTCGGACCCA3'TAMRA。用PEDV N-基因PCR扩增子产生标准曲线并且使用Ct值基于标准曲线测定各样品的复本数值。括弧中报道的值显示每个组中对病毒呈阳性的猪崽数作为分子，其中分母显示在所指示天数时所述具体组中剩余的猪崽总数(尚未处死用于尸检)。结果如下：
注意到(表7)，第38代材料有助于少量早期死亡率，随后并不明显，但产生其后续第60代(SEQ ID NO:66)以缓解这种情况。
参考表8，通过PCR测量粪便排出。参看对照值“35”(未排出)，可发现与仅接收培养基作为接种物的受攻击的对照物相比，所有纯系皆保护猪崽。应注意，纯系F6a的保护作用大于纯系G8b，符合这种纯系中存在的完全独特脯氨酸残基(Orf1a/b蛋白质的位置551)。
类似地，如表9中所示(再次与未经接种的对照物相比)，在攻击后，所有3种病毒分离物基本上阻止排出，其中F6a纯系再次显示比纯系G8b更好的结果。
表7.通过时间点反映的累计死亡(总动物死亡/百分比)
表8.攻击后猪崽中的粪便排出(RTqPCR(阳性猪数目/总猪数目))
表9.攻击后的排出持续时间(平均阳性天数(范围))
实例6
日龄猪崽中单次给药功效和安全性
对应于SEQ ID NO:36(纯系G8b)和SEQ ID NO:37(纯系F6a)(由其编码)的经灭毒的PEDV病毒显示作为疫苗的显著功效，提供随后用毒性北美原型病毒(由例如USA/科罗拉多/2013表示，GenBank寄存编号KF272920)进行的攻击的交叉保护。这类保护是仅由疫苗的单次给药实现，所述给药是早在生命中的第1天提供给猪崽，甚至在母体猪未经PEDV处理时，即血清反应呈阴性，既未暴露于野生型病毒也未被接种。这种功效水平在接种大母猪和猪崽时如何管理猪操作方面赋予生产商极大的灵活性，并且还赋予生产商对大母猪畜群或猪崽进行接种而不在接种之前进行用于测定任何动物的血清状况的分析法的能力。这些结果是重要的，因为PEDV感染的病理学在猪崽出生时最严重，并且随动物年龄增长而降低(如接种需求或值)。应注意，与母体大母猪在猪崽出生之前血清反应呈阳性或血清反应呈阴性无关，合并有SEQ ID NO:36和37病毒的疫苗是适用的，并且与母体猪是否先前被野生型菌株(一种疫苗菌株)(包括由猪崽感染)感染或用活的或经杀灭的疫苗接种(在任一种情况下一次或多次，包括育种前和生育前)无关，初乳衍生的母体抗体不会阻止本发明的疫苗有效。如果需要，还可以由生产商对猪崽进行第二次给药。
相应地，适用于本发明的实践的接种程序的代表性实例包括：治疗或预防猪崽中由PEDV引起的疾病的方法，其包含在所述猪崽是约1-7日龄时给予所述猪崽第一剂量的疫苗组合物，此外或任选地，在猪崽是约2-5周龄时给予第二剂量的所述疫苗。与给予猪崽1或2次给药无关，在替代方案中，母体猪可在育种前或生育前或所述两个时间点接种，与母体猪是否已经血清反应呈阳性(如由先前感染引起)无关。如上文提及，或者，母体猪血清反应呈阴性。
因此，本研究的目标是测定当在1日龄(第0天)经口给予猪崽，接着在第21天(22日龄)进行毒性PEDv攻击时，来源于PED的变异体(INDEL)菌株USA/IL/2014-20697的两种经传代的PEDV分离物(SEQ ID NO:36和37)的安全性和交叉保护。将通过接种后与PEDv相关的死亡和临床症状的发生率来测定安全性。通过攻击后与毒性PEDv相关的死亡和临床症状以及肠病灶的发生率来测定交叉保护的迹象。
接种剂量(对照物是仅培养基)是1×104TCID50，使用每次经口给药2ML。“TCID50”是指“组织培养物感染性剂量”并且被定义为感染50％给定批次接种细胞培养物所需的病毒稀释度。多种方法可用于计算TCID50，包括在整个本说明书中利用的斯皮尔曼-卡勃方法。斯皮尔曼-卡勃方法的描述参见B.W.Mahy和H.O.Kangro,《病毒学方法指南》,第25-46页(1996)。
每组中的猪崽进一步被指定三种结果中的一种，在第6天处死以进行尸检、在第28天处死以进行尸检或猪崽完成研究并且报道超过第40天。
实际攻击材料(具有1×105TCID50/5ML剂量的浓度)与USA/科罗拉多/2013，GenBank寄存编号KF272920紧密相关，尤其是来自明尼苏达大学兽医学诊断实验室(University of Minnesota Veterinary Diagnostic Laboratory)的当代北美传染病分离物，寄存号D13-031630，其来自爱荷华州的农场。样品对轮状病毒A、B和C、TGE、艰难梭菌毒素和产气荚膜梭菌呈阴性。
代表性结果由下表中的粪便排出分数提供。从第0天(即1日龄，用经G8b或F6a灭毒的病毒接种的日期)计算以下日期
表10.毒性攻击后猪崽中的粪便排出[RTqPCR(阳性猪数目/总猪数目)]
表10.毒性攻击后猪崽中的粪便排出[RTqPCR(阳性猪数目/总猪数目)]
通过RTqPCR分析进行粪便排出的PCR评估，其中对于排出病毒，报道值是40时为阴性(与对照物相同)，并且小于40的值是阳性。报道的数目是用于检测的循环的数目，其中40是声明未检测的最大数字。所遵循的方案通常以其它方式在说明书中陈述，并且如下类似地实现。在3毫升DMEM培养基中收集粪便拭子并且在-80℃下储存直到使用。样品在4℃下解冻并且通过涡旋5秒来混合。从试管移出一毫升样品并且置放于96孔方块中，并且在3200rpm下离心10分钟以使粪便颗粒材料沉降。根据制造商说明，在Qiagen QIAsymphonyAutomated Robot上使用Qiagen DSP病毒/病原体微型试剂盒或在QIA cube HT机器上使用Qiagen cador Pathogen 96试剂盒，使用两百微升粪便样品上清液进行核酸提取。使用Path-ID多工单步骤RT-PCR试剂盒(Applied Biosystems/Life Technologies)和PEDV N-基因引物和探针，通过RT-QPCR分析测定循环临界值。PEDV正向引物：PEDV N基因-F 5'-GAATTCCCAAGGGCGAAAAT-3'，在[100μM]下，反向引物：PEDV N基因-R 5'-TTTTCGACAAATTCCGCATCT-3'，在[100μM]下，PEDV探针6FAM 5'-CGTAGCAGCTTGCTTCGGACCCA3'TAMRA。用PEDV N-基因PCR扩增子产生标准曲线并且使用Ct值基于标准曲线测定各样品的复本数值。因此，括弧中报道的值显示每个组中对病毒呈阳性的猪崽数作为分子，其中分母显示在所指示天数时所述具体组中剩余的猪崽总数(尚未处死用于尸检)。第27天和第30天的结果显示极高数目的攻击(但未接种)对照物正在排出病毒，而用灭毒物G8b和F6a接种的猪崽明显受到更好的保护。
实例7
概述
2013年4月美国(U.S.)第一次检测出猪流行性腹泻病毒(PEDV)[1]。当前已经发现至少两种基因上不同的PEDV菌株并且在美国猪中共同传播(美国PEDV技术原型菌株和S-INDEL-变异体菌株)[2-4]。在先前研究中，我们以实验方式确认在5日龄猪崽中美国S-INDEL-变异体菌株的病原性比美国技术原型菌株低[5]。然而，PEDV的致病性可能与年龄相关[6-7]。当前研究的目标是1)评估两种美国PEDV菌株在断奶猪中的发病机理差异；以及2)检验断奶猪中两种菌株之间的交叉保护功效。
材料和方法
从常规饲养农场购买八十五只3周龄猪并且运送到爱荷华州大学实验室动物来源机构。全部猪在到达时肌肉内注射剂量并且通过直肠拭子上的病毒特异性PCR确认PEDV、猪δ冠状病毒和传染性胃肠炎病毒阴性并且通过血清样品的病毒特异性间接荧光抗体(IFA)分析法确认PEDV抗体阴性。
猪按体重分批，并且接着随机分成7个组，每组15或10只猪(表11)。猪在第0天(D0)用病毒阴性培养基(N)、PEDV技术原型分离物USA/IN19338/2013-P7(P-技术原型菌株)或PEDV S-INDEL-变异体分离物USA/IL20697/2014-P7R1(V-变异体菌株)以口胃方式接种，随后在D28攻击。每个点的接种使用每只猪10ml接种物，含有104TCID50/ml病毒接种体。七个组根据第1次接种/第2次接种命名：P/V(15只猪)、V/V(15只猪)、N/V(15只猪)、P/P(10只猪)、V/P(10只猪)、N/P(10只猪)、N/N(10只猪)。
表11.实验设计.
注意：
P＝技术原型PEDV分离物USA/IN19338/2013；V＝变异体PEDV分离物USA/IL20697/2014；N＝阴性培养基。
接种物：104TCID50/ml，每只猪10ml技术原型或变异体分离物；或每只猪10ml培养基用于阴性对照。
在D4，对来自P/V、V/V和N/V组的五只猪进行尸检，比较两种PEDV菌株之间的肉眼损害和微观病灶。第2次接种之后6天(D34)对来自全部7个组的五只猪进行尸检，就肉眼损害和微观病灶评估交叉保护功效。每组的剩余5只猪保持到第2次接种之后4周(D56)来评估病毒排出和攻击后抗体反应。
记录临床观察结果。在D0、2、4、7、10、14、21、28、30、32、34、38、42、49和56收集直肠拭子并且通过基于定量PEDV N基因的实时RT-PCR测试。在D0、7、14、21、28、35、42、49以及56收集血清样品并且分别通过间接荧光抗体(IFA)分析法和病毒中和(VN)分析法测试使用两种PEDV菌株作为指示剂病毒。收集小肠用于组织病理学评估和免疫组织化学(IHC)染色。
使用一般化线性混合(GLIMMIX)模型使用统计分析***(SAS)版本9.3(SASinstitute,Cary,NC)分析各组的病毒排出效价Log10(gc/ml)、IFA和VN Ab效价、临床观察分数、病理学评分、绒毛高度比隐窝深度(VH/CD)比率差异。在D0-D28期间，N/N、N/V和N/P组接收相同接种物并且在相同的处理情况下进行分析，V/V和V/P组以及P/V和P/P组类似。在统计分析之前，将IFA效价转换成log2([IFA效价]/10)，并且将VN效价转换成log2(VN效价)。P值<0.05定义为统计显著差异。
结果
在3周龄猪中进行美国PEDV技术原型菌株和S-INDEL-变异体菌株的发病机理比较。在D0-D28期间，7组猪分为3类：P菌株接种(P/V和P/P组)、V菌株接种(V/V和V/P组)以及阴性培养基接种(N/V、N/P以及N/N组)。
在3周龄猪中第1次接种(D0)之后，用P菌株(P/V和P/P)接种的两组在D2和D4之间产生半水泻到水泻；用V菌株接种的一个组(V/P)在D2-D4期间具有轻度软粪便并且用V菌株接种的其它组(V/V)在D5到D7产生水泻。对于在第1次接种时用病毒阴性培养基接种的其它3组(N/N、N/V和N/P)，在D28之前没有观察到腹泻。
如图28中所显示，如通过定量PEDV rRT-PCR所测试，阴性对照猪(N/N、N/V和N/P组)在D0-D28期间在直肠拭子中没有排出任何病毒。P菌株接种的组(P/V和P/P)中的粪便排出在D4达到峰值水平，接着逐渐下降。相比之下，V菌株接种的组(V/V和V/P)中的粪便排出在前几天逐渐增加并且在D7达到峰值水平。在D0-D28，与用V菌株接种的猪(V/V和V/P组)相比，用P菌株接种的猪(P/V和P/P组)整体在粪便中排出显著较高量的病毒(P＝0.0396)。
来自P菌株接种(P/V组)、V菌株接种(V/V组)和阴性培养基接种(N/V组)的五只猪在D4(第1次接种之后4天)尸检，比较P菌株和V菌株在3周龄猪中引起的宏观和微观病理学损害。P菌株接种的猪中，小肠、盲肠和结肠的平均内容物评分的数值比V菌株和模拟接种的猪高，但差异不显著(图29A)。V菌株和模拟接种的猪的小肠和盲肠的平均肉眼损害评分没有显著不同，但都显著的不如P菌株接种的猪严重(图29A)。P菌株接种的猪的远端空肠和回肠中的绒毛高度比隐窝深度(VH/CD)比率显著低于V菌株猪，表明P菌株引起的绒毛萎缩比V菌株更严重(图30A)。在V菌株组和模拟接种组之间，远端空肠和回肠的平均VH/CD比率没有显著不同(图30A)。
对于D4的IHC染色，P菌株接种的猪在远端空肠和回肠中的对应平均IHC评分是4和4，这显著高于V菌株接种的猪，其在远端空肠和回肠中的对应平均IHC评分分别是1.4和1.4(图29B)。有趣的是，在用P菌株接种的3只猪(评分1、1和2)的盲肠上皮细胞和1只猪(评分1)的结肠上皮细胞中还观察到PEDV IHC染色。V菌株接种的猪的盲肠和结肠中没有观察到PEDV IHC染色。模拟接种的猪的任何组织(小肠、盲肠和结肠)中都没有观察到PEDV IHC染色。
在年龄是7周的猪中进行美国PEDV技术原型菌株和S-INDEL-变异体菌株的发病机理比较。在D28在第2次接种之后(当时猪的年龄是7周)，对N/V、N/P和N/N组进行比较来评估年龄是7周的断奶猪中P菌株和V菌株的发病机理。
第2次接种之后，N/P和N/N组没有腹泻，而N/V组在D33-D38(第2次接种之后5-10天)期间产生水泻。D28到D56，从N/N组的直肠拭子没有检测到任何病毒。在D28-D56期间，与N/P组相比，N/V组的直肠拭子中整体排出显著较高水平的病毒(P＝0.0359)(图28)。
对在D34(第2次接种之后6天)尸检的来自N/N、N/V和N/P组的五只猪进行比较，评估P菌株和V菌株在年龄是7周的猪中引起的宏观和微观病理学损害。整体来说，全部三组猪中的宏观病理学改变很细微。P菌株和模拟接种的猪之间小肠、盲肠和结肠的平均内容物评分类似，但显著低于V菌株接种的猪(图29B)。P菌株、V菌株和模拟接种的猪之间的小肠中的平均肉眼损害评分没有显著不同(图29B)；但V菌株接种的猪的盲肠和结肠中的平均肉眼损害评分显著高于P菌株和模拟接种的猪(图29B)。在D34，N/V组的远端空肠和回肠中的VH/CD比率的数值比N/N和N/P组低，但差异不显著(图31A)。
在D34，仅N/V组的远端空肠、回肠和盲肠和N/P组的盲肠呈PEDV IHC染色阳性。N/V组在远端空肠和回肠中的平均IHC评分比N/P和N/N组显著高(图31B)。
交叉保护功效的评估在D28的第2次接种之后，对7个组(P/V、V/V、N/V、P/P、V/P、N/P和N/N)进行比较来评估先前暴露(D0的第1次接种)对随后攻击(D28的第2次接种)的结果的作用。
第2次接种(D28)之后，仅在D33和D38之间在V/V和N/V组中观察到水泻，并且任何其它基团都没有观察到腹泻。
在D28的第2次接种之后比较7个组的粪便病毒排出(图1)。对于用V菌株攻击的3个组，P/V和V/V组在D28-D56期间整体排出类似量的病毒(P＝0.9422)；但P/V和V/V组排出的病毒的量显著低于N/V组(P<0.0001)。对于用P菌株攻击的3个组，在D28-D56期间，V/P和P/P组排出的病毒的量显著低于N/P组(P<0.0001)，而V/P组在D34比其它天排出明显更高量的病毒，其在D28到D56比P/P组排出显著更多病毒(P＝0.0001)。
在D34(攻击之后6天)，用V菌株攻击的3个组(N/V、V/V和P/V组)中，仅在N/V组中观察到一些微小宏观病理学改变，但在V/V和P/V组中不明显。N/V、V/V和P/V组之间的小肠中的平均内容物评分和器官损害没有显著不同。但V/V和P/V组中的盲肠和结肠中的平均内容物评分以及结肠中的平均损害评分显著低于N/V组(图29B)。V/V和P/V组的远端空肠和回肠中的平均VH/CD比率的数值高于N/V组；然而，仅在N/V和V/V组的远端空肠和回肠VH/CD比率以及V/V和P/V组的远端空肠VH/CD比率中观察到显著差异(图31A)。V/V组和P/V组在远端空肠和回肠中的平均IHC评分都比N/V组显著低(图31B)。
在D34，在用P菌株攻击的3个组(N/P、V/P和P/P组)中，任何组中的宏观和细微病理学改变都不明显并且任何组之间都没有观察到平均内容物评分和组织损害(图29B)、平均VH/CD比率(图31A)或平均IHC评分(图31B)的显著差异。
抗体反应
第1次接种之后，用P菌株(P/P和P/V组)或V菌株(V/V和V/P组)接种的全部猪在D7-D14开始都产生IFA和VN抗体，无论是否使用病毒株作为指示剂病毒(图32A、32B、33A、33B)。全部PEDV接种的组的平均抗体效价在D21和D28达到峰值。这四个组中的PEDV抗体效价在D28攻击之后略微增加，接着保持到研究结束(D56)。N/P和N/V组在D42(第2次接种后14天)之前都是PEDV抗体阴性，在D42时IFA和VN抗体变得可检测并且保持到D56。N/N组在D0-56保持PEDV抗体阴性。
概述
看起来在3周龄猪中美国PEDV技术原型菌株实现的粪便病毒排出水平比S-INDEL-变异体菌株高，但在7周龄猪中观察到相反结果。然而，这个观察结果需要进一步确认来判断技术原型和INDEL疫苗在大龄猪中提供峰值功效的最优年龄。美国PEDV技术原型菌株防止同源和异源菌株在断奶猪中的攻击；美国PEDV S-INDEL-变异体菌株在断奶猪中防止同源菌株攻击和至少部分防止异源(技术原型)菌株攻击。
参考文献
1.Stevenson GW,Hoang H,Schwartz KJ,Burrough EB,Sun D,Madson D,CooperVL,Pillatzki A,Gauger P,Schmitt BJ,Koster LG,Killian ML和Yoon KJ.(2013)。美国猪流行性腹泻病毒的出现：临床症状、病灶和病毒基因组序列(Emergence of porcineepidemic diarrhea virus in the United States:clinical signs,lesions,and viralgenomic sequences),《兽医学诊断研究杂志(Journal of Veterinary DiagnosticInvestigation)》25(5):649-654。
2.Chen Q,Li G,Stasko J,Thomas JT,Stensland WR,Pillatzki AE,Gauger PC,Schwartz KJ,Madson D,Yoon KJ,Stevenson GW,Burrough ER,Harmon KM,Main RG和Zhang J.(2014)。美国与2013年猪疾病爆发相关的猪流行性腹泻病毒的分离和表征(Isolation and characterization of porcine epidemic diarrhea virusesassociated with the 2013disease outbreak among swine in the United States),《临床微生物学杂志(Journal of Clinical Microbiology)》52(1),234-243。
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6.Thomas JT,Chen Q,Gauger PC,Gimenez-Lirola LG,Sinha A,Harmon KM,Madson DM,Burrough ER,Magstadt DR,Salzbrenner H,Welch MW,Yoon KJ,Zimmerman JJ和Zhang J.(2015)。未处理的新生和断奶猪中猪流行性腹泻病毒感染性剂量对感染结果的作用,《科学公共图书馆综合卷》10(10):e0139266。
7.Jung K,Annamalai T,Lu Z和Saif LJ.(2015)。常规9日龄养育猪崽与26日龄断奶猪中美国猪流行性腹泻病毒(PEDV)菌株PC21A的比较性发病机理,《兽医微生物学》178,31-40。
尽管上文已参考公开的实施例和实例描述具体实施例，但这类实施例仅是说明性的并且不限制本发明的范围。一般技术人员可在不脱离本发明的如由以下权利要求定义的更广泛方面的情况下进行变化和修改。
所有公开案、专利和专利文献均以引用的方式并入本文中，如同以引用的方式单独并入一般。已经参考各种特定和优选实施例与技术来描述本发明。然而，应了解在保持在本发明的精神和范围内的同时，可以进行许多变化和修改。
已如此描述了本发明，将显而易见的是其可以多种方式变化。这类变化不应视为偏离本发明的精神和范围。

Claims (61)

1.一种由DNA聚核苷酸编码的经分离的猪流行性腹泻病毒(PEDV)，所述DNA聚核苷酸在核苷酸层面上与SEQ ID NO:67至少95％一致并且包括以下氨基酸特征中的一个或多个：
(a)多蛋白1a/1b的位置551处(紧接在DAT之后)的L或P，如通过参考SEQ ID NO:46测定，或其保守性取代；
(b)刺突蛋白的位置1009处(紧接在NIT之后)的P，如通过参考SEQ ID NO:47测定，或其保守性取代；
(c)刺突蛋白的位置973处(紧接在PFS之后)的H，如通过参考SEQ ID NO:47测定，或其保守性取代；以及
(d)ORF3的编码序列的修饰，其引起ORF3翻译的早期终止。
2.根据权利要求1所述的病毒，其由具有SEQ ID NO:35、36或37中所阐述的序列的聚核苷酸编码。
3.根据权利要求1所述的病毒，其中编码所述病毒的所述DNA聚核苷酸在全长核苷酸层面上与SEQ ID NO:67至少98％一致。
4.根据权利要求1所述的病毒，其中编码所述病毒的所述DNA聚核苷酸在全长核苷酸层面上与SEQ ID NO:67至少99％一致。
5.根据权利要求1所述的病毒，其中编码所述病毒的所述DNA聚核苷酸在全长核苷酸层面上与SEQ ID NO:67至少99.5％一致。
6.根据权利要求1所述的病毒，其中所述ORF3的修饰包含缺失，其产生位置138-143处(紧接在SEQ ID NO:48中的NGKAA之后)的氨基酸LTANPL和位置143之后的所述ORF蛋白质的截短。
7.根据权利要求1所述的病毒，其中所述指定氨基酸中的一个或多个的保守性取代是选自：(1)缬氨酸或异白氨酸取代白氨酸；(2)甘氨酸取代脯氨酸；以及(3)赖氨酸或精氨酸取代组氨酸。
8.一种疫苗组合物，其包含根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒(PEDV)和载剂，其中所述组合物能够保护猪避免PEDV的变异体和原型菌株的攻击以及预防或治疗与PEDV感染相关的一种或多种症状，并且其中保护的实现是通过选自以下组成的组的终点测定：预防或控制脱水、发热、腹泻、呕吐、哺乳性能不良、繁殖性能不良、死亡等PEDV感染症状中的任一种，和预防或控制体重减轻或增重失败。
9.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其中所述病毒是活的或经杀灭的。
10.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其中所述载剂是稀释剂。
11.根据权利要求9所述的疫苗组合物，其进一步包含佐剂。
12.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其中所述受保护的猪包括大母猪、小母猪、公猪、肉猪和猪崽中的任一种。
13.根据权利要求12所述的疫苗组合物，其中所述疫苗在单次给药程序中有效。
14.根据权利要求12所述的疫苗组合物，其中所述疫苗在两次给药程序中有效。
15.根据权利要求14所述的疫苗组合物，其中所述第一次给药是在猪崽为约1-7日龄时给予，并且第二次给药是在猪崽为2-5周龄时给予。
16.根据权利要求13所述的疫苗组合物，其中所述单次给药是在约1-21日龄，优选在约1-7日龄时给予。
17.根据权利要求8中任一权利要求所述的疫苗组合物，其中所述最小有效剂量在约10与约106log10TCID50之间。
18.根据权利要求11所述的疫苗组合物，其中所述佐剂是溶解于油中的去油化卵磷脂，通常是轻液链烷烃和氢氧化铝。
19.根据权利要求11所述的疫苗组合物，其中所述佐剂是CpG/DEAE-聚葡萄糖/矿物油(TXO)。
20.一种经分离的猪流行性腹泻病毒(PEDV)，其由在全长核苷酸层面上与SEQ ID NO:37至少90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的核苷酸序列编码，其中所述核苷酸序列包含以下中的一个：(1)ORF1a/1b蛋白质，其在其对应于SEQ ID NO:46中的位置551(紧接在DAT之后)的氨基酸位置具有脯氨酸残基；和(2)刺突蛋白，其在其对应于SEQ ID NO:47中的位置973(紧接在PFS之后)的氨基酸位置具有组氨酸残基。
21.一种治疗或预防猪崽中由PEDV引起的疾病的方法，其包含在所述猪崽是约1-7日龄时给予所述猪崽第一剂量的根据权利要求8所述的疫苗组合物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述给药进一步包括在所述猪崽是约2-5周龄时给予第二剂量的所述疫苗。
23.根据权利要求22所述的方法，其中给予所述猪崽2次给药，并且母体猪，尽管在育种前接种，但不在生育前接种。
24.根据权利要求22所述的方法，其中给予所述猪崽2次给药，并且所述母体猪在生育前接种。
25.一种治疗或预防猪崽中由PEDV引起的疾病的方法，其包含在所述猪崽是约1-7日龄时给予所述猪崽单次有效剂量的根据权利要求8所述的疫苗组合物，其中所述母体猪未经PEDV处理，并且未在任何时间接种。
26.一种全长RNA聚核苷酸，其对应于根据权利要求1所述的编码DNA聚核苷酸，或其补体。
27.根据权利要求27所述的RNA聚核苷酸，其是感染性纯系。
28.一种质体或细菌人工染色体，其包含根据权利要求1所述的编码DNA聚核苷酸。
29.一种活的经灭毒的病毒组合物，其包含：
经传代的***缺失变异体菌株猪流行性腹泻病毒(PEDV)，和
载剂，
其中所述经传代的***缺失变异体菌株用以下氨基酸取代或缺失中的一个或多个编码以下蛋白质中的一个或多个或其保守性修饰变异体：
如通过参考SEQ ID NO:46、其相应同系物或其保守性取代测定的PEDV刺突蛋白的位置633处的赖氨酸(K)(紧接在KPL之后的K)、位置884处的精氨酸(R)(紧接在DPA之后的R)、位置959处的丙氨酸(A)(紧接在GGM之后的A)、位置345处的缬氨酸(V)(紧接在LSF之后)、位置48处的白氨酸(L)(紧接在AVV之后的L)、位置1225处的天冬氨酸(D)(紧接在SLV之后的D)、位置973处的组氨酸(H)(紧接在PFS之后的H)和位置1272处的酥氨酸(T)(紧接在FNA之后的T)；
如通过参考SEQ ID NO:48、其相应同系物或其保守性取代测定的PEDV ORF 3蛋白质的位置189处白氨酸(L)(紧接在NPL之后的L)的缺失、138-144(紧接在KAA之后)的缺失、位置8处酪氨酸(Y)(紧接在LFO之后的Y)的缺失和位置174-189(紧接在LAI之后)的缺失；
如参考SEQ ID NO:51、其相应同系物或其保守性取代测定的PEDV核衣壳蛋白的位置27处的组氨酸(H)(紧接在VTN之后的H)；
如通过参考SEQ ID NO:46、其相应同系物或其保守性取代测定的PEDV多蛋白1a/1b的位置1591处的甲硫氨酸(M)(紧接在KVS之后的M)、位置5087处的丝氨酸(S)(紧接在FST之后的S)和位置6138处的S(紧接在TFS之后的S)；
如通过参考SEQ ID NO:49、其相应同系物或其保守性取代测定的PEDV包膜蛋白的位置62处的苯丙氨酸(F)(紧接在VYK之后的F)；以及
如通过参考SEQ ID NO:45、其相应同系物或其保守性取代测定的PEDV膜蛋白的位置5处的丙氨酸(紧接在SNG之后的A)和位置183处的异白氨酸(I)(紧接在YGG之后的I)。
30.根据权利要求1所述的活的经灭毒的病毒组合物，其中所述经传代的***缺失变异体菌株编码以下具有所示氨基酸取代的蛋白质或其保守性修饰变异体：
PEDV刺突蛋白(例如SEQ ID NO:47)的位置633处的K(紧接在KPL之后的K)；和
PEDV ORF 3蛋白质(SEQ ID NO:48)的位置189处的L(紧接在NPL之后的L)的缺失。
31.根据权利要求1所述的活的经灭毒的病毒组合物，其中所述经传代的***缺失变异体菌株编码以下具有所示氨基酸取代的蛋白质或其保守性修饰变异体：
PEDV刺突蛋白(SEQ ID NO:47)的位置633处的K(紧接在KPL之后的K)和位置884处的R(紧接在DPA之后的R)；
PEDV ORF 3蛋白质(SEQ ID NO:48)的位置189处的L(紧接在NPL之后的L)的缺失。
32.根据权利要求1所述的活的经灭毒的病毒组合物，其中所述经传代的***缺失变异体菌株编码以下具有所示氨基酸取代的蛋白质或其保守性修饰变异体：
PEDV刺突蛋白(SEQ ID NO:47)的位置884处的R(紧接在DPA之后的R)和位置959处的A(紧接在GGM之后的A)；
PEDV ORF 3蛋白质(SEQ ID NO:48)的位置189处的L(紧接在NPL之后的L)的缺失。
33.根据权利要求1所述的活的经灭毒的病毒组合物，其中所述经传代的***缺失变异体菌株编码以下具有所示氨基酸取代的蛋白质或其保守性修饰变异体：
PEDV刺突蛋白(SEQ ID NO:47)的位置48处的L(紧接在AVV之后的L)、位置345处的V(紧接在LSF之后)、位置884处的R(紧接在DPA之后的R)以及位置959处的A(紧接在GGM之后的A)；
PEDV ORF 3蛋白质(SEQ ID NO:48)的138-144(紧接在KAA之后)的缺失和189处L(紧接在NPL之后的L)的缺失；和
PEDV核衣壳蛋白(SEQ ID NO:51)的位置27处的H(紧接在VTN之后的H)。
34.根据权利要求1所述的活的经灭毒的病毒组合物，其中所述经传代的***缺失变异体菌株编码以下具有所示氨基酸取代的蛋白质或其保守性修饰变异体：
PEDV刺突蛋白(SEQ ID NO:47)的位置884处的R(紧接在DPA之后的R)、位置959处的A(紧接在LIGGM之后的A)和位置1225处的D(紧接在SLV之后的D)；
PEDV ORF 3蛋白质(SEQ ID NO:48)的位置8处的Y(紧接在LFO之后的Y)的缺失、138-144(紧接在KAA之后)的缺失和位置174-189(紧接在LAI之后)的缺失；
PEDV多蛋白1a/1b(SEQ ID NO:46)的位置1591处的M(紧接在KVS之后的M)、位置5087处的S(紧接在FST之后的S)和位置6138处的S(紧接在TFS之后的S)；
PEDV包膜蛋白(SEQ ID NO:49)的位置62处的F(紧接在VYK之后的F)；以及
PEDV膜蛋白的位置183处的I(紧接在YGG之后的I)。
35.根据权利要求36所述的菌株，其中所述菌株包括具有SEQ ID NO:40、41、42、43、44或45的氨基酸序列的蛋白质或其保守性修饰变异体。
36.根据权利要求1所述的活的经灭毒的病毒组合物，其中所述经传代的***缺失变异体菌株编码以下包含所示氨基酸取代的蛋白质或其保守性修饰变异体：
PEDV刺突蛋白(SEQ ID NO:47)的位置884处的R(紧接在DPA之后)、位置959处的A(紧接在LIGGM之后)、位置973处的H(紧接在PFS之后的H)和位置1225处的D(紧接在SLV之后的D)；
PEDV ORF 3蛋白质(SEQ ID NO:48)的位置8处的Y(紧接在LGLFO之后的Y)的缺失、138-144(紧接在KAA之后)的缺失和位置174-189(紧接在LYLAI之后)的缺失，
PEDV多蛋白1a/1b(SEQ ID NO:46)的位置1591处的M(紧接在KVS之后的M)、位置5087处的S(紧接在FST之后的S)和位置6138处的S(紧接在TFS之后的S)；
PEDV包膜蛋白(SEQ ID NO:49)的位置62处的F(紧接在VYK之后的F)；以及
PEDV膜蛋白的位置5处的A(紧接在SNG之后的A)和位置183处的I(紧接在YGG之后的I)。
37.根据权利要求1所述的活的经灭毒的病毒组合物，其中所述经传代的***缺失变异体菌株编码以下包含所示氨基酸取代的蛋白质或其保守性修饰变异体：
PEDV刺突蛋白(SEQ ID NO:47)的位置48处的L(紧接在AVV之后)、位置345处的V(紧接在LSF之后)和位置1272处的T(紧接在FNA之后的T)；
PEDV包膜蛋白(SEQ ID NO:49)的位置62处的S(紧接在VYK之后的S)；以及
PEDV核衣壳蛋白(SEQ ID NO:51)的位置27处的H(紧接在VTN之后的H)。
38.一种疫苗组合物，其包含活的经灭毒的变异型猪流行性腹泻病毒(PEDV)和载剂，其中所述菌株编码权利要求30中枚举的取代或缺失中的一个或多个或其保守性变异体，其中所述组合物能够保护猪避免PEDV的变异体和原型菌株的攻击以及预防或治疗与PEDV感染相关的一种或多种症状，并且其中所述保护是通过选自以下组成的组的终点评估：脱水、发热、腹泻、呕吐、哺乳性能不良、繁殖性能不良、死亡，以及预防或控制体重减轻或增重失败。
39.根据权利要求30所述的疫苗组合物，其中所述载剂是稀释剂。
40.根据权利要求40所述的疫苗组合物，其中所述稀释剂是无菌稀释剂。
41.根据权利要求40所述的疫苗组合物，其进一步包含佐剂。
42.根据权利要求39所述的疫苗组合物，其中所述受保护的猪包括大母猪、小母猪、公猪、肉猪和猪崽中的任一种。
43.根据权利要求43所述的疫苗组合物，其在1日龄或更大的猪崽中有效。
44.根据权利要求44所述的疫苗组合物，其中所述疫苗在单次给药程序中有效。
45.根据权利要求44所述的疫苗组合物，其中所述疫苗在两次给药程序中有效。
46.根据权利要求46所述的疫苗组合物，其中所述第一次给药是在猪崽为约1-7日龄时给予，并且第二次给药是在猪崽为2-5周龄时给予。
47.根据权利要求10中任一权利要求所述的疫苗组合物，其中所述最小有效剂量在约10与约106log10TCID50之间。
48.根据权利要求42所述的疫苗组合物，其中所述佐剂是溶解于油中的去油化卵磷脂，通常是轻液链烷烃和氢氧化铝。
49.根据权利要求42所述的疫苗组合物，其中所述佐剂是CpG/DEAE-聚葡萄糖/矿物油(TXO)。
50.一种疫苗组合物，其包含活的经灭毒的变异型猪流行性腹泻病毒(PEDV)和载剂，其中所述组合物能够保护猪避免PEDV的变异体和原型菌株的攻击以及预防或治疗与PEDV感染相关的一种或多种症状，并且其中保护的实现是通过选自以下组成的组的终点测定：预防或控制脱水、发热、腹泻、呕吐、泌乳性能不良、繁殖性能不良、死亡等PEDV感染症状中的任一种，以及预防或控制体重减轻或增重失败，其中所述疫苗组合物中使用的病毒与PEDVSEQ ID NO:39或SEQ ID NO:59至少90％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
51.一种治疗或预防猪崽中由PEDV引起的疾病的方法，其包含在所述猪崽为约1至7日龄时给予所述猪崽第一剂量的根据权利要求39所述的疫苗组合物，和任选地，在所述猪崽为约2-5周龄时给予第二剂量的所述疫苗。
52.根据权利要求52所述的方法，其中给予所述猪崽2次给药，并且母体猪，尽管在育种前接种，但不在生育前接种。
53.根据权利要求52所述的方法，其中给予所述猪崽1次给药，并且所述母体猪在育种前和生育后接种。
54.一种治疗或预防猪崽中由PEDV引起的疾病的方法，其包含在生育前或育种前第一次给予所述猪崽的母猪根据权利要求39所述的疫苗组合物，随后在出生之后给予所述猪崽一次或多次剂量的所述疫苗组合物。
55.一种预防健康猪中由PEDV引起的疾病的方法，其包含用根据权利要求39所述的疫苗组合物对所述猪进行第一次接种，接着每年或在生育前给予其它剂量的失活的PEDV疫苗。
56.根据权利要求30所述的组合物，其中所述变异型***缺失菌株在3周龄猪中毒性更强，但在7周龄猪中毒性较弱。
57.一种预防健康猪中由PEDV引起的疾病的方法，其包含在3周龄猪中用原型经灭毒的活的PEDV疫苗组合物对所述猪进行第一次接种，接着用根据权利要求30所述的疫苗组合物在第7周或更大的猪中进行第二次接种。
58.一种疫苗组合物，其包含PEDV的经灭毒的原型传代菌株和载剂，其中所述PEDV的菌株包含核酸序列，其编码在以下位置处具有取代的一种或多种蛋白质：
如通过参考SEQ ID NO:52测定的多蛋白1a/1b的位置814、1076、1564、1896、2310、2600、3247、3473或3522；
如通过参考SEQ ID NO:54测定的刺突蛋白的位置257、326、375、491、881、888、1277、1339或1358；
如通过参考SEQ ID NO:55测定的ORF 3的位置39或更后面位置处的截短；
如通过参考SEQ ID NO:56测定的包膜蛋白的位置69或62；
如通过参考SEQ ID NO:57测定的膜蛋白的位置208；
如通过参考SEQ ID NO:58测定的核衣壳蛋白的位置141、418、424或439。
59.根据权利要求59所述的疫苗组合物，其中所述PEDV的菌株包含以下取代中的一个或多个或其保守性变异体：
如通过参考SEQ ID NO:52测定的多蛋白1a/1b的位置814处的V、位置1076处的A、位置1564处的F、位置1896处的I、位置2310处的H、位置2600处的Y、位置3247处的F、位置3473处的V或位置3522处的R；
如通过参考SEQ ID NO:54测定的刺突蛋白的位置257处的N、位置326处的I、位置375处的F、位置491处的Y、位置881处的R、位置888处的R、位置1277处的F、位置1339处的T或位置1358处的L；
如通过参考SEQ ID NO:55测定的ORF 3的位置39或更后面位置处的截短；
如通过参考SEQ ID NO:56测定的包膜蛋白的位置69处的I；
如通过参考SEQ ID NO:57测定的膜蛋白的位置208处的T；
如通过参考SEQ ID NO:58测定的核衣壳蛋白的位置141处的L、位置418处的Q、位置424处的N或位置439处的I。
60.一种疫苗组合物，其包含活的经灭毒的原型猪流行性腹泻病毒(PEDV)；和载剂
其中所述组合物能够保护猪避免PEDV的变异体和原型菌株的攻击并且预防或治疗与PEDV感染相关的一种或多种症状，并且其中保护的实现是通过选自以下组成的组的终点测定：预防或控制脱水、发热、腹泻、呕吐、泌乳性能不良、繁殖性能不良、死亡等PEDV感染症状中的任一种，以及预防或控制体重减轻或增重失败，其中所述病毒是根据权利要求60所述的菌株。
61.一种预防健康猪中由PEDV引起的疾病的方法，其包含在3周龄猪中用根据权利要求59所述的原型经灭毒的活的PEDV疫苗组合物对所述猪进行第一次接种，接着在第7周或更大的猪中用变异型***缺失病毒的疫苗组合物进行第二次接种。
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