EA021241B1 - ОКСАЗОЛО[5,4-b]ПИРИДИН-5-ИЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ - Google Patents

Abstract

В изобретении предложены оксазоло[5,4-b]пиридин-5-ильные соединения, подходящие для лечения рака.

Description

В настоящем изобретении также предложен кристаллический 2-[5-(2,4-дифторфенил)-4-[2-[[(18)-3метокси-1-метилпропил]амино]оксазоло[5,4-Ь]пиридин-5-ил]-1Н-имидазол-2-ил]-2-метилпропан-1-ол, характеризующийся порошковой рентгеновской дифрактограммой, (излучение Си, λ= 1,54060 А), имеющей пик при 13,73 и один или более пиков при 16,54, 22,87 и 18,57 (2θ+/-0,2°).

В настоящем изобретении предложено соединение, которое представляет собой 2-[5-(2,4дифторфенил)-4-[2-[[(18)-3-метокси-1-метилпропил]амино]оксазоло[5,4-Ь]пиридин-5-ил]-1Н-имидазол2-ил]-2-метилпропан-1-ол, или его фармацевтически приемлемая соль.

В настоящем изобретении предложено соединение, которое представляет собой 5-[2-циклопропил5-(2,4-дифторфенил)-1Н-имидазол-4-ил]-Н-[(1§)-3-метокси-1-метилпропил]оксазоло[5,4-Ь]пиридин-2амин, или его фармацевтически приемлемая соль.

В настоящем изобретении предложено соединение, которое представляет собой 5-[5-(2,4дифторфенил)-2-(3-метилоксетан-3-ил)-1Н-имидазол-4-ил]-Ы-[(1§)-3-метокси-1-метилпропил]оксазоло [5,4-Ь]пиридин-2-амин, или его фармацевтически приемлемая соль.

В настоящем изобретении предложено соединение, которое представляет собой [1-[5-(2,4дифторфенил)-4-[2-[[(18)-2-этокси-1-метилэтил]амино]оксазоло[5,4-Ь]пиридин-5-ил]-1Н-имидазол-2ил]циклопропил]метанол, или его фармацевтически приемлемая соль.

В настоящем изобретении предложен способ лечения рака яичников у млекопитающего, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в указанном лечении, эффективного количества соединения или соли согласно настоящему изобретению.

В настоящем изобретении предложен способ лечения множественной миеломы у млекопитающего, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в указанном лечении, эффективного количества соединения или соли согласно настоящему изобретению.

В настоящем изобретении предложен способ лечения рака, в частности рака почек, у млекопитающего, включающий одновременное, раздельное или последовательное введение млекопитающему, нуждающемуся в указанном лечении, эффективного количества соединения или соли согласно настоящему изобретению в комбинации с сунитинибом.

В настоящем изобретении также предложены фармацевтические композиции, содержащие соединение или соль согласно настоящему изобретению в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или наполнителями. В конкретном варианте реализации композиция дополнительно содержит один или более других терапевтических агентов. Более конкретно, другой терапевтический агент представляет собой сунитиниб.

В изобретении также предложено соединение или соль согласно настоящему изобретению для применения в терапии. В изобретении также предложено соединение или соль согласно настоящему изобретению для применения для лечения рака. Кроме того, в настоящем изобретении предложено применение соединения или соли согласно настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения рака. Кроме того, в настоящем изобретении предложено применение соединения или соли согласно настоящему изобретению для применения для лечения рака. В частности, указанное раковое заболевание представляет собой рак яичников. Кроме того, указанное раковое заболевание представляет собой множественную миелому.

В настоящем изобретении также предложены соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль и сунитиниб, применяемые в виде объединенного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения в терапии.

В изобретении также предложен сунитиниб для одновременного, раздельного или последовательного применения в комбинации с соединением согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой солью для лечения рака. В качестве альтернативы в изобретении предложено соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль для одновременного, раздельного или последовательного применения в комбинации с сунитинибом для лечения рака. Более конкретно, рак представляет собой рак почек.

Специалистам в данной области техники будет понятно, что соединения формулы I могут образовывать соли. Соединения согласно настоящему изобретению содержат основные гетероциклы и, соответственно, взаимодействуют с любыми неорганическими и органическими кислотами с образованием фармацевтически приемлемых солей присоединения кислот. Указанные фармацевтически приемлемые соли присоединения кислот и общие способы их получения хорошо известны в данной области техники. См., например, Р. 8&Ы, е! а1., ΗΑΝΏΒΟΟΚ ОБ РНАКМАСЕИТ1САЕ 8АЬТ8: ΡΚΌΡΕΚΊΊΕ8, 5Е1.ЕСТ1ОХ ΑΝΏ И8Е, (УСНАЖйеу-УСН, 2008); 8.М. Вегде, е! а1., РЬагшасеийса1 ЗаЙ8, 1оигиа1 οί РЬагшасеийса1 Зшеисек, Уо1 66, Νο. 1, 1аииагу 1977.

Специалистам в данной области техники будем очевидным, что соединения согласно настоящему изобретению содержат по меньшей мере один хиральный центр. Настоящее изобретение охватывает все индивидуальные энантиомеры и диастереомеры, а также смеси энантиомеров и диастереомеров указанных соединений, включая рацематы. Предпочтительно соединения согласно настоящему изобретению, содержащие по меньшей мере один хиральный центр, существуют в виде отдельного энантиомера или

- 2 021241 диастереомера. Отдельные энантиомеры или диастереомеры можно получать с применением исходных хиральных реагентов или при помощи стереоселективных или стереоспецифичных способов синтеза. В качестве альтернативы, отдельные энантиомеры или диастереомеры можно выделять из смесей при помощи традиционных способов хиральной хроматографии или кристаллизации.

Сунитиниб, реализуемый под торговой маркой δυΤΕΝΤ®, представляет собой пероральный низкомолекулярный многоцелевой ингибитор рецепторных тирозинкиназ, одобренный ΡΌΆ для лечения почечноклеточной карциномы и стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта, резистентных к иматинибу. Сунитиниб описан в \УО 200160814.

Получение соединений формулы I, где К представляет собой циклопропил или 3-метилоксетан-3ил; X такой, как определено выше.

Схема I

Ортогидроксипиридил-3-амины (А) обрабатывают изотиоцианатами (В), которые могут представлять собой рацематы или отдельные энантиомеры, в этаноле при нагревании. При нагревании периодически избыток Ν,Ν'-дизамещенного карбодиимида добавляют для удаления сульфида водорода. Например, Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимид, Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимид или гидрохлорид 1-этил-3-(3диметиламинопропил)карбодиимида можно применять. Синтез изотиацианатов (В), которые могут представлять собой рацематы или отдельные энантиомеры, описан ниже в примерах получения.

Получение соединений формулы I, где К представляет собой метил-2-метилпропанкарбоксилат-2ил или метил-циклопропанкарбоксилат-1-ил; X такой, как определено выше.

Схема II

5-(1Н-имидазол-4-ил)оксазоло[5,4-Ъ]пиридины (С) восстанавливают с применением боргидрида лития в эфире с получением соединений формулы I, промежуточные соединения (С) аналогично получают из соответствующих гидроксипиридил-3-аминов (А) (схема I), где К представляет собой метил-2метилпропанкарбоксилат-2-ил или метилциклопропанкарбоксилат-1-ил, и изотиацианатов (В), как показано на схеме I.

Синтез промежуточных соединений (А), где К представляет собой метил-2-метилпропанкарбоксилат-2-ил, метилциклопропанкарбоксилат-1-ил, циклопропил или 3-метилоксетан-3-ил.

В 6-(1Н-имидазол-4-ил)-3-нитропиридин-2-амине (Ό) осуществляют превращения функциональных групп пиридинового кольца, включая деазотирование аминогруппы в положении 2 пиридила, последующее гашение водой и гидрирование нитрогруппы в положении 3 пиридила с получением промежуточных соединений (А).

Синтез промежуточных соединений (Ό), где К такой, как определено на схеме III.

Схема IV

Промежуточные соединения (Ό) получают из 1-(6-амино-5-нитро-2-пиридил)-2-(2,4-дифторфенил) этан-1,2-диона (Р) и известных альдегидов (Е) путем нагревания в диоксане с ацетатом аммония. Синтез промежуточного соединения (Р) описан ниже в примерах получения.

Соединения согласно настоящему изобретению получают, по существу, так же, как проиллюстрировано в схемах, примерах получения и примерах, приведенных ниже. Реагенты и исходные вещества

- 3 021241 легкодоступны специалистам в данной области техники или могут быть получены при помощи способов, выбранных из традиционных способов органической и гетероциклической химии, способов, аналогичных примерам синтеза известных соединений со схожей структурой, и способов, описанных ниже в примерах, включая любые новые способы. Следует понимать, что примеры получения и примеры приведены в качестве иллюстрации, но не ограничения, и специалисты в данной области техники могут проводить различные модификации.

Названия, приведенные в следующих примерах получения и примерах, в целом, получали с применением инструмента составления названий ШРЛС δΥΜΥΧ® Ога\у. версия 3.2 ΝΕΤ.

Пример получения 1. трет-Бутил-(3§)-3-[бензил-[(18)-1-фенилэтил]амино]бутаноат

Примеры получения 1 и 2 описаны в \УО 2006/076595 на примере Ρ,Ρ-энантиомера. См. также Эаνίθδ, δ. С. апб 1еЫйага, О. Тс1гаНсбгоп: Л5уттс1гу 1991, 2, 183-186, где приведено описание асимметрического синтеза 3-аминобутаноатов из (Е)-бут-2-еноатов (кротонатов).

(18)-^Бензил-1-фенилэтанамин (28,53 г, 135 ммоль) растворяли в безводном тетрагидрофуране (ТГФ) и раствор охлаждали до 0°С в атмосфере аргона. Н-бутиллитий (2,5М в гексане, 54 мл, 135 ммоль) добавляли по каплям в течение 30 мин. Реакционную смесь перемешивали в течение 20 мин при 0°С, а затем охлаждали до -78°С. Раствор трет-бутил-(Е)-бут-2-еноата (10 г, 70,32 ммоль) в безводном ТГФ (75 мл) добавляли в реакционную смесь в течение 20 мин. Через 75 мин реакцию гасили путем добавления насыщенного раствора ΝΗ₄Ο (175 мл) и насыщенного водного Ν;·ιί'Ί (солевой раствор, 100 мл). Слои разделяли и водный слой экстрагировали диэтиловым эфиром (2x125 мл). Объединенные органические слои сушили над безводным Μ§δΟ₄, фильтровали и концентрировали с получением желтой маслянистой жидкости. Неочищенный продукт растворяли в гексане (250 мл) и промывали 10% водным раствором лимонной кислоты (3x75 мл). Органический слой сушили над Μ§δΟ₄, фильтровали и концентрировали с получением титульного соединения в виде желтой маслянистой жидкости (24,12 г, 97%). ЖХ-ИЭР/МС т/ζ 354 (М+1).

Пример получения 2. (38)-3-[Бензил-[(18)-1-фенилэтил]амино]бутан-1-ол

трет-бутил-(38)-3-[бензил-[(18)-1-фенилэтил]амино]бутаноат (24 г, 67,9 ммоль) растворяли в безводном ТГФ (237 мл) и охлаждали до 0°С в атмосфере аргона. 1М алюмогидрид лития в ТГФ (237 мл, 237 ммоль) добавляли по каплям в течение 10 мин. Реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение 1 ч, а затем при 60°С в течение 1 ч. Смесь охлаждали до комнатной температуры (КТ) и разбавляли диэтиловым эфиром (500 мл). Реакцию гасили смесью СЕПТЕ® и №₂δΟ₄ 10Η₂Ο (1:1), которую добавляли порциями в течение 15 мин. Смесь фильтровали и концентрировали в вакууме с получением титульного соединения в виде бесцветной маслянистой жидкости (17,54 г, 90%). ЖХ-ИЭР/МС т/ζ 284 (М+1).

Пример получения 3. (28)-^Бензил-4-метокси-^[(18)-1-фенилэтил]бутан-2-амин

(38)-3-[бензил-[(18)-1-фенилэтил]амино]бутан-1-ол (17,54 г, 61,9 ммоль) растворяли в безводном ТГФ (186 мл) и охлаждали до 0°С в атмосфере аргона. Гидрид натрия (4,95 г, 60% суспензия в минеральном масле, 123,8 ммоль) добавляли порциями в течение 10 мин. Смесь перемешивали при 0°С в течение 15 мин, затем оставляли нагреваться до КТ. Метилйодид (10,54 г, 74,28 ммоль) добавляли по каплям в течение 30 мин. После перемешивания в течение 30 мин реакцию гасили путем добавления насыщенного раствора ПН₄С1 в воде. Слои разделяли и водный слой экстрагировали диэтиловым эфиром (2x100 мл). Объединенные органические слои сушили над Μ§δΟ₄, концентрировали и неочищенное вещество очищали путем нормально-фазовой хроматографии (два 120 г картриджа с силикагелем, 10% метил-третбутиловый эфир в гексане) с получением титульного соединения в виде бесцветной маслянистой жидкости (14,96 г, 81%). ЖХ-ИЭР/МС т/ζ 298 (М+1).

Пример получения 4. Гидрохлорид (8)-4-метоксибутан-2-амина ын,С| (28)-^бензил-4-метокси-^[(18)-1-фенилэтил]бутан-2-амин (14,96 г, 50,29 ммоль) растворяли в метаноле (400 мл). Из раствора удаляли кислород путем продувания азотом. К раствору добавляли 20%

- 4 021241 гидроксид палладия на подложке углерода (1,50 г) и полученную суспензию насыщали водородом и перемешивали в атмосфере водорода в течение 16 ч. Основным продуктом в этот момент являлся продукт монодебензилирования. Суспензию фильтровали через подложку СБЫТЕ® и 1,1 г 20% гидроксида палладия на подложке углерода добавляли в полученный раствор. Суспензию перемешивали в течение 24 ч в атмосфере водорода, суспензию фильтровали через подложку СЕЫТЕ® и 2н. раствор НС1 в диэтиловом эфире (60 мл) добавляли в смесь и перемешивали в течение 30 мин. Раствор концентрировали при пониженном давлении с получением титульного соединения в виде белого твердого вещества (7,01 г, 99%). Ή ЯМР (400 МГц, СОСТ); δ 1,48 (3Н, Л, 1= 6,8 Гц), 1,8-1,9 (1Н, т), 2,0-2,1 (1Н, т), 3,37 (3Н, 5), 3,53,7 (3Н, т), 8,3 (3Н, Ьг).

Пример получения 5. (К)-Ы-[(1§)-3-Метокси-1-метилпропил]-2-метилпропан-2-сульфинамид

Ψ „3-,

ΗΝ О

Следующий способ основан на способе, приведенном в Е11тап, 1. А. с1 а1 1. Огд. СЬет. 2007, 72, 626-629.

К 1н. раствору НС1 (7,0 мл, 7,00 ммоль) добавляли 1,3,3-триметоксибутан (53,19 мл, 337,38 ммоль) по каплям и полученный раствор нагревали до 50°С и перемешивали в течение 30 мин. Бикарбонат натрия (16,50 г, 196,41 ммоль) добавляли в смесь, охлажденную до КТ, затем добавляли диэтиловый эфир и Мд8О₄. Фильтрование и последующее выпаривание растворителя приводили к получению кетоэфирного промежуточного соединения, 4-метоксибутан-2-она, в виде желтой маслянистой жидкости. Маслянистую жидкость добавляли к раствору (К)-(+)-2-метил-2-пропансульфинамида (36,80 г, 303,64 ммоль) и этоксида титана (IV) (123,14 г, 539,80 ммоль) в ТГФ (482 мл) при 25°С в атмосфере азота. Полученную желтую суспензию нагревали до 60°С и перемешивали при указанной температуре в течение 16 ч. Реакционную смесь охлаждали до КТ, а затем до -48°С. 1,0М три(втор-бутил)боргидрид лития в ТГФ (539,80 мл, 539,80 ммоль) добавляли по каплям. Реакционную смесь оставляли нагреваться до КТ. Через 1 ч реакционную смесь охлаждали до 0°С и метанол (1100 мл) добавляли при быстром перемешивании до окончания выделения газа. Полученную суспензию фильтровали через небольшую колонку с СЕЫТЕ® и осадок промывали этилацетатом. Фильтрат промывали солевым раствором, слой в солевом растворе экстрагировали дважды этилацетатом. Объединенные органические слои сушили над Να₂8Ο₄, фильтровали и выпаривали с получением желтой маслянистой жидкости.

Неочищенное вещество помещали в силикагель и очищали на колонке с силикагелем с применением градиентного элюирования смесью гексан/этилацетат (от 7:1 до 100% этилацетата) с получением целевого продукта. Другие фракции, содержащие неполярные примеси и целевой продукт, собирали и очищали снова путем хроматографии на силикагеле. Неполярную примесь удаляли с применением смеси гексан/этилацетат, 4:1. Целевой продукт элюировали смесью дихлорметан/метанол, 95:5, с получением дополнительного количества вещества. Две навески вещества объединяли с получением 38 г (54%) смеси с соотношением содержания целевого/нежелательного диастереомеров, определенным путем ЖХМС, составляющим примерно 3:1.

Вещество (38 г) объединяли с другой навеской вещества (23 г), которую получали при помощи того же общего способа, и диастереомеры (соотношение 3:1, 61 г) разделяли путем хиральной высокоэффективной жидкостной хроматографии (стационарная фаза: ΟΌ-Н; размер колонки (20 мкм, 80x250 мм); режим элюирования: изократический; мобильная фаза: гексан/изопропанол; расход 300 мл/мин; УФ детектирование: 215,16 нм; нагрузка: 4 г/6 мин). Первый элюируемый пик соответствовал побочному диастереомеру, Т_Е = 4,75 мин. Второй элюируемый пик соответствовал основному диастереомеру (целевой продукт), Т_Е = 6,61 мин. Титульное соединение получали в виде светло-желтой маслянистой жидкости (43,5 г) путем хиральной хроматографии. ИЭР/МС т/ζ 208 (М+1); э.и. >98%.

Пример получения 6. Гидрохлорид (8)-4-метоксибутан-2-амина |\)Н₃С1

Хлороводород, 4,0М в диоксане (110,15 г, 419,61 ммоль) добавляли к раствору (Κ)-Ν-[(18)-3метокси-1-метилпропил]-2-метилпропан-2-сульфинамида (43,5 г, 209,80 ммоль) в 1,4-диоксане (109 мл) при 0°С и реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч при КТ. Растворитель концентрировали при пониженном давлении, остаток повторно суспендировали в толуоле и растворитель выпаривали при пониженном давлении. Остаток сушили в вакууме в течение 15 мин. Добавляли ТГФ, и осаждалось белое твердое вещество. Белое твердое вещество отфильтровывали, промывали ТГФ, оставляли сушиться и собирали с получением титульного соединения (25,4 г, 87%).

Абсолютную конфигурацию амина можно подтверждать путем дериватизации с применением (8)-(-)-а-трифторметилфенилуксусной кислоты и сравнения ЯМР спектра со спектром указанного производного (8)-4-метоксибутан-2-амина, полученного согласно примеру получения 4 при помощи хирально- 5 021241 го способа.

Пример получения 7. (3§)-3-Изотиоцианато-1-метоксибутан

Гидрохлорид (§)-4-метоксибутан-2-амина (25,4 г, 181,92 ммоль) суспендировали в ТГФ (609 мл) и добавляли триэтиламин (ТЭА, 32,17 мл, 230,78 ммоль). 1,1'-тиокарбонилдиимидазол (46,74 г, 251,76 ммоль) добавляли в белую суспензию (реакция проходит с незначительным выделением тепла) и полученную желтую суспензию перемешивали в атмосфере азота в течение ночи. Этилацетат (500 мл) добавляли в желтую суспензию, затем 1н. НС1 (500 мл). Органическую фазу отделяли и промывали 1н. НС1 (3x200 мл), водой (200 мл) и солевым раствором (200 мл), сушили над Ν;·ι₂δϋ₄. фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением титульного соединения (25,3 г, 83%) в виде желтой маслянистой жидкости. ' Н ЯМР (400 МГц, СЭС1₃); δ1,37 (3Н, й, 1= 6,6 Гц), 1,83 (2Н, ф 1= 6,6 Гц), 3,35 (3Н, 5), 3,6-3,4 (2Н, т), 3,99 (1Н, 5ΐχ, 1= 6,6 Гц).

Пример получения 8. Метил-2,2-диметил-3-оксопропаноат

О н

Метил-3-гидрокси-2,2-диметилпропаноат (52,4 г, 396,49 ммоль) растворяли в дихлорметане (495 мл) и смесь охлаждали на ледяной бане. Трихлоризоциануровую кислоту (101,36 г, 436,14 ммоль) добавляли порциями, затем 2,2,6,6-тетраметилпиперидин^-оксид (6,20 г, 39,65 ммоль). Смесь перемешивали при 0°С в течение 15 мин, затем оставляли нагреваться до КТ и перемешивали еще 60 мин. Затем твердое вещество отфильтровывали через СЕПТЕ® и промывали дихлорметаном (300 мл). Фильтрат промывали насыщенным раствором №₂СО₃ в воде. Органическую фазу сушили над Να₂δϋ.₁, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением титульного соединения (41,24 г, 80%) в виде зеленоватого твердого вещества. Продукт применяли без дополнительной очистки в реакции на следующей стадии. Ή ЯМР (400 МГц, СЭС1₃); δ 1,34 (6Н, 5), 1,34 (6Н, 5), 3,74 (3Н, 5), 9,64 (1Н, 5).

Пример получения 9. 6-[2-(2,4-дифторфенил)этинил]-3-нитропиридин-2-амин

6-Хлор-3-нитропиридин-2-амин (1254 г, 7,23 моль), триэтиламин (1510 мл, 10,84 моль) и ацетонитрил (10 л) помещали в 20 л 4-горлую круглодонную колбу, оборудованную механической мешалкой, в атмосфере азота. В полученную желтую суспензию добавляли йодид меди (I) (13,9 г, 72,3 ммоль) и хлорид бис(трифенилфосфин)палладия (II) (50,72 г, 72,3 ммоль). Полученную бледно-оранжевую суспензию охлаждали до 0-5°С, а затем дегазировали в течение 10 мин азотом. Раствор 1-этинил-2,4-дифторбензола (1100 г, 7,95 моль) в ацетонитриле (2,5 л) добавляли по каплям в течение 60 мин. Полученную смесь оставляли перемешиваться при КТ (30°С) на ночь. Смесь охлаждали до 0-5°С. В суспензию добавляли толуол (6 л) и смесь перемешивали в течение 45 мин и фильтровали через фритту. Твердое вещество промывали толуолом (3x3 л), водой (2x3 л) и сушили в течение ночи в вакуумной печи с получением титульного соединения в виде желтого твердого вещества (1750 г, 92%). ЖХ-ИЭР/МС т/ζ 276 (М+1).

Пример получения 10.1-(6-Амино-5-нитро-2-пиридил)-2-(2,4-дифторфенил)этан-1,2-дион

В охлажденную суспензию (0-10°С) 6-[2-(2,4-дифторфенил)этинил]-3-нитропиридин-2-амина (500 г, 1,82 моль) в ацетоне (10 л) добавляли охлажденный буфер |№-1Н₂РО₄ (0,8М)/№₂НРО₄ (0,8М) = 85/15 (об./об.)] (рН 6,0; 0-10°С; 10 л). Поддерживали температуру, составляющую 15°С. Перманганат калия (1035 г, 6,55 моль) добавляли порциями (3 части). Смесь перемешивали в течение 4 ч при 15°С. рН доводили до 5,0 и температуру поддерживали ниже 15°С. Медленно добавляли 28% раствор тиосульфата натрия (2054 мл, 3,64 моль), поддерживая температуру ниже 15° и рН ниже 7,5. Солевой раствор (7,5 л) и смесь метил-трет-бутилового эфира (3,75 л) и этилацетата (3,75 л) добавляли в суспензию. Смесь перемешивали в течение 15 мин при 13°С. Две фазы разделяли и водную коричневую суспензию экстрагировали дважды метил-трет-бутиловым эфиром (3,5 л). Объединенные органические слои собирали и промывали солевым раствором (2x3 л), сушили над №₂8О₄, фильтровали и растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением титульного соединения в виде желтого твердого вещества (375 г). Эксперимент повторяли в тех же условиях еще два раза. Полученные партии объединяли с получением

- 6 021241

1080 г титульного вещества. ЖХ-ИЭР/МС т/ζ 308 (М+1).

Пример получения 11. Метил-2-[4-(6-амино-5-нитро-2-пиридил)-5-(2,4-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил] -2-метилпропаноат

В круглодонную колбу, оборудованную обратным холодильником, добавляли 1-(6-амино-5-нитро2-пиридил)-2-(2,4-дифторфенил)этан-1,2-дион (50 г, 162,75 ммоль), ацетат аммония (126,72 г, 1,63 моль), метил-2,2-диметил-3-оксопропаноат (42,36 г, 325,51 ммоль) и 1,4-диоксан (163 мл). Реакционную смесь нагревали до 80°С в течение 1,5 ч. Исходный оранжевый раствор темнел при нагревании. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления диоксана и остаток сушили в глубоком вакууме в течение ночи. Остаток перерастворяли в этилацетате (800 мл) и экстрагировали 2М раствором Ыа₂СО₃ в воде. Органическую фазу сушили над М§§0₄, концентрировали и сушили в глубоком вакууме в течение ночи с получением титульного соединения в виде неочищенного оранжевого твердого вещества (80 г), которое применяли на следующей стадии без дополнительной очистки. ЖХ-ИЭР/МС т/ζ 418(М+1).

Пример получения 12. Метил-2-[5-(2,4-дифторфенил)-4-(6-гидрокси-5-нитро-2-пиридил)-1Н-имидазол-2-ил]-2-метилпропаноат

К раствору метил-2-[4-(6-амино-5-нитро-2-пиридил)-5-(2,4-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2метилпропаноата (56 г, 134,17 ммоль) в диметилсульфоксиде (ДМСО, 400 мл) и воде (320 мл) по каплям добавляли 95-97% серную кислоту (80 мл). Затем смесь охлаждали до 0°С. К полученной выше смеси добавляли по каплям раствор нитрита натрия (18,70 г, 268,35 ммоль) в воде (80 мл) в течение 15 мин при 0°С. Реакционную смесь перемешивали в течение 20 мин при указанной температуре, а затем удаляли охлаждающую баню и температуру повышали до КТ. К реакционной смеси добавляли 0,8М водный буферный раствор одноосновного фосфата натрия (1200 мл, рН 6). Образовывалась желтая суспензия. Указанную суспензию перемешивали при КТ в течение 1 ч. Твердое вещество отфильтровывали, промывали водой и сушили в печи с получением титульного соединения в виде оранжевого твердого вещества (49,5 г, 88%). ЖХ-ИЭР/МС т/ζ 419 (М+1).

Пример получения 13. Метил-2-[4-(5-амино-6-гидрокси-2-пиридил)-5-(2,4-дифторфенил)-1Нимидазол-2-ил]-2-метилпропаноат

Смесь метил-2-[5-(2,4-дифторфенил)-4-(6-гидрокси-5-нитро-2-пиридил)-1Н-имидазол-2-ил]-2-метилпропаноата (49,5 г, 118,32 ммоль) и 5 мас.% палладия (в пересчете на сухое вещество) на подложке активированного угля (4,95 г, 2,33 ммоль) в метаноле (1,18 л) перемешивали в атмосфере водорода (баллон) при КТ в течение ночи. Суспензию фильтровали через СБЫТЕ®, промывали метанолом и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного титульного соединения (39 г) в виде коричневого твердого вещества.

Неочищенное вещество (90 г, 231,74 ммоль), полученное в нескольких сериях, очищали следующим образом. Вещество суспендировали в 1:1 смеси дихлорметана (450 мл) и этилацетата (450 мл). Суспензию перемешивали при КТ в течение ночи. Суспензию фильтровали и твердое вещество перемешивали в 1.1 смеси дихлорметан/этилацетат. Коричневое твердое вещество сушили и собирали с получением 67 г титульного соединения с чистотой >98%, определенной путем жидкостной хроматографии-масс спектрометрии ЖХ-ИЭР/МС т/ζ 389 (М+1).

Пример получения 14. Метил-2-[5-(2,4-дифторфенил)-4-[2-[[(1§)-3-метокси-1-метилпропил]амино] оксазоло[5,4-Ь]пиридин-5-ил]-1Н-имидазол-2-ил]-2-метилпропаноат

(3§)-3-изотиацианато-1-метоксибутан (24,68 г, 169,94 ммоль) добавляли к суспензии метил-2-[4-(5амино-6-гидрокси-2-пиридил)-5-(2,4-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2-метилпропаноата (55 г, 141,62

- 7 021241 ммоль) в этаноле (550 мл) при КТ. Реакционную смесь при перемешивании кипятили с обратным холодильником в течение ночи, затем охлаждали до 50°С. К смеси добавляли дициклогексилкарбодиимид (37,99 г, 184,10 ммоль) и полученную суспензию при перемешивании кипятили с обратным холодильником в течение 20 ч. Реакционную смесь оставляли охлаждаться до КТ и растворитель выпаривали при пониженном давлении. Остаток помещали в силикагель и очищали на колонке с силикагелем (сначала с применением дихлорметана в качестве элюента для удаления наиболее неполярных примесей, а затем с применением смеси дихлорметан/метанол 95:5 для элюирования целевого продукта) с получением титульного соединения (52 г, 74%) в виде темно-коричневой пены. ЖХ-ИЭР/МС т/ζ 500 (М+1).

Пример получения 15. 2-[(1§)-2-Гидрокси-1-метилэтил]изоиндолин-1,3-дион

Смесь (2§)-2-аминопропан-1-ола (26 мл, 333 ммоль) в фталевого ангидрида (51,7 г, 349,4 ммоль) нагревали при 140°С в течение ночи. За это время твердое вещество превращалось в оранжевую жидкость. Реакционную смесь охлаждали до КТ и разбавляли этилацетатом (10 мл/г). Органическую фазу промывали насыщенным ЫаНСОз и 10% лимонной кислотой, сушили над М§§0₄, фильтровали и концентрировали с получением титульного соединения (68,3 г, 98%) в виде белого твердого вещества, которое применяли без дополнительной очистки. ЖХ-ИЭР/МС т/ζ 206 (М+1).

Пример получения 16. 2-[(1§)-2-Этокси-1-метилэтил]изоиндолин-1,3-дион

К раствору 2-[(1§)-2-гидрокси-1-метилэтил]изоиндолин-1,3-диона (47 г, 229 ммоль) и йодэтана (89,3 г, 572,5 ммоль) в ТГФ (376 мл) добавляли трет-бутоксид калия (64,25 г, 572,5 ммоль) за один раз. Смесь перемешивали в атмосфере азота в течение 15 ч. Смесь разбавляли этилацетатом (200 мл) и промывали солевым раствором (200 мл). Водную фазу экстрагировали этилацетатом (2x100 мл). Объединенные органические экстракты сушили над М§§0₄, фильтровали, концентрировали при пониженном давлении, а затем сушили в глубоком вакууме с получением титульного соединения (39,4 г, 74%) в виде оранжевого твердого вещества, которое применяли без дополнительной очистки. ЖХ-ИЭР/МС т/ζ 234 (М+1).

Пример получения 17. Гидрохлорид (2§)-1-этоксипропан-2-амина

2-[(1§)-2-этокси-1-метилэтил]изоиндолин-1,3-дион (12,84 г, 55 ммоль) растворяли в метаноле (120 мл). Медленно добавляли моногидрат гидразина (6,9 мл, 138 ммоль) и смесь перемешивали при 40°С в течение 4 ч (образовывалось белое твердое вещество). ΝαΟΗ (1 мл) добавляли, рН повышался до 13-14. Твердое вещество отфильтровывали и промывали дихлорметаном. Слои фильтрата разделяли и водный слой дополнительно экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические слои сушили над М§§0₄ и фильтровали. 2н. К раствору добавляли НС1 в диэтиловом эфире (70 мл, 140 ммоль). Смесь перемешивали в течение 15 мин и растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением титульного соединения в виде белого твердого вещества (6,61 г, 86%). 'Н ЯМР (400 МГц, СО₃ОЭ); δ 1,22 (ΐ, 3Н, 1 = 7,02 Гц), 1,28 (ά, 3Н, 1 = 6,52 Гц), 3,42 (т, 2Н), 3,58 (т, 3Н).

Пример получения 18. (2§)-1-Этокси-2-изотиоцианатопропан

К раствору гидрохлорида (2§)-1-этоксипропан-2-амина (2 г, 12,03 ммоль) в диметилформамиде (ДМФ, 20 мл) и ТЭА (1,85 мл, 13,24 ммоль) добавляли 1,1'-тиокарбонилдиимидазол (2,36 г, 13,24 ммоль). Смесь перемешивали в атмосфере азота в течение 16 ч. Смесь разбавляли этилацетатом и тщательно промывали 1н. НС1, водой и солевым раствором, сушили над М§§0₄ и концентрировали при пониженном давлении (температура бани не превышала 20°С для предотвращения испарения продукта) с получением неочищенного вещества (1,84 г), содержащего титульное соединение, которое применяли в таком виде без дополнительной очистки. ¹Н ЯМР (400 МГц, СОС1₃); δ 1,26 (ί, 3Н, 1= 7,13 Гц), 1,33 (ά, 2Н, 1 = 6,63 Гц), 3,46 (άά, 1 = 5,86, 1,62 Гц, 2Н), 3,55 (άά, 1= 13,98, 6,97 Гц, 2Н), 3,93 (т, 1Н).

Пример получения 19. 3-Метилоксетан-3-карбальдегид рО (3-метилоксетан-3-ил)метанол (6,0 г, 58,75 ммоль) растворяли в дихлорметане (117 мл). Трихлори- 8 021241 зоциануровую кислоту (13,93 г, 59,92 ммоль) добавляли порциями при -5°С, затем добавляли 2,2,6,6тетраметилпиперидин-1-оксил (ТЕМРО) (0,92 г, 5,87 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 5°С в течение 20 мин, оставляли нагреваться до КТ и перемешивали еще 20 мин. Смесь фильтровали через подложку СЕЫТЕ®, разбавляли дихлорметаном (200 мл) и промывали насыщенным водным Ыа₂СО₃ (100 мл), 1н. НС1 (100 мл) и солевым раствором (50 мл). Органическую фракцию концентрировали с получением титульного соединения в виде оранжевой маслянистой жидкости (4,17 г, 71%), которую применяли без дополнительной очистки. ¹Н ЯМР (400 МГц, СИС1₃); δ 1,48 (8, 3Н), 4,50 (б, 2Н, 1= 6,34 Гц), 4,88 (б, 2Н, 1 = 6,34 Гц), 9,95 (8, 1Н).

Альтернативный пример получения.

Бромид калия (11,65 г, 0,098 моль) добавляли в смесь (3-метилоксетан-3-ил)метанола (200 г, 1,96 моль) и ТЕМРО (3,06 г, 0,019 моль) в дихлорметане (2 л) при 0°С Затем 10% водный раствор гипохлорита натрия (1,6 л, 2,35 моль), в который добавляли твердый ЫаНСО₃ до достижения рН 9, добавляли по каплям к полученному выше раствору (добавляли в течение 3 ч, температуру раствора поддерживали <10°С). Полученную смесь перемешивали в течение 15 мин, две полученные фазы разделяли. Водную фазу экстрагировали 10% смесью 2-пропанол/дихлорметан до исчезновения продукта в водной фазе, которое определяли путем тонкослойной хроматографии. Объединенные органические фазы промывали насыщенным раствором тиосульфата натрия, сушили над М§§О₄, фильтровали и концентрировали с получением титульного соединения в виде оранжевой маслянистой жидкости (114 г, 58%).

Пример получения 20. 1-Метоксикарбонилциклопропанкарбоновая кислота рЧ ^он ' о

Диметил-циклопропан-1,1-дикарбоксилат (26,08 мл, 189,87 ммоль) растворяли в метаноле (319 мл) и раствор охлаждали до 0°С. 1н. По каплям добавляли ЫаОН (190 мл, 190 ммоль, 1 экв.) в воде. Полученную смесь перемешивали при КТ в течение ночи Раствор концентрировали при пониженном давлении для удаления метанола и полученный водный раствор промывали дихлорметаном (3x50 мл) и подкисляли 1н. НС1 (рН 2-3). Раствор затем экстрагировали этилацетатом (5x100 мл) и дихлорметаном (3x50 мл). Объединенные органические фракции сушили над М§§О₄, фильтровали и концентрировали с получением титульного соединения (16,4 г, 60%) ¹Н ЯМР (400 МГц, СИС1₃); δ 1,9-1,7 (т, 4Н), 3,78 (8, 3Н).

Пример получения 21. Метил-1-(гидроксиметил)циклопропанкарбоксилат

1-метоксикарбонилциклопропанкарбоновую кислоту (16,4 г, 113,89 ммоль), ТЭА (17,6 мл, 127,55 ммоль) и ТГФ (325 мл) помещали в круглодонную колбу. Смесь охлаждали до -10°С и добавляли по каплям изобутилхлорформиат (16,5 мл, 127,55 ммоль). Раствор перемешивали в течение 1 ч. В отдельной колбе боргидрид натрия (13 г, 341,67 ммоль) растворяли в смеси ТГФ (165 мл) и воды (40 мл) и охлаждали на ледяной бане. Нерастворимое вещество удаляли путем фильтрования из первого раствора. Раствор боргидрида добавляли к раствору 1-метоксикарбонилциклопропанкарбоновой кислоты, описанный выше, по каплям в течение 1,5 ч. Полученный раствор перемешивали при указанной температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь выливали в охлажденный 20% водный раствор лимонной кислоты и экстрагировали этилацетатом (3x150 мл). Объединенные органические слои промывали солевым раствором, сушили над М§§О₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением титульного соединения (13,5 г, 91%). ^!Н ЯМР (400 МГц, СИС1₃); δ 0,9-0,8 (т, 2Н), 1,3-1,2 (т, 2Н), 3,62 (8, 2Н) 3,69 (8, 3Н).

Пример получения 22. Метил-1-формилциклопропанкарбоксилат рЧ ^н ' о

Метил-1-(гидроксиметил)циклопропанкарбоксилат (16,0 г, 123,07 ммоль) растворяли в дихлорметане (320 мл) и смесь охлаждали до -5°С. Трихлоризоциануровую кислоту (29,1 г, 125,5 ммоль) добавляли порциями, затем добавляли ТЕМРО (1,9 г, 12,3 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при -5°С в течение 20 мин, оставляли нагреваться до КТ и перемешивали в течение 20 мин. Смесь фильтровали через подложку СЕЬ1ТЕ® и разбавляли дихлорметаном (500 мл). Раствор промывали насыщенным Ыа₂СО₃ (300 мл), 1н. НС1 (300 мл), солевым раствором (300 мл) и насыщенным хлоридом аммония (3x200 мл). Органическую фракцию сушили над М§§О₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением 19 г титульного соединения, содержащего дихлорметан (теоретический выход 15,75 г). Вещество применяли в таком виде в следующей реакции. 'Н ЯМР (400 МГц, СЭС1₃); δ 1,7-1,6 (т, 4Н), 3,81 (8, 3Н), 10,38 (8, 1Н).

- 9 021241

Пример получения 23. 6-[2-Циклопропил-5-(2,4-дифторфенил)-1Н-имидазол-4-ил]-3-нитропиридин2-амин

В пробирку ΚΙΜΛΧ® помещали 1-(6-амино-5-нитро-2-пиридил)-2-(2,4-дифторфенил)-этан-1,2дион (5 г, 16,28 ммоль), 1,4-диоксан (50 мл) и ацетат аммония (6,27 г, 81,38 ммоль). К смеси добавляли по каплям циклопропанкарбальдегид (3,42 мл, 48,83 ммоль). Полученную смесь продували азотом, пробирку закрывали и нагревали при 80°С в течение ночи, после чего смесь оставляли охлаждаться до КТ. Смесь затем концентрировали насухо при пониженном давлении. Добавляли этилацетат (700 мл) и насыщенный водный раствор NаНСОз. Органический слой отделяли, промывали солевым раствором (3x250 мл), сушили над М§§0₄ и концентрировали с получением неочищенного титульного соединения (5,5 г), которое применяли на следующей стадии без дополнительной очистки. ЖХ-ИЭР/МС т/ζ 358 (М+1).

Промежуточные соединения, приведенные ниже в таблице, получали, по существу, согласно способу, описанному в примере получения 23, с применением 1-(6-амино-5-нитро-2-пиридил)-2-(2,4дифторфенил)этан-1,2-диона и соответствующего альдегида в качестве исходных веществ.

Пр. ПОЛ.	Структура	Химическое название	ЖХ- ИЭР/МС ш/ζ
24*	χχ- па	6-(5-(2,4-дифторфенил)-2-(3- мегилоксетан-3-ил)- 1Н- имидазол-4-ил]-3-	388 (М+1)
		нитропирвдин-2-амин
25	/°Л й χΧ	Меги-1 -[4-(6-амино-5-нитро-2- пиридил )-5-(2,4-дифторфенил)- 1 Н-имидазол-2- ил]циклопропанкарбоксилат	416 (М+1)

* Реакцию проводили при 90°С в течение 1,5 ч. Во время обработки осаждалось твердое вещество, которое собирали после добавления раствора бикарбоната. Фильтрат обрабатывали, как указано выше, с получением красной маслянистой жидкости. Маслянистую жидкость обрабатывали ультразвуком в 4:1 смеси этилацетат/гексан с получением суспензии, которую фильтровали.

Пример получения 26. 6-[2-Циклопропил-5-(2,4-дифторфенил)-1Н-имидазол-4-ил]-3-нитропиридин2-ол

6-[2-Циклопропил-5-(2,4-дифторфенил)-1Н-имидазол-4-ил]-3-нитропиридин-2-амин (5,51 г, 15,41 ммоль) суспендировали в диметилсульфоксиде (ДМСО, 32 мл), воде (25 мл) и концентрированной Η₂δΟ₄ (6 мл). Суспензию охлаждали до 0°С и порциями добавляли нитрит натрия (2,13 г, 30,81 ммоль) с такой скоростью, чтобы температура не превышала 5°С. Смесь перемешивали при 0°С в течение 30 мин, а затем оставляли нагреваться до КТ и перемешивали до полной конверсии исходного вещества, определенной путем жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (ЖХ/МС) (1 ч). 0,8М водный раствор одноосновного фосфата натрия (200 мл) добавляли в смесь. Образовывалась желтая суспензия. 1н. водный ΝαΟΗ затем добавляли до достижения рН 8. Смесь перемешивали в течение 30 ч, фильтровали и твердое вещество промывали водой, а затем сушили при пониженном давлении с получением титульного соединения (4,53 г, 82%). ЖХ-ИЭР/МС т/ζ 358,9 (М+1).

Промежуточные соединения, приведенные ниже в таблице, получали, по существу, согласно способу, описанному в примере 26, с применением соответствующего 3-нитропиридин-2-амина в качестве исходного вещества.

- 10 021241

Пр. ПОЛ.	Структура	Химическое название	ЖХ- ИЭР/МС т/у
27	ИГЫ°2 νΛ°η в γΊι	6-(5-(2,4-дифторфенил)-2-(3- метилоксетан-3-ил)-1Н- имидазол-4-ил]-3- нитропиридин-2-ол	389,1 (М+1)
28	/Ο о й XX	Метил-1-[5-(2,4-дифтор фенил)- 4-(6-гидрокси-5-нитро-2- пиридил)-1 Н-имидазол-2- ил]циклопропанкарбоксилат	417 (М+1)

Пример получения 29. 3-Амино-6-[2-циклопропил-5-(2,4-дифторфенил)-1Н-имидазол-4-ил]пиридин-2-ол

6-[2-Циклопропил-5-(2,4-дифторфенил)-1Н-имидазол-4-ил]-3-нитропиридин-2-ол (4,525 г, 12,63 ммоль) растворяли в этаноле (63 мл). Раствор дегазировали путем продувания азотом. 10% К смеси порциями добавляли Ρά/С (920 мг) и смесь насыщали водородом. Смесь перемешивали в атмосфере водорода (баллон) при КТ в течение выходных, после чего анализ ЖХ/МС показывал полную конверсию исходных веществ. Суспензию фильтровали через подложку СБЫТЕ® для удаления катализатора и раствор концентрировали при пониженном давлении с получением титульного соединения (3,97 г, 89%). ЖХ-ИЭР/МС т/ζ 328,9 (М+1).

Промежуточные соединения, приведенные ниже в таблице, получали, по существу, согласно способу, описанному в примере получения 29, с применением соответствующего 3-нитропиридинола в качестве исходного вещества.

Пр. ПОЛ.	Структура	Химическое название	ЖХ- ИЭР/МС
30	ϋα	3-амнно-6-[5-(2,4- дифторфенил )-2-(3- метилоксетан-3-ил)- 1Н- имидазол-4-ил]пиридин-2-ол	359 (М+1)
31	<9η,ν'1[ ν<°η /°Λ Β χΧ	Метил-1 -[4-(5-амино-6- гидрокси-2-пиридил)-5-(2,4- дифторфенил)-1 Н-имидазол-2- ил Циклопропанкарбоксилат	387 (М+1)

Пример получения 32. Метил-1-[5-(2,4-дифторфенил)-4-[2-[[(1§)-2-этокси-1-метилэтил]амино]оксазоло[5,4-Ь] пиридин-5 -ил] -1 Н-имидазол-2-ил] циклопропанкарбоксилат

Смесь метил-1-[4-(5-амино-6-гидрокси-2-пиридил)-5-(2,4-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]циклопропанкарбоксилата (4 г, 10,35 ммоль) и (2§)-1-этокси-2-изотиоцианатопропана (2,379 г, 15,53 ммоль) растворяли в этаноле (34 мл). Смесь нагревали до 85°С в герметичной колбе в течение 16 ч. Добавляли по каплям диизопропилкарбодиимид (3,21 г, 20,71 ммоль) и смесь перемешивали при 85°С в течение 16 ч, после чего еще 3 г диизопропилкарбодиимида добавляли и смесь нагревали при 85°С в течение 4 ч. Растворитель выпаривали и остаток очищали путем нормально-фазовой хроматографии (120 г картридж с силикагелем) с применением градиентного элюирования смесью гексан-этанол с получением титульного соединения (1,180 г, 24%). ЖХ-ИЭР/МС т/ζ 498,1 (М+1).

Примеры синтеза, альтернативные примеру 1.

Пример получения 33. (§)-Ы-[(1§)-3-Метокси-1-метилпропил]-2-метилпропан-2-сульфинамид

- 11 021241

Ψ

ΗΝ'%

Сравнение Ь-селектрида и боргидрида натрия в качестве восстановителей Ν-третбутансульфинилиминов см. в Раи1, Μ. Μ. 1. Огд. Сйет. 2007, 71, 6859-6862.

1,3,3-Триметоксибутан (145,4 г, 0,98 моль) смешивали с 1н. водной хлороводородной кислотой (50,0 мл, 0,05 моль) и перемешивали в течение 1-2 ч при КТ в атмосфере азота. Добавляли ТГФ (1,5 л) и растворитель дважды выпаривали при нормальном атмосферном давлении и температуре не более 70°С. Добавляли ТГФ (1,5 л) с получением раствора 4-метоксибутан-2-она в ТГФ. Добавляли (8)-(-)-2-метил-2пропансульфинамид (124,4 г, 1,03 моль) и этоксид титана (IV) (447,0 г, 1,96 моль) и реакционную смесь нагревали до 65-70°С в течение 16-17 ч. Реакционную смесь охлаждали до -10-0°С. Порциями добавляли боргидрид натрия (37,0 г, 0,98 моль), а затем смесь перемешивали в течение 1-2 ч при указанной температуре. Реакционную смесь нагревали до КТ и перемешивали в течение 1-2 ч. Затем смесь охлаждали до 10-20°С и метанол (100 мл) добавляли по каплям в течение 1-2 ч. 25% добавляли водный хлорид натрия (300 мл) и смесь нагревали до КТ. Добавляли этилацетат (500 мл). Смесь перемешивали в течение 1-2 ч при КТ, затем фильтровали. Осадок дополнительно промывали этилацетатом (807 мл). Слои разделяли и органическую фазу промывали 25% водным хлоридом натрия (1,0 л). Водную фазу экстрагировали этилацетатом (500 мл). Органические фракции объединяли и растворитель отгоняли при атмосферном давлении (без вакуумирования) и температуре не более 75°С до достижения общего объема 300-500 мл. Добавляли этилацетат (600 мл) и тиосульфат натрия (150,0 г) и смесь перемешивали в течение 1-2 ч при 2030°С. Смесь фильтровали и фильтрат концентрировали. Диастереомеры разделяли путем сверхкритической флюидной хроматографии с получением титульного соединения в виде желтой маслянистой жидкости (205,0 г, 65%). Колонка: СЫга1Ра1® ΆΌ, 10 мкм, 50x300 мм; режим элюирования: изократический; мобильная фаза: СО₂/этанол; расход 280 мл/мин; УФ детектирование: 215,16 нм; нагрузка: 300 мг/мл. Первый элюируемый пик соответствовал побочному диастереомеру, Т_Е = 15,17 мин. Второй элюируемый пик соответствовал основному диастереомеру, который представлял собой титульное соединение, Т_Е = 17,11 мин.

Пример получения 34. (38)-3-Изотиоцианато-1-метоксибутан

В атмосфере азота смешивали метанол (185 мл), ТГФ (1,76 л) и ^(8)-[(18)-3-метокси-1метилпропил]-2-метилпропан-2-сульфинамид (220,0 г, 1,06 моль) и охлаждали до -10-0°С. Добавляли по каплям хлороводородную кислоту (1,26 л, 5,3 моль, 4,2н. в ТГФ) и температуру поддерживали ниже 10°С. Реакционную смесь перемешивали в течение 3-4 ч при 0-10°С, концентрировали при пониженном давлении и температуре не более 45°С до достижения объема раствора 400,0-600,0 мл. Добавляли ТГФ (880 мл) и реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и температуре не более 45°С до достижения объема раствора 400-600 мл. Реакционную смесь охлаждали до 20-30°С и перемешивали в течение 0,5-1 ч. Добавляли затравочные кристаллы гидрохлорида (8)-4-метоксибутан-2-амина (5,0 г, 35,8 ммоль). (Затравочные кристаллы можно получать из твердых веществ, полученных в примерах получения 4 или 6, или при помощи других способов, общеизвестных специалистам в данной области техники, таких как перекристаллизации небольшой аликвоты). Также добавляли метил-трет-бутиловый эфир (660 мл) и смесь перемешивали при 20-25°С в течение 2-4 ч. Смесь охлаждали до 0-5°С и перемешивали в течение 2-4 ч. Твердые вещества собирали путем фильтрования и осадок промывали метилтрет-бутиловым эфиром (110 мл). Твердые вещества переносили в реакционный сосуд и метил-третбутиловый эфир (660 мл) добавляли при КТ Добавляли тиосульфат натрия (270,0 г, 1,9 моль) и гидроксид натрия (42,5 г, 1,06 моль) и смесь перемешивали в течение 1-2 ч при 10-20°С. Смесь фильтровали и осадок промывали метил-трет-бутиловым эфиром (440 мл) с получением (8)-4-метоксибутан-2-амина в виде неочищенного раствора в метил-трет-бутиловом эфире (87,5 г). Вещество применяли в следующей реакции так, как описано далее.

В атмосфере азота добавляли Ν,Ν-тиокарбонилдиимидазол (97,0 г, 0,55 моль) и ТГФ (470 мл) и смесь перемешивали в течение 15-30 мин. Смесь охлаждали до -10-0°С, добавляли раствор (8)-4метоксибутан-2-амина (46,9 г, 0,455 моль) в метил-трет-бутиловом эфире (389 мл) и реакционную смесь нагревали до 10-20°С. Реакционную смесь перемешивали при указанной температуре в течение 15-20 ч, а затем охлаждали до 0-10°С. Хлороводородную кислоту (275 мл, 4н. в воде) добавляли до достижения рН 1-2. Реакционную смесь нагревали до КТ и слои разделяли. Водный слой экстрагировали этилацетатом (235 мл) и органические слои объединяли и промывали водой (140 мл). Органический раствор концентрировали при пониженном давлении и температуре не более 45°С, добавляли этилацетат (211,5 мл) и раствор дважды концентрировали при пониженном давлении и температуре не более 45°С, добавляли

- 12 021241 этилацетат (235 мл). Добавляли тиосульфат натрия (32,3 г, 227,0 ммоль), раствор фильтровали, осадок промывали этилацетатом (104 мл). Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и температуре не более 45°С с получением титульного соединения в виде бесцветной маслянистой жидкости (55,0 г, 77%).

Пример получения 35. Метил-2,2-диметил-3-оксопропаноат о н

Метил-3-гидрокси-2,2-диметилпропаноат (25,4 кг, 192,2 моль) и дихлорметан (241 л) объединяли в атмосфере азота при КТ и перемешивали. Добавляли (2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-ил)оксил (0,61 кг, 3,9 моль) и реакционную смесь охлаждали до 0-5°С. Порциями добавляли трихлоризоциануровую кислоту (31,2 кг, 134,5 моль) при 0-5°С и реакционную смесь перемешивали в течение 16-18 ч при указанной температуре. Реакционную смесь фильтровали и осадок промывали дихлорметаном (25,4 л), фильтрат концентрировали при пониженном давлении и температуре не более 50°С. Добавляли 1,4-диоксан (25,4 л) и органическую фазу концентрировали при пониженном давлении и температуре не более 65°С с получением титульного соединения в виде желтой жидкости (127,8 кг, 77%), которую применяли без дополнительной очистки.

Пример получения 36. 6-[2-(2,4-Дифторфенил)этинил]-3-нитропиридин-2-амин

6-Хлор-3-нитропиридин-2-иламин (16,2 кг, 93,3 моль), ацетонитрил (130,8 л), йодид меди (I) (0,18 кг, 1,0 моль) и хлорид бис(трифенилфосфин)палладия (II) (0,66 кг, 0,9 моль) объединяли в атмосфере азота при 20-25°С и перемешивали. Триэтиламин (19,7 л, 141,3 моль) добавляли и смесь нагревали до 3035°С. Добавляли раствор 1-этинил-2,4-дифторбензола (18,0 кг, 130,3 моль) в ацетонитриле (32,6 л) в атмосфере азота при 30-35°С. Смесь перемешивали при 15-25°С в течение 2-4 ч. Добавляли толуол (80,0 л) и смесь перемешивали в течение 0,5-1 ч, затем охлаждали до 0-5°С и перемешивали в течение 2-4 ч. Реакционную смесь центрифугировали и осадок промывали толуолом (2x64 л) и водой (2x32,4 л). Твердые вещества сушили при пониженном давлении и температуре не более 50°С с получением титульного соединения в виде желтого твердого вещества (21,7 кг, 83%).

Пример получения 37. 1-(6-Амино-5-нитро-2-пиридил)-2-(2,4-дифторфенил)этан-1,2-дион

6-[2-(2,4-Дифторфенил)этинил]-3-нитропиридин-2-амин (2,0 кг, 7,3 моль) и ацетон (40,5 л) добавляли в реактор в атмосфере азота и смесь охлаждали до 0-10°С при перемешивании. Буферный раствор, состоящий из воды (38,3 л), дигидрофосфата натрия (3,3 кг) и гидрофосфата натрия (0,7 кг), добавляли при 0-15°С. Смесь охлаждали до 3-6°С и помещали твердый перманганат калия (4,1 кг, 25,9 моль) при 36°С. Смесь перемешивали в течение 3-5 ч, затем по частям реакционную смесь переносили в сосуд, содержащий воду (9,3 л) и пентагидрат тиосульфата натрия (3,6 кг) при 15-20°С. Смесь перемешивали при 15-25°С. Воду (50 л) добавляли и смесь перемешивали в течение 0,5-1 ч и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и температуре не более 45°С. После завершения отгонки растворителя добавляли воду (40 л) при 20-25°С и смесь перемешивали в течение 0,5-1 ч. Твердые вещества собирали путем фильтрования и осадок сушили при температуре не более 40°С с получением титульного соединения в виде желтого твердого вещества (1,7 кг, 75%).

Пример получения 38. Метансульфонатметил-2-[4-(6-амино-5-нитро-2-пиридил)-5-(2,4-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил] -2-метилпропаноата

Ацетат аммония (30,0 кг, 389,2 моль), 1,4-диоксан (193,6 л) и метил-2,2-диметил-3-оксопропаноат (10,2 кг, 78,4 моль) объединяли в атмосфере азота и перемешивали при 20-25°С в течение 0,5-1 ч. 1-(6Амино-5-нитро-2-пиридил)-2-(2,4-дифторфенил)этан-1,2-дион (18,5 кг, 60,2 моль) добавляли и смесь перемешивали в течение 10-14 ч при 20-25°С. Добавляли толуол (36,9 л) и раствор концентрировали при пониженном давлении и температуре не более 65°С. Добавляли толуол (76,8 л) и затем раствор концентрировали при пониженном давлении и температуре не более 65°С. Добавляли толуол (36,9 л) и этилацетат (37,1 л) и смесь фильтровали. Фильтрат отставляли, а осадок переносили в отдельный реактор и добавляли этилацетат (37,1 л). Смесь нагревали до 50-60°С при перемешивании в течение 20-30 мин. Смесь

- 13 021241 охлаждали до 20-25°С, фильтровали и фильтрат объединяли с полученным ранее фильтратом. Объединенные фильтраты концентрировали при пониженном давлении и температуре не более 60°С и толуол (76,8 л) добавляли. Смесь концентрировали при пониженном давлении и температуре не более 65°С. Этилацетат (18,6 л) и толуол (18,3 л) добавляли и раствор нагревали до 50-70°С. Добавляли метансульфокислоту (4,3 л, 66,2 моль) в этилацетате (18,6 л) и реакционную смесь перемешивали в течение 1-2 ч. Реакционную смесь охлаждали до 10-25°С и перемешивали в течение 2-5 ч. Твердые вещества собирали путем фильтрования и осадок промывали этилацетатом (18,6 л) с получением титульного соединения в виде коричневого твердого вещества (17,0 кг, чистота 96,2%, выход 46,2%). 'Н ЯМР (б₆-ДМСО, 400 МГц) δ 1,69 (5, 6Н), 2,36 (5, 3Н), 3,68 (5, 3Н), 6,89 (б, 1Н, 1= 8,8 Гц), 7,00 (5, 1Н), 7,25 (5, 1Н), 7,12 (5, 1Н), 7,27 (бб, 1Н, 1 = 8,4 Гц, 1,6 Гц), 7,45 (ббб, 1Н, 1= 10,0 Гц, 10,0 Гц, 2,4 Гц), 7,83-7,68 (т, 2 Н), 8,40 (б, 1Н, 1= 8,8 Гц).

Пример получения 39. Метил-2-[5-(2,4-дифторфенил)-4-(6-гидрокси-5-нитро-2-пиридил)-1Нимидазол-2-ил] -2-метилпропаноат

В атмосфере азота добавляли метансульфонат метил-2-[4-(6-амино-5-нитро-2-пиридил)-5-(2,4дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2-метилпропаноата (68,9 г, 134,2 ммоль), диметилсульфоксид (275,5 мл), ТГФ (116,2 мл) и воду (303,2 мл) и смесь перемешивали при 20-25°С, 95-97%. К реакционной смеси добавляли по каплям серную кислоту (93,6 мл) и температуру поддерживали ниже 30°С. Реакционную смесь охлаждали до 0-5°С и раствор нитрита натрия (18,6 г, 0,27 ммоль) в воде (82,7 мл) добавляли при 0-10°С. Реакционную смесь перемешивали в течение 1-2 ч при указанной температуре. Добавляли по каплям 10% водный дигидрофосфат натрия (930,0 мл), поддерживая температуру ниже 25°С. Полученную смесь перемешивали в течение 2-3 ч при 15-25°С и твердые вещества собирали путем фильтрования. Осадок промывали водой (138 мл) и твердые вещества переносили в реакционный сосуд. Добавляли метанол (566 мл) и смесь нагревали до 60-65°С в течение 1-2 ч. Реакционную смесь охлаждали до 15-25°С и перемешивали при 15-25°С в течение 2-4 ч. Смесь фильтровали, осадок промывали метанолом (87 мл) и сушили в вакууме при температуре не более 70°С с получением титульного соединения в виде желтого твердого вещества (53,28 г, 93%).

Пример получения 40. Метил-2-[4-(5-амино-6-гидрокси-2-пиридил)-5-(2,4-дифторфенил)-1Нимидазол-2-ил] -2-метилпропаноат

Метил-2-[5-(2,4-дифторфенил)-4-(6-гидрокси-5-нитро-2-пиридил)-1Н-имидазол-2-ил]-2-метилпропаноат (90,0 г, 0,22 моль), влажный 10% Рб/С (4,5 г) и метанол (1,77 л) смешивали при 15-25°С. Реакционную смесь перемешивали в атмосфере 20-25 р5Щ водорода в течение 3-6 ч. Реакционную смесь фильтровали через диатомитовую землю и фильтрующую среду промывали метанолом (227 мл). Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и температуре не более 40°С и добавляли метил-третбутиловый эфир (729,3 мл). МТБЭ удаляли при пониженном давлении и температуре не более 40°С и снова добавляли метил-трет-бутиловый эфир (729,3 мл). МТБЭ удаляли при пониженном давлении и температуре не более 40°С. Метил-трет-бутиловый эфир (182 мл) и метанол (46 мл) добавляли и смесь нагревали до 50-60°С в течение 1-2 ч. Смесь охлаждали до 10-15°С и перемешивали в течение 2-4 ч. Твердые вещества собирали путем фильтрования и осадок промывали метил-трет-бутиловым эфиром (61 мл). Твердые вещества сушили в вакууме при температуре не более 50°С с получением титульного соединения в виде желтого твердого вещества (75,0 г, 88%).

Пример получения 41. Метил-2-[5-(2,4-дифторфенил)-4-[2-[[(1§)-3-метокси-1-метилпропил]амино] оксазоло[5,4-Ь]пиридин-5-ил]-1Н-имидазол-2-ил]-2-метилпропаноат

Диметилсульфоксид (713 мл) дегазировали азотом при 25-30°С в течение 0,5-1 ч в атмосфере азота. Добавляли метил-2-[4-(5-амино-6-гидрокси-2-пиридил)-5-(2,4-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2метилпропаноат (35,0 г, 90,0 ммоль) и (3§)-3-изотиоцианато-1-метоксибутан (19,58 г, 0,14 моль) и реакционную смесь нагревали до 63-68°С. Реакционную смесь перемешивали в течение 18-24 ч при указан- 14 021241 ной температуре, а затем порциями добавляли гидрохлорид 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (19,3 г, 100,7 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 2-4 ч при 60-65°С. Дополнительное количество гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (1,9 г, 9,9 ммоль) добавляли в случае, если полная конверсия не происходила. Реакционную смесь охлаждали до 20-30°С и фильтровали через диатомитовую землю. К фильтрату добавляли этилацетат (351 мл) и воду (350 мл). Слои разделяли и водную фазу экстрагировали этилацетатом (312 мл). Органические слои объединяли и промывали водой (2x210 мл), а затем добавляли гептан (626 мл). Раствор перемешивали в течение 0,5-1 ч и фильтровали через силикагель, промывали смесью этилацетата (351 мл) и гептана (348 мл). Раствор концентрировали при пониженном давлении и температуре не более 45°С и добавляли этилацетат (156 мл). Добавляли активированный уголь (3,5 г) и смесь нагревали до 60-70°С при перемешивании в течение 0,5-1 ч. Смесь охлаждали до 20-30°С, фильтровали и фильтрат концентрировали при пониженном давлении и температуре не более 45°С. Толуол (242 мл) помещали в полученный остаток и вещество концентрировали при пониженном давлении и температуре не более 45°С. Добавляли толуол (40 мл) и смесь нагревали до 60-70°С при перемешивании в течение 0,5-1 ч. Смесь охлаждали до 25-30°С, перемешивали в течение 2-4 ч, а затем охлаждали до 0-5°С. Смесь перемешивали при 0-5°С в течение 2-4 ч и твердые вещества собирали путем фильтрования. Осадок промывали толуолом (40 мл) и сушили при пониженном давлении и температуре не более 60°С с получением титульного соединения в виде беловатого твердого вещества (33,0 г, 71%).

Пример 1. 2-[5-(2,4-Дифторфенил)-4-[2-[[(1§)-3-метокси-1-метилпропил]амино]оксазоло[5,4-Ъ]пиридин-5-ил]-1Н-имидазол-2-ил] -2-метилпропан-1 -ол

Метил-2-[5-(2,4-дифторфенил)-4-[2-[[(1§)-3-метокси-1-метилпропил]амино]-оксазоло[5,4-Ъ]пиридин-5-ил]-1Н-имидазол-2-ил]-2-метилпропаноат (497 мг, 0,99 ммоль) растворяли в смеси диэтилового эфира (5 мл) и ТГФ (2,5 мл). Смесь охлаждали до 0°С и порциями добавляли боргидрид лития (45,6 мг, 1,99 ммоль). Реакционную смесь затем перемешивали при КТ в атмосфере азота в течение 2 ч. 1М НС1 медленно добавляли до достижения рН 1 и смесь перемешивали в течение 15 мин при КТ. Смесь подщелачивали твердым ЫаНСОз и слои разделяли. Водный слой экстрагировали дихлорметаном и объединенные органические слои сушили над Мд§О₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенное вещество очищали путем нормально-фазовой хроматографии (40 г картридж с силикагелем, 20% этанол в гексане). Получали коричневое твердое вещество (298 мг), которое дополнительно очищали путем обращенно-фазовой хроматографии (колонка ΧΒΚΙΌΟΕ™ (5 мкм, 19x100 мм); градиент от 35 до 38% ацетонитрила в водном растворе карбоната аммония (рН 9); расход 25 мл/мин) с получением 193 мг (41%) титульного соединения. ЖХ-ИЭР/МС т/ζ 472 (М+1). [а]_с ²² +33,79° (с = 0,72, метанол).

Пример 1. Альтернативный способ очистки.

2-[5-(2,4-Дифторфенил)-4-[2-[[(1§)-3-метокси-1-метилпропил]амино]оксазоло[5,4-Ъ]пиридин-5-ил]1Н-имидазол-2-ил]-2-метилпропан-1-ол.

Метил-2-[5-(2,4-дифторфенил)-4-[2-[[(1§)-3-метокси-1-метилпропил]амино]оксазоло[5,4-Ъ]пиридин-5-ил]-1Н-имидазол-2-ил]-2-метилпропаноат (50 г, 100,1 ммоль) растворяли в смеси диэтилового эфира (1 л) и ТГФ (500 мл). Смесь охлаждали до 0°С и добавляли боргидрид лития (4,36 г, 200,19 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при КТ в атмосфере азота в течение 2 ч. Медленно добавляли 1М НС1 (600 мл) (выделение газа) и полученную смесь перемешивали в течение 1,5 ч при КТ. Слои разделяли и водную фазу экстрагировали метил-трет-бутиловым эфиром. Водный слой подщелачивали (рН 8) путем добавления 2М ЫаОН (200 мл) и экстрагировали дихлорметаном (3x400 мл). Объединенные органические слои сушили над Ыа₂8О₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением коричневой пены. Неочищенное вещество элюировали через колонку с силикагелем (элюент: дихлорметан/3н. ΝΉ₃ в метаноле, 95:5) с получением целевого продукта в виде фиолетовой пены (35 г). Твердое вещество суспендировали в смеси 2:1 гептан/метил-трет-бутиловый эфир и обрабатывали ультразвуком. Суспензию перемешивали при КТ в течение ночи. Твердое вещество отфильтровывали и сушили в вакууме с получением титульного соединения в виде беловатого твердого вещества (30 г, 64%). МС (т/ζ): 472 (М+1).

Пример 1. Способ, альтернативный примерам получения 33-41.

2-[5-(2,4-Дифторфенил)-4-[2-[[(1§)-3-метокси-1-метилпропил]амино]оксазоло[5,4-Ъ]пиридин-5-ил]1Н-имидазол-2-ил] -2-метилпропан- 1-ол

2-Метилтетрагидрофуран (135 мл) охлаждали до -5-0°С в атмосфере азота и порциями добавляли боргидрид лития (4,95 г, 0,23 моль), поддерживая температуру ниже 10°С. Раствор метил-2-[5-(2,4дифторфенил)-4-[2-[[(1§)-3-метокси-1-метилпропил]амино]оксазоло[5,4-Ь]пиридин-5-ил]-1Н-имидазол2-ил]-2-метилпропаноата (45,0 г, 0,09 моль) в 2-метилтетрагидрофуране (225 мл) добавляли по каплям при -5-0°С и перемешивали в течение 12-14 ч. 2М водную хлороводородную кислоту (203 мл) добавляли по каплям при -5-0°С и реакционную смесь нагревали до 30-40°С при перемешивании в течение 1-2 ч. Реакционную смесь охлаждали до 15-25°С и слои разделяли. Органическую фазу экстрагировали смесью воды (135 мл) и 2М водной хлороводородной кислоты (45 мл) и органическую фазу отбрасывали. Водные слои объединяли и добавляли по каплям 25% водный гидроксид натрия (75 мл) до достижения рН 8-9. Водный слой экстрагировали дихлорметаном (225 мл) при КТ и слои разделяли. Органическую фракцию промывали водой (2x180 мл), а затем концентрировали при пониженном давлении и температуре не более 40°С. Добавляли метил-трет-бутиловый эфир (231 мл) и раствор концентрировали при пониженном давлении и температуре не более 40°С дважды.

Добавляли этилацетат (101 мл) и смесь нагревали до 50-60°С при перемешивании в течение 1-2 ч. Раствор охлаждали до 0-5°С при перемешивании в течение 2-4 ч. Твердые вещества отфильтровывали и осадок промывали гептаном (66 мл). Твердые вещества переносили в реакционный сосуд, добавляли этилацетат (181 мл), а затем смесь нагревали до 70-75°С при перемешивании в течение 0,5-1 ч. Смесь охлаждали до 50-60°С и добавляли по каплям гептан (157 мл), и перемешивали в течение 2-4 ч. Смесь затем охлаждали до 10-15°С при перемешивании в течение 2-4 ч. Твердые вещества отфильтровывали и осадок промывали гептаном (66 мд). Твердые вещества переносили в реакционный сосуд и добавляли этилацетат (406 мл). Смесь нагревали до 60-75°С при перемешивании в течение 0,5-1 ч, затем охлаждали до 40-45°С и концентрировали при пониженном давлении и температуре не более 45°С до достижения конечного объема раствора, составляющего примерно 200 мл. Смесь нагревали до 70-75°С при перемешивании в течение 0,5-1 ч, а затем охлаждали до 50-60°С. Добавляли гептан (268 мл), затем затравочные кристаллы (2,25 г). (Затравочные кристаллы можно получать из полученных ранее навесок твердого продукта согласно примеру 1 или можно получать при помощи других способов, общеизвестных специалистам в данной области техники, таких как перекристаллизация небольшой аликвоты). Смесь перемешивали при 50-60°С в течение 2-4 ч. Смесь охлаждали до 10-15°С и перемешивали в течение 2-4 ч. Твердые вещества собирали путем фильтрования и осадок промывали смесью этилацетата (18 мл) и гептана (16 мл). Осадок сушили при пониженном давлении и температуре не более 65°С с получением титульного соединения в виде беловатого твердого вещества (27,5 г, 63%). Способ ВЭЖХ: Колонка: СЫга1Рак® ΆΌН, 5 мкм, 4,6x250 мм; режим элюирования: изократический; мобильная фаза: гексан/изопропанол/диэтиламин (92:8:0,1); расход: 1,0 мл/мин; УФ-детектирование: 337 нм. Т_к = 22,6 мин, э.и. 100%.

Соединение согласно примеру 1, рентгеновская порошковая дифракция (ΧΚΡϋ)

Дифрактограммы ΧΚΡΌ кристаллических твердых веществ получали на порошковом рентгеновском дифрактометре Вгикег Ό4 Епйеауог, оборудованном источником СиК_а, λ= 1,54060 А, и детектором Уап1ес с рабочими характеристиками 35 кВ и 50 мА. Образец сканировали в диапазоне от 4 до 40° 2Θ с шагом 0,009° 2Θ и скоростью сканирования 0,5 с/шаг, дивергенция 0,6 мм, антирассеивающая щель 5,28, щели детектора 9,5 мм. Сухой порошок помещали в кварцевый держатель образца, гладкую поверхность получали при помощи предметного стекла. Дифрактограммы кристаллической формы получали при температуре и относительной влажности окружающей среды. В данном анализе в ошибке положения пиков ±0,2° 2Θ учтены возможные отклонения, при этом она не препятствует однозначной идентификации указанной кристаллической формы. Подтверждение типа кристаллической формы можно проводить на основании уникальной комбинации отличительных пиков (в °2Θ), как правило, являющихся наиболее выраженными пиками. Дифрактограммы кристаллической формы, полученные при температуре и относительной влажности окружающей среды, нормировали с применением стандарта ΝΙ8Τ675 с пиками при 8,853 и 26,774 градусов 2-тета.

Таблица 1. Пики порошковой рентгеновской дифракции формы I соединения согласно примеру 1 Положения пиков

Пик	Угол (о2-тета) +/- 0,2°	Относительная интенсивность (% от наиболее интенсивного пика)	значение ά (ангстрем)
1	15,06	100	5,88
2	19,94	85,5	4,45
3	10,31	60,8	8,57
4	20,78	60,4	4,27
5	17,91	59,9	4,95
6	19,25	40,1	4,61
7	16,16	39,3	5,48
8	9,33	35,7	9,47
9	21,86	31,5	4,06
10	26,61	27,7	3,35

- 16 021241

Таким образом, кристаллическая форма I 2-[5-(2,4-дифторфенил)-4-[2-[[(18)-3-метокси-1-метилпропил]амино]оксазоло[5,4-Ь]пиридин-5-ил]-1Н-имидазол-2-ил]-2-метилпропан-1 -ола согласно настоящему изобретению может быть охарактеризована порошковой рентгеновской дифрактограммой, полученной с применением излучения СиК_а, имеющей пики дифракции (2-тета), описанные в табл. 1, в частности, имеющей пик при 15,06 в комбинации с одним или более пиками при 19,94, 10,31 и 20,78, более конкретно, имеющей пик при 15,06; где ошибка измерения углов дифракции составляет 0,2°.

Пример 1. (Форма свободного основания II).

Форму свободного основания II соединения согласно примеру 1 получали путем смешения 8,01 г свободного основания в 125 мл колбе со 100 мл метил-трет-бутилового эфира с получением коричневой суспензии твердого вещества. Образец суспендировали в течение ночи при 300 об/мин и 50°С. Через 18 ч образец представлял собой суспензию беловатого твердого вещества в бордовой надосадочной жидкости. Образец упаривали до снижения объема примерно в два раза и беловатое твердое вещество выделяли путем вакуумного фильтрования. Полученный беловатый осадок сушили в течение 2 ч при 65°С в вакуумной печи. 7,15 г твердого вещества выделяли (89%).

Таблица 2. Пики порошковой рентгеновской дифракции формы II соединения согласно примеру 1

	Положения пиков
Пик	Угол (°2-тета) +/- 0,2°	Относительная интенсивность (% от наиболее интенсивного пика)	значение ά (ангстрем)
1	13,73	100	6,45
2	16,54	67,6	5,35
3	22,87	66,5	3,89
4	18,57	62,2	4,77
5	20,80	37,4	4,27
6	17,47	37,2	5,07
7	15,30	34,3	5,79
8	12,36	31,2	7,16
9	12,87	29,4	6,87
10	9,61	22,3	9,20

Таким образом, кристаллическая форма II 2-[5-(2,4-дифторфенил)-4-[2-[[(18)-3-метокси-1-метилпропил]амино]оксазоло[5,4-Ь]пиридин-5-ил]-1Н-имидазол-2-ил]-2-метилпропан-1-ола может быть охарактеризована порошковой рентгеновской дифрактограммой, полученной с применением излучения СиК,,, имеющей пики дифракции (2-тета), описанные в табл. 2, в частности, имеющей пик при 13,73 в комбинации с одним или более пиками при 16,54, 22,87 и 18,57; более конкретно, имеющей пик при 13,73; где ошибка измерения углов дифракции составляет 0,2°.

Пример 2. Метансульфонат 2-[5-(2,4-дифторфенил)-4-[2-[[(18)-3-метокси-1-метилпропил]амино] оксазоло[5,4-Ь]пиридин-5-ил]-1Н-имидазол-2-ил]-2-метилпропан-1-ола.

2-[5-(2,4-Дифторфенил)-4-[2-[[(18)-3-метокси-1-метилпропил]амино]оксазоло[5,4-Ь]пиридин-5-ил]1Н-имидазол-2-ил]-2-метилпропан-1-ол (37,5 мг, 0,080 ммоль) растворяли в 1:1 смеси дихлорметан/метанол (общий объем 1 мл). Добавляли по каплям 0,5М раствор метансульфокислоты в метаноле (0,16 мл). Смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин. Растворитель выпаривали при пониженном давлении и полученный остаток растирали дважды с метил-трет-бутиловым эфиром. Остаток сушили в вакууме с получением титульного соединения (42 мг, 93%). ЖХ-ИЭР/МС т/ζ 472 (М+1).

Пример 3. Гидрохлорид 2-[5-(2,4-дифторфенил)-4-[2-[[(18)-3-метокси-1-метилпропил]амино]оксазоло[5,4-Ь]пиридин-5-ил]-1Н-имидазол-2-ил]-2-метилпропан-1-ола.

В светло-розовую суспензию 2-[5-(2,4-дифторфенил)-4-[2-[[(18)-3-метокси-1-метилпропил]амино] оксазоло[5,4-Ь]пиридин-5-ил]-1Н-имидазол-2-ил]-2-метилпропан-1-ола (25,7 г, 54,51 ммоль) в метилтрет-бутиловом эфире (771 мл) при 60°С добавляли 4,0М раствор НС1 в диоксане (16,35 мл, 65,41 ммоль). Полученную суспензию нагревали до 60°С в течение 30 мин, а затем оставляли постепенно охлаждаться до КТ. Образовывалось твердое вещество, которое отфильтровывали в инертной атмосфере азота, быстро собирали и сушили в вакууме при 60°С в течение ночи с получением титульного соединения в виде густого твердого вещества. (28 г, 98%). ЖХ-ИЭР/МС т/ζ 472 (М+1).

Пример 4. 2-[5-(2,4-Дифторфенил)-4-[2-[[(1К)-3-метокси-1-метилпропил]амино]оксазоло[5,4-Ь] пиридин-5-ил]-1Н-имидазол-2-ил] -2-метилпропан-1 -ол

Титульное соединение получали при помощи способа, по существу, аналогичного способу получения δ-энантиомера, с тем исключением, что в примере получения 1 (1К)-Ы-бензил-1-фенилэтанамин

- 17 021241 применяли вместо δ-энантиомера. [α]_Β ²²-32,11°, (с = 0,54, метанол).

Пример 5. Метансульфонат 2-[5-(2,4-дифторфенил)-4-[2-[[(1К)-3-метокси-1-метилпропил]амино] оксазоло[5,4-Ь]пиридин-5-ил]-1Н-имидазол-2-ил]-2-метилпропан-1-ола.

Титульное соединение получали при помощи способа, по существу, аналогичного способу получения δ-энантиомера, описанному в примере 2.

Пример 6. 5-[2-Циклопропил-5-(2,4-дифторфенил)-1Н-имидазол-4-ил]-Х-[(^)-3-метокси-1-метилпропил]оксазоло[5,4-Ь]пиридин-2-амин

В пробирку ΚΙΜΑΧ® помещали 3-амино-6-[2-циклопропил-5-(2,4-дифторфенил)-1Н-имидазол-4ил]пиридин-2-ол (0,7 г, 2,13 ммоль) и этанол (7 мл). Добавляли (3δ)-3-изотиоцианато-1-метоксибутан (0,46 г, 3,2 ммоль), колбу закрывали и смесь нагревали до 85°С. Через 16 ч добавляли Ν,Ν'дициклогексилкарбодиимид (0,88 г, 4,26 ммоль) и смесь перемешивали в течение 4 ч при 85°С в закрытой пробирке. Затем к смеси добавляли дополнительное количество Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимида (0,44 г, 2,13 ммоль), грели при 85°С в течение ночи. Затем к смеси добавляли дополнительное количество Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимида (0,88 г, 4,26 ммоль) и грели при 85°С еще 4 ч. Неочищенную реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток очищали путем нормально-фазовой хроматографии (120 г картридж с силикагелем, градиентное элюирование смесью дихлорметан-этанол). Фракции, содержащие целевое соединение, дополнительно очищали путем полупрепаративной обращенно-фазовой высокоэффективной ЖХ/МС с применением колонки ΧΒΚ.ΙΌΟΕ™ (5 мкм, 19x100 мм) в изократическом режиме с применением 36% ацетонитрила в 20 мМ ΝΗ.·|Ηί.Ό₃, (рН 9), 5 мин, расход 25 мл/мин, с получением титульного соединения (0,15 г, 16%). ЖХ-ИЭР/МС т/ζ 440 (М+1); [а]_с ²² +58,60°, (с = 0,50, метанол).

Пример 7. Метансульфонат 5-[2-циклопропил-5-(2,4-дифторфенил)-1Н-имидазол-4-ил]-Х-[(^)-3метокси-1-метилпропил]оксазоло[5,4-Ь]пиридин-2-амина.

5-[2-Циклопропил-5-(2,4-дифторфенил)-1Н-имидазол-4-ил] -Ν-[(1 δ)-3 -метокси-1 -метилпропил] оксазоло[5,4-Ь]пиридин-2-амин (0,090 г, 0,23 ммоль) растворяли в 1:1 смеси дихлорметана и метанола (общий объем 3 мл). К раствору добавляли по каплям 0,5М раствор метансульфокислоты в метаноле (0,47 мл). Смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, затем растворитель выпаривали при пониженном давлении. Остаток смешивали с метанолом и концентрировали дважды с получением титульного соединения (0,111 г, 89%). ЖХ-ИЭР/МС т/ζ 440 (М+1).

Пример 8. 5-[5-(2,4-Дифторфенил)-2-(3-метилоксетан-3-ил)-1Н-имидазол-4-ил]-Х-[(^)-3-метокси1 -метилпропил] оксазоло [5,4-Ь] пиридин-2-амин

В пробирку ΚΙΜΑΧ® помещали 3-амино-6-[5-(2,4-дифторфенил)-2-(3-метилоксетан-3-ил)-1Нимидазол-4-ил]пиридин-2-ол (2,28 г, 6,36 ммоль) и этанол (18 мл). Добавляли (3δ)-3-изотиоцианато-1метоксибутан (1,39 г, 9,54 ммоль), колбу закрывали и смесь нагревали до 85°С. Через 16 ч добавляли (3δ)-3-изотиоцианато-1-метоксибутан (700 мг) и смесь перемешивали в течение 48 ч при 85°С в закрытой пробирке. Добавляли Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимид (1,04 г) и смесь перемешивали в течение 3 ч при 85°С в закрытой пробирке. Неочищенную реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток очищали путем нормально-фазовой хроматографии (120 г картридж с силикагелем, гексан-этанол). Целевое соединение элюировали смесью с 3% содержанием этанола с получением титульного соединения в виде коричневого твердого вещества (2,61 г, 87%). ХЖ-ИЭР/МС т/ζ 470 (М+1); [а]_с ²² +42,2°, (с = 0,50, метанол).

Пример 9. Метансульфонат 5-[5-(2,4-дифторфенил)-2-(3-метилоксетан-3-ил)-1Н-имидазол-4-ил]-Х[(^)-3-метокси-1-метилпропил]оксазоло[5,4-Ь]пиридин-2-амина.

5-[5-(2,4-Дифторфенил)-2-(3 -метилоксетан-3 -ил)-1Н-имидазол-4-ил] -Ν-[(1 δ)-3 -метокси-1-метилпропил]оксазоло[5,4-Ь]пиридин-2-амин (0,72 г, 1,54 ммоль) растворяли в 1:1 смеси дихлорметан/метанол (общий объем 15 мл). К раствору добавляли по каплям 0,5М раствор метансульфокислоты в метаноле (3,07 мл). Смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, затем растворитель выпаривали при пониженном давлении. Остаток растирали с метил-трет-бутиловым эфиром с получением титульного соединения в виде коричневого твердого вещества (0,841 г, 97%). ЖХ-ИЭР/МС т/ζ 470 (М+1).

Пример 10. [1-[5-(2,4-Дифторфенил)-4-[2-[[(^)-2-этокси-1-метилэтил]амино]оксазоло[5,4-Ь]пиридин-5-ил]-1Н-имидазол-2-ил]циклопропил]метанол

- 18 021241

Метил-1-[5-(2,4-дифторфенил)-4-[2-[[(18)-2-этокси-1-метилэтил]амино]оксазоло[5,4-Ь]пиридин-5ил]-1Н-имидазол-2-ил]циклопропанкарбоксилат (0,9 г, 1,99 ммоль) растворяли в сухом диэтиловом эфире (20 мл) и сухом ТГФ (7 мл) в атмосфере азота и охлаждали до 0°С. Порциями добавляли Боргидрид лития (87 мг, 3,99 ммоль) и смесь перемешивали при 0°С в течение 1 ч. Остатки реагентов нейтрализовали путем добавления 1н. НС1 в смесь при КТ по каплям в течение 30 мин до достижения рН 1. Смесь промывали этилацетатом, водный слой подщелачивали (до рН 8) №ЮН и экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические слои сушили над Мд8О₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали путем нормально-фазовой хроматографии (120 г картридж с силикагелем) с градиентным элюированием смесью гексан-этанол с получением титульного соединения (0,56 г, 60%). ЖХ-ИЭР/МС т/ζ 470,2 (М+1); [α]_η ²² -18,00°, (с = 0,50, МеОН); [α]η²² -18,0°, (с = 0,50, СНС13).

Пример 11. Метансульфонат [1-[5-(2,4-дифторфенил)-4-[2-[[(18)-2-этокси-1-метилэтил]амино]оксазоло[5,4-Ь]пиридин-5-ил]-1Н-имидазол-2-ил]циклопропил]метанола.

[1-[5-(2,4-Дифторфенил)-4-[2-[[(18)-2-этокси-1-метилэтил]амино]оксазоло[5,4-Ь]пиридин-5-ил]-1Нимидазол-2-ил]циклопропил]метанол (0,56 г, 1,19 ммоль) растворяли в 1:1 смеси дихлорметан/метанол (общий объем 12 мл). К раствору добавляли по каплям 0,5М раствор метансульфокислоты в метаноле (2,37 мл). Смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, затем растворитель выпаривали при пониженном давлении. Остаток смешивали с метанолом и концентрировали дважды с получением титульного соединения (0,64 г, 96%). ЖХ-ИЭР/МС т/ζ 470,1 (М+1).

Биологические исследования

Приведенные ниже исследования доказывают, что предложенные соединения согласно настоящему изобретению являются высокоактивными ингибиторами р38а МАР киназы, высокоактивными ингибиторами р38в МАР киназы и высокоактивными ингибиторами сигнального пути р38 МАР киназы в раковых клетках. Приведенные исследования также показывают, что соединение согласно примеру 1 или соли соединения согласно примеру 1 (соединения согласно примерам 2 или 3) имеют высокую активность ίη νίνο и являются эффективными противораковыми агентами отдельно и/или в комбинации с другими онколитическими агентами.

Ингибирование ферментной активности р38а МАР киназы

Получение реагентов.

Буфер для киназной реакции получали в виде маточного раствора, содержащего 1440 мкл 1М 4-(2гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфокислоты (НЕРЕ8) рН 7,5, 240 мкл 1М МдС1₂, 72 мкл 1М дитиотреитола (ДТТ), 25 мкл 10% ТΚIТΟN® Х-100, 43223 мкл Н₂О. Смесь субстратов получали путем смешения следующих компонентов: 2775 мкл буфера для киназной реакции, 75,0 мкл 10 мМ аденозинтрифосфата (АТФ), 270 мкл 4 мМ пептида РЭФР (Ирк1а1е Вю1ес1то1оду/МППроге) (9,17 мг/мл) и 12,5 мкл ³³РАТФ. Маточный раствор фермента р38 МАР киназы получали путем разбавления 0,1 мг/мл раствора очищенной р38а МАР киназы человека в 3000 мкл буфера для киназной реакции. Маточные растворы исследуемых соединений получали путем растворения соединений в 100% диметилсульфоксиде (ДМСО) до достижения 10 мМ концентрации. 100 мкМ разбавленные растворы для планшета получали путем разбавления 2 мкл 10 мМ маточного раствора в 198 мкл 20% ДМСО. Проводили 1:3 разбавления 100 мкМ маточного раствора в 20% ДМСО с применением дозатора Тесап.

Исследование киназы.

Для исследования киназы 5 мкл разбавленного соединения переносили в реакционный планшет, затем добавляли 10 мкл маточного раствора фермента (добавляли с применением дозатора жидкостей МиЬТГОКОР®). Для инициирования реакции 10 мкл смеси субстратов добавляли при помощи МИЬТГОКОР® и планшет встряхивали в течение 30 с Конечные условия реакции приведены ниже: 25 мМ НЕРЕ8 рН 7,5, 4,25 мМ МдС1₂, 1,30 мМ ДТТ, 0,004% ΊΚΠΌΝ® Х-100, 100 мкМ АТФ, 100 мкМ пептид РЭФР, 11,8 нМ р38а МАР киназа и 4% ДМСО. Реакционную смесь инкубировали при КТ в течение 60 мин, затем реакцию останавливали путем добавления 75 мкл 5% уксусной кислоты (свежеприготовленной). После остановки реакции 100 мкл реакционной смеси переносили в фильтрующий планшет с фосфоцеллюлозным фильтром (МПНроте, NАРН), который предварительно промывали 100 мкл 0,5% уксусной кислоты. Реакционную смесь инкубировали в планшете с фосфоцеллюлозным фильтром в течение 30 мин, фильтровали с применением вакуумного коллектора и промывали один раз 300 мкл, а затем дважды 200 мкл 0,5% ортофосфорной кислоты. После промывки 80 мкл М1СКО8СШТ™ 20 добавляли и определяли радиоактивность на Тгйих М1СКОВЕТА®. Значения 1С₅₀ рассчитывали при помощи программного обеспечения ДсНуНу Ваке (ГОВ8). Все предложенные соединения имели значения 1С₅₀ менее 0,050 мкМ. Например, соединение согласно примеру 1 имело значение 1С₅₀ = 0,003 мкМ. Данное исследование подтверждает, что соединение согласно примеру 1 является высокоактивным ингибитором р38а

- 19 021241

МАР киназы.

Ингибирование ферментной активности р38В МАР киназы

Получение реагентов.

Буфер для киназной реакции получали, по существу, аналогично предложенному выше описанию. Смесь субстратов получали путем смешения следующих компонентов: 2840 мкл буфера для киназной реакции, 15,0 мкл 10 мМ АТФ, 125 мкл 4 мМ пептида РЭФР (9,174 мг/мл), 18,75 мкл ³³Р-АТФ. Маточный раствор фермента р38Ц МАР киназы получали путем разбавления 2,25 мкл коммерчески доступного 0,57 мг/мл раствора р38Ц МАР киназы <ир81а1е В1о1есЬпо1о§у/М1Шроге) в 2000 мкл буфера для киназной реакции. Маточные растворы исследуемых соединений получали по существу аналогично предложенному выше описанию.

Исследование киназы.

Исследование киназы проводили, по существу, согласно описанию исследования р38а МАР киназы. Конечные условия реакции приведены ниже: 25 мМ НЕРЕБ рН 7,5, 4,25 мМ МдС1₂, 1,30 мМ ДТТ, 0,004% ΤΚΙΤ0Ν® Х-100, 20 мкМ АТФ, 65 мкМ пептид РЭФР, 0,25 нг/мкл р38Р МАР киназа, 4% ДМСО. Все предложенные соединения имели значения 1С₅₀ менее 0,050 мкМ. Например, соединение согласно примеру 1 имело значение 1С₅₀ = 0,007 мкМ. Данное исследование подтверждает, что соединение согласно примеру 1 является высокоактивным ингибитором р38Ц МАР киназы.

Клеточное исследование ингибирования р38 МАР киназы.

Исследовали ингибирование р38 МАР киназы в клетках НеЬа путем измерения уровня МАРКАРК2 после стимуляции ФНОа в присутствии исследуемого соединения. Клетки НеЬа человека (АТСС) выращивали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (среда ЭМЕМ). содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС, 01ВС0). Проводили последовательные разбавления 1:3 исследуемых соединений в питательной среде до достижения конечной концентрации в ДМСО, составляющей 0,1%. Для исследования 60000 клеток на лунку помещали в 100 мкл среды ЭМЕМ, содержащей 10% эмбриональную бычью сыворотку, в 96-луночный планшет с покрытием поли-Э-лизина. Клетки инкубировали в течение ночи при 37°С в инкубаторе с 5% С0₂. На следующий день планшеты переворачивали для удаления среды и 90 мкл свежеприготовленной среды, содержащей ДМСО (контрольные лунки) или последовательно разбавленное исследуемое соединение, добавляли. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°С в присутствии 5% С0₂. Через 1 ч 20 мкл 100 нг/мл раствора ФНОа человека (полученного в ЭМЕМ/ЭБС) добавляли в лунки с получением конечной концентрации, составляющей 18,2 нг/мл Все лунки обрабатывали ФНОа за исключением лунок, в которые ФНОа не вводили, по которым определяли минимальный фоновый сигнал. Клетки инкубировали с ФНОа в течение 15 мин (37°С/5% СО₂) для стимуляции фосфорилирования МАРКАРК2, субстрата р38 МАР киназы.

Для исследования сЕМБА среду удаляли путем переворачивания планшета. Клетки фиксировали путем добавления фиксатора РРЕЕЕК® (Апа1есН Ий) в течение 30 мин при КТ. Клетки промывали три раза по 5 мин 100 мкл фосфатного буферного раствора (ФБР), содержащего 0,1% ΤΚΙΤ0Ν™ Х-100 (эту смесь называют РВБП). 100 мкл 0,6% Н₂О₂ в РВБЛ добавляли в клетки в течение 15 мин для нейтрализации пероксидазы, затем снова промывали три раза по 5 мин РВБК Клетки блокировали путем добавления 5% раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) при КТ в течение 1 ч. Клетки промывали три раза по 5 мин РВБК Клетки инкубировали совместно с первичным антителом к р-МАРКАРК-2 Τ1ιγ334 (Се11 БЦпаПпд), разбавленным 1/1000 в РВБК содержащем 5% БСА, при 4°С в течение ночи. Клетки промывали три раза по 5 мин РВБК Клетки обрабатывали вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой антикроличьим 1д антителом (Атеткйат), разбавленным 1/1000 в РВБК содержащем 5% БСА, в течение 1 ч при КТ. Клетки промывали три раза по 5 мин РВБК

Для детектирования сигнала применяли набор БυРЕΡБIСNА^® ЕЬ1БА ГетЮ (Р1егсе). Равные части люминола/усилителя ЕетЮ и пероксидазы смешивали перед применением. 100 мкл смеси добавляли в каждую лунку и встряхивали в течение 1 мин при помощи устройства перемешивания микропланшет. Значения в относительных световых единицах определяли на люминометре УюЮг 1420. Относительные значения 1С₅₀ определяли при помощи программного обеспечения АсЕуПу Ваке (ГОВБ). Все предложенные соединения имели значения 1С₅₀ менее 0,050 мкМ. Например, соединение согласно примеру 1 имело значение 1С₅₀ = 0,0016 мкМ. Данное исследование показывает, что соединение согласно примеру 1 является высокоактивным ингибитором сигнального пути р38 МАР киназы в раковых клетках.

Направленное ингибирование ΐη νίνο (ГУТГ) р38 МАР киназы у мышей С57ВБ/6, не использовавшихся ранее в лабораторных исследованиях ίνΤΙ р38 МАР киназы измеряли в мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК) мышей, которым перорально вводили исследуемое соединение, при помощи исследования проточной цитометрии р-МАРКАРК2, субстрата р38 МАР киназы.

Фаза исследования животных.

Самцов мышей С57ВЬ/6 (возрастом 6-8 недель) случайным образом делили на группы по 4 особи. Исследуемое соединение принудительно перорально вводили в 0,1 мл носителя (1% гидроксиэтилцеллюлоза (ГЭЦ), 0,25% ^УЕЕШ^¹ 80, 0,05% противопенного агента). Контрольным животным вводили 0,1

- 20 021241 мл носителя, не содержащего исследуемое соединение. Для исследования действия единственной дозы и зависимости доза-эффект животных умерщвляли через 2 ч после введения дозы. Для исследования курса лечения животных умерщвляли с различными временными интервалами после введения дозы, как правило, через 1, 2, 4, 6, 18 и 24 ч. Цельную кровь собирали в пробирки с покрытием ЭДТА (АЦи18ЕЬ).

Детектирование фосфорилированной МАРКАРК2 в МКПК путем проточной цитометрии: 100 мкл цельной крови мышей добавляли в каждую пробирку с ЭДТА и инкубировали при 37°С в течение 10 мин. Смесь трех антител получали следующим образом путем разбавления в окрашивающем/промывочном буфере: конъюгированное с ФИТЦ крысиное антимышиное Ьу-6С тАЬ (ΒΌ Βίοδοίепсек) 1:25; конъюгированное с АФЦ крысиное антимышиное СЭ11Ь тАЬ (ΒΌ ВюхаспссЦ 1:10; и мышиный ΒΌ Рс В1оск (ΒΌ ВюхаспссЦ 1:100. Получали маточный раствор анизомицина (81дта) в ДМСО с концентрацией 5 мг/мл. Аликвоты по 15 мкл маточного раствора анизомицина помещали в раздельные пробирки и хранили при -20°С для однократного применения. В день исследования маточный раствор анизомицина (5 мг/мл) разбавляли до 100 мкг/мл в окрашивающем/промывочном буфере (ΒΌ). Равный объем разбавленного анизомицина смешивали со смесью антител.

мкл полученной выше смеси добавляли в каждую пробирку с цельной кровью, одну пробирку наполняли за 20 с. Образец инкубировали при 37°С в течение 15 мин в термомиксере при осторожном встряхивании. Лизисный/фиксирующий буфер (ΒΌ) разбавляли 5х в воде и нагревали до 37°С. 1,6 мл разбавленного лизисного/фиксирующего буфера (=1х рабочая концентрация) добавляли в каждую пробирку, одну пробирку наполняли за 20 с, в той же последовательности, что и ранее. Образцы инкубировали при 37°С в течение 10 мин при встряхивании. Клетки затем центрифугировали при 600хд в течение 8 мин при КТ. Клетки промывали один раз 3 мл промывочного/окрашивающего буфера, ФБР и 5% декомплементированной (инактивированной нагреванием) ЭБС. Надосадочную жидкость осторожно удаляли для предотвращения потерь клеточной массы. Антитело к фосфорилированной МАРКАРК2 (ТЬг334) (Се11 81дпа1шд ТесЬпо1оду, клон 27В) и мышиный Рс-Ь1оск разбавляли в пермеабилизирующей среде В (Сакад) (250х разбавление для обоих антител). 200 мкл разбавленной смеси антител применяли для повторного суспендирования клеток.

Клетки затем инкубировали при КТ в течение 30 мин. Затем добавляли 3 мл окрашивающего/ промывочного буфера и клетки центрифугировали так, как описано выше. Снова проводили промывку 3 мл окрашивающего/промывочного буфера. Козий антикроличий Р(аЬ')₂ конъюгат иммуноглобулин-РЕ (Βίοзоигсе) разбавляли в окрашивающем/промывочном буфере (250хразбавление) 200 мкл разбавленного антитела затем добавляли в каждую пробирку.

Образцы инкубировали при КТ в течение 30 мин. Затем добавляли 3 мл окрашивающего/ промывочного буфера и клетки центрифугировали. Снова проводили промывку 3 мл окрашивающего/промывочного буфера. Наконец, клетки повторно суспендировали в 250 мкл ФБР, содержащем 1% декомплементированную (инактивированную нагреванием) ЭБС. Образцы анализировали при помощи способа проточной цитометрии (РАСЗсакЬег, ΒΌ). После определения популяции каждого вида жизнеспособных клеток путем бокового и прямого светорассеяния уровень р-МАРКАРК2 измеряли в популяции моноцитов, определенной (по повышенному сигналу флуоресценции) с применением СП11Ь^ыЬу6С^-.

Анализ данных.

Среднюю интенсивность флуоресценции в моноцитах анализировали для определения уровня рМАРКАРК2. Уровень р-МАРКАРК2 (рМК2) в стимулированных анизомицином за вычетом уровня в нестимулированных моноцитах контрольных животных, которым вводили носитель, использовали для определения диапазона сигналов. Ингибирование в процентах под действием исследуемого соединения определяли при помощи следующего уравнения:

ингибирование. %= 100-Н00*<’стимул,рМК2- несгимул.рМК2 у животных, которым вводили соединение)!

(стимул.рМК2-нестимул рМК2 у животных, которым вводили носитель)

Согласно данному протоколу пороговая эффективная доза 70% ингибирования (ТЕЭ-₀) для соединения согласно примеру 1 составляла 5,1 мг/кг через 2 ч после введения дозы. Пороговая эффективная концентрация 70% ингибирования (ТЕС70), определенная путем измерения уровня соединения, поступающего в кровоток, в плазме в том же исследовании составляла 39,4 нг/мл (0,084 мкМ) через 2 ч после введения дозы. Указанное исследование показывает, что соединение согласно примеру 1 имеет высокую активность ίη νί\Ό.

Ингибирование ΐη νίνο р38 МАР киназы у мышей-опухоленосителей

Для определения ингибирования р38 МАР киназы в опухолях применяли модель ксенотрансплантации мышам опухолевой клеточной линией человека, И87МС.

Фаза исследования животных.

Самкам бестимусных мышей (24-26 г, Наг1ап) в бок вводили подкожную инъекцию 5х10⁶ клеток И87МС на одно животное. Клетки инъецировали в 0,2 мл 1:1 смеси питательной среды для клеточных культур и матрицы ΒΌ МАТЫСЕЬ™. Через 7 дней после имплантации размер опухолей измеряли при помощи циркуля-калипера и данные записывали. После этого размер опухолей измеряли два раза в неде- 21 021241 лю и данные записывали. Когда средний размер опухолей достигал примерно 250 мм³ (как правило, через 10-15 дней после имплантации) животных случайным образом делили на группы по 8-10 особей для исследования способа лечения. Животным затем перорально вводили 0,2 мл носителя (1% ГЭЦ, 0,25% Τ\νΕΕΝ®80. 0,05% противопенного агента) отдельно или носителя, содержащего исследуемое соединение. Через 2 ч после введения животных усыпляли. Опухоли извлекали и немедленно обрабатывали путем гомогенизации в растворе 1%ΤΚΙΤΘΝ® Х-100 и полного протеазного коктейля ингибиторов фосфатаз (РосНе §1аибагб 1аЬ1е15 сотр1е!е, не содержащий ЭДТА протеазный ингибирующий коктейль, кат.№11893580001). Кроме того, кровь собирали в пробирки с покрытием этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и плазму получали с использованием 96-луночного планшета для анализа воздействия.

Исследование р-МАРКАРК2 в лизатах опухолей

Уровень Р-МАРКАРК2 в лизатах опухолей определяли с применением набора Ме5О5са1е ОНсоуегу (ΜδΌ) для анализа ЕЫ8А с захватом (2-фосфорилированная МАРКАРК2 (ТЬг334)). Концентрацию белка в лизатах определяли с применением набора для исследования белков ВюКаб ΌΟ (ВюВаб). Образцы белков из каждого лизата опухоли разбавляли до концентрации 2 мг/мл при помощи 1% раствора ΤΡΙΤΟΝ® Х-100. Для определения мезодиапазона МАРКАРК2 50 мкг лизата опухоли добавляли в 96луночный планшет с углеродным электродом, в который предварительно вводили захватывающее антитело (= антитело к сумме белков МАРКАРК2). Уровень р-МАРКАРК2 исследовали с применением меченого рутением детектирующего антитела к р-МАРКАРК2. После инкубации с детектирующим антителом планшет ΜδΌ промывали, после чего добавляли буфер считывания радиоактивного сигнала ΜδΌ. После пропускания тока через электрод электрохемилюминесценция приводила к выработке света, которую количественно оценивали на оборудовании ΜδΌ §ес!ог 6000. В каждом исследовании рассчитывали ингибирование в процентах по сравнению с контрольной группой, которой вводили носитель, и анализ ΑΝΟνΑ (статистический анализ вариаций) проводили при помощи программного обеспечения ΙΜΡ для определения статистической значимости. Результаты анализа подтверждали при помощи иммуноблота репрезентативных исследований. В этом исследовании определили, что соединение согласно примеру 1 имеет значение ΤΕΌ₇₀ направленного ингибирования р38 ΜΑΡ киназы в опухолях, составляющее 2,9 мг/кг, а значение ТЕС₇₀ составляет 31,3 нг/мл. Полученные данные подтверждают, что соединение согласно примеру 1 имеет схожую активность направленного ингибирования в опухолях и в МКПК.

Определение эффективности ΐη νίνο в моделях ксенотрансплантации

Модель ксенотрансплантации А2780.

Самок СЭ1 пи/пи мышей с массой, составляющей примерно 22-25 г, приобретали в СЬаг1е8 Р|уег ЬаЬога1ог1е5. После акклиматизации в течение 1 недели в бок каждой мыши вводили подкожную инъекцию 2х10⁶ клеток А2780 карциномы яичников человека в 0,2 мл 1:1 смеси питательной среды для клеточных культур и матрицы ΒΌ ΜΑΤΚΙΟΕΤ®. Размер опухоли отслеживали при помощи циркулякалипера два раза в неделю. Когда средний размер опухоли достигал 150 мм³, животных случайным образом делили на группы по 10 особей. Введение ингибитора р38 ΜΑΡ киназы начинали после деления на группы. Соединение согласно примеру 2 вводили перорально в 0,2 мл 1% ГЭЦ, 0,25% руееп® 80, 0,05% противопенного агента (ГЭЦ/ΤνΕΕΝ®). Соединение вводили в дозах, составляющих 1, 3 и 10 мг/кг. Введение проводили три раза в день (ΤΙΌ) по схеме, включающей 4 дня дозирования и 3 дня отдыха. Проводили три цикла дозирования. Размер опухолей отслеживали два раза в неделю во время периода дозирования и отслеживали эффективность (подавление роста опухоли) по сравнению с контрольной группой, которой вводили носитель (п=10 животных). Через 1, 2 и 8 ч после введения последней дозы ингибитора р38 ΜΑΡ киназы собирали образцы плазмы животных для определения уровня соединений в кровотоке животных.

	Подавление роста опухоли (%)	Средняя концентрация в плазме (мкМ) в момент времени (час) после введения последней дозы
Исследуемые группы (РО, 1ΊΙΛ 4 дня введения, 3 дня отдыха, 4 цикла) (мг/кг)	День 20	День 23	День 26	День 29(посл.)	1	2	3
1	70,6	76,6	76	78,3	0,0263	0,0146	ниже предела обнаружения <(1,<Ю)
3	32,5	47,7	42,7	37,7	0,0526	0,0604	0,0042
10	60	71,2	72,8	74,8	0,4952	0,3978	0,0243

- 22 021241

Модель ксенотрансплантации множественной миеломы ОРМ-2.

Самок мышей СВ-17 §СГО с массой 20-22 г приобретали в Тасотс. После акклиматизации в течение одной недели мышей облучали дозой 2,5 Грей. В течение 24 ч после облучения мышам в бок вводили подкожную инъекцию 1,0x10’ клеток ОРМ-2 в 0,2 мл 1:1 смеси питательной среды для клеточных культур и матрицы ΒΌ МАТКЮЕЬ™. Размер опухолей отслеживали путем измерения при помощи циркуля-калипера два раза в неделю. Когда размер опухоли достигал 100-150 мм³, животных случайным образом делили по группам дозирования. Введение соединения начинали после деления на группы. Соединение согласно примеру 2 вводили перорально в 0,2 мл 1% ГЭЦ, 0,25% Т^ЕЕЫ® 80, 0,05% противопенного агента (ГЭЦ/Т^ЕЕЫ®). Вводимые дозы соединения составляли 15 и 30 мг/кг. Дозирование проводили два раза в день (ВШ) в течение 28 дней. Объем опухоли отслеживали два раза в неделю в течение периода дозирования, отслеживали эффективность (подавление роста опухоли) по сравнению с контрольной группой, которой вводили носитель (п=10 животных).

Название группы:	ГЭЦПЛУЕЕМ, 11,2 мл, РО, ВШ	Пример 2,15 мг/кг, РО, ВШ	Пример 2, М мг/кг, РО, ВШ
День	ЧИСЛО мышей	Ср.разм. опух. (мл?)	ско	Знач	число мышей	Ср. рази. опух. (мм3)	ско	Знач	ЧИСЛО мышей	Ср разм. опух. (мл?)	ско	Знач
4	10	102,8	20,84	Конт	9	101,69	18,94	НЗ	9	97,8	16,77	го
8	10	88,54	17,95	Конг	9	87,96	16,38	го	9	90,78	15,57	НЗ
11	10	141,58	28,7	Конт	9	104,9	19,54	го	9	118,46	20,32	НЗ
15	10	132,95	26,95	Конт	8	104,21	19,65	го	9	95,34	16,35	НЗ
18	10	161,01	32,64	Конт	8	120,17	22,83	го	9	103,71	17,79	•
21	10	211,27	42,83	Конт	8	182,47	34,89	НЗ	9	115,16	19,75	♦♦
25	10	233,07	47,25	Конт	8	169,53	32,63	го	9	155,27	26,63	НЗ
29	10	289,92	58,77	Конт	8	214,18	41,47	го	9	154,83	26,56
33	10	464,75	94,21	Конт	8	326,29	63,41	го	9	224,14	38,45	»♦
36	10	635,98	128,92	Конт	8	384,59	74,93	*	9	243,32	41,74	*♦*
43	10	875,15	177,41	Конт	8	628,46	123,01	ю	9	407,07	69,82
46	9	1162,28	237,09	Конт	8	700,62	137,33	•	9	527,14	90,42
49	8	1238,92	256,05	Конт	8	937,29	183,95	го	9	642,22	110,16	**
53	8	1437,56	301,51	Конт	8	1138,19	223,68	НЗ	9	812,48	139,37	*

Модель ксенотрансплантации 786-О в комбинации с сунитинибом.

Самок бестимусных мышей с массой 24-26 г приобретали в Наг1ап ЬаЪ8. Через 1 неделю акклиматизации 5x10⁶ клеток 786-О почечноклеточной карицномы человека подкожно инъецировали в бок каждой мыши в 0,2 мл 1:1 смеси питательной среды для клеточных культур и матрицы ΒΌ МЛТКЮЕЬ™. Размер опухоли отслеживали путем измерения при помощи циркуля-калипера два раза в неделю. Когда средний размер опухоли достигал 150-200 мм³, животных случайным образом делили на группы по 8-10 особей. Введение ингибитора р38 МАР киназы начинали после проведения деления по группам. Соединение вводили перорально в 0,2 мл 1% ГЭЦ, 0,25% Т^ЕЕЫ® 80, 0,05% противопенного агента (ГЭЦ/ТАЕЕЖ®). Дозирование проводили два раза в день (ВГО) с применением исследуемого соединения в концентрации 15 мг/кг отдельно или в комбинации с 10 мг/кг или 20 мг/кг сунитиниба, который также вводили перорально ВШ в том же носителе. Размер опухоли отслеживали два раза в неделю, определяли эффективность (подавление роста опухоли) по сравнению с контрольной группой животных, которым вводили носитель.

- 23 021241

	Подавление роста опухоли, %
№ группы	Группы (ГО, ВГО х 28)	Число субъектов	День 17	День 21	День 24	День 28	День 31
1	ГЭи/ΓΛΈΕΝ©, 0,2 мп ГЭЦТ^ЕЕЫ® 0,2 мл	10	0	0	0	0	0
2	Пример 315 мг/кг ГЭЦ/Т\УЕЕЫ® 0,2 мл	8	-35,5	-23	-52,4	-74,1*	-58,8*
3	Сунитиниб 10 мг/кг ГЭЦ/ТОЕЕМ® 0,2 мл	8	-1,6	2,9	-16,3	-21,2	-27,7
4	Сунитиниб 20 мг/кг ГЭЦ/ТОЕЕЫ® 0,2 мл	8	-55,9	31,5	18	34,5	35,4*
5	Пример 3 15 мг/кг Сунитиниб 10 мг/кг	8	-31,3	9,8	-14,9	-23,2	-0,4
6	Пример 315 мг/кг Сунитиниб 20 мг/кг	8	69,4*	96,8*	89*	99,1*	97,5*

* статистически значимое значение по сравнению с носителем.

Данные, полученные в этом исследовании, показывают, что ингибирование р38 МАР киназы (15 мг/кг ВГО) усиливает противоопухолевую эффективность сунитиниба, вводимого с дозой 20 мг/кг. Статистическое определение синергии проводили при помощи двустороннего анализа вариации при повторных измерениях зависимости логарифмического объема опухоли от времени. Этот анализ подтверждал общую значительную синергию (р>0,0001) ингибитора р38 МАР киназы, дозируемого ВГО в количестве 15 мг/кг, и сунитиниба, дозируемого ВГО в количестве 20 мг/кг.

Соединения согласно настоящему изобретению предпочтительно находятся в форме фармацевтических композиций, которые вводят при помощи различных способов. Наиболее предпочтительно указанные композиции предназначены для перорального или внутривенного введения. Указанные фармацевтические композиции и способы их получения хорошо известны в данной области техники. См., например, ΚΕΜΙΝΟΤΟΝ: ТНЕ ЕЮЕЖР А\1) РКАСПСЕ ОР РНАКМАСУ (Ό. Тгоу, е! а1, еЛз., 21⁸‘ ед., Прршсой ^1Шат8 & ХУПкиъ, 2005).

Соединения согласно настоящему изобретению в целом являются эффективными в широком диапазоне дозировок. Например, дозируемое за день количество, как правило, находится в диапазоне, составляющем примерно 14-155 мг. В некоторых случаях введение дозировки ниже нижнего предела вышеуказанного диапазона может быть достаточным, в то же время в других случаях даже более высокие дозы можно применять без возникновения каких-либо опасных побочных эффектов, и, таким образом, приведенный выше диапазон дозировок никаким образом не ограничивает объем настоящего изобретения. Нужно понимать, что фактически вводимое количество соединения определяет лечащий врач с учетом важных обстоятельств, включая состояние, требующее лечения, выбранный способ введения, вводимое соединение или соединения, возраст, рост и ответ индивидуального пациента и тяжесть симптомов у пациента.

Claims (17)

1. Соединение формулы где X представляет собой метоксиэтил или этоксиметил;

О представляет собой циклопропил, 2-метилпропанол-2-ил, 3-метилоксетан-3-ил, 1-гидроксиметил1-циклопропил;

или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Соединение по п.1, представляющее собой 2-[5-(2,4-дифторфенил)-4-[2-[[(18)-3-метокси-1метилпропил]амино]оксазоло[5,4-Ь]пиридин-5-ил]-1Н-имидазол-2-ил]-2-метилпропан-1-ол, или его фармацевтически приемлемая соль.

3. Соединение по п.1 или 2, представляющее собой кристаллический 2-[5-(2,4-дифторфенил)-4-[2[[(18)-3-метокси-1-метилпропил]амино]оксазоло[5,4-Ь]пиридин-5-ил]-1Н-имидазол-2-ил]-2метилпропан-1-ол, форма I, характеризуемый порошковой рентгеновской дифрактограммой (излучение Си, λ = 1,54060 А), содержащей пик при 15,06 и один или более пиков при 19,94, 10,31 и 20,78 (2θ±0,2°).

4. Соединение по п.1 или 2, представляющее собой кристаллический 2-[5-(2,4-дифторфенил)-4-[2[[(18)-3-метокси-1-метилпропил]амино]оксазоло[5,4-Ь]пиридин-5-ил]-1Н-имидазол-2-ил]-2метилпропан-1-ол, форма II, характеризуемый порошковой рентгеновской дифрактограммой (излучение

- 24 021241

Си, λ = 1,54060 А), содержащей пик при 13,73 и один или более пиков при 16,54, 22,87 и 18,57 (2θ±0,2°).

5. Соединение по п.1, представляющее собой 5-[2-циклопропил-5-(2,4-дифторфенил)-1Н-имидазол4-ил]-Ы-[(1§)-3-метокси-1-метилпропил]оксазоло[5,4-Ь]пиридин-2-амин, или его фармацевтически приемлемая соль.

6. Соединение по п.1, представляющее собой 5-[5-(2,4-дифторфенил)-2-(3-метилоксетан-3-ил)-1Нимидазол-4-ил]-Н-[(1§)-3-метокси-1-метилпропил]оксазоло[5,4-Ь]пиридин-2-амин, или его фармацевтически приемлемая соль.

7. Соединение по п.1, представляющее собой [1-[5-(2,4-дифторфенил)-4-[2-[[(1§)-2-этокси-1метилэтил]амино]оксазоло[5,4-Ь]пиридин-5-ил]-1Н-имидазол-2-ил]циклопропил]метанол, или его фармацевтически приемлемая соль.

8. Фармацевтическая композиция для лечения ракового заболевания, содержащая соединение или соль по любому из пп.1-7 в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или наполнителями.

9. Фармацевтическая композиция по п.8, дополнительно содержащая один или более онколитических терапевтических агентов.

10. Применение соединения или соли по любому из пп.1-7 в терапии заболеваний, связанных с активностью р38 МАР киназы.

11. Применение соединения или соли по любому из пп.1-7 для лечения ракового заболевания.

12. Применение по п.11, отличающееся тем, что раковое заболевание представляет собой рак яичников.

13. Применение по п.11, отличающееся тем, что раковое заболевание представляет собой множественную миелому.

14. Применение соединения или соли по любому из пп.1-7 одновременно, раздельно или последовательно в комбинации с сунитинибом для лечения рака.

15. Применение по п.14, отличающееся тем, что раковое заболевание представляет собой рак почки.

16. Применение соединения или соли по любому из пп.1-7 для получения лекарственного средства для лечения рака яичников.

17. Применение соединения или соли по любому из пп.1-7 для получения лекарственного средства для лечения множественной миеломы.