JP2023519502A - Aav生成のための二重二官能基ベクター - Google Patents
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Abstract
本発明は、組換えパルボウイルス遺伝子療法ベクターの生成のための核酸構築物の新規組合せに関する。特に、本発明は、好ましくは2つ以下の構築物の組合せに関し、第1の構築物はパルボウイルスCap及びRepタンパク質を発現し、第2の構築物は少なくとも導入遺伝子に隣接するITRを含み、任意選択でCapタンパク質のための発現カセットを再び含む。核酸構築物は、好ましくは昆虫細胞でのrAAVの生成のためのバキュロウイルスベクターである。【選択図】なし
Description
本発明は、医学、分子生物学及び遺伝子療法の分野に関する。本発明は、バキュロウイルスベクターで反復する不完全なパリンドローム/相同反復配列が使用される、細胞でのタンパク質の生成に関する。特に、本発明は遺伝子療法で使用することができるパルボウイルスベクターの生成、及びパルボウイルスベクターの生産性を増加させるウイルスレプリカーゼ(Rep)タンパク質の発現の向上に関する。
バキュロウイルス発現系は、真核生物のクローニング及び発現ベクターとしてのその使用が周知である(King、L.A.及びR.D.Possee、1992年、「The baculovirus expression system」、Chapman and Hall、United Kingdom;O’Reilly、D.R.ら、1992年。Baculovirus Expression Vectors:A Laboratory Manual.New York:W.H.Freeman)。バキュロウイルス発現系の利点は、とりわけ、発現されるタンパク質がたいてい可溶性であり、正しく折りたたまれており、生物学的に活性であるということである。さらなる利点には、高いタンパク質発現レベル、より速い生成、大きなタンパク質の発現への適合性及び大規模生成への適合性が含まれる。しかし、昆虫細胞バイオリアクターでバキュロウイルス系を使用した異種タンパク質の大規模又は連続生成において、通過効果としても知られる生成レベルの不安定性は主要な障害である。この効果は、少なくとも一部、バキュロウイルスDNAにおける反復相同配列の間の組換えによる。
バキュロウイルス発現系は、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターの生成のためにも首尾よく使用されている(Urabeら、2002年、Hum.Gene Ther.13:1935~1943頁;米国特許第6,723,551号及び米国特許出願公開第20040197895号)。AAVは、ヒト遺伝子療法のための最も有望なウイルスベクターのうちの1つと考えることができる。今日まで、研究及び臨床グレードのAAV材料を届けることが可能な主要生成系として、2つのプラットホームが現れている。いずれの場合も、レプリカーゼ(Rep、DNA複製及びパッケージングタンパク質)及びカプシド(Cap、構造タンパク質)コード遺伝子を含む発現カセットが、AAV2逆方向末端反復配列(ITR)に隣接するto-be-packaged導入遺伝子と一緒にプロデューサー細胞へ送達される。1つのアプローチは、それらの成分を送達してAAVを生成するために、Hek293細胞へのプラスミドの一時的化学的トランスフェクションに依存する。第2のアプローチでは、バキュロウイルス発現ベクター(BEV)は、これらの成分を無脊椎動物細胞の懸濁培養へ送達する。rAAVのための哺乳動物細胞をベースとした生成系は高力価のAAV材料を生成することができるが、それはスケールアップのためにより好適でない。これは大部分はプラスミド生成の高い費用並びにHek293細胞を懸濁液での増殖及びAAV生成に適合させる必要性のためであり、それでも、収量は昆虫細胞と同じオーダーではない。対照的に、バキュロウイルスは、一旦産生されて特徴付けられると、AAV生成のための接種の前に昆虫細胞と一緒に増幅させ、懸濁液で増殖させることができるので、BEV生成系はrAAV生成のためのよりスケーラブルなプラットホームを提供する。一般に、細胞あたりの収量は懸濁昆虫細胞及び接着性Hek293細胞で同等である。
昆虫細胞でrAAVを生成するために最も頻繁に使用される方法は、3つの別々のバキュロウイルスの共感染を通すもの、TripleBac系である。これらのバキュロウイルスは、Rep、Cap及び導入遺伝子(Trans)発現カセットをそれぞれ含む。rAAV生成の間に3つのバキュロウイルスの共感染を使用することの主要な欠点は、非同時感染が起こる可能性があることである。本明細書でDuoBac系(各ベクターはCapとRep又はCapとTransを含有する、図1)と呼ばれる、各々二重発現カセットを含有するバキュロウイルスベクターを作製することによって、rAAV生成のために必要とされる異なるバキュロウイルスのベクターの数を低減することができ、それによって同時感染の可能性を向上させる。プロセスの複雑性のこの低減は、いくつかの潜在的利益を有する:1.汚染のより低いリスク;2.未精製の溶解物バルク(CLB)における平均してより高いAAV収量;3.より頑強なバキュロウイルスMOI応答;4.アップスケールとの適合性の増加;5.1つ少ない種ウイルスが必要とされるのでより低い商品費用;及び6.AAVバッチの全体/完全の比の低減。良好なAAV生成のために必要とされる分子成分が正しい時間に細胞中に存在する可能性がより高いので、全てのこれらの利点がもたらされる。
昆虫細胞でバキュロウイルスを使用するAAV生成のために、Cap及びRepタンパク質発現を時間及び量の両面で最適化することは、生成されるAAVの量と質のためにきわめて重要である。以前、初期のRep78発現(複製Rep)及び後期のRep52発現(パッケージングRep)が、生成されたAAVの品質を向上させたことが観察された(米国特許第8,697,417号)。感染の異なる相で活性になる異なるバキュロウイルスプロモーターを利用することによって、発現のタイミングの制御を行使することができる(Chaabihi、H.ら、1993年、J Virol 67(5)、2664~71頁;Hill-Perkins、M.S.及びPossee、R.D.、1990年、J Gen Virol 71(4)、971~6頁;Pullen、S.S.及びFriesen、P.D.、1995年、J Virol 69(1)、156~65頁)。前初期(IE)プロモーターは、バキュロウイルス感染の初期の感染直後に活性であるが、その後減退する。p10及びポリヘドリンプロモーターは両方とも強力であるが最後期プロモーターであり、ピークの発現は感染の20~24時間後に観察される。Rep52及びRep78発現カセットを分離し、それらの発現を異なるプロモーターで制御することによって、本発明者はRepタンパク質の個々の強度及びタイミングのより優れた制御を有し、それによって生成されるAAVの品質を向上させる。さらに、国際出願2007/148971において、本発明者らは、Rep78及びRep52タンパク質に単一のコード配列を使用することで、昆虫細胞におけるrAAVベクター生成の安定性を有意に向上させており、ここでは、Rep78タンパク質に、スキャニングするリボソームによって部分的にスキップされる最適以下の開始コドンを使用することで、さらに下流のRep52タンパク質の開始コドンでも翻訳の開始が起こることを可能にしている。国際出願2009/014445では、昆虫細胞におけるrAAVベクター生成の安定性は、Rep52及びRep78のために別々の発現カセットを用いることによって再びさらに向上され、ここでは反復コード配列は相同組換えを低減するためにコドンバイアスが異なる。
カプシドタンパク質(VP1、VP2及びVP3)の化学量は、1:1:10の天然の比にできるだけ接近する必要がある。一旦カプシドが細胞に入ると、VP1はホスホリパーゼA2活性を有し、エンドソームエスケープのために必須である。この比がその最適値から外れる場合、カプシドはより強力でなくなり、例えば、低いVP1は感染性の劣化(細胞侵入及び導入遺伝子発現で測定される)に一般的につながるが、高力価AAV生成(gc/ml)をもたらす。選択されたカプシドプロモーターとVP1開始コドンの組合せはこの比に対して最も大きい影響を一緒に発揮し、個々のAAV血清型のために最適化する必要性がある。異なるプロモーター強度及びVP1開始コドンを混合することで、生成されるカプシドのVP1:2:3の比、及びそれによってその力価を変更することができる(Bosma、B.ら、2018年、Gene Ther 25(6)、415~424頁)。国際出願2007/084773は、昆虫細胞におけるrAAV生成の方法であって、VP2及びVP3に対してVP1を補充することによって、感染性ウイルス粒子の生成を増加させ、方法を開示する。補充は、VP1、VP2及びVP3を発現するヌクレオチド配列を含むカプシドベクターを昆虫細胞に導入し、さらに、同じカプシドベクター上又は異なるベクター上にあってよい、VP1を発現するヌクレオチド配列を、昆虫細胞に導入することによって実施することができる。
過去には、二重発現カセットを含有するバキュロウイルス構築物が、AAV血清型1に関して設計された(国際出願2009/104964)。これらの構築物は向上した全体/完全の比及び正常なカプシド化学量を提示したが、ウイルス収量はTripleBac AAV1生成の概ね3分の1であった。低減した収量の1つの説明は、単一のRep発現カセットの使用による可能性があり、そこでは、発現のタイミング並びにRep52とRep78の比は最適以下だった。これは、おそらく粒子における高い異種(非AAV)DNAカプシド封入及び低収量につながった。したがって、rAAVなどの組換えパルボウイルス遺伝子療法ベクターの品質及び量を向上させるための手段及び方法の必要性がなおある。
第1の態様では、本発明は:i)mRNAをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第1のプロモーターを含む第1の発現カセットであって、細胞におけるその翻訳はパルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つを生成する、第1の発現カセット;ii)mRNAをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第2のプロモーターを含む第2の発現カセットであって、細胞におけるその翻訳はパルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つを生成する、第2の発現カセット;iii)パルボウイルスVP1、VP2及びVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第3のプロモーターを含む第3の発現カセット;並びにiv)少なくとも1つのパルボウイルス逆方向末端反復配列に隣接する導入遺伝子を含むヌクレオチド配列;を含む1つ又は複数の核酸構築物を含む細胞に関し、ここで、第1及び第2の発現カセットのうちの少なくとも1つは、第3の発現カセットと共に第1の核酸構築物に存在し、1つ又は複数の核酸構築物による細胞のトランスフェクションの後、第1のプロモーターは第2及び第3のプロモーターの前に活性である。好ましくは、パルボウイルス逆方向末端反復配列に隣接する導入遺伝子を含むヌクレオチド配列は、第2の核酸構築物の上に存在する。好ましくは、第2の核酸構築物は、パルボウイルスVP1、VP2及びVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第4のプロモーターを含む第4の発現カセットをさらに含み、第1のプロモーターは第2、第3及び第4のプロモーターの前に活性であり、任意選択で、第3及び第4のプロモーターは同一であり、任意選択で、第3及び第4の発現カセットのヌクレオチド配列によってコードされるパルボウイルスVP1、VP2及びVP3カプシドタンパク質は同一である。
好ましい実施形態では、パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つ並びにパルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つは、パルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つの第2のアミノ酸から最もC末端のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む共通のアミノ酸配列を含み、ここで、パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つ並びにパルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つの共通アミノ酸配列は少なくとも90%同一であり、パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列並びにパルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、90%未満同一である。好ましくは、パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つ並びにパルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つの共通アミノ酸配列は少なくとも99%同一であり、好ましくは100%同一である。パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、パルボウイルスRep52及び40のうちの少なくとも1つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と比較して、細胞のための改善されたコドン使用頻度バイアスを有するか、又はパルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と比較して、細胞のための改善されたコドン使用頻度バイアスを有することがさらに好ましく、より好ましくは、パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つ並びにパルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つにおける共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の間のコドン適応指数の差は、少なくとも0.2である。
一実施形態では、第1のプロモーターは構成的プロモーターである。
一実施形態では、第2、第3及び第4のプロモーターのうちの少なくとも1つは、誘導性プロモーターである。好ましくは、誘導性プロモーターは、ウイルス感染周期のより後期に誘導されるウイルスプロモーター、好ましくはウイルスによる細胞のトランスフェクション又は感染の少なくとも24時間後に誘導されるウイルスプロモーターである。
一実施形態では、第1及び第2の核酸構築物のうちの少なくとも1つは、細胞のゲノムに安定して組み込まれている。
好ましい実施形態では、細胞は昆虫細胞であり、ここで、第1及び第2の核酸構築物のうちの少なくとも1つは昆虫細胞適合ベクター、好ましくはバキュロウイルスベクターである。好ましくは昆虫細胞では、a)第1のプロモーターは、deltaElプロモーター及びElプロモーターから選択され;b)第2、第3及び第4のプロモーターはpolHプロモーター及びp10プロモーターから選択される。より好ましくは、昆虫細胞では、少なくとも1つの発現カセットは、少なくとも1つのバキュロウイルスエンハンサーエレメント及び/又は少なくとも1つのエクジソン応答エレメントを含み、ここで、好ましいエンハンサーエレメントは、hr1、hr2、hr2.09、hr3、hr4、hr4b及びhr5からなる群から選択され、好ましくは群hr2.09、hr4b及びhr5から選択される。
一実施形態では、細胞におけるその翻訳はパルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つだけを生成するmRNAをコードするヌクレオチド配列は、無傷(intact)のパルボウイルスp19プロモーターを含む。
好ましい実施形態では、パルボウイルスRep 78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つ、パルボウイルスRep 52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つ、パルボウイルスVP1、VP2及びVP3カプシドタンパク質並びに少なくとも1つのパルボウイルス逆方向末端反復配列は、アデノ随伴ウイルス(AAV)に由来する。
一実施形態では、第1の核酸構築物はDuoBac CapRep6(配列番号10)であり、第2の核酸構築物はDuoBac CapTrans1(配列番号12)であり、ここで、第1及び第2の構築物は好ましくは3:1のモル比で存在する。
第2の態様では、本発明は細胞で組換えパルボウイルスビリオンを生成する方法であって、a)本明細書で規定される細胞を組換えパルボウイルスビリオンが生成される条件下で培養するステップ;及びb)組換えパルボウイルスビリオンを回収するステップを含む方法に関する。好ましくは、本方法では、細胞は昆虫細胞であり、及び/又はパルボウイルスビリオンはAAVビリオンである。好ましい方法では、ステップb)の組換えパルボウイルスビリオンの回収は、固定化抗パルボウイルス抗体、好ましくは単鎖ラクダ抗体若しくはその断片を使用した、ビリオンの親和性精製、又は30~70nmの名目孔径を有するフィルターでの濾過のうちの少なくとも1つを含む。
第3の態様では、本発明は本明細書で規定される核酸構築物に、具体的には本明細書で規定される第1及び第2の核酸構築物に関する。
第4の態様では、本発明は、少なくとも本明細書で規定される第1及び第2の核酸構築物を含むパーツのキット(kit of parts)に関する。
定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語は、本開示が属する分野の当業技術者が通常理解するのと同じ意味を有する。当業技術者は、本発明の実施で用いることができるであろう、本明細書に記載されるものに類似しているか又は同等の多くの方法及び材料を理解しよう。実際、本発明は、この方法にいかなる場合も限定されない。
特に定義されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語は、本開示が属する分野の当業技術者が通常理解するのと同じ意味を有する。当業技術者は、本発明の実施で用いることができるであろう、本明細書に記載されるものに類似しているか又は同等の多くの方法及び材料を理解しよう。実際、本発明は、この方法にいかなる場合も限定されない。
この文書及びその請求項では、動詞「含む」及びその活用形は、単語に続く項目が含まれるが、具体的に指摘されていない項目は排除されないことを意味するために、その非限定的な意味で使用される。さらに、不定冠詞「a」又は「an」によるエレメントへの言及は、エレメントが1つ及びわずか1つあることを文脈が明らかに要求しない限り、そのエレメントが複数存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「a」又は「an」は、通常「少なくとも1つ」を意味する。
本明細書で使用されるように、用語「及び/又は」は、明記される事例のうちの1つ若しくは複数が単独で、又は明記される事例のうちの少なくとも1つからその全てと共に起こることができることを示す。
本明細書で使用されるように、「少なくとも」特定の値は、その特定の値又はそれ以上を意味する。例えば、「少なくとも2つ」は「2つ又はそれ以上」と同じであること、すなわち、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15等であると理解される。
単語「約」又は「概ね」は、数値に関連して使用される場合(例えば約10)、好ましくはその値が、その値から0.1%大きいか又は小さい所与の値(10)であってよいことを意味する。
この文書に記載の医薬としての物質の使用は、医薬の製造における前記物質の使用と解釈することもできる。同様に、物質が治療のために、又は医薬として使用されるときはいつでも、それは治療のための医薬の製造のために使用することもできる。本明細書に記載される医薬用の製品は、治療方法で使用することができ、ここで、そのような治療方法は、使用のための本製品の投与を含む。
用語「相同性」、「配列同一性」などは、本明細書で互換的に使用される。本明細書で配列同一性は、配列の比較によって決定される、2つ以上のアミノ酸(ポリペプチド又はタンパク質)配列又は2つ以上の核酸(ポリヌクレオチド)配列の間の関係と規定される。当技術分野で、「同一性」は、アミノ酸又は核酸配列の間の配列関係の程度であって、場合によっては、そのような配列のストリングの間の一致によって決定される、配列関係の程度も意味する。2つのアミノ酸配列の間の「類似性」は、1つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換を第2のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。「同一性」及び「類似性」は、公知の方法によって容易に計算することができる。
「配列同一性」及び「配列類似性」は、2つの配列の長さによってグローバル又はローカルアラインメントアルゴリズムを使用して、2つのペプチド又は2つのヌクレオチド配列のアラインメントによって決定することができる。類似の長さの配列は、好ましくは全長にわたって最適に配列をアラインメントさせるグローバルアラインメントアルゴリズム(例えば、Needleman Wunsch)を使用してアラインメントされ、実質的に異なる長さの配列は好ましくはローカルアラインメントアルゴリズム(例えば、Smith Waterman)を使用してアラインメントされる。配列は、それらが(例えばデフォルトパラメータを使用したプログラムGAP又はBESTFITによって最適にアラインメントされるとき)少なくともある特定の最小限のパーセンテージの配列同一性を共有するならば(下で規定される)、「実質的に同一である」又は「本質的に類似している」と呼ぶことができる。GAPはNeedleman及びWunschのグローバルアラインメントアルゴリズムを使用して、2つの配列をそれらの全長(完全長)にわたってアラインメントさせ、一致の数を最大にし、ギャップの数を最小にする。グローバルアラインメントは、好適には2つの配列が類似の長さを有するときに配列同一性を決定するために使用される。一般的に、GAPのデフォルトパラメータが使用され、ギャップ形成ペナルティ=50(ヌクレオチド)/8(タンパク質)、及びギャップ伸張ペナルティ=3(ヌクレオチド)/2(タンパク質)である。ヌクレオチドの場合、使用されるデフォルトスコアリングマトリックスはnwsgapdnaであり、タンパク質の場合、デフォルトスコアリングマトリックスはBlosum62(Henikoff & Henikoff、1992年、PNAS 89、915~919頁)である。パーセンテージ配列同一性のための配列アラインメント及びスコアは、Accelrys社、9685 ScrantonRoad、San Diego、CA 92121-3752 USAから入手可能であるGCG Wisconsin Package、バージョン10.3などのコンピュータプログラムを使用して、又は、上のGAPと同じパラメータを使用した、若しくはデフォルト設定(「needle」及び「water」の両方、並びにタンパク質及びDNAアラインメントの両方のために、デフォルトのギャップオープニングペナルティは10.0であり、デフォルトのギャップ伸張ペナルティは0.5である;デフォルトスコアリングマトリックスはタンパク質ではBlossum62、DNAではDNAFullである)を使用したEmbossWINバージョン2.10.0の中のプログラム「needle」(グローバルNeedleman Wunschアルゴリズムを使用)又は「water」(ローカルSmith Watermanアルゴリズムを使用)などのオープンソースソフトウェアを使用して、決定することができる。配列が実質的に異なる全長を有するとき、Smith Watermanアルゴリズムを使用したものなどのローカルアラインメントが好ましい。
或いは、パーセンテージ類似性又は同一性は、FASTA、BLAST等などのアルゴリズムを使用して公開データベースに対して検索することによって決定することができる。したがって、本発明の核酸及びタンパク質配列は、例えば他のファミリーメンバー又は関連配列を同定するために公開データベースに対して検索を実行するための「クエリー配列」としてさらに使用することができる。そのような検索は、Altschulら(1990年)J.Mol.Biol.215:403~10頁、のBLASTn及びBLASTxプログラム(バージョン2.0)を使用して実行することができる。本発明の酸化還元酵素核酸分子に相同的なヌクレオチド配列を得るために、BLASTヌクレオチド検索をNBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12で実行することができる。本発明のタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得るために、BLASTタンパク質検索をBLASTxプログラム、スコア=50、ワード長=3で実行することができる。比較目的のためにギャップアラインメントを得るために、Altschulら、(1997年)Nucleic Acids Res.25(17):3389~3402頁に記載されているようにGapped BLASTを利用することができる。BLAST及びGapped BLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム(例えば、BLASTx及びBLASTn)のデフォルトパラメータを使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/のNational Center for Biotechnology Informationのホームページを参照する。
本明細書で使用される用語「選択的にハイブリダイズしている」、「選択的にハイブリダイズする」及び類似の用語は、少なくとも66%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%又はより好ましくは少なくとも99%互いに相同的であるヌクレオチド配列が、一般的に互いとハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を記載するものである。すなわち、そのようなハイブリダイズする配列は、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%、又はより好ましくは少なくとも99%の配列同一性を共有することができる。
そのようなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、約45℃の6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)でのハイブリダイゼーションと、続く約50℃、好ましくは約55℃、好ましくは約60℃、さらにより好ましくは約65℃の1×SSC、0.1%SDSでの1回又は複数回の洗浄である。
高ストリンジェント条件には、例えば、約68℃の5×SSC/5×デンハート液/1.0%SDSでのハイブリダイゼーション及び室温の0.2×SSC/0.1%SDSでの洗浄が含まれる。或いは、洗浄は42℃で実行することができる。
当業者であれば、ストリンジェントな及び高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件にどのような条件を適用するべきかについて認識しているであろう。そのような条件に関する追加の指針は、当技術分野で、例えばSambrookら、1989年、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press、N.Y.;及び、Ausubelら(編)、Sambrook及びRussell(2001年)「Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版)、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York 1995年、Current Protocols in Molecular Biology、(John Wiley & Sons、N.Y.)で直ちに入手できる。
当然ながら、ポリA配列(mRNAの3’末端のポリ(A)路など)だけ、又は相補的なT(又はU)残基の区間だけとハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部に特異的にハイブリダイズするために使用される本発明のポリヌクレオチドに含まれない。その理由は、そのようなポリヌクレオチドはポリ(A)区間又はその相補鎖を含有するあらゆる核酸分子(例えば、実際上あらゆる二本鎖cDNAクローン)にハイブリダイズするからである。
本明細書において「核酸構築物」又は「核酸ベクター」は、組換えDNA技術の使用からもたらされる人工核酸分子を意味すると理解される。したがって、用語「核酸構築物」は天然に存在する核酸分子を含まないが、核酸構築物は天然に存在する核酸分子の(一部)を含むことができる。「ベクター」は、外因性核酸配列(すなわち、DNA又はRNA)を宿主細胞に移す役目をする核酸構築物(一般的にDNA又はRNA)である。用語「発現ベクター」又は「発現構築物」は、そのような配列に適合する宿主細胞又は宿主生物体における遺伝子の発現に影響を及ぼすことが可能であるヌクレオチド配列を指す。これらの発現ベクターは、発現させる生成物をコードする配列の発現に影響を及ぼすことが可能な機能的単位である少なくとも1つの「発現カセット」を一般的に含み、ここで、コード配列は、好適な転写調節配列及び任意選択で3’転写終結シグナルを少なくとも含む適当な発現制御配列に作動可能に連結される。発現エンハンサーエレメントなどの、発現に影響を及ぼすことで必要であるか又は役に立つ追加の因子が存在してもよい。発現ベクターは好適な宿主細胞に導入され、宿主細胞のin vitro細胞培養においてコード配列の発現に影響を及ぼすことができる。発現ベクターは、ウイルスベクター、特に組換えAAVベクター、本発明の宿主細胞又は生物体における複製のために好適である。
本明細書で使用されるように、用語「プロモーター」又は「転写調節配列」は、1つ又は複数のコード配列の転写を制御する働きをする核酸断片を指し、コード配列の転写開始部位の転写の方向に関して上流に位置し、DNA依存性RNAポリメラーゼのための結合部位、転写開始部位、並びに転写因子結合部位、リプレッサー及び活性化タンパク質結合部位を限定されずに含む、任意の他のDNA配列、及びプロモーターからの転写の量を調節するために直接的又は間接的に作用することが当業者に公知であるヌクレオチドの任意の他の配列の存在によって構造的に同定される。「構成的」プロモーターは、ほとんどの生理的及び発達条件下でほとんどの組織において活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、例えば化学的インデューサー又は生物学的実体の適用によって、生理的に又は発達上調節されるプロモーターである。
用語「レポーター」はマーカーと互換的に使用することができるが、それは緑色蛍光性タンパク質(GFP)又はルシフェラーゼなどの可視マーカーを指すために主に使用される。
用語「タンパク質」又は「ポリペプチド」は互換的に使用され、特異的作用様式、サイズ、三次元構造又は起源に関係なく、アミノ酸の鎖からなる分子を指す。
用語「遺伝子」は、好適な調節領域(例えばプロモーター)に作動可能に連結された、細胞中でRNA分子(例えばmRNA)に転写される領域(転写される領域)を含むDNA断片を意味する。遺伝子は、いくつかの作動可能に連結される断片、例えばプロモーター、5’リーダー配列、コード領域及びポリアデニル化部位を含む3’非翻訳配列(3’末端)を通常含む。「遺伝子の発現」は、適当な調節領域、特にプロモーターに作動可能に連結されるDNA領域が、生物学的に活性である、すなわち生物学的に活性なタンパク質又はペプチドに翻訳することが可能であるRNAに転写されるプロセスを指す。
所与の(組換え)核酸又はポリペプチド分子と所与の宿主生物体又は宿主細胞の間の関係を示すために使用されるときの用語「同種」は、天然では核酸又はポリペプチド分子が同じ種、好ましくは同じ変種又は系統の宿主細胞又は生物体によって生成されることを意味すると理解される。宿主細胞と同種である場合、ポリペプチドをコードする核酸配列は、一般的に(しかし、必ずしもそうとは限らない)、その天然の環境におけるより別の(異種の)プロモーター配列に、及び適用可能であるならば別の(異種の)分泌シグナル配列及び/又はターミネーター配列に作動可能に連結される。調節配列、シグナル配列、ターミネーター配列等が宿主細胞と同種であってもよいと理解される。これに関連して、「同種」配列エレメントだけの使用は、「自己クローン」遺伝子改変生物体(GMO)(欧州指令98/81/EC Annex IIの通り自己クローニングは本明細書で規定されている)の構築を可能にする。2つの核酸配列の関係を示すために使用される場合、用語「相同的」は、1つの一本鎖核酸配列が相補的一本鎖核酸配列にハイブリダイズすることができることを意味する。ハイブリダイゼーションの程度は、配列間の同一性の量、並びに後で議論される温度及び塩濃度などのハイブリダイゼーション条件を含むいくつかの因子に依存し得る。
核酸(DNA又はRNA)又はタンパク質に関して使用されるときの用語「異種」及び「外因性」は、それが存在する生物体、細胞、ゲノム又はDNA又はRNA配列の一部として天然に存在しないか、又は、それが天然に見出されるものと異なる細胞又はゲノム若しくはDNA若しくはRNA配列中の位置(複数可)で見出される核酸又はタンパク質を指す。異種及び外因性の核酸又はタンパク質は、それらが導入される細胞に内因性でないが、別の細胞から得られたか、又は合成的に若しくは組換えで生成される。そうとは限らないが一般的に、そのような核酸は、DNAが転写又は発現される細胞によって通常生成されないタンパク質、すなわち外因性タンパク質をコードする。同様に、外因性RNAは、外因性RNAが存在する細胞で通常発現されないタンパク質をコードする。異種/外因性の核酸及びタンパク質は、外来の核酸又はタンパク質と呼ぶこともできる。発現される細胞にとって外来であると当業者が認識するであろう、いずれの核酸又はタンパク質も、本明細書において異種又は外因性の核酸又はタンパク質という用語に包含される。異種及び外因性という用語は、核酸又はアミノ酸配列の非天然の組合せ、すなわち組合せ配列の少なくとも2つが相互に外来である組合せにも適用される。
本明細書で使用されるように、生物体に関して使用されるときの用語「天然に存在しない」は、その生物体が、参照される種の野生系統を含む参照される種の天然に存在する系統において通常見出されない少なくとも1つの遺伝子変化を有することを意味する。遺伝子変化には、例えば、タンパク質若しくは酵素をコードする発現可能な核酸を導入する改変、他の核酸付加、核酸欠失、核酸置換、又は生物体の遺伝物質の他の機能的破壊が含まれる。そのような改変には、例えば、参照される種のための異種又は同種ポリペプチドのコード領域及びその機能的断片が含まれる。追加の改変には、例えば、その改変が遺伝子又はオペロンの発現を変更する非コード調節領域が含まれる。酵素をコードする核酸分子又はその機能的断片への遺伝子改変は、生化学的反応能力又は代謝経路能力を、その天然に存在する状態から変更される天然に存在しない生物体に付与することができる。
本明細書で使用される、用語「作動可能に連結された/されている」は、ポリヌクレオチド(又は、ポリペプチド)エレメント同士の機能的関係での連結を指す。核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれるとき、「作動可能に連結されている」。例えば、転写調節配列は、コード配列の転写に影響を及ぼす場合は、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されているとは、連結されているDNA配列が一般的に連続していること、及び2つのタンパク質コード領域を接続する必要がある場合、連続し、読み枠の中にあることを意味する。
「発現カセット」は、発現制御配列及び発現させる核酸配列を含む核酸配列を指す。
「発現制御配列」又は「調節制御配列」は、それが作動可能に連結されるヌクレオチド配列の発現を調節する核酸配列を指す。
発現制御配列は、それがヌクレオチド配列の転写及び/又は翻訳を制御及び調節するとき、ヌクレオチド配列に「作動可能に連結されている」。したがって、発現制御配列は、プロモーター、エンハンサー、リボソーム内部進入部位(IRES)、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン、イントロンのためのスプライシングシグナル及び終止コドンを含むことができる。
用語「発現制御配列」は、最小限、その存在が発現に影響するように設計される配列を含むものであり、追加の有益な成分を含むこともできる。例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列は発現制御配列である。本用語は、枠の内外の望ましくない潜在的開始コドンが配列から除去されるような核酸配列の設計を含むこともできる。それは、望ましくない潜在的スプライス部位が除去されるような核酸配列の設計を含むこともできる。それは、ポリAテール、すなわちポリA配列と呼ばれる配列であるmRNAの3’末端のアデニン残基のストリングの追加を指示する配列又はポリアデニル化配列(pA)を含む。それは、mRNAの安定性を増強するように設計することもできる。転写及び翻訳の安定性に影響を及ぼす発現制御配列、例えばプロモーター、並びに翻訳に影響を及ぼす配列、例えばコザック配列は昆虫細胞で公知である。発現制御配列は、より低い発現レベル又はより高い発現レベルが達成されるように、それが作動可能に連結されるヌクレオチド配列をモジュレートするような性質であってよい。
用語「完全ビリオン」は、逆方向末端反復(ITR)配列に隣接する導入遺伝子DNAを封入するパルボウイルス構造/カプシドタンパク質(VP1:2:3)を含むビリオン粒子を指す。用語「空のビリオン」は、パルボウイルスゲノム物質を含まないビリオン粒子を指す。本発明の好ましい実施形態では、完全ビリオン対空のビリオンの比は、少なくとも1:50、より好ましくは少なくとも1:10、さらにより好ましくは少なくとも1:1である。さらにより好ましくは、空のビリオンは検出することができず、最も好ましくは空のビリオンは存在しない。当業者であれば、ビリオンにつき1ゲノムコピーだけが存在するので、例えば、遺伝子コピー数を集められたAAVカプシド数による全粒子で割ることによって(又は、全ての集めたカプシド:ゲノムコピー数)完全ビリオン対空のビリオンの比を決定する方法を認識しているであろう。当業者であれば、そのような比を決定する方法を認識しているであろう。例えば、空のビリオン対全カプシドの比は、ゲノムコピーの量(すなわちゲノムコピー数)を全パルボウイルス粒子の量(すなわちパルボウイルス粒子の数)によって割ることによって決定することができ、ここで、mlあたりのゲノムコピーの量は定量的PCRによって測定され、mlあたりの全パルボウイルス粒子の量は、例えばProgenからの酵素免疫測定法で測定される。
本明細書で使用される用語「TripleBac」は、3つの別々のバキュロウイルスベクター、すなわちそれぞれRep、Cap及びTrans発現カセットの各々のための3つの異なるバキュロウイルスベクターの共感染を必要とする昆虫細胞でrAAVを生成するためのバキュロウイルスベクターの系を指す。本明細書で使用される用語「DuoBac」は、2つの異なるバキュロウイルスベクターだけを使用する系を指し、そのうちの1つは2つの発現カセットを含む、例えば、Cap及びRep発現カセットを含むか又はCap及びTransカセットを含む。本明細書で使用される用語「DuoDuoBac」は、その各々は少なくとも2つの異なる発現カセットを含む2つの異なるバキュロウイルスベクターを使用する系を指し、例えば、1つのベクターはCap及びRepカセットを含み、他のベクターはCap及びTransカセットを含む。
[発明の詳細な説明]
パルボウイルス、すなわちAAV、構造及び非構造タンパク質の間の発現動態及び比は、特にバキュロウイルス及び昆虫細胞プラットホームを使用した生成プラットホームからのベクター生成の収量及び品質にとって重要である。ベクター品質は完全ビリオンと空のビリオンの間の比に強く関連し、それはベクター自体の効力に寄与する。
パルボウイルス、すなわちAAV、構造及び非構造タンパク質の間の発現動態及び比は、特にバキュロウイルス及び昆虫細胞プラットホームを使用した生成プラットホームからのベクター生成の収量及び品質にとって重要である。ベクター品質は完全ビリオンと空のビリオンの間の比に強く関連し、それはベクター自体の効力に寄与する。
本発明者は、中でも1)2つのDuoBacベクター、すなわちCap-Repバキュロウイルスベクター及びCap-Transバキュロウイルスベクターを使用すること(「DuoDuoBac」AAV生成と呼ばれる、図1を参照する)、2)プロモーター/VP1開始コドン組合せを最適化すること、及び3)単一のRep発現カセットを二重Rep発現カセットに換えることのうちの1つ又は複数によって、昆虫細胞でバキュロウイルスベクターからのrAAVの生成をさらに最適化した。Cap-RepバキュロウイルスベクターがCap-Transバキュロウイルスベクターと組み合わされるDuoDuoBac系を使用することの利点は、AAV生成の間のCap:Rep比のより多くの制御が達成されることである。以前のTripleBac AAV生成実験は、Cap:Repバキュロウイルス接種比を変更することが、全体/完全の比及びAAV収量(gc/ml)に影響を及ぼすことを示した。
本発明者は、rAAV生成の間にRepの量を増加させることは、カプシド形成及び全体/完全の比を抑制するが、Capの量を増加させることは全体/完全の比並びに収量を増加させることを見出した。上記のように、全体/完全の比はAAVバッチを特徴付けるために使用することができる1つのパラメータであることが当業者にわかるだろう。全体/完全の比は、本明細書で使用されるように、DNAで満たされたAAV粒子(gc/mlで表される)のAAV粒子の総数(VP/mlで表される)に対する比を指す。その結果として、より低い全体/完全の比は完全な粒子あたりのより少ない空粒子を意味し、逆も同じである。1キログラムあたり類似の量のゲノムコピーを達成するためにより少ない粒子を投薬することができるので、生成されるAAVの全体/完全の比を低減することは、AAV生成物のために潜在的に有益である可能性がある。低い全体/完全の比は、頑強な下流プロセスの設定のために有益であるより均一な生成プロファイルをももたらす。
さらに、接種のためのバキュロウイルスの数が低減されるので、TripleBac系では通常接種することができないより高いCap:Rep比を探ることができる。TripleBac系では、接種されるバキュロウイルスの数の低減は、生成培養に加えられる全体のバキュロウイルス量もより低いことを意味する。AAV生成に高い接種量を加えることが望ましくなかったことは、当業者に公知である。第1に、多量のバキュロウイルスを頑強に生成することが困難であるからであり、第2に、AAV生成に多量のバキュロウイルスを加えることは生成を阻害するからである。これは、とりわけ、生成培養への多量の使用済み培地の追加のためであると考えられている。
第1の態様では、したがって本発明は:i)mRNAをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第1のプロモーターを含む第1の発現カセットであって、細胞におけるその翻訳はパルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つを生成する、第1の発現カセット;ii)mRNAをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第2のプロモーターを含む第2の発現カセットであって、細胞におけるその翻訳はパルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つを生成する、第2の発現カセット;iii)パルボウイルスVP1、VP2及びVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第3のプロモーターを含む第3の発現カセット;並びにiv)少なくとも1つのパルボウイルス逆方向末端反復配列に隣接する導入遺伝子を含むヌクレオチド配列、を含む1つ又は複数の核酸構築物を含む細胞であって、第1及び第2の発現カセットのうちの少なくとも1つは、第3の発現カセットと共に第1の核酸構築物に存在し、1つ又は複数の核酸構築物による細胞のトランスフェクションの後、第1のプロモーターは第2及び第3のプロモーターの前に活性である、細胞を提供する。細胞は好ましくは、例えば本明細書で下に規定されるような昆虫細胞である。その翻訳はパルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つ又はパルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つを生成するmRNAをコードするヌクレオチド配列は、好ましくは本明細書で下に記載されるヌクレオチド配列である。パルボウイルスVP1、VP2及びVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、好ましくは本明細書で下に記載されるヌクレオチド配列である。1つ又は複数のパルボウイルス逆方向末端反復配列に隣接する導入遺伝子を含むヌクレオチド配列は、下でさらに詳細に記載される。したがって、第1の核酸構築物は、好ましくは第1、第2及び第3の発現カセットの各々を含む単一のタイプの核酸構築物である。一実施形態では、第1の核酸構築物は、1つ又は複数のパルボウイルス逆方向末端反復に隣接する導入遺伝子を含まない。
したがって、一実施形態では、パルボウイルス逆方向末端反復配列に隣接する導入遺伝子を含むヌクレオチド配列は、第2の核酸構築物の上に存在する。第2の核酸構築物は、好ましくは第1の核酸構築物と異なる。
好ましい実施形態では、第2の核酸構築物は、パルボウイルスVP1、VP2及びVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第4のプロモーターを含む第4の発現カセットをさらに含み、第1のプロモーターは第2、第3及び第4のプロモーターの前に活性である。好ましくは、第3及び第4の発現カセットのヌクレオチド配列によってコードされるパルボウイルスVP1、VP2及びVP3カプシドタンパク質は同一である。第3及び第4のプロモーターは同一であってよいか又はそれらは異なるプロモーターであってもよい。
本発明の構築物で第1、第2、第3及び/又は第4のプロモーターとして適用される好適なプロモーターは、下でより詳細に記載される。
レプリカーゼタンパク質
パルボウイルス、特にAAVのレプリカーゼ、すなわちRepタンパク質は、rep遺伝子カセットによってコードされる非構造タンパク質である。内因性のP19プロモーターのために、この遺伝子は長さの異なる2つの重複するメッセンジャーリボ核酸(mRNA)を生成する。これらのmRNAの各々は、スプライスアウトすることができるか、又は最終的に4つのRepタンパク質、Rep78、Rep68、Rep52及びRep40を生成させないことができる。Rep78/68及びRep52/40は、ITR依存性AAVゲノム又は導入遺伝子複製及びウイルス粒子アセンブリにとって重要である。Rep78/68はウイルス複製イニシエータタンパク質の役割をし、ウイルスゲノムのためのレプリカーゼとして作用する(Chejanovsky、N.、Carter、B.J.。Mutation of a consensus purine nucleotide consensus binding site in the adeno-associated virus rep gene generates a dominant negative phenotype for DNA replication、J Virol.、1990年、64:1764~1770頁、Hong、G.、Ward、P.、Berns、K.I.、In vitro replication of adeno-associated virus DNA、Proc Natl Acad Sci USA、1992年、89:4673~4677頁。Ni.T-H.ら、In vitro replication of adeno-associated virus DNA、J Virol.、1994年、68:1128~1138頁)。Rep52/40タンパク質は3’から5’への極性を有するDNAヘリカーゼであり、空のカプシドへのウイルスDNAのパッケージングの間に決定的な役割を演じ、ここでそれらはパッケージング運動複合体の一部であると考えられている(The Rep52 Gene Product of Adeno-Associated Virus Is a DNA Helicase with 3’-5’ Polarity;Smith及びKotin、J.Virol.、1998年、4874~4881頁、DNA helicase-mediated packaging of adeno-associated virus type2 genomes into preformed capsids。King、J.A.ら、EMBO J.、2001年、20:3282~3291頁)。バキュロウイルス及び昆虫細胞プラットホームからAAVを生成するために、Rep68及びRep40の両方の存在は必要条件でない(Urabe、ら、2002年)。
パルボウイルス、特にAAVのレプリカーゼ、すなわちRepタンパク質は、rep遺伝子カセットによってコードされる非構造タンパク質である。内因性のP19プロモーターのために、この遺伝子は長さの異なる2つの重複するメッセンジャーリボ核酸(mRNA)を生成する。これらのmRNAの各々は、スプライスアウトすることができるか、又は最終的に4つのRepタンパク質、Rep78、Rep68、Rep52及びRep40を生成させないことができる。Rep78/68及びRep52/40は、ITR依存性AAVゲノム又は導入遺伝子複製及びウイルス粒子アセンブリにとって重要である。Rep78/68はウイルス複製イニシエータタンパク質の役割をし、ウイルスゲノムのためのレプリカーゼとして作用する(Chejanovsky、N.、Carter、B.J.。Mutation of a consensus purine nucleotide consensus binding site in the adeno-associated virus rep gene generates a dominant negative phenotype for DNA replication、J Virol.、1990年、64:1764~1770頁、Hong、G.、Ward、P.、Berns、K.I.、In vitro replication of adeno-associated virus DNA、Proc Natl Acad Sci USA、1992年、89:4673~4677頁。Ni.T-H.ら、In vitro replication of adeno-associated virus DNA、J Virol.、1994年、68:1128~1138頁)。Rep52/40タンパク質は3’から5’への極性を有するDNAヘリカーゼであり、空のカプシドへのウイルスDNAのパッケージングの間に決定的な役割を演じ、ここでそれらはパッケージング運動複合体の一部であると考えられている(The Rep52 Gene Product of Adeno-Associated Virus Is a DNA Helicase with 3’-5’ Polarity;Smith及びKotin、J.Virol.、1998年、4874~4881頁、DNA helicase-mediated packaging of adeno-associated virus type2 genomes into preformed capsids。King、J.A.ら、EMBO J.、2001年、20:3282~3291頁)。バキュロウイルス及び昆虫細胞プラットホームからAAVを生成するために、Rep68及びRep40の両方の存在は必要条件でない(Urabe、ら、2002年)。
本発明によれば、細胞は、パルボウイルスRepタンパク質の発現のための少なくとも第1及び第2の発現カセットを含む第1の核酸構築物を含む。第1の発現カセットは、mRNAをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第1のプロモーターを含み、細胞におけるその翻訳はパルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つを生成する。
好ましい実施形態では、第1の発現カセットはmRNAをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第1のプロモーターを含み、細胞におけるその翻訳はパルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つだけを生成する。それによって、パルボウイルスRep78及び/又は68タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、Rep52及び/又は40タンパク質もmRNAから翻訳されるように、部分的エクソンスキップに影響を及ぼす翻訳の最適以下の開始を有しない、パルボウイルスRep78及び/又は68タンパク質のためのオープンリーディングフレームをコードすることが理解される(下を参照する)。細胞におけるその翻訳は本発明で使用するためのパルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つを生成するmRNAをコードする好適なヌクレオチド配列は:a)配列番号18のアミノ酸配列と少なくとも50、60、70、80、88、89、90、95、97、98又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;b)配列番号19の位置11~1876のヌクレオチド配列と少なくとも50、60、70、80、81、82、85、90、95、97、98又は99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列;c)その相補鎖が(a)又は(b)の核酸分子配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列;及びd)遺伝子コードの同義性のためにその配列が(c)の核酸分子の配列と異なるヌクレオチド配列と規定することができる。これらのRep78/60コード配列は、翻訳の最適以下の開始をコードしてもしなくともよいことが理解される。
したがって第1の核酸構築物は、パルボウイルスRep52及び/又は40タンパク質の発現のための第2の発現カセットをさらに含む。第2の発現カセットは、mRNAをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第2のプロモーターであって、細胞におけるその翻訳はパルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つを生成する第2のプロモーターを含む。
好ましい実施形態では、第2の発現カセットはmRNAをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第2のプロモーターを含み、細胞におけるその翻訳はパルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つだけを生成する。それによって、パルボウイルスRep52及び/又は40タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、パルボウイルスRep78及び/又は68タンパク質もコードするより大きなコード配列の一部でないものと理解される。好ましくは、細胞におけるその翻訳はパルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つだけを生成するmRNAをコードするヌクレオチド配列は、パルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つの翻訳開始コドンから最もC末端のアミノ酸までのアミノ酸配列からなるオープンリーディングフレームを含み、より好ましくは、このオープンリーディングフレームはmRNAをコードするヌクレオチド配列に含まれる唯一のオープンリーディングフレームである。細胞におけるその翻訳は本発明で使用するためのパルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つだけを生成するmRNAをコードする好適なヌクレオチド配列は:a)配列番号20のアミノ酸配列と少なくとも50、60、70、80、88、89、90、95、97、98又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;b)配列番号21~25のいずれか1つのヌクレオチド配列と少なくとも50、60、70、80、81、82、85、90、95、97、98又は99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列;c)その相補鎖が(a)又は(b)の核酸分子配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列;及びd)遺伝子コードの同義性のためにその配列が(c)の核酸分子の配列と異なるヌクレオチド配列と規定することができる。
好ましくは、ヌクレオチド配列は、昆虫細胞でのパルボウイルスベクター生成に必要とされ、十分であるパルボウイルスRepタンパク質をコードする。
一実施形態では、Rep78及びRep52翻訳開始部位以外の、Repタンパク質コード配列中の、可能性がある偽の翻訳開始部位は排除される。一実施形態では、昆虫細胞で認識することができる推定上のスプライス部位は、Repタンパク質コード配列から排除される。これらの部位の排除は、当業者であればよく理解するであろう。
さらなる実施形態では、パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つ並びにパルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つは、パルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つの第2のアミノ酸から最もC末端のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む共通アミノ酸配列を含み、パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つ並びにパルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つの共通アミノ酸配列は、少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100%同一であり、パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列並びにパルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、60%未満同一である。
一実施形態では、パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、パルボウイルスRep52及び40のうちの少なくとも1つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と比較して、細胞のための改善されたコドン使用頻度バイアスを有するか、又はパルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と比較して、細胞のための改善されたコドン使用頻度バイアスを有する。さらなる実施形態では、パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つ並びにパルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つにおける共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の間のコドン適応指数の差は、少なくとも0.2である。
共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の宿主細胞のコドン使用頻度への適応性は、コドン適応指数(CAI)で表すことができる。好ましくは、コドン使用頻度は、共通アミノ酸配列を有するRepタンパク質が発現される昆虫細胞に適応させられる。通常、これはスポドプテラ属の細胞、より好ましくはスポドプテラ・フルジペルダ細胞である。したがって、コドン使用頻度は、好ましくはスポドプテラ・フルジペルダ又はオートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス(AcMNPV)感染細胞に適応させられる。コドン適応指数は、本明細書では高度に発現される遺伝子のコドン使用頻度に対する遺伝子のコドン使用頻度の相対的適応性の測定値と規定される。各コドンの相対的適応性(w)は、各コドンの使用頻度の同じアミノ酸のための最も豊富なコドンのそれに対する比である。CAI指数は、これらの相対的適応性の値の幾何平均と規定される。非同義コドン及び終結コドン(遺伝子コードに依存する)は、排除される。CAI値は0~1の範囲内であり、より高い値は最も豊富なコドンのより高い割合を示す(Sharp及びLi、1987年、Nucleic Acids Research 15:1281~1295頁;以下も参照する:Kimら、Gene.1997年、25 199:293~301頁;zur Megedeら、Journal of Virology、2000年、74:2628~2635頁)。
好ましくは、パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つ並びにパルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つにおける共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の間のコドン適応指数の差は、少なくとも0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7又は0.8であり、これにより、より好ましくは、パルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列のCAIは、少なくとも0.5、0.6、0.7、0.8、0.9又は1.0である。
したがって、代わりの実施形態では、パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つ並びにパルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つは、パルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つの第2のアミノ酸から最もC末端のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む共通アミノ酸配列を含み、ここで、パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つ並びにパルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つの共通アミノ酸配列は少なくとも90%同一であり、パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列並びにパルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、90%未満同一であり、パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、パルボウイルスRep52及び40のうちの少なくとも1つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と比較して、細胞のための改善されたコドン使用頻度バイアスを有するか、又はパルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と比較して、細胞のための改善されたコドン使用頻度バイアスを有し、好ましくは、パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つ並びにパルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つにおける共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の間のコドン適応指数の差は、少なくとも0.2である。パルボウイルスRepタンパク質のコドン最適化は、この後さらに詳細に議論される。
パルボウイルスRepタンパク質の温度最適化は、昆虫細胞が増殖する温度及びRepが機能する温度に関して最適な条件の使用を指す。Repタンパク質は例えば37℃で最適に活性であってよく、昆虫細胞は28℃で最適に増殖することができる。Repタンパク質が活性である温度及び昆虫細胞が増殖する温度は、30℃であってよい。好ましい実施形態では、最適化された温度は、27、28、29、30、31、32、33、34又は35℃より高く、及び/又は37、36、35、34、33、32、31、30又は29℃未満である。
当業者に理解されるように、完全ビリオン:空ビリオンの比は、中程度から高いRep発現と比較して減弱したCap発現、例えばより弱いプロモーターによって向上させることもできる。
一実施形態では、細胞におけるその翻訳はパルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つだけを生成するmRNAをコードするヌクレオチド配列は、例えばパルボウイルスRep78及び68タンパク質をコードする天然のパルボウイルスヌクレオチド配列に存在するように無傷のパルボウイルスp19プロモーターを含む。
一実施形態では、第1の核酸構築物中の第1及び第2の発現カセットは、(昆虫)細胞中のRep78のRep52に対する所望のモル比を得るために最適化される。好ましくは、第1の核酸構築物は、(昆虫)細胞で1:10~10:1、1:5~5:1又は1:3~3:1の範囲内のRep78のRep52に対するモル比をもたらす。より好ましくは、第1の核酸構築物は、少なくとも1:2、1:3、1:5又は1:10であるRep78のRep52に対するモル比をもたらす。Rep78及びRep52のモル配分比は、好ましくはRep78及びRep52の共通エピトープを認識するモノクローナル抗体を使用した、又は、例えばマウス抗Rep抗体を使用したウエスタンブロットによって決定することができる(303.9、Progen、Germany;希釈1:50)。
Rep78のRep52に対する所望のモル比は、本明細書の下でさらに記載されるように、それぞれ第1及び第2の発現カセットにおけるプロモーターの選択によって得ることができる。代わりに、又は組合せによって、Rep78のRep52に対する所望のモル比は、パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つの定常状態レベルを低減する手段を用いて得ることができる。
したがって、一実施形態では、パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つのmRNAをコードするヌクレオチド配列は、パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つの低減された定常状態レベルに影響を及ぼす改変を含む。低減された定常状態条件は、例えば、調節エレメント若しくは上流プロモーターをトランケーションすること(Urabeら、前掲、Dongら、前掲)、タンパク質分解シグナルペプチド、例えばPEST若しくはユビキチン化ペプチド配列を加えること、より最適以下のものに開始コドンを置換することによって、又は国際出願2008/024998に記載される人工イントロンの導入によって達成することができる。
好ましい実施形態では、パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つをコードするヌクレオチド配列は、最適以下の翻訳開始コドンから開始するオープンリーディングフレームを含む。最適以下の開始コドンは、好ましくは、部分的エクソンスキップに影響を及ぼす開始コドンである。部分的エクソンスキップは、本明細書ではリボソームの少なくとも一部がRep78タンパク質の最適以下の開始コドンで翻訳を開始しないが、さらに下流の開始コドンで開始することができ、それによって好ましくはさらに下流のこの(第1の)開始コドンはRep52タンパク質の開始コドンであることを意味すると理解される。代わりに、パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つをコードするヌクレオチド配列は、最適以下の翻訳開始コドンから開始するオープンリーディングフレームを含み、さらに下流の開始コドンを有しない。最適以下の開始コドンは、好ましくは昆虫細胞でのヌクレオチド配列の発現の後に部分的エクソンスキップに影響を及ぼす。
本明細書において用語「最適以下の開始コドン」は、トリヌクレオチド開始コドン自体だけでなくその状況も指す。したがって、最適以下の開始コドンは、最適以下の状況、例えば非コザック状況における「最適な」ATGコドンからなることができる。しかし、トリヌクレオチド開始コドン自体が最適以下である、すなわちATGでない、最適以下の開始コドンがより好ましい。最適以下は、本明細書において、正常なATGコドンと比較して、それ以外の点では同一の状況で、翻訳の開始においてそのコドンがより効率的でないことを意味すると理解される。好ましくは、最適以下のコドンの効率は、それ以外は同一の状況での正常なATGコドンの効率の90、80、60、40又は20%未満である。翻訳の開始の相対的効率を比較する方法は、それ自体当業者に公知である。好ましい最適以下の開始コドンは、ACG、TTG、CTG及びGTGから選択することができる。ACGがより好ましい。パルボウイルスRepタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、本明細書において、Rep78及びRep52タンパク質などの昆虫細胞におけるパルボウイルスベクター生成に必要とされ、十分である、非構造Repタンパク質をコードするヌクレオチド配列であると理解される。
カプシドタンパク質
パルボウイルスカプシド(Cap)タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、本明細書において、3つのパルボウイルスカプシドタンパク質、VP1、VP2及びVP3のうちの1つ又は複数をコードするヌクレオチド配列を含むと理解される。パルボウイルスヌクレオチド配列は、好ましくはデペンドウイルスに、より好ましくはヒト又はサルのアデノ随伴ウイルス(AAV)に、最も好ましくはヒト(例えば、血清型1、2、3A、3B、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は13)又は霊長類(例えば、血清型1及び4)に通常感染するAAVに由来し、そのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、参照により完全に本明細書に組み込まれる、Lubelskiら、米国特許出願公開第2017356008号に掲載される。したがって、本発明による核酸構築物は、Lubelskiら、米国特許出願公開第2017356008号に開示されるように、AAVカプシドタンパク質の全オープンリーディングフレームを含むことができる。或いは、配列は人工であってよく、例えば、配列はハイブリッドの形であってよいか、又は例えばAcmNPv若しくはスポドプテラ・フルジペルダのコドン使用によってコドン最適化されてもよい。例えば、カプシド配列はAAV1のVP2及びVP3配列で構成することができ、一方、VP1配列の残りはAAV5のものである。好ましいカプシドタンパク質は、Lubelskiら米国特許出願公開第2017356008号に掲載されるように、配列番号26で提供されるAAV5又はAAV8である。したがって、好ましい実施形態では、AAVカプシドタンパク質は、本発明により改変されたAAV血清型5又はAAV血清型8カプシドタンパク質である。より好ましくは、AAVカプシドタンパク質は、本発明により改変されたAAV血清型5カプシドタンパク質である。カプシドタンパク質の正確な分子量並びに翻訳開始コドンの正確な位置は、異なるパルボウイルスの間で異なることがあると理解される。しかし、当業者であれば、AAV5と別のパルボウイルスからのヌクレオチド配列における対応する位置を同定する方法を認識しているであろう。或いは、AAVカプシドタンパク質をコードする配列は、例えば定方向進化実験の結果としての人工配列である。これは、DNAシャッフリング、変異性PCR、バイオインフォマティクス合理的設計、部位飽和突然変異誘発を通したカプシドライブラリーの作製を含むことができる。生じたカプシドは既存の血清型に基づくが、そのようなカプシドの特徴を向上させる様々なアミノ酸又はヌクレオチド変化を含有する。生じたカプシドは既存の血清型の様々な部分の組合せ、「シャッフルされたカプシド」であってよいか、又は群に組織されるか又は遺伝子若しくはタンパク質の全長に広がっている、完全に新規の変化、すなわち1つ又は複数のアミノ酸若しくはヌクレオチドの付加、欠失若しくは置換を含有することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Schaffer及びMaheshri;Proceedings of the 26th Annual International Conference of the IEEE EMBS San Francisco、CA、USA;2004年9月1~5日、3520~3523頁;Asuriら、2012年、Molecular Therapy 20(2):329~3389頁;Lisowskiら、2014年、Nature 506(7488):382~386頁を参照する。
パルボウイルスカプシド(Cap)タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、本明細書において、3つのパルボウイルスカプシドタンパク質、VP1、VP2及びVP3のうちの1つ又は複数をコードするヌクレオチド配列を含むと理解される。パルボウイルスヌクレオチド配列は、好ましくはデペンドウイルスに、より好ましくはヒト又はサルのアデノ随伴ウイルス(AAV)に、最も好ましくはヒト(例えば、血清型1、2、3A、3B、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は13)又は霊長類(例えば、血清型1及び4)に通常感染するAAVに由来し、そのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、参照により完全に本明細書に組み込まれる、Lubelskiら、米国特許出願公開第2017356008号に掲載される。したがって、本発明による核酸構築物は、Lubelskiら、米国特許出願公開第2017356008号に開示されるように、AAVカプシドタンパク質の全オープンリーディングフレームを含むことができる。或いは、配列は人工であってよく、例えば、配列はハイブリッドの形であってよいか、又は例えばAcmNPv若しくはスポドプテラ・フルジペルダのコドン使用によってコドン最適化されてもよい。例えば、カプシド配列はAAV1のVP2及びVP3配列で構成することができ、一方、VP1配列の残りはAAV5のものである。好ましいカプシドタンパク質は、Lubelskiら米国特許出願公開第2017356008号に掲載されるように、配列番号26で提供されるAAV5又はAAV8である。したがって、好ましい実施形態では、AAVカプシドタンパク質は、本発明により改変されたAAV血清型5又はAAV血清型8カプシドタンパク質である。より好ましくは、AAVカプシドタンパク質は、本発明により改変されたAAV血清型5カプシドタンパク質である。カプシドタンパク質の正確な分子量並びに翻訳開始コドンの正確な位置は、異なるパルボウイルスの間で異なることがあると理解される。しかし、当業者であれば、AAV5と別のパルボウイルスからのヌクレオチド配列における対応する位置を同定する方法を認識しているであろう。或いは、AAVカプシドタンパク質をコードする配列は、例えば定方向進化実験の結果としての人工配列である。これは、DNAシャッフリング、変異性PCR、バイオインフォマティクス合理的設計、部位飽和突然変異誘発を通したカプシドライブラリーの作製を含むことができる。生じたカプシドは既存の血清型に基づくが、そのようなカプシドの特徴を向上させる様々なアミノ酸又はヌクレオチド変化を含有する。生じたカプシドは既存の血清型の様々な部分の組合せ、「シャッフルされたカプシド」であってよいか、又は群に組織されるか又は遺伝子若しくはタンパク質の全長に広がっている、完全に新規の変化、すなわち1つ又は複数のアミノ酸若しくはヌクレオチドの付加、欠失若しくは置換を含有することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Schaffer及びMaheshri;Proceedings of the 26th Annual International Conference of the IEEE EMBS San Francisco、CA、USA;2004年9月1~5日、3520~3523頁;Asuriら、2012年、Molecular Therapy 20(2):329~3389頁;Lisowskiら、2014年、Nature 506(7488):382~386頁を参照する。
本発明の好ましい実施形態では、VP1カプシドタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、ACG、ATT、ATA、AGA、AGG、AAA、CTG、CTT、CTC、CTA、CGA、CGC、TTG、TAG及びGTGからなる群から選択される非正規の翻訳開始コドンから開始する。好ましくは、非正規の翻訳開始コドンは、GTG、CTG、ACG及びTTGからなる群から選択され、より好ましくは非正規の翻訳開始コドンはCTGである。
AAVカプシドタンパク質の発現のための本発明のヌクレオチド配列は、VP1オープンリーディングフレームのヌクレオチド12位のG、ヌクレオチド21位のA、及びヌクレオチド24位のCの中から選択される、AAV VP1カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも1つの改変をさらに好ましくは含み、ここで、ヌクレオチド位置は野生型ヌクレオチド配列のヌクレオチド位置に対応する。「潜在的/可能性がある偽の開始部位」又は「潜在的/可能性がある偽の翻訳開始コドン」は、本明細書において、カプシドタンパク質(複数可)のコード配列に位置するインフレームATGコドンを意味すると理解される。他の血清型のVP1コード配列の中の翻訳のための可能性がある偽の開始部位の排除は、昆虫細胞で認識することができる推定上のスプライス部位の排除のように、当業者に十分に理解される。例えば、ヌクレオチドTは偽のATGコドンを生成しないので、12位のヌクレオチドの改変は組換えAAV5のために必要とされない。パルボウイルスカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の具体的な例は、配列番号27~29で与えられる。本発明のパルボウイルスCap及び/又はRepタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、穏やかな、又は好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号27~29及び21~25のヌクレオチド配列にそれぞれハイブリダイズするそれらの能力によって規定することもできる。
カプシドタンパク質コード配列は、様々な形で存在することがある。例えば、カプシドタンパク質VP1、-2及び-3の各々のための別々のコード配列を使用することができ、それによって、各コード配列は昆虫細胞での発現のための発現制御配列に作動可能に連結される。しかし、より好ましくは、第2の発現カセットは、パルボウイルス(AAV)VP1、VP2及びVP3カプシドタンパク質の全3つをコードする単一のオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列を含み、ここで、VP1カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンは、例えばUrabeら(2002年、前掲)及び国際出願2007/046703に記載されるように、ATGでない最適以下の開始コドンである。VP1カプシドタンパク質のための最適以下の開始コドンは、Rep78タンパク質のために上記で規定される通りであってよい。VP1カプシドタンパク質のためのより好ましい最適以下の開始コドンは、ACG、TTG、CTG及びGTGから選択することができ、そのうちCTG及びACGが最も好ましい。
代わりの実施形態では、第2の発現カセットは、パルボウイルス(AAV)VP1、VP2及びVP3カプシドタンパク質の全3つをコードする単一のオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列を含み、ここで、VP1カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンはATGであり、ヌクレオチド配列でコードされるVP1カプシドタンパク質をコードするmRNAは、(国際出願2019/016349に記載される通り)オープンリーディングフレームVP1カプシドタンパク質の枠外の代わりの開始コドンを含む。好ましくは、代わりの開始コドンは、CTG、ATG、ACG、TTG、GTG、CTC及びCTTからなる群から選択され、そのうちATGが好ましい。好ましくは、AAVカプシドタンパク質は、AAV5血清型カプシドタンパク質である。この実施形態では、好ましくは、ヌクレオチド配列は、VP1のための前記ATG翻訳開始コドンを包含する代わりの開始コドンで開始する代わりのオープンリーディングフレームを含み、それによって、好ましくは、代わりの開始コドンに続く代わりのオープンリーディングフレームは、最高20アミノ酸のペプチドをコードする。
カプシドタンパク質の発現のための第2の発現カセットに含まれるヌクレオチド配列は、国際出願2007/046703に記載されるように1つ又は複数の改変をさらに含むことができる。VP及びビリオンの収量を増加させるか、又はビリオンの向性の変更若しくは抗原性の低減などの他の所望の効果を有することができる、VPコード領域の様々なさらなる改変が当業者に公知である。これらの改変は、本発明の範囲内にある。
一実施形態では、VP1の発現は、VP2及びVP3の発現と比較して増加する。国際出願2007/084773に記載されているように、VP1発現は、VP1の補給によって、VP1のためのヌクレオチド配列を含む単一のベクターの昆虫細胞への導入によって増加させることができる。
一般的に、本発明の方法では、VP1、VP2及びVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも1つのオープンリーディングフレーム、又はRep78及びRep68タンパク質のうちの少なくとも1つをコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームを含む、少なくとも1つのオープンリーディングフレーム。一実施形態では、VP1、VP2及びVP3カプシドタンパク質、又はRep78及びRep68タンパク質のうちの少なくとも1つをコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームを含む少なくとも1つのオープンリーディングフレームは、人工イントロン(又は、人工イントロンに由来する配列)を含まない。すなわち、Rep又はVPタンパク質をコードするために使用される少なくともオープンリーディングフレームは、人工イントロンを含まない。人工イントロンとは、アデノ随伴ウイルスRep又はCap配列中に天然に存在しないイントロン、例えば、昆虫細胞の中で機能的スプライシングを許すように工学操作されたイントロンを意味するものである。したがって、これに関連して、人工イントロンは野生型昆虫細胞イントロンを包含する。本発明の発現カセットは、天然のトランケーションされたイントロン配列を含むことができる(天然は、アデノ随伴ウイルスに天然に存在する配列を意味する)-そのような配列は、本明細書に規定される人工イントロンの範疇に入るものでない。
本発明では、1つの可能性は、VP1、VP2及びVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレーム、及び/又はRep78及びRep68タンパク質のうちの少なくとも1つをコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームのいずれも、人工イントロンを含まないことである。
プロモーター
好ましくは、AAVタンパク質をコードする本発明のヌクレオチド配列は、昆虫細胞での発現のための発現制御配列に作動可能に連結される。これらの発現制御配列は、昆虫細胞で活性であるプロモーターを少なくとも含む。
好ましくは、AAVタンパク質をコードする本発明のヌクレオチド配列は、昆虫細胞での発現のための発現制御配列に作動可能に連結される。これらの発現制御配列は、昆虫細胞で活性であるプロモーターを少なくとも含む。
パルボウイルスカプシドタンパク質をコードする本発明のヌクレオチド配列の転写を制御するための第3及び/又は第4のプロモーターとして使用される好適なプロモーターは、例えばLubelskiら米国特許出願公開第2017356008号で開示される、多角体プロモーター(polH)、例えば配列番号30で提供されるpolHプロモーター、及びその短縮バージョン配列番号31である。しかし、昆虫細胞で活性である、及び本発明により選択することができる他のプロモーターは、当技術分野で公知である、例えば、ポリヘドリン(polH)プロモーター、p10プロモーター、p35プロモーター、4xHsp27 EcRE+minimal Hsp70プロモーター、deltaE1プロモーター、E1プロモーター又はIE-1プロモーター、及び上の参考文献に記載されるさらなるプロモーター。一実施形態では、AAVカプシドタンパク質をコードする本発明のヌクレオチド配列の転写のためのプロモーターは、p10又はpolHである。さらなる実施形態では、AAVカプシドタンパク質をコードする本発明のヌクレオチド配列の転写のためのプロモーターは、p10である。代わりの実施形態では、AAVカプシドタンパク質をコードする本発明のヌクレオチド配列の転写のためのプロモーターは、polHである。
これらの上記のプロモーターは、パルボウイルスRepタンパク質をコードする本発明のヌクレオチド配列の転写を制御するための第1及び第2のプロモーターとして使用することもできる。一実施形態では、第1のプロモーターは構成的プロモーターである。本明細書で使用されるように、用語「プロモーター」又は「転写調節配列」は、1つ又は複数のコード配列の転写を制御する機能を果たす核酸断片を指し、コード配列の転写開始部位の転写方向に関して上流に位置し、転写因子結合部位、リプレッサー及び活性化タンパク質結合部位、及びプロモーターからの転写量を調節するために直接的又は間接的に作用することが当業者に公知であるヌクレオチドの任意の他の配列を限定されずに含む、DNA依存性RNAポリメラーゼ、転写開始部位及び任意の他のDNA配列のための結合部位の存在によって構造的に同定される。「構成的」プロモーターは、ほとんどの生理的及び発達条件下でほとんどの組織において活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、例えば化学的インデューサーの適用によって、生理的に又は発達上調節されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特異的タイプの組織又は細胞だけで活性である。「クリプティックプロモーター」は、活性化することができる、後成的にサイレンシングされたプロモーターである。
好ましい実施形態では、Rep78タンパク質のRep52タンパク質に対する発現の比は:(a)例えばレポーター遺伝子発現(例えばルシフェラーゼ又はSEAP)又はノーザンブロットによって決定される通り、第2のプロモーターは第1のプロモーターより強力であること;(b)第1の発現カセットと比較して第2の発現カセットの上流におけるヌクレオチドスペーサー又はより多くの及び/又はより強力なエンハンサーエレメントの存在;(c)Rep78タンパク質をコードするヌクレオチド配列と比較して、パルボウイルスRep52タンパク質をコードするヌクレオチド配列はより高いコドン適応指数を有すること;(d)パルボウイルスRepタンパク質の温度最適化;及び対応する野生型Repタンパク質と比較してアミノ酸配列に1つ又は複数の変化を有するバリアントRepタンパク質のうちの1つ又は複数によって調節され、ここで、昆虫細胞でAAV生成の増加を検出することによって調査される通り1つ又は複数のアミノ酸変化はRep機能の活性の増加をもたらす。昆虫細胞でAAV生成の増加を検出することによって調査される通り、Rep機能の活性が増加したバリアントRepタンパク質の生成、選択及び/又はスクリーニングのための方法は、哺乳動物細胞でのAAV生成に関して機能が増加したバリアントRepタンパク質を得るための米国特許出願公開第20030134351号に記載される方法の昆虫細胞への適応によって得られる。対応する野生型Repタンパク質と比較してアミノ酸配列に1つ又は複数の変化を有するバリアントRepタンパク質は、本明細書において対応する野性型Repタンパク質のアミノ酸配列と比較して、バリアントアミノ酸配列の中に1つ又は複数のアミノ酸置換、挿入及び/又は欠失を有するRepタンパク質を含むと理解される。
第2のプロモーターは第1のプロモーターより強力であるとは、Rep52タンパク質をコードするヌクレオチド配列がRep78タンパク質をコードするヌクレオチド配列より多く発現されることを意味する。Rep52タンパク質の発現がRep78タンパク質の発現と比較してその後増加するので、等しく強力なプロモーターを使用することができる。プロモーターの強度は、本発明の方法で使用される条件の下で得られる発現によって決定することができる。一実施形態では、第2、第3及び第4のプロモーターのうちの少なくとも1つは誘導性プロモーターであり、好ましくは、polH及びp10から選択される。さらなる実施形態では、誘導性プロモーターは、ウイルス感染周期のより後期に誘導されるウイルスプロモーターであり、好ましくはウイルスによる細胞のトランスフェクション又は感染の少なくとも24時間後に誘導されるウイルスプロモーターである。
一実施形態では、第1のプロモーターは、deltaElプロモーター及びElプロモーターから選択され;第2、第3及び第4のプロモーターはpolHプロモーター又はp10プロモーターから選択される。さらなる実施形態では、第1のプロモーターはdeltaE1であり、第2のプロモーターはpolHである。
別々のAAV遺伝子を作動させるために同じバキュロウイルス構築物で同じバキュロウイルスプロモーターを2回使用することは、プロモーターの間で競合をもたらすことがある。この競合はCap及びRep遺伝子の発現の減少をもたらし、それによってAAV収量を低減する。発現カセットの中の類似したエレメントの近接性は、この作用を潜在的に増強する可能性がある。減弱遺伝子の発現は、より強力な開始コドンの使用によって又はカプシドタンパク質を作動させるプロモーターの交換(例えばpolHからP10に)によって向上させることができる。したがって、好ましい実施形態では、第1、第2及び第3のプロモーターは異なるプロモーターであり、より好ましくは、第1、第2、第3及び第4のプロモーターは異なるプロモーターである。
エンハンサー
「エンハンサーエレメント」又は「エンハンサー」は、プロモーターの活性を増強し(すなわち、プロモーターの下流の配列の転写率を増加させる)、プロモーターとは対照的にプロモーター活性を保有せず、通常プロモーターに対する位置(すなわちプロモーターの上流、又は下流)にかかわりなく機能することができる配列を規定するものである。エンハンサーエレメントは、当技術分野で周知である。本発明で使用することができるエンハンサーエレメント(又は、その一部)の非限定的な例には、昆虫細胞で見出されるバキュロウイルスエンハンサー及びエンハンサーエレメントが含まれる。エンハンサーエレメントが細胞内でプロモーターが作動可能に連結された遺伝子のmRNA発現を、エンハンサーエレメントが存在しない場合の遺伝子のmRNA発現と比較して少なくとも25%、より好ましくは少なくとも50%、さらにより好ましくは少なくとも100%、最も好ましくは少なくとも200%増加させることが好ましい。mRNA発現は、例えば定量的RT-PCRによって決定することができる。
「エンハンサーエレメント」又は「エンハンサー」は、プロモーターの活性を増強し(すなわち、プロモーターの下流の配列の転写率を増加させる)、プロモーターとは対照的にプロモーター活性を保有せず、通常プロモーターに対する位置(すなわちプロモーターの上流、又は下流)にかかわりなく機能することができる配列を規定するものである。エンハンサーエレメントは、当技術分野で周知である。本発明で使用することができるエンハンサーエレメント(又は、その一部)の非限定的な例には、昆虫細胞で見出されるバキュロウイルスエンハンサー及びエンハンサーエレメントが含まれる。エンハンサーエレメントが細胞内でプロモーターが作動可能に連結された遺伝子のmRNA発現を、エンハンサーエレメントが存在しない場合の遺伝子のmRNA発現と比較して少なくとも25%、より好ましくは少なくとも50%、さらにより好ましくは少なくとも100%、最も好ましくは少なくとも200%増加させることが好ましい。mRNA発現は、例えば定量的RT-PCRによって決定することができる。
本明細書において、パルボウイルスRepタンパク質の発現を増強するためにエンハンサーエレメントを使用することが好ましい。したがって、一実施形態では、少なくとも1つの発現カセットは少なくとも1つのバキュロウイルスエンハンサーエレメント及び/又は少なくとも1つのエクジソン応答エレメントを含み、好ましいエンハンサーエレメントはhr1、hr2、hr3、hr4及びhr5からなる群から選択される。好ましくは、エンハンサーエレメントは、バキュロウイルスの相同領域(hr)エンハンサーエレメントなどのようにバキュロウイルスの前初期タンパク質(IE1)又はそのスプライスバリアント(IE0)に応答性であり、好ましくは、バキュロウイルスはオートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)マルチカプシド核多角体病ウイルスである。IE1は、プラスミドトランスフェクションアッセイにおいてバキュロウイルス初期遺伝子プロモーターをトランス活性化し、後期遺伝子発現を支える、高度に保存された67kDaのDNA結合タンパク質である(例えば、Olsonら、2002年、J Virol.、76:9505~9515頁を参照する)。AcMNPV IE1は、プロモーターのトランス活性化及びDNA結合に寄与する分離可能なドメインを所有する。この582残基リンタンパク質のN末端半分は、残基8~118及び168~222の転写刺激ドメインを含有する。IE1は、AcMNPVゲノム全体に分散して見出される複数の相同領域(hr)の中で反復配列を構成する、約28bpの不完全な回文(28mer)に結合する。hr 28merは、IE1媒介エンハンサー及び起源特異的複製機能のために必要とされる最小限の配列モチーフである。
一実施形態では、hrエンハンサーエレメントは、hr2-0.9以外のhrエンハンサーエレメントである(米国特許出願公開第2012/100606号)。さらなる実施形態では、hrエンハンサーエレメントは、hr1、hr3、hr4b及びhr5からなる群から選択され、そのうちhr4b及びhr5が好ましく、hr4bが最も好ましい。代わりの実施形態では、hrエンハンサーエレメントは、例えば天然に存在しない設計されたエレメントなどのバリアントhrエンハンサーエレメントである。バリアントhrエンハンサーエレメントは、好ましくはhr28mer配列CTTTACGAGTAGAATTCTACGCGTAAAA(配列番号32)を少なくとも1コピー、及び/又は少なくとも18、20、21、22、23、24、25、26又は27ヌクレオチドが配列CTTTACGAGTAGAATTCTACGCGTAAAA(配列番号32)と同一であり、好ましくはバキュロウイルスのIE1タンパク質に、より好ましくはAcMNPV IE1タンパク質に結合する、配列を少なくとも1コピー含む。バリアントhrエンハンサーエレメントは、さらに好ましくは、バリアントエレメントがpolHプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む発現カセットに作動可能に連結されるとき、a)非誘導条件下で、バリアントエレメントを有するカセットは、バリアントエレメントの代わりにhr2-0.9エレメントを含む、それ以外は同一の発現カセットより少ないレポーター転写物を生成するか、又は、バリアントエレメントを有するカセットは、バリアントエレメントの代わりにhr4bエレメントを含む、それ以外は同一の発現カセットによって生成されるレポーター転写物の量の1.1、1.2、1.5、2、5又は10分の1を生成し;及びb)誘導条件下で、バリアントエレメントを有するカセットは、バリアントエレメントの代わりにhr4b又はhr2-0.9エレメントを含む、それ以外は同一の発現カセットによって生成されるレポーター転写物の量の少なくとも50、60、70、80、90又は100%を生成するという点で機能的に規定される。非誘導条件は、カセットが試験される場合に細胞中にIE1タンパク質が存在しない条件として理解され、誘導条件は、hr4b又はhr2-0.9エレメントを含む参照カセットで最大のレポーター発現を得るために十分なIE1タンパク質が存在する条件であると理解される。バキュロウイルスIE1タンパク質へのバリアントhrエンハンサーエレメントの結合は、例えば、Rodems及びFriesen(J Virol.1995年;69(9):5368~75頁)によって記載される通り移動シフトアッセイを用いて分析することができる。
ウイルスベクター
本発明は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞における核酸の導入及び/又は発現のためのベクターとして使用するための、パルボウイルス、特に感染性のヒト又はサルのAAVなどのデペンドウイルス、及びその成分(例えば、パルボウイルスゲノム)の使用に関する。特に、本発明は昆虫細胞で生成されるときの、そのようなパルボウイルスベクターの生産性の向上に関する。
本発明は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞における核酸の導入及び/又は発現のためのベクターとして使用するための、パルボウイルス、特に感染性のヒト又はサルのAAVなどのデペンドウイルス、及びその成分(例えば、パルボウイルスゲノム)の使用に関する。特に、本発明は昆虫細胞で生成されるときの、そのようなパルボウイルスベクターの生産性の向上に関する。
これに関連した生産性は、生成力価の向上及び生じた生成物、例えば全体:完全の比(核酸を含む粒子の数の尺度)を向上させた生成物の品質の向上を包含する。すなわち、最終生成物は、増加した割合の充填粒子を有することができ、充填は、粒子が核酸を含むことを意味する。
「パルボウイルスベクター」は、in vivo、ex vivo又はin vitroで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む、組換えで生成されたパルボウイルス又はパルボウイルス粒子と規定される。パルボウイルスベクターの例には、例えば、アデノ随伴ウイルスベクターが含まれる。本明細書では、パルボウイルスベクター構築物は、ウイルスゲノム又はその一部、及び導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。パルボウイルス科(Parvoviridae)のウイルスは、小DNAウイルスである。パルボウイルス科は、2つの亜科に分けることができる:脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科(Parvovirinae)及び昆虫を含む無脊椎動物に感染するデンソウイルス亜科(Densovirinae)。パルボウイルス亜科のメンバーはパルボウイルスと本明細書で呼ばれ、デペンドウイルス属を含む。それらの属名から推測されるように、デペンドウイルスのメンバーは、それらが細胞培養での増殖性感染のためにアデノウイルス又はヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスとの同時感染を通常必要とするという点で特異である。デペンドウイルス属には、ヒト(例えば、血清型1、2、3A、3B、4、5、6、7、8、9、10、11、12及び13)又は霊長類(例えば、血清型1及び4)に通常感染するAAV、及び他の温血動物に感染する関連したウイルス(例えば、ウシ、イヌ、ウマ及びヒツジのアデノ随伴ウイルス)が含まれる。パルボウイルス及びパルボウイルス科の他のメンバーに関するさらなる情報は、Fields Virology(第3版1996年)の第69章、Kenneth I.Berns、「Parvoviridae:The Viruses and Their Replication」に記載される。本発明はAAVに限定されず、他のパルボウイルスに等しく適用することができることが理解されるが、便宜上、本発明はAAVへの参照によって本明細書においてさらに例示され、記載される。したがって一実施形態では、パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つ、パルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つ、パルボウイルスVP1、VP2及びVP3カプシドタンパク質、並びに少なくとも1つのパルボウイルス逆方向末端反復配列はAAVに、好ましくはヒトに感染する血清型のものに由来する。
全ての既知のAAV血清型のゲノム構成は、非常に類似している。AAVのゲノムは、長さが約5,000ヌクレオチド(nt)未満である線状の一本鎖DNA分子である。逆方向末端反復配列(ITR)は、非構造複製(Rep)タンパク質及び構造ウイルス粒子(VP)タンパク質のための特異なコードヌクレオチド配列を挟む。VPタンパク質(VP1、-2及び-3)は、カプシドを形成する。末端の145nt ITRは自己相補的であり、T字状のヘアピンを形成するエネルギー的に安定した分子内二重鎖が形成されるように構成される。これらのヘアピン構造はウイルスDNA複製の起点として機能し、細胞DNAポリメラーゼ複合体のためのプライマーの役目をする。哺乳動物細胞での野生型(wt)AAV感染に続いて、Rep遺伝子(すなわち、Rep78及びRep52)はP5プロモーター及びP19プロモーターからそれぞれ発現され、両方のRepタンパク質はウイルスゲノムの複製及びパッケージングにおける役割を有する。Rep ORFにおけるスプライシング事象は、実際に4つのRepタンパク質(すなわち、Rep78、Rep68、Rep52及びRep40)の発現をもたらす。しかし、哺乳動物細胞におけるRep78及びRep52タンパク質をコードするスプライスされていないmRNAは、AAVベクターの生成に十分であることが示された。昆虫細胞においても、Rep78及びRep52タンパク質は、AAVベクターの生成にとって十分である。3つのカプシドタンパク質、VP1、VP2及びVP3は、p40プロモーターからの単一のVP読み枠から発現される。哺乳動物細胞におけるwtAAV感染は、カプシドタンパク質の生成のために、2つのスプライス受容部位の交互使用及びVP2のACG開始コドンの最適以下の利用の組合せに依存する。
「組換えパルボウイルス又はAAVベクター」(又は、「rAAVベクター」)は、本明細書において目的の1つ又は複数のポリヌクレオチド配列、目的の遺伝子、又は少なくとも1つのパルボウイルス若しくはAAVの逆方向末端反復配列(ITR)に隣接する「導入遺伝子」を含むベクターを指す。好ましくは、導入遺伝子(複数可)は、導入遺伝子(複数可)の各側に1つずつのITRが隣接する。そのようなrAAVベクターは、AAV rep及びキャップ遺伝子生成物(すなわち、AAV Rep及びCapタンパク質)を発現する昆虫宿主細胞に存在するとき、感染性ウイルス粒子の中に複製してパッケージすることができる。rAAVベクターがより大きな核酸構築物(例えば、染色体に、又はクローニング若しくはトランスフェクションのために使用されるプラスミド若しくはバキュロウイルスなどの別のベクターに)に組み込まれるならば、rAAVベクターは、AAVパッケージング機能及び必要なヘルパー機能の存在下で複製及びカプシド形成によって「レスキューする」ことができる「プロベクター」と一般的に呼ばれる。
(ii)のヌクレオチド配列は、Rep78及びRep68タンパク質のうちの少なくとも1つをコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームを含むことが好ましい。好ましくは、ヌクレオチド配列は同じ血清型である。より好ましくは、ヌクレオチド配列は、組換えを最小化又は阻止するためにそれらがコドン最適化されるか、AT最適化されるか又はGC最適化されることがあるという点で、互いと異なる。好ましくは、第1の発現カセットは、パルボウイルスRepタンパク質をコードする2つのヌクレオチド配列、すなわち、第1のヌクレオチド配列及び第2のヌクレオチド配列を含む。好ましくは、パルボウイルスRepタンパク質の共通アミノ酸配列をコードする第1及び第2のヌクレオチド配列における差は、以下の1つ又は複数によって最大化される(すなわち、ヌクレオチド同一性が最小化される):a)パルボウイルスRep共通アミノ酸配列をコードする第1のヌクレオチド配列のコドンバイアスを変更すること;b)パルボウイルスRep共通アミノ酸配列をコードする第2のヌクレオチド配列のコドンバイアスを変更すること;c)共通アミノ酸配列をコードする第1のヌクレオチド配列のGC含有量を変更すること;及びd)共通アミノ酸配列をコードする第2のヌクレオチド配列のGC含有量を変更すること。コドン最適化は、コドン使用頻度データベースで見出されるような、本発明の方法で使用される昆虫細胞、好ましくはスポドプテラ・フルジペルダのコドン使用頻度に基づいて実行することができる(例えば、http://www.kazusa.or.jp/codon/を参照する)。コドン最適化のための好適なコンピュータプログラムは、当業者に利用可能である(例えば、Jayarajら、2005年、Nucl.Acids Res.33(9):3011~3016頁;及びインターネットを参照する)。或いは、最適化は、同じコドン使用頻度データベースを使用して手動で実行することができる。
導入遺伝子
一実施形態では、本発明は、パルボウイルス逆方向末端反復配列に隣接する導入遺伝子を含むヌクレオチド配列が第2の核酸構築物(第1の核酸構築物と異なる)の上に存在する細胞に関する。好ましい実施形態では、パルボウイルス逆方向末端反復配列に隣接する導入遺伝子を含むヌクレオチド配列は、第2の核酸構築物(第1の核酸構築物と異なる)の上に存在する。
一実施形態では、本発明は、パルボウイルス逆方向末端反復配列に隣接する導入遺伝子を含むヌクレオチド配列が第2の核酸構築物(第1の核酸構築物と異なる)の上に存在する細胞に関する。好ましい実施形態では、パルボウイルス逆方向末端反復配列に隣接する導入遺伝子を含むヌクレオチド配列は、第2の核酸構築物(第1の核酸構築物と異なる)の上に存在する。
本発明との関連で、「少なくとも1つのパルボウイルス逆方向末端反復ヌクレオチド配列」は、「A」、「B」及び「C」領域とも呼ばれる大部分相補的な対称的に配置された配列を含むパリンドローム配列を意味すると理解される。ITRは、複製において「シス」の役割を有する部位、すなわち例えばRep78(又は、Rep68)などのトランス作用性複製タンパク質のための認識部位である、複製起点として機能し、それはパリンドローム及びパリンドローム内部の特異的配列を認識する。ITR配列の対称性の1つの例外は、ITRの「D」領域である。それは、特異である(1つのITRの中に相補体を有しない)。一本鎖DNAのニッキングは、AとD領域の間の接合部で起こる。それは、新規のDNA合成が開始する領域である。D領域は、通常パリンドロームの片側に位置し、核酸複製ステップに方向性を提供する。哺乳動物細胞内で複製するパルボウイルスは、一般的に2つのITR配列を有する。しかし、A領域及びD領域の両方の鎖の上の結合部位が対称的に位置し、パリンドロームの各側に1つずつあるようにITRを工学操作することが可能である。二本鎖環状DNA鋳型(例えば、プラスミド)の上では、Rep78又はRep68に助けられた核酸複製は両方向に進行し、環状ベクターのパルボウイルス複製にとって単一のITRが十分である。したがって、1つのITRヌクレオチド配列を本発明との関連で使用することができる。しかし、好ましくは、2つ又は別の偶数の通常のITRが使用される。最も好ましくは、2つのITR配列が使用される。好ましいパルボウイルスITRは、AAV ITRである。より好ましくは、AAV2 ITRが使用される。安全性の理由で、第2のAAVの存在下で細胞への最初の導入の後にさらに増殖することのできない組換えパルボウイルス(rAAV)ベクターを構築することが望ましいかもしれない。レシピエントでの望ましくないベクター増殖を制限するそのような安全性機構は、米国特許出願公開第2003148506号に記載されるキメラITRを有するrAAVを用いて提供することができる。
本明細書において、配列に別のエレメント(複数可)に隣接することに関する用語「隣接する」は、配列に対して上流及び/又は下流、すなわち5’及び/又は3’に隣接するエレメントのうちの1つ又は複数が存在することを示す。用語「隣接する」は、その配列が必ず連続していることを示すものでない。例えば、導入遺伝子をコードする核酸と隣接するエレメントの間に介在配列があってもよい。2つの他のエレメント(例えばITR)が「隣接する」配列は、一方のエレメントが配列の5’に位置し、他方が配列の3’に位置することを示すが、それらの間に介在配列があってもよい。好ましい実施形態では、(iv)のヌクレオチド配列は、いずれかの側にパルボウイルス逆方向末端反復ヌクレオチド配列が隣接する。
本発明の実施形態では、少なくとも1つのパルボウイルスITR配列に隣接する導入遺伝子(目的の遺伝子生成物をコードする)を含むヌクレオチド配列は、好ましくは、昆虫細胞で生成された組換えパルボウイルス(rAAV)ベクターのゲノムに組み込まれる。好ましくは、導入遺伝子は哺乳動物細胞での発現のための目的の遺伝子生成物をコードする。好ましくは、導入遺伝子を含むヌクレオチド配列は、2つのパルボウイルス(AAV)ITRヌクレオチド配列に隣接し、導入遺伝子は2つのパルボウイルス(AAV)ITRヌクレオチド配列の間に位置する。好ましくは、目的の遺伝子生成物(哺乳動物細胞での発現のための)をコードするヌクレオチド配列は、それが2つの通常のITRの間に位置するか又は2つのD領域で工学操作されたITRのいずれかの側に位置するならば、昆虫細胞で生成された組換えパルボウイルス(rAAV)ベクターに組み込まれる。
昆虫細胞で組換えAAVビリオンの生成のために本発明で使用することができるAAV配列は、任意のAAV血清型のゲノムから導くことができる。一般的に、AAV血清型はアミノ酸及び核酸レベルでかなりの相同性のゲノム配列を有し、遺伝子機能の同一のセットを提供し、本質的に物理的及び機能的に同等であるビリオンを生成し、事実上同一の機構によって複製し、アセンブルする。様々なAAV血清型のゲノム配列及びゲノム類似性の概要に関しては、例えばGenBank受託番号U89790;GenBank受託番号J01901;GenBank受託番号AF043303;GenBank受託番号AF085716;Chloriniら(1997年、J.Vir.71:6823~33頁);Srivastavaら(1983年、J.Vir.45:555~64頁);Chloriniら(1999年、J.Vir.73:1309~1319頁);Rutledgeら(1998年、J.Vir.72:309~319頁);及びWuら(2000年、J.Vir.74:8635~47頁)を参照する。AAV血清型1、2、3、4及び5は、本発明との関連で使用するためのAAVヌクレオチド配列の好ましいソースである。好ましくは、本発明との関連で使用するためのAAV ITR配列は、AAV1、AAV2、AAV4及び/又はAAV7に由来する。同様に、Rep(Rep78/68及びRep52/40)コード配列は、好ましくはAAV1、AAV2、AAV4及び/又はAAV7に由来する。しかし、本発明との関連で使用するためのVP1、VP2及びVP3カプシドタンパク質をコードする配列は、既知の42血清型のいずれかから、より好ましくはAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12若しくはAAV13、又は例えばカプシドシャッフリング技術及びAAVカプシドライブラリーによって得られた新規開発のAAV様粒子から、又は、Anc-80カプシドなどの新たに及び合成的に設計、開発又は発展させたカプシドからとることができる。
AAV Rep及びITR配列は、特にほとんどの血清型の間で保存されている。様々なAAV血清型のRep78タンパク質は、例えば89%を超えて同一であり、AAV2、AAV3A、AAV3B及びAAV6の間のゲノムレベルでの全ヌクレオチド配列同一性はおよそ82%である(Bantel-Schaalら、1999年、J.Virol.、73(2):939~947頁)。さらに、多くのAAV血清型のRep配列及びITRは、哺乳動物細胞でのAAV粒子の生成において他の血清型からの対応する配列を効率的に交差相補する(すなわち、機能的に代行する)ことが知られている。米国特許出願公開第2003148506号は、AAV Rep及びITR配列が昆虫細胞で他のAAV Rep及びITR配列も効率的に交差相補することを報告している。
VPタンパク質としても知られるAAVカプシドタンパク質は、AAVビリオンの細胞向性を決定することが知られている。VPタンパク質コード配列は、異なるAAV血清型の間でRepタンパク質及び遺伝子より有意に保存されていない。他の血清型の対応する配列を交差相補するRep及びITR配列の能力は、ある血清型(例えば、AAV3)のカプシドタンパク質並びに別のAAV血清型(例えば、AAV2)のRep及び/又はITR配列を含む偽型化rAAV粒子の生成を可能にする。そのような偽型化rAAV粒子は、本発明の一部である。
改変された「AAV」配列は、本発明との関連で、例えば昆虫細胞でのrAAVベクターの生成のために使用することもできる。そのような改変された配列は、例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12又はAAV13ITRと、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%又はそれ以上のヌクレオチド及び/又はアミノ酸配列同一性を有する配列(例えば、約75~99%のヌクレオチド配列同一性を有する配列)を含み、Rep又はVPを野生型AAV ITR、Rep又はVP配列の代わりに使用することができる。
多くの点で他のAAV血清型に類似しているが、AAV5は他の公知のヒト及びサルの血清型よりも他のヒト及びサルのAAV血清型と異なる。それを考慮すると、昆虫細胞ではrAAV5の生成は他の血清型の生成と異なるかもしれない。rAAV5を生成するために本発明の方法が用いられる場合、複数の構築物の場合、1つ又は複数の構築物は、AAV5 ITRを含むヌクレオチド配列、AAV5 Repコード配列を含むヌクレオチド配列を集合的に含むことが好ましい(すなわち、ヌクレオチド配列はAAV5 Rep78を含む)。そのようなITR及びRep配列は、所望により昆虫細胞でrAAV5又は偽型化rAAV5ベクターの効率的な生成を得るように改変することができる。例えば、昆虫細胞でrAAV5ベクターの生成を向上させるために、Rep配列の開始コドンを改変することができ、VPスプライス部位を改変若しくは排除することができ、及び/又は、VP1開始コドン及び近くのヌクレオチドを改変することができる。
一般的に、ITRを含んでいる目的の遺伝子生成物は、長さが5,000ヌクレオチド(nt)以下である。別の実施形態では、過大なDNA分子、すなわち長さが5,000ntを超えるものは、本発明に記載されるAAVベクターを使用してin vitro又はin vivoで発現させることができる。過大なDNAは、5.5kbpの最大AAVパッケージング限界を超えるDNAであるとここで理解される。したがって、通常5.0kbより大きなゲノムによってコードされる組換えタンパク質を生成することができるAAVベクターの産生も、実行可能である。
本明細書の上で規定される導入遺伝子を含むヌクレオチド配列は、したがって目的の遺伝子生成物をコードするヌクレオチド配列(哺乳動物細胞での発現のための)又は目的の遺伝子を標的にするヌクレオチド配列(哺乳動物細胞で目的の前記遺伝子を抑制するための)を含むことができ、昆虫細胞で複製する組換えパルボウイルス(rAAV)ベクターにそれが組み込まれるように位置することができる。本発明との関連で、「目的の遺伝子生成物」を発現させるか又は抑制する特に好ましい哺乳動物細胞はヒト細胞であると理解される。本発明により生成した組換えパルボウイルス(rAAV)ベクターでトランスフェクトした哺乳動物細胞での後の発現のために、任意のヌクレオチド配列を組み込むことができる。ヌクレオチド配列は例えばタンパク質をコードすることができるか、又はそれはRNAi剤、すなわちRNA干渉が可能であるRNA分子、例えばshRNA(短いヘアピンRNA)又はsiRNA(短い干渉RNA)を発現することができる。「siRNA」は、哺乳動物細胞で有毒でない短い長さの二本鎖RNAである小さい干渉RNAを意味する(Elbashirら、2001年、Nature 411:494~98頁;Caplenら、2001年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:9742~47頁)。好ましい実施形態では、導入遺伝子を含むヌクレオチド配列は2つのコードヌクレオチド配列を含むことができ、各々は哺乳動物細胞での発現のための目的の1つの遺伝子生成物をコードする。目的の生成物をコードする2つのヌクレオチド配列の各々は、昆虫細胞で複製する組換えパルボウイルス(rAAV)ベクターにそれが組み込まれるように位置する。
哺乳動物細胞での発現のための目的の生成物は、治療的遺伝子生成物であってよい。治療的遺伝子生成物は、標的細胞中で発現されるときに所望の治療効果を提供する、ポリペプチド又はRNA分子(si/sh/miRNA)又は他の遺伝子生成物であってもよい。所望の治療効果は、例えば望ましくない活性(例えばVEGF)の除去、遺伝子欠損の相補性、疾患を引き起こす遺伝子の抑制、酵素活性の欠乏の修復、又は任意の他の疾患修飾効果であってよい。治療的ポリペプチド遺伝子生成物の例には、限定されずに、増殖因子、凝固カスケードの一部を形成する因子、酵素、リポタンパク質、サイトカイン、神経栄養因子、ホルモン及び治療的免疫グロブリン及びそのバリアントが含まれる。治療的RNA分子生成物の例には、ポリグルタミン疾患、異常脂血症又は筋萎縮性側索硬化症(ALS)を限定されずに含む疾患を抑制することにおいて有効なmiRNAが含まれる。
本発明により生成される組換えパルボウイルス(rAAV)ベクターを使用して治療することができる疾患は、遺伝的原因又は基礎を一般的に有するもの以外、特に限定されない。例えば、開示されるベクターで治療することができる疾患には、限定されずに、急性間欠性ポルフィリン症(AIP)、加齢性黄斑変性症、アルツハイマー病、関節炎、バッテン病、キャナバン病、1型シトルリン血症、クリグラーナジャー、鬱血性心不全、嚢胞性線維症、デュシェーヌ筋ジストロフィー、脂質異常症、糖原病I型(GSD-I)、血友病A、血友病B、遺伝性気腫、ホモ接合の家族性高コレステロール血症(HoFH)、ハンチントン舞踏病(HD)、レーバーの先天性黒内障、メチルマロン酸血症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠乏症(OTC)、パーキンソン病、フェニルケトン尿症(PKU)、脊髄筋萎縮症、麻痺、ウィルソン病、てんかん、ポンペ病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、テイ-サックス病、過シュウ酸尿症9PH-1、1型脊髄小脳失調(SCA-1)、SCA-3、u-ジストロフィン、II型若しくはIII型ゴーシェ病、催不整脈性右心室心筋症(ARVC)、ファブリー病、家族性ブルセラ症(FMF)、プロピオン酸血症、脆弱X症候群、レット症候群、ニーマン-ピック病及びクラベ病を含めることができる。発現される治療的遺伝子生成物の例には、N-アセチルグルコサミニダーゼ、アルファ(NaGLU)、Treg167、Treg289、EPO、IGF、IFN、GDNF、FOXP3、第VIII因子、第IX因子及びインスリンが含まれる。
或いは又はさらに、別の遺伝子生成物として、本明細書の上で規定される導入遺伝子を含むヌクレオチド配列は、細胞形質転換及び発現を調査するための選択マーカータンパク質の役目をするポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含むことができる。この目的のための好適なマーカータンパク質は、例えば、蛍光性タンパク質GFP、並びに選択マーカー遺伝子HSVチミジンキナーゼ(HAT培地での選択のため)、細菌ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ(ハイグロマイシンBでの選択のため)、Tn5アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(G418での選択のため)、及びジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)(メトトレキセートでの選択のため)、CD20、低親和性神経成長因子遺伝子である。これらのマーカー遺伝子を得るためのソース及びそれらの使用方法は、前掲Sambrook及びRusselで提供される。さらに、本明細書の上で規定される導入遺伝子を含むヌクレオチド配列は、必要と考えられる場合、本発明の組換えパルボウイルス(rAAV)ベクターで形質導入した細胞から対象を治癒させることを可能にする、フェイルセーフ機構の役目をすることができるポリペプチドをコードするさらなるヌクレオチド配列を含むことができる。しばしば自殺遺伝子と呼ばれるそのようなヌクレオチド配列は、そのタンパク質が発現されるトランスジェニック細胞を死滅させることが可能である有毒物質にプロドラッグを変換することが可能であるタンパク質をコードする。そのような自殺遺伝子の好適な例には、例えば、大腸菌(E.coli)シトシンデアミナーゼ遺伝子、又は単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス及び水痘-帯状疱疹ウイルスからのチミジンキナーゼ遺伝子のうちの1つが含まれ、その場合には、対象でトランスジェニック細胞を死滅させるプロドラッグとしてガンシクロビルを使用することができる(例えばClairら、1987年、Antimicrob.Agents Chemother.31:844~849頁を参照する)。
昆虫細胞での適切な発現のための、例えば野生型パルボウイルス配列を含む本明細書で規定されるヌクレオチド配列の様々な改変は、例えば、例えばSambrook及びRussell(2001年)「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」(第3版)、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York」に記載される周知の遺伝子操作技術の適用によって達成される。コードタンパク質の収量を増加させる可能性のあるコード領域の様々なさらなる改変は、当業者に公知である。これらの改変は、本発明の範囲内にある。
細胞
本発明による細胞は、異種タンパク質の生成に好適である任意の細胞であってよい。好ましくは、細胞は昆虫細胞、より好ましくはバキュロウイルスベクターの複製を可能にし、培養で維持することができる昆虫細胞である。より好ましくは、昆虫細胞はrAAVベクターを含む組換えパルボウイルスベクターの複製も可能にする。例えば、使用される細胞株は、スポドプテラ・フルジペルダ(Spodoptera frugiperda)、ショウジョウバエ属(Drosophila)細胞株又はカ細胞株、例えばヒトスジシマカ(Aedes albopictus)由来の細胞株からのものであってよい。好ましい昆虫細胞又は細胞株は、例えばS2(CRL-1963、ATCC)、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、Ha2302、Hz2E5、High Five(Invitrogen、CA、USA)及びexpresSF+(登録商標)(米国特許第6,103,526号;Protein Sciences社、CT、USA)を含む、バキュロウイルス感染に感受性である昆虫種からの細胞である。本発明による好ましい昆虫細胞は、組換えパルボウイルスベクターの生成のための昆虫細胞である。
本発明による細胞は、異種タンパク質の生成に好適である任意の細胞であってよい。好ましくは、細胞は昆虫細胞、より好ましくはバキュロウイルスベクターの複製を可能にし、培養で維持することができる昆虫細胞である。より好ましくは、昆虫細胞はrAAVベクターを含む組換えパルボウイルスベクターの複製も可能にする。例えば、使用される細胞株は、スポドプテラ・フルジペルダ(Spodoptera frugiperda)、ショウジョウバエ属(Drosophila)細胞株又はカ細胞株、例えばヒトスジシマカ(Aedes albopictus)由来の細胞株からのものであってよい。好ましい昆虫細胞又は細胞株は、例えばS2(CRL-1963、ATCC)、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、Ha2302、Hz2E5、High Five(Invitrogen、CA、USA)及びexpresSF+(登録商標)(米国特許第6,103,526号;Protein Sciences社、CT、USA)を含む、バキュロウイルス感染に感受性である昆虫種からの細胞である。本発明による好ましい昆虫細胞は、組換えパルボウイルスベクターの生成のための昆虫細胞である。
当業者は、ヌクレオチド配列を昆虫ゲノムに安定して導入する方法、及びゲノム中のそのようなヌクレオチド配列を有する細胞を同定する方法を認識している。ゲノムへの組込みは、例えば、昆虫ゲノムの領域に高度に相同的であるヌクレオチド配列を含むベクターの使用によって助けることができる。トランスポゾンなどの特異的配列の使用は、ヌクレオチド配列をゲノムに導入する別の方法である。ゲノムへの組込みは、1つ又は複数のステップを通すものであってよい。用語「組み込まれる」への言及は、用語「安定して組み込まれる」も意味することは当業者であれば認識しているであろう。
一実施形態では、第1及び第2の核酸構築物のうちの少なくとも1つが細胞のゲノムに安定して組み込まれている、本発明による細胞が提供される。一実施形態では、第1の核酸構築物が、細胞のゲノムに安定して組み込まれている。代わりの実施形態では、第2の核酸構築物が、細胞のゲノムに安定して組み込まれている。さらなる実施形態では、第1及び第2の核酸構築物が、細胞のゲノムに安定して組み込まれている。
培養における昆虫細胞の成長条件、及び培養の昆虫細胞における異種生成物の生成は当技術分野で周知であり、例えば、昆虫細胞の分子工学に関する上記の引用文献(国際出願2007/046703も参照する)に記載される。
「昆虫細胞適合ベクター」又は「ベクター」は、昆虫又は昆虫細胞の増殖性形質転換又はトランスフェクションが可能な核酸分子であることが理解される。例示的な生物学的ベクターには、プラスミド、線状核酸分子及び組換えウイルスが含まれる。それが昆虫細胞に適合する限り、任意のベクターを用いることができる。ベクターは昆虫細胞ゲノムに組み込むことができるが、昆虫細胞におけるベクターの存在は恒久的である必要はなく、一時的エピソームベクターも含まれる。ベクターは、公知の任意の手段、例えば細胞の化学的処理、エレクトロポレーション又は感染によって導入することができる。好ましい実施形態では、ベクターはバキュロウイルス、ウイルスベクター又はプラスミドである。より好ましい実施形態では、ベクターはバキュロウイルスである、すなわち、核酸構築物はバキュロウイルス発現ベクターである。バキュロウイルス発現ベクター及びそれらの使用方法は、例えば、Summers及びSmith。1986年。A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures、Texas Agricultural Experimental Station Bull.No.7555、College Station、Tex.;Luckow.1991年。出典Prokopら、Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors’ Recombinant DNA Technology and Applications、97~152頁;King、L.A.及びR.D.Possee、1992年、The baculovirus expression system、Chapman and Hall、United Kingdom;O’Reilly、D.R.、L.K.Miller、V.A.Luckow、1992年、Baculovirus Expression Vectors:A Laboratory Manual、New York;W.H.Freeman及びRichardson、C.D.、1995年、Baculovirus Expression Protocols、Methods in Molecular Biology、第39巻;米国特許第4,745,051号;米国特許出願公開第2003148506号;及び国際公開第03/074714号に記載される。
組換えパルボウイルス(rAAV)ベクターの生成のために昆虫細胞で用いられる核酸構築物の数は、本発明では制限されない。しかし、好ましい実施形態では、組換えパルボウイルス(rAAV)ベクターの生成のために、2つ以下の核酸構築物が昆虫細胞で用いられる。好ましくは、2つの核酸構築物は、本明細書の上で規定される第1及び第2の核酸構築物である。好ましくは、第1の核酸構築物はRep-Cap構築物であり、したがってそれは第1、第2及び第3の発現カセットを好ましくは含み、それによって第1及び第2の発現カセットはそれぞれRep78/68タンパク質及びRep52/40タンパク質をコードし、第3の発現カセットはCapタンパク質をコードする。第2の核酸構築物はTrans構築物又はCap-Trans構築物であり、したがって少なくとも1つのパルボウイルス逆方向末端反復配列に隣接する導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を少なくとも含む。
しかし好ましい(DuoDuoBac)実施形態では、第2の核酸構築物は、好ましくはCapタンパク質のための発現カセット、すなわち第4の発現カセットもさらに含む。好ましいDouDuoBac実施形態では、第1の核酸構築物は:i)パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたdElプロモーターを含む第1の発現カセット;ii)パルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたpolHプロモーターを含む第2の発現カセット;並びにiii)パルボウイルスVP1、VP2及びVP3カプシドタンパク質をコードする、好ましくはAAV5 VP1、VP2及びVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたpolHプロモーターを含む第3の発現カセットを含み、それによって、より好ましくはVP1開始コドンはACGである。第2の核酸構築物は、パルボウイルス逆方向末端反復配列に隣接する導入遺伝子、さらにパルボウイルスVP1、VP2及びVP3カプシドタンパク質をコードする、好ましくはAAV5 VP1、VP2及びVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたpolHプロモーターを含む第4の発現カセットを含み、それによってより好ましくは、VP1開始コドンはACGである。この実施形態では、第4の発現カセットはしたがって好ましくは第3の発現カセットと同一である。好ましくは、この実施形態では、第2及び第1の核酸構築物は、5:1~1:10の範囲内のモル比で、好ましくは1:1~1:8の範囲内、より好ましくは1:2~1:6の範囲内、及び最も好ましくは1:3~1:5の範囲内のモル比で、細胞の中に存在し、及び/又はその中にトランスフェクトされる。例えば、第1の核酸構築物はDuoBac CapRep6(配列番号10)であってよく、第2の核酸構築物はDuoBac CapTrans1(配列番号12)であってよく、ここで、好ましくは、第1及び第2の構築物は3:1のモル比で存在する。それによって、第2の構築物中の「Trans」は2つのITRの間の目的の任意の遺伝子であってよいことが理解される。
パルボウイルスRepタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、本明細書において、Rep78若しくはRep68及び/又はRep52若しくはRep40タンパク質などの昆虫細胞におけるパルボウイルスベクター生成に必要とされ、十分である、非構造Repタンパク質をコードするヌクレオチド配列であると理解される。パルボウイルスヌクレオチド配列は、好ましくはデペンドウイルスに、より好ましくはヒト又はサルのアデノ随伴ウイルス(AAV)に、最も好ましくはヒト(例えば、血清型1、2、3A、3B、4、5、6、8及び9)又は霊長類(例えば、血清型1及び4)に通常感染するAAVに由来する。パルボウイルスRepタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例は配列番号33で与えられ、それはRepタンパク質をコードするAAV血清型2配列ゲノムの一部を表す。Rep78コード配列はヌクレオチド11~1876を含み、Rep52コード配列はヌクレオチド683~1876を含み、同じく配列番号33及び19で別々に表される。Rep78及びRep52タンパク質の正確な分子量並びに翻訳開始コドンの正確な位置は、異なるパルボウイルスの間で異なることがあると理解される。しかし、当業者であれば、AAV-2と別のパルボウイルスからのヌクレオチド配列における対応する位置を同定する方法を認識しているであろう。
好ましくは、本発明の核酸構築物は、昆虫細胞適合ベクターである。「昆虫細胞適合ベクター」又は「ベクター」は、Rep78若しくはRep68及び/又はRep52若しくはRep40タンパク質などの昆虫細胞におけるパルボウイルスベクター生成に十分であると理解される。パルボウイルスヌクレオチド配列は、好ましくはデペンドウイルスに、より好ましくはヒト又はサルのアデノ随伴ウイルス(AAV)に、最も好ましくはヒト(例えば、血清型1、2、3A、3B、4、5及び6)又は霊長類(例えば、血清型1及び4)に通常感染するAAVに由来する。パルボウイルスRepタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例は、配列番号33及び19で与えられる。
したがって、代わりの実施形態では、細胞は昆虫細胞であり、ここで、第1及び第2の核酸構築物のうちの少なくとも1つは昆虫細胞適合ベクター、好ましくはバキュロウイルスベクターであり、少なくとも1つの発現カセットは少なくとも1つのバキュロウイルスエンハンサーエレメント及び/又は少なくとも1つのエクジソン応答エレメントを含み、好ましいエンハンサーエレメントはhr1、hr2、hr2.09、hr3、hr4、hr4b及びhr5からなる群から選択される。好ましい実施形態では、本発明は、パルボウイルスRepタンパク質をコードする単一のオープンリーディングフレームを含む1種類以下のヌクレオチド配列を含む昆虫細胞に関する。好ましくは、単一のオープンリーディングフレームはパルボウイルスRepタンパク質のうちの1つ又は複数をコードし、より好ましくはオープンリーディングフレームはパルボウイルスRepタンパク質の全てをコードし、最も好ましくは、オープンリーディングフレームは好ましくは少なくともRep52及びRep78タンパク質を昆虫細胞で発現させることができる完全長Rep78タンパク質をコードする。本明細書において、昆虫細胞は、例えば多コピーエピソームベクターの中に単一タイプのヌクレオチド配列の複数のコピーを含むことができるが、これらは本質的に全く同一の核酸分子、又は少なくとも全く同一のRepアミノ酸配列をコードする核酸分子、例えば、遺伝子コードの同義性のために互いに異なるだけである核酸分子の複数のコピーであると理解される。パルボウイルスRepタンパク質をコードする単一タイプの核酸分子だけの存在は、Rep配列を含む異なるタイプのベクターに存在するような、昆虫細胞におけるパルボウイルス生成レベル(の安定性)に影響を及ぼす、欠陥のあるRep発現構築物をもたらすかもしれない相同配列の間の組換えを回避する。
方法
さらなる態様では、本発明は細胞で組換えパルボウイルスビリオンを生成する方法であって:
a)本明細書で規定される細胞を組換えパルボウイルスビリオンが生成される条件下で培養するステップ;及び
b)組換えパルボウイルスビリオンを回収するステップ
を含む方法を提供する。
さらなる態様では、本発明は細胞で組換えパルボウイルスビリオンを生成する方法であって:
a)本明細書で規定される細胞を組換えパルボウイルスビリオンが生成される条件下で培養するステップ;及び
b)組換えパルボウイルスビリオンを回収するステップ
を含む方法を提供する。
回収は、好ましくは、抗AAV抗体、好ましくは固定化された抗体を使用した、組換えパルボウイルス(rAAV)ベクターを含むビリオンの親和性精製のステップを含む。抗AAV抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。特に好適な抗体は、例えばラクダ又はラマから得られるような、単鎖ラクダ抗体又はその断片である(例えば、Muyldermans、2001年、Biotechnol.74:277~302頁を参照する)。rAAVの親和性精製のための抗体は、好ましくはAAVカプシドタンパク質の上のエピトープに特異的に結合する抗体であり、それによって、好ましくはエピトープは複数のAAV血清型のカプシドタンパク質の上に存在するエピトープである。例えば、抗体はAAV2カプシドへの特異的結合に基づいて産生又は選択することができるが、同時に、それはAAV1、AAV3及びAAV5カプシドに特異的に結合することもできる。
一実施形態では、細胞は昆虫細胞であり、及び/又はパルボウイルスビリオンはAAVビリオンである。
さらなる実施形態では、ステップb)の組換えパルボウイルスビリオンの回収は、固定化抗パルボウイルス抗体、好ましくは単鎖ラクダ抗体又はその断片を使用した、ビリオンの親和性精製、及び30~70nmの名目孔径を有するフィルターでの濾過のうちの少なくとも1つを含む。
したがって、一実施形態では、本発明は細胞で組換えパルボウイルスビリオンを生成する方法であって:
a)本明細書で規定される細胞を組換えパルボウイルスビリオンが生成される条件下で培養するステップ;及び
b)組換えパルボウイルスビリオンを回収するステップ
を含む方法を提供し、ステップb)の組換えパルボウイルスビリオンの回収は、固定化抗パルボウイルス抗体、好ましくは単鎖ラクダ抗体若しくはその断片を使用した、ビリオンの親和性精製、又は30~70nmの名目孔径を有するフィルターでの濾過のうちの少なくとも1つを含む。
a)本明細書で規定される細胞を組換えパルボウイルスビリオンが生成される条件下で培養するステップ;及び
b)組換えパルボウイルスビリオンを回収するステップ
を含む方法を提供し、ステップb)の組換えパルボウイルスビリオンの回収は、固定化抗パルボウイルス抗体、好ましくは単鎖ラクダ抗体若しくはその断片を使用した、ビリオンの親和性精製、又は30~70nmの名目孔径を有するフィルターでの濾過のうちの少なくとも1つを含む。
さらなる態様では、本発明は、本発明の上記の方法で生成されるパルボウイルスビリオンのバッチに関する。「パルボウイルスビリオンのバッチ」は、本明細書において、任意選択で昆虫細胞の容器ごとの、同じラウンドの生成で生成される全てのパルボウイルスビリオンと規定される。好ましい実施形態では、本発明のパルボウイルスビリオンのバッチは、前記のような完全ビリオン:全ビリオンの比、及び/又は前記のような完全ビリオン:空の比を含む。
構築物とキット
さらなる態様では、本発明は本明細書で規定される第1の核酸構築物を提供する。一実施形態では、本明細書で規定される第2の核酸構築物が提供される。
さらなる態様では、本発明は本明細書で規定される第1の核酸構築物を提供する。一実施形態では、本明細書で規定される第2の核酸構築物が提供される。
さらなる態様では、本発明は、少なくとも本明細書で規定される第1の核酸構築物及び本明細書で規定される第2の核酸構築物を含むパーツのキット(kit of parts)を提供する。キットは、昆虫細胞及び/又は本明細書で規定されるヌクレオチド配列及び/又は昆虫細胞での発現のためのバキュロウイルスヘルパー機能をコードする核酸配列をさらに含むことができる。
発明の利点
本発明の発明者らは、誘導性プラスミドベクター(パルボウイルスレプリカーゼタンパク質を発現する)設計を2つの方法でさらに最適化した。
本発明の発明者らは、誘導性プラスミドベクター(パルボウイルスレプリカーゼタンパク質を発現する)設計を2つの方法でさらに最適化した。
第1に、AAV遺伝子発現の調節における代わりのバキュロウイルスプロモーターの使用を調査することによる。これまで、BEV設定で、多面体プロモーター(polH)がAAV生成において最も研究されたプロモーターである(van Oers、M.M.ら、J Gen Virol.2015年1月;96(Pt 1):6~23頁)。p10などの代わりの後期プロモーターが宿主因子をpolHと共有することが報告されているが(Ghosh、S.ら、J Virol.1998年9月;72(9):7484~93頁)、他のバキュロウイルスプロモーターは異なる誘導強度及び時間的プロファイルを示すことが報告されている(Dong、Z.Q.ら、J Biol Eng.2018年12月4日;12:30;Lin、C.H及びJarvis、D.L.、J Biotechnol.2013年5月10日;165(1):11~7頁;Martinez-Solis、M.ら、PeerJ.、2016年1月28日;4:e2183)。それにもかかわらず、昆虫細胞でのAAV生成のためのそれらの潜在的有用性は、これまで全く報告されていない。
第2に、宿主細胞に非常に毒性であるAAV Repの発現のよりタイトな調節もこの研究で探られる。バキュロウイルス相同領域(hr)2又はhr2.09エンハンサー配列のpolHと組み合わせた使用が、誘導性OneBacプラットホームのためのデフォルト分子設計になっている(Aslanidi、G.ら、Proc Natl Acad Sci USA.2009年3月31日;106(13):5059~64頁)。ここで、我々は、OneBacプラットホーム、特にOneBac Cap Transをグレードアップする目的で、他のバキュロウイルスhrと組み合わせた代わりのバキュロウイルスプロモーターの潜在的有用性を検査した。異なるバキュロウイルスプロモーター及びエンハンサーを異なる分子配座でも調査することによって、高い力価の高品質のAAVバッチを与える、安定した頑強なAAV生成プラットホームを最終的にもたらすことができる、AAV遺伝子(Cap、Rep)の発現を最適化することを目指す。
本発明は、したがって、野生型(wt)の単一の又は分割されたカセットのAAV Rep又は他のAAV遺伝子発現を調節する誘導性発現構築物を形成するために、類似の又は異なる発現強度及び時間的プロファイルを有する代わりの及び非保存的バキュロウイルスプロモーター(p10、39k、p6.9、pSel120)の使用を提供する。これは、組換えバキュロウイルスのトランス活性化の後のシス:トランスプロモーター競合が起こりにくいという利点を有する、誘導性プラスミドベクター構築物の生成を可能にする。さらに、本発明によって提供される新規の非hr2-0.9バキュロウイルスhrエンハンサーは、非誘導条件下で漏出性がより低く、それによって、誘導性プラスミドベクター構築物からの毒性Repタンパク質のよりタイトな調節の利点を提供する。
本発明の追加の利益には、OneBac及び昆虫細胞プラットホームに対して向上したAAV生成収量及び品質;より生存能力のある安定したAAVパッケージング細胞を可能にする、スイッチが「オフ」のときにRepなどの有害なAAV遺伝子の発現がない、誘導性プロモーターの生成;及び分割カセットRep AAV設計の誘導性プラスミドベクターへの適応が含まれる。
示した実施例で、発明者は、生成物の品質及びベクター収量に及ぼす二重発現カセット(例えば、Bac.Cap-RepとBac.Cap-Trans又はBac.Cap-RepとBac.Trans)の使用の影響を検討することを目指す。実施例1で、発明者はwtAAV5及びAAV2/5の収量及び生成物品質に及ぼす二重Rep-Capカセットの分子最適化の影響を特徴付ける。実施例2で、発明者は最適化されたwtAAV5 Cap-Rep及び導入遺伝子バキュロウイルス(DuoBac)でwtAAV5を生成し、それを三重感染で生成されたwtAAV5に対して比較する。実施例3で、発明者はDuoBac収量をより大きな生成規模対三重Bac系に外挿する。最後に、実施例4で、発明者は、品質及びベクター収量に及ぼすCap-Trans及びCap-Rep二重バキュロウイルス(DuoDuoBac)の様々な組合せの使用の影響を検査し、これらを三重感染wtAAV5生成と比較する。
方法及び材料
発現カセット
簡潔には、Cap-Rep DuoBac構築物(DuoBac CapRep1~7)は、ポリヘドリン(PolH)又はP10プロモーターの制御下のCapカセット(wtAAV5又はAAV2/5)及びRepカセットの組合せを含む。ここでは、Repカセットは、PolH及びdIE1プロモーターによってそれぞれ制御されるRep52及びRep78によるスプリットデザインである。DuoBac CapTrans1は、PolHプロモーターの制御下のwtAAV5 CapカセットをBacTrans4導入遺伝子カセットと組み合わせる。DuoBac及びTripleBac AAV生成のために、単一の発現カセット構築物も必要だった。これらの構築物は常に同じに保たれ、BacCap1又はBacCap2、(wtAAV5)、及びBacRep1、スプリットRepカセットである。図2は、カセットデザインで使用された配向を要約し、表1A及び1Bは構築物ごとに使用された異なるプロモーター/開始コドン組合せを要約する。
発現カセット
簡潔には、Cap-Rep DuoBac構築物(DuoBac CapRep1~7)は、ポリヘドリン(PolH)又はP10プロモーターの制御下のCapカセット(wtAAV5又はAAV2/5)及びRepカセットの組合せを含む。ここでは、Repカセットは、PolH及びdIE1プロモーターによってそれぞれ制御されるRep52及びRep78によるスプリットデザインである。DuoBac CapTrans1は、PolHプロモーターの制御下のwtAAV5 CapカセットをBacTrans4導入遺伝子カセットと組み合わせる。DuoBac及びTripleBac AAV生成のために、単一の発現カセット構築物も必要だった。これらの構築物は常に同じに保たれ、BacCap1又はBacCap2、(wtAAV5)、及びBacRep1、スプリットRepカセットである。図2は、カセットデザインで使用された配向を要約し、表1A及び1Bは構築物ごとに使用された異なるプロモーター/開始コドン組合せを要約する。
細胞培養及びバキュロウイルス増幅
ExpresSF+昆虫細胞を、28℃で135RPMの振盪フラスコの中のSF-900II SFM培地(Gibco)で維持した。各実施例の生成のために、新鮮なバキュロウイルスを産生した。ここでは、ExpresSF+細胞は、昆虫細胞1mlにつき保存株3μlの濃度の冷凍バキュロウイルス保存株で接種した。感染の開始の72時間後に、1900xgで15分間細胞を遠心分離し、細胞上清を保存することによって新鮮なバキュロウイルスを採取した。
ExpresSF+昆虫細胞を、28℃で135RPMの振盪フラスコの中のSF-900II SFM培地(Gibco)で維持した。各実施例の生成のために、新鮮なバキュロウイルスを産生した。ここでは、ExpresSF+細胞は、昆虫細胞1mlにつき保存株3μlの濃度の冷凍バキュロウイルス保存株で接種した。感染の開始の72時間後に、1900xgで15分間細胞を遠心分離し、細胞上清を保存することによって新鮮なバキュロウイルスを採取した。
AAVの生成及び精製
AAV材料は、expresSF+昆虫細胞を容積測定に基づいて二重発現カセット(Cap-Rep及びCap-Trans)若しくは単一の発現カセット(Cap、Rep、Trans)を含む新たに増幅させた組換えバキュロウイルスの様々な組合せ、又は二重発現(Cap-Rep)及び単一の(Trans)発現カセットの組合せと同時感染させることによって産生した。正確な比は、実施例に記載される。28℃で72時間のインキュベーションの後、細胞を溶解緩衝液(1.5M NaCl、0.5Mトリス-HCl、1mM MgCl2、1%Triton x-100、pH=8.5)で1時間溶解した。次に、ゲノムDNAを37℃で1時間ベンゾナーゼ(Merck)で消化し、その後細胞デブリを15分間の1900xgでペレットにした(未精製溶解物試料)。精製の開始まで、上清を4℃で保存した。次に、AVBセファロース(GE healthcare)によるバッチ結合によって、AAVを未精製の溶解したバルク(CLB)から精製した。簡潔には、AVBセファロース樹脂を0.2M HPO4 pH=7.5緩衝液で洗浄し、その後透明にした未精製溶解物を樹脂に加え、85rpmでのインキュベーター振盪の中で室温(RT)で2時間インキュベートした。樹脂を0.2M HPO4 pH=7.5緩衝液で再び洗浄した。次に、結合したウイルスは、0.2MグリシンpH=2.5の添加により樹脂から溶出させた。溶出したウイルスのpHは、0.5Mトリス-HCl pH=8.5の添加によって直ちに中和し、さらなる使用まで-20℃で保存した。
AAV材料は、expresSF+昆虫細胞を容積測定に基づいて二重発現カセット(Cap-Rep及びCap-Trans)若しくは単一の発現カセット(Cap、Rep、Trans)を含む新たに増幅させた組換えバキュロウイルスの様々な組合せ、又は二重発現(Cap-Rep)及び単一の(Trans)発現カセットの組合せと同時感染させることによって産生した。正確な比は、実施例に記載される。28℃で72時間のインキュベーションの後、細胞を溶解緩衝液(1.5M NaCl、0.5Mトリス-HCl、1mM MgCl2、1%Triton x-100、pH=8.5)で1時間溶解した。次に、ゲノムDNAを37℃で1時間ベンゾナーゼ(Merck)で消化し、その後細胞デブリを15分間の1900xgでペレットにした(未精製溶解物試料)。精製の開始まで、上清を4℃で保存した。次に、AVBセファロース(GE healthcare)によるバッチ結合によって、AAVを未精製の溶解したバルク(CLB)から精製した。簡潔には、AVBセファロース樹脂を0.2M HPO4 pH=7.5緩衝液で洗浄し、その後透明にした未精製溶解物を樹脂に加え、85rpmでのインキュベーター振盪の中で室温(RT)で2時間インキュベートした。樹脂を0.2M HPO4 pH=7.5緩衝液で再び洗浄した。次に、結合したウイルスは、0.2MグリシンpH=2.5の添加により樹脂から溶出させた。溶出したウイルスのpHは、0.5Mトリス-HCl pH=8.5の添加によって直ちに中和し、さらなる使用まで-20℃で保存した。
Q-PCRによる滴定及びA260/A280又はHPLCによる全体/完全の比の測定
未精製溶解物及び精製されたAAVバッチのウイルス力価は、Q-PCRによって決定した。Q-PCRは、導入遺伝子のプロモーター領域に特異的なプライマーで実行した。Q-PCRは、Applied Biosystems 7500迅速Q-PCRシステムで実行した。精製されたAAVバッチの全体/完全の比は、UV/可視光吸光分光分析によって測定した。1μlの10%SDSを100μlの精製AAVと混合し、75℃で10分間インキュベートした。熱処理の後、260及び280nmでの吸光度をNanodropで測定した。Sommerら2003年によって記載される計算を使用して、AAV材料の全体/完全の比を計算した。或いは、全粒子をHPLCによって測定した。ここでは、精製されたAAV材料はサイズ排除カラムにロードされる。カプシドピークの曲線下面積を積分することを通して、全粒子を決定する。その後、全粒子をQ-PCRによって測定されたウイルス力価で割ることによって、全体/完全の比を計算する。
未精製溶解物及び精製されたAAVバッチのウイルス力価は、Q-PCRによって決定した。Q-PCRは、導入遺伝子のプロモーター領域に特異的なプライマーで実行した。Q-PCRは、Applied Biosystems 7500迅速Q-PCRシステムで実行した。精製されたAAVバッチの全体/完全の比は、UV/可視光吸光分光分析によって測定した。1μlの10%SDSを100μlの精製AAVと混合し、75℃で10分間インキュベートした。熱処理の後、260及び280nmでの吸光度をNanodropで測定した。Sommerら2003年によって記載される計算を使用して、AAV材料の全体/完全の比を計算した。或いは、全粒子をHPLCによって測定した。ここでは、精製されたAAV材料はサイズ排除カラムにロードされる。カプシドピークの曲線下面積を積分することを通して、全粒子を決定する。その後、全粒子をQ-PCRによって測定されたウイルス力価で割ることによって、全体/完全の比を計算する。
精製されたAAVバッチの全タンパク質ゲル
精製されたAAVバッチは、95℃で5分間加熱した、10%β-メルカプトエタノール(Bio-Rad)を補った4×Laemmli試料緩衝液(Biorad)で希釈し、4~20%ミニPROTEAN(登録商標)TGXステインフリーゲル(Biorad)にロードした。TGS緩衝液(Biorad)中での200ボルトでの35分間の電気泳動の後、ゲルを紫外線の下に5分間曝露させ、Chemidocタッチ撮影装置(Biorad)でバンドを可視化することによって、ゲル染色を発色させた。
精製されたAAVバッチは、95℃で5分間加熱した、10%β-メルカプトエタノール(Bio-Rad)を補った4×Laemmli試料緩衝液(Biorad)で希釈し、4~20%ミニPROTEAN(登録商標)TGXステインフリーゲル(Biorad)にロードした。TGS緩衝液(Biorad)中での200ボルトでの35分間の電気泳動の後、ゲルを紫外線の下に5分間曝露させ、Chemidocタッチ撮影装置(Biorad)でバンドを可視化することによって、ゲル染色を発色させた。
HelaRC32での感染性アッセイ
単一の感染性粒子に必要とされるゲノムコピー数(gc/ip)は、限界希釈をベースとした感染力価アッセイで決定した。簡潔には、AAV由来のRep及びCapタンパク質を安定して発現するHelaRC32(ATCC)細胞は、10反復でAAV希釈系列で形質導入し、50のwtAd5:HeLaRC32 MOIのWTアデノウイルス5(wtAd5)の有る無しで感染させた。プレートは37℃で48時間インキュベートし、ベクターゲノム特異的プライマープローブセットを使用したQ-PCRによって、ウェルをベクターゲノムDNAの有無について調査した。播種されたベクターゲノムあたりの感染性粒子の数は、Spearman-Karber法[5]により計算した。
単一の感染性粒子に必要とされるゲノムコピー数(gc/ip)は、限界希釈をベースとした感染力価アッセイで決定した。簡潔には、AAV由来のRep及びCapタンパク質を安定して発現するHelaRC32(ATCC)細胞は、10反復でAAV希釈系列で形質導入し、50のwtAd5:HeLaRC32 MOIのWTアデノウイルス5(wtAd5)の有る無しで感染させた。プレートは37℃で48時間インキュベートし、ベクターゲノム特異的プライマープローブセットを使用したQ-PCRによって、ウェルをベクターゲノムDNAの有無について調査した。播種されたベクターゲノムあたりの感染性粒子の数は、Spearman-Karber法[5]により計算した。
ゲノムAAV DNAを用いたホルムアルデヒドゲル電気泳動
ゲノムAAV DNAを精製AAVバッチからPCR精製ヌクレオスピンキット(Machery Nagel)を用いて単離した。電気泳動ランの前に、500ngのAAVゲノムDNAを、ホルムアルデヒドローディング緩衝液(1mlの20×MOPS、3.6mlの37%ホルムアルデヒド、67%スクロース中の2mlの5mg/mlのOrange G、MQで10mlにした)の中で95℃で10分間変性させ、直ちに氷上に置いた。次に試料を6.6%ホルムアルデヒドを補充した1xMOPS(40mM MOPS、10mM NaAc、1mM EDTA、pH=8.0)で作成した1%アガロースゲル上で実行した。次に試料を2時間、100ボルト、6.6%ホルムアルデヒドランニング緩衝剤を補充した1xMOPS中で泳動した。泳動後、DNAをSYBR Gold(Thermofisher)を用いて染色し、バンドをケミドックタッチイメージャー(Biorad)で視覚化した。
ゲノムAAV DNAを精製AAVバッチからPCR精製ヌクレオスピンキット(Machery Nagel)を用いて単離した。電気泳動ランの前に、500ngのAAVゲノムDNAを、ホルムアルデヒドローディング緩衝液(1mlの20×MOPS、3.6mlの37%ホルムアルデヒド、67%スクロース中の2mlの5mg/mlのOrange G、MQで10mlにした)の中で95℃で10分間変性させ、直ちに氷上に置いた。次に試料を6.6%ホルムアルデヒドを補充した1xMOPS(40mM MOPS、10mM NaAc、1mM EDTA、pH=8.0)で作成した1%アガロースゲル上で実行した。次に試料を2時間、100ボルト、6.6%ホルムアルデヒドランニング緩衝剤を補充した1xMOPS中で泳動した。泳動後、DNAをSYBR Gold(Thermofisher)を用いて染色し、バンドをケミドックタッチイメージャー(Biorad)で視覚化した。
実験計画(DoE)法
DuoBac及びTripleBac系の全体:完全の比に及ぼす上流バイオプロセス分散の影響を研究するために、2つの研究を実験計画(DoE)法及び分析にかけた。2つの研究はわずかに異なる方法を使用して実行したが、両方の場合において実験分散を振盪フラスコに導入し、同等の方法を使用してAAV精製を実行した。さらに、両方の研究のために、各実験条件のために2種類の分析を精製試料で実行した:ベクターゲノムコピー数(gc)を決定するためにqPCRを使用し、含有量に関係なく粒子の総量を決定するためにSEC-HPLCを使用した。ゲノムコピーを含有する完全カプシドに対する全AAVカプシドの割合を表す、全体:完全の比を計算するために、これらの2つの測定基準をその後使用した。両試験の間の差は、2つの以降のセクションに記載される。
DuoBac及びTripleBac系の全体:完全の比に及ぼす上流バイオプロセス分散の影響を研究するために、2つの研究を実験計画(DoE)法及び分析にかけた。2つの研究はわずかに異なる方法を使用して実行したが、両方の場合において実験分散を振盪フラスコに導入し、同等の方法を使用してAAV精製を実行した。さらに、両方の研究のために、各実験条件のために2種類の分析を精製試料で実行した:ベクターゲノムコピー数(gc)を決定するためにqPCRを使用し、含有量に関係なく粒子の総量を決定するためにSEC-HPLCを使用した。ゲノムコピーを含有する完全カプシドに対する全AAVカプシドの割合を表す、全体:完全の比を計算するために、これらの2つの測定基準をその後使用した。両試験の間の差は、2つの以降のセクションに記載される。
DoE DuoBac系:設計空間及び実験プラットホーム
表2に掲載されるように中心複合計画(CCD)により、Sf+細胞のDuoBac媒介形質導入の間に実験分散を導入した。これは、3反復中点で合計17の実験条件(「生成培養」)を与えた。
表2に掲載されるように中心複合計画(CCD)により、Sf+細胞のDuoBac媒介形質導入の間に実験分散を導入した。これは、3反復中点で合計17の実験条件(「生成培養」)を与えた。
増幅されたバキュロウイルス及び種細胞は、揺動運動バイオリアクター(BioWave PU-Biostat、Sartorius)を使用して10Lウェーブバッグ(Flexsafe、Sartorius)の中で産生した。この試験全体で使用した培地は、Sf900 II培地(ThermoFisher)であった。全てのインキュベーションの設定は以下の通りであったT=28℃;25rpm及び8°の角度で撹拌;DO=50%;及び0.2L/分の気流速度。細胞の増幅のために1つの専用のバイオリアクターを5Lの作業容量、及び1.2×106VC/mL(リアクターA)の初期VCDで使用した。リアクターAの接種から18.5時間後に、2つのバイオリアクターを0.8×106VC/mLの濃度及び5.25L(リアクターB及びC)の作業容量で接種した。バキュロウイルスBacTrans5及びDuoBac CapRep3の別々の増幅のために、細胞接種の18時間後に15.75mLのバキュロウイルス作業種ウイルス(WSV)をリアクターB及びCに加えた。追加の48時間のインキュベーション後に、全てのリアクターを採取した。生じた材料(細胞及びバキュロウイルス)は、AAV生成培養を調製するために使用した。
生成培養のために、TOI時のVCD及び培地組成を制御する形質導入の前に、新鮮培地交換ステップを実行した。この培地交換は300gでの各種培養の弱い遠心分離を含み、上清を廃棄し、新鮮培地に細胞を再懸濁してTOI時の目標VCDを達成した。生成培養組成は、表2の規定により実行した。
70時間後に、形質導入は、溶解(10×溶解緩衝液の10v/v%の添加、37℃及び135rpmでの60分間のインキュベーション)、ベンゾナーゼ処理(1mLにつき10単位のベンゾナーゼの添加、37℃及び135rpmでの60分間のインキュベーション)、清澄化(室温及び4100gでの15分間の遠心分離)及び濾過(真空下の0.22μmボトルトップフィルターによる濾過)の連続ステップによって終了した。偶発のウイルス不活性化のために、濾液を室温で12時間インキュベートした。(1)0.2Mリン酸緩衝液pH7.5中での(1:1の容量比)AVBセファロースHP樹脂の調製;(2)250μLの樹脂懸濁液の40mLの濾液への添加及び40rpmで4時間のインキュベーション;(3)4100gで5分間の樹脂の遠心分離;(4)0.2Mリン酸緩衝液pH7.5によるペレットの洗浄;(5)4分間のインキュベーションの間の500μLの0.5Mグリシン/HCl pH2.5を使用したペレットの抽出;(6)ベンチトップ遠心分離を使用した使用済みペレットの遠心分離;(7)200μLのトリス/HCl pH8.5緩衝液を使用した上清の中和;及び(8)0.22μm PVDFシリンジフィルターによる中和された溶出液の濾過を含むバッチ結合親和性クロマトグラフィープロトコールを使用して、残りの濾液を精製した。精製された材料は、全体:完全の比を決定するためにqPCR及びSEC-HPLC分析のために使用した。
結果
実施例1:wtAAV5及びAAV2/5 Cap-Rep DuoBac構築物の特徴付け
昆虫細胞でのAAV生成は、Rep、Cap及びTransカセットを含む3つのバキュロウイルスを同時感染させることによって一般的に実行される。全ての3つの成分が同時に細胞中に存在する統計的可能性を向上させるために、Cap及びRep発現カセットを単一のバキュロウイルスに移動させた(図1)。二重感染設定で生成されるwtAAV5及びAAV2/5の品質及び量を向上させることができるかどうか調査するために、発明者は単一のRep発現カセットをスプリットRep発現カセットに換え、Capのプロモーター/VP1開始コドン組合せを最適化した。スプリットRepカセットの導入は、Rep52及びRep78のタイミング及び発現強度へのより優れた制御を与えることができる。さらに、カプシドのVP123比の最適化は、感染性AAVの生成のために必須である。
実施例1:wtAAV5及びAAV2/5 Cap-Rep DuoBac構築物の特徴付け
昆虫細胞でのAAV生成は、Rep、Cap及びTransカセットを含む3つのバキュロウイルスを同時感染させることによって一般的に実行される。全ての3つの成分が同時に細胞中に存在する統計的可能性を向上させるために、Cap及びRep発現カセットを単一のバキュロウイルスに移動させた(図1)。二重感染設定で生成されるwtAAV5及びAAV2/5の品質及び量を向上させることができるかどうか調査するために、発明者は単一のRep発現カセットをスプリットRep発現カセットに換え、Capのプロモーター/VP1開始コドン組合せを最適化した。スプリットRepカセットの導入は、Rep52及びRep78のタイミング及び発現強度へのより優れた制御を与えることができる。さらに、カプシドのVP123比の最適化は、感染性AAVの生成のために必須である。
構築物DuoBac CapRep1~7(表1A及び図1)は、wtAAV5及びAAV2/5 Capの発現を最適化して、それらをスプリットRepカセットから発現されるRepとバランスさせるように設計した。これらの変化のAAVベクター収量及び品質に及ぼす影響を調査するために、DuoBac生成を治療関連の導入遺伝子(BacTrans4)で実行した。AAVは、5%の新たに増幅したCap-Repバキュロウイルス及び1%の新たに増幅した導入遺伝子バキュロウイルスを有するexpresSF+昆虫細胞(50ml)で生成した。生成の後、ウイルスを精製し、生じたAAV材料でいくつかのアッセイを実行した。ウイルス力価(Q-PCRによる)は、未精製溶解物で決定した。全体/完全の比(HPLC/Q-PCRによる)及びカプシド化学量(SDS-Pageゲルによる)は、精製されたAAVで決定した。1感染性粒子に必要とされるゲノムコピー数(gc/IP)は、HelaRC32細胞における感染性アッセイで決定した。
図3は、wtAAV5及びAAV2/5 DuoBac生成の未精製溶解物で測定したウイルス力価を要約する。高いウイルスの収量(>1e11 gc/ml)は構築物DuoBac CapRep2、5及び7で得られ、比較的低い収量は構築物DuoBac CapRep1及び6で観察された。精製されたウイルスバッチの全体/完全の比は、全粒子/ml(HPLCで決定した)をゲノムコピー/ml(Q-PCRで決定した)で割ることによって決定された。一般的に、全てのDuoBac構築物で低い全体/完全の比(<2.0)が観察された(図4)。この観察は、通常5を越える、TripleBac AAV生成で通常観察される全体/完全の比とかなり対照的である(実施例2を参照する)。精製されたAAVのカプシド化学量は、SDS-Pageゲル電気泳動によって決定された(図5、DuoBac CapRep6のカプシド化学量は低いウイルス収量のために決定できなかった)。カプシド化学量は、どのDuoBac構築物が使用されたかによってかなりの影響を受けた。DuoBac CapRep3及び7は1:1:10の正しいカプシド化学量を提示するが、DuoBac CapRep2、4及び5は最適以下のカプシド化学量を提示する(DuoBacCapRep2、4及び5では低いVP1、又はDuoBac CapRep1の場合は非常に高いVP1)。これらの変化がAAV感染性に及ぼす可能性のある影響は、HelaRC32における限界希釈感染性アッセイによって決定された(図6)。AAV感染性の結果は、カプシド化学量の結果を映した。ここでは、DuoBac CapRep1、3及び6は、カプシドにおける正常であるか又は高いVP1のために高い感染性(低いgc/ip)を示した。一方、DuoBac CapRep2、4及び5(高いgc/ip)はカプシドにおける低い量のVP1のために低減された感染性を示した。表3は、これらの実験からのデータを要約する。
これらの結果から、プロモーター競合はwtAAV5 DuoBac構築物のウイルス力価にかなりの影響を及ぼす(wtAAV5、DuoBac CapRep1及び6の場合PolH Rep+PolH Cap=低い力価)が、AAV2/5にはより少ない(AAV2/5、DuoBac CapRep3の場合PolH Rep+PolH Cap=高い力価)ようである。wtAAV5カセットの前にP10プロモーターを導入することは力価(DuoBac CapRep2)を向上させるが、最適以下のVP123化学量をもたらす。VP1の前により強力な開始コドンを導入すること(二重ATG)はVP123化学量をレスキューし、高い力価(DuoBac CapRep7)をもたらす。これはCapVP1のためのプロモータータイプ及び開始強度のバランスをとることが、正しいAAVカプシド化学量で高い力価を生成するために必須であることを示す。さらに、同じバキュロウイルスでRep及びCapを組み合わせることによって、プロセスの複雑性が低減される。AAV遺伝子のこの組合せは、全体/完全の比の明白な向上にさらにつながった。DuoBac AAV生成がどのようにTripleBac AAV生成に匹敵するかは、実施例2で調べられる。
実施例2:AAV5 DuoBac(Bac.Cap-Rep及びBac.Transgene)及び三重Bac(Bac.Cap、Bac.Rep Bac.Transgene)AAV生成の比較。
前の実施例は、同じバキュロウイルスの上でCap及びRepカセットを組み合わせ、Capカセットを分子的に最適化することによって、向上したAAV生成物を生成することができることを示した。この実施例は、DuoBac及びTripleBacプロセスによって生成されたAAVを比較する。2つの生成系DuoBac(DuoBac CapRep7:Cap wtAAV5-Rep)を比較するために、生成をベクター収量及び品質に関してTripleBac AAV生成(BacCap1 wtAAV5、BacRep1)と比較した。レポーター及び2つの治療関連の導入遺伝子を、AAV生成(BacTrans1、3及び4)で使用した。AAV生成を実行するために、expresSF+昆虫細胞(50ml又は2.5L)を新たに増幅されたバキュロウイルス保存株の複数の容量比で接種した。接種量は、培養量の1~5%の範囲であった。生成の後、ウイルスを精製し、いくつかのアッセイをその材料で実行した。ウイルス力価(Q-PCRによりgc/mlで表す)は、未精製溶解物及び精製AAVで決定した。全体/完全の比(A260/A280による)及びVP123比(SDS-Pageゲルによる)は、精製されたAAV材料で決定した。
表4は50mlの生成結果を要約し、表5は2.5Lの生成結果を要約する。50ml及び2.5Lスケールの両方で、DuoBac生成はウイルス収量及び全体/完全の比の両方でTripleBac生成に優る。生成のために使用した接種量又は導入遺伝子によって、CLBにおける力価(gc/ml)は、同等のTripleBac生成と比較してDuoBac CapRep7で4~10倍向上した。生成から精製された全ゲノムコピーは、類似の倍率で増加した。興味深いことに、全体/完全の比もDuoBacプロセスで向上した。ここでは、使用した導入遺伝子はこのパラメータが向上させる量に影響するようであるが、全体/完全の比はDuoBac生成において一貫して向上した(生成のために使用した導入遺伝子カセットによって概ね2~8倍)。VP123カプシドタンパク質の発現はDuoBacとTripleBac AAV生成の間で同一で(図7)、1:1:10の理想的な化学量を維持していた。
同じバキュロウイルスの上でCap及びRep発現カセットを組み合わせることによってプロセスの複雑性を低減することは、収量及び全体/完全の比の明白な向上をもたらした(図8)が、AAVの理想的なVPタンパク質化学量は維持された。ここでは調査されないが、3つから2つの変数への低減のために、プロセスの頑健性(バッチ間の変動)をDuoBacプロセスで向上させることができそうである。
実施例3:DuoDuoBac(Bac.Cap-Rep及びBac.Cap-Trans)のTripleBac AAV(Bac.Cap、Bac.Rep Bac.Transgene)との比較
以前の研究は、TripleBac AAV生成のCap:Repバキュロウイルス接種比が、AAV生成の全体/完全の比及び力価収量に直接的な影響を及ぼすことを示した。ここでは、Repバキュロウイルス接種の増加は、カプシド生成及び全体/完全の比の低減をもたらした。対照的に、Capバキュロウイルス接種比の増加は、全体/完全の比及び収量を増加させた。Rep及び導入遺伝子バキュロウイルスの両方にCapカセットを導入し、それによって二重DuoBacプロセス又はDuoDuoBacプロセス(図1)を形成することによって、我々は、AAV生成の間に細胞におけるCap:Rep比を制御するより多くの自由を有する。さらに、それは、我々がTripleBac AAVプロセスで達成するのが不可能である(AAV生成を阻害する高過ぎる接種量のために)Cap:Rep生成比(特に高いCap比)を探ることを可能にするだろう。
以前の研究は、TripleBac AAV生成のCap:Repバキュロウイルス接種比が、AAV生成の全体/完全の比及び力価収量に直接的な影響を及ぼすことを示した。ここでは、Repバキュロウイルス接種の増加は、カプシド生成及び全体/完全の比の低減をもたらした。対照的に、Capバキュロウイルス接種比の増加は、全体/完全の比及び収量を増加させた。Rep及び導入遺伝子バキュロウイルスの両方にCapカセットを導入し、それによって二重DuoBacプロセス又はDuoDuoBacプロセス(図1)を形成することによって、我々は、AAV生成の間に細胞におけるCap:Rep比を制御するより多くの自由を有する。さらに、それは、我々がTripleBac AAVプロセスで達成するのが不可能である(AAV生成を阻害する高過ぎる接種量のために)Cap:Rep生成比(特に高いCap比)を探ることを可能にするだろう。
この実施例では、昆虫細胞感染の間にCap:Rep比を変更することがAAV品質及び収量に及ぼす影響を調査することを目指しており、これはDuoBac CapTrans1のDuoBac CapRep6に対する接種比を変えることによって達成された。DuoDuoBac AAV生成は、TripleBac AAV生成と比較された。AAV生成は、50mlスケールでexpresSF+昆虫細胞で実行した。接種量は、各バキュロウイルスで培養量の1~5%の範囲であった。生成の後、ウイルスをAVBセファロースで精製した。ウイルス力価(Q-PCRにより決定されたgc/ml)は、未精製溶解物及び精製AAVで測定した。全体/完全の比(A260/A280による)及びカプシド組成(SDS-Pageゲルによる)は、精製されたAAVで決定した。さらに、AAV粒子にパッケージされたゲノムDNAは、ホルムアルデヒドゲル電気泳動によっても調査された。
表6は、DuoDuoBac及びTripleBac AAV生成の結果を要約する。DuoDuoBac生成のために、それは使用した接種条件、並びにTripleBac AAV生成で類似の比を達成するために必要とされるだろう同等の接種条件を掲載する。試験したDuoDuoBac AAV生成の全てで、未精製溶解物でのベクター収量は、試験したTripleBac生成の6~7e+11と比較して7e+11~1.4e+12gc/mlに低下し、これは最良のDuoDuoBac条件で2倍の力価上昇が観察されることを意味する。全てのDuoDuoBac生成の全体/完全の比は、TripleBac生成と比較して低減した。DuoDuoBac生成を比較した場合、より多くのRepが存在したときにより低い全体/完全の比が一般的に観察され、より高い全体/完全の比はCapの増加に関連付けされた。試験した最良の条件は、1:3のDuoBac CapTrans1のDuoBac CapRep6共感染に対する比であって、それは約1.5の全体/完全の比で、1.2e+12gc/mlのCLBにおける平均力価をもたらした。その最も接近したTripleBac同等物(5:5:1の比)と比較して、力価は2倍(1.2e+12対6e+11)向上し、全体/完全の比は概ね4倍(1.5対6)向上した。DuoDuoBacとTripleBac生成の間でカプシドタンパク質VP-1、-2及び-3の発現を比較した場合、1:1:10の類似した化学量が試験した全ての条件で観察された(図9)。これは、Rep及び導入遺伝子バキュロウイルスにCapカセットを導入することが最適比を変更せず、それを1:1:10に維持したことを示した。さらに、AAV粒子にパッケージされたゲノムDNAは、DuoDuoBacとTripleBac生成の間で類似していた(図10)。両方の生成から単離されたゲノムAAV DNAは、ホルムアルデヒドゲルで同一のバンドパターンをもたらした。主なバンドは長さが2.4kbであり、BacTrans4導入遺伝子の単一のコピーを表す。
要約すると、DuoDuoBacプロセスは、TripleBacと比較してBac.Cap-RepのBac.Cap-Transに対する広範囲の接種比を使用して、向上したベクター収量及び完全対全体の比をもたらす。AAV生成の間に生成細胞におけるCap:Rep比を変更する自由の増加は(2つのCap発現カセットの存在及び感染のために使用したバキュロウイルスの種の数の低減のため)、生成されるAAVの全体/完全の比の舵取り及び最適化を可能にする。我々は、Repの増加はわずかに低い収量及び全体/完全の比をもたらすが、Capの増加はより高い全体/完全の比をもたらすことを観察した。DuoDuoBac生成は、TripleBacと比較して収量及び全体/完全の比の変動を最小にする。さらに、DuoDuoBac AAV生成は、我々がTripleBacプロセスでうまく到達することができないCap:Rep比を探ることを可能にする。DuoDuoBacプロセスによって提供されるこの拡張された操作余地は、より頑強なAAV生成プロセスの開発を潜在的に可能にすることがある。
実施例4:DuoDuoBac(Bac.Cap-Rep及びBac.Cap-Trans)のDuoBac AAV(Bac.Cap、Bac.Rep Bac.Transgene)との比較
4.1 細胞培養及びバキュロウイルス増幅
ExpresSF+昆虫細胞を、上記の条件下でSF-900II SFM培地の中で培養した。新鮮なバキュロウイルス接種原を、前記の通りに産生した。
4.1 細胞培養及びバキュロウイルス増幅
ExpresSF+昆虫細胞を、上記の条件下でSF-900II SFM培地の中で培養した。新鮮なバキュロウイルス接種原を、前記の通りに産生した。
4.2 1L振盪フラスコでのDOE研究
4.2.1 DOE計画
2つの因子(0.33~3%の範囲内の2つの増幅されたバキュロウイルスの容量感染比)及びそれらの相互作用を調査するために、中心複合計画(CCD)を使用した。統計分析は、DesignExpert 11(Statease、Minneapolis、MN)及びJMP 15(SAS Institute社、Cary、NC)を使用して実行した。回転式CCD(α=1.414)及び3つの中心点を使用して、二次応答表面モデルを作成した。濾過された未精製溶解バルク中のゲノムコピー力価及び全粒子のゲノムコピーに対する(tp/gc)比を、応答として設定した。統計的に有意なモデル項目(p<0.1)だけが各モデルで含まれ、段階的回帰を通して選択されたが、モデル階層は維持された。
4.2.1 DOE計画
2つの因子(0.33~3%の範囲内の2つの増幅されたバキュロウイルスの容量感染比)及びそれらの相互作用を調査するために、中心複合計画(CCD)を使用した。統計分析は、DesignExpert 11(Statease、Minneapolis、MN)及びJMP 15(SAS Institute社、Cary、NC)を使用して実行した。回転式CCD(α=1.414)及び3つの中心点を使用して、二次応答表面モデルを作成した。濾過された未精製溶解バルク中のゲノムコピー力価及び全粒子のゲノムコピーに対する(tp/gc)比を、応答として設定した。統計的に有意なモデル項目(p<0.1)だけが各モデルで含まれ、段階的回帰を通して選択されたが、モデル階層は維持された。
4.2.2 AAVの生成及び精製
増幅されたバキュロウイルス及び種細胞(前培養)は、28℃の135rpmの1L振盪フラスコの中で産生した。この試験全体で使用された培地は、SF900 II培地(ThermoFisher)であった。前培養のVCDに基づいて、400mLの最終作業容量中に1.3×106VC/mLの目標播種細胞密度を達成するために、計算された量の培養を各1L振盪フラスコに加える。必要に応じて培養量を400mLにするために、追加のSF900 II培地を各振盪フラスコに加えた。1L振盪フラスコの中での細胞増量は、28℃の135rpmで実行した。接種の15~21時間後に、増幅されたバキュロウイルス接種原のプールをDOE計画による容量感染比で加えた。感染後、設定温度を30℃に上昇させ、135rpmで68~76時間培養を継続した。その後、10%(v/v)の10×溶解緩衝液(Lonza)を加えることによって培養を採取した。溶解を開始して30分後、設定温度を37℃に上昇させた。設定温度に到達したとき、ベンゾナーゼを加え(9単位/mL)、その後培養をさらに60分間インキュベートした。未精製の溶解バルクの清澄化は、4100g及び室温(20~25℃)で15分間の遠心分離、続いて0.2μmメンブランフィルターによる濾過によって実行した。濾過されたバルクは、次にCytivaからのAVBセファロースHP樹脂を使用して精製した。0.2Mグリシン/HCl pH2.4緩衝液を使用して生成物を溶出し、60mMトリスpH8.5を使用してその後中和した。精製された試料は、その後qPCR(ベクターゲノムコピー数、未精製溶解物中のGC濃度を決定するために)及びSEC-HPLC(全AAV粒子の全量を決定するために)によって分析した。表7の結果は、DuoDuoBac系が2つのバキュロウイルスの広範囲の感染比にわたって同等のDuoBac系より高いベクター収量を達成することを示す。
増幅されたバキュロウイルス及び種細胞(前培養)は、28℃の135rpmの1L振盪フラスコの中で産生した。この試験全体で使用された培地は、SF900 II培地(ThermoFisher)であった。前培養のVCDに基づいて、400mLの最終作業容量中に1.3×106VC/mLの目標播種細胞密度を達成するために、計算された量の培養を各1L振盪フラスコに加える。必要に応じて培養量を400mLにするために、追加のSF900 II培地を各振盪フラスコに加えた。1L振盪フラスコの中での細胞増量は、28℃の135rpmで実行した。接種の15~21時間後に、増幅されたバキュロウイルス接種原のプールをDOE計画による容量感染比で加えた。感染後、設定温度を30℃に上昇させ、135rpmで68~76時間培養を継続した。その後、10%(v/v)の10×溶解緩衝液(Lonza)を加えることによって培養を採取した。溶解を開始して30分後、設定温度を37℃に上昇させた。設定温度に到達したとき、ベンゾナーゼを加え(9単位/mL)、その後培養をさらに60分間インキュベートした。未精製の溶解バルクの清澄化は、4100g及び室温(20~25℃)で15分間の遠心分離、続いて0.2μmメンブランフィルターによる濾過によって実行した。濾過されたバルクは、次にCytivaからのAVBセファロースHP樹脂を使用して精製した。0.2Mグリシン/HCl pH2.4緩衝液を使用して生成物を溶出し、60mMトリスpH8.5を使用してその後中和した。精製された試料は、その後qPCR(ベクターゲノムコピー数、未精製溶解物中のGC濃度を決定するために)及びSEC-HPLC(全AAV粒子の全量を決定するために)によって分析した。表7の結果は、DuoDuoBac系が2つのバキュロウイルスの広範囲の感染比にわたって同等のDuoBac系より高いベクター収量を達成することを示す。
4.3 2L撹拌タンクバイオリアクターでの生成
4.3.1 AAVの生成及び精製
増幅されたバキュロウイルス及び種細胞(前培養)は、28℃の135rpmの1L振盪フラスコの中で産生した。この試験全体で使用された培地は、SF900 II培地(ThermoFisher)であった。バキュロウイルスの各組合せのために、2つの2L撹拌タンクリアクター(STR、UniVessel(登録商標)SU、Satorious)を使用してrAAV生成を2反復で実行した。前培養のVCDに基づいて、2Lの最終作業容量中に0.5×106VC/mLの目標播種細胞密度を達成するために、計算された量の培養を2L STRに加える。必要に応じて培養量を2Lにするために、追加のSF900 II培地を2L STRに加えた。2L STRの中での細胞増量は、28℃で実行した。溶存酸素(DO)は、0.2L/分でのオーバレイを通した連続固定気流、及び100~300rpmの撹拌速度を使用した0~150ccmの流速のスパージャーを通した酸素添加によって30%に維持された。接種の43~48時間後に、増幅されたバキュロウイルス接種原のプールを表8に示す容量感染比で加えた。感染後、設定温度を30℃に上昇させ、上記の設定を使用して培養を継続した。
4.3.1 AAVの生成及び精製
増幅されたバキュロウイルス及び種細胞(前培養)は、28℃の135rpmの1L振盪フラスコの中で産生した。この試験全体で使用された培地は、SF900 II培地(ThermoFisher)であった。バキュロウイルスの各組合せのために、2つの2L撹拌タンクリアクター(STR、UniVessel(登録商標)SU、Satorious)を使用してrAAV生成を2反復で実行した。前培養のVCDに基づいて、2Lの最終作業容量中に0.5×106VC/mLの目標播種細胞密度を達成するために、計算された量の培養を2L STRに加える。必要に応じて培養量を2Lにするために、追加のSF900 II培地を2L STRに加えた。2L STRの中での細胞増量は、28℃で実行した。溶存酸素(DO)は、0.2L/分でのオーバレイを通した連続固定気流、及び100~300rpmの撹拌速度を使用した0~150ccmの流速のスパージャーを通した酸素添加によって30%に維持された。接種の43~48時間後に、増幅されたバキュロウイルス接種原のプールを表8に示す容量感染比で加えた。感染後、設定温度を30℃に上昇させ、上記の設定を使用して培養を継続した。
10%(v/v)の10×溶解緩衝液(Lonza)を加えることによって感染の68~76時間後に培養を採取した。溶解を開始して30分後、設定温度を37℃に上昇させた。設定温度に到達したとき、ベンゾナーゼを加え(9単位/mL)、その後培養をさらに60分間インキュベートした。未精製の溶解バルクの清澄化は、4100g及び室温(20~25℃)で15分間の遠心分離、続いて0.2μmメンブランフィルターによる濾過によって実行した。濾過されたバルクは、次にCytivaからのAVBセファロースHP樹脂を充填したカラムを使用して精製した。0.2Mグリシン/HCl 2M尿素 pH2.4緩衝液を使用して生成物を溶出し、60mMトリス2M尿素pH8.5を使用してその後中和した。中和された溶出液は、次に5mL Mustang Q膜(Pall)にロードした。生成物溶出は60mMトリス150mM NaCl 2M尿素pH8.5緩衝液を使用して実行し、その後Planova35Nフィルター(0.01m2)を使用してナノ濾過を実行した。最後に、5%スクロースを含有するリン酸緩衝食塩水(Merck)に対して生成物を限外濾過し、所望の量に濃縮した。
精製された試料は、その後qPCR(ベクターゲノムコピー数、未精製溶解物中のGC濃度を決定するために)、SEC-HPLC(全AAV粒子の全量を決定するために)、FIX力価アッセイ及びHelaRC32での感染性アッセイによって分析した。表8は、DuoDuoBac系(BacCapTrans1+BacCapRep6)が、少なくともベクター収量、力価及び感染性に関して同等のDuoBac系(BacCapRep6+BacTrans4)に優ることを示す。
参考文献:
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3. Pullen, S.S. and P.D. Friesen, Earlytranscription of the ie-1 transregulator gene of Autographa californica nuclearpolyhedrosis virus is regulated by DNA sequences within its 5' noncoding leaderregion. J Virol, 1995. 69(1): p. 156-65.
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5. Grieger, J.C., S. Snowdy, and R.J.Samulski, Separate basic region motifs within the adeno-associated virus capsidproteins are essential for infectivity and assembly. J Virol, 2006. 80(11): p.5199-210.
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Claims (22)
- i)mRNAをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第1のプロモーターを含む第1の発現カセットであって、細胞におけるその翻訳はパルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つを生成する、第1の発現カセット;
ii)mRNAをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第2のプロモーターを含む第2の発現カセットであって、細胞におけるその翻訳はパルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つを生成する、第2の発現カセット;
iii)パルボウイルスVP1、VP2及びVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第3のプロモーターを含む第3の発現カセット;及び
iv)少なくとも1つのパルボウイルス逆方向末端反復配列に隣接する導入遺伝子を含むヌクレオチド配列、
を含む1つ又は複数の核酸構築物を含む細胞であって、
前記第1及び第2の発現カセットのうちの少なくとも1つは、前記第3の発現カセットと共に第1の核酸構築物に存在し、
前記1つ又は複数の核酸構築物による前記細胞のトランスフェクションの後、前記第1のプロモーターは前記第2及び前記第3のプロモーターの前に活性である、細胞。 - 前記パルボウイルス逆方向末端反復配列に隣接する前記導入遺伝子を含む前記ヌクレオチド配列が、第2の核酸構築物に存在する、請求項1に記載の細胞。
- 前記第2の核酸構築物が、パルボウイルスVP1、VP2及びVP3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第4のプロモーターを含む第4の発現カセットをさらに含み、前記第1のプロモーターが前記第2、第3及び第4のプロモーターの前に活性であり、任意選択で前記第3及び第4のプロモーターが同一であり、任意選択で、前記第3及び第4の発現カセットの前記ヌクレオチド配列によってコードされる前記パルボウイルスVP1、VP2及びVP3カプシドタンパク質が同一である、請求項2に記載の細胞。
- 前記パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つ並びに前記パルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つが、前記パルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つの第2のアミノ酸から最もC末端のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む共通アミノ酸配列を含み、前記パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つ並びに前記パルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つの前記共通アミノ酸配列が少なくとも90%同一であり、前記パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つの前記共通アミノ酸配列をコードする前記ヌクレオチド配列並びに前記パルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つの前記共通アミノ酸配列をコードする前記ヌクレオチド配列が90%未満同一である、請求項3に記載の細胞。
- 前記パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つ並びに前記パルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つの前記共通アミノ酸配列が少なくとも99%同一であり、好ましくは100%同一である、請求項4に記載の細胞。
- 前記パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つの前記共通アミノ酸配列をコードする前記ヌクレオチド配列が、前記パルボウイルスRep52及び40のうちの少なくとも1つの前記共通アミノ酸配列をコードする前記ヌクレオチド配列と比較して、前記細胞のための改善されたコドン使用頻度バイアスを有するか、又は前記パルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つの前記共通アミノ酸配列をコードする前記ヌクレオチド配列が、前記パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つの前記共通アミノ酸配列をコードする前記ヌクレオチド配列と比較して、前記細胞のための改善されたコドン使用頻度バイアスを有し、好ましくは、前記パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つ並びに前記パルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つにおける前記共通アミノ酸配列をコードする前記ヌクレオチド配列の間のコドン適応指数の差が少なくとも0.2である、請求項4又は5に記載の細胞。
- 前記第1のプロモーターが構成的プロモーターである、前記請求項のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記第2、第3及び第4のプロモーターのうちの少なくとも1つが誘導性プロモーターである、前記請求項のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記誘導性プロモーターが、ウイルス感染周期のより後期に誘導されるウイルスプロモーター、好ましくは前記ウイルスによる前記細胞のトランスフェクション又は感染の少なくとも24時間後に誘導されるウイルスプロモーターである、請求項8に記載の細胞。
- 前記第1及び第2の核酸構築物のうちの少なくとも1つが前記細胞のゲノムに安定して組み込まれている、前記請求項のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞が昆虫細胞であり、前記第1及び第2の核酸構築物のうちの少なくとも1つが昆虫細胞適合ベクター、好ましくはバキュロウイルスベクターである、前記請求項のいずれか一項に記載の細胞。
- a)前記第1のプロモーターがdeltaElプロモーター及びElプロモーターから選択され;
b)前記第2、第3及び第4のプロモーターがpolHプロモーター及びp10プロモーターから選択される、
請求項11に記載の細胞。 - 少なくとも1つの発現カセットが、少なくとも1つのバキュロウイルスエンハンサーエレメント及び/又は少なくとも1つのエクジソン応答エレメントを含み、好ましいエンハンサーエレメントはhr1、hr2、hr2.09、hr3、hr4、hr4b及びhr5からなる群から選択される、請求項11又は12に記載の細胞。
- 前記細胞におけるその翻訳がパルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つだけを生成するmRNAをコードする前記ヌクレオチド配列が、無傷(intact)のパルボウイルスp19プロモーターを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記パルボウイルスRep78及び68タンパク質のうちの少なくとも1つ、前記パルボウイルスRep52及び40タンパク質のうちの少なくとも1つ、前記パルボウイルスVP1、VP2及びVP3カプシドタンパク質、並びに前記少なくとも1つのパルボウイルス逆方向末端反復配列がアデノ随伴ウイルス(AAV)に由来する、前記請求項のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記第1の核酸構築物がDuoBac CapRep6(配列番号10)であり、前記第2の核酸構築物がDuoBac CapTrans1(配列番号12)であり、好ましくは前記第1及び第2の構築物が3:1のモル比で存在する、請求項4~15のいずれか一項に記載の細胞。
- 細胞で組換えパルボウイルスビリオンを生成する方法であって、
a)請求項1~16のいずれか一項に記載の細胞を、組換えパルボウイルスビリオンが生成される条件下で培養するステップ;及び
b)前記組換えパルボウイルスビリオンを回収するステップ
含む方法。 - 前記細胞が昆虫細胞であり、及び/又は前記パルボウイルスビリオンがAAVビリオンである、請求項17に記載の方法。
- ステップb)の前記組換えパルボウイルスビリオンの回収が、固定化抗パルボウイルス抗体、好ましくは一本鎖ラクダ抗体又はその断片を使用した、前記ビリオンの親和性精製、又は30~70nmの名目孔径を有するフィルターでの濾過のうちの少なくとも1つを含む、請求項17又は18に記載の方法。
- 請求項1~15のいずれか一項に記載の第1の核酸構築物。
- 請求項2~15のいずれか一項に記載の第2の核酸構築物。
- 少なくとも請求項1~15のいずれか一項に記載の第1の核酸構築物及び請求項2~15のいずれか一項に記載の第2の核酸構築物を含む、パーツのキット(kit of parts)。
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