EA024716B1 - Производные 5-(3-аминофенил)-5-алкил-5,6-дигидро-2h-[1,4]оксазин-3-амина - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к новым производным 5-(3-аминофенил)-5-алкил-5,6-дигидро-2H-[1,4]оксазин-3-амина формулы (I)где определения заместителей Rи Ar даны в формуле изобретения, в качестве ингибиторов бета-секретазы, также известной как фермент, расщепляющий предшественник амилоида по бета-сайту, BACE, BACE1, Asp2 или мемапсин2. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим такие соединения, к способам получения таких соединений и композиций и к применению таких соединений и композиций для предупреждения и лечения нарушений, в которые вовлечена бета-секретаза, таких как болезнь Альцгеймера (AD), умеренное когнитивное нарушение, старение, деменция, деменция с тельцами Леви, церебральная амилоидная ангиопатия, слабоумие вследствие множественных инфарктов, синдром Дауна, деменция, ассоциированная с инсультом, деменция, ассоциированная с болезнью Паркинсона, и деменция, ассоциированная с бета-амилоидом.

Description

Настоящее изобретение относится к новым производным 5-(3-аминофенил)-5-алкил-5,6-дигидро2Н-[1,4]оксазин-3-амина в качестве ингибиторов бета-секретазы, также известной как фермент, расщепляющий предшественник амилоида по бета-сайту, ВАСЕ, ВАСЕ1, А§р2 или мемапсин2. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим такие соединения, к способам получения таких соединений и композиций и к применению таких соединений и композиций для предупреждения и лечения расстройств, в которые вовлечена бета-секретаза, таких как болезнь Альцгеймера (АО), умеренное когнитивное нарушение, старение, деменция, деменция с тельцами Леви, церебральная амилоидная ангиопатия, слабоумие вследствие множественных инфарктов, синдром Дауна, деменция, ассоциированная с инсультом, деменция, ассоциированная с болезнью Паркинсона, и деменция, ассоциированная с бета-амилоидом.

Предпосылки изобретения

Болезнь Альцгеймера (АО) представляет собой нейродегенеративное заболевание, ассоциированное со старением. Пациенты с АО страдают дефицитом когнитивных функций и потерей памяти, а также поведенческими проблемами, такими как тревожность. Более 90% пораженных АО имеют спорадическую форму расстройства, тогда как менее 10% случаев являются семейными или наследственными. В Соединенных Штатах приблизительно 1 из 10 людей в возрасте 65 лет имеет АО, тогда как в возрасте 85 лет 1 из каждых двух индивидов поражен АО. Средняя предполагаемая продолжительность жизни от первоначального диагноза составляет 7-10 лет, и пациенты с АО нуждаются во всестороннем уходе или в доме престарелых, что является очень дорогостоящим или осуществляется членами семьи. При возрастающем количестве пожилых людей в популяции АО представляет собой растущую медицинскую проблему. Доступные в настоящее время виды терапии АО обеспечивают лечение лишь симптомов заболевания и включают ингибиторы ацетилхолинэстеразы для улучшения когнитивных свойств, а также анксиолитики и нейролептики для контроля поведенческих проблем, ассоциированных с данной болезнью.

Отличительными патологическими признаками в головном мозге пациентов с АО являются нейрофибриллярные клубки, которые возникают в результате гиперфосфорилирования тау-белка, и амилоидные бляшки, которые образуются в результате агрегации пептида бета-амилоида 1-42 (абета 1-42). Абета 1-42 образует олигомеры и затем фибриллы и, в конечном итоге, амилоидные бляшки. Олигомеры и фибриллы считаются особенно нейротоксичными и могут вызывать большинство нейрологических повреждений, ассоциированных с АО. Средства, которые предупреждают образование абета 1-42, имеют потенциал, чтобы стать средствами, модифицирующими течение заболевания, для лечения АО. Абета 142 образуется из белка-предшественника амилоида (АРР), состоящего из 770 аминокислот. Ν-конец абета 1-42 расщепляется с помощью бета-секретазы (ВАСЕ), и затем гамма-секретаза расщепляет С-конец. В дополнение к абета 1-42 гамма-секретаза также высвобождает абета 1-40, который является преобладающим продуктом расщепления, так же как абета 1-38 и абета 1-43. Эти формы абета также могут агрегироваться с образованием олигомеров и фибрилл. Таким образом, предполагается, что ингибиторы ВАСЕ будут предупреждать образование абета 1-42, а также абета 1-40, абета 1-38 и абета 1-43 и будут являться потенциальными терапевтическими средствами для лечения АО.

В \УО-2011/009943 (ΝοναΠίδ) раскрывают незамещенные и 2-замещенные производные оксазина и их применение в качестве ингибиторов ВАСЕ для лечения нейрологических нарушений. В \УО2011/020806 (НоГГтапп-БаКосНс) раскрывают производные 2,6-незамещенного 3-амино-5-фенил-5,6дигидро-2Н-[1,4]оксазина, характеризующиеся ингибиторными свойствами ВАСЕ1 и/или ВАСЕ2.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к производным 5,6-дигидро-2Н-[1,4]оксазин-3-иламина формулы (I)

а также их стереоизомерным формам, где

К¹ представляет собой фтор, дифторметил или трифторметил;

К² представляет собой водород или трифторметил; или

К¹ и К² образуют двухвалентный радикал =СР₂;

К³ представляет собой С1_-3алкил, циклопропил, моно- или полигалоген-С1_-3алкил;

К⁴ представляет собой водород или фтор;

Аг представляет собой гетероарил;

где гетероарил выбран из группы, состоящей из пиридила и пиримидила, каждый из которых необязательно замещен одним, двумя или тремя заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, циано, С1_-3алкила, С_2-3алкинила, С_4-3алкилокси, моно-и полигалоген-С1_-3алкила, моно- и полигалоген-С1_-3алкилокси и С1_-3алкилоксиС1_-3алкилокси, и их фармацевтически приемлемым солям присоединения.

- 1 024716

Примером настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и любое из соединений, описанных выше. Примером настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, полученная путем смешивания любого из соединений, описанных выше, и фармацевтически приемлемого носителя. Примером настоящего изобретения является способ получения фармацевтической композиции, включающий смешивание любого из соединений, описанных выше, и фаомацевтически приемлемого носителя.

Примером настоящего изобретения являются способы лечения расстройства, опосредованного ферментом бета-секретазой, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества любого из соединений или фармацевтических композиций, описанных выше.

Дополнительным примером настоящего изобретения являются способы ингибирования фермента бета-секретазы, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества любого из соединений или фармацевтических композиций, описанных выше.

Примером настоящего изобретения является способ лечения расстройства, выбранного из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, умеренного когнитивного нарушения, старения, деменции, деменции с тельцами Леви, церебральной амилоидной ангиопатии, слабоумия вследствие множественных инфарктов, синдрома Дауна, деменции, ассоциированной с инсультом, деменции, ассоциированной с болезнью Паркинсона, и деменции, ассоциированной с бета-амилоидом, предпочтительно болезни Альцгеймера, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества любого из соединений или фармацевтических композиций, описанных в данном документе.

Другим примером настоящего изобретения является любое из соединений, описанных выше, для применения в лечении: (а) болезни Альцгеймера, (Ь) умеренного когнитивного нарушения, (с) старения, (б) деменции, (е) деменции с тельцами Леви, (Г) синдрома Дауна, (д) деменции, ассоциированной с инсультом, (й) деменции, ассоциированной с болезнью Паркинсона, и (ί) деменции, ассоциированной с бета-амилоидом, у субъекта, нуждаюшегося в этом.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к соединениям формулы (I), определенным выше в данном документе, и их фармацевтически приемлемым солям и сольватам. Соединения формулы (I) являются ингибиторами фермента бета-секретазы (также известного как фермент, расщепляющий по бета-сайту, ВАСЕ, ВАСЕ1, Азр2 или мемапсин2) и являются применимыми в лечении болезни Альцгеймера, умеренного когнитивного нарушения, старения, деменции, деменции, ассоциированной с инсультом, деменции с тельцами Леви, синдрома Дауна, деменции, ассоциированной с болезнью Паркинсона, и деменции, ассоциированной с бета-амилоидом, предпочтительно болезни Альцгеймера, умеренного когнитивного нарушения или деменции, более предпочтительно болезни Альцгеймера.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения

К¹ представляет собой фтор, дифторметил или трифторметил;

К² представляет собой водород или трифторметил; или

К¹ и К² образуют двухвалентный радикал =СР₂;

К³ представляет собой С_1-3алкил, циклопропил, моно- или полигалоген-С_1-3алкил;

К⁴ представляет собой водород или фтор;

Аг представляет собой гетероарил;

где гетероарил представляет собой пиридил или пиримидил, каждый из которых необязательно замещен одним, двумя или тремя заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, циано, С_1-3алкила, С_2-3алкинила, С_1-3алкилокси, моно- и полигалоген-С_1-3алкила, моно- и полигалоген-С₁₃алкилокси и С_1-3алкилоксиС_1-3алкилокси;

и их фармацевтически приемлемых солей присоединения или сольватов.

В другом варианте осуществления

К¹ представляет собой фтор, дифторметил или трифторметил, и К² представляет собой водород; или

К¹ представляет собой фтор, и К² представляет собой трифторметил; или

К¹ и К² образуют двухвалентный радикал =СР₂;

К³ представляет собой метил или циклопропил;

К⁴ представляет собой водород или фтор;

Аг представляет собой гетероарил;

где гетероарил представляет собой пиридил, замещенный метокси, или пиримидил; и их фармацевтически приемлемые соли присоединения или сольваты.

В другом варианте осуществления атом углерода, замещенный К³, характеризуется Кконфигурацией.

В другом варианте осуществления соединение формулы (I) выбрано из (5Е, 63)- 5-циклопропил-6-фтор-5-{3-I(3-метоксипиридин-2ил)амино)фенил)-6-(трифторметил)-5,6 -дигидро-2Н-1,4-оксазин-3- 2 024716 амина, (5К,6К)- 6-фтор-5 - {2-фтор-5-[(3-метоксипиридин-2 ил)амино]фенил)- 5-метил-5,б-дигидро-2Н-1,4-оксазин-3 -амгна, (5Е) - б -(дифторме тили цен.)-5-{2-фтор-5-[(3-метоксипиридин-2ил)амино]фенил}- 5-метил-5,б-дигидро-2Н-1,4-оксазин-3 - амина/ (5К,6К*)-6- (дифт орметил) - 5 - {2 - фтор - 5- [ (3-ыетоксипиридин-2 ил)а лино]фенил{-5-метил-5,б-дигидро-2Н-1,4-океазин-3-амина/ (5К,6К)- 6-фтор-5 -[2-фтор-5-г пиримидин-2-иламино)феьил]-5метип-5, б-дигидро-2Н-1,4-оксазин-3-амина, (5К,6И)-5 -{2-фтор-5 - [(3-метоксипиридин - 2 -ил)амино]фенил}5-метил-б-(трифтормэтил)- 5,б-дигидро-2Н-1,4-оксазин-3-амина, <5К,6К) -5- [2-фтор-5-ίпиримидин-2-иламиноιфенил]-5-метил-б(трифторметилι-5,6-дигидро-2Н-1,4-оксазин-3 - амина, ί5К,6И)-б-фтор-5-{2-фтор-5- [ ί3-метоксипиразин-2ил)амино]фенил}-5-метил-5,б-дигидро-2Н-1,4-оксазин-3-амина и (5К, 6Е) -5- {2 - фтор - 5 - [ (3 - метоксипиразин - 2-ил) амино ] сменил } 5-метил - б - (трифторметил) -5,6-дигидро-2Н-1,4-оксазин - 3-амина.

Определения.

Галоген будет обозначать фтор, хлор или бром; С_1-3алкил будет обозначать неразветвленную или с разветвленной цепью насыщенную алкильную группу с 1, 2 или 3 атомами углерода, например метил, этил, 1-пропил и 2-пропил; С_1-3алкилокси будет обозначать простой эфирный радикал, где С₁₃алкил является таковым, как определено выше; моно- и полигалогенС_1-3алкил будут обозначать определенный ранее С_1-3алкил, замещенный 1, 2, 3 или, если возможно, большим количеством атомов галогенов, определенных выше; моно- и полигалогенС_1-3алкилокси будут обозначать простой эфирный радикал, где моно- и полигалогенС_1-3алкил является таковым, как определено выше; С_3-6циклоалкил будет обозначать циклопропил, циклобутил, циклопентил и циклогексил; С_3-6циклоалкандиил будет обозначать двухвалентный радикал, такой как циклопропандиил, циклобутандиил, циклопентандиил и циклогександиил.

Используемое в данном документе выражение субъект относится к животному, предпочтительно млекопитающему, наиболее предпочтительно человеку, который является или являлся объектом лечения, наблюдения или эксперимента.

Используемое в данном документе выражение терапевтически эффективное количество означает такое количество активного соединения или фармацевтического средства, которое вызывает биологический или медицинский эффект в системе тканей у животного или человека, желаемый исследователем, ветеринаром, врачом или другим клиницистом, что включает облегчение симптомов заболевания или расстройства, лечение которого осуществляют.

Используемое в данном документе выражение композиция предназначена для охвата продукта, содержащего определенные ингредиенты в определенных количествах, а также любого продукта, который получают, прямо или опосредованно, в результате комбинаций определенных ингредиентов в определенных количествах.

Выше и ниже в данном документе выражение соединение формулы (I) следует понимать как включающее его соли присоединения, сольваты и стереоизомеры.

Выражения стереоизомеры или стереохимически изомерные формы ранее и далее в данном документе используют взаимозаменяемо.

Настоящее изобретение включает все стереоизомеры соединения формулы (I) или в виде чистого стереоизомера, или в виде смеси из двух или более стереоизомеров.

Энантиомеры являются стереоизомерами, которые представляют собой не совпадающие при наложении зеркальные отображения друг друга. Смесь 1:1 пары энантиомеров является рацематом или рацемической смесью. Диастереомеры (или диастереоизомеры) являются стереоизомерами, которые не являются энантиомерами, т.е они не соотносятся как зеркальные изображения. Если соединение содержит двойную связь, заместители могут находиться в Е- или Ζ-конфигурации. Если соединение содержит двузамещенную циклоалкильную группу, заместители могут находиться в цис- или транс-конфигурации. Таким образом, настоящее изобретение включает энантиомеры, диастереомеры, рацематы, Е-изомеры, Ζизомеры, цис-изомеры, транс-изомеры и их смеси.

Абсолютная конфигурация определяется согласно системе Кана-Ингольда-Прелога. Конфигурация при асимметричном атоме определяется или как К, или как 8. Анализируемые соединения, абсолютная конфигурация которых неизвестна, могут быть обозначены как (+) или (-) в зависимости от направления, в котором они вращают плоскость поляризованного света.

Если указан конкретный стереоизомер, это означает, что указанный стереоизомер практически чистый, т.е. связан с менее 50%, предпочтительно менее 20%, более предпочтительно менее 10%, еще более

- 3 024716 предпочтительно менее 5%, в частности менее 2% и наиболее предпочтительно менее 1% других изомеров. Таким образом, если соединение формулы (I), например, указано как (К), то это означает, что соединение практически не содержит δ-изомер; если соединение формулы (I), указано, например, как Е, то это означает, что соединение практически не содержит Ζ-изомер; если соединение формулы (I) указано, например, как цис, это означает, что соединение практически не содержит транс-изомер.

Соединения формулы (I) сосуществуют в динамическом равновесии с таутомерами формулы (1-а)

где Ь представляет собой -ΝΗ-.

Что касается применения в медицине, соли соединений по настоящему изобретению относятся к нетоксичным фармацевтически приемлемым солям. Однако, при получении соединений согласно настоящему изобретению или их фармацевтически приемлемых солей могут быть использованы другие соли. Подходящие фармацевтически приемлемые если соединений включают соли присоединения кислоты, которые можно получать, например, путем смешивания раствора соединения с раствором фармацевтически приемлемой кислоты, такой как соляная кислота, серная кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота, уксусная кислота, бензойная кислота, лимонная кислота, винная кислота, угольная кислота или фосфорная кислота. Кроме того, если соединения по настоящему изобретению несут кислотный фрагмент, их подходящие фармацевтически приемлемые соли могут включать соли щелочных металлов, например соли натрия или калия; соли щелочно-земельных металлов, например соли кальция или магния; и соли, образованные подходящими органическими лигандами, например соли четвертичного аммония.

Типичные кислоты, которые можно использовать при получении фармацевтически приемлемых солей, включают, но без ограничений, следующие: уксусную кислоту, 2,2-дихлоруксусную кислоту, ацилированные аминокислоты, адипиновую кислоту, альгиновую кислоту, аскорбиновую кислоту, Ьаспарагиновую кислоту, бензолсульфоновую кислоту, бензойную кислоту, 4-ацетамидобензойную кислоту, (+)-камфорную кислоту, камфорсульфоновую кислоту, каприновую кислоту, капроевую кислоту, каприловую кислоту, коричную кислоту, лимонную кислоту, цикламовую кислоту, этан-1,2дисульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, 2-гидрокси-этансульфоновую кислоту, муравьиную кислоту, фумаровую кислоту, галактаровую кислоту, гентизиновую кислоту, глюкогептоновую кислоту, Ό-глюконовую кислоту, Ό-глюкуроновую кислоту, Ь-глутаминовую кислоту, бета-оксо-глутаровую кислоту, гликолевую кислоту, гиппуровую кислоту, бромисто-водородную кислоту, хлористо-водородную кислоту, (+)-Ь-молочную кислоту, (+)-ОЙ-молочную кислоту, лактобионовую кислоту, малеиновую кислоту, (-)-Ь-яблочную кислоту, малоновую кислоту, (±)-ОЙ-миндальную кислоту, метансульфоновую кислоту, нафталин-2-сульфоновую кислоту, нафталин-1,5-дисульфоновую кислоту, 1-гидрокси-2нафтойную кислоту, никотиновую кислоту, азотную кислоту, олеиновую кислоту, оротовую кислоту, щавелевую кислоту, пальмитиновую кислоту, памоевую кислоту, фосфорную кислоту, Ьпироглутаминовую кислоту, салициловую кислоту, 4-аминосалициловую кислоту, себациновую кислоту, стеариновую кислоту, янтарную кислоту, серную кислоту, дигалловую кислоту, (+)-Ь-винную кислоту, тиоциановую кислоту, п-толуолсульфоновую кислоту, трифторметилсульфоновую кислоту и ундециленовую кислоту. Типичные основания, которые можно использовать в получении фармацевтически приемлемых солей без ограничения включают следующие: аммиак, Ь-аргинин, бенетамин, бензатин, гидроксид кальция, холин, диметилэтаноламин, диэтаноламин, диэтиламин, 2-(диэтиламино)-этанол, этаноламин, этилендиамин, Ν-метилглюкамин, гидрабамин, 1Н-имидазол, Ь-лизин, гидроксид магния, 4-(2гидроксиэтил)-морфолин, пиперазин, гидроксид калия, 1-(2-гидроксиэтил)-пирролидин, вторичный амин, гидроксид натрия, триэтаноламин, трометамин и гидроксиц цинка.

Названия соединений по настоящему изобретению составлены в соответствии с правилами номенклатуры, согласованными с Химической реферативной службой (САЗ) с использованием программного обеспечения от Абсапссб СЬеш1еа1 Оссс1ортсп1, Отс. (АСЭ/название продукта, версия 10.01; сборка 15494, 1 декабря 2006 г.) или в соответствии с правилами номенклатуры, согласованными с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ЮРАС) с использованием программного обеспечения от Абсапссб СЬстюа1 Осус1ортсп1, Отс. (АСЭ/название продукта, версия 10.01.0.14105, октябрь 2006 г.). В случае таутомерных форм составляли название представленных таутомерных форм структуры. Другие не представленные таутсмерные формы также включены в объем настоящего изобретения.

Получение соединений.

Экспериментальная методика 1.

Конечные соединения в соответствии с формулой (I) можно получить путем взаимодействия промежуточного соединения формулы (II) и соединения формулы (III) в соответствии со схемой реакции (1), реакции, которую проводили в подходящем реакционно-инертном растворителе, таком как, например, изопропанол или 1,4-диоксан, в присутствие подходящей кислоты, такой как, например, Η₂δΟ₄ или НС1,

- 4 024716 при температурных условиях, таких как, например, нагревание реакционной смеси при 100°С, например, в течение 16 ч. Это превращение также можно проводить в присутствие Рб-комплексного катализатора, такого как, например, трис(дибензилиденацетон) дипалладий (0) [СА§ 51364-51-3] в подходящем реакционно-инертном растворителе, таком как, например, 1,4-диоксан, этанол или смеси инертных растворителей, в присутствие подходящего основания, такого как, например, водный К₃РО₄, Ыа₂СО₃ или С§₂СО₃, и подходящего лиганда, такого как, например, 1,1'-бис(дифенилфосфино)-ферроцен [СА§ 12150-46-3], при температурных условиях, таких как, например, нагревание реакционной смеси при 160°С в микроволновом излучении до завершения реакции, например, в течение 1 ч. В схеме реакции (1) все переменные величины определены в формуле (I) и представляет собой галоген, Ь представляет собой -ΝΗ-, все заместители Х1-Х4 представляют собой СН, и Р5 представляет собой водород.

Схема реакции 1

Экспериментальная методика 2.

Конечные соединения в соответствии с формулой (Ι-Ь), где Р³ представляет собой дифторметил и Р⁴ представляет собой водород, можно получить путем каталитической гидрогенизации промежуточного соединения формулы (Ι-а) в соответствии со схемой реакции (2). Указанное превращение можно проводить путем обработки промежуточного соединения формулы (Ι-а) водородом в присутствие подходящего катализатора, такого как, например, палладий или углерод, подходящего каталитического яда, такого как, например, тиофен, в подходящем реакционно-инертном растворителе, таком как, например, этилацетат. Смесь перемешивают в атмосфере водорода при подходящей температуре, как правило, комнатной температуре, при подходящем давлении, таком как, например, атмосферное давление, например, в течение 16 ч. На схеме реакции (2) все переменные величины определены как в формуле (I) , Ь представляет собой -ΝΗ-, все заместители Х1-Х4 представляют собой СН, и Р5 представляет собой водород.

Схема реакции 2

Экспериментальная методика 3.

В общем, промежуточные соединения формулы (ΙΙ-а) и (ΙΙ-Ь) можно получить после стадий реакции, показанных на схеме реакции (3) ниже, где переменные величины определены как в формуле (Ι), Ь представляет собой -ΝΗ-, все заместители Х1-Х4 представляют собой СН, и Р5 представляет собой водород.

Схема реакции 3

- 5 024716

А - превращение тиоамида в амидин.

В - превращение амида в тиоамид (тионирование).

С - циклизация.

Ό - сочетание по типу Бухвальда-Хартвига (где представляет собой галоген).

Е - восстановление нитросоединения до амина (где К⁶ представляет собой Н).

Р - превращение бромсоединения в амин (где К⁶ представляет собой Н).

Производные амидина из вышеуказанной схемы реакции можно беспрепятственно получить из соответствующих производных тиоамида, действуя в соответствии с известным из уровня техники методикам превращения тиоамида в амидин (стадия реакции А). Указанное превращение можно беспрепятственно осуществлять путем обработки указанных тиоамидов источником аммиака, таким как, например, хлорид аммония или водный аммиак, в подходящем реакционно-инертном растворителе, таком как, например, вода или метанол и т. п., при температурных условиях, таких как, например, нагревание реакционной смеси при 60°С, например, в течение 6 ч.

Альтернативно, промежуточные соединения формулы (ΙΙ-а), где К⁶ представляет собой водород, в приведенной выше схеме реакции (3) можно получить из соответствующих промежуточных соединений формулы (ΙΙ-Ь) посредством типа методики сочетания, катализируемого медью (стадия реакции Р). Указанное сочетание можно проводить путем обработки промежуточных соединений формулы (ΙΙ-Ь) азидом натрия в подходящем реакционно-инертном растворителе, таком как, например, ДМСО, в присутствии смеси подходящих оснований, таких как, например, диметилэтилендиамин и Ыа₂СО₃, медного катализатора, такого как, например, СФ, при температурных условиях, таких как, например, нагревание реакционной смеси при 110°С до завершения реакции, например, в течение 1 ч.

Производные тиоамида из вышеуказанной схемы реакции (3) можно получить из производных амида, следуя известным из уровня техники методикам тионирования (стадия реакции В). Указанное превращение можно беспрепятственно осуществлять путем обработки указанных амидов средством для тионирования, таким как, например, пентасульфид фосфора или 2,4-бис-(4-метоксифенил)-1,3-дитиа-2,4дифосфетан-2,4-дисульфид [реагент Лавессона, СА8 19172-47-5], в реакционно-инертном растворителе, таком как, например, тетрагидрофуран или 1,4-диоксан и т. п., при температурных условиях, таких как, например, нагревание реакционной смеси при 50°С, например, в течение 50 ч.

Производные амида в указанной выше схеме реакции (3) можно получить из производных бетааминоспирта формулы (νΙΙΙ) и промежуточных соединений формулы (νΙΙ) в результате известных в данной области методик циклизации (стадия реакции С). Указанную циклизацию можно беспрепятственно проводить путем обработки указанных бета-аминоспиртов промежуточным соединением формулы (νΙΙ) в присутствии основания, такого как трет-бутоксид калия, или смеси оснований, такой как, третбутоксид калия/ЮЫ-диизопропилэтиламин, реакционно-инертного растворителя, такого как, например, тетрагидрофуран и т. п., при -(80-100)°С, предпочтительно -(15-25)°С, в течение 30 мин-100 ч, предпочтительно 1-24 ч.

Помимо этого, промежуточные соединения формулы (Ιν-а) и (νΙ-а) в описанной выше схеме реакции (3) можно получить из соответствующих промежуточных соединений формул (Ιν-Ь) и (νΙ-Ь), следуя известным в данной области методикам реакции сочетания типа Бухвальда-Хартвига (стадия реакции Ό). Указанное сочетание можно проводить путем обработки промежуточных соединений формул (Ιν-Ь) и (νΙ-Ь) с промежуточным соединением формулы (ν) в подходящем реакционно-инертном растворителе, таком как, например, этанол, или смеси инертных растворителей, таких как, например, 1,2диметоксиэтан/вода/этанола, в присутствие подходящего основания, такого как, например, водный К₃РО₄ или С§₂СО₃, Рб-комплексного катализатора, такого как, например, [1,1'бис(дифенилфосфино)ферроцен]-дихлорпалладий (ΙΙ) [СА8 72287-26-4] или диацетат трансбис(дициклогексиламин)палладия [ЭАРСу, СА8 628339-96-8] при температурных условиях, таких как, например, нагревание реакционной смеси при 80°С, например, в течение 20 ч, или, например, нагревание реакционной смеси при 130°С, например, в течение 10 мин в микроволновом излучении.

Кроме того, промежуточные соединения формул (Ιν-а) и (νΙ-а) в описанной выше схеме реакции (3), где К⁶ представляет собой Н, можно получить из соответствующих промежуточных соединений формул (Ιν-Ь) и (νΙ-Ь), следуя известным в данной области методикам реакции сочетания типа Бухвальда-Хартвига (стадия реакции Е) . Указанное восстановление можно беспрепятственно провести, следуя известным в данной области методикам каталитической гидрогенизации. Например, указанное восстановление можно осуществлять путем перемешивания реагирующих веществ в атмосфере водорода и в присутствии соответствующего катализатора, такого как, например, палладий на угле, платина на угле, никель Ренея и им подобные катализаторы. Подходящими растворителями являются, например, вода, алканолы, например метанол, этанол и т. п., сложные эфиры, например этилацетат и т. п. Для повышения скорости указанной реакции восстановления может быть предпочтительным повышение температуры и/или давления в реакционной смеси. Нежелательное дополнительное гидрирование определенных функциональных групп в реагирующих веществах и продуктах реакции можно предотвратить добавлением каталитического яда, такого как, например, тиофен и т. п., к реакционной смеси.

В общем, промежуточные соединения формул (νΙΙ), (νΙΙΙ-а), (νΙΙΙ-Ь) и (УШ-с) можно получить,

- 6 024716 следуя известным в данной области методикам по типу Штрекера, описанным в литературе, с последующими стандартными химическими трансформациями цианогруппы.

Экспериментальная методика 4.

В общем, промежуточные соединения формул (ΙΧ-а), (ΙΧ-Ь) и (ΙΧ-с) можно получить после стадий реакции, показанных на схеме реакции (4) ниже, где все заместители Χ1-Χ4 представляют собой СН, и К5 представляет собой водород.

Н- хлорирование.

I - трифторметилирование. 1 - восстановление.

К - циклизация.

Промежуточные соединения формул (ΙΧ-а) и (ΙΧ-Ь) в указанной выше схеме реакции (4) можно получить из промежуточных соединений формул (Χ-а) и (Χ-Ь), следуя известным в данной области методикам фторирования (стадия реакции С). Такое превращение можно проводить путем обработки промежуточных соединений формул (Χ-а) и (Χ-Ь) в присутствие фторирующего средства, такого как, например, диэтиламиносеры трифторид (ΌΆδΤ), в подходящем реакционно-инертном растворителе, таком как, например, дихлорметан. Реакционную смесь перемешивают при подходящей температуре, например 0°С, в течение необходимого времени для завершения реакции, например 20-40 мин.

Промежуточные соединения формулы (ΙΧ-с) из вышеуказанной схемы реакции (4) можно получить из промежуточных соединений формулы (ΧΙ), следуя известными из уровня техники методиками хлорирования (стадия реакции Н). Указанное превращение можно проводить путем обработки промежуточного соединения формулы (Χ-а) соответствующим хлорирующим средством, таким как, например, тионилхлорид, в присутствие основания, такого как, например, пиридин, в реакционно-инертном растворителе, таком как, например, дихлорметан. Реакционную смесь перемешивают при подходящей температуре, например 0°С, в течение времени, необходимого для завершения реакции, например в течение 30-60 мин.

Промежуточные соединения формулы (Χ-а) из вышеуказанной схемы реакции (4) можно получить из промежуточных соединений формулы (ΧΙ), следуя известным в данной области методикам трихлорметилирования (стадия реакции Ι). Указанное превращение можно осуществить путем обработки промежуточного соединения формулы (ΧΙ) в присутствие фторида тетрабутиламмония (ΤΒΛΡ), трифторметилирующим средством, таким как, например, (трифторметил)триметилсилан, в подходящем реакционноинертном растворителе, таком как, например, тетрагидрофуран. Реакционную смесь перемешивают при подходящей температуре, например при комнатной температуре, в течение времени, необходимого для завершения реакции, например в течение 2 ч.

Промежуточные соединения формулы (Χ-Ь) из вышеуказанной схеме реакции (4) можно получить из промежуточных соединений формулы (ΧΙ), следуя известными из уровня техники методикам хлорирования (стадия реакции Е). Указанное превращение можно проводить путем обработки промежуточного соединения формулы (ΧΙ) восстанавливающим средством, таким как, например, гидрид диизобутилалюминия, в подходящем реакционно-инертном растворителе, таком как, например, тетрагидрофуран. Реакционную смесь перемешивают при подходящей температуре, как правило, от -78°С до комнатной температуры в течение необходимого времени для завершения реакции, например 2 ч.

Промежуточные соединения формулы (ΧΙ) из вышеуказанной схемы реакции (4) можно получить из промежуточных соединений формулы (ΧΙΙ), следуя известным из уровня техники методикам циклизации (стадия реакции К). Указанное превращение можно проводить, во-первых, путем обработки промежуточных соединений формулы (ΧΙΙ) промежуточным соединением формулы (УП), таким как, например, хлорацетилхлорид, в присутствие основания, такого как, например, ЫаОН, в подходящей смеси инертных растворителей, таких как, например, вода и 1,4-диоксан или вода и ТГФ. рН реакционной смеси доводят до подходящего значения рН, например 10-11, путем добавления подходящего основания, такого

- 7 024716 как, например, ΝαΟΗ. Реакционную смесь перемешивают при подходящей температуре, например от 0 до 25°С, в течение времени, необходимого для завершения реакции, например в течение 1-4 ч. Полученный неочищенный остаток в дальнейшем можно циклизировать для получения промежуточного соединения (XI) путем добавления подходящего основания, такого как, например, К₂СО₃, С§₂СО₃, Ν,Νдиизопропилэтиламин или NаΗСΟ₃, в подходящем реакционно-инертном растворителе, таком как, например, ацетонитрил или ДМФА. Реакционную смесь перемешивают при температурных условиях, таких как, например, нагревание реакционной смеси при от 25 до 80°С в течение 2-24 ч или, например, нагревание реакционной смеси при 140°С в течение 15-30 мин в микроволновом излучении. Это превращение также можно выполнить в отсутствие основания в подходящем реакционно-инертном растворителе, таком как, например, ацетонитрил или ДМФА, при подходящей температуре, как правило, от 40 до 110°С, в течение периода, например 24-48 ч.

Экспериментальная процедура 5.

В общем, промежуточные соединения формул (VIII) и (IX) можно получить из промежуточных соединений формулы (X), следуя известным из уровня техники методикам (стадия реакции Ь), где все заместители Х1-Х4 представляют собой СН, и К5 представляет собой водород. Указанное превращение можно осуществить путем обработки промежуточного соединения формулы ЦХ-с) подходящим цинковым реагентом, таким как, например, цинковая пыль или цинк-медная пара, в подходящем растворителе, таком как уксусная кислота, при подходящей температуре, как правило, от комнатной температуры до 80°С, в течение времени, необходимого для завершения реакции, например в течение 1-16 ч. Данное превращение обеспечивает смесь промежуточных соединений формулы (VIII) и (IX) в различном соотношении в зависимости от условий реакции и реактивов.

Фармацевтические композиции.

В настоящем изобретении также представлены композиции для предупреждения или лечения заболеваний, при которых ингибирование бета-секретазы является благоприятным, таких как болезнь Альцгеймера (ΑΌ), умеренное когнитивное нарушение, старение, деменция, деменция с тельцами Леви, синдром Дауна, деменция, ассоциированная с инсультом, деменция, ассоциированная с болезнью Паркинсона, и деменция, ассоциированная с бета-амилоидом. Указанные композиции содержат терапевтически эффективное количество соединения в соответствии с формулой (I) и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

Хотя активный ингредиент можно вводить отдельно, предпочтительно предоставлять его в виде фармацевтической композиции. Следовательно, в настоящем изобретении дополнительно представлена фармацевтическая композиция, содержащая соединение согласно настоящему изобретению вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Носитель или разбавитель должны быть приемлемыми в том смысле, что они должны быть совместимыми с другими ингредиентами композиции и должны быть не вредны для получающих их пациентов.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть получены любыми способами, хорошо известными в области фармацевтики. Терапевтически эффективное количество конкретного соединения в форме основания или в форме соли присоединения в качестве активного ингредиента комбинируют в однородную смесь с фармацевтически приемлемым носителем, который может иметь разнообразные формы в зависимости от формы препарата, который необходимо ввести. Желательно, чтобы данные фармацевтические композиции находились в единичной лекарственной форме, подходящей предпочтительно для системного введения, такого как пероральное, чрескожное или парентеральное введение; или для местного введения, такого как с помощью ингаляции, назального спрея, глазных капель или с помощью крема, геля, шампуня и т. п. Например, при получении композиций в виде пероральной лекарственной формы можно использовать любую общепринятую фармацевтическую среду, такую как, например, вода, гликоли, масла, спирты и т. п., в случае пероральных жидких препаратов, таких как суспензии, сиропы, эликсиры и растворы; или твердые носители, такие как крахмалы, сахара, каолин, смазывающие вещества, связующие вещества, средства для улучшения распадаемости и т. п., в случае порошков, пилюль, капсул и таблеток. Благодаря простоте их введения таблетки и капсулы представляют собой наиболее предпочтительные пероральные единичные лекарственные формы, в случае которых несомненно используют твердые фармацевтические носители. Для парентеральных композиций носитель будет, как правило, по меньшей мере, в значительной степени содержать стерильную воду, хотя может включать и другие ингредиенты, например, для улучшения растворимости. Например, могут быть получены растворы для инъекций, в которых носитель содержит физиологический раствор, раствор глюкозы или смесь физиологического раствора и раствора глюкозы. Также могут быть получены суспензии для инъекций, в случае которых могут быть использованы подходящие жидкие носители, суспендирую- 8 024716 щие средства и т. п. В композициях, подходящих для чрескожного введения, носитель необязательно содержит средство, повышающее проникновение, и/или подходящее смачиваемое средство, необязательно в комбинации с подходящими добавками любого происхождения в минимальных пропорциях, при этом добавки не оказывают никаких существенных вредных воздействий на кожу. Указанные добавки могут облегчать нанесение на кожу и/или могут быть полезными при получении необходимых композиций. Данные композиции могут наноситься различными путями, например, в виде трансдермального пластыря, точечно или в виде мази.

Особенно предпочтительно для простоты введения и равномерности дозирования составлять вышеупомянутые фармацевтические композиции в единичные лекарственные формы. Единичная лекарственная форма, как используется в описании и формуле изобретения в данном документе, относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных дозировок, причем каждая единица содержит предварительно определенное количество активного ингредиента, рассчитанное так, чтобы получить необходимый терапевтический эффект, совместно с требуемым фармацевтическим носителем. Примерами таких единичных лекарственных форм являются таблетки (в том числе делимые или покрытые таблетки), капсулы, пилюли, пакеты с порошком, облатки, растворы или суспензии для инъекций, чайные ложки, столовые ложки и т. п. и их отдельные множества.

Точная дозировка и частота введения зависят от конкретного применяемого соединения формулы (I), конкретного состояния, лечение которого осуществляют, тяжести состояния, лечение которого осуществляют, возраста, веса, пола, степени тяжести расстройства и общего физического состояния конкретного пациента, а также от другой лекарственной терапии, которую может получать индивидуум, как хорошо известно специалисту в данной области. Более того, очевидно, что указанное эффективное суточное количество можно снижать или увеличивать в зависимости от ответа субъекта, подвергаемого лечению, и/или в зависимости от оценки врача, назначающего соединения по настоящему изобретению.

В зависимости от способа введения фармацевтическая композиция будет содержать от 0,05 до 99 вес.%, предпочтительно от 0,1 до 70 вес.%, более предпочтительно от 0,1 до 50 вес.% активного ингредиента и от 1 до 99,95 вес.%, предпочтительно от 30 до 99,9 вес.%, более предпочтительно от 50 до 99,9 вес.% фармацевтически приемлемого носителя, при этом все процентные содержания основываются на общем весе композиции.

Данные соединения можно применять для системного введения, такого как пероральное, чрескожное или парентеральное введение; или для местного введения, такого как с помощью ингаляции, назального спрея, глазных капель или с помощью крема, геля, шампуня или т. п. Соединения преимущественно являются перорально вводимыми. Точная дозировка и частота введения зависят от конкретного применяемого соединения в соответствии с формулой (I), конкретного состояния, лечение которого осуществляют, тяжести состояния, лечение которого осуществляют, возраста, веса, пола, степени тяжести расстройства и общего физического состояния конкретного пациента, а также другой лекарственной терапии, которую может получать индивидуум, что хорошо известно специалистам в данной области. Более того, очевидно, что указанное эффективное ежедневное количество можно снижать или увеличивать в зависимости от реакции субъекта, подвергаемого лечению, и/или в зависимости от оценки врача, назначающего соединения по настоящему изобретению.

Количество соединения формулы (I), которое можно комбинировать с материалом носителя для получения разовой лекарственной формы, будет изменяться в зависимости от заболевания, лечение которого осуществляют, видов млекопитающих и конкретного способа введения. Однако, в качестве общего руководства подходящие стандартные дозы для соединений по настоящему изобретению могут, например, предпочтительно содержать от 0,1 до приблизительно 1000 мг активного соединения. Предпочтительная стандартная доза составляет от 1 до приблизительно 500 мг. Более предпочтительная стандартная доза составляет от 1 до приблизительно 300 мг. Еще более предпочтительная стандартная доза составляет от 1 до приблизительно 100 мг. Такие стандартные дозы можно вводить более одного раза в день, например 2, 3, 4, 5 или 6 раз в день, но предпочтительно 1 или 2 раза в день, чтобы общая дозировка для взрослого человека весом 70 кг была в диапазоне от 0,001 до приблизительно 15 мг на кг веса субъекта за введение. Предпочтительная доза составляет от 0,01 до приблизительно 1,5 мг на кг веса субъекта на введение, и такая терапия может длиться в течение нескольких недель или месяцев, а в некоторых случаях в течение нескольких лет. Однако, следует понимать, что определенный уровень дозы для любого конкретного пациента будет зависеть от ряда факторов, включающих активность определенного используемого соединения; возраст, вес тела, общее состояние здоровья, пол и режим питания индивидуума, подлежащего лечению; время и путь введения; скорость экскреции; другие лекарственные средства, которые были введены ранее; и тяжесть конкретного заболевания, подвергаемого терапии, что хорошо понятно специалистам в данной области.

Типичной дозой может быть одна таблетка от 1 до приблизительно 100 мг или от 1 до приблизительно 300 мг, принимаемая один раз в день или несколько раз в день, или одна капсула или таблетка пролонгированного действия, принимаемая один раз в день и содержащая пропорционально более высокое содержание активного ингредиента. Эффекта пролонгированного действия можно добиться с помощью материалов капсулы, которые растворяются при различных значениях рН, с помощью капсул, кото- 9 024716 рые медленно высвобождают лекарственное средство при осмотическом давлении, или с помощью любых иных известных средств с контролируемым высвобождением.

В некоторых случаях может понадобиться применение доз вне этих диапазонов, что будет очевидно специалистам в данной области. Кроме того, следует отметить, что клиницист или лечащий врач будет знать, как и когда начинать, прерывать, корректировать или завершать терапию в соответствии с реакцией отдельного пациента.

В отношении композиций, способов и наборов, приведенных выше, специалисту в данной области будет понятно, что предпочтительными соединениями для использования в каждом являются такие соединения, отмеченные как предпочтительные выше. Еще более предпочтительными соединениями для композиций, способов и наборов являются соединения, приведенные в неограничивающих примерах ниже.

Экспериментальная часть.

Далее в данном документе термин т.п. означает точку плавления, водн. означает водный, р.с. означает реакционную смесь, к.т. означает комнатную температуру, ΌΙΡΕΆ означает Ν,Νдиизопропилэтиламин, ΌΙΡΕ означает диизопропилэфир, ТГФ означает тетрагидрофуран, ДМФА означает диметилформамид, ЭСМ означает дихлорметан, ΕΐΘΗ означает этанол, ЕЮАс означает этилацетат, АсОН означает уксусную кислоту, ίΡτΘΗ означает изопропанол, ίΡτΝΗ₂ означает изопропиламин, МеС№' означает ацетонитрил, МеОН означает метанол, Ρά(ΘΑ^₂ означает диацетат палладия (II), рац. означает рацемический, нас. означает насыщенный, §РС означает сверхкритическую жидкостную хроматографию, 8ЕС-МС означает сверхкритическую жидкостную хроматографию/масс-спектрометрию, ЖХ-МС означает жидкостную хроматографию/масс-спектрометрию, ОСМС означает газовую хроматографию/масс-спектрометрию, ВЭЖХ означает высокоэффективную жидкостную хроматографию, ΚΡ означает обращенно-фазовую, иББС означает сверхпроизводительную жидкостную хроматографию, Κι означает время удерживания (в минутах), [М+Н]+ означает протонированную массу свободного основания соединения, ΌΑδΤ означает трифтори диэтиламиносеры, ЭМГММ означает 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолина хлорид, НАТИ означает О-(7-азабензотриазол-1-ил)-Н^№,№-тетраметилурония гексафторфосфат, ХаШрйок означает (9,9диметил-9Н-ксантен-4,5-диил)бис[дифенилфосфин], ТВАТ означает тетрабутиламмония трифенилдифторсиликат, ТЕА означает трифторуксусную кислоту, ЕьО означает диэтиловый эфир, ДМСО означает диметилсульфоксид, МеС№ означает ацетонитрил.

Для ключевых промежуточных соединений, как и для некоторых конечных соединений, абсолютную конфигурацию хиральных центров (обозначена как Κ и/или §) устанавливали посредством сравнения с образцами с известной конфигурацией или путем использования аналитических методик, пригодных для определения абсолютной конфигурации, таких как УСЭ (вибрационный круговой дихроизм) или рентгеноструктурная кристаллография. Если абсолютная конфигурация хирального центра не известна, его произвольно обозначают Κ*.

А. Получение промежуточных соединений.

Пример А1. Получение промежуточного соединения 1

Вг

Изопропоксид титана (IV) (202 мл, 658 ммоль) добавляли к перемешанной смеси этил-2-(3-бромфенил)-2-оксо-ацетата [(СА§ 62123-80-2), 80 г, 329 ммоль] и (§)-2-метил-2-пропансульфинамида (47,9 г, 395 ммоль) в н-гептане (740 мл). Смесь перемешивали при 80°С в течение 4 ч. Смесь охлаждали при комнатной температуре и добавляли воду. Полученную в результате смесь фильтровали через прокладку из диатомитовой земли и промывали н-гептаном. Органический слой отделяли, высушивали (Мд§О₄), фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель; элюент: н-гептан/ЕЮАс от 100/0 до 50/50). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 1 (91 г, выход 74%).

Пример А2. Получение промежуточного соединения 2

Вг

Бромид циклопропилмагния (1М, 300 мл, 300 ммоль) по каплям добавляли к перемешанному раствору промежуточного соединения 1 (91 г, 243 ммоль) в ЭСМ (1500 мл) при -40°С. Смесь перемешивали при данной температуре в течение 30 мин, а затем реакцию гасили путем добавления насыщенного водного раствора Ν^Ο с последующим добавлением воды. Смесь экстрагировали с помощью ЭСМ. Органический слой отделяли, высушивали (Мд§О₄), фильтровали и растворители выпаривали в вакууме с получением промежуточного соединения 2 (100 г, выход 99%), которое использовали без дополнитель- 10 024716 ной очистки на следующей стадии.

Пример А3. Получение промежуточного соединения 3

1М водный раствор №ЮН (750 мл, 750 ммоль) добавляли к раствору неочищенного промежуточного соединения 2 (100 г, 240 ммоль) в МеОН (400 мл). Полученную смесь перемешивали при дефлегмировании в течение 4 ч. Смесь охлаждали до комнатной температуры, а затем распределяли между водой и ЕЮАс. Водный слой отделяли и нейтрализовали путем добавления 1М водного раствора НС1 (750 мл), а затем экстрагировали с помощью ЭСМ. Органический слой отделяли, высушивали (Мд§О₄), фильтровали и растворители выпаривали в вакууме. Остаток растирали в порошок с помощью ΌΙΡΕ/МеСН, и полученные твердые частицы отфильтровывали и высушивали в вакууме с получением промежуточного соединения 3 (37 г, выход 41%).

а_с: +37,59° (589 нм, конц. 0,564 вес./об.%, МеОН, 20°С). Абсолютную конфигурацию определяли путем рентгенодифракции.

Пример А4. Получение промежуточного соединения 4

Соль хлористо-водородной кислоты

Промежуточное соединение 3 (37 г, 99 ммоль) перемешивали в 4М растворе НС1 в диоксане (74 мл) и 1,4-диоксане (75 мл) при комнатной температуре в течение 30 мин. К полученной суспензии добавляли ΌΙΡΕ, и осадок отфильтровывали и высушивали в вакууме с получением промежуточного соединения 4 (28 г, выход 92%).

а : -68,89° (589 нм, с 0,646 вес./об.%, МеОН, 20°С).

Пример А5. Получение промежуточного соединения 5 ,Η.νΛΖ'

1М водный раствор №ЮН (182,6 мл, 182,6 ммоль) добавляли к раствору промежуточного соединения 4 (28 г, 91,3 ммоль) и смесь охлаждали в ледяной бане. К этой смеси по каплям добавляли раствор хлорацетилхлорида (21,8 мл, 274 ммоль) в ТГФ (280 мл) при 15°С в течение более одного часа, добавляя одновременно раствор 25%-ного водного раствора №ЮН для поддержания рН приблизительно 10-11. После завершения реакции концентрированный водный раствор НС1 осторожно добавляли к реакционной смеси до рН 2. Смесь частично концентрировали в вакууме и полученный в результате осадок отфильтровывали, промывали с помощью ΌΙΡΕ и высушивали в вакууме с получением промежуточного соединения 5 (2 6 г, выход 82%).

а : -6,49° (589 нм, конц. 0,5855 вес./об.% МеОН, 20°С)

Пример А6. Получение промежуточного соединения 6

Промежуточное соединение 5 (0,7 г, 2,02 ммоль) и NаΗСОз (0,34 г, 4,04 ммоль) растворяли в ДМФА (17 мл), и реакционную смесь перемешивали при 80°С в течение 2 ч. Смесь частично концентрировали при пониженном давлении, охлаждали до комнатной температуры и затем фильтровали через диатомитовую землю. Фильтрат концентрировали в вакууме, и остаток очищали путем колончной флэшхроматографии (силикагель; элюент: н-гептан/ЕЮАс от 100/0 до 50/50). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 6 (0,54 г, выход 86%).

а : -15,68° (589 нм, конц. 0,37 вес./об.%, МеОН, 20°С).

Пример А7. Получение промежуточного соединения 7

К раствору промежуточного соединения 6 (4,2 г, 13,54 ммоль) в ТГФ (55 мл) добавляли ТВАТ (0,73 г, 1,35 ммоль). Затем по каплям добавляли (трифторметил)триметилсилан (4,0 мл, 27 ммоль), и реакци- 11 024716 онную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Смесь гасили водным ЫаС1, экстрагировали с помощью ЕЮЛс, органическую фазу отделяли, высушивали (М§80₄) и концентрировали в вакууме. Полученное масло очищали колоночной хроматографией (силикагель; элюент: ЭСМ/ЕЮДс от 100/0 до 0/100). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 7 (3 г, выход 58%) в виде смеси цис- и транс-изомеров, которую без дополнительной очистки использовали в следующей стадии.

Пример А8. Получение промежуточного соединения 8

Промежуточное соединение 7 (3 г, 7,9 ммоль) растворяли в ЭСМ (20 мл) и по каплям добавляли ΌΑ8Τ (1,16 мл, 9,5 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч и затем реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток распределяли между ЭСМ и водным насыщенным раствором ЫаНС0₃. Органический слой отделяли и водный слой экстрагировали с помощью ЭСМ. Объединенные органические слои высушивали (М§80₄), фильтровали, и растворитель выпаривали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэшхроматографией на силикагеле (элюент: н-гептан/ЕЮАс от 100/0 до 0/100). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 8 (2 г, выход 6 6%) в виде смеси цис- и транс-изомеров, которую без дополнительной очистки использовали в следующей стадии.

Пример А9. Получение промежуточного соединения 9

Р₂8₅ (1,16 г, 5,23 ммоль) добавляли к раствору промежуточного соединения 8 (2 г, 5,23 ммоль) в ТГФ (43 мл) при комнатной температуре. Смесь перемешивали при 70°С в течение 3 ч. Затем смесь охлаждали до комнатной температуры, отфильтровывали, и органический растворитель выпаривали в вакууме. Неочищенный остаток очищали колоночной флэш-хроматографии (силикагель; элюент: нгептан/ОСМ от 80/100 до 0/100). Требуемые фракции собирали и выпаривали в вакууме с получением промежуточного соединения 9 (1,6 г, выход 77%) в виде смеси цис- и транс-изомеров.

Пример А10. Получение промежуточных соединений 10 и 11

Промежуточное соединение 9 (4,2 г, 10,55 ммоль) добавляли к смеси 7 н. аммиака в МеОН (16 мл) и водного раствора ΝΗ₄ΟΗ (40 мл) и реакционную смесь перемешивали при 14 0°С в течение 1 ч в микроволновом излучении. Затем растворитель выпаривали и остаток растворяли в ЭСМ, высушивали (М§₂80₄), фильтровали, и растворитель выпаривали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэшхроматографией (силикагель; элюент: н-гептан/ЕЮАс от 100/0 до 50/50). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 10 (2,44 г, выход 61%) и промежуточного соединения 11 (0,7 г, выход 17%).

Пример А11. Получение промежуточного соединения 12

Промежуточное соединение 10 (2,44 г, 6,4 ммоль) объединяли с Ν;·ιΝ₃ (1,04 г, 16 ммоль), Си1 (1,52 г, 8,0 ммоль) и №-ьС0₃ (1,357 г, 12,8 ммоль) в ДМСО (92 мл), и реакционную смесь дегазировали. После этого добавляли Ν,Ν'-диметилэтилендиамин (1,2 мл, 11,2 ммоль), и смесь нагревали при 110°С до завершения реакции приблизительно 6 ч. Реакционную смесь вливали в ЭСМ. Добавляли гидроксид аммония (28% в воде) и органический слой отделяли и промывали три раза раствором гидроксида аммония. Затем органический слой высушивали (М§80₄), фильтровали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 12 (2 г, выход 98%).

Пример А12. Получение промежуточного соединения 13

Триметилсилилцианид (30,7 мл, 230 ммоль) добавляли к перемешанному раствору 5-бром-2фторацетофенона (25 г, 115 ммоль) и ΝΗ₄0 (18,5 г, 345 ммоль) в ЯН₃/Ме0Н (150 мл). Смесь перемеши- 12 024716 вали при комнатной температуре в течение 3 дней. Затем растворитель выпаривали в вакууме и остаток поглощали в ЕЮАс (80 мл). Твердую фазу фильтровали, и фильтрат выпаривали в вакууме с получением промежуточного соединения 13 (колич. выход 27,9 г), которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

Пример А13. Получение промежуточного соединения 14

Промежуточное соединение 13 (27 г, 111 ммоль) растворяли в НС1 (37% в Н₂О) (130 мл) и уксусной кислоте (130 мл), и смесь кипятили с обратным холодильником в течение 16 ч. После охлаждения до комнатной температуры смесь концентрировали в вакууме. Добавляли воду и водный слой экстрагировали с помощью ЕЮАс. Водный слой ощелачивали водным раствором ΝαΟΗ (25%) до рН 7. Водный слой частично концентрировали в вакууме. Смесь охлаждали в ледяной бане, и осадок отфильтровывали, промывали водой и затем ЕьО и высушивали в вакууме с получением промежуточного соединения 14 (18 г, выход 62%) в виде белого твердого вещества.

Пример А14. Получение промежуточного соединения 15

Смесь промежуточного соединения 14 (15 г, 57,2 ммоль) в растворе 10% Н₂§О₄ в метаноле (330 мл) кипятили с обратным холодильником в течение 48 ч. Реакционную смесь концентрировали в вакууме. Добавляли воду, и раствор ощелачивали до рН 8 насыщенным водным раствором NНСΟз. Затем водный слой экстрагировали с помощью ЕЮАс. Органический слой отделяли, высушивали (Мд₄§О₄), фильтровали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 15 (15 г, выход 95%).

Пример А15. Получение промежуточного соединения 16

Промежуточное соединение 15 (10 г) разделяли на соответствующие энантиомеры препаративной 8РС на (СЫга1рак® О;исс1 АО 30x250 мм). Подвижная фаза (СО₂, МеОН с 0,2% ίΡιΝ^). при этом получали промежуточное соединение 16 (4,2 г, выход 42%) .

α : -10,1° (365 нм, конц. 0,762 вес./об.% МеОН, 20°С).

Пример А16. Получение промежуточного соединения 17

ТГФ (150 мл) добавляли к раствору промежуточного соединения 16 (40 г, 145 ммоль) в №ЮН (1М в Н2О, 360 мл). Смесь перемешивали в течение 4 ч при комнатной температуре. Смесь концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 17 (42 г) в виде белого твердого вещества, которое использовали без дополнительной очистки на следующей стадии реакции.

Пример А17. Получение промежуточного соединения 18

К охлажденному раствору промежуточного соединения 17 (41,3 г, 145 ммоль) в Н₂О (150 мл) по каплям добавляли раствор хлорацетилхлорида (24 мл, 304,5 ммоль) в 1,4-диоксане (75 мл). Одновременно добавляли №ЮН (5М в Н₂О, 2 9 мл) для доведения рН до 10-11. Органический слой отделяли, и водный слой экстрагировали с помощью ЕьО. Затем водный слой подкисляли с помощью НС1 (6М, в Н₂О) до рН 2. Осажденное белое твердое вещество собирали фильтрацией, промывали с помощью Н₂О и высушивали с получением промежуточного соединения 18 (42 г, выход 86%).

Пример А18. Получение промежуточного соединения 19

Промежуточное соединение 18 (42 г, 124 ммоль) и №-1НСО₃, (20,8 г, 248 ммоль) растворяли в ДМФА (1000 мл), и реакционную смесь перемешивали при 80°С в течение 3 ч. Смесь частично концентрировали при пониженном давлении, охлаждали до комнатной температуры и затем фильтровали через диатомитовую землю. Фильтрат концентрировали в вакууме, и остаток очищали колоночной флэш- 13 024716 хроматографией (силикагель; элюент: МеОН/ОСМ от 0/100 до 5/95). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 19 (36 г, выход 96%).

Пример А19. Получение промежуточного соединения 20

Раствор промежуточного соединения 19 (10 г, 21,5 ммоль) в ТГФ (105 мл) охлаждали до -78°С в атмосфере Ν₂. Затем медленно добавляли гидрид диизобутилалюминия (43 мл, 4 3 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч, способствуя ее медленному подогреву до комнатной температуры. Реакционную смесь охлаждали до 0°С и гасили путем медленного добавления водного раствора 1 н. НС1. Затем смесь экстрагировали с помощью ЕБОАс, органические слои отделяли, высушивали (№₂8О₄), фильтровали и растворители выпаривали в вакууме с получением промежуточного соединения 20 (колич. выход 6,6 г, смесь диастереоизомеров 80/20), которое использовали без дополнительной очистки на следующей стадии реакции.

Пример А20. Получение промежуточного соединения 21 о

А ^|сАо

Промежуточное соединение 20 (6,3 г, 20,7 ммоль) растворяли в ЭСМ (84 мл), и реакционную смесь охлаждали до 0°С. Затем по каплям добавляли ΌΑδΤ (3 мл, 24,9 ммоль). Через 20 мин при 0°С реакционную смесь гасили насыщенным водным раствором NаНСОз и экстрагировали с помощью ЭСМ. Объединенные органические слои высушивали (М§§О₄), фильтровали, и растворитель выпаривали в вакууме. Неочищенный продукт выделяли из ΌΙΡΕ, отфильтровывали и высушивали в вакууме при 60°С с получением промежуточного соединения 21 (4,2 г, выход 66%, смесь диастереоизомеров 80/20).

Пример А21. Получение промежуточного соединения 22

Промежуточное соединение 22 синтезировали, действуя в соответствии с тем же подходом, описанным в примере А9. Начиная с промежуточного соединения 21 (4,2 г, 13,7 ммоль) получали промежуточное соединение 22 (3 г, выход 68%, смесь диастереоизомеров 60/40).

Пример А22. Получение промежуточных соединений 23 и 24

Промежуточное соединение 22 (6 г, 18,6 ммоль) растворяли в 7 н. аммиаке в МеОН (300 мл), и реакционную смесь перемешивали при 60°С в течение 18 ч. Растворитель выпаривали и добавляли дополнительно 7 н. аммиак в МеОН (300 мл) и смесь дополнительно перемешивали при 60°С в течение 18 ч. Затем растворитель выпаривали и неочищенный продукт очищали колоночной хроматографией (силикагель; элюент: 7М раствор аммиака в метаноле/ОСМ от 0/100 до 10/90). Необходимые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 23 (3,7 г, выход 65%) и промежуточного соединения 24 (0,6 г, выход 11%).

Пример А23. Получение промежуточного соединения 25 1МН₂

Промежуточное соединение 23 (1,6 г, 5,24 ммоль) объединяли с №ιΝ (0,85 г, 13 ммоль), СЫ (1,25 г, 6,5 ммоль) и №-ьСО₃, (1,1 г, 10,5 ммоль) в ДМСО (75 мл), и реакционную смесь дегазировали. После этого добавляли Ν,Ν'-диметилэтилендиамин (1 мл, 9,1 ммоль), и смесь нагревали при 110°С до завершения реакции приблизительно 4 ч. Реакционную смесь вливали в ЭСМ. Добавляли гидроксид аммония (28% в воде), и органический слой отделяли и промывали три раза гидроксидом аммония. Затем органический слой высушивали (М§2§О₄), фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной хроматографией (силикагель; элюент: 7М раствор аммиака в метаноле/ОСМ от 0/100 до

- 14 024716

10/90). Необходимые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 25 (0,3 г, выход 24%).

Пример А24. Получение промежуточного соединения 26

К раствору промежуточного соединения 19 (11,6 г, 38,5 ммоль) в ТГФ (117 мл) добавляли ТВАТ (2,08 г, 3,85 ммоль). Затем по каплям добавляли (трифторметил)триметилсилан (12,5 мл, 84,6 ммоль), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин. Смесь гасили водным Ναί'Ί и экстрагировали с помощью ЕгОАс. Объединенные органические слои высушивали (М§§0₄), фильтровали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 26 (14 г, выход 98%) в виде смеси цис- и транс-изомеров, которую без дополнительной очистки использовали на следующей стадии.

Пример А25. Получение промежуточного соединения 27

Промежуточное соединение 26 (14 г, 37,6 ммоль) растворяли в ЭСМ (600 мл) и охлаждали до 0°С и затем по каплям добавляли хлорид тионила (11,2 мл, 150 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин при 0°С и затем добавляли пиридин (18,2 мл, 225,7 ммоль). Через 30 мин реакционную смесь гидролизировали водным раствором 1 н. НС1, а затем экстрагировали с помощью ЭСМ. Органические слои отделяли, высушивали (М§§0₄), фильтровали и выпаривали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель; элюент: 7М раствор аммиака в метаноле/ОСМ от 0/100 до 2/98). Необходимые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 27 (6 г, выход 41%, смесь диастереоизомеров).

Пример А26. Получение промежуточного соединения 28

Промежуточное соединение 27 (7 г, 17,9 ммоль) и цинк-медную пару (8,55 г, 66,3 ммоль) перемешивали в уксусной кислоте (420 мл) при комнатной температуре в течение 16 ч. Реакционную смесь фильтровали, промывали с помощью ЭСМ и концентрировали в вакууме. Добавляли раствор гидроксида аммония (28% в воде) и ЭСМ. и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа. Органический слой отделяли, и водный слой экстрагировали с помощью ЭСМ. Объединенные органические слои высушивали (М§₄§0₄), фильтровали и выпаривали в вакууме с получением промежуточного соединения 28 (6 г, выход 99%) .

Пример А27. Получение промежуточного соединения 29

Ρ₂δ₅ (5,95 г, 26,8 ммоль) добавляли к раствору промежуточного соединения 28 (6 г, 17,9 ммоль) в ТГФ (145 мл) при комнатной температуре. Смесь перемешивали при 70°С в течение 90 мин. Затем смесь охлаждали до комнатной температуры, отфильтровывали и выпаривали органический растворитель в вакууме с получением промежуточного соединения 29 (5,9 г), которое использовали без дополнительной очистки на следующей стадии.

Пример А28. Получение промежуточного соединения 30

Промежуточное соединение 30 синтезировали, действуя в соответствии с тем же подходом, описанным в примере А22. Начиная с промежуточного соединения 29 (5,9 г, 16,8 ммоль) получали промежуточное соединение 30 (4,04 г, выход 72%).

Пример А29. Получение промежуточного соединения 31

- 15 024716

Промежуточное соединение 31 синтезировали, действуя в соответствии с тем же подходом, описанным в примере А23. Начиная с промежуточного соединения 30 (3,6 г, 10,7 ммоль) получали промежуточное соединение 31 (1,52 г, выход 52%).

Пример А30. Получение промежуточного соединения 32

К раствору промежуточного соединения 27 (3 г, 7,68 ммоль) в уксусной кислоте (136 мл) добавляли цинк (1,26 г, 19,2 ммоль). Затем реакционную смесь перемешивали при 80°С в течение 3 ч, после чего реакционную смесь фильтровали горячей и концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в ЭСМ и промывали раствором гидроксида аммония. Органическую фазу отделяли, высушивали (М§§0₄), и растворитель концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной хроматографией (силикагель; элюент: 7М раствор аммиака в метаноле/ОСМ от 0/100 до 3/97). Необходимые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 32 (2,7 г, выход 99%).

Пример А31. Получение промежуточного соединения 33

Реагент Лавессона (6,82 г, 16,85 ммоль) добавляли к раствору промежуточного соединения 32 (6 г, 16,85 ммоль), растворенного в ТГФ (68 мл), при комнатной температуре. Смесь перемешивали при 60°С в течение 4 ч. Затем смесь охлаждали до комнатной температуры, отфильтровывали и органический растворитель выпаривали в вакууме. Неочищенный остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель; элюент: н-гептан/ОСМ от 100/0 до 50/50). Требуемые фракции собирали и выпаривали в вакууме с получением промежуточного соединения 33 (6 г, выход 96%) в виде желтоватого масла.

Пример А32. Получение промежуточных соединений 34 и 35

Промежуточное соединение 33 (6 г, 16,1 ммоль) растворяли в 7 н. аммиаке в МеОН (97 мл), и реакционную смесь перемешивали при 80°С в течение 24 ч. Затем растворитель выпаривали и неочищенный продукт очищали колоночной хроматографией (силикагель; элюент: 7М раствор аммиака в метаноле/ОСМ от 0/100 до 2/98). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 34 (3,4 г, выход 59%) и промежуточного соединения 35 (0,75 г, выход 13%).

Пример А33. Получение промежуточного соединения 36

Промежуточное соединение 34 (3,4 г, 9,6 ммоль) объединяли с ΝαΝ₃ (1,56 г, 24 ммоль), Си1 (2,28 г, 12 ммоль) и №-ьС.’О₃ (2,03 г, 19,1 ммоль) в ДМСО (137 мл), и реакционную смесь дегазировали. После этого добавляли Ν,Ν'-диметилэтилендиамин (1,8 мл, 16,8 ммоль), и смесь нагревали при 110°С до завершения реакции приблизительно 1 ч. Реакционную смесь отфильтровывали и фильтровальный осадок промывали с помощью ЕЮАс. К фильтрату добавляли воду и ЕЮАс. и смесь подкисляли путем добавления НС1 (1Мв Н₂О). Затем органический слой отделяли и водный слой отмывали с помощью ЕЮАс. Затем водный слой ощелачивали с помощью водн. раствора аммиака и снова экстрагировали с помощью ЕЮАс. Объединенные органические слои высушивали (№₂8О₄), фильтровали и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 36 (2,5 г, выход 90%).

α : -94,91° (0589 нм, конц. 0,393 вес./об.%, МеОН, 20°С).

- 16 024716

В. Получение конечных соединений.

Пример В1. Получение соединения 1: (5К,68)-5-циклопропил-6-фтор-5-{3-[(3-метоксипиридин-2ил)амино] фенил}-6-(трифторметил)-5,6-дигидро-2Н-1,4-оксазин-3 -амин

Промежуточное соединение 12 (0,07 г, 0,221 ммоль) растворяли в изопропаноле (5 мл) и добавляли 2-бром-3-метоксипиридин (0,083 г, 0,441 ммоль) и серную кислоту (0,108 г, 1,1 ммоль). Смесь перемешивали в течение 40 ч при 80°С. Смеси давали охладиться до комнатной температуры. Добавляли ЭСМ и насыщенный водный раствор №НС.'О₃. Органические слои отделяли, высушивали (М§§0₄), фильтровали, и растворители выпаривали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэшхроматографией (силикагель; элюент: 7М раствор аммиака в метаноле/ОСМ от 0/100 до 10/90). Необходимые фракции собирали и концентрировали в вакууме. Затем остаток растворяли в ΌΙΡΕ и превращали в соль НС1 путем добавления НС1 в изопропаноле. Полученное твердое вещество фильтровали и высушивали в вакууме с получением соединения 1 (0,025 г, выход 25%) в виде хлористо-водородной соли.

Пример В2. Получение соединения 2: (5К,6К)-6-фтор-5-{2-фтор-5-[(3-метоксипиридин-2ил)амино] фенил}-5 -метил-5,6-дигидро -2Н-1,4-оксазин-3 -амин

Промежуточное соединение 25 (0,3 г, 1,24 ммоль) растворяли в изопропаноле (15 мл) и добавляли 2-бром-3-метоксипиридин (0,467 г, 2,49 ммоль) и серную кислоту (0,61 г, 6,22 ммоль). Смесь перемешивали в течение 40 ч при 80°С. Смеси давали остыть до комнатной температуры. Добавляли ЭСМ и насыщенный водный раствор ЫаНСО₃. Органические слои отделяли, высушивали (М§8О₄), фильтровали, и растворители испаряли в вакууме. Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ на (КР Уубас ЭепаП® С18 - 10 мкм, 200 г, 5 см) подвижной фазе (0,25%-ный раствор ХН₄НСО₃ в воде, СН₃СЫ) с получением соединения 2 (0,044 г, выход 10%).

Пример В3. Получение соединения 3: (5К)-6-(дифторметилиден)-5-{2-фтор-5-[(3-метоксипиридин2-ил)амино] фенил} -5 -метил-5,6-дигидро-2Н-1,4-оксазин-3 -амин

Промежуточное соединение 31 (0,35 г, 1,29 ммоль) растворяли в изопропаноле (15 мл) и добавляли 2-бром-3-метоксипиридин (0,485 г, 2,58 ммоль) и серную кислоту (0,34 мл, 6,45 ммоль). Смесь перемешивали в течение 72 ч при 80°С. Смеси давали остыть до комнатной температуры. Добавляли ЭСМ и насыщенный водный раствор ЫаНСО₃. Органические слои отделяли, высушивали (М§§0₄), фильтровали, и растворители испаряли в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель; элюент: 7М раствор аммиака в метаноле/ОСМ от 0/100 до 2/98). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме. Остаток выделяли из ΌΙΡΕ/гептанов, фильтровали и высушивали при сильном разрежении с получениемсоединения 3 (0,279 г, выход 57%) в виде белого порошка.

Пример В4. Получение соединения 4: (5К,6К*)-6-(дифторметил)-5-{2-фтор-5-[(3-метоксипиридин2-ил)амино] фенил} -5 -метил-5,6-дигидро-2Н-1,4-оксазин-3 -амин

Соединение 3 (0,228 г, 0,603 ммоль) растворяли в ЕЮАс (4 мл) и добавляли палладий на угле (10%) (0,064 г, 0,06 ммоль) и тиофен (0,4%-ный раствор в ТГФ, 0,8 мл, 0,041 ммоль). Смесь гидрогенизировали при комнатной температуре и атмосферном давлении в течение 16 ч. Катализатор отфильтровывали и растворители выпаривали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель; элюент: 7М раствор аммиака в метаноле/ОСМ от 0/100 до 2/98). Необходимые фракции собирали и концентрировали в вакууме. Остаток выделяли из ΌΙΡΕ/гептанов, фильтровали и высушивали при сильном разрежении с получением соединения 4 (0,074 г, выход 32%).

- 17 024716

Пример В5. Получение соединения 5 (5К,6К)-6-фтор-5-[2-фтор-5-(пиримидин-2-иламино)фенил]-5метил-5,6 -дигидро -2Н-1,4-оксазин-3 -амин

Промежуточное соединение 25 (0,048 г, 0,199 ммоль) растворяли в 1,4-диоксане (2 мл) и добавляли 2-бромпиримидин (0,032 г, 0,199 ммоль) и 4М раствор НС1 в диоксане (0,1 мл, 0,4 ммоль). Смесь перемешивали в течение 16 ч при 100°С. Смеси давали охладиться до комнатной температуры. Добавляли ОСМ и насыщенный водный раствор NаНСΟ₃. Органические слои отделяли, высушивали (Мд§О₄), фильтровали, и растворители испаряли в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэшхроматографией (силикагель; элюент: 7М раствор аммиака в метаноле/ОСМ от 0/100 до 5/95). Требуемые фракции собирали и концентрировали в вакууме с получением соединения 5 (0,013 г, выход 20%).

Пример В6. Получение соединения 6: (5К,6К)-5-{2-фтор-5-[(3-метоксипиридин-2-ил)амино]фенил}5-(трифторметил)-5,6-дигидро-2Н-1,4-оксазин-3-амин

Промежуточное соединение 36 (0,1 г, 0,343 ммоль) растворяли в изопропаноле (4 мл) и добавляли 2-бром-3-метоксипиридин (0,129 г, 0,687 ммоль) и серную кислоту (0,09 мл, 1,7 ммоль). Смесь перемешивали в течение 40 ч при 80°С. Смеси давали охладиться до комнатной температуры. Добавляли ОСМ и насыщенный водный раствор NаНСΟ₃. Органические слои отделяли, высушивали (Мд§О₄), фильтровали, и растворители выпаривали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэшхроматографией (силикагель; элюент: 7М раствор аммиака в метаноле/ОСМ от 0/100 до 5/95) с получением соединения 6 (0,013 г, выход 20%).

Пример В7. Получение соединения 7: (5К,6К)-5-[2-фтор-5-(пиримидин-2-иламино)фенил]-5-метил6-(трифторметил)-5,6-дигидро-2Н-1,4-оксазин-3-амин

Промежуточное соединение 36 (0,1 г, 0,343 ммоль) растворяли в 1,4-диоксане (3,4 мл) и добавляли 2-бромпиримидин (0,055 г, 0,343 ммоль) и 4М раствор НС1 в диоксане (0,17 мл, 0,69 ммоль). Смесь перемешивали в течение 16 ч при 100°С. Смеси давали охладиться до комнатной температуры. Добавляли ОСМ и насыщенный водный раствор №-1НСО₃. Органические слои отделяли, высушивали (Мд§О₄), фильтровали, и растворители выпаривали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэшхроматографией (силикагель; элюент: 7М раствор аммиака в метаноле/ОСМ от 0/100 до 5/95). Требуемые фракции собирали и концентрировали. Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ на (СЫга1ра1 Э|асе1 Α8 20x250 мм). Подвижная фаза (СО₂, МеОН с 0,2% 1Р1®Н₂), при этом получали соединение 7 (0,036 г, выход 28%) .

Пример В8. Получение соединения 8: (5К,6К)-6-фтор-5-{2-фтор-5-[(3-метоксипиразин-2ил)амино] фенил}-5 -метил-5,6-дигидро -2Н-1,4-оксазин-3 -амин

Промежуточное соединение 25 (0,15 г, 0,622 ммоль) растворяли в 1,4-диоксане (6 мл). Добавляли 2йод-3-метоксипиразин (0,12 г, 0,508 ммоль), карбонат цезия (0,405 г, 1,244 ммоль), 1,1'бис(дифенилфосфино)ферроцен (0,052 г, 0,093 ммоль) и трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0) (0,028 г, 0,031 ммоль). Реакционную пробирку запаивали и смесь перемешивали при 160°С в течение 1 ч в микроволновом излучении. После охлаждения реакционную смесь разбавляли с помощью ЭСМ и фильтровали через дикалит. Фильтрат концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель; элюент: 7М раствор аммиака в метаноле/ЭСМ от 0/100 до 5/95). Требуемые фракции собирали и концентрировали. Неочищенный продукт дополнительно очищали препаративной ВЭЖХ на (СЫга1ра1 Э|асе1 Α8 20x250 мм). Подвижная фаза (СО₂, МеОН с 0,2% ιΡγΝΉ₂), при

- 18 024716 этом получали соединение 8 (0,010 г, выход 5%). Пример В9. Получение соединения 9

Промежуточное соединение 25 (0,30 г, 1,244 ммоль) и 2-бромникотинонитрил (455 мг, 2,487 ммоль) растворяли в 1,4-диоксане (12,5 мл), затем по каплям добавляли 4М раствор НС1 в диоксане (0,933 мл, 3,731 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 16 ч при 120°С. Затем добавляли насыщенный водный раствор NаΗСΟз, после чего ОСМ. Фазы разделяли, и органический слой концентрировали при пониженном давлении. Полученное в результате масло очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель; элюент: 7М раствор аммиака в метаноле/ОСМ от 0/100 до 5/95). Необходимые фракции собирали и далее очищали препаративной §РС на (СЫга1сс1 0|асс1 ΟΌ 20x250 мм). Подвижная фаза (СО₂, ιΡγΟΗ с 0,2% ιΡγΝΗ₂), при этом получали соединение 9 (0,006 г, 1%).

Промежуточное соединение 25 (0,482 г, 2 ммоль) растворяли в ιΡγΟΗ (24 мл), затем добавляли 2,3дибромопиридин (0,948 г, 4 ммоль) и серную кислоту (0,533 мл, 10 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 4 дней при 80°С. Реакционной смеси давали охладиться, затем добавляли ОСМ и насыщенный водный раствор NаΗСΟз. Фазы разделяли и органический слой высушивали и концентрировали при пониженном давлении. Полученное масло очищали колоночной хроматографией (силикагель; элюент: 7М раствор аммиака в метаноле/ЭСМ от 0/100 до 10/90). Необходимые фракции собирали и далее очищали препаративной §РС (СЫга1рак Оаюс1 АЗ 20 микроом 500 гр). Подвижная фаза(ТО₂, ιΡγΟΗ с 0,2% ιΡγΝΗ₂), при этом получали соединение 10 (0,135 г, 17%).

Пример В11. Получение соединения 11

Промежуточное соединение 36 (0,358 г, 1,229 ммоль) растворяли в 1,4-диоксане (14,7 мл). Добавляли 2-бром-3-цианопиридин (0,191 г, 1,045 ммоль), карбонат цезия (0,800 г, 2,458 ммоль), 1,1'бис(дифенилфосфино)ферроцен (0,104 г, 0,184 ммоль) и смесь перемешивали в атмосфере аргона в течение нескольких минут. Затем добавляли трис(дибензилиден-ацетон)дипалладий(0) (0,056 г, 0,062 ммоль). Пробирку для реакций запаивали, и смесь перемешивали при 160°С в течение 1 ч в микроволновом излучении. После охлаждения реакционную смесь разбавляли с помощью ОСМ и фильтровали через дикалит. Фильтрат концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэшхроматографией (силикагель; элюент: 7М раствор аммиака в метаноле/ОСМ от 0/100 до 5/95). Требуемые фракции собирали и концентрировали. Неочищенный продукт дополнительно очищали препаративной §РС на (СЫга1ра1 0|асс1 А§ 20x250 мм). Подвижная фаза (ί.Ό₂. МсΟΗ с 0,2% ιΡγΝΗ₂) с получением соединения 11 (0,052 г, выход 11%).

Соединения 1-11 в табл. 1-5 представляют собой соединения, полученные согласно одному из приведенных выше примеров. В случае, если не указана форма соли, соединение получали в виде свободного основания. № примера означает номер примера, в соответствии с протоколом которого соединение было синтезировано. № соединения означает номер соединения.

Таблица 1

Χϊ соединения	№ примера	X,. Х2, Хз, Х4	—Ь-Аг	стереохимия
1	В1	х1=х2=х3=х4=сн	Со N N Н	С5(К);Сб(8) Один диастереоизомер Чистый энантиомер

- 19 024716

Таблица 2

№ соединения	№ примера	Χι, X?. Х4	-Ь-Аг	стереохимия
2	В2	Х[=СР Х;=Х3=Х4=СН	г°П 'ν'ιμ н	С5(К);С6(К) Один д и астереоизомер Чистый энантиомер
5	В5	Х[=СР х=х=х4=сн	н	С5(К);Сб(К) Один диастереоизомер Чистый энантиомер
9	В9	Х[=СР Х2=Х3=Х4=СН	'П Η	С5(К);Сб(К) Один диастереоизомер Чистый энантиомер
10	В10	Х[=СР х,=х,=х4=сн	.Ύ) 'м'-'Чг Η	С5(И);Сб(К) Один диастереоизомер Чистый энантиомер

Таблица 3

х>. «х₃ ^Х2

№ соединения	№ примера	Χι, Χΐ5 Х3, Х4	—Ь-Аг	стереохимия
3	вз	Х,=СР Х2=Хз=Х4=СН	г°П N N Н	Сд(К) Чистый энантиомер

Таблица 4

№ соединения	№ примера	Х1,Х2,Х3,Х4	—Ь-Аг	стереохимия
4	В4	Х|=СР Х2=Хз=Х4=СН	г°П N N Н	С5(Ю;С6(К*) Один диастереоизомер Чистый энантиомер

Таблица 5

С. Аналитическая часть.

ЖХМС.

Для исследования соединений по настоящему изобретению с помощью (ЖХ)МС использовали следующие способы.

Общая методика.

Измерения с помощью ЖХ осуществляли с использованием системы ЛссцЩу ИРЬС (\Уа1ег5), содержащей насос для двухкомпонентных смесей, камеру для образцов, нагреватель колонки (установленный на 55°С) , диодно-матричный детектор (ИАО) и колонку, как определено в соответствующих способах ниже. Поток из колонки разделялся для МС-спектрометра. МС-детектор был оснащен источником ионизации электрораспылением. Масс-спектры получали сканированием от 100 до 1000 за 0,18 с с использованием времени выдержки 0,02 с. Напряжение капиллярной иглы составляло 3,5 кВ, и температуру источника поддерживали при 140°С. В качестве газа-распылителя использовали азот. Сбор и обработ- 20 024716 ку данных проводили с помощью системы обработки данных ^а1ег8-М1сгота88 Ма88Ьупх-Ореп1упх.

Способ 1.

Обращенно-фазовую ИРЬС (сверхпроизводительную жидкостную хроматографию) проводили на колонке С18 с мостиковым гибридом этилсилоксан/диоксид кремния (ВЕН) (1,7 мкм, 2,1x50 мм; \Уа1ег5 ЛссцЩу) со скоростью потока 0,8 мл/мин. Две подвижные фазы (подвижная фаза А: 10 мМ аммония ацетат в смеси 95/5 Н₂О/ацетонитрил; подвижная фаза В: ацетонитрил) использовали для соблюдения условия - градиент от 95% А и 5% В до 5% А и 95% В за 1,3 мин при удерживании в течение 0,2 мин. Использовали объем вводимой пробы 0,5 мкл.

Напряжение на конусе составляло 10 В для режима положительной ионизации и 20 В для режима отрицательной ионизации.

Способ 2.

Обращенно-фазную ИРЬС (сверхпроизводительную жидкостную хроматографию) проводили на колонке С18 с мостиковым гибридом этилсилоксан/диоксид кремния (ВЕН) (1,7 мкм, 2,1x50 мм; \Уа1ег5 Асцибу) со скоростью потока 0,8 мл/мин. Две подвижные фазы (10 мМ ацетата аммония в Н₂О/ацетонитриле 95/5; подвижная фаза В: ацетонитрил) применяли для соблюдения условия градиента от 95% А и 5% В до 5% А и 95% В за 1,3 мин при удерживании в течение 0,3 мин. Использовали объем вводимой пробы 0,5 мкл.

Напряжение на конусе составляло 10 В для режима положительной ионизации и 20 В для режима отрицательной ионизации.

Способ 3.

Обращенно-фазную ИРЬС (сверхпроизводительную жидкостную хроматографию) проводили на колонке С18 с мостиковым гибридом этилсилоксан/диоксид кремния (ВЕН) (1,7 мкм, 2,1x50 мм; \Уа1ег5 Асцибу) со скоростью потока 0,8 мл/мин. Две подвижные фазы (10 мМ ацетата аммония в Н₂О/ацетонитриле 95/5; подвижная фаза В: ацетонитрил) использовали для соблюдения условия градиента от 95% А и 5% В до 5% А и 95% В за 1,3 мин при удерживании в течение 0,3 мин. Использовали объем вводимой пробы 0,5 мкл.

Напряжение на конусе составляло 10 В для режима положительной ионизации и 20 В для режима отрицательной ионизации.

Точки плавления.

Значения представляют собой или пиковые значения, или диапазоны плавления, и их получают с экспериментальными погрешностями, которые обычно связаны с данным аналитическим способом.

И8С823е (обозначено И8С в табл. 6).

Для ряда соединений точки плавления определяли с помощью И8С823е (Меб1ег-То1ебо). Точки плавления измеряли с градиентом температуры 30°С/мин. Максимальная температура составляла 400°С.

Таблица 6

Аналитические данные - К означает время удерживания (мин), [М+Н]+ означает протонированную массу соединения, способ относится к способу, используемому для (ЖХ)МС

н.о. означает не определено, ш.д. означает широкий диапазон.

Оптические вращения.

Оптические вращения измеряли на поляриметре Регкт-Е1тег 341 с натриевой лампой и обозначали следующим образом: [α]/ ^С (конц. г/100 мл, растворитель).

Таблица 7

Аналитические данные - значения оптического вращения для энантиомерно чистых соединений

№ соединения	«нП	Длина волны (ни)	Концентрация (вес./об,%)	Раствори тель	Температу ра (»С)
3	-163,16	589	0,456	ДМФА	20
4	+196,03	365	0,1765	ДМФА	20
6	+9,12	365	0,57	ДМФА	20

- 21 024716

ЯМР.

Для ряда соединений спектры 'Н-ЯМР регистрировали на спектрометре Вгикег ΌΡΧ-360, Вгикег ΌΡΧ-400 или Вгикег Ауапсе 600 со стандартными последовательностями импульсов, действующими при 360, 400 и 600 МГц соответственно, с использованием хлороформа-б (дейтерированного хлороформа, СШСЕ,) или ДМСО-б₆ (дейтерированного ДМСО, диметил-б₆ сульфоксида) в качестве растворителей. Химические сдвиги (δ) регистрировали в частях на миллион (м.д.) относительно тетраметилсилана (ТМ§), который использовали в качестве внутреннего стандарта.

Таблица 8

№ соединения	Результат ЯМР
4	2Н-ЯМР (360 МГц, ДМСО-а6) δ м.д. 1,52 (с, ЗН) 3,87 (с, ЗН) 3, 90-4, 04 (м, 1Н) 4,06-4,21 (м, 2Н) 5, 43-5, 75 (м, 1Н) 5,77 (шир.с, 2Н) 6,73 (ДД, 0=7,7, 5,1 Гц, 1Н) 6,99 (дд, 0=11,7, 8,8 Гц, 1Н) 7,19 (д, 0-7,0 Гц, 1Н) 7,71 (д, 0-4,0 Гц, 1Н) 7,85 (ддд, 0=8,2, 3,7, 3,5 Гц, 1Н) 7,91 (дд, 0=7,0, 2,6 Гц, 1Н) 8,04 (с, 1Н)
5	Ч-ЯМР (360 МГц, СОС13-С1) : δ 1,62 (т, 0=1,8 Гц, ЗН) 3,24-3,65 (м, 2Н) 3,95-4,28 (м, 2Н) 5,936,14 (м, 1Н) 6,68 (т, 0=4,76 Гц, 1Н) 7,02 (дд, 0=11, 53, 8, 96 Гц, 1Н) 7,32 (дд, 0=6,95, 2,93 Гц, 1Н) 7,63-7,74 (м, 2Н) 8,37 (д, 0=4,76 Гц, 2Н)
6	Ч-ЯМР (360 МГц, СПИу-б) : δ 1,67 (с, ЗН) 3,90 (с, ЗН) 4,22 (с, 2Н) 4,65 (кв., 0=8,40 Гц, 1Η) 6,68 (дд, 0=8,05, 5,12 Гц, 1Н) 6,91-7,04 (м, 2Н) 7,08 (с, 1Н) 7,65 (дд, 0=6, 59, 2,93 Гц, 1Н) 7,80 (дд, 0-5,12, 1,10 Гц, 1Н) 8,07-8,17 (м, 1Н)
7	1Н-ЯМР (360 МГц, сгсч-ά) : δ 1,68 (с, ЗН) 4,22 (с, 4Н) 4,63 (кв., 0=8,05 Гц, 1Н) 6,70 (т, 0=4,76 Гц, 1Н) 7,01 (дд, 0=11,34, 8,78 Гц, 1Н) 7,22 (с, 1Н) 7,70 (дд, 0=6, 59, 2, 93 Гц, 1Н) 7,89 (дт, 0=8,78, 3, 66 Гц, 1Н) 8,40 (д, 0=4,76 Гц, 2Н)
8	^-ЯМР (360 МГц, СРС13-0) : δ 1,65 (т, 0=1,83 Гц, ЗН) 3, 97-4, 30 (м, 5Н) 5,95-6,17 (м, 1Н) 6,95-7,10 (м, 2Н) 7,39 (дд, 0=6, 95, 2, 93 Гц, 1Н) 7,46 (д, 0=2,93 Гц, 1Н) 7,64 (д, 0=3,29 Гц, 1Н) 7,86 (ддд, 0=8,78, 4,03, 2,93 Гц, 1Н)
9	^-ЯМР (360 МГц, ΟϋΟΐ^-ά) : δ 1,21 (д, 0=6,22 Гц, ЗН) 3, 98-4,30 (Μ, 2Н) 5,91-6,15 (м, 1Н) 6,78 (дд, 0=7, 68, 4, 76 Гц, 1Н) 6,95-7,11 (м, 2Н) 7,31 (дд, σ-6, 77, 2, 74 Гц, 1Н) 7,64-7,72 (м, 1Н) 7, 75-7, 83 (м, 1Н) 8,33 (дд, 0=5,12, 1,83 Гц, 1Н)
10	Ч-ЯМР (360 МГц, ΟϋΟ13-ά) : δ 1,66 (т, 0=1,65 Гц, ЗН) 3, 97-4,30 (м, 2Н) 5,94-6,16 (м, 1Н) 6,62 (дд, 0=7, 68, 4, 76 Гц, 1Н) 6,93 (с, 1Н? 7,04 (дд, 0=11,34, 8,78 Гц, 1Н) 7,32 (дд, 0=6, 95, 2, 93 Гц, 1Н) 7, 65-7, 78 (м, 2Н) 8,10 (дд, 0=4,76, 1,46 Гц, 1Н)
11	^-ЯМР (360 МГц, ССС13-а> : δ м.д. 1,67 (с, ЗН) 4,14-4,34 (м, 4Н) 4,65 (д, 0=8,42 Гц, 1Н) 6,78 (дд, 0=7, 50, 4, 94 Гц, 1Н) 6, 98-7, 08 (м, 2Н) 7,71 (дд, 0-6,59, 2,93 Гц, 1Н) 7,78 (дд, 0=7, 68, 1, 83 Гц, 1Н) 7,94 (ддд, 0=8, 78, 4,03, 2,93 Гц, 1Н) 8,37 (дд, 0=5,12, 1,83 Гц, 1Н)

Ό. Фармакологические примеры.

Соединения, предложенные в настоящем изобретении, являются ингибиторами ΑΡΡрасщепляющего по бета-сайту фермента 1 (ВАСЕ1). Полагают, что ингибирование ВАСЕ1, аспарагиновой протеазы, является существенным для лечения болезни Альцгеймера (АО). Полагают, что продуцирование и накопление бета-амилоидных пептидов (Абета) из белка-предшественника бета-амилоида (ΑΡΡ) играет ключевую роль в возникновении и прогрессировании АО. Абета образуется из белкапредшественника амилоида (ΑΡΡ) в результате последовательного расщепления на Ν- и С-концах домена абета бета-секретазой и гамма-секретазой соответственно.

Предполагается, что соединения формулы (I) действуют главным образом на ВАСЕ1 в силу своей способности ингибировать ферментативную активность. Поведение таких ингибиторов, которые тестировали с помощью биохимического анализа на основе резонансного переноса энергии флуоресценции (РВЕТ) и клеточного анализа </.Ша на клетках 81^ВЕ2, которые описаны ниже и которые являются подходящими для выявления таких соединений и, в частности, соединений в соответствии с формулой (I), показано в табл. 9 и 10.

Биохимический анализ на основе РВЕТ.

- 22 024716

Данный анализ представляет собой анализ на основе резонансного переноса энергии флуоресценции (ЕРЕТ). Субстратом для данного анализа является полученный из АРР 13 аминокислотный пептид, который содержит шведскую мутацию Ьук-МеСАки-Ьеи сайта расщепления белка-предшественника амилоида (АРР) бета-секретазой. Данный субстрат также содержит два флуорофора: (7-метоксикумарин4-ил)уксусную кислоту (Мса), которая является донором флуоресценции с длиной волны возбуждения 320 нм и излучения 405 нм, и 2,4-динитрофенил (Όηρ), который является соответствующим акцепторомгасителем. Расстояние между этими двумя группами выбирали таким образом, чтобы при световом возбуждении энергия флуоресценции донора в значительной степени гасилась акцептором посредством резонансного переноса энергии. При расщеплении с помощью ВАСЕ1 флуорофор Мса отделяется от гасящей группы Όηρ, восстанавливая полный выход флуоресценции донора. Увеличение флуоресценции линейно зависит от степени протеолиза.

Вкратце, в 384-луночном формате рекомбинантный белок ВАСЕ1 при конечной концентрации 1 мкг/мл инкубировали в течение 120 мин при комнатной температуре с 10 мкМ субстрата в инкубационном буфере (40 мМ цитратного буфера, рН 5,0, 0,04% РЕС, 4% ДМСО) в отсутствии или в присутствии соединения. Далее величину протеолиза непосредственно измеряли путем измерения флуоресценции в момент Т=0 и Т=120 (возбуждение при 320 нм и излучение при 405 нм). Результаты выражали в РЕИ (относительных единицах флуоресценции) как разницу между Т120 и Т0.

Кривую наилучшего приближения подбирали при помощи методики суммы наименьших квадратов для графика зависимости % мин. контроля от концентрации соединения. На его основании можно получить значение 1С₅₀ (ингибирующая концентрация, вызывающая 50% ингибирование активности).

ЬС=Медиана значений низкого контроля =Низкий контроль:реакция без фермента;

НС=Медиана значений высокого контроля =Высокий контроль:реакция с ферментом;

% эффекта=100-[(образец-ЕС)/(НС-ЬС)*100];

% контроля=(образец/НС)*100;

% мин контроля=(образец-ЕС)/(НС-ЕС)*100.

Следующие соединения, приведенные в качестве примера, тестировали главным образом, как описано выше, и они проявляли следующую активность:

Таблица 9

Клеточный анализ аЫка на клетках 8ΚΝΒΕ2.

В двух анализах Ыка количественно определяли уровни общего абета и абета 1-42, продуцируемых и секретируемых в среду клеток 8ΚΝΒΕ2 нейробластомы человека. Анализ основан на 8ΚΝΒΕ2 нейробластомы человека, экспрессирующих белок-предшественник амилоида дикого типа (ЙАРР695). Соединения разбавляли и добавляли к этим клеткам, инкубировали в течение 18 ч, а затем осуществляли измерения количества абета 1-42 и общего абета. Общий абет и абет 1-42 измеряли с помощью сендвич аЫка. аЫка представляет собой сэндвич-анализ с использованием биотинилированного антитела АЬМ25, связанного с покрытыми стрептавидином гранулами, или антитела АЬ4С8 или сАЬ42/26, конъюгированного с груналами-акцепторами, для определения общего абета и абета 1-42 соответственно. В присутствии общего абета или абета 1-42 гранулы приближаются друг к другу. Возбуждение гранул-доноров вызывает высвобождение молекул синглетного кислорода, что запускает каскад переноса энергии на гранулыакцепторы, приводящий в результате к излучению света. Излучение света измеряли через 1 ч после инкубирования (возбуждение при 650 нм и излучение при 615 нм).

Кривую наилучшего приближения подбирали при помощи методики суммы наименьших квадратов для графика зависимости % мин контроля от концентрации соединения. На его основании можно получить значение 1С₅₀ (ингибирующая концентрация, вызывающая 50% ингибирование активности).

- 23 024716

ЬС=Медиана значений низкого контроля =Низкий контроль: клетки, предварительно инкубированные без соединения, без биотинилированного ЛЬ в аЫка;

НС=Медиана значений высокого контроля =Высокий контроль: клетки, предварительно инкубированные без соединения;

% эффекта=100-[(образец-ЬС)/(НС-ЬС)*100];

% контроля=(образец/НС)*100;

% мин контроля=(образец-ЬС)/(НС-ЬС)*100.

Следующие соединения, приведенные в качестве примера, тестировали главным образом, как описано выше, и они проявляли следующую активность:

Таблица 10

Claims (8)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение формулы (I) где К¹ представляет собой фтор, дифторметил или трифторметил;

   К² представляет собой водород или трифторметил; или

   К¹ и К² образуют двухвалентный радикал =СР₂;

   К³ представляет собой С1_-3алкил, циклопропил, моно- или полигалоген-С1_-3алкил;

   К⁴ представляет собой водород или фтор;

   Аг представляет собой гетероарил;

   где гетероарил представляет собой пиридил или пиримидил, каждый из которых необязательно замещен одним, двумя или тремя заместителями, выбранными из галогена, циано, С1_-3алкила, С₂₃алкинила, Сцзалкилокси, моно- и полигалоген-С1_-3алкила, моно- и полигалоген-Сцзалкилокси и С₁3алкилоксиС1-3алкилокси;

   или его стереоизомерная форма или его фармацевтически приемлемая соль.
2. 2. Соединение по п.1, где

   К¹ представляет собой фтор, дифторметил или трифторметил,

   К² представляет собой водород; или

   К¹ представляет собой фтор,

   К² представляет собой трифторметил; или

   К¹ и К² образуют двухвалентный радикал =СР₂;

   К³ представляет собой метил или циклопропил;

   К⁴ представляет собой водород или фтор;

   Аг представляет собой гетероарил;

   где гетероарил представляет собой пиридил, замещенный метокси или пиримидил; или его фармацевтически приемлемая соль.
3. 3. Соединение по п.1, где атом углерода, замещенный К³, характеризуется К-конфигурацией.
4. 4. Соединение по п.1, выбранное из (5К,6§)-5-циклопропил-6-фтор-5-{3-[(3-метоксипиридин-2-ил)амино]фенил}-6-(трифторметил)-5,6дигидро-2Н-1,4-оксазин-3-амина, (5К,6К)-6-фтор-5-{2-фтор-5-[(3-метоксипиридин-2-ил)амино]фенил}-5-метил-5,6-дигидро-2Н-1,4оксазин-3 -амина,

   - 24 024716 (5К)-6-(дифторметилиден)-5-{2-фтор-5-[(3-метоксипиридин-2-ил)амино]фенил}-5-метил-5,6дигидро-2Н-1,4-оксазин-3 -амина, (5К,6К*)-6-(дифторметил)-5-{2-фтор-5-[(3-метоксипиридин-2-ил)амино]фенил}-5-метил-5,6дигидро-2Н-1,4-оксазин-3 -амина, (5К,6К)-6-фтор-5-[2-фтор-5-(пиримидин-2-иламино)фенил]-5-метил-5,6-дигидро-2Н-1,4-оксазин-3амина, (5К,6К)-5-{2-фтор-5-[(3-метоксипиридин-2-ил)амино]фенил]-5-метил-6-(трифторметил)-5,6дигидро-2Н-1,4-оксазин-3-амина, (5К,6К)-5-[2-фтор-5-(пиримидин-2-иламино)фенил]-5-метил-6-(трифторметил)-5,6-дигидро-2Н-1,4оксазин-3 -амина, (5К,6К)-6-фтор-5-{2-фтор-5-[(3-метоксипиразин-2-ил)амино]фенил}-5-метил-5,6-дигидро-2Н-1,4оксазин-3-амина и (5К,6К)-5-{2-фтор-5-[(3-метоксипиразин-2-ил)амино]фенил}-5-метил-6-(трифторметил)-5,6дигидро-2Н-1,4-оксазин-3-амина.
5. 5. Фармацевтическая композиция для лечения расстройства, выбранного из болезни Альцгеймера, умеренного когнитивного нарушения, старения, деменции, деменции с тельцами Леви, церебральной амилоидной ангиопатии, слабоумия вследствие множественных инфарктов, синдрома Дауна, деменции, ассоциированной с инсультом, деменции, ассоциированной с болезнью Паркинсона, и деменции, ассоциированной с бета-амилоидом, содержащая терапевтически эффективное количество соединения по любому из пп.1-4 и фармацевтически приемлемый носитель.
6. 6. Способ получения фармацевтической композиции по п.5, отличающийся тем, что фармацевтически приемлемый носитель тщательно смешивают с терапевтически эффективным количеством соединения по любому из пп.1-4.
7. 7. Применение соединения по любому из пп.1-4 для лечения или профилактики болезни Альцгеймера (АО), умеренного когнитивного нарушения, старения, деменции, деменции с тельцами Леви, церебральной амилоидной ангиопатии, слабоумия вследствие множественных инфарктов, синдрома Дауна, деменции, ассоциированной с инсультом, деменции, ассоциированной с болезнью Паркинсона, или деменции, ассоциированной с бета-амилоидом.
8. 8. Способ лечения расстройства, выбранного из болезни Альцгеймера, умеренного когнитивного нарушения, старения, деменции, деменции с тельцами Леви, церебральной амилоидной ангиопатии, слабоумия вследствие множественных инфарктов, синдрома Дауна, деменции, ассоциированной с инсультом, деменции, ассоциированной с болезнью Паркинсона, и деменции, ассоциированной с бетаамилоидом, у субъекта, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.5.