EA020969B1 - ОПТИМИЗАЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ПАРВОВИРУСНЫХ БЕЛКОВ Rep И Cap В КЛЕТКАХ НАСЕКОМЫХ - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к улучшенной продукции рекомбинантных парвовирусных вирионов в клетках насекомых. В частности, изобретение относится к усовершенствованному способу получения рекомбинантных парвовирусных вирионов в клетках насекомых, при котором соотношение заполненные/пустые парвовирусные вирионы повышено. Изобретение также относится к получению парвовирусных векторов, которые можно применять в генной терапии, и к улучшению экспрессии вирусных белков Rep, что повышает продуктивность парвовирусных векторов.

Description

Настоящее изобретение относится к получению парвовирусных векторов, в частности к получению рекомбинантных аденоассоциированных вирусов (гААУ) в клетках насекомых, к бакуловирусным экспрессирующим векторам, содержащим конструкцию согласно изобретению, и к клетке, содержащей такой бакуловирусный экспрессирующий вектор.

Уровень техники

Бакуловирусная система экспрессии хорошо известна для применения в качестве эукариотического клонирующего и экспрессирующего вектора (Кшд, Ь. А. апй К. Ό. Ро88ее, 1992, ТЬе Ъаси1оупи8 ехрге88ΐοη 8у81еш, СЬартап апй На11, ИпЪей Кшдйот; О'КеШу, Ό. К., е! а1., 1992. Васи1оупи8 Ехрте88юп Уес1от8: А ЬаЪотаЮгу Мапиа1. №\ν Уотк; Н. Ртеешап). Наряду с другими преимуществами бакуловирусной системы экспрессии ее преимуществом является то, что экспрессированные белки почти всегда растворимы, подвергаются правильному фолдингу и биологически активны. Дополнительными преимуществами являются высокие уровни экспрессии белка, более быстрое продуцирование, пригодность для экспрессии крупных белков и пригодность для крупномасштабного получения. Однако в случае крупномасштабного или непрерывного получения гетерологичных белков с использованием бакуловирусный системы экспрессии в биореакторах с клетками насекомых большие трудности создает нестабильность уровней продуцирования, также известная как эффект пассажа. Такой эффект, по меньшей мере, частично является следствием рекомбинации между повторяющимися гомологичными последовательностями в бакуловирусной ДНК.

Бакуловирусную систему экспрессии также успешно применяли для получения рекомбинантных векторов на основе аденоассоциированных вирусов (ААУ) (ИтаЪе е! а1., 2002, Нит. Оепе ТЬег. 13: 19351943; И8 6723551 и И8 20040197895). ААУ можно считать одним из наиболее многообещающих вирусных векторов для генной терапии человека. ААУ обладает способностью эффективно инфицировать делящиеся, а также не делящиеся клетки человека, вирусный геном ААУ интегрируется в один хромосомный сайт в геноме клеток-хозяев, и что наиболее важно, даже несмотря на то что ААУ присутствует в организме многих людей, он никогда не был ассоциирован ни с каким заболеванием. С точки зрения таких преимуществ рекомбинантный аденоассоциированный вирус (гААУ) проходит оценку в клинических испытаниях генной терапии гемофилии В, злокачественной меланомы, кистозного фиброза, гиперлипопротеинемии типа I и других заболеваний.

Чтобы преодолеть проблемы, связанные с системами продуцирования млекопитающих, в случае ААУ ИтаЪе с соавторами (2002, выше) разработали систему получения ААУ в клетках насекомых. Для получения ААУ в клетках насекомых были необходимы некоторые модификации, чтобы добиться правильной стехиометрии трех капсидных белков ААУ (УР1, УР2 и УР3) на основе сочетания поочередного использования двух акцепторных сайтов сплайсинга и субоптимального использования кодона инициации АСО для УР2, который не точно репродуцируется клетками насекомых. Чтобы имитировать точную стехиометрию капсидных белков в клетках насекомых, ИтаЪе с соавторами (2002, выше) используют конструкцию, которая транскрибируется в одну полицистронную матричную РНК, которая способна экспрессировать все три белка УР без необходимости в сплайсинге, и где расположенный выше других по ходу транскрипции инициирующий кодон заменен субоптимальным инициирующим кодоном АСО. В публикации \7О 2007/046703 описано дополнительное повышение инфекционности полученных с помощью бакуловирусов гААУ-векторов, основанное на получении с использованием оптимизации стехиометрии капсидных белков ААУ, которые продуцируются в клетках насекомых.

Для экспрессии белков Кер ААУ в системе экспрессии ААУ в клетках насекомых, которая исходно разработана ИтаЪе с соавторами (2002, выше), используют рекомбинантную бакуловирусную конструкцию, которая несет две независимых единицы экспрессии Кер (одну для Кер78 и одну для Кер52), каждая из которых находится под контролем отдельного промотора клеток насекомых, промоторов ΔΙΕ1 и Ро1Н, соответственно. Однако КоЬ1Ъгеппег с соавторами (2005, Мо1. ТЬег. 12: 1217-25; \7О 2005/072364) сообщили, что бакуловирусная конструкция для экспрессии двух белков Кер, которую использовали ИтаЪе с соавторами, страдает присущей ей нестабильностью. Благодаря расщеплению двух ориентированных в виде палиндрома генов Кер в исходном векторе, разработанном ИтаЪе, и конструированию двух отдельных бакуловирусных векторов для экспрессии Кер52 и Кер78, КоЬ1Ъгеппег с соавторами (2005, выше) повысили стабильность вектора при пассажах. Однако, несмотря на согласованную экспрессию Кер78 и Кер52 с двух независимых конструкций бакуловирус-Кер в клетках насекомых на протяжении по меньшей мере 5 пассажей, выход вектора гААУ в 5-10 раз ниже по сравнению с исходной конструкцией бакуловирус-Кер, созданной ИтаЪе с соавторами (2002, выше).

В заявке \7О 2007/148971 указано, что авторы настоящего изобретения значительно повысили стабильность продуцирования вектора гААУ в клетках насекомых с использованием одной кодирующей последовательности для белков Кер78 и Кер52, при этом использовали субоптимальный инициирующий кодон для белка Кер78, который частично пропускается сканирующими рибосомами, что обеспечивает возможность того, что инициация трансляции далее также происходит ниже в кодоне инициации белка Кер52.

В международной заявке на выдачу патента \7О 2007/084773 описан способ получения гААУ в

- 1 020969 клетках насекомых, при этом продуцирование инфекционных вирусных частиц повышено посредством добавления ΥΡ1 к ΥΡ2 и ΥΡ3. Добавление может быть осуществлено введением в клетку насекомого капсидного вектора, содержащего нуклеотидные последовательности, экспрессирующие ΥΡ1, УР2 и УР3, и, кроме того, введением в клетку насекомого нуклеотидных последовательностей, экспрессирующих ΥΡ1, которые могут быть либо в одном и том же капсидном векторе, либо в другом векторе.

Однако все еще существует необходимость в дальнейших усовершенствованиях крупномасштабного (коммерческого) получения парвовирусных векторов в клетках насекомых. Таким образом, целью настоящего изобретения являются средства и способы, которые обеспечивают стабильное получение парвовирусных векторов с высоким выходом (крупномасштабное), и получение, результатом которого является повышенное соотношение полные/пустые частицы (т.е. большая доля заполненных частиц).

Сущность изобретения

Изобретение относится к способу получения рекомбинантного парвовирусного вириона. Применение такого способа может обеспечить возможность получения таких вирионов с повышенным титром. Применение способа альтернативно или дополнительно может обеспечить возможность получения более высокой доли заполненных частиц, т.е. более благоприятного соотношения заполненных/пустых частиц или суммарных/заполненных частиц.

Изобретение относится к способу получения рекомбинантного парвовирусного вириона, включающему следующие стадии:

(a) получения клетки насекомого, содержащей одну или несколько конструкций нуклеиновых кислот, содержащих (т) нуклеотидную последовательность, содержащую трансген, который фланкирован по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью парвовирусного инвертированного концевого повтора;

(ίί) первую кассету экспрессии, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Кер парвовируса, которая функционально связана с первым промотором, который способен управлять экспрессией белка Кер в клетках насекомых;

(ίίί) вторую кассету экспрессии, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую капсидный белок парвовируса, которая функционально связана со вторым промотором, который способен управлять экспрессией капсидного белка в клетках насекомых;

(b) культивирования клетки, определенной в пункте (а), в условиях, подходящих для экспрессии Кер и капсидного белка; и (c) необязательно извлечения рекомбинантного парвовирусного вириона;

причем первая и вторая кассеты экспрессии присутствуют в одной конструкции нуклеиновой кислоты, и при этом первая и вторая кассеты экспрессии, когда они присутствуют в эквимолярном количестве в клетках насекомых, дают отношение уровня мРНК, кодирующей белок Кер, к уровню мРНК, кодирующей капсидный белок, составляющее по меньшей мере 0,5, которое определяют с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией во временной точке в интервале от 24 до 72 чпосле трансфекции.

Изобретение также относится к конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей первую и вторую кассеты экспрессии, которые определены выше, при этом (a) первым промотором является промотор р10, а вторым промотором является промотор ΡοΙΗ или 4хН§р27 ЕсКЕ+минимальный промотор №р70;

(b) первым промотором является 4хН§р27 ЕсКЕ+минимальный промотор Н§р70, а вторым промотором является промотор ΡοΙΗ;

(c) первым промотором является промотор ΡοΙΗ, а вторым промотором является промотор р10, йе11аЕ1 или Е1;

(ά) первым промотором является промотор ΡοΙΗ, а вторым промотором является промотор 0еНаЕ1 или Е1;

(е) первым промотором является промотор р10, а вторым промотором является промотор Не11а.Е1 или промотор Е1; или (£) первым промотором является промотор ΡοΙΗ, а вторым промотором является промотор ΡοΙΗ, и при этом первая кассета экспрессии необязательно содержит энхансерный элемент; клетке насекомого, которая определена выше; и набору, содержащему (a) конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую первую и вторую кассеты экспрессии, которые определены выше; и (b) конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую сайт множественного клонирования для трансгена, который фланкирован по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью инвертированного концевого повтора парвовируса, и такой трансген функционально связан с промотором, способным управлять экспрессией трансгена в клеткехозяине.

- 2 020969

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показано схематичное представление конструирования ρνΌ118(ηο\ν).

На фиг. 2 показано схематичное представление конструирования ρνΌ118(ηο№)+ΗΚ1.

На фиг. 3 показано схематичное представление конструирования ρνΌ165.

На фиг. 4 показано схематичное представление конструирования ρν0165+ΗΚ1.

На фиг. 5 показано схематичное представление конструирования ρν0165 + 4хЕсКЕ1 САР.

На фиг. 6 показано схематичное представление конструирования ρν0165 + 4хЕсКЕ Κορ78.

На фиг. 7 показано схематичное представление конструирования ρΥΟ165 + беИа1Е1 САР.

На фиг. 8 показано схематичное представление конструирования йе11а1Е1 Саρ + ρΡοΙΗ Κορ (ρνΌ190).

На фиг. 9 показано схематичное представление конструирования ρ10Саρ + ρΡοΙΗ Κορ.

На фиг. 10 показано схематичное представление конструирования ρν0194.

На фиг. 11А показан Вестерн-блот-анализ белков Сар и Κορ, экспрессированных с Вас.УЭ194. через три дня после инфекции с использованием соотношений бакуловирусов 1:1 и 5:1 (С=Вас.УО88:Вас.УО84:Вас.УЭ43 5:1:1, соответственно). На фиг. 11В показаны титры вирусов в случае тех же самых получений, которые проанализированы на фиг. 11А.

Описание изобретения

Определения

В используемом в настоящем описании смысле термин функционально связан относится к связыванию полинуклеотидных (или полипептидных) элементов с возникновением в результате функциональной взаимосвязи. Нуклеиновая кислота функционально связана, когда она помещена в функциональной взаимосвязи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, последовательность регуляции транскрипции функционально связана с кодирующей последовательностью, если она влияет на транскрипцию кодирующей последовательность. Функционально связаны означает, что связанные последовательности ДНК обычно являются смежными последовательностями, и, в том случае, когда необходимо связать две области, кодирующие белки, являются смежными и находятся в рамке считывания.

Последовательность регуляции экспрессии относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая регулирует экспрессию нуклеотидной последовательности, с которой она функционально связана.

Последовательность регуляции экспрессии функционально связана с нуклеотидной последовательностью, когда последовательность регуляции экспрессии контролирует и регулирует транскрипцию и/или трансляцию нуклеотидной последовательности. Таким образом, последовательность регуляции экспрессии может включать промоторы, энхансеры, участки внутренней посадки рибосомы (1РЕ§), терминаторы транскрипции, стартовый кодон перед геном, кодирующим белок, сигнал сплайсинга интронов и стоп-кодоны. Подразумевается, что термин последовательности регуляции экспрессии включает как минимум последовательность, присутствие которой в конструкции влияет на экспрессию, а также может включать дополнительные предпочтительные компоненты. Например, лидерные последовательности и последовательности партнеров при слиянии являются последовательностями регуляции экспрессии. Термин также может включать конструирование последовательности нуклеиновой кислоты так, чтобы нежелательные потенциальные кодоны инициации в рамке и вне рамки были удалены из последовательности. Термин также может включать конструирование последовательности нуклеиновой кислоты так, чтобы нежелательные потенциальные сайты сплайсинга были удалены. Термин включает последовательности или последовательности полиаденилирования (рА), которые управляют добавлением поли-Ахвоста, т.е. цепочки из остатков аденина, на З'-конце мРНК, такие последовательности называют поли-Апоследовательностями. Также может быть сконструирована последовательность регуляции экспрессии для повышения стабильности мРНК. Последовательности регуляции экспрессии, которые влияют на стабильность транскрипции и трансляции, например, промоторы, а также последовательности, которые влияют на трансляцию, например последовательности Козака, в клетках насекомых известны. Последовательности регуляции экспрессии могут иметь такую природу, что способны модулировать нуклеотидную последовательность, с которой они функционально связаны, так чтобы получить более низкие уровни экспрессии или более высокие уровни экспрессии.

В используемом в настоящем описании смысле термин промотор или последовательность регуляции транскрипции относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который функционирует, регулируя транскрипцию одной или нескольких кодирующих последовательностей, и расположен выше по направлению транскрипции от сайта инициации транскрипции кодирующей последовательности и структурно идентифицируется по наличию сайта связывания для ДНК-зависимой РНК-полимеразы, сайтов инициации транскрипции и любых других последовательностей ДНК, включая без ограничения сайты связывания факторов транскрипции, сайты связывания белка репрессора и белка активатора и любые другие последовательности нуклеотидов, которые, как известно специалисту в данной области, действуют прямо или опосредованно, регулируя количество транскрипции с промотора. Конститутивный промотор представляет собой промотор, который является активным в большинстве тканей в случае большинства физиологических условий и условий, связанных со стадией развития. Индуцируемый промотор пред- 3 020969 ставляет собой промотор, который регулируется физиологическими условиями или в зависимости от стадии развития, например, в результате использования химического индуктора. Тканеспецифичный промотор активен только в конкретных типах тканей или клеток.

Идентичность последовательностей и сходство последовательностей можно определить посредством выравнивания двух пептидных или двух нуклеотидных последовательностей, используя алгоритмы глобального или локального выравнивания в зависимости от длины двух последовательностей.

Последовательности сходной длины предпочтительно выравнивают, используя алгоритмы глобального выравнивания (например, алгоритм Нидлмана-Вунша), которые оптимально выравнивают последовательности по всей длине, тогда как последовательности с существенно различающейся длиной предпочтительно выравнивают, используя алгоритм локального выравнивания (например, алгоритм СмитаВатермана). Затем последовательности могут быть названы по существу, идентичными или по существу, сходными, когда они (при оптимальном выравнивании с использованием, например, программ САР или ΒΕ8ΤΡΊΤ с параметрами по умолчанию) имеют, по меньшей мере, некоторую минимальную идентичность последовательностей в процентах (которая определена ниже). В программе САР используется алгоритм глобального выравнивания Нидлмана и Вунша для выравнивания двух последовательностей по всей длине (полной длине), максимизирующий количество совпадений и минимизирующий количество пробелов. Глобальное выравнивание соответственно используют для определения идентичности последовательностей, когда две последовательности имеют сходные длины. В общем, используют параметры САР по умолчанию, при этом штраф за пропуск = 50 (нуклеотиды)/8 (белки) и штраф за удлинение пропуска = 3 (нуклеотиды)/2 (белки). В случае нуклеотидов используемой по умолчанию матрицей является матрица игедарбпа, и в случае белков используемой по умолчанию матрицей является матрица В1о8ит62 (Нешко££ апб Нешко1Т 1992, ΡΝΑ8 89, 915-919). Выравнивание последовательностей и оценка идентичности последовательностей в процентах могут быть осуществлены с использованием компьютерных программ, таких как пакет программ ССС ^ίδοοηδίη, версия 10.3, доступный из Ассе1гу§ 1пс., 9685 8сгап1оп Коаб, 8ап И1едо, СА 92121-3752 И8А, или с использованием компьютерной программы из открытого источника, такой как программа пееб1е (использующая глобальный алгоритм Нидлмана-Вунша) или программа \\а1ег (использующая локальный алгоритм Смита-Ватермана) в ЕтЬо88\νΐΝ. версия 2.10.0, с использованием таких же параметров, как параметры, указанные для САР выше, или с использованием установок по умолчанию (как для пееб1е, так и для та1ег, и как выравнивания и белков, и ДНК, штраф за открытие пропуска по умолчанию равен 10,0, и штраф за удлинение пропуска по умолчанию равен 0,5; матрицами подсчета по умолчанию являются В1о88ит62 для белков и ΌΝΛΡΪιΙΙ для ДНК). Когда последовательности имеют, по существу, разные общие длины, предпочтительны локальные выравнивания, такие как выравнивания с использованием алгоритма Смита-Ватермана. Альтернативно, сходство или идентичность в процентах можно определить в результате поиска в общедоступных базах данных использованием таких алгоритмов, как РА8ТА, ВЬА8Т и т.д.

Нуклеотидные последовательности, кодирующие парвовирусные белки Сар и/или Кер согласно изобретению, также могут быть определены по их способности гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 20, 22, 24 и 1-4, соответственно, в умеренных или предпочтительно в жестких условиях гибридизации.

Условия жесткости гибридизации в настоящем описании определяют как условия, которые позволяют последовательности нуклеиновой кислоты длиной по меньшей мере около 25, предпочтительно около 50 нуклеотидов, 75 или 100 и более предпочтительно около 200 или более нуклеотидов гибридизоваться при температуре, составляющей примерно 65°С, в растворе, содержащем примерно 1 М соль, предпочтительно в 6 х 88С или любом другом растворе, имеющем сравнимую ионную силу, и промывку при 65°С в растворе, содержащем примерно 0,1 М соль или соль в меньшей концентрации, предпочтительно в 0,2 х 88С или любом другом растворе, имеющем сравнимую ионную силу. Предпочтительно гибридизацию осуществляют в течение ночи, т.е. по меньшей мере в течение 10 ч, и предпочтительно промывку осуществляют в течение по меньшей мере 1 ч, используя по меньшей мере две замены раствора для промывки. Такие условия, как правило, обеспечивают возможность специфичной гибридизации последовательностей, имеющих примерно 90% или большую идентичность последовательностей.

Умеренные условия в данном случае определяют как условия, которые позволяют последовательностям нуклеиновых кислот длиной по меньшей мере 50 нуклеотидов, предпочтительно примерно 200 или более нуклеотидов гибридизоваться при температуре около 45°С в растворе, содержащем примерно 1 М соль, предпочтительно в 6 х 88С или любом другом растворе, имеющем сравнимую ионную силу, и промывку при комнатной температуре в растворе, содержащем примерно 1 М соль, предпочтительно в 6 х 88С или любом другом растворе, имеющем сравнимую ионную силу. Предпочтительно гибридизацию осуществляют в течение ночи, т.е. в течение по меньшей мере 10 ч, и предпочтительно промывку осуществляют в течение по меньшей мере 1 ч, используя по меньшей мере две замены раствора для промывки. Такие условия, как правило, обеспечивают возможность специфичной гибридизации последовательностей, имеющих идентичность последовательностей до 50%. Специалист в данной области сможет модифицировать такие условия гибридизации, чтобы специфично идентифицировать последовательности,

- 4 020969 идентичность которых варьирует в диапазоне 50-90%.

Вектор представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты (обычно ДНК или РНК), которая служит для переноса последовательности нуклеиновой кислоты-пассажира (т.е. ДНК или РНК) в клеткухозяина. Три общих типа векторов включают плазмиды, фаги и вирусы. Предпочтительно вектор является вирусом. Векторы, которые содержат и промотор, и сайт клонирования, в котором полинуклеотид может быть функционально связан, хорошо известны в данной области. Такие векторы способны к транскрипции РНК ίη νίΐτο или ίη νίνο и являются коммерчески доступными из таких источников, как §1та1адепе (Ьа ίο11;·ι, СайГ.) и Рготеда Вю1есй (МабПоп. ^ίκ.). Чтобы оптимизировать экспрессию и/или транскрипцию ίη νίίτο, может быть необходимым удаление, добавление или изменение 5/- и/или 3'нетранслируемых частей клонов, чтобы исключить дополнительные, потенциально неподходящие альтернативные кодоны инициации трансляции или другие последовательности, которые могут мешать или снижать экспрессию либо на уровне транскрипции, либо на уровне трансляции. Альтернативно, консенсусные сайты связывания с рибосомой могут быть встроены непосредственно с 5'-стороны от стартового кодона, чтобы усилить экспрессию.

Вирусный вектор относится к вектору, содержащему некоторые или все следующие компоненты: вирусные гены, кодирующие генный продукт, регуляторные последовательности и последовательности для упаковки вирусов.

Парвовирусный вектор определяют как рекомбинантно полученный парвовирус или парвовирусную частицу, которая содержит полинуклеотид, который необходимо доставить в клетку-хозяина, либо ίη νίνο, либо ех νίνο, либо ίη νίίτο. Примерами парвовирусных векторов являются, например, аденоассоциированные вирусные векторы. В настоящем описании конструкция парвовирусного вектора относится к полинуклеотиду, содержащему вирусный геном или его часть и трансген.

Адаптация нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент, к использованию кодонов клетки-хозяина может быть выражена в виде индекса адаптации кодонов (СА1). Индекс адаптации кодонов в данном случае определяют как меру относительной адаптации использования кодонов гена по отношению к использованию кодонов высокоэкспрессируемых генов в конкретной клетке или организмехозяине. Относительная адаптация (ет) каждого кодона представляет собой отношение использования каждого кодона к использованию наиболее широко встречаемого кодона для той же самой аминокислоты. Индекс СА1 определяют как геометрическое среднее таких значений относительной адаптации. Исключаются несинонимические кодоны и кодоны терминации (зависимые от генетического кодона). Диапазон значений СА1 составляет от 0 до 1, при этом более высокие значения свидетельствуют о более высокой доле широко используемых кодонов (см. §Ьатр аиб Ы, 1987, Ыискю Ашбк КекеагсЬ 11: 1281-1295; также см.: Тшксп е1 а1., 2003, Ыискю Лабак Ке8. 31 (8): 2242-51).

Термин репортер (или репортерный ген или белок) главным образом используют по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей видимые маркерные белки, такие как зеленый флуоресцирующий белок (СРР), еОРР, другие флуоресцирующие белки, люцифераза, секретируемая щелочная фосфатаза (8ЕАР), ОИ8 и тому подобные, а также маркеры ηρίΙΙ и тому подобные.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к применению парвовирусов, в частности депендовирусов, таких как инфекционный ААУ человека или обезьяны, и их компонентов (например, парвовирусного генома), для использования в качестве векторов для введения и/или экспрессии нуклеиновых кислот в клетках млекопитающих, предпочтительно клетках человека. В частности, изобретение относится к повышению продуктивности таких парвовирусных векторов в случае продуцирования в клетках насекомых.

Продуктивность в таком контексте охватывает повышение продуцируемых титров и улучшение качества полученного продукта, например, получение продукта, который имеет улучшенное соотношение суммарные/заполненные (мера количества частиц, которые содержат нуклеиновую кислоту). То есть конечный продукт может иметь повышенную долю заполненных частиц, при этом термин заполненная подразумевает, что частица содержит нуклеиновую кислоту.

Вирусы семейства Ρ;·ΐΓ\Όνίπ6;·κ представляют собой небольшие ДНК-вирусы. Семейство Ρητνονίτίбае можно разделить на два подсемейства: Ρ;·ΐΓνονίπη;·^, которые инфицируют позвоночных, и ^еη5ον^^^нае, которые инфицируют беспозвоночных, включая насекомых. Представители подсемейства Ρ;·ΐΓνονίπнае в настоящем описании называют парвовирусами, и они включают род депендовирусов. Как можно определить, исходя из названия такого рода, представители депендовирусов уникальны в том, что обычно они требуют совместной инфекции с хелперным вирусом, таким как аденовирус или вирус герпеса для продуктивной инфекции в культуре клеток. Род депендовирусов включает ААУ, который обычно инфицирует человека (например, серотипы 1, 2, 3А, 3В, 4, 5 и 6) или приматов (например, серотипы 1 и 4), и родственные вирусы, которые инфицируют других теплокровных животных (например, аденоассоциированные вирусы коров, собак, лошадей и овец). Дополнительная информация о парвовирусах и других представителях Рапоутбае описана (см. Ксппс1й I. Ветк Ρа^νον^^^бае: ТЬе УШкек аиб ТЬеи КерЬсаίίοη, глава 69 в Р1е1бк УтоЦду (3б Еб. 1996)). Для удобства настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано и описано в настоящем описании со ссылкой на ААУ. Однако следует понимать, что изобретение не ограничено ААУ, и в равной мере может быть применено к другим парвовирусам.

- 5 020969

Геномная организация всех известных серотипов АЛУ очень сходна. Геном ААУ представляет собой линейную однонитевую молекулу ДНК, которая имеет длину меньше чем примерно 5000 нуклеотидов. Инвертированные концевые повторы (1ТК) фланкируют уникальные кодирующие нуклеотидные последовательности для неструктурных белков репликации (Кер) и структурных белков (УР). Белки УР (УР1, -2 и -3) образуют капсид. Концевые 145 нуклеотидов являются самокомплементарными и организованы таким образом, что может быть образован энергетически стабильный внутримолекулярный дуплекс, образующий Т-образную шпильку. Такие структуры в виде шпилек функционируют в качестве начала репликации вирусной ДНК, служат в качестве праймеров для клеточного комплекса ДНКполимеразного комплекса. После инфекции \\1ЛЛУ в клетки млекопитающих гены Кер (т.е. Кер78 и Кер52) экспрессируются с промотора Р5 и промотора Р19, соответственно, и оба белка Кер выполняют функцию в репликации вирусного генома. Событие сплайсинга в ОКР Кер фактически приводит к экспрессии четырех белков Кер (т.е. Кер78, Кер68, Кер52 и Кер40).

Однако было показано, что не подвергнутые сплайсингу мРНК, кодирующие белки Кер78 и Кер52, в клетках млекопитающих достаточны для продуцирования вектора ААУ. Также в клетках насекомых белки Кер78 и Кер52 достаточны для продуцирования вектора ААУ.

Рекомбинантный парвовирусный вектор или ААУ-вектор (или вектор гААУ) в настоящем описании относится к вектору, содержащему одну или несколько представляющих интерес полинуклеотидных последовательностей, представляющих интерес генов или трансгенов, которые фланкированы по меньшей мере одной последовательностью инвертированного концевого повтора (1ТК) парвовируса или ААУ. Предпочтительно трансген (трансгены) фланкирован/фланкированы 1ТК, по одному с каждой стороны трансгена (трансгенов). Такие векторы гААУ могут быть реплицированы и упакованы в инфекционные вирусные частицы в клетке-хозяине насекомого, которая экспрессирует продукты генов гер и сар ААУ (т.е. белки Кер и Сар ААУ). Когда вектор гААУ включен в более крупную конструкцию нуклеиновой кислоты (например, в хромосому или в другой вектор, такой как плазмида или бакуловирус, используемый для клонирования или трансфекции), такой вектор гААУ обычно называют провектором, который может быть спасен в результате репликации и капсидирования при наличии функций упаковки ААУ и необходимых хелперных функций.

Изобретение относится к способу получения рекомбинантного парвовирусного (гААУ) вириона, содержащего рекомбинантный парвовирусный (гААУ) вектор, в клетке насекомого.

В первом аспекте изобретение относится к способу получения рекомбинантного парвовирусного вириона, включающему стадии (а) получения клетки насекомого, содержащей одну или несколько конструкций нуклеиновых кислот, содержащих (ί) нуклеотидную последовательность, содержащую трансген, который фланкирован по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью парвовирусного инвертированного концевого повтора; (ίί) первую кассету экспрессии, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Кер парвовируса, которая функционально связана с первым промотором, который способен управлять экспрессией белка Кер в клетках насекомых; (ίίί) вторую кассету экспрессии, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую капсидный белок парвовируса, которая функционально связана со вторым промотором, который способен управлять экспрессией капсидного белка в клетках насекомых; (Ь) культивирования клетки, определенной в пункте (а), в условиях, подходящих для экспрессии Кер и капсидного белка; и (с) необязательно извлечения рекомбинантного парвовирусного вириона.

Предпочтительно в клетке насекомого первая и вторая кассеты экспрессии присутствуют в одной конструкции нуклеиновой кислоты.

Предпочтительно первая и вторая кассеты экспрессии в том случае, когда они присутствуют в эквимолярном количестве в клетке насекомого, обеспечивают отношение уровня мРНК, кодирующей белок Кер, к уровню мРНК, кодирующей капсидный белок, составляющее по меньшей мере примерно 0,5, по меньшей мере примерно 0,75, по меньшей мере примерно 1,0, по меньшей мере примерно 1,5, по меньшей мере примерно 2,0, по меньшей мере примерно 5,0 или по меньшей мере примерно 10,0. Уровни мРНК, кодирующих Кер и капсид, предпочтительно определяют с использованием количественной ПЦР с обратной транскрипцией, Нозерн-блота или других способов количественной оценки РНК, известных в данной области.

Предпочтительно такое соотношение уровней мРНК, кодирующих Кер и капсид, продуцируется в клетках насекомых во временной точке от 24, 30, 36, 40, 44 или 46 ч после трансфекции до 72, 66, 60, 54, 52 или 50 ч после трансфекции. Более предпочтительно такое соотношение уровней мРНК, кодирующих Кер и капсид, продуцируется в клетках насекомых по меньшей мере примерно через 48 ч плюс/мин 2 или 1 ч после трансфекции.

Альтернативно предпочтительно первая и вторая кассеты экспрессии в том случае, когда они присутствуют в эквимолярных количествах в клетке насекомого, обеспечивают отношение уровня белка Кер к уровню капсидного белка, составляющеепо меньшей мере примерно 0,5, по меньшей мере примерно 0,75, по меньшей мере примерно 1,0, по меньшей мере примерно 1,5, по меньшей мере примерно 2,0, по меньшей мере примерно 5,0 или по меньшей мере примерно 10,0. Уровни белка Кер и капсидного белка предпочтительно определяют с использованием эталонных антител против белка Кер и капсидного белка

- 6 020969 в количественном иммуноанализе (например, ЕЬ18А или количественный Вестерн-блот). Предпочтительно такое соотношение уровней Кер и капсидного белка продуцируется в клетках насекомых во временной точке от 24, 30, 36, 40, 44 или 46 ч после трансфекции до 72, 66, 60, 54, 52 или 50 ч после трансфекции. Более предпочтительно такое соотношение уровней белка Кер и капсидного белка продуцируется в клетках насекомых через 48 ч плюс/минус 2 или 1 ч после трансфекции. Подходящими эталонными антителами для количественной оценки уровней белка Кер и капсидного белка АЛУ являются, например, анти-ААУ-гер моноклональные антитела мыши, клон 303.9, или анти-ААУ УР1/УР2/УР3 моноклональные антитела мыши, клон В1, который можно получить из ΡΚΟΟΕΝ В|о1ееНп|к ОтЬН.

В способе согласно изобретению первая и вторая кассеты экспрессии присутствуют в одной конструкции нуклеиновой кислоты. Одно из преимуществ присутствия обеих кассет экспрессии в одной конструкции нуклеиновой кислоты заключается в том, что трансфицированные клетки насекомых будут экспрессировать оба белка, белок Кер и капсидный белок. Только экспрессия обоих белков, белка Кер и капсидного белка, в клетке насекомого будет приводить к образованию парвовирусных вирионов. Другое преимущество заключается в том, что можно регулировать минимальное требуемое соотношение экспрессии белка Кер и экспрессии капсидного белка в том случае, когда первая и вторая кассеты экспрессии находятся в одной конструкции.

Один из вариантов осуществления изобретения состоит в том, что другая конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Кер, также может присутствовать в клетке.

В способе согласно изобретению нуклеотидная последовательность первой кассеты экспрессии по п. (ίί) предпочтительно может содержать только одну открытую рамку считывания, включающую нуклеотидные последовательности, кодирующиепо меньшей мере один из белков Кер78 и Кер 68. То есть белок или белки Кер будут кодироваться одной открытой рамкой считывания, а не двумя или более открытыми рамками считывания. Иначе говоря, первая кассета экспрессии, как правило, не будет иметь двух или более отдельных открытых рамок считывания, кодирующих один и тот же или разные белки Кер. Однако, во избежание сомнений, одна открытая рамка считывания может быть способна кодировать более одного белка, например, два, три или четыре белка.

Все сказанное выше может быть в равной мере применимо к белкам УР1, УР2 и УР3, т.е. два или все такие белки могут легко кодироваться одной открытой рамкой считывания.

Обычно в способе согласно изобретению по меньшей мере одна открытая рамка считывания, содержащая нуклеотидные последовательности, кодирующие капсидные белки УР1, УР2 и УР3, или по меньшей мере одна открытая рамка считывания, содержащая нуклеотидные последовательности, кодирующие по меньшей мере один из белков Кер78 и Кер68, не содержит искусственного интрона (или последовательности, полученной из искусственного интрона). То есть, по меньшей мере, открытые рамки считывания, используемые для кодирования белков Кер или УР, не будут содержать искусственный интрон. Под искусственным интроном подразумевают интрон, который не может встречаться в природе в последовательностях Кер или Сар аденоассоциированных вирусов, например, интрон, который был сконструирован для того, чтобы обеспечить функциональный сплайсинг в клетке насекомого. Следовательно, искусственный интрон в данном контексте охватывает интроны клетки насекомого дикого типа. Кассета экспрессии согласно изобретению может содержать нативную укороченную последовательность интрона (под нативной подразумевают последовательность, встречающуюся в природе у аденоассоциированного вируса), подразумевают, что такие последовательности не подпадают под определение значения искусственного интрона, которое приведено в настоящем описании.

В изобретении одним из возможных вариантов является вариант, когда ни открытая рамка считывания, содержащая нуклеотидные последовательности, кодирующие капсидные белки УР1, УР2 и УР3, и/или ни открытая рамка считывания, содержащая нуклеотидные последовательности, кодирующие по меньшей мере один из белков Кер78 и Кер68, не содержат искусственного интрона.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность, содержащая трансген, также находится в той же самой конструкции нуклеиновой кислоты, что и первая и вторая кассеты экспрессии. Преимущество такого расположения заключается в том, что все трансфицированные клетки содержат каждую из трех нуклеотидных последовательностей, которые необходимы для получения парвовирусных вирионов.

Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что чем выше соотношение белок Кер/капсидный белок, тем выше соотношение заполненный вирион/пустой вирион. Термин заполненный вирион относится к вирионной частице, которая содержит парвовирусный вектор. Термин пустой вирион относится к вирионной частице, которая не содержит парвовирусный вектор. В предпочтительном варианте осуществления изобретения отношение количества заполненных вирионов к пустым вирионам составляет по меньшей мере 1:100, более предпочтительно по меньшей мере 1:10 и еще более предпочтительно по меньшей мере 1:1. Еще более предпочтительно пустые вирионы не могут быть выявлены, и наиболее предпочтительно пустые вирионы отсутствуют. Специалисту в данной области будет понятно, как определить отношение заполненных вирионов к пустым вирионам, например, путем деления количества копий гена на (суммарное количество копий капсида - количество геномный копий), так

- 7 020969 как на вирион будет присутствовать только одна геномная копия. Наоборот, чем выше соотношение белок Кер/капсидный белок, тем меньше соотношение количество пустых вирионов/суммарное количество вирионов (т.е. заполненные + пустые вирионы). Специалисту будет понятно, как определить такие соотношения. Например, соотношение пустые вирионы/суммарные капсиды можно определить путем деления количества геномных копий (т.е. число геномных копий) на суммарное количество парвовирусных частиц (т.е. число парвовирусных частиц), при этом количество геномных копий в мл измеряют с помощью количественной ПЦР, а суммарное количество парвовирусных частиц в мл измеряют с использованием ферментного иммуноанализа, например, доступного из Ргодеп. В предпочтительном варианте осуществления изобретения соотношение количество пустых вирионов/суммарное количество вирионов составляет меньше чем 100:1, более предпочтительно меньше чем 10:1, и еще более предпочтительно меньше чем 1:1. Еще более предпочтительно пустые вирионы не могут быть выявлены, и наиболее предпочтительно пустые вирионы отсутствуют.

В предпочтительном варианте отношение экспрессии белка Кер к экспрессии капсидного белка регулируется одним или несколькими из следующего: (а) первый промотор имеет такую же силу или является более сильным, чем второй промотор, что определяют по экспрессии репортерного гена (например, люциферазы или §ЕАР) или с использованием Нозерн-блота; (Ь) присутствие большего количества и/или более сильных энхансерных элементов в первой кассете экспрессии по сравнению со второй кассетой экспрессии; (с) нуклеотидная последовательность, кодирующая парвовирусный белок Кер, имеет более высокий индекс адаптации кодонов по сравнению с нуклеотидной последовательностью, кодирующей капсидный белок; (Д) оптимизация температуры парвовирусного белка Кер; и/или (е) варианты белков Кер с одним или несколькими изменениями в аминокислотной последовательности по сравнению с соответствующим белком Кер дикого типа, и при этом одно или несколько изменений аминокислот приводит к повышению активности функции Кер, которое оценивают с помощью выявления повышенной продукции ААУ в клетках насекомых. Способы создания, селекции и/или скрининга вариантов белков Кер с повышенной активностью функции Кер, которую оценивают с помощью выявления повышенной продукции ААУ в клетках насекомых, могут быть разработаны посредством адаптации к клеткам насекомых способов, описанных в И8 20030134351 для получения вариантов белков Кер с повышенной функцией, имеющих отношение к продукции ААУ в клетках млекопитающих. В настоящем описании подразумевается, что варианты белков Кер с одним или несколькими изменениями в аминокислотной последовательности по сравнению с соответствующим белком Кер дикого типа включают белки Кер с одной или несколькими аминокислотными заменами, инсерциями и/или делециями в аминокислотной последовательности варианта по сравнению с аминокислотной последовательностью соответствующего белка Кер дикого типа.

Первый промотор, который имеет такую же силу или является более сильным, чем второй промотор, означает, что в случае большего количества нуклеотидных последовательностей, кодирующих белок Кер, чем нуклеотидных последовательностей, кодирующих капсидный белок, можно использовать промотор такой же силы, так как экспрессия белка Кер затем будет повышена по сравнению с экспрессией капсидного белка, тогда как в случае сходных количеств нуклеотидных последовательностей, кодирующих Кер и кодирующий капсидный белок, можно использовать более сильный промотор для экспрессии белка Кер, чем для экспрессии капсидного белка. Сила промотора может быть определена по экспрессии, которую получают в условиях, которые применяются в способе согласно изобретению. В предпочтительном варианте первый промотор или второй промотор выбран из группы, состоящей из промотора Ро1Н, промотора р10, основного промотора белка, индуцируемого промотора или промотора ДеЙаЕ1 или промотора Е1 или любого другого промотора позднего или очень позднего бакуловирусного гена. Более предпочтительно первый промотор выбран из группы, состоящей из промотора Ро1Н, промотора р10 или основного промотора белка, и при этом вторым промотором является промотор Де11аЕ1 или промотор Е1 или любой другой промотор раннего или позднего бакуловирусного гена. Предпочтительно первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению является промотор р10, а вторым промотором является промотор Ро1Н или 4хН§р27 ЕсКЕ + минимальный промотор Н§р70. В другом варианте первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению является 4хН§р27 ЕсКЕ + минимальный промотор Н§р70, а вторым промотором является промотор Ро1Н. В еще одном варианте первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению является промотор Ро1Н, а вторым промотором является промотор р10, ДеЙаЕ1 или Е1. В еще одном варианте первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению является промотор Ро1Н, а вторым промотором является промотор Де11аЕ1 или Е1. В еще одном варианте первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению является промотор р10, а вторым промотором является промотор ДеЙаЕ1 или Е1. В еще одном варианте первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению является промотор Ро1Н, а вторым промотором является промотор Ро1Н. Наиболее предпочтительно первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению является промотор Ро1Н, а вторым промотором является промотор Де11аЕ1.

Термин энхансерный элемент или энхансер предназначен для определения последовательности, которая усиливает активность промотора (т.е. увеличивает скорость транскрипции последовательности,

- 8 020969 расположенной ниже промотора), которая в противоположность промотору не обладает промоторной активностью и которая обычно может функционировать независимо от положения по отношению к промотору (т.е. выше или ниже промотора). Энхансерные элементы хорошо известны в данной области. Неограничивающими примерами энхансерных элементов (или их частей), которые можно использовать в настоящем изобретении, являются энхансеры и энхансерные элементы бакуловирусов, обнаруженные в клетках насекомых. Предпочтительно энхансерный элемент усиливает в клетке экспрессию мРНК гена, с которым промотор функционально связан по меньшей мере на 25%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 100% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 200% по сравнению с экспрессией мРНК гена в отсутствие энхансерного элемента. Экспрессию мРНК можно определить, например, с использованием количественной ОТ-ПЦР.

В настоящем изобретении предпочтительно использование энхансерного элемента, чтобы усилить экспрессию белка Кер парвовируса. Таким образом, в следующем предпочтительном варианте первая кассета экспрессии содержит по меньшей мере один бакуловирусный энхансерный элемент и/или по меньшей мере один отвечающий на экдизон элемент. Предпочтительно энхансерный элемент выбран из группы, состоящей из Нг1, 1и2. Нг3, Нг4 и Нг5.

Оптимизация кодонов парвовирусного белка Кер более подробно обсуждается ниже.

Оптимизация температуры для парвовирусного белка Кер относится к использованию оптимального условия как по отношению к клетке насекомого, которая будет расти, так и по отношению к функционированию Кер. Белок Кер, например, может быть оптимально активным при 37°С, тогда как клетка насекомого может оптимально расти при 28°С. Температура, при которой активен белок Кер и при которой клетка насекомого растет, может составлять 30°С. В предпочтительном варианте оптимизированная температура составляет более 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35°С и/или менее 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30 или 29°С.

Как будет понятно специалисту в данной области, соотношение заполненный вирион/пустой вирион также может быть улучшено при ослабленной экспрессии Сар, например, с помощью более слабого промотора, по сравнению с умеренной-высокой экспрессией Кер.

Предпочтительно конструкция нуклеиновой кислоты согласно изобретению представляет собой вектор, совместимый с клеткой насекомого. Термин совместимый с клеткой насекомого вектор или вектор относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной к продуктивной трансформации или трансфекции насекомого или клетки насекомого. Примерами биологических векторов являются плазмиды, линейные молекулы нуклеиновых кислот и рекомбинантные вирусы. Можно использовать любой вектор, при условии, что он совместим с клеткой насекомого. Вектор может интегрировать в геном клеток насекомых, но присутствие вектора в клетках насекомых не обязательно является постоянным, и примерами также являются временные эписомные векторы. Векторы могут быть введены любыми известными способами, например, в результате химической обработки клеток, электропорации или инфекции. В предпочтительном варианте вектором является бакуловирус, вирусный вектор или плазмида. В более предпочтительном варианте вектором является бакуловирус, т.е. конструкция нуклеиновой кислоты представляет собой экспрессирующий бакуловирусный вектор. Экспрессирующие бакуловирусные векторы и способы их применения описаны (см., например, в §иттетк апй 8тИЬ, 1986. А Мапиа1 о£ МекНойк £ог Васи1оу|гик Уескогк апй 1пкеск СиНите Ртосейитек, Техак Адг1си11ига1 Ехрет1теп1а1 8какюп Ви11. Νο. 7555, Со11еде §какюп, Тех.; Ьискоте. 1991. 1п Ргокор ек а1., С1ошпд апй Ехртеккюп о£ Некего1одоик Оепек ш 1пкеск Се11к \νίΐΗ Васи1оу1ги8 Уескогк' КесотЫпапк ΌΝΑ ТесНпо1оду апй АррНсайопк, 97-152; Кшд, Ь. А. апй К. Ό. Роккее, 1992, ТНе Ьаси1оу|гик ехртеккюп куккет, СНартап апй На11, ишкей Кшдйот; О'КеШу, Ό. К., Ь. К МШег, У. А. Ьискоте, 1992, Васи1оу|гик Ехртеккюп Уескогк: А ЬаЬотакоту Мапиа1, №ν Уогк; А. Н. Ргеетап апй КюНатйкоп, С. Ό., 1995, Васи1о\агик Ехртеккюп Ргокосо1к, МекНойк ш Мо1еси1аг Вю1оду, уо1ите 39; И8 4745051; И8 2003148506 и АО 03/074714).

Количество конструкций нуклеиновой кислоты, используемых в клетках насекомых для получения рекомбинантного парвовирусного (гААУ) вектора, в изобретении не ограничено. Например, одна, две, три или более отдельных конструкций могут быть использованы для получения гААУ в клетках насекомых согласно способам, предлагаемым в настоящем изобретении. Если используют две конструкции, то одна конструкция может содержать нуклеотидную последовательность, содержащую трансген, который фланкирован по меньшей мере одной последовательностью 1ТК парвовируса, тогда другая конструкция может содержать первую и вторую кассеты экспрессии. Если используют три конструкции, то одна конструкция может содержать нуклеотидную последовательность, содержащую трансген, которая фланкирована по меньшей мере одной последовательностью 1ТК парвовируса, другая конструкция может содержать первую и вторую кассеты экспрессии, и еще одна конструкция может содержать дополнительную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Кер, необязательно оптимизированную по кодонам, АТ-оптимизированную или ОС-оптимизированную, чтобы минимизировать или предотвратить рекомбинацию, как описано далее.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая парвовирусные белки Кер, в настоящем описании означает нуклеотидную последовательность, кодирующую неструктурные белки Кер, которые необходимы и достаточны для получения парвовирусного вектора в клетках насекомых, такие как белки Кер78

- 9 020969 или Кер68 и/или Кер52 или Кер40. Парвовирусную нуклеотидную последовательность предпочтительно получают из депендовируса, более предпочтительно из аденоассоциированного вируса (ААУ) человека или обезьян и наиболее предпочтительно из ААУ, который обычно инфицирует человека (например, серотипов 1, 2, 3А, 3В, 4, 5 и 6) или приматов (например, серотипов 1 и 4). Пример нуклеотидной последовательности, кодирующей парвовирусные белки Кер, приведен в последовательности §Е0 ГО N0: 5, которая изображает часть геномной последовательности ААУ серотипа-2, кодирующей белки Кер. Последовательность, кодирующая Кер78, включает нуклеотиды 11-1876, и последовательность, кодирующая Кер52, включает нуклеотиды 683-1876, также изображенные отдельно в §Е0 ГО N0: 5 и 7. Понятно, что точные молекулярные массы белков Кер78 и Кер52, а также точные положения кодонов инициации трансляции у разных парвовирусов могут отличаться. Однако специалисту в данной области будет понятно, как идентифицировать соответствующее положение в нуклеотидной последовательности других парвовирусов, отличных от ААУ-2.

В предпочтительном варианте первая кассета экспрессии содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность парвовирусного белка Кер52 или 40, и/или нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность парвовирусного белка Кер7 8 или 68. Предпочтительно парвовирусные белки Кер являются белками Кер аденоассоциированного вируса (ААУ).

В предпочтительном варианте изобретение относится к клетке насекомого, которая содержит не более одного типа нуклеотидной последовательности, содержащей одну открытую рамку считывания, кодирующую парвовирусный белок Кер. Предпочтительно одна открытая рамка считывания кодирует один или несколько парвовирусных белков Кер, более предпочтительно открытая рамка считывания кодирует все парвовирусные белки Кер, наиболее предпочтительно открытая рамка считывания кодирует полноразмерный белок Кер78, с которой предпочтительно в клетках насекомых могут быть экспрессированы по меньшей мере два белка Кер52 и Кер78. В данном случае понятно, что клетка насекомого может содержать более одной копии нуклеотидной последовательности одного типа, например, в многокопийном эписомном векторе, но такие копии являются множественными копиями, по существу, одной и той же молекулы нуклеиновой кислоты или, по меньшей мере, молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность Кер, например, молекул нуклеиновых кислот, которые отличаются друг от друга только вследствие вырожденности генетического кода. Наличие только одного типа молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей парвовирусные белки Кер, позволяет избежать рекомбинации между гомологичными последовательностями, которые могут присутствовать в разных типах векторов, содержащих последовательности Кер, что может приводить к появлению дефектных конструкций, экспрессирующих Кер, и влиять на (стабильность) уровни продукции парвовирусов в клетках насекомых.

В альтернативном варианте осуществления изобретения первая кассета экспрессии содержит более одной нуклеотидной последовательности, кодирующей парвовирусный белок Кер. Предпочтительно нуклеотидная последовательность по п. (ίί) содержит открытую рамку считывания, включающую нуклеотидные последовательности, кодирующие по меньшей мере один из белков Кер78 и Кер68. Предпочтительно нуклеотидные последовательности являются последовательности одного и того же серотипа. Более предпочтительно нуклеотидные последовательности отличаются друг от друга тем, что они могут быть либо оптимизированы по кодонам, либо АТ-оптимизированы, либо ОС-оптимизированы, чтобы минимизировать или предотвратить рекомбинацию. Предпочтительно первая кассета экспрессии содержит две нуклеотидных последовательности, кодирующих парвовирусный белок Кер, т.е. первую нуклеотидную последовательность и вторую нуклеотидную последовательность. Предпочтительно различие между первой и второй нуклеотидными последовательностями, кодирующими общие аминокислотные последовательности парвовирусного белка Кер, максимизированы (т.е. идентичность нуклеотидов минимизирована) благодаря одному или несколькими из следующих изменений: а) изменение отклонения от равномерности использования кодонов в первой нуклеотидной последовательности, кодирующей общую аминокислотную последовательность парвовирусного Кер; Ь) изменение отклонения от равномерности использования кодонов во второй нуклеотидной последовательности, кодирующей общую аминокислотную последовательность парвовирусного Кер; с) изменение содержания ОС в первой нуклеотидной последовательности, кодирующей общую аминокислотную последовательность; и б) изменение содержаний ОС во второй нуклеотидной последовательности, кодирующей общую аминокислотную последовательность. Оптимизация кодонов может быть осуществлена на основе использования кодонов клетки насекомого, применяемой в способе согласно изобретению, предпочтительно 8робор1ета Ггидрегба, информацию о котором можно найти в базе использования кодонов (см., например, 1и1р://\у\у\у.ка/и5а.ог.)р/собоп/). Подходящие компьютерные программы для оптимизации кодонов доступны специалисту (см., например, Нуага) е! а1., 2005, №с1. Аабк Кек. 33(9): 3011-3016; и в Интернете). Альтернативно, оптимизации можно осуществлять вручную, используя такую же базу данных использования кодонов.

Нуклеотидная последовательность первой кассеты экспрессии, кодирующая парвовирусный белок Кер52, может быть определена как нуклеотидная последовательность

- 10 020969

a) которая кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 88, 89, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью 5>ЕС ГО N0: 6;

b) которая имеет по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 81, 82, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с любой из нуклеотидных последовательностей 5>ЕС ГО N0: 1-5;

c) комплементарная нить которой гибридизуется с последовательностью молекулы нуклеиновой кислоты по п. (а) или (Ь);

б) нуклеотидные последовательности, последовательность которых отличается от последовательности молекулы нуклеиновой кислоты по п. (с) вследствие вырожденности генетического кода.

Нуклеотидная последовательность первой кассеты экспрессии, кодирующей парвовирусный белок Кер78, может быть определена как нуклеотидная последовательность

a) которая кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 88, 89, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью 5>ЕС ГО N0: 8;

b) которая имеет по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 81, 82, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью в положениях 11-1876 последовательности 5>ЕС ГО N0:7;

c) комплементарная нить которой гибридизуется с последовательностью молекулы нуклеиновой кислоты по п. (а) или (Ь);

б) нуклеотидные последовательности, последовательности которых отличаются от последовательности молекулы нуклеиновой кислоты по п. (с) вследствие вырожденности генетического кода.

Предпочтительно нуклеотидная последовательность кодирует парвовирусные белки Кер, которые необходимы и достаточны для продукции парвовирусного вектора в клетках насекомых.

Исключение возможных ложных сайтов инициации трансляции в последовательностях, кодирующих белки Кер, отличных от сайтов инициации трансляции Кер78 и Кер52, других парвовирусов будет понятно специалисту в данной области, также как исключение предполагаемых сайтов сплайсинга, которые могут распознаваться в клетках насекомых.

В предпочтительном варианте кодон инициации трансляции парвовирусного белка Кер78 представляет собой субоптимальный кодон инициации. Субоптимальный кодон инициации предпочтительно представляет собой кодон инициации, который влияет на частичное перепрыгивание экзонов. В настоящем описании подразумевают, что частичное перепрыгивание экзонов означает, что по меньшей мере часть рибосом не инициирует трансляцию в субоптимальном кодоне инициации белка Кер78, но будет инициировать трансляцию в кодоне инициации дальше ниже по течению, при этом предпочтительно кодон инициации, расположенный дальше ниже по течению, представляет собой кодон инициации белка Кер52. Субоптимальный кодон инициации предпочтительно вызывает частичное перепрыгивание экзона при экспрессии нуклеотидной последовательности в клетке насекомого. Предпочтительно субоптимальный кодон инициации вызывает частичное перепрыгивание экзона в клетке насекомого так, что приводит к получению в клетках насекомых молярного отношения Кер78 к Кер52 в диапазоне от 1:10 до 10:1, от 1:5 до 5:1 или от 1:3 до 3:1, предпочтительно примерно через 20-40 ч после инфекции, более предпочтительно примерно через 30-40 ч после инфекции, при использовании бакуловирусной экспрессии. Молярное соотношение Кер78 и Кер52 можно определить с помощью Вестерн-блоттинга, предпочтительно используя моноклональное антитело, которое узнает общий эпитоп Кер78 и Кер52, или используя, например, мышиное анти-Кер-антитело (303.9, Ргодеп, Оеттапу; в разведении 1:50).

Термин субоптимальный кодон инициации в настоящем описании относится не только к трехнуклеотидному кодону инициации как таковому, но также к его контексту. Следовательно, субоптимальный кодон инициации может состоять из оптимального кодона АТО в субоптимальном контексте, например, в контексте, отличном от контекста согласно Козаку. Однако более предпочтительными являются субоптимальные кодоны инициации, в которых трехнуклеотидный кодон инициации сам по себе является субоптимальным, т.е. не является кодоном АТО. В настоящем описании подразумевают, что субоптимальный означает, что кодон является менее эффективным в инициации трансляции в случае во всем остальном идентичного контекста по сравнению с нормальным кодоном АТО. Предпочтительно эффективность субоптимального кодона составляет менее 90, 80, 60, 40 или 20% от эффективности нормального кодона АТО в случае во всем остальном идентичного контекста. Способы сравнения относительной эффективности инициации трансляции известны специалисту. Предпочтительные субоптимальные кодоны инициации могут быть выбраны из АСО, ТТО, СТО и ОТО. Более предпочтительным является АСО. Нуклеотидную последовательность, кодирующую парвовирусные белки Кер, в настоящем описании понимают как нуклеотидную последовательность, кодирующую неструктурные белки Кер, которые необходимы и достаточны для продукции парвовирусного вектора в клетках насекомых, например белки Кер78 и Кер52.

Также возможна замена других АТО в последовательности с другим кодоном, кодирующим метионин так, чтобы уменьшить вероятность инициации трансляции с таких АТО.

Различные модификации кодирующей нуклеотидной последовательности, которая определена вы- 11 020969 ше, включая, например, парвовирусные последовательности дикого типа, для правильной экспрессии в клетках насекомых осуществляют, применяя хорошо известные методики генетического конструирования, такие как методики, описанные, например, в ЗатЬгсюк апй Ки88е11 (2001) (ΜοΚαιΕίΓ Ο1οηίη§: А ЬаЬο^аΐο^у Мапиа1 (3^Γά еййюп), ί’οΐά §ргшд ΗηιΤογ ^аЬο^аΐο^у, ί’οΐά §ргшд ΗηιΤογ ^аЬο^аΐο^у ΡϊΌδδ. Ыете ΥοιΊ<). Другие различные модификации кодирующих областей, которые могут увеличивать выход кодируемых белков, известны специалисту в данной области. Такие модификации входят в объем настоящего изобретения.

В настоящем описании подразумевается, что нуклеотидная последовательность, кодирующая парвовирусный капсидный (Сар) белок, содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие один или несколько из трех парвовирусных капсидных белков, νΡ1, -2 и -3. Парвовирусная нуклеотидная последовательность предпочтительно получена из депендовируса, более предпочтительно из аденоассоциированного вируса (ΑΑν) человека или обезьяны (ΑΑν) и наиболее предпочтительно из ΑΑν, который обычно инфицирует людей (например, серотипы 1, 2, 3А, 3В, 4, 5 и 6) или приматов (например, серотипы 1 и 4). Примеры нуклеотидной последовательности, кодирующей парвовирусные капсидные белки, приведены в §ЕЦ ГО N0: 20, 22 и 24.

В предпочтительном варианте нуклеотидная последовательность по п. (ίίί) содержит открытую рамку считывания, включающую нуклеотидные последовательности, кодирующие капсидные белки νΡ1, νΡ2 и νΡ3. Последовательности, кодирующие капсидные белки, могут присутствовать в различных формах. Например, можно использовать отдельные кодирующие последовательности для каждого из капсидных белков ΥΡ1, -2 и -3, при этом каждая кодирующая последовательность функционально связана с последовательностями регуляции экспрессии для экспрессии в клетке насекомого. Однако более предпочтительно вторая кассета экспрессии содержит нуклеотидную последовательность, включающую одну открытую рамку считывания, кодирующую все три капсидных белка парвовируса (ΑΑν): ΥΡ1, νΡ2 и νΡ3, при этом кодон инициации для трансляции капсидного белка ΥΡ1 представляет собой субоптимальный кодон инициации, который не является кодоном ΑΤΟ, который, например, описан в ИгаЬе е1 а1. (2002, выше) и в \У0 2007/046703. Субоптимальным кодоном инициации для капсидного белка ΥΡ1 может быть кодон, который определен выше для белка Кер78. Более предпочтительные субоптимальные кодоны инициации для капсидного белка νΡ1 могут быть выбраны из ΑΟΟ, ΤΤΟ, СТО и ΟΤΟ, из которых СТО и ΟΤΟ являются наиболее предпочтительными. Нуклеотидная последовательность, входящая в состав второй кассеты экспрессии, для экспрессии капсидных белков, может дополнительно содержать одну или несколько модификаций, которые описаны в \У0 2007/046703. Специалисту в данной области известны различные дополнительные модификации кодирующих областей νΡ, которые могут либо увеличивать выход νΡ и вириона или вызывают другие требуемые эффекты, такие как измененный тропизм или сниженная антигенность вириона. Такие модификации входят в объем настоящего изобретения.

В предпочтительном варианте экспрессия ΥΡ1 увеличена по сравнению с экспрессией ΥΡ2 и ΥΡ3. Экспрессия ΥΡ1 может быть увеличена за счет пополнения ΥΡ1 посредством введения в клетку насекомого одного вектора, содержащего нуклеотидные последовательности для ΥΡ1, как описано в \У0 2007/084773.

В контексте изобретения подразумевают, что по меньшей мере одна нуклеотидная последовательность инвертированного концевого повтора парвовируса означает палиндромную последовательность, содержащую в основном комплементарные, симметрично расположенные последовательности, также называемые областями А, В и С. ΙΤΒ функционирует в качестве начала репликации, сайта, играющего цис-роль в репликации, т.е. сайта узнавания для транс-действующих белков репликации, таких как, например, Кер78 (или Кер68), которые узнают палиндром и специфичные последовательности, являющиеся внутренними по отношению к палиндрому. Одним исключением с точки зрения симметрии последовательности ΙΤΒ является область Ό ΙΤΚ Она является уникальной (не имеющей комплемента в пределах одного ΙΤΒ). Образование разрывов однонитевой ДНК происходит в месте соединения между областями А и Ό. В указанном месте инициируется синтез новой ДНК. Область Ό обычно находится с одной стороны от палиндрома и обеспечивает направленность к стадии репликации нуклеиновой кислоты. Парвовирус, реплицирующийся в клетке млекопитающего, обычно имеет две последовательности ΙΤΒ. Однако можно сконструировать ΙΤΒ так, чтобы сайты связывания были на обеих нитях областей А, и области Ό были расположены симметрично, по одной с каждой стороны палиндрома. На двунитевой кольцевой матрице ДНК (например, плазмиде), репликация нуклеиновой кислоты, осуществляемая с помощью Кер78 или Кер68, происходит в обоих направлениях, и один ΙΤΒ достаточен для парвовирусной репликации кольцевого вектора. Таким образом, одна нуклеотидная последовательность ΙΤΒ может быть использована в контексте настоящего изобретения. Однако предпочтительно используют два или другое четное количество стандартных ΙΤΚ Наиболее предпочтительно используют две последовательности ΙΤΚ Предпочтительным парвовирусным ΙΤΒ является ПК ΑΑν. По причинам безопасности желательным может быть конструирование рекомбинантного парвовирусного (τΑΑν) вектора, который не способен к дальнейшему размножению после начального введения в клетку в присутствии второго ΑΑν. Такой механизм безопасности для ограничения нежелательного размножения вектора у реципиента можно обеспечить с использованием γΑΑΥ с химерным ΙΤΚ который описан в И8 2003148506.

- 12 020969

Термин фланкирована по отношению к последовательности, которая фланкирована другим элементом (элементами), в данном описании указывает на наличие одного или нескольких фланкирующих элементов выше и/или ниже, т.е. с 5'- и/или 3'-стороны относительно последовательности. Термин фланкирована не предназначен для указания того, что последовательности обязательно являются непрерывными. Например, могут существовать промежуточные последовательности между нуклеиновой кислотой, кодирующей трансген, и фланкирующим элементом.

Последовательность, которая фланкирована двумя другими элементами (например, ГТК), показывает, что один элемент расположен с 5'-стороны от последовательности, а другой расположен с 3'стороны от последовательности; однако между ними могут присутствовать промежуточные последовательности. В предпочтительном варианте нуклеотидная последовательность по п. (ί) фланкирована с любой стороны нуклеотидными последовательностями инвертированного концевого повтора парвовируса.

В вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность, содержащая трансген (кодирующий представляющий интерес генный продукт), которая фланкирована по меньшей мере одной последовательностью ГТК парвовируса, предпочтительно включается в геном рекомбинантного парвовирусного (гААУ) вектора, продуцируемого в клетках насекомых. Предпочтительно трансген кодирует представляющий интерес генный продукт для экспрессии в клетке млекопитающего. Предпочтительно нуклеотидная последовательность, содержащая трансген, фланкирована двумя нуклеотидными последовательностями ГТК парвовируса (ААУ), и при этом трансген расположен между двумя нуклеотидными последовательностями ГТК парвовируса (АЛУ). Предпочтительно нуклеотидная последовательность, кодирующая представляющий интерес генный продукт (для экспрессии в клетке млекопитающего), будет включена в рекомбинантный парвовирусный (гААУ) вектор, продуцируемый в клетках насекомых, если она расположена между двумя стандартными ГТК или расположена с любой стороны от ГТК, сконструированного с двумя областями Ό.

Последовательности ААУ, которые могут быть использованы в настоящем изобретении для получения рекомбинантного ААУ-вириона в клетках насекомых, могут быть получены из генома ААУ любого серотипа. В общем, серотипы ААУ имеют геномные последовательности со значительной гомологией на уровне аминокислот и нуклеиновых кислот, обеспечивают идентичный набор генетических функций, продуцируют вирионы, которые являются, по существу, физически и функционально эквивалентными, и реплицируются и подвергаются сборке посредством практически идентичных механизмов. Геномные последовательности разных серотипов ААУ и обзор сходства геномов (см., например, в СепВапк, номер доступа И89790; СепВапк, номер доступа 101901; СепВапк, номер доступа АР043303; СепВапк, номер доступа АР085716; СЫопш е! а1. (1997, 1. УК. 71: 6823-33); Зпуазйуа е! а1. (1983, 1. УК. 45:555-64); СЫопш е! а1. (1999, 1. Ун. 73:1309-1319); Ки!1ейде е! а1. (1998, 1. Ун. 72:309-319) и Аи е! а1. (2000, 1. УК. 74: 8635-47)). Серотипы ААУ 1, 2, 3, 4 и 5 являются предпочтительным источником нуклеотидных последовательностей ААУ для применения в контексте настоящего изобретения. Предпочтительно последовательности ГТК ААУ для применения в контексте настоящего изобретения получают из ААУ1, ААУ2 и/или ААУ4. Подобным образом, последовательности, кодирующие Кер (Кер78/68 и Кер52/40), предпочтительно получают из ААУ1, ААУ2 и/или ААУ4. Однако последовательности, кодирующие капсидные белки УР1, УР2, и УР3, для применения в контексте настоящего изобретения могут быть взяты из любого из известных 42 серотипов, более предпочтительно из ААУ1, ААУ2, ААУ3, ААУ4, ААУ5, ААУ6, ААУ7, ААУ8 или ААУ9 или недавно разработанных ААУ-подобных частиц, полученных, например, с использованием методики перетасовки капсидов и библиотек капсидов ААУ, или с использованием недавно сконструированных, разработанных или выделенных ГТК.

Последовательности Кер ААУ и ГТК являются особенно консервативными у большинства серотипов. Например, белки Кер78 различных серотипов идентичны более чем на 89%, и суммарная идентичность нуклеотидных последовательностей на уровне генома между ААУ2, ААУ3А, ААУ3В и ААУ6 составляет около 82% (Вап!е1-8еЬаа1 е! а1., 1999, 1. У1го1, 73(2): 939-947). Кроме того, известно, что последовательности Кер и ГТК многих серотипов ААУ эффективно перекрестно комплементируют (т.е. функционально заменимы) соответствующие последовательности других серотипов при получении частиц ААУ в клетках млекопитающих. В ИЗ 2003148506 сообщается, что последовательности Кер ААУ и ГТК также эффективно перекрестно комплементируют другие последовательности Кер ААУ и ГТК в клетках насекомых.

Известно, что белки УР ААУ определяют клеточную тропность вириона ААУ. Последовательности, кодирующие белок УР, значительно менее консервативны, чем белки и гены Кер разных серотипов ААУ. Способность последовательностей Кер и ГТК перекрестно комплементировать соответствующие последовательности других серотипов позволяет получать псевдотипированные частицы гААУ, содержащие капсидные белки одного серотипа (например, ААУ3) и последовательности Кер и/или ГТК другого серотипа ААУ (например, ААУ2). Такие псевдотипированные частицы гААУ составляют часть настоящего изобретения.

Модифицированные последовательности ААУ также можно использовать в контексте настоящего изобретения, например, для получения векторов гААУ в клетках насекомых. Такие модифицированные последовательности, например, включая последовательности, имеющие по меньшей мере примерно 70%,

- 13 020969 по меньшей мере примерно 75%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95% или большую идентичность нуклеотидных и/или аминокислотных последовательностей (например, последовательность, имеющую примерно 75-99% идентичность по нуклеотидной последовательности) с ΙΤΚ, Кер или УР ААУ1, ЛЛУ2, ЛАУЗ, ААУ4, ААУ5, ААУ6, ААУ7, ААУ8 или ААУ9, можно использовать вместо последовательностей ΙΤΚ, Кер или УР ААУ дикого типа.

Несмотря на сходство во многих отношениях с другими серотипами ААУ, ААУ5 отличается от других серотипов ААУ человека и обезьян больше, чем другие известные серотипы человека и обезьян. В связи с этим продукция гААУ5 может отличаться от продукции других серотипов в клетках насекомых. В том случае, когда способы согласно изобретению применяют для получения гААУ5, предпочтительно в одной или нескольких конструкциях, содержащих (вместе в случае наличия более одной конструкции) нуклеотидную последовательность, содержащую ΙΤΚ ААУ5, нуклеотидная последовательность содержит последовательность, кодирующую Кер ААУ5 (т.е. нуклеотидная последовательность содержит Кер78 ААУ5). Такие последовательности ΙΤΚ и Кер при необходимости могут быть модифицированы, чтобы получить эффективную продукцию векторов гААУ5 или псевдотипированных гААУ5 в клетках насекомых. Например, стартовый кодон последовательностей Кер может быть модифицирован, сайты сплайсинга УР могут быть модифицированы или исключены, и/или стартовый кодон УР1 и соседние нуклеотиды могут быть модифицированы, чтобы улучшить продукцию векторов гААУ5 в клетках насекомых.

Таким образом, нуклеотидная последовательность, содержащая трансген, который определен в настоящем описании выше, может включать нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес генный продукт, для экспрессии в клетке млекопитающих, расположенную так, чтобы она была включена в рекомбинантный парвовирусный (гААУ) вектор, реплицируемый в клетках насекомых. В контексте изобретения подразумевают, что особенно предпочтительной клеткой млекопитающего, в которой необходимо экспрессировать представляющий интерес генный продукт, является клетка человека. Может быть включена любая нуклеотидная последовательность для более поздней экспрессии в клетке млекопитающего, трансфицированной рекомбинантным парвовирусным (гААУ) вектором, продуцируемым согласно настоящему изобретению. Нуклеотидная последовательность, например, может кодировать белок, она может экспрессировать агент РНК-и, т.е. молекулу РНК, которая способна к интерференции РНК, такую как, например, δΗ-РНК (короткая шпилечная РНК) или δί-РНК (короткая интерферирующая РНК) . δί-РНК означает короткую интерферирующую РН, которая представляет собой двунитевую РНК небольшой длины, которая не является токсичной в клетках млекопитающих (ЕФазЫг е! а1., 2001, Ыа!иге 411: 494-98; Сар1еп е! а1., 2001, Ргос. ЫаЙ. АсаЛ. 8еЬ И8А 98: 9742-47). В предпочтительном варианте нуклеотидная последовательность, содержащая трансген, может включать две кодирующих нуклеотидных последовательности, каждая из которых кодирует один представляющий интерес генный продукт, для экспрессии в клетке млекопитающего. Каждая из двух нуклеотидных последовательностей, кодирующих представляющий интерес продукт, локализована так, чтобы она была включена в рекомбинантный парвовирусный (гААУ) вектор, реплицируемый в клетках насекомых. Представляющим интерес продуктом для экспрессии в клетке млекопитающего может быть терапевтический генный продукт. Терапевтический генный продукт может представлять собой полипептид или молекулу РНК (δί-РНК), или другой генный продукт, который при экспрессии в клетке-мишени обеспечивает требуемый терапевтический эффект, такой как, например, удаление нежелательной активности, например, удаление инфицированной клетки, или комплементация генетического дефекта, например, вызывающего недостаточность ферментативной активности.

Примерами терапевтических полипептидных генных продуктов являются СРЕК, фактор IX, липаза липопротеидов (ЬРЬ, предпочтительно ЬРЬ 8447Х; см. \УО 01/00220), аполипопротеид А1, уридиндифосфатглюкуронозилтрансфераза (υΟΤ), белок, взаимодействующий с регулятором ГТАазы, пигментозного ретинита (КР-ОКР) и цитокины или интерлейкины, подобные, например, 1Ь-10, порфобилиногендезаминаза (РВОЭ). нейротрофический фактор, такой как нейротрофический фактор, полученный из линии глиальных клеток (ΟΌΝΡ), и аланин:гликосилат-аминотрансфераза (ΛΟΤ).

Альтернативно или дополнительно в качестве другого генного продукта нуклеотидная последовательность, содержащая трансген, который определен в настоящем описании выше, может дополнительно включать нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который служит в качестве маркерного белка для оценки трансформации и экспрессии клеток. Подходящими маркерными белками для такой цели являются, например, флуоресцирующий белок ОРР, и селектируемые маркерные гены тимидинкиназы Н8У (для селекции на среде НА^, бактериальной гигромицин В-фосфотрансферазы (для селекции на гигромицине В), аминогликозидфосфотрансферазы Τη5 (для селекции на О418) и дигидрофолатредуктазы (ЭНРК) (для селекции на метотрексате), СЭ20, ген низкоаффинного фактора роста нервов. Источники для получения таких маркерных генов и способы их применения описаны в публикации ЗатНгоок апЛ Κиδδе1, выше. Кроме того, нуклеотидная последовательность, содержащая трансген, который определен в настоящем описании выше, может включать дополнительную нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который может служить в качестве надежного механизма,

- 14 020969 который позволяет устранять у субъекта клетки, трансдуцированные рекомбинантным парвовирусным (гААУ) вектором согласно изобретению, если это необходимо. Такая нуклеотидная последовательность, часто называемая суицидным геном, кодирует белок, который способен превращать пролекарство в токсичное вещество, которое способно убивать трансгенные клетки, в которых экспрессируется белок. Подходящими примерами таких суицидных генов являются, например, ген цитозиндезаминазы Е. сой или один из генов тимидинкиназы вируса простого герпеса, цитомегаловируса и вируса ветрянкиопоясывающего лишая, и в таком случае можно использовать ганцикловир в качестве пролекарства для того, чтобы вызвать гибель трансгенных клеток у субъекта (см., например, С1аи е! а1., 1987, ЛпйписгоЬ. Адеп!к С’НетоШег. 31: 844-849).

В другом варианте одним из представляющих интерес генных продуктов может быть белок ААУ. В частности, белок №ρ, такой как Κορ78 или Κορ68, или его функциональный фрагмент. Нуклеотидная последовательность, кодирующая №ρ78 и/или Κορ68, в том случае, если она присутствует в геноме рекомбинантного парвовирусного (гААУ) вектора согласно изобретению и экспрессируется в клетке млекопитающего, трансдуированной вектором, обеспечивает возможность интеграции рекомбинантного парвовирусного (гААУ) вектора в геном трансдуцированной клетки млекопитающего. Экспрессия Κορ78 и/или Κορ68 в гААУ-трансдуцированной или инфицированной клетке млекопитающего может обеспечивать преимущество для определенных применений рекомбинантного парвовирусного (гААУ) вектора, создавая возможность долговременной или постоянной экспрессии любого другого представляющего интерес генного продукта, введенного в клетку с помощью вектора.

В рекомбинантных парвовирусных (гААУ) векторах согласно изобретению по меньшей мере одна нуклеотидная последовательность(ти), кодирующая представляющий интерес генный продукт, для экспрессии в клетке млекопитающего, предпочтительно функционально связана по меньшей мере с одной совместимой с клеткой млекопитающего последовательностью регуляции экспрессии, например, с промотором. В данной области известно много таких промоторов (см. ЗатЬгоок апб Ки88е1, 2001, выше). Можно использовать конститутивные промоторы, которые широко экспрессируются во многих типах клеток, такие как промотор СМУ. Однако более предпочтительны промоторы, которые являются индуцируемыми, тканеспецифичными, специфичными для типа клеток или специфичными для клеточного цикла. Например, в случае специфичной для печени экспрессии промотор может быть выбран из промотора а1-антитрипсина (ААТ), промотора глобулина, связывающего тиреоидный гормон, промотор альбумина, промотор ЬР8 (связывающего тироксин глобулина), гибридный промотор ΗСΚ-АροСII, гибридный промотор ΗСΚ-ЬЛАТ, промотор ААТ, промотор в сочетании с энхансерным элементом гена альбумина мыши (Еа1Ь) и промотор аполипопротеида Е. Другими примерами являются промотор Е2Р для экспрессии, избирательной для опухоли, и в частности экспрессии, избирательной для неврологических клеточных опухолей (Рагг е! а1., 1997, №!. Меб. 3: 1145-9), или промотор 1Ь-2 для применения в мононуклеарных клетках крови (НадепЬаидй е! а1., 1997, 1. Еxρ. Меб.; 185: 2101-10).

ААУ способен инфицировать ряд клеток млекопитающих (см., например, ТгаксЫп е! а1. (1985, Мо1. Се11 Бю1. 5: 3251-3260) и Сптт е! а1. (1999, Нит. Оепе ТНег. 10: 2445-2450). Однако трансдукция ААУ синовиальных фибробластов человека значительно более эффективна, чем в сходных мышиных клетках, 1епп1п§8 е! а1., АгИтОк Ке8, 3: 1 (2001), и клеточная тропность ААУ у разных серотипов разная. См., например, публикацию Эа\тбкоп е! а1. (2000, Ргос. Νπΐ1. Асаб. §сг ИЗА, 97: 3428-3432), в которой обсуждаются различия среди ААУ2, ААУ4 и ААУ5 в отношении тропизма к клеткам ЦНС млекопитающих и эффективности трансдукции. В предпочтительном варианте клеткой-хозяином согласно изобретению является любая клетка млекопитающего, которая может быть инфицирована парвовирусным вирионом, например, но без ограничения, мышечная клетка, клетка печени, нервная клетка, глиальная клетка и эпителиальная клетка. В предпочтительном варианте клеткой-хозяином согласно изобретению является клетка человека.

Предпочтительно в конструкции нуклеотидная последовательность, кодирующая парвовирусный белок Рец и/или парвовирусный капсидный белок, функционально связана с последовательностями регуляции экспрессии для экспрессии в клетке насекомого. Такие последовательности регуляции экспрессии, по меньшей мере, будут включать промотор, который активен в клетках насекомых. При практическом осуществлении изобретения можно применять способы экспрессии чужеродных генов в клеткаххозяевах насекомых, известные специалисту в данной области. Методика молекулярного конструирования и экспрессии полипептидов в клетках насекомых описана, например, в Зиттегк апб διηίΐΐτ 1986 (А Мапиа1 о£ Ме!йобк £ог Васи1о\агик Уес!огк апб 1пкес! Си1!иге Ргосебигек, Техак Адпси1!ига1 Еxρе^^теηίа1 8!абоп Ви11. №. 7555, Со11еде 8!абоп, Тех.; Ьискоте. 1991. В Ргокоц е! а1., С1отпд апб Еxρ^еκκ^οη о£ Не!его1одоик Сепек т 1пкес! Се11к \νίΐΗ Васи1о\агик УесЮгк' ЕесотЬшап! ^NЛ ТесНпо1оду апб ЛρρΙ^саι^οηκ„ 97152; Ктд, Ь. А. апб Κ. Ό. Роккее, 1992, ТНе Ьасп1оу|гпк еxρ^екк^οη кук!ет, Оифтап апб На11, Иш!еб Кшдбот; О'НеШу, Ό. Κ., Ь. К МШег, V. А. Ьискоте, 1992, Васи1о\агик Еxρ^екк^οη Уес!огк: А ЬаЬога!огу Мапиа1, №\ν Уогк; V. Н. Ргеетап апб Κ^сΗа^бкοη. С. Ό., 1995, Васи1о\агик Е-Хэге^ю!·! Рго!осо1к, Ме!йобк ш Мо1еси1аг Вю1о§у, уо1пте 39; И8 4745051; И8 2003148506 и \УО 03/074714). Подходящими промоторами для транскрипции нуклеотидных последовательностей, находящихся в первой и второй конструкции соглас- 15 020969 но изобретению, являются, например, промоторы полиэдрина (Ро1Н), р10, р35, ΙΕ-Ι или ΔΙΕ-1 и дополнительные промоторы, описанные в указанных выше ссылках.

Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая, по меньшей мере, первую и/или вторую кассеты экспрессии, дополнительно может содержать последовательность регуляции экспрессии, которая включает нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 9 или нуклеотидную последовательность, по существу гомологичную 8ЕЦ ГО ΝΟ: 9, выше кодона инициации нуклеотидной последовательности, кодирующей парвовирусный белок Кер, и/или кодона инициации нуклеотидной последовательности, кодирующей парвовирусный капсидный белок УР1. Последовательностью, обладающей значительной степенью идентичности с нуклеотидной последовательностью 8ЕЦ ГО ΝΟ: 9, которая будут помогать увеличивать экспрессию парвовирусного белка Кер, является, например, последовательность, которая обладает по меньшей мере 60, 70, 80 или 90% идентичностью с нуклеотидной последовательностью 8ЕЦ ГО ΝΟ: 9.

Клетка насекомого может представлять собой любую клетку, которая подходит для продукции гетерологичных белков. Предпочтительно клетка насекомого обеспечивает возможность репликации бакуловирусных векторов, и ее можно поддерживать в культуре. Более предпочтительно клетка насекомого также обеспечивает репликацию рекомбинантных парвовирусных векторов, включая векторы гААУ. Например, используемой клеточной линией может быть линия клеток 8робор1ега Ггищрегба. линии клеток Ого5орШ1а или линии клеток комара, например, линии клеток, полученных из Аебек а1Ьор1с1и5. Предпочтительными клетками или клеточными линиями насекомых являются клетки видов насекомых, которые чувствительны к бакуловирусной инфекции, включая, например, 82 (СКЬ-1963, АТСС), 8е301, 8е12О2109, 8еИСК1, 8Г9, 8Г900+, 8Г21, ΒΤΙ-ΤΝ-5Β1-4, МО-Ι, Тп368, №Ат1, На2302, Н2Е5, Шдк РКе Дпукгодеп, СА, И8А) и ехрге§8Р+® (И8 6103526; Рго1еш 8с1епсе§ Согр., СТ, И8А). Предпочтительной клеткой насекомого согласно изобретению является клетка насекомого для получения рекомбинантных парвовирусных векторов.

Способом согласно изобретению одна или несколько конструкций нуклеиновых кислот могут быть стабильно интегрированы в геном клетки насекомого. Специалисту в данной области известно, как стабильно ввести нуклеотидную последовательность в геном насекомого и как идентифицировать клетку, имеющую такую нуклеотидную последовательность в геноме. Включение в геном может быть осуществлено, например, с помощью применения вектора, содержащего нуклеотидные последовательности, высоко гомологичные областям генома насекомого. Применение специфичных последовательностей, таких как транспозоны, является другим путем введения нуклеотидной последовательности в геном.

Условия выращивания клеток насекомых в культуре и получения гетерологичных продуктов в клетках насекомых в культуре хорошо известны в данной области и описаны, например, в цитированных выше ссылках по молекулярному конструированию клеток насекомых (см. также νΟ 2007/046703).

В предпочтительном варианте способа согласно изобретению рекомбинантный парвовирусный вирион извлекают. Извлечение предпочтительно включает стадию аффинной очистки рекомбинантного парвовирусного (гААУ) вектора (содержащие его вирионов) с использованием анти-ААУ-антитела, предпочтительно иммобилизованного антитела. Анти-ААУ-антителом предпочтительно является моноклональное антитело. Особенно подходящим антителом является одноцепочечное антитело верблюдовых или его фрагмент, например, антитело, получаемое от верблюдов или лам (см., например, МиуМегтапк, 2001, В1о1есНпо1. 74: 277-302). Антителом для аффинной очистки гААУ предпочтительно является антитело, которое специфично связывает эпитоп на капсидном белке ААУ, при этом предпочтительно эпитоп представляет собой эпитоп, который присутствует на капсидном белке у более чем одного серотипа ААУ. Например, антитело может быть получено или выбрано на основе специфичного связывания с капсидом ААУ2, но в то же время он также может специфично связываться с капсидами ААУ1, ААУ3 и ААУ5.

Во втором аспекте изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей одну или несколько кассет экспрессии согласно изобретению, которые определены в настоящем описании выше. В предпочтительном варианте конструкция нуклеиновой кислоты согласно изобретению содержит первую и вторую кассету экспрессии согласно изобретению и необязательно последовательность нуклеиновой кислоты по п. (ί).

Предпочтительно первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению является промотор р10, а вторым промотором является промотор Ро1Н или 4хН§р27 ЕсКЕ + минимальный промотор Н§р70. Более предпочтительно первый промотор функционально связан с энхансером, предпочтительно энхансером НК1. В другом варианте первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению является 4хН§р27 ЕсКЕ + минимальный промотор Н§р70, а вторым промотором является промотор Ро1Н. В еще одном варианте первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению является промотор Ро1Н, а вторым промотором является промотор р10, бекаЕ1 или Е1. В еще одном варианте первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению является промотор Ро1Н, а вторым промотором является промотор бекаЕ1 или Е1. В еще одном варианте первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению

- 16 020969 является промотор р10, а вторым промотором является промотор бе11а.Е1 или Е1. В еще одном варианте первым промотором в конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению является промотор Ро1Н, а вторым промотором является промотор Ро1Н. В следующих вариантах любое другое сочетание первого промотора и второго промотора является частью изобретения. Первый промотор может быть выбран из группы, состоящей из промотора Ро1Н, промотора р10, основного промотора белка, индуцируемого промотора или промотора беИаЕ1 или промотора Е1 или любого другого промотора позднего или очень позднего бакуловирусного гена. Второй промотор может быть выбран из группы, состоящей из промотора Ро1Н, промотора р10, основного промотора белка, индуцируемого промотора или промотора бе11аЕ1 или Е1 или любого другого промотора позднего или очень позднего бакуловирусного гена. Более предпочтительно первый промотор выбран из группы, состоящей из промотора Ро1Н, промотора р10 или основного промотора белка, и при этом вторым промотором является промотор бе11а.Е1 или промотор Е1 или любой другой промотор раннего или позднего бакуловирусного гена.

В предпочтительном варианте первая кассета экспрессии, находящаяся в конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению, содержит энхансерный элемент, который определен выше.

В третьем аспекте изобретение относится к клетке насекомого, которая определена выше.

В четвертом аспекте изобретение относится к набору, содержащему (а) конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую первую и вторую кассеты экспрессии, которые определены выше; и (Ь) конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую сайт множественного клонирования для трансгена, который фланкирован по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью инвертированного концевого повтора парвовируса, и такой трансген функционально связан с промотором, способным управлять экспрессией трансгена в клетке-хозяине.

В предпочтительном варианте конструкция нуклеиновой кислоты (Ь) содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую трансген, который фланкирован по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью инвертированного концевого повтора парвовируса, и такой трансген функционально связан с промотором, способным управлять экспрессией трансгена в клетке-хозяине.

Набор может дополнительно содержать клетки насекомых и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую хелперные функции бакуловируса для экспрессии в клетках насекомых.

В следующем аспекте изобретение относится к партии парвовирусных вирионов, полученных описанными выше способами согласно изобретению. Термин партия парвовирусных вирионов в настоящем описании означает все парвовирусные вирионы, которые получают в одном и том же раунде продуцирования, необязательно в одной емкости с клетками насекомых. В предпочтительном варианте партия парвовирусных вирионов согласно изобретению имеет соотношение заполненные вирионы/суммарные вирионы, которое описано выше, и/или соотношение заполненные вирионы/пустые вирионы, которое описано выше.

В настоящем документе и в формуле изобретения глагол содержать и его сочетания используют в не ограничивающем смысле для обозначения того, что элементы, следующие после слова включены, но элементы, специально не указанные, не исключены. Кроме того, указание элемента с использованием грамматической формы единственного числа не исключает вероятность того, что присутствует больше одного элемента, если контекст ясно не диктует, что присутствует один и только один из элементов. Таким образом, форма единственного числа обычно означает по меньшей мере один.

Следующие далее примеры иллюстрируют изобретение.

Примеры

Пример 1

1.1 Материалы и способы

1.1.1 Создание рекомбинантного бакуловируса

Были созданы следующие конструкции.

1.1.1.1 Конструирование рУО 118(пе\у) рУЭ1118(ие№) является контрольным вектором, содержащим кассету экспрессии, включающую нуклеотидную последовательность Кер78 под контролем промотора р10, и кассету экспрессии, включающую нуклеотидную последовательность генов Сар под контролем промотора полиэдрина (Ро1Н или рРН). рУЭ118(ие№) конструировали, как показано на фиг. 1. Перед созданием конечной плазмиды рУЭ118(пе\у) конструировали предшественники рРакШас Эиа1 Кер78/АСО и рУЭ118 (партия № 1). Коротко, плазмиду КЕР-АСО/Р8С (заявка на выдачу патента \УО 2007148971; также называемую в настоящем описании рУО88) рУО88 расщепляли 8реРХЬа1 и выступающие 5'-концы делали тупыми. Фрагмент длиной 2057 п.н. выделяли из агарозного геля, очищали и лигировали в линеаризованную 8та1 плазмиду рРакШас Эиа1 (1иуйгодеи), получая рРа^Вас Эиа1 Кер78/АСО. Затем указанную плазмиду расщепляли Β6Ζ17Ι и §иаВ1 и фрагмент р10_Кер78/АСО длиной 2537 п.н. выделяли и лигировали в ΒδίΖ17Ιлинеаризованную рУО84, создавая рУЭ118 (партия № 1). Однако ориентация кассеты экспрессии Кер78/АСО была неправильной, и поэтому ее делетировали, осуществляя расщепление с использованием ЫЬеРВ1р1. После затупления выступающих 5'-концов фрагмент вектора длиной 12431 п.н. выделяли и очищали из геля. Затем очищенный фрагмент длиной 2057 п.н. из КЕР-АСО/Р8С лигировали в вектор, и

- 17 020969 смесью для трансформации трансформировали химически комптенетные клетки ТОР10 Цпуйтодеп), и клетки высевали на чашки, содержащие ампициллин. Осуществляли рестрикционный анализ с использованием Ыае1-8ас1 ДНК, выделенной из культур минипрепаративным способом. Правильные клоны давали фрагменты размером 2204 и 12292 п.н.

1.1.1.2. Конструирование рУЭ118(пе\у) + НК1 рУЭ118(пе№) + НК1 представляет собой такой же вектор, как рУЭ118, с добавлением энхансера Ьг1, который расположен между р10 и промотором полиэдрина, и его конструировали, как показано на фиг. 2. Коротко, ПЦР, осуществляемая на вирусной ДНК АсМИРУ (Рто!еш 8с1епсе8 Сотротайоп, Мепйеп, И8А) с использованием праймеров НК1-Р^ 5'-дЫасдЫдасас!а!сда!дйдас-3' (8ЕЦ ГО ИО: 10) и НК1-Ку 5'д1а1асца1сца11аПдс1ссаа1ас1ад-3' (8ЕЦ ГО ИО: 11), приводила к получению продукта длиной 904 п.н., который клонирован в векторе рСР11-Ыип1-ТОРО (1пуйгодеп). После расщепления Β8ΪΖ17Ι фрагмент длиной 898 п.н. выделяли из геля, очищали и лигировали в вектор рУЭ118(пе\у), который был расщеплен Β81Ζ17Ι и дефосфорилирован. Контрольные расщепления ферментами 8реЬЕсо№ приводили к образованию фрагментов длиной 1269 и 14125 п.н.

1.1.1.3 Конструирование рУЭ84 (+р10 Кер) (=рУЭ165) рУО165 представляет собой контрольный вектор, содержащий кассету экспрессии, включающую нуклеотидную последовательность Кер78, в которой стартовый кодон был мутирован с получением кодона АСО, под контролем промотора р10, и кассету экспрессии, включающую нуклеотидную последовательность генов Сар под контролем промотора Ро1Н. Кассеты экспрессии расположены в плазмиде в противоположном направлении. рУО165 конструировали, как показано на фиг. 3. Коротко, ПЦР, осуществляемая на рУЭ118(пе\у) с использованием праймеров поли-А Р\у 5'-ада!с!д!ад!ддс!а!ддсадддс-3' (8ЕЦ ГО ИО: 12) и р10 Ку 5'-ада!с!сссдддасддасс!йаайсаасссаас-3' (8ЕЦ ГО ИО: 13), приводила к получению продукта длиной 2566 п.н., который клонировали в векторе рСКЙ-Ъ1ип!-ТОРО (1пуйгодеп). После расщепления Β§1ΙΙ фрагмент длиной 2541 п.н. выделяли из геля, очищали и лигировали в вектор рУО84, который был расщеплен Β§1ΙΙ и дефосфорилирован. Контрольные расщепления правильных клонов 8ре1-ХЬа1 приводили к образованию фрагментов длиной 1269 и 11810 п.н.

1.1.1.4 Конструирование рУЭ165 + НК1 рУО165 + НК1 представляет собой такой же вектор, как рУО165, с добавлением энхансера Ьг1 ниже промотора р10, и его конструировали, как показано на фиг. 4. Коротко, ПЦР, осуществляемая на вирусной ДНК АсМИРУ с использованием праймеров НР1-Р\у 5'-д!а!асд!а!дасас! а!сда!дйдас-3' (8ЕЦ ГО ИО: 10) и НК1-Ку 5'-д1а!асда!сдайайдс!ссаа!ас!ад-3' (8ЕЦ ГО ИО: 11), приводила к получению продукта длиной 904 п.н., который клонировали в векторе рСКЙ-Ъ1ип!-ТОРО Цпуйтодеп). После расщепления Β8ΪΖ17Ι фрагмент длиной 898 п.н. выделяли из геля, очищали и лигировали в вектор рУО165, который был расщеплен 8таI и дефосфорилирован. Контрольные расщепления правильных клонов с использованием СЫ приводили к образованию фрагментов длиной 875, 1184, 4160 и 9180 п.н.

1.1.1.5. Конструирование рУЭ165 с индуцируемым промотором выше САР (рУЭ165 + 4хЕсКЕ

САР) рУЭ 165 + 4хЕсКЕ САР подобен рУЭ165, но содержит индуцируемый промотор вместо промотора полиэдрина (рРН). рУЭ165 + 4хЕсКЕ САР конструировали, как показано на фиг. 5. Коротко, индуцируемый промотор, который содержит 4 последовательно расположенных ЕсКЕ, минимальный промотор Н8р70 (Рое18 е! а1. Й18ес1 ВюсЬет. Мо1. Вю1. 2004, 34(5): 451-458) и часть последовательности, кодирующей САР, синтезировали и лигировали в рСКП-Ъ1ип!-ТОРО Цпуйтодеп). После расщепления Β8ΪΖ17Ι и ЕсоИЙ фрагмент длиной 375 п.н. выделяли из геля, очищали и лигировали в вектор рУО165, который расщепляли Β8ΪΖ17Ι и ЕсоИР Контрольные расщепления правильных клонов РтеРЕсоКУ приводили к образованию фрагментов длиной 2554 и 12116 п.н.

1.1.1.6. Конструирование рУЭ165 с индуцируемым промотором выше Кер (рУИ165 + 4хЕсКЕ Кер78-52) рУЭ165 + 4хЕсКЕ Кер78 подобен рУЭ165, но содержит индуцируемый промотор вместо промотора р10. рУЭ165 + 4хЕсКЕ Кер78 конструировали, как показано на фиг. 6. Коротко, синтезировали индуцируемый промотор, который состоит из 4 последовательно расположенных ЕсКЕ и минимального промотора Н8р70, и лигировали в рСКП-Ъ1ип!-ТОРО Цпуйтодеп). После расщепления Β81Ζ17Ι и 8реI фрагмент длиной 290 п.н. выделяли из геля, очищали и лигировали в вектор рУО165, который был расщеплен 8таI и 8реР Контрольные расщепления правильных клонов 8реI·ΒдШ приводили к образованию фрагментов длиной 298, 2376 и 11954 п.н.

1.1.1.7. Конструирование конструкции рУЭ190 (йе1ЫЕ1 Сар + рРо1Ь Кер)

Ие1ЫЕ1 Сар + рРо1Ь Кер подобен рУЭ165, но содержит промотор йе1ЫЕ1 вместо промотора рРН и промотор рРо1Н вместо промотора р10. Ие1ЫЕ1 Сар + рРо1Ь Кер конструировали, как показано на фиг. 7 и 8. Для этого конструировали вектор-предшественник следующим образом. ПЦР, осуществляемая на рРБР8РР (ИтаЪе е! а1. Нитап депе !Ьегару 2002; 13(16): 1935-1943) с использованием праймеров Β81Ζ17Ιйе1ЫЕ1 Ρν: 5'-дд1ссдЫасдасда!аасдссдйдд!ддсд-3' (8ЕЦ ГО ИО: 14) и Айй-йейа РЕ1 Ку: 5'сдасйаадасддсдаайс!дсада!ддс-3' (8ЕЦ ГО ИО: 15), приводила к получению продукта длиной 181 п.н., кото- 18 020969 рый клонировали в векторе рСКП-ЫиШ-ТОРО (Iην^ί^οдеη). После расщепления ΒδίΖΠΙΆΓΠΙ фрагмент длиной 165 п.н. выделяли из геля, очищали и лигировали в вектор рУЭ165 + 4хЕсКЕ САР, который расщепляли ΒκίΖ17Ι и АГШ. Полученная в результате плазмида представляла собой плазмиду рУЭ165 + бе11а1Е1 САР, и контрольное расщепление ΒδίΖΠΙΆΓΙΠ должно приводить к образованию фрагментов длиной 165 и 14374 п.н. Затем промотор полиэдрина клонировали перед кассетой экспрессии Кер в рУЭ165 + беЙа1Е1 САР. Для этого осуществляли ПЦР с использованием праймеров ЗтаI-ρΡο1Ь Р\у: 5'ίсίсссдддадаίсаίддадаίааίίαаίдаίаас-3' (ЗЕЦ ГО N0: 16) и ЗρеI-ρΡο1Ь Κν: 5'- дηасίадίдадсίсдίсдас-3' (ЗЕЦ ΙΌ N0: 17) на рУО88. При этом получали ПЦР-продукт длиной 198 п.н., который клонировали в векторе рСКП-ЫшИ-ТОРО (Iην^ί^οдеη). После расщепления ЗреРЗпкН фрагмент длиной 188 п.н. выделяли из геля, очищали и лигировали в вектор рУЭ165 + беЬа1Е1 Сар, который был расщеплен §ре1 и §та1. В итоге получали конструкцию рУЭ165 + беЬа1Е1 САР.

1.1.1.8 Конструирование конструкции ρ10-Саρ-ρΡο1Ь-Κеρ

Конструкция р10_Сар + ρΡο1Ь_Κеρ подобна конструкции бе1ίа-IЕ1-Саρ-ρΡο1Ь-Κеρ, но содержит промотор р10 вместо промотора беЬа-1Е1 перед кассетой экспрессии Сар, и ее конструировали, как показано на фиг. 9. ПЦР, осуществляемая на рРакШас Эиа1 с использованием праймеров Β5ίΖ17I-ρ10 Р\у: 5'адίаίасддассίίίааίίсаас-3' (ЗЕЦ ГО N0: 18) и АГ111-р10 Κν: 5'-сдас11аададсдддссдсШсдаа1с-3' (ЗЕЦ ГО N0: 19), приводила к получению продукта длиной 171 п.н., который клонировали в векторе рСКП-ЫиЩ:ТОРО (Шйгодец). После расщепления Β5ίΖ17Ι·ΆΓ1ΙΙ фрагмент длиной 160 п.н. выделяли из геля, очищали и лигировали в конструкцию бе1ίа-IЕ1-Саρ-ρΡο1Ь-Κеρ, которая была расщеплена ΒκίΖ17Ι и АГШ.

1.1.1.9 Конструирование рУО194 (Кер78/СТО(беЬа АТС))

Сначала конструировали гер-плазмиду со стартовым кодоном СТО без каких-либо внутренних сайтов АТО посредством синтеза необходимого гена в соответствии с последовательностью, указанной в ЗЕЦ ГО N0: 31. Затем ген гер делетировали из плазмиды рУЭ88, используя ферменты рестрикции ΚκτΙΙ и ХЬаР Затем синтезированный ген лигировали в плазмиду рУО88, используя сайты рестрикции ΚκτΙΙ и ХЬаР получая рУЭ195. Затем рУЭ195 расщепляли ΒдШ, получая фрагменты длиной 9297 и 2231 п.н. Затем выступающие 5'-концы заполняли фрагментом Кленова и затем расщепляли, используя ЗехАЕ При этом получали фрагменты длиной 9297, 1372 и 859 п.н. Затем выделяли фрагмент 859 п.н. Необходимый вектор создавали, расщепляя рУО165 ферментом ЗреР получая линейный фрагмент длиной 14501 п.н. Выступающие 5'-концы заполняли фрагментом Кленова и затем расщепляли, используя ЗехАР с получением фрагментов 13600 и 901 п.н. Выделяли фрагмент длиной 13600 п.н. Фрагмент ΒдШ(Кленов)·ЗеxАI длиной 859 п.н. затем лигировали в рУЭ165 (ЗреИКленоврЗехАЦ получая рУЭ194 (см. фиг. 10). Контрольное расщепление ЗеxΆI·XтаI должно приводить к образованию фрагментов длиной 13435 п.н. и 1029 п.н.

1.1.1.10. Конструирование рУЭ84

Чтобы превратить стартовый сайт бакуловирусного вектора экспрессии ρРΒААУ1УΡт11 (ИтаЬе е1 а1., 2002, Нит. Оспс ТЬег. 13: 1935-1943) из АСО в ОТО, осуществляли ПЦР, используя следующие праймеры.

Последовательность прямого праймера содержит сайт ΒатНI (АМТ праймер № 169; ЗЕЦ ГО NО: 29)

5'- ТТАООАТССТОТТААООТООСТОССОАСОО-3'

Последовательность обратного праймера содержит сайт 3ΐιιΙ (АМТ праймер № 158; ЗЕЦ ГО NО: 30)

5'-ОТСОТАООССТТОТСОТОСТСОАОООССОС-3'

Стартовый сайт	Прямой праймер	Обратный праймер	№ плазмиды АМТ (хвост к хвосту)	№ плазмиды АМТ (Р5С)
СТС	169	158	ρνϋ63	ρνϋ84

Осуществляли ПЦР с использованием праймеров № 169 и 158, и продукт ПЦР (250 п.н.) очищали, используя набор для очистки продуктов ПЦР (^адеи партия № 11879372), и разрезали ферментами рестрикции ΒатНI и δίυΙ. Бакуловирусный экспрессирующий вектор также расщепляли ферментами ΒатΗΙ и 3ίυΙ. После дефосфорилирования вектора с использованием ЗАР (Рготеда, партия № 17501504), вставку (Сар со стартовым сайтом ОТО) и вектор очищали в геле. После лигирования вектора и вставки осуществляли трансформацию химически компетентных клеток ΌΗ5α (Iην^ί^οдеη, партия № 1241753), и клетки высевали штрихом на чашки с ΕΒ, содержащие ампициллин. ДНК рУЭ63 (Сар/стартовый сайт ОТО) очищали и исследовали в отношении идентичности, используя анализ последовательностей Βа8еС1еаг и рестрикцию.

Чтобы клонировать ген Сар со стартовым сайтом ОТО в бакуловирусном экспрессирующем векторе рРЗС10 (Рго1ет Засмсек), его вырезали из рУЭ63 ферментами δтаI и АугП и лигировали в дефосфорилированный экспрессирующий вектор, который был разрезан ЕтоКУ и ХЬаР Затем смесью для лигирования трансформировали химически компетентные клетки ΌΗ10β Д^йгодещ партия № 1268527), и клетки высевали штрихом на чашки с ΕΒ-ампициллином. После минипрепаративного выделения ДНК с использованием набора ОМргер Зрш МШртер (^адеи партия № 12180218), один минипрепарат (клон

- 19 020969 № 13) отбирали на основе рестрикционного анализа с использованием 8рЫ. ДНК такого клона (рУЭ84) очищали с помощью набора 8NΛР пиб1ргер (1пуйгодеп, партия раствора № 1256921 и партия колонки № 1259367). Идентичность рУЭ84 проверяли с использованием анализа последовательности вблизи стартового кодона, осуществляемого с помощью Ва§еС1еаг, и рестрикционным анализом с использованием ферментов ВатН1 и 8рЫ (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 28).

1.1.1.11. Получение рекомбинантного бакуловируса

Рекомбинантные Вас.УЭ118(пе\у), Вас.УЭ118(пе\у)+НВ1, Вас.УЭ165, Вас.УЭ165+НК1, Вас.УЭ165+4хЕсКЕ САР, Вас.УЭ165+4хЕсКЕ Кер78, Вас.УЭ190 и Вас.УЭ194 (р0) создавали, используя систему Рго!еш 8аепсе5 (Рго1е1п 8аепсе5 СогрогаБоп, Мепбеп, И8А). Рекомбинантный бакуловирус амплифицировали при разведении 1:100 в 2х10⁶ клеток 8Р+ в мл. Через три дня после инфекции клетки осаждали центрифугированием и извлекали надосадок, содержащий вирус. Амплификацию следующих пассажей осуществляли таким же образом.

1.1.2 Получение гААУ

Партии гААУ получали согласно ИгаЬе е1 а1., 2002 (выше) с тем исключением, что использовали два рекомбинантных бакуловируса вместо трех. Один бакуловирус нес экспрессирующую конструкцию под контролем промотора СМУ и фланкированную ΙΤΚ ААУ. Другой бакуловирус представлял собой бакуловирус Кер-Сар, который нес две кассеты экспрессии, одну для гена репликации ААУ и одну для капсида ААУ. Экспрессия гена репликации или гена капсида под контролем индуцируемого промотора регулируется добавлением 0,001-1 мкМ понастерона А в культуральную среду. Разные эксперименты по получению гААУ1 осуществляли, используя исходные культуры бакуловируса Вас.УЭ43 р5, содержащего трансген ЬРЬ под контролем промотора СМУ, и разные пассажи (р3, р4 или р5) бакуловирусов Кер/Сар. В каждом эксперименте в качестве контроля использовали стандартную продукцию гААУ1 (Вас.УО88:Вас.УО84:Вас.УП43 в соотношении 5:1:1).

1.1.3. Определение соотношение заполненные/суммарные частицы ААУ

Чтобы определить отношение количества заполненных к суммарному количеству капсидов, количество геномных копий (дс) делили на общее количество частиц ААУ. Количество дс/мл измеряли в количественном ПЦР-анализе, и суммарное количество частиц ААУ определяли с использованием иммуноферментного анализа Ргодеп (см. ниже). Для реакции количественной ПЦР использовали основную смесь для ПЦР 8УВК Сгееп (АррНеб ВюхуЦепъ, № 4309155) согласно инструкциям производителя (общий объем 25 мкл; программа ПЦР: 10 мин 95°С, 40 циклов 15 с 95°С и 1 мин 60°С), используя следующие наборы праймеров:

рг59 ААТОООСООТАООСОТОТА СМУ 8ЕЭГОИО:26 ргбО АООССАТСТОАСООТТСАСТАА СМУ 8Ε<3ΙΌΝΟ:27

Соотношение сравнивают с соотношением, полученным в стандартных условиях продуцирования при использовании объемного соотношения 5:1:1 Вас.Кер, Вас.Сар и Вас.1ТК.

1.1.4. Вестерн-блот-анализ

Через три дня после продуцирования гААУ клетки лизировали добавлением 0,1 У лизирующего 10х трис-буфера (1,5 М №С1, 0,5 М трис, 0,01 М МдС1, 1% тритон Х-100, рН 8,5, стерилизованный фильтрованием) и инкубировали на льду в течение 30 мин. Свободную ДНК и РНК разрушали инкубацией с бензоназой при 37°С в течение 15 мин. Клеточный лизат центрифугировали (1900 х д; 15 мин; 4°С). К образцу надосадка добавляли буфер для образцов NиРАСΕ ЬЭ8 (4х, 1пуНгодеп) и наносили на 4-12% бистрис-гель (120 В). Белки с помощью блоттинга переносили на мембрану РУЭР (ВюКаб) в течение 30 мин, 10 В (полусухой блоттинг). Осуществляли Вестерн-иммнохимический анализ, блокируя мембрану блокирующим буфером 8ирегЬ1оск-РВ8 (Р1ЕКСЕ) и затем инкубируя с мышиными анти-Кер-антителами (303.9, Ргодеп, Сегтапу; разведение 1:50) и кроличьими антителами против 1д мыши - НКР (ИАКО, разведение 1:500). Белки Кер визуализировали с помощью хемилюминесцентного окрашивания, используя субстрат для Вестерн-блоттинга 1ит1-НдЫ р1и8 (КосНе).

1.1.5. ЕЬ18А суммарных частиц гААУ1

Общее количество частиц гААУ1 (1р)„ полученное при каждом продуцировании, определяли с помощью набора для ЕЬ18А с титрованием ААУ1 (Ргодеп, Не1бе1Ьегд, Сегтапу), и определение осуществляли согласно протоколу, прилагаемому к набору производителем, за исключением того, что все образцы и контроли предварительно разбавляли в неочищенной массе лизата (СЬВ). Коротко, СЬВ получали посредством сбора клеток ехрге888Р+спустя три дня, добавляя 10х лизирующий буфер и инкубируя в течение 1 ч при 28°С. После обработки бензоназой в течение 1 ч при 37°С лизат центрифугировали при 1900 д, и надосадок хранили при 4°С. Чтобы определить общее количество частиц гААУ1 в неочищенном лизате каждой популяции, образцы предварительно разбавляли 50 раз в СЬВ, указанное разведение было начальным разведением. Затем осуществляли дополнительные разведения в 250, 1250 и 6250 раз в СЬВ. Стандартную линию также разбавляли в СЬВ. Образцы при получении Вас.УЭ190 разбавляли только 50 и 100 раз вследствие низких уровней экспрессии капсидных белков.

1.1.6. Анализы суммарных частиц с использованием ВЭЖХ

Неизвестные штаммы ААУ-1 инъецировали в систему ВЭЖЖХ, получая пик на хроматограмме.

- 20 020969

Такой пик можно интегрировать с помощью компьютерной программы Сйетз1а1юп, и он представляет суммарное количество инъецированных частиц. Концентрированную культуру ААУ-1 титровали в отношении количества суммарных частиц в мл с помощью электронной микроскопии и использовали в способе. Используя такой стандарт в качестве калибровочного, вычисляли количество суммарных частиц в неизвестном образце. Кроме того, при инъекции конкретного количества геномных копий (которое примерно представляет количество заполненных частиц) в диапазоне стандарта можно оценить соотношение заполненных и пустых частиц.

1.2. Результаты

Соотношение заполненные/пустые частицы ААУ улучшается в случае применения основанной на двух бакуловирусах системе, в частности, с высокой экспрессией белка Кер и умеренной экспрессией белка Сар

Подробно исследовали три конструкции, рУЭ165, рУЭ190 и рУЭ194.

Чтобы определить соотношение заполненные/пустые частицы гААУ1, продуцируемых с использованием Вас.УЭ165, концентрацию суммарных частиц в неочищенных лизатах определяли в двух независимых экспериментах. Результаты таких экспериментов ЕЫ5А и соответствующие соотношения суммарные/заполненные частицы показаны в табл. 1.

Таблица 1. Соотношение суммарные/заполненные гААУ1, полученные с использованием бакуловирусного штамма Вас.УЭ165. Концентрацию суммарных частиц определяли с помощью ЕЫ5А суммарных частиц ААУ1. Концентрацию заполненных частиц определяли с помощью количественной ПЦР. Соотношения суммарные/заполненные частицы можно сравнивать только с контролем, полученным в том же самом эксперименте

Вас.УО165: Вас.УЦ43	Концентрация суммарных частиц (Όρ/мл)	Концентрация заполненных частиц (дс/мл)	Соотношение суммарные/ заполненные частицы (Όρ/дс)
#1 Контроль	7,07Е+12	2,05Е+10	345
1:1	4,91Е+11	2,24Е+09	219
5:1	8,ЗЕ+11	5,0Е+09	166
#2 Контроль	3,19Е+13	1,99Е+10	1603
1:1	6,32Е+11	6,ЗЗЕ+08	998
5:1	1,30Е+12	Ι,ΙΟΕ+09	1182

Соотношение суммарные/заполненные частицы в случае продуцирования 1:1 в обоих экспериментах было в 1,6 раз лучше по сравнению с контролем. Для продуцирования 5:1 соотношение суммарные/заполненные частицы в 2,1 и 1,4 раза лучше по сравнению с контролем. В заключение, соотношение суммарные/заполненные частицы улучшается в случае частиц гААУ1, получаемых с использованием Вас.УШ65.

В Вас.УЭ190 кассета экспрессии Сар находится под контролем слабого промотора А1Е1. Это может приводить к более низкой экспрессии капсида, чем в случае продуцирования, осуществляемого с использованием других Кер/Сар-бакуловирусов или в контрольной ситуации, поскольку во всех указанных условиях экспрессия Сар индуцируется сильным промотором полиэдрина. Чтобы проверить такую гипотезу, определяли концентрацию суммарных частиц из двух разных экспериментов, осуществляемых с использованием Вас.УЭ190. Результаты показаны в табл. 2.

Таблица 2. Соотношение суммарные/заполненные гААУ1, получаемых с использованием бакуловирусного штамма Вас.УЭ190. Концентрацию суммарных частиц определяли с использованием ЕЫ5А суммарных частиц ААУ1. Концентрацию заполненных частиц определяли с помощью количественной ПЦР. Соотношения суммарные/заполненные частицы можно сравнивать только с контролем, получаемым в том же самом эксперименте

Вас.УО190: Вас.УО43	Концентрация суммарных частиц (Όρ/мл)	Концентрация заполненных частиц (дс/мл)	Соотношение суммарные/ заполненные частицы (Όρ/дс)
#1 Контроль	3,19Е+13	1,99Е+10	1603
1:1	8,6Е+10	5,97Е+09	14
5:1	3,62Е+11	1,8Е+09	201
#2 Контроль	6,11Е+12	4,03Е+10	152
1:1	3,75Е+11	1,74Е+09	216
5:1	3,44Е+11	3,12Е+09	110

Результаты получения № 1 (табл. 2) показывают, что соотношения суммарные/заполненные частицы, полученные при продуцировании 1:1 и 5:1, были в 114 и 8 раз лучше по сравнению с контролем, соответственно. При получении № 2 соотношение суммарные/заполненные частицы в 1,4 раза ниже или в

1,4 раза выше для продуцирования 1:1 или 5:1. В заключение, соотношение суммарные/заполненные частицы, по-видимому, также улучшается в случае частиц гААУ1, продуцируемых с использованием Вас.УЭ190 (как наблюдали в случае Вас.УЭ165).

- 21 020969

В случае Вас.УО194 осуществляли Вестерн-блот-анализ, чтобы определить экспрессию Кер и Сар. Соответственно через три дня после инфекции клеток с использованием 2 разных соотношений бакуловирусов (т.е. 1:1 и 9:1, при соотношении 5:1:1 для контроля из трех компонентов) лизаты клеток собирали и подвергали Вестерн-блот-анализу. Как показано на фиг. 11А, экспрессия Сар была низкой при продуцировании с использованием соотношения бакуловирусов 1:1, но продуцирование с использованием соотношения 9:1 было сравнимым с трехкомпонентным контролем. Однако в случае продуцирования при соотношениях 1:1 и 9:1 экспрессия Кер сильно снижалась по сравнению с трехкомпонентным контролем. Однако на фиг. 11В показано, что продуцирование вируса выше в случае получения с использованием Вас.УЭ194. Тот факт, что продуцирование выше, хотя экспрессия Сар ниже, свидетельствует о более предпочтительном соотношении суммарные/заполненные частицы. И снова можно сделать вывод, что двухкомпонентная система с эквимолярными количествами Кер и Сар, и особенно с высокой экспрессией Кер и умеренной экспрессией Сар, приводит к более низкому соотношению суммарные/заполненные частицы (т.е. в к более высокому процентному содержанию заполненных частиц).

Пример 2

Материалы и способы

В три встряхиваемых колбы (все колбы культивировали при 28°С перед инфекцией) высевали инокулят Р5: 4 мл Вас.УЭ43, 4 мл Вас.УЭ84 и 20 мл Вас.УЭ88. Встряхиваемые флаконы инкубировали на протяжении 72-часового продуцирования вирусов при трех разных температурах (26, 28 и 30°С).

Лизирующую обработку в случае всех встряхиваемых флаконов осуществляли в 1 инкубаторе со встряхиванием, используя 0,9% (об./об.) тритон Х-100. После добавления лизирующего буфера встряхиваемые колбы инкубировали в течение 30 мин при заданной температуре 28°С, добавляли бензоназу (16 мкл на 400 мл) и встряхиваемые колбы инкубировали в течение 1 ч при заданной температуре 37°С. После обработки бензоназой все встряхиваемые колбы выдерживали в течение ночи при 29°С для клиренса вирусов и затем хранили при 4°С максимум в течение 3 суток.

Из каждого инкубатора со встряхиванием 200 мл неочищенной лизированной массы обрабатывали на аффинной колонке объемом 1 мл, используя расход 1 мл/мин. После промывки продукт элюировали, используя РВ§, рН 3,5.

Результаты

Текущий подсчет клеток во встряхиваемых флаконах, используемых для температурного исследования, показан в табл. 1. Повышение температуры коррелирует со снижением общей концентрации клеток и жизнеспособности во время сбора. Жизнеспособность, получаемая при 28°С, сравнима с результатами, получаемыми с использованием системы биореактора Аауе.

Таблица 1. Текущий подсчет клеток при получении во встряхиваемых колбах

Встряхиваемая колба(номер партии)	Перед инфекцией	Перед добавлением лизирующего буфера
	Общая концентрация клеток (количество/мл)	Жизнеспособность (%)	Общая концентрация клеток (количество/мл)	Жизнеспособность (%)
Температура при инфекции во встряхиваемой колбе 26®С (партия № 0078)	1,89x10*	99,5	2,74x10*	85,7
Температура при инфекции во встряхиваемой колбе 28аС (партия № 0078)	1,89x10*	99,5	2,51x10*	74,9
Температура при инфекции во встряхиваемой колбе 30°С (партия № 0078)	1,89x10*	99,5	2,42x10*	61,0

Результаты тестирования неочищенной лизированной массы и элюатов из встряхиваемых колб показаны в табл. 2.

- 22 020969

Таблица 2. Соотношение суммарные/заполненные частицы гААУ, продуцированные при разных температурах

Встряхиваемая колба (номер партии)	Суммарные частицы (ΐρ/мл) Способ ВЭЖХ	Количественная ПЦРСЬВ (ВС/мл)	Количественная ПЦР элюата (£С/МЛ)	Соотношение суммарные/ заполненные (Ф/ВС)
Колба, встряхиваемая при 26°С (партия № 0078)	6,14хЮ12	1,28x1ο10	5,52x10'°	111
Колба, встряхиваемая при 28°С (партия № 0078)	6,58х1012	2,00x10'°	1,43х10]|	46
Колба, встряхиваемая при 30°С (партия № 0078)	7,24х10'2	3,94x10'°	1,73x10	42

Обсуждение и выводы

Повышение температуры во время продуцирования гААУ в клетках §Р⁺ незначительно увеличивает общее количество продуцируемых частиц гААУ, но в большйе степени увеличивает количество продуцируемых заполненных, приводя к снижению соотношения суммарные/заполненные частицы.

Claims (13)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ получения рекомбинантного парвовирусного вириона, включающий стадии:

   (a) получение клетки насекомого, содержащей одну или несколько конструкций нуклеиновых кислот, содержащих (ί) нуклеотидную последовательность, содержащую трансген, который фланкирован по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью парвовирусного инвертированного концевого повтора;

   (ίί) первую кассету экспрессии, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один из белков Кер78 и Кер68, которая функционально связана с первым промотором, способным управлять экспрессией белка Кер в клетке насекомого;

   (ίίί) вторую кассету экспрессии, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую капсидный белок парвовируса, которая функционально связана со вторым промотором, который способен управлять экспрессией капсидного белка в клетке насекомого;

   (b) культивирование клетки, определенной в п.(а), в условиях, подходящих для экспрессии Кер и капсидного белка; и (c) необязательно выделение рекомбинантного парвовирусного вириона;

   причем первая и вторая кассеты экспрессии присутствуют в одной конструкции нуклеиновой кислоты, и в котором отношение экспрессии белка Кер к экспрессии капсидного белка регулируется одним или несколькими из следующих путей:

   первый промотор имеет такую же силу или является более сильным, чем второй промотор; присутствие большего количества и/или более сильных энхансерных элементов в первой кассете экспрессии по сравнению со второй кассетой экспрессии;

   нуклеотидная последовательность, кодирующая парвовирусный белок Кер, имеет более высокий индекс адаптации кодонов по сравнению с нуклеотидной последовательностью, кодирующей капсидный белок;

   оптимизация температуры для парвовирусного белка Кер и/или варианты белков Кер с одной или несколькими заменами, инсерциями и/или делециями в аминокислотной последовательности по сравнению с соответствующим белком Кер дикого типа, и при этом замена, инсерция и/или делеция аминокислот приводят к повышению активности функции Кер, которое оценивают с помощью выявления повышенной продукции ААУ в клетках насекомых.
2. 2. Способ по п.1, в котором нуклеотидная последовательность по π.(ίίί) содержит открытую рамку считывания, включающую нуклеотидные последовательности, кодирующие капсидные белки УР1, УР2 и УР3.
3. 3. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором нуклеотидная последовательность по п.(и) содержит только одну открытую рамку считывания, включающую нуклеотидные последовательности, кодирующие по меньшей мере один из белков Кер78 и Кер68.
4. 4. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором открытая рамка считывания, содержащая нуклеотидные последовательности, кодирующие капсидные белки УР1, УР2 и УР3, или открытая рамка считывания, содержащая нуклеотидные последовательности, кодирующие по меньшей мере один из белков Кер78 и Кер68, не содержат искусственного интрона.
5. 5. Способ по п.4, в котором ни открытая рамка считывания, содержащая нуклеотидные последовательности, кодирующие капсидные белки УР1, УР2 и УР3, и/или ни открытая рамка считывания, содержащая нуклеотидные последовательности, кодирующие по меньшей мере один из белков Кер78 и Кер68,

   - 23 020969 не содержат искусственного интрона.
6. 6. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором первый промотор или второй промотор выбран из группы, состоящей из промотора Ро1Н, промотора р10, основного промотора, индуцируемого промотора, промотора Е1 или промотора бе11аЕ1.
7. 7. Способ по п.6, в котором первый промотор выбран из группы, состоящей из промотора Ро1Н, промотора р10 или основного промотора, и в котором вторым промотором является промотор беКаЕ1 или промотор Е1.
8. 8. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором первая кассета экспрессии содержит по меньшей мере один бакуловирусный энхансерный элемент и/или по меньшей мере один элемент, отвечающий на экдизон.
9. 9. Способ по п.8, в котором энхансерный элемент выбран из группы, состоящей из Ьг1, Ьг2, Ьг3, Ьг4 и Ьг5.
10. 10. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором последовательность 1ТК парвовируса, парвовирусный белок Кер и/или парвовирусный белок Сар происходят из аденоассоциированного вируса (ААУ).
11. 11. Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая первую и вторую кассеты экспрессии, которые определены в любом из пп.1-10, в которой (a) первым промотором является промотор р10, а вторым промотором является промотор Ро1Н или 4хНзр27 ЕсКЕ+минимальный промотор Нзр70;

    (b) первым промотором является 4хНзр27 ЕсКЕ+минимальный промотор Нзр70, а вторым промотором является промотор Ро1Н;

    (c) первым промотором является промотор Ро1Н, а вторым промотором является промотор р10, бе11аЕ1 или Е1;

    (б) первым промотором является промотор Ро1Н, а вторым промотором является промотор бе11аЕ1 или Е1;

    (е) первым промотором является промотор р10, а вторым промотором является промотор бе11аЕ1 или промотор Е1 или (1) первым промотором является промотор Ро1Н, и вторым промотором является промотор Ро1Н, и при этом первая кассета экспрессии необязательно содержит энхансерный элемент.
12. 12. Клетка насекомого, включающая конструкцию нуклеиновой кислоты, определенную в любом из пп.1-10.
13. 13. Набор, содержащий (а) конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую первую и вторую кассеты экспрессии, которые определены в любом из пп.1-10; и (Ь) конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую сайт множественного клонирования для трансгена, который фланкирован по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью инвертированного концевого повтора парвовируса, причем трансген функционально связан с промотором, способным управлять экспрессией трансгена в клетке-хозяине.