JP2023519502A - Ａａｖ生成のための二重二官能基ベクター - Google Patents

Abstract

本発明は、組換えパルボウイルス遺伝子療法ベクターの生成のための核酸構築物の新規組合せに関する。特に、本発明は、好ましくは２つ以下の構築物の組合せに関し、第１の構築物はパルボウイルスＣａｐ及びＲｅｐタンパク質を発現し、第２の構築物は少なくとも導入遺伝子に隣接するＩＴＲを含み、任意選択でＣａｐタンパク質のための発現カセットを再び含む。核酸構築物は、好ましくは昆虫細胞でのｒＡＡＶの生成のためのバキュロウイルスベクターである。【選択図】なし

Description

本発明は、医学、分子生物学及び遺伝子療法の分野に関する。本発明は、バキュロウイルスベクターで反復する不完全なパリンドローム／相同反復配列が使用される、細胞でのタンパク質の生成に関する。特に、本発明は遺伝子療法で使用することができるパルボウイルスベクターの生成、及びパルボウイルスベクターの生産性を増加させるウイルスレプリカーゼ（Ｒｅｐ）タンパク質の発現の向上に関する。

バキュロウイルス発現系は、真核生物のクローニング及び発現ベクターとしてのその使用が周知である（Ｋｉｎｇ、Ｌ．Ａ．及びＲ．Ｄ．Ｐｏｓｓｅｅ、１９９２年、「Ｔｈｅ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ」、Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ、Ｄ．Ｒ．ら、１９９２年。Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ）。バキュロウイルス発現系の利点は、とりわけ、発現されるタンパク質がたいてい可溶性であり、正しく折りたたまれており、生物学的に活性であるということである。さらなる利点には、高いタンパク質発現レベル、より速い生成、大きなタンパク質の発現への適合性及び大規模生成への適合性が含まれる。しかし、昆虫細胞バイオリアクターでバキュロウイルス系を使用した異種タンパク質の大規模又は連続生成において、通過効果としても知られる生成レベルの不安定性は主要な障害である。この効果は、少なくとも一部、バキュロウイルスＤＮＡにおける反復相同配列の間の組換えによる。

バキュロウイルス発現系は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの生成のためにも首尾よく使用されている（Ｕｒａｂｅら、２００２年、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：１９３５～１９４３頁；米国特許第６，７２３，５５１号及び米国特許出願公開第２００４０１９７８９５号）。ＡＡＶは、ヒト遺伝子療法のための最も有望なウイルスベクターのうちの１つと考えることができる。今日まで、研究及び臨床グレードのＡＡＶ材料を届けることが可能な主要生成系として、２つのプラットホームが現れている。いずれの場合も、レプリカーゼ（Ｒｅｐ、ＤＮＡ複製及びパッケージングタンパク質）及びカプシド（Ｃａｐ、構造タンパク質）コード遺伝子を含む発現カセットが、ＡＡＶ２逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接するｔｏ－ｂｅ－ｐａｃｋａｇｅｄ導入遺伝子と一緒にプロデューサー細胞へ送達される。１つのアプローチは、それらの成分を送達してＡＡＶを生成するために、Ｈｅｋ２９３細胞へのプラスミドの一時的化学的トランスフェクションに依存する。第２のアプローチでは、バキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）は、これらの成分を無脊椎動物細胞の懸濁培養へ送達する。ｒＡＡＶのための哺乳動物細胞をベースとした生成系は高力価のＡＡＶ材料を生成することができるが、それはスケールアップのためにより好適でない。これは大部分はプラスミド生成の高い費用並びにＨｅｋ２９３細胞を懸濁液での増殖及びＡＡＶ生成に適合させる必要性のためであり、それでも、収量は昆虫細胞と同じオーダーではない。対照的に、バキュロウイルスは、一旦産生されて特徴付けられると、ＡＡＶ生成のための接種の前に昆虫細胞と一緒に増幅させ、懸濁液で増殖させることができるので、ＢＥＶ生成系はｒＡＡＶ生成のためのよりスケーラブルなプラットホームを提供する。一般に、細胞あたりの収量は懸濁昆虫細胞及び接着性Ｈｅｋ２９３細胞で同等である。

昆虫細胞でｒＡＡＶを生成するために最も頻繁に使用される方法は、３つの別々のバキュロウイルスの共感染を通すもの、ＴｒｉｐｌｅＢａｃ系である。これらのバキュロウイルスは、Ｒｅｐ、Ｃａｐ及び導入遺伝子（Ｔｒａｎｓ）発現カセットをそれぞれ含む。ｒＡＡＶ生成の間に３つのバキュロウイルスの共感染を使用することの主要な欠点は、非同時感染が起こる可能性があることである。本明細書でＤｕｏＢａｃ系（各ベクターはＣａｐとＲｅｐ又はＣａｐとＴｒａｎｓを含有する、図１）と呼ばれる、各々二重発現カセットを含有するバキュロウイルスベクターを作製することによって、ｒＡＡＶ生成のために必要とされる異なるバキュロウイルスのベクターの数を低減することができ、それによって同時感染の可能性を向上させる。プロセスの複雑性のこの低減は、いくつかの潜在的利益を有する：１．汚染のより低いリスク；２．未精製の溶解物バルク（ＣＬＢ）における平均してより高いＡＡＶ収量；３．より頑強なバキュロウイルスＭＯＩ応答；４．アップスケールとの適合性の増加；５．１つ少ない種ウイルスが必要とされるのでより低い商品費用；及び６．ＡＡＶバッチの全体／完全の比の低減。良好なＡＡＶ生成のために必要とされる分子成分が正しい時間に細胞中に存在する可能性がより高いので、全てのこれらの利点がもたらされる。

昆虫細胞でバキュロウイルスを使用するＡＡＶ生成のために、Ｃａｐ及びＲｅｐタンパク質発現を時間及び量の両面で最適化することは、生成されるＡＡＶの量と質のためにきわめて重要である。以前、初期のＲｅｐ７８発現（複製Ｒｅｐ）及び後期のＲｅｐ５２発現（パッケージングＲｅｐ）が、生成されたＡＡＶの品質を向上させたことが観察された（米国特許第８，６９７，４１７号）。感染の異なる相で活性になる異なるバキュロウイルスプロモーターを利用することによって、発現のタイミングの制御を行使することができる（Ｃｈａａｂｉｈｉ、Ｈ．ら、１９９３年、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７（５）、２６６４～７１頁；Ｈｉｌｌ－Ｐｅｒｋｉｎｓ、Ｍ．Ｓ．及びＰｏｓｓｅｅ、Ｒ．Ｄ．、１９９０年、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７１（４）、９７１～６頁；Ｐｕｌｌｅｎ、Ｓ．Ｓ．及びＦｒｉｅｓｅｎ、Ｐ．Ｄ．、１９９５年、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６９（１）、１５６～６５頁）。前初期（ＩＥ）プロモーターは、バキュロウイルス感染の初期の感染直後に活性であるが、その後減退する。ｐ１０及びポリヘドリンプロモーターは両方とも強力であるが最後期プロモーターであり、ピークの発現は感染の２０～２４時間後に観察される。Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ７８発現カセットを分離し、それらの発現を異なるプロモーターで制御することによって、本発明者はＲｅｐタンパク質の個々の強度及びタイミングのより優れた制御を有し、それによって生成されるＡＡＶの品質を向上させる。さらに、国際出願２００７／１４８９７１において、本発明者らは、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質に単一のコード配列を使用することで、昆虫細胞におけるｒＡＡＶベクター生成の安定性を有意に向上させており、ここでは、Ｒｅｐ７８タンパク質に、スキャニングするリボソームによって部分的にスキップされる最適以下の開始コドンを使用することで、さらに下流のＲｅｐ５２タンパク質の開始コドンでも翻訳の開始が起こることを可能にしている。国際出願２００９／０１４４４５では、昆虫細胞におけるｒＡＡＶベクター生成の安定性は、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ７８のために別々の発現カセットを用いることによって再びさらに向上され、ここでは反復コード配列は相同組換えを低減するためにコドンバイアスが異なる。

カプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）の化学量は、１：１：１０の天然の比にできるだけ接近する必要がある。一旦カプシドが細胞に入ると、ＶＰ１はホスホリパーゼＡ２活性を有し、エンドソームエスケープのために必須である。この比がその最適値から外れる場合、カプシドはより強力でなくなり、例えば、低いＶＰ１は感染性の劣化（細胞侵入及び導入遺伝子発現で測定される）に一般的につながるが、高力価ＡＡＶ生成（ｇｃ／ｍｌ）をもたらす。選択されたカプシドプロモーターとＶＰ１開始コドンの組合せはこの比に対して最も大きい影響を一緒に発揮し、個々のＡＡＶ血清型のために最適化する必要性がある。異なるプロモーター強度及びＶＰ１開始コドンを混合することで、生成されるカプシドのＶＰ１：２：３の比、及びそれによってその力価を変更することができる（Ｂｏｓｍａ、Ｂ．ら、２０１８年、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２５（６）、４１５～４２４頁）。国際出願２００７／０８４７７３は、昆虫細胞におけるｒＡＡＶ生成の方法であって、ＶＰ２及びＶＰ３に対してＶＰ１を補充することによって、感染性ウイルス粒子の生成を増加させ、方法を開示する。補充は、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３を発現するヌクレオチド配列を含むカプシドベクターを昆虫細胞に導入し、さらに、同じカプシドベクター上又は異なるベクター上にあってよい、ＶＰ１を発現するヌクレオチド配列を、昆虫細胞に導入することによって実施することができる。

過去には、二重発現カセットを含有するバキュロウイルス構築物が、ＡＡＶ血清型１に関して設計された（国際出願２００９／１０４９６４）。これらの構築物は向上した全体／完全の比及び正常なカプシド化学量を提示したが、ウイルス収量はＴｒｉｐｌｅＢａｃ ＡＡＶ１生成の概ね３分の１であった。低減した収量の１つの説明は、単一のＲｅｐ発現カセットの使用による可能性があり、そこでは、発現のタイミング並びにＲｅｐ５２とＲｅｐ７８の比は最適以下だった。これは、おそらく粒子における高い異種（非ＡＡＶ）ＤＮＡカプシド封入及び低収量につながった。したがって、ｒＡＡＶなどの組換えパルボウイルス遺伝子療法ベクターの品質及び量を向上させるための手段及び方法の必要性がなおある。

第１の態様では、本発明は：ｉ）ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１のプロモーターを含む第１の発現カセットであって、細胞におけるその翻訳はパルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つを生成する、第１の発現カセット；ｉｉ）ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の発現カセットであって、細胞におけるその翻訳はパルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つを生成する、第２の発現カセット；ｉｉｉ）パルボウイルスＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第３のプロモーターを含む第３の発現カセット；並びにｉｖ）少なくとも１つのパルボウイルス逆方向末端反復配列に隣接する導入遺伝子を含むヌクレオチド配列；を含む１つ又は複数の核酸構築物を含む細胞に関し、ここで、第１及び第２の発現カセットのうちの少なくとも１つは、第３の発現カセットと共に第１の核酸構築物に存在し、１つ又は複数の核酸構築物による細胞のトランスフェクションの後、第１のプロモーターは第２及び第３のプロモーターの前に活性である。好ましくは、パルボウイルス逆方向末端反復配列に隣接する導入遺伝子を含むヌクレオチド配列は、第２の核酸構築物の上に存在する。好ましくは、第２の核酸構築物は、パルボウイルスＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第４のプロモーターを含む第４の発現カセットをさらに含み、第１のプロモーターは第２、第３及び第４のプロモーターの前に活性であり、任意選択で、第３及び第４のプロモーターは同一であり、任意選択で、第３及び第４の発現カセットのヌクレオチド配列によってコードされるパルボウイルスＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質は同一である。

好ましい実施形態では、パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つ並びにパルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つは、パルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つの第２のアミノ酸から最もＣ末端のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む共通のアミノ酸配列を含み、ここで、パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つ並びにパルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つの共通アミノ酸配列は少なくとも９０％同一であり、パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列並びにパルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、９０％未満同一である。好ましくは、パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つ並びにパルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つの共通アミノ酸配列は少なくとも９９％同一であり、好ましくは１００％同一である。パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、パルボウイルスＲｅｐ５２及び４０のうちの少なくとも１つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と比較して、細胞のための改善されたコドン使用頻度バイアスを有するか、又はパルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と比較して、細胞のための改善されたコドン使用頻度バイアスを有することがさらに好ましく、より好ましくは、パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つ並びにパルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つにおける共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の間のコドン適応指数の差は、少なくとも０．２である。

一実施形態では、第１のプロモーターは構成的プロモーターである。

一実施形態では、第２、第３及び第４のプロモーターのうちの少なくとも１つは、誘導性プロモーターである。好ましくは、誘導性プロモーターは、ウイルス感染周期のより後期に誘導されるウイルスプロモーター、好ましくはウイルスによる細胞のトランスフェクション又は感染の少なくとも２４時間後に誘導されるウイルスプロモーターである。

一実施形態では、第１及び第２の核酸構築物のうちの少なくとも１つは、細胞のゲノムに安定して組み込まれている。

好ましい実施形態では、細胞は昆虫細胞であり、ここで、第１及び第２の核酸構築物のうちの少なくとも１つは昆虫細胞適合ベクター、好ましくはバキュロウイルスベクターである。好ましくは昆虫細胞では、ａ）第１のプロモーターは、ｄｅｌｔａＥｌプロモーター及びＥｌプロモーターから選択され；ｂ）第２、第３及び第４のプロモーターはｐｏｌＨプロモーター及びｐ１０プロモーターから選択される。より好ましくは、昆虫細胞では、少なくとも１つの発現カセットは、少なくとも１つのバキュロウイルスエンハンサーエレメント及び／又は少なくとも１つのエクジソン応答エレメントを含み、ここで、好ましいエンハンサーエレメントは、ｈｒ１、ｈｒ２、ｈｒ２．０９、ｈｒ３、ｈｒ４、ｈｒ４ｂ及びｈｒ５からなる群から選択され、好ましくは群ｈｒ２．０９、ｈｒ４ｂ及びｈｒ５から選択される。

一実施形態では、細胞におけるその翻訳はパルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つだけを生成するｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、無傷（ｉｎｔａｃｔ）のパルボウイルスｐ１９プロモーターを含む。

好ましい実施形態では、パルボウイルスＲｅｐ ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つ、パルボウイルスＲｅｐ ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つ、パルボウイルスＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質並びに少なくとも１つのパルボウイルス逆方向末端反復配列は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来する。

一実施形態では、第１の核酸構築物はＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ６（配列番号１０）であり、第２の核酸構築物はＤｕｏＢａｃ ＣａｐＴｒａｎｓ１（配列番号１２）であり、ここで、第１及び第２の構築物は好ましくは３：１のモル比で存在する。

第２の態様では、本発明は細胞で組換えパルボウイルスビリオンを生成する方法であって、ａ）本明細書で規定される細胞を組換えパルボウイルスビリオンが生成される条件下で培養するステップ；及びｂ）組換えパルボウイルスビリオンを回収するステップを含む方法に関する。好ましくは、本方法では、細胞は昆虫細胞であり、及び／又はパルボウイルスビリオンはＡＡＶビリオンである。好ましい方法では、ステップｂ）の組換えパルボウイルスビリオンの回収は、固定化抗パルボウイルス抗体、好ましくは単鎖ラクダ抗体若しくはその断片を使用した、ビリオンの親和性精製、又は３０～７０ｎｍの名目孔径を有するフィルターでの濾過のうちの少なくとも１つを含む。

第３の態様では、本発明は本明細書で規定される核酸構築物に、具体的には本明細書で規定される第１及び第２の核酸構築物に関する。

第４の態様では、本発明は、少なくとも本明細書で規定される第１及び第２の核酸構築物を含むパーツのキット（ｋｉｔ ｏｆ ｐａｒｔｓ）に関する。

ＴｒｉｐｌｅＢａｃ ＡＡＶ生成では、Ｒｅｐ、Ｃａｐ及び導入遺伝子カセットを含む３つのバキュロウイルスがｅｘｐｒｅｓＳＦ＋昆虫細胞に同時感染することを示す図。対照的に、ＤｕｏＢａｃプロセスでは、Ｃａｐ及びＲｅｐカセットは１つのバキュロウイルスゲノムの上で一緒にされ、導入遺伝子カセットを含有する別個のバキュロウイルスとｅｘｐｒｅｓＳＦ＋昆虫細胞に同時感染する。ＤｕｏＤｕｏＢａｃ生成プロセスでは、Ｃａｐ－Ｒｅｐ及びＣａｐ－Ｔｒａｎｓ発現カセットが２つのバキュロウイルスの上で一緒にされ、ｅｘｐｒｅｓＳＦ＋細胞に同時感染する。 実施例で使用されたＣａｐ－Ｒｅｐ及びＣａｐ－Ｔｒａｎｓ ＤｕｏＢａｃバキュロウイルス構築物の発現カセット及び配向並びに使用された単一の発現カセットバキュロウイルスの概略図。 ＢａｃＣａｐ２又はＢａｃＣａｐ３ ＤｕｏＢａｃ ＡＡＶ生成のＣＬＢで測定されたウイルス力価を示す図。生成は、５％Ｃａｐ－Ｒｅｐバキュロウイルス保存株及び１％導入遺伝子保存株の容量比で実行した。構築物ＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ２、３、４及び７で高力価が得られ、ＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ１及び６から低力価が得られた。 ｗｔＡＡＶ５及びＡＡＶ２／５ ＤｕｏＢａｃ生成の全体／完全の比を示す図。全てのＤｕｏＢａｃ構築物から生成されたＡＡＶでは、低い全体／完全の比（＜２）が観察される。これらの全体完全の比は、ＴｒｉｐｌｅＢａｃ ＡＡＶ生成で通常観察される（＞５の全体／完全、表２）より有意に低い。 ＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ１～５で作製した精製ＡＡＶ材料によるＳＤＳ Ｐａｇｅゲルの実行を示す図。構築物ＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ６は、低収量のために含まれなかった。ＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ３及びＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ７は、１：１：１０の正しいカプシド化学量を提示するが、ＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ２、４及び５は最適以下のカプシド化学量を提示する（ＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ２、４、５では低いＶＰ１、又はＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ１の場合には非常に高いＶＰ１）。 ＤｕｏＢａｃ構築物ＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ１～６で生成されたＡＡＶのＧｃ／ｉｐを示す図。生成されたＡＡＶの感染性は、ＤｕｏＢａｃ構築物のＶＰ１２３カプシド化学量を映す。ここでは、低いＶＰ１はＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ２、４及び５の低い感染性（高ｇｃ／ｉｐ）をもたらし、高いか又は正常なＶＰ１はＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ３及び１の高い感染性（低ｇｃ／ｉｐ）をもたらす。 ＤｕｏＢａｃ及びＴｒｉｐｌｅＢａｃ生成プロセスで作製した精製ＡＡＶ材料によるＳＤＳ Ｐａｇｅゲルの実行を示す図。ＡＡＶのための１：１：１０の理想的なカプシドＶＰ１、２、３タンパク質の化学量は、ＤｕｏＢａｃプロセスへの切り替え後に維持された（レーン１～２、１１、１３対レーン５～１０、１２、１４）。 ＤｕｏＢａｃとＴｒｉｐｌｅＢａｃ ＡＡＶ生成の間の全体／完全の比の比較を示す図。 精製されたＤｕｏＤｕｏＢａｃ及びＴｒｉｐｌｅＢａｃ生成ＡＡＶによるＳＤＳ Ｐａｇｅゲルの実行を示す図。ＤｕｏＤｕｏＢａｃ及びＴｒｉｐｌｅＢａｃプロセスで作製されたＡＡＶを比較したとき、１：１：１０の類似したＶＰ１２３化学量が観察された。 ＤｕｏＤｕｏＢａｃ又はＴｒｉｐｌｅＢａｃ生成プロセスで生成されたＡＡＶから得られたゲノムＡＡＶ ＤＮＡによるホルムアルデヒドゲルの実行を示す図。ＤｕｏＤｕｏＢａｃを使用して異なるＲｅｐ：Ｃａｐ比で生成されたＡＡＶは、ＡＡＶ粒子にパッケージされた類似のゲノムＤＮＡを有する。ＤｕｏＤｕｏＢａｃ ＡＡＶ断片は、ＴｒｉｐｌｅＢａｃ生成後に見出されたＤＮＡ断片に一致する。主なバンドは長さが２．４ｋｂであり、導入遺伝子の単一のコピーを表す。

定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語は、本開示が属する分野の当業技術者が通常理解するのと同じ意味を有する。当業技術者は、本発明の実施で用いることができるであろう、本明細書に記載されるものに類似しているか又は同等の多くの方法及び材料を理解しよう。実際、本発明は、この方法にいかなる場合も限定されない。

この文書及びその請求項では、動詞「含む」及びその活用形は、単語に続く項目が含まれるが、具体的に指摘されていない項目は排除されないことを意味するために、その非限定的な意味で使用される。さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」によるエレメントへの言及は、エレメントが１つ及びわずか１つあることを文脈が明らかに要求しない限り、そのエレメントが複数存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、通常「少なくとも１つ」を意味する。

本明細書で使用されるように、用語「及び／又は」は、明記される事例のうちの１つ若しくは複数が単独で、又は明記される事例のうちの少なくとも１つからその全てと共に起こることができることを示す。

本明細書で使用されるように、「少なくとも」特定の値は、その特定の値又はそれ以上を意味する。例えば、「少なくとも２つ」は「２つ又はそれ以上」と同じであること、すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５等であると理解される。

単語「約」又は「概ね」は、数値に関連して使用される場合（例えば約１０）、好ましくはその値が、その値から０．１％大きいか又は小さい所与の値（１０）であってよいことを意味する。

この文書に記載の医薬としての物質の使用は、医薬の製造における前記物質の使用と解釈することもできる。同様に、物質が治療のために、又は医薬として使用されるときはいつでも、それは治療のための医薬の製造のために使用することもできる。本明細書に記載される医薬用の製品は、治療方法で使用することができ、ここで、そのような治療方法は、使用のための本製品の投与を含む。

用語「相同性」、「配列同一性」などは、本明細書で互換的に使用される。本明細書で配列同一性は、配列の比較によって決定される、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチド又はタンパク質）配列又は２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列の間の関係と規定される。当技術分野で、「同一性」は、アミノ酸又は核酸配列の間の配列関係の程度であって、場合によっては、そのような配列のストリングの間の一致によって決定される、配列関係の程度も意味する。２つのアミノ酸配列の間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。「同一性」及び「類似性」は、公知の方法によって容易に計算することができる。

「配列同一性」及び「配列類似性」は、２つの配列の長さによってグローバル又はローカルアラインメントアルゴリズムを使用して、２つのペプチド又は２つのヌクレオチド配列のアラインメントによって決定することができる。類似の長さの配列は、好ましくは全長にわたって最適に配列をアラインメントさせるグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈ）を使用してアラインメントされ、実質的に異なる長さの配列は好ましくはローカルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ）を使用してアラインメントされる。配列は、それらが（例えばデフォルトパラメータを使用したプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによって最適にアラインメントされるとき）少なくともある特定の最小限のパーセンテージの配列同一性を共有するならば（下で規定される）、「実質的に同一である」又は「本質的に類似している」と呼ぶことができる。ＧＡＰはＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのグローバルアラインメントアルゴリズムを使用して、２つの配列をそれらの全長（完全長）にわたってアラインメントさせ、一致の数を最大にし、ギャップの数を最小にする。グローバルアラインメントは、好適には２つの配列が類似の長さを有するときに配列同一性を決定するために使用される。一般的に、ＧＡＰのデフォルトパラメータが使用され、ギャップ形成ペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）、及びギャップ伸張ペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）である。ヌクレオチドの場合、使用されるデフォルトスコアリングマトリックスはｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質の場合、デフォルトスコアリングマトリックスはＢｌｏｓｕｍ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２年、ＰＮＡＳ ８９、９１５～９１９頁）である。パーセンテージ配列同一性のための配列アラインメント及びスコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ社、９６８５ ＳｃｒａｎｔｏｎＲｏａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ ９２１２１－３７５２ ＵＳＡから入手可能であるＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３などのコンピュータプログラムを使用して、又は、上のＧＡＰと同じパラメータを使用した、若しくはデフォルト設定（「ｎｅｅｄｌｅ」及び「ｗａｔｅｒ」の両方、並びにタンパク質及びＤＮＡアラインメントの両方のために、デフォルトのギャップオープニングペナルティは１０．０であり、デフォルトのギャップ伸張ペナルティは０．５である；デフォルトスコアリングマトリックスはタンパク質ではＢｌｏｓｓｕｍ６２、ＤＮＡではＤＮＡＦｕｌｌである）を使用したＥｍｂｏｓｓＷＩＮバージョン２．１０．０の中のプログラム「ｎｅｅｄｌｅ」（グローバルＮｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用）又は「ｗａｔｅｒ」（ローカルＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用）などのオープンソースソフトウェアを使用して、決定することができる。配列が実質的に異なる全長を有するとき、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用したものなどのローカルアラインメントが好ましい。

或いは、パーセンテージ類似性又は同一性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等などのアルゴリズムを使用して公開データベースに対して検索することによって決定することができる。したがって、本発明の核酸及びタンパク質配列は、例えば他のファミリーメンバー又は関連配列を同定するために公開データベースに対して検索を実行するための「クエリー配列」としてさらに使用することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～１０頁、のＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｘプログラム（バージョン２．０）を使用して実行することができる。本発明の酸化還元酵素核酸分子に相同的なヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索をＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実行することができる。本発明のタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＢＬＡＳＴｘプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実行することができる。比較目的のためにギャップアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９～３４０２頁に記載されているようにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴｘ及びＢＬＡＳＴｎ）のデフォルトパラメータを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのホームページを参照する。

本明細書で使用される用語「選択的にハイブリダイズしている」、「選択的にハイブリダイズする」及び類似の用語は、少なくとも６６％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％又はより好ましくは少なくとも９９％互いに相同的であるヌクレオチド配列が、一般的に互いとハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を記載するものである。すなわち、そのようなハイブリダイズする配列は、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、又はより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を共有することができる。

そのようなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、約４５℃の６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でのハイブリダイゼーションと、続く約５０℃、好ましくは約５５℃、好ましくは約６０℃、さらにより好ましくは約６５℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの１回又は複数回の洗浄である。

高ストリンジェント条件には、例えば、約６８℃の５×ＳＳＣ／５×デンハート液／１．０％ＳＤＳでのハイブリダイゼーション及び室温の０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳでの洗浄が含まれる。或いは、洗浄は４２℃で実行することができる。

当業者であれば、ストリンジェントな及び高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件にどのような条件を適用するべきかについて認識しているであろう。そのような条件に関する追加の指針は、当技術分野で、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．；及び、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９５年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．）で直ちに入手できる。

当然ながら、ポリＡ配列（ｍＲＮＡの３’末端のポリ（Ａ）路など）だけ、又は相補的なＴ（又はＵ）残基の区間だけとハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部に特異的にハイブリダイズするために使用される本発明のポリヌクレオチドに含まれない。その理由は、そのようなポリヌクレオチドはポリ（Ａ）区間又はその相補鎖を含有するあらゆる核酸分子（例えば、実際上あらゆる二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリダイズするからである。

本明細書において「核酸構築物」又は「核酸ベクター」は、組換えＤＮＡ技術の使用からもたらされる人工核酸分子を意味すると理解される。したがって、用語「核酸構築物」は天然に存在する核酸分子を含まないが、核酸構築物は天然に存在する核酸分子の（一部）を含むことができる。「ベクター」は、外因性核酸配列（すなわち、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を宿主細胞に移す役目をする核酸構築物（一般的にＤＮＡ又はＲＮＡ）である。用語「発現ベクター」又は「発現構築物」は、そのような配列に適合する宿主細胞又は宿主生物体における遺伝子の発現に影響を及ぼすことが可能であるヌクレオチド配列を指す。これらの発現ベクターは、発現させる生成物をコードする配列の発現に影響を及ぼすことが可能な機能的単位である少なくとも１つの「発現カセット」を一般的に含み、ここで、コード配列は、好適な転写調節配列及び任意選択で３’転写終結シグナルを少なくとも含む適当な発現制御配列に作動可能に連結される。発現エンハンサーエレメントなどの、発現に影響を及ぼすことで必要であるか又は役に立つ追加の因子が存在してもよい。発現ベクターは好適な宿主細胞に導入され、宿主細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養においてコード配列の発現に影響を及ぼすことができる。発現ベクターは、ウイルスベクター、特に組換えＡＡＶベクター、本発明の宿主細胞又は生物体における複製のために好適である。

本明細書で使用されるように、用語「プロモーター」又は「転写調節配列」は、１つ又は複数のコード配列の転写を制御する働きをする核酸断片を指し、コード配列の転写開始部位の転写の方向に関して上流に位置し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのための結合部位、転写開始部位、並びに転写因子結合部位、リプレッサー及び活性化タンパク質結合部位を限定されずに含む、任意の他のＤＮＡ配列、及びプロモーターからの転写の量を調節するために直接的又は間接的に作用することが当業者に公知であるヌクレオチドの任意の他の配列の存在によって構造的に同定される。「構成的」プロモーターは、ほとんどの生理的及び発達条件下でほとんどの組織において活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、例えば化学的インデューサー又は生物学的実体の適用によって、生理的に又は発達上調節されるプロモーターである。

用語「レポーター」はマーカーと互換的に使用することができるが、それは緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）又はルシフェラーゼなどの可視マーカーを指すために主に使用される。

用語「タンパク質」又は「ポリペプチド」は互換的に使用され、特異的作用様式、サイズ、三次元構造又は起源に関係なく、アミノ酸の鎖からなる分子を指す。

用語「遺伝子」は、好適な調節領域（例えばプロモーター）に作動可能に連結された、細胞中でＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）に転写される領域（転写される領域）を含むＤＮＡ断片を意味する。遺伝子は、いくつかの作動可能に連結される断片、例えばプロモーター、５’リーダー配列、コード領域及びポリアデニル化部位を含む３’非翻訳配列（３’末端）を通常含む。「遺伝子の発現」は、適当な調節領域、特にプロモーターに作動可能に連結されるＤＮＡ領域が、生物学的に活性である、すなわち生物学的に活性なタンパク質又はペプチドに翻訳することが可能であるＲＮＡに転写されるプロセスを指す。

所与の（組換え）核酸又はポリペプチド分子と所与の宿主生物体又は宿主細胞の間の関係を示すために使用されるときの用語「同種」は、天然では核酸又はポリペプチド分子が同じ種、好ましくは同じ変種又は系統の宿主細胞又は生物体によって生成されることを意味すると理解される。宿主細胞と同種である場合、ポリペプチドをコードする核酸配列は、一般的に（しかし、必ずしもそうとは限らない）、その天然の環境におけるより別の（異種の）プロモーター配列に、及び適用可能であるならば別の（異種の）分泌シグナル配列及び／又はターミネーター配列に作動可能に連結される。調節配列、シグナル配列、ターミネーター配列等が宿主細胞と同種であってもよいと理解される。これに関連して、「同種」配列エレメントだけの使用は、「自己クローン」遺伝子改変生物体（ＧＭＯ）（欧州指令９８／８１／ＥＣ Ａｎｎｅｘ ＩＩの通り自己クローニングは本明細書で規定されている）の構築を可能にする。２つの核酸配列の関係を示すために使用される場合、用語「相同的」は、１つの一本鎖核酸配列が相補的一本鎖核酸配列にハイブリダイズすることができることを意味する。ハイブリダイゼーションの程度は、配列間の同一性の量、並びに後で議論される温度及び塩濃度などのハイブリダイゼーション条件を含むいくつかの因子に依存し得る。

核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はタンパク質に関して使用されるときの用語「異種」及び「外因性」は、それが存在する生物体、細胞、ゲノム又はＤＮＡ又はＲＮＡ配列の一部として天然に存在しないか、又は、それが天然に見出されるものと異なる細胞又はゲノム若しくはＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列中の位置（複数可）で見出される核酸又はタンパク質を指す。異種及び外因性の核酸又はタンパク質は、それらが導入される細胞に内因性でないが、別の細胞から得られたか、又は合成的に若しくは組換えで生成される。そうとは限らないが一般的に、そのような核酸は、ＤＮＡが転写又は発現される細胞によって通常生成されないタンパク質、すなわち外因性タンパク質をコードする。同様に、外因性ＲＮＡは、外因性ＲＮＡが存在する細胞で通常発現されないタンパク質をコードする。異種／外因性の核酸及びタンパク質は、外来の核酸又はタンパク質と呼ぶこともできる。発現される細胞にとって外来であると当業者が認識するであろう、いずれの核酸又はタンパク質も、本明細書において異種又は外因性の核酸又はタンパク質という用語に包含される。異種及び外因性という用語は、核酸又はアミノ酸配列の非天然の組合せ、すなわち組合せ配列の少なくとも２つが相互に外来である組合せにも適用される。

本明細書で使用されるように、生物体に関して使用されるときの用語「天然に存在しない」は、その生物体が、参照される種の野生系統を含む参照される種の天然に存在する系統において通常見出されない少なくとも１つの遺伝子変化を有することを意味する。遺伝子変化には、例えば、タンパク質若しくは酵素をコードする発現可能な核酸を導入する改変、他の核酸付加、核酸欠失、核酸置換、又は生物体の遺伝物質の他の機能的破壊が含まれる。そのような改変には、例えば、参照される種のための異種又は同種ポリペプチドのコード領域及びその機能的断片が含まれる。追加の改変には、例えば、その改変が遺伝子又はオペロンの発現を変更する非コード調節領域が含まれる。酵素をコードする核酸分子又はその機能的断片への遺伝子改変は、生化学的反応能力又は代謝経路能力を、その天然に存在する状態から変更される天然に存在しない生物体に付与することができる。

本明細書で使用される、用語「作動可能に連結された／されている」は、ポリヌクレオチド（又は、ポリペプチド）エレメント同士の機能的関係での連結を指す。核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれるとき、「作動可能に連結されている」。例えば、転写調節配列は、コード配列の転写に影響を及ぼす場合は、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されているとは、連結されているＤＮＡ配列が一般的に連続していること、及び２つのタンパク質コード領域を接続する必要がある場合、連続し、読み枠の中にあることを意味する。

「発現カセット」は、発現制御配列及び発現させる核酸配列を含む核酸配列を指す。

「発現制御配列」又は「調節制御配列」は、それが作動可能に連結されるヌクレオチド配列の発現を調節する核酸配列を指す。

発現制御配列は、それがヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を制御及び調節するとき、ヌクレオチド配列に「作動可能に連結されている」。したがって、発現制御配列は、プロモーター、エンハンサー、リボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン、イントロンのためのスプライシングシグナル及び終止コドンを含むことができる。

用語「発現制御配列」は、最小限、その存在が発現に影響するように設計される配列を含むものであり、追加の有益な成分を含むこともできる。例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列は発現制御配列である。本用語は、枠の内外の望ましくない潜在的開始コドンが配列から除去されるような核酸配列の設計を含むこともできる。それは、望ましくない潜在的スプライス部位が除去されるような核酸配列の設計を含むこともできる。それは、ポリＡテール、すなわちポリＡ配列と呼ばれる配列であるｍＲＮＡの３’末端のアデニン残基のストリングの追加を指示する配列又はポリアデニル化配列（ｐＡ）を含む。それは、ｍＲＮＡの安定性を増強するように設計することもできる。転写及び翻訳の安定性に影響を及ぼす発現制御配列、例えばプロモーター、並びに翻訳に影響を及ぼす配列、例えばコザック配列は昆虫細胞で公知である。発現制御配列は、より低い発現レベル又はより高い発現レベルが達成されるように、それが作動可能に連結されるヌクレオチド配列をモジュレートするような性質であってよい。

用語「完全ビリオン」は、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列に隣接する導入遺伝子ＤＮＡを封入するパルボウイルス構造／カプシドタンパク質（ＶＰ１：２：３）を含むビリオン粒子を指す。用語「空のビリオン」は、パルボウイルスゲノム物質を含まないビリオン粒子を指す。本発明の好ましい実施形態では、完全ビリオン対空のビリオンの比は、少なくとも１：５０、より好ましくは少なくとも１：１０、さらにより好ましくは少なくとも１：１である。さらにより好ましくは、空のビリオンは検出することができず、最も好ましくは空のビリオンは存在しない。当業者であれば、ビリオンにつき１ゲノムコピーだけが存在するので、例えば、遺伝子コピー数を集められたＡＡＶカプシド数による全粒子で割ることによって（又は、全ての集めたカプシド：ゲノムコピー数）完全ビリオン対空のビリオンの比を決定する方法を認識しているであろう。当業者であれば、そのような比を決定する方法を認識しているであろう。例えば、空のビリオン対全カプシドの比は、ゲノムコピーの量（すなわちゲノムコピー数）を全パルボウイルス粒子の量（すなわちパルボウイルス粒子の数）によって割ることによって決定することができ、ここで、ｍｌあたりのゲノムコピーの量は定量的ＰＣＲによって測定され、ｍｌあたりの全パルボウイルス粒子の量は、例えばＰｒｏｇｅｎからの酵素免疫測定法で測定される。

本明細書で使用される用語「ＴｒｉｐｌｅＢａｃ」は、３つの別々のバキュロウイルスベクター、すなわちそれぞれＲｅｐ、Ｃａｐ及びＴｒａｎｓ発現カセットの各々のための３つの異なるバキュロウイルスベクターの共感染を必要とする昆虫細胞でｒＡＡＶを生成するためのバキュロウイルスベクターの系を指す。本明細書で使用される用語「ＤｕｏＢａｃ」は、２つの異なるバキュロウイルスベクターだけを使用する系を指し、そのうちの１つは２つの発現カセットを含む、例えば、Ｃａｐ及びＲｅｐ発現カセットを含むか又はＣａｐ及びＴｒａｎｓカセットを含む。本明細書で使用される用語「ＤｕｏＤｕｏＢａｃ」は、その各々は少なくとも２つの異なる発現カセットを含む２つの異なるバキュロウイルスベクターを使用する系を指し、例えば、１つのベクターはＣａｐ及びＲｅｐカセットを含み、他のベクターはＣａｐ及びＴｒａｎｓカセットを含む。

［発明の詳細な説明］
パルボウイルス、すなわちＡＡＶ、構造及び非構造タンパク質の間の発現動態及び比は、特にバキュロウイルス及び昆虫細胞プラットホームを使用した生成プラットホームからのベクター生成の収量及び品質にとって重要である。ベクター品質は完全ビリオンと空のビリオンの間の比に強く関連し、それはベクター自体の効力に寄与する。

本発明者は、中でも１）２つのＤｕｏＢａｃベクター、すなわちＣａｐ－Ｒｅｐバキュロウイルスベクター及びＣａｐ－Ｔｒａｎｓバキュロウイルスベクターを使用すること（「ＤｕｏＤｕｏＢａｃ」ＡＡＶ生成と呼ばれる、図１を参照する）、２）プロモーター／ＶＰ１開始コドン組合せを最適化すること、及び３）単一のＲｅｐ発現カセットを二重Ｒｅｐ発現カセットに換えることのうちの１つ又は複数によって、昆虫細胞でバキュロウイルスベクターからのｒＡＡＶの生成をさらに最適化した。Ｃａｐ－ＲｅｐバキュロウイルスベクターがＣａｐ－Ｔｒａｎｓバキュロウイルスベクターと組み合わされるＤｕｏＤｕｏＢａｃ系を使用することの利点は、ＡＡＶ生成の間のＣａｐ：Ｒｅｐ比のより多くの制御が達成されることである。以前のＴｒｉｐｌｅＢａｃ ＡＡＶ生成実験は、Ｃａｐ：Ｒｅｐバキュロウイルス接種比を変更することが、全体／完全の比及びＡＡＶ収量（ｇｃ／ｍｌ）に影響を及ぼすことを示した。

本発明者は、ｒＡＡＶ生成の間にＲｅｐの量を増加させることは、カプシド形成及び全体／完全の比を抑制するが、Ｃａｐの量を増加させることは全体／完全の比並びに収量を増加させることを見出した。上記のように、全体／完全の比はＡＡＶバッチを特徴付けるために使用することができる１つのパラメータであることが当業者にわかるだろう。全体／完全の比は、本明細書で使用されるように、ＤＮＡで満たされたＡＡＶ粒子（ｇｃ／ｍｌで表される）のＡＡＶ粒子の総数（ＶＰ／ｍｌで表される）に対する比を指す。その結果として、より低い全体／完全の比は完全な粒子あたりのより少ない空粒子を意味し、逆も同じである。１キログラムあたり類似の量のゲノムコピーを達成するためにより少ない粒子を投薬することができるので、生成されるＡＡＶの全体／完全の比を低減することは、ＡＡＶ生成物のために潜在的に有益である可能性がある。低い全体／完全の比は、頑強な下流プロセスの設定のために有益であるより均一な生成プロファイルをももたらす。

さらに、接種のためのバキュロウイルスの数が低減されるので、ＴｒｉｐｌｅＢａｃ系では通常接種することができないより高いＣａｐ：Ｒｅｐ比を探ることができる。ＴｒｉｐｌｅＢａｃ系では、接種されるバキュロウイルスの数の低減は、生成培養に加えられる全体のバキュロウイルス量もより低いことを意味する。ＡＡＶ生成に高い接種量を加えることが望ましくなかったことは、当業者に公知である。第１に、多量のバキュロウイルスを頑強に生成することが困難であるからであり、第２に、ＡＡＶ生成に多量のバキュロウイルスを加えることは生成を阻害するからである。これは、とりわけ、生成培養への多量の使用済み培地の追加のためであると考えられている。

第１の態様では、したがって本発明は：ｉ）ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１のプロモーターを含む第１の発現カセットであって、細胞におけるその翻訳はパルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つを生成する、第１の発現カセット；ｉｉ）ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の発現カセットであって、細胞におけるその翻訳はパルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つを生成する、第２の発現カセット；ｉｉｉ）パルボウイルスＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第３のプロモーターを含む第３の発現カセット；並びにｉｖ）少なくとも１つのパルボウイルス逆方向末端反復配列に隣接する導入遺伝子を含むヌクレオチド配列、を含む１つ又は複数の核酸構築物を含む細胞であって、第１及び第２の発現カセットのうちの少なくとも１つは、第３の発現カセットと共に第１の核酸構築物に存在し、１つ又は複数の核酸構築物による細胞のトランスフェクションの後、第１のプロモーターは第２及び第３のプロモーターの前に活性である、細胞を提供する。細胞は好ましくは、例えば本明細書で下に規定されるような昆虫細胞である。その翻訳はパルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つ又はパルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つを生成するｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、好ましくは本明細書で下に記載されるヌクレオチド配列である。パルボウイルスＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、好ましくは本明細書で下に記載されるヌクレオチド配列である。１つ又は複数のパルボウイルス逆方向末端反復配列に隣接する導入遺伝子を含むヌクレオチド配列は、下でさらに詳細に記載される。したがって、第１の核酸構築物は、好ましくは第１、第２及び第３の発現カセットの各々を含む単一のタイプの核酸構築物である。一実施形態では、第１の核酸構築物は、１つ又は複数のパルボウイルス逆方向末端反復に隣接する導入遺伝子を含まない。

したがって、一実施形態では、パルボウイルス逆方向末端反復配列に隣接する導入遺伝子を含むヌクレオチド配列は、第２の核酸構築物の上に存在する。第２の核酸構築物は、好ましくは第１の核酸構築物と異なる。

好ましい実施形態では、第２の核酸構築物は、パルボウイルスＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第４のプロモーターを含む第４の発現カセットをさらに含み、第１のプロモーターは第２、第３及び第４のプロモーターの前に活性である。好ましくは、第３及び第４の発現カセットのヌクレオチド配列によってコードされるパルボウイルスＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質は同一である。第３及び第４のプロモーターは同一であってよいか又はそれらは異なるプロモーターであってもよい。

本発明の構築物で第１、第２、第３及び／又は第４のプロモーターとして適用される好適なプロモーターは、下でより詳細に記載される。

レプリカーゼタンパク質
パルボウイルス、特にＡＡＶのレプリカーゼ、すなわちＲｅｐタンパク質は、ｒｅｐ遺伝子カセットによってコードされる非構造タンパク質である。内因性のＰ１９プロモーターのために、この遺伝子は長さの異なる２つの重複するメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を生成する。これらのｍＲＮＡの各々は、スプライスアウトすることができるか、又は最終的に４つのＲｅｐタンパク質、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０を生成させないことができる。Ｒｅｐ７８／６８及びＲｅｐ５２／４０は、ＩＴＲ依存性ＡＡＶゲノム又は導入遺伝子複製及びウイルス粒子アセンブリにとって重要である。Ｒｅｐ７８／６８はウイルス複製イニシエータタンパク質の役割をし、ウイルスゲノムのためのレプリカーゼとして作用する（Ｃｈｅｊａｎｏｖｓｋｙ、Ｎ．、Ｃａｒｔｅｒ、Ｂ．Ｊ．。Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｐｕｒｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐ ｇｅｎｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ａ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｆｏｒ ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、１９９０年、６４：１７６４～１７７０頁、Ｈｏｎｇ、Ｇ．、Ｗａｒｄ、Ｐ．、Ｂｅｒｎｓ、Ｋ．Ｉ．、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１９９２年、８９：４６７３～４６７７頁。Ｎｉ．Ｔ－Ｈ．ら、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、１９９４年、６８：１１２８～１１３８頁）。Ｒｅｐ５２／４０タンパク質は３’から５’への極性を有するＤＮＡヘリカーゼであり、空のカプシドへのウイルスＤＮＡのパッケージングの間に決定的な役割を演じ、ここでそれらはパッケージング運動複合体の一部であると考えられている（Ｔｈｅ Ｒｅｐ５２ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｉｓ ａ ＤＮＡ Ｈｅｌｉｃａｓｅ ｗｉｔｈ ３’－５’ Ｐｏｌａｒｉｔｙ；Ｓｍｉｔｈ及びＫｏｔｉｎ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９８年、４８７４～４８８１頁、ＤＮＡ ｈｅｌｉｃａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ２ ｇｅｎｏｍｅｓ ｉｎｔｏ ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ ｃａｐｓｉｄｓ。Ｋｉｎｇ、Ｊ．Ａ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．、２００１年、２０：３２８２～３２９１頁）。バキュロウイルス及び昆虫細胞プラットホームからＡＡＶを生成するために、Ｒｅｐ６８及びＲｅｐ４０の両方の存在は必要条件でない（Ｕｒａｂｅ、ら、２００２年）。

本発明によれば、細胞は、パルボウイルスＲｅｐタンパク質の発現のための少なくとも第１及び第２の発現カセットを含む第１の核酸構築物を含む。第１の発現カセットは、ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１のプロモーターを含み、細胞におけるその翻訳はパルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つを生成する。

好ましい実施形態では、第１の発現カセットはｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１のプロモーターを含み、細胞におけるその翻訳はパルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つだけを生成する。それによって、パルボウイルスＲｅｐ７８及び／又は６８タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、Ｒｅｐ５２及び／又は４０タンパク質もｍＲＮＡから翻訳されるように、部分的エクソンスキップに影響を及ぼす翻訳の最適以下の開始を有しない、パルボウイルスＲｅｐ７８及び／又は６８タンパク質のためのオープンリーディングフレームをコードすることが理解される（下を参照する）。細胞におけるその翻訳は本発明で使用するためのパルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つを生成するｍＲＮＡをコードする好適なヌクレオチド配列は：ａ）配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０、７０、８０、８８、８９、９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ｂ）配列番号１９の位置１１～１８７６のヌクレオチド配列と少なくとも５０、６０、７０、８０、８１、８２、８５、９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；ｃ）その相補鎖が（ａ）又は（ｂ）の核酸分子配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列；及びｄ）遺伝子コードの同義性のためにその配列が（ｃ）の核酸分子の配列と異なるヌクレオチド配列と規定することができる。これらのＲｅｐ７８／６０コード配列は、翻訳の最適以下の開始をコードしてもしなくともよいことが理解される。

したがって第１の核酸構築物は、パルボウイルスＲｅｐ５２及び／又は４０タンパク質の発現のための第２の発現カセットをさらに含む。第２の発現カセットは、ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２のプロモーターであって、細胞におけるその翻訳はパルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つを生成する第２のプロモーターを含む。

好ましい実施形態では、第２の発現カセットはｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２のプロモーターを含み、細胞におけるその翻訳はパルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つだけを生成する。それによって、パルボウイルスＲｅｐ５２及び／又は４０タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、パルボウイルスＲｅｐ７８及び／又は６８タンパク質もコードするより大きなコード配列の一部でないものと理解される。好ましくは、細胞におけるその翻訳はパルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つだけを生成するｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、パルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つの翻訳開始コドンから最もＣ末端のアミノ酸までのアミノ酸配列からなるオープンリーディングフレームを含み、より好ましくは、このオープンリーディングフレームはｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に含まれる唯一のオープンリーディングフレームである。細胞におけるその翻訳は本発明で使用するためのパルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つだけを生成するｍＲＮＡをコードする好適なヌクレオチド配列は：ａ）配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０、７０、８０、８８、８９、９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ｂ）配列番号２１～２５のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも５０、６０、７０、８０、８１、８２、８５、９０、９５、９７、９８又は９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；ｃ）その相補鎖が（ａ）又は（ｂ）の核酸分子配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列；及びｄ）遺伝子コードの同義性のためにその配列が（ｃ）の核酸分子の配列と異なるヌクレオチド配列と規定することができる。

好ましくは、ヌクレオチド配列は、昆虫細胞でのパルボウイルスベクター生成に必要とされ、十分であるパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードする。

一実施形態では、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２翻訳開始部位以外の、Ｒｅｐタンパク質コード配列中の、可能性がある偽の翻訳開始部位は排除される。一実施形態では、昆虫細胞で認識することができる推定上のスプライス部位は、Ｒｅｐタンパク質コード配列から排除される。これらの部位の排除は、当業者であればよく理解するであろう。

さらなる実施形態では、パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つ並びにパルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つは、パルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つの第２のアミノ酸から最もＣ末端のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む共通アミノ酸配列を含み、パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つ並びにパルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つの共通アミノ酸配列は、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％同一であり、パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列並びにパルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６０％未満同一である。

一実施形態では、パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、パルボウイルスＲｅｐ５２及び４０のうちの少なくとも１つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と比較して、細胞のための改善されたコドン使用頻度バイアスを有するか、又はパルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と比較して、細胞のための改善されたコドン使用頻度バイアスを有する。さらなる実施形態では、パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つ並びにパルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つにおける共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の間のコドン適応指数の差は、少なくとも０．２である。

共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の宿主細胞のコドン使用頻度への適応性は、コドン適応指数（ＣＡＩ）で表すことができる。好ましくは、コドン使用頻度は、共通アミノ酸配列を有するＲｅｐタンパク質が発現される昆虫細胞に適応させられる。通常、これはスポドプテラ属の細胞、より好ましくはスポドプテラ・フルジペルダ細胞である。したがって、コドン使用頻度は、好ましくはスポドプテラ・フルジペルダ又はオートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）感染細胞に適応させられる。コドン適応指数は、本明細書では高度に発現される遺伝子のコドン使用頻度に対する遺伝子のコドン使用頻度の相対的適応性の測定値と規定される。各コドンの相対的適応性（ｗ）は、各コドンの使用頻度の同じアミノ酸のための最も豊富なコドンのそれに対する比である。ＣＡＩ指数は、これらの相対的適応性の値の幾何平均と規定される。非同義コドン及び終結コドン（遺伝子コードに依存する）は、排除される。ＣＡＩ値は０～１の範囲内であり、より高い値は最も豊富なコドンのより高い割合を示す（Ｓｈａｒｐ及びＬｉ、１９８７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：１２８１～１２９５頁；以下も参照する：Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ．１９９７年、２５ １９９：２９３～３０１頁；ｚｕｒ Ｍｅｇｅｄｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２０００年、７４：２６２８～２６３５頁）。

好ましくは、パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つ並びにパルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つにおける共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の間のコドン適応指数の差は、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７又は０．８であり、これにより、より好ましくは、パルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列のＣＡＩは、少なくとも０．５、０．６、０．７、０．８、０．９又は１．０である。

したがって、代わりの実施形態では、パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つ並びにパルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つは、パルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つの第２のアミノ酸から最もＣ末端のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む共通アミノ酸配列を含み、ここで、パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つ並びにパルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つの共通アミノ酸配列は少なくとも９０％同一であり、パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列並びにパルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、９０％未満同一であり、パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、パルボウイルスＲｅｐ５２及び４０のうちの少なくとも１つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と比較して、細胞のための改善されたコドン使用頻度バイアスを有するか、又はパルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つの共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と比較して、細胞のための改善されたコドン使用頻度バイアスを有し、好ましくは、パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つ並びにパルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つにおける共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の間のコドン適応指数の差は、少なくとも０．２である。パルボウイルスＲｅｐタンパク質のコドン最適化は、この後さらに詳細に議論される。

パルボウイルスＲｅｐタンパク質の温度最適化は、昆虫細胞が増殖する温度及びＲｅｐが機能する温度に関して最適な条件の使用を指す。Ｒｅｐタンパク質は例えば３７℃で最適に活性であってよく、昆虫細胞は２８℃で最適に増殖することができる。Ｒｅｐタンパク質が活性である温度及び昆虫細胞が増殖する温度は、３０℃であってよい。好ましい実施形態では、最適化された温度は、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５℃より高く、及び／又は３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０又は２９℃未満である。

当業者に理解されるように、完全ビリオン：空ビリオンの比は、中程度から高いＲｅｐ発現と比較して減弱したＣａｐ発現、例えばより弱いプロモーターによって向上させることもできる。

一実施形態では、細胞におけるその翻訳はパルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つだけを生成するｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、例えばパルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質をコードする天然のパルボウイルスヌクレオチド配列に存在するように無傷のパルボウイルスｐ１９プロモーターを含む。

一実施形態では、第１の核酸構築物中の第１及び第２の発現カセットは、（昆虫）細胞中のＲｅｐ７８のＲｅｐ５２に対する所望のモル比を得るために最適化される。好ましくは、第１の核酸構築物は、（昆虫）細胞で１：１０～１０：１、１：５～５：１又は１：３～３：１の範囲内のＲｅｐ７８のＲｅｐ５２に対するモル比をもたらす。より好ましくは、第１の核酸構築物は、少なくとも１：２、１：３、１：５又は１：１０であるＲｅｐ７８のＲｅｐ５２に対するモル比をもたらす。Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２のモル配分比は、好ましくはＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２の共通エピトープを認識するモノクローナル抗体を使用した、又は、例えばマウス抗Ｒｅｐ抗体を使用したウエスタンブロットによって決定することができる（３０３．９、Ｐｒｏｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ；希釈１：５０）。

Ｒｅｐ７８のＲｅｐ５２に対する所望のモル比は、本明細書の下でさらに記載されるように、それぞれ第１及び第２の発現カセットにおけるプロモーターの選択によって得ることができる。代わりに、又は組合せによって、Ｒｅｐ７８のＲｅｐ５２に対する所望のモル比は、パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つの定常状態レベルを低減する手段を用いて得ることができる。

したがって、一実施形態では、パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つのｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つの低減された定常状態レベルに影響を及ぼす改変を含む。低減された定常状態条件は、例えば、調節エレメント若しくは上流プロモーターをトランケーションすること（Ｕｒａｂｅら、前掲、Ｄｏｎｇら、前掲）、タンパク質分解シグナルペプチド、例えばＰＥＳＴ若しくはユビキチン化ペプチド配列を加えること、より最適以下のものに開始コドンを置換することによって、又は国際出願２００８／０２４９９８に記載される人工イントロンの導入によって達成することができる。

好ましい実施形態では、パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列は、最適以下の翻訳開始コドンから開始するオープンリーディングフレームを含む。最適以下の開始コドンは、好ましくは、部分的エクソンスキップに影響を及ぼす開始コドンである。部分的エクソンスキップは、本明細書ではリボソームの少なくとも一部がＲｅｐ７８タンパク質の最適以下の開始コドンで翻訳を開始しないが、さらに下流の開始コドンで開始することができ、それによって好ましくはさらに下流のこの（第１の）開始コドンはＲｅｐ５２タンパク質の開始コドンであることを意味すると理解される。代わりに、パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列は、最適以下の翻訳開始コドンから開始するオープンリーディングフレームを含み、さらに下流の開始コドンを有しない。最適以下の開始コドンは、好ましくは昆虫細胞でのヌクレオチド配列の発現の後に部分的エクソンスキップに影響を及ぼす。

本明細書において用語「最適以下の開始コドン」は、トリヌクレオチド開始コドン自体だけでなくその状況も指す。したがって、最適以下の開始コドンは、最適以下の状況、例えば非コザック状況における「最適な」ＡＴＧコドンからなることができる。しかし、トリヌクレオチド開始コドン自体が最適以下である、すなわちＡＴＧでない、最適以下の開始コドンがより好ましい。最適以下は、本明細書において、正常なＡＴＧコドンと比較して、それ以外の点では同一の状況で、翻訳の開始においてそのコドンがより効率的でないことを意味すると理解される。好ましくは、最適以下のコドンの効率は、それ以外は同一の状況での正常なＡＴＧコドンの効率の９０、８０、６０、４０又は２０％未満である。翻訳の開始の相対的効率を比較する方法は、それ自体当業者に公知である。好ましい最適以下の開始コドンは、ＡＣＧ、ＴＴＧ、ＣＴＧ及びＧＴＧから選択することができる。ＡＣＧがより好ましい。パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、本明細書において、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質などの昆虫細胞におけるパルボウイルスベクター生成に必要とされ、十分である、非構造Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列であると理解される。

カプシドタンパク質
パルボウイルスカプシド（Ｃａｐ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、本明細書において、３つのパルボウイルスカプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３のうちの１つ又は複数をコードするヌクレオチド配列を含むと理解される。パルボウイルスヌクレオチド配列は、好ましくはデペンドウイルスに、より好ましくはヒト又はサルのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に、最も好ましくはヒト（例えば、血清型１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３）又は霊長類（例えば、血清型１及び４）に通常感染するＡＡＶに由来し、そのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、参照により完全に本明細書に組み込まれる、Ｌｕｂｅｌｓｋｉら、米国特許出願公開第２０１７３５６００８号に掲載される。したがって、本発明による核酸構築物は、Ｌｕｂｅｌｓｋｉら、米国特許出願公開第２０１７３５６００８号に開示されるように、ＡＡＶカプシドタンパク質の全オープンリーディングフレームを含むことができる。或いは、配列は人工であってよく、例えば、配列はハイブリッドの形であってよいか、又は例えばＡｃｍＮＰｖ若しくはスポドプテラ・フルジペルダのコドン使用によってコドン最適化されてもよい。例えば、カプシド配列はＡＡＶ１のＶＰ２及びＶＰ３配列で構成することができ、一方、ＶＰ１配列の残りはＡＡＶ５のものである。好ましいカプシドタンパク質は、Ｌｕｂｅｌｓｋｉら米国特許出願公開第２０１７３５６００８号に掲載されるように、配列番号２６で提供されるＡＡＶ５又はＡＡＶ８である。したがって、好ましい実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、本発明により改変されたＡＡＶ血清型５又はＡＡＶ血清型８カプシドタンパク質である。より好ましくは、ＡＡＶカプシドタンパク質は、本発明により改変されたＡＡＶ血清型５カプシドタンパク質である。カプシドタンパク質の正確な分子量並びに翻訳開始コドンの正確な位置は、異なるパルボウイルスの間で異なることがあると理解される。しかし、当業者であれば、ＡＡＶ５と別のパルボウイルスからのヌクレオチド配列における対応する位置を同定する方法を認識しているであろう。或いは、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列は、例えば定方向進化実験の結果としての人工配列である。これは、ＤＮＡシャッフリング、変異性ＰＣＲ、バイオインフォマティクス合理的設計、部位飽和突然変異誘発を通したカプシドライブラリーの作製を含むことができる。生じたカプシドは既存の血清型に基づくが、そのようなカプシドの特徴を向上させる様々なアミノ酸又はヌクレオチド変化を含有する。生じたカプシドは既存の血清型の様々な部分の組合せ、「シャッフルされたカプシド」であってよいか、又は群に組織されるか又は遺伝子若しくはタンパク質の全長に広がっている、完全に新規の変化、すなわち１つ又は複数のアミノ酸若しくはヌクレオチドの付加、欠失若しくは置換を含有することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｃｈａｆｆｅｒ及びＭａｈｅｓｈｒｉ；Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ２６ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＩＥＥＥ ＥＭＢＳ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ；２００４年９月１～５日、３５２０～３５２３頁；Ａｓｕｒｉら、２０１２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０（２）：３２９～３３８９頁；Ｌｉｓｏｗｓｋｉら、２０１４年、Ｎａｔｕｒｅ ５０６（７４８８）：３８２～３８６頁を参照する。

本発明の好ましい実施形態では、ＶＰ１カプシドタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、ＡＣＧ、ＡＴＴ、ＡＴＡ、ＡＧＡ、ＡＧＧ、ＡＡＡ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＴＴＧ、ＴＡＧ及びＧＴＧからなる群から選択される非正規の翻訳開始コドンから開始する。好ましくは、非正規の翻訳開始コドンは、ＧＴＧ、ＣＴＧ、ＡＣＧ及びＴＴＧからなる群から選択され、より好ましくは非正規の翻訳開始コドンはＣＴＧである。

ＡＡＶカプシドタンパク質の発現のための本発明のヌクレオチド配列は、ＶＰ１オープンリーディングフレームのヌクレオチド１２位のＧ、ヌクレオチド２１位のＡ、及びヌクレオチド２４位のＣの中から選択される、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも１つの改変をさらに好ましくは含み、ここで、ヌクレオチド位置は野生型ヌクレオチド配列のヌクレオチド位置に対応する。「潜在的／可能性がある偽の開始部位」又は「潜在的／可能性がある偽の翻訳開始コドン」は、本明細書において、カプシドタンパク質（複数可）のコード配列に位置するインフレームＡＴＧコドンを意味すると理解される。他の血清型のＶＰ１コード配列の中の翻訳のための可能性がある偽の開始部位の排除は、昆虫細胞で認識することができる推定上のスプライス部位の排除のように、当業者に十分に理解される。例えば、ヌクレオチドＴは偽のＡＴＧコドンを生成しないので、１２位のヌクレオチドの改変は組換えＡＡＶ５のために必要とされない。パルボウイルスカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の具体的な例は、配列番号２７～２９で与えられる。本発明のパルボウイルスＣａｐ及び／又はＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、穏やかな、又は好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２７～２９及び２１～２５のヌクレオチド配列にそれぞれハイブリダイズするそれらの能力によって規定することもできる。

カプシドタンパク質コード配列は、様々な形で存在することがある。例えば、カプシドタンパク質ＶＰ１、－２及び－３の各々のための別々のコード配列を使用することができ、それによって、各コード配列は昆虫細胞での発現のための発現制御配列に作動可能に連結される。しかし、より好ましくは、第２の発現カセットは、パルボウイルス（ＡＡＶ）ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質の全３つをコードする単一のオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列を含み、ここで、ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンは、例えばＵｒａｂｅら（２００２年、前掲）及び国際出願２００７／０４６７０３に記載されるように、ＡＴＧでない最適以下の開始コドンである。ＶＰ１カプシドタンパク質のための最適以下の開始コドンは、Ｒｅｐ７８タンパク質のために上記で規定される通りであってよい。ＶＰ１カプシドタンパク質のためのより好ましい最適以下の開始コドンは、ＡＣＧ、ＴＴＧ、ＣＴＧ及びＧＴＧから選択することができ、そのうちＣＴＧ及びＡＣＧが最も好ましい。

代わりの実施形態では、第２の発現カセットは、パルボウイルス（ＡＡＶ）ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質の全３つをコードする単一のオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列を含み、ここで、ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンはＡＴＧであり、ヌクレオチド配列でコードされるＶＰ１カプシドタンパク質をコードするｍＲＮＡは、（国際出願２０１９／０１６３４９に記載される通り）オープンリーディングフレームＶＰ１カプシドタンパク質の枠外の代わりの開始コドンを含む。好ましくは、代わりの開始コドンは、ＣＴＧ、ＡＴＧ、ＡＣＧ、ＴＴＧ、ＧＴＧ、ＣＴＣ及びＣＴＴからなる群から選択され、そのうちＡＴＧが好ましい。好ましくは、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ５血清型カプシドタンパク質である。この実施形態では、好ましくは、ヌクレオチド配列は、ＶＰ１のための前記ＡＴＧ翻訳開始コドンを包含する代わりの開始コドンで開始する代わりのオープンリーディングフレームを含み、それによって、好ましくは、代わりの開始コドンに続く代わりのオープンリーディングフレームは、最高２０アミノ酸のペプチドをコードする。

カプシドタンパク質の発現のための第２の発現カセットに含まれるヌクレオチド配列は、国際出願２００７／０４６７０３に記載されるように１つ又は複数の改変をさらに含むことができる。ＶＰ及びビリオンの収量を増加させるか、又はビリオンの向性の変更若しくは抗原性の低減などの他の所望の効果を有することができる、ＶＰコード領域の様々なさらなる改変が当業者に公知である。これらの改変は、本発明の範囲内にある。

一実施形態では、ＶＰ１の発現は、ＶＰ２及びＶＰ３の発現と比較して増加する。国際出願２００７／０８４７７３に記載されているように、ＶＰ１発現は、ＶＰ１の補給によって、ＶＰ１のためのヌクレオチド配列を含む単一のベクターの昆虫細胞への導入によって増加させることができる。

一般的に、本発明の方法では、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのオープンリーディングフレーム、又はＲｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質のうちの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームを含む、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム。一実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質、又はＲｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質のうちの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームを含む少なくとも１つのオープンリーディングフレームは、人工イントロン（又は、人工イントロンに由来する配列）を含まない。すなわち、Ｒｅｐ又はＶＰタンパク質をコードするために使用される少なくともオープンリーディングフレームは、人工イントロンを含まない。人工イントロンとは、アデノ随伴ウイルスＲｅｐ又はＣａｐ配列中に天然に存在しないイントロン、例えば、昆虫細胞の中で機能的スプライシングを許すように工学操作されたイントロンを意味するものである。したがって、これに関連して、人工イントロンは野生型昆虫細胞イントロンを包含する。本発明の発現カセットは、天然のトランケーションされたイントロン配列を含むことができる（天然は、アデノ随伴ウイルスに天然に存在する配列を意味する）－そのような配列は、本明細書に規定される人工イントロンの範疇に入るものでない。

本発明では、１つの可能性は、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレーム、及び／又はＲｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質のうちの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームのいずれも、人工イントロンを含まないことである。

プロモーター
好ましくは、ＡＡＶタンパク質をコードする本発明のヌクレオチド配列は、昆虫細胞での発現のための発現制御配列に作動可能に連結される。これらの発現制御配列は、昆虫細胞で活性であるプロモーターを少なくとも含む。

パルボウイルスカプシドタンパク質をコードする本発明のヌクレオチド配列の転写を制御するための第３及び／又は第４のプロモーターとして使用される好適なプロモーターは、例えばＬｕｂｅｌｓｋｉら米国特許出願公開第２０１７３５６００８号で開示される、多角体プロモーター（ｐｏｌＨ）、例えば配列番号３０で提供されるｐｏｌＨプロモーター、及びその短縮バージョン配列番号３１である。しかし、昆虫細胞で活性である、及び本発明により選択することができる他のプロモーターは、当技術分野で公知である、例えば、ポリヘドリン（ｐｏｌＨ）プロモーター、ｐ１０プロモーター、ｐ３５プロモーター、４ｘＨｓｐ２７ ＥｃＲＥ＋ｍｉｎｉｍａｌ Ｈｓｐ７０プロモーター、ｄｅｌｔａＥ１プロモーター、Ｅ１プロモーター又はＩＥ－１プロモーター、及び上の参考文献に記載されるさらなるプロモーター。一実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする本発明のヌクレオチド配列の転写のためのプロモーターは、ｐ１０又はｐｏｌＨである。さらなる実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする本発明のヌクレオチド配列の転写のためのプロモーターは、ｐ１０である。代わりの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする本発明のヌクレオチド配列の転写のためのプロモーターは、ｐｏｌＨである。

これらの上記のプロモーターは、パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードする本発明のヌクレオチド配列の転写を制御するための第１及び第２のプロモーターとして使用することもできる。一実施形態では、第１のプロモーターは構成的プロモーターである。本明細書で使用されるように、用語「プロモーター」又は「転写調節配列」は、１つ又は複数のコード配列の転写を制御する機能を果たす核酸断片を指し、コード配列の転写開始部位の転写方向に関して上流に位置し、転写因子結合部位、リプレッサー及び活性化タンパク質結合部位、及びプロモーターからの転写量を調節するために直接的又は間接的に作用することが当業者に公知であるヌクレオチドの任意の他の配列を限定されずに含む、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、転写開始部位及び任意の他のＤＮＡ配列のための結合部位の存在によって構造的に同定される。「構成的」プロモーターは、ほとんどの生理的及び発達条件下でほとんどの組織において活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、例えば化学的インデューサーの適用によって、生理的に又は発達上調節されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特異的タイプの組織又は細胞だけで活性である。「クリプティックプロモーター」は、活性化することができる、後成的にサイレンシングされたプロモーターである。

好ましい実施形態では、Ｒｅｐ７８タンパク質のＲｅｐ５２タンパク質に対する発現の比は：（ａ）例えばレポーター遺伝子発現（例えばルシフェラーゼ又はＳＥＡＰ）又はノーザンブロットによって決定される通り、第２のプロモーターは第１のプロモーターより強力であること；（ｂ）第１の発現カセットと比較して第２の発現カセットの上流におけるヌクレオチドスペーサー又はより多くの及び／又はより強力なエンハンサーエレメントの存在；（ｃ）Ｒｅｐ７８タンパク質をコードするヌクレオチド配列と比較して、パルボウイルスＲｅｐ５２タンパク質をコードするヌクレオチド配列はより高いコドン適応指数を有すること；（ｄ）パルボウイルスＲｅｐタンパク質の温度最適化；及び対応する野生型Ｒｅｐタンパク質と比較してアミノ酸配列に１つ又は複数の変化を有するバリアントＲｅｐタンパク質のうちの１つ又は複数によって調節され、ここで、昆虫細胞でＡＡＶ生成の増加を検出することによって調査される通り１つ又は複数のアミノ酸変化はＲｅｐ機能の活性の増加をもたらす。昆虫細胞でＡＡＶ生成の増加を検出することによって調査される通り、Ｒｅｐ機能の活性が増加したバリアントＲｅｐタンパク質の生成、選択及び／又はスクリーニングのための方法は、哺乳動物細胞でのＡＡＶ生成に関して機能が増加したバリアントＲｅｐタンパク質を得るための米国特許出願公開第２００３０１３４３５１号に記載される方法の昆虫細胞への適応によって得られる。対応する野生型Ｒｅｐタンパク質と比較してアミノ酸配列に１つ又は複数の変化を有するバリアントＲｅｐタンパク質は、本明細書において対応する野性型Ｒｅｐタンパク質のアミノ酸配列と比較して、バリアントアミノ酸配列の中に１つ又は複数のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を有するＲｅｐタンパク質を含むと理解される。

第２のプロモーターは第１のプロモーターより強力であるとは、Ｒｅｐ５２タンパク質をコードするヌクレオチド配列がＲｅｐ７８タンパク質をコードするヌクレオチド配列より多く発現されることを意味する。Ｒｅｐ５２タンパク質の発現がＲｅｐ７８タンパク質の発現と比較してその後増加するので、等しく強力なプロモーターを使用することができる。プロモーターの強度は、本発明の方法で使用される条件の下で得られる発現によって決定することができる。一実施形態では、第２、第３及び第４のプロモーターのうちの少なくとも１つは誘導性プロモーターであり、好ましくは、ｐｏｌＨ及びｐ１０から選択される。さらなる実施形態では、誘導性プロモーターは、ウイルス感染周期のより後期に誘導されるウイルスプロモーターであり、好ましくはウイルスによる細胞のトランスフェクション又は感染の少なくとも２４時間後に誘導されるウイルスプロモーターである。

一実施形態では、第１のプロモーターは、ｄｅｌｔａＥｌプロモーター及びＥｌプロモーターから選択され；第２、第３及び第４のプロモーターはｐｏｌＨプロモーター又はｐ１０プロモーターから選択される。さらなる実施形態では、第１のプロモーターはｄｅｌｔａＥ１であり、第２のプロモーターはｐｏｌＨである。

別々のＡＡＶ遺伝子を作動させるために同じバキュロウイルス構築物で同じバキュロウイルスプロモーターを２回使用することは、プロモーターの間で競合をもたらすことがある。この競合はＣａｐ及びＲｅｐ遺伝子の発現の減少をもたらし、それによってＡＡＶ収量を低減する。発現カセットの中の類似したエレメントの近接性は、この作用を潜在的に増強する可能性がある。減弱遺伝子の発現は、より強力な開始コドンの使用によって又はカプシドタンパク質を作動させるプロモーターの交換（例えばｐｏｌＨからＰ１０に）によって向上させることができる。したがって、好ましい実施形態では、第１、第２及び第３のプロモーターは異なるプロモーターであり、より好ましくは、第１、第２、第３及び第４のプロモーターは異なるプロモーターである。

エンハンサー
「エンハンサーエレメント」又は「エンハンサー」は、プロモーターの活性を増強し（すなわち、プロモーターの下流の配列の転写率を増加させる）、プロモーターとは対照的にプロモーター活性を保有せず、通常プロモーターに対する位置（すなわちプロモーターの上流、又は下流）にかかわりなく機能することができる配列を規定するものである。エンハンサーエレメントは、当技術分野で周知である。本発明で使用することができるエンハンサーエレメント（又は、その一部）の非限定的な例には、昆虫細胞で見出されるバキュロウイルスエンハンサー及びエンハンサーエレメントが含まれる。エンハンサーエレメントが細胞内でプロモーターが作動可能に連結された遺伝子のｍＲＮＡ発現を、エンハンサーエレメントが存在しない場合の遺伝子のｍＲＮＡ発現と比較して少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも１００％、最も好ましくは少なくとも２００％増加させることが好ましい。ｍＲＮＡ発現は、例えば定量的ＲＴ－ＰＣＲによって決定することができる。

本明細書において、パルボウイルスＲｅｐタンパク質の発現を増強するためにエンハンサーエレメントを使用することが好ましい。したがって、一実施形態では、少なくとも１つの発現カセットは少なくとも１つのバキュロウイルスエンハンサーエレメント及び／又は少なくとも１つのエクジソン応答エレメントを含み、好ましいエンハンサーエレメントはｈｒ１、ｈｒ２、ｈｒ３、ｈｒ４及びｈｒ５からなる群から選択される。好ましくは、エンハンサーエレメントは、バキュロウイルスの相同領域（ｈｒ）エンハンサーエレメントなどのようにバキュロウイルスの前初期タンパク質（ＩＥ１）又はそのスプライスバリアント（ＩＥ０）に応答性であり、好ましくは、バキュロウイルスはオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）マルチカプシド核多角体病ウイルスである。ＩＥ１は、プラスミドトランスフェクションアッセイにおいてバキュロウイルス初期遺伝子プロモーターをトランス活性化し、後期遺伝子発現を支える、高度に保存された６７ｋＤａのＤＮＡ結合タンパク質である（例えば、Ｏｌｓｏｎら、２００２年、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、７６：９５０５～９５１５頁を参照する）。ＡｃＭＮＰＶ ＩＥ１は、プロモーターのトランス活性化及びＤＮＡ結合に寄与する分離可能なドメインを所有する。この５８２残基リンタンパク質のＮ末端半分は、残基８～１１８及び１６８～２２２の転写刺激ドメインを含有する。ＩＥ１は、ＡｃＭＮＰＶゲノム全体に分散して見出される複数の相同領域（ｈｒ）の中で反復配列を構成する、約２８ｂｐの不完全な回文（２８ｍｅｒ）に結合する。ｈｒ ２８ｍｅｒは、ＩＥ１媒介エンハンサー及び起源特異的複製機能のために必要とされる最小限の配列モチーフである。

一実施形態では、ｈｒエンハンサーエレメントは、ｈｒ２－０．９以外のｈｒエンハンサーエレメントである（米国特許出願公開第２０１２／１００６０６号）。さらなる実施形態では、ｈｒエンハンサーエレメントは、ｈｒ１、ｈｒ３、ｈｒ４ｂ及びｈｒ５からなる群から選択され、そのうちｈｒ４ｂ及びｈｒ５が好ましく、ｈｒ４ｂが最も好ましい。代わりの実施形態では、ｈｒエンハンサーエレメントは、例えば天然に存在しない設計されたエレメントなどのバリアントｈｒエンハンサーエレメントである。バリアントｈｒエンハンサーエレメントは、好ましくはｈｒ２８ｍｅｒ配列ＣＴＴＴＡＣＧＡＧＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡＣＧＣＧＴＡＡＡＡ（配列番号３２）を少なくとも１コピー、及び／又は少なくとも１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６又は２７ヌクレオチドが配列ＣＴＴＴＡＣＧＡＧＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡＣＧＣＧＴＡＡＡＡ（配列番号３２）と同一であり、好ましくはバキュロウイルスのＩＥ１タンパク質に、より好ましくはＡｃＭＮＰＶ ＩＥ１タンパク質に結合する、配列を少なくとも１コピー含む。バリアントｈｒエンハンサーエレメントは、さらに好ましくは、バリアントエレメントがｐｏｌＨプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む発現カセットに作動可能に連結されるとき、ａ）非誘導条件下で、バリアントエレメントを有するカセットは、バリアントエレメントの代わりにｈｒ２－０．９エレメントを含む、それ以外は同一の発現カセットより少ないレポーター転写物を生成するか、又は、バリアントエレメントを有するカセットは、バリアントエレメントの代わりにｈｒ４ｂエレメントを含む、それ以外は同一の発現カセットによって生成されるレポーター転写物の量の１．１、１．２、１．５、２、５又は１０分の１を生成し；及びｂ）誘導条件下で、バリアントエレメントを有するカセットは、バリアントエレメントの代わりにｈｒ４ｂ又はｈｒ２－０．９エレメントを含む、それ以外は同一の発現カセットによって生成されるレポーター転写物の量の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０又は１００％を生成するという点で機能的に規定される。非誘導条件は、カセットが試験される場合に細胞中にＩＥ１タンパク質が存在しない条件として理解され、誘導条件は、ｈｒ４ｂ又はｈｒ２－０．９エレメントを含む参照カセットで最大のレポーター発現を得るために十分なＩＥ１タンパク質が存在する条件であると理解される。バキュロウイルスＩＥ１タンパク質へのバリアントｈｒエンハンサーエレメントの結合は、例えば、Ｒｏｄｅｍｓ及びＦｒｉｅｓｅｎ（Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９５年；６９（９）：５３６８～７５頁）によって記載される通り移動シフトアッセイを用いて分析することができる。

ウイルスベクター
本発明は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞における核酸の導入及び／又は発現のためのベクターとして使用するための、パルボウイルス、特に感染性のヒト又はサルのＡＡＶなどのデペンドウイルス、及びその成分（例えば、パルボウイルスゲノム）の使用に関する。特に、本発明は昆虫細胞で生成されるときの、そのようなパルボウイルスベクターの生産性の向上に関する。

これに関連した生産性は、生成力価の向上及び生じた生成物、例えば全体：完全の比（核酸を含む粒子の数の尺度）を向上させた生成物の品質の向上を包含する。すなわち、最終生成物は、増加した割合の充填粒子を有することができ、充填は、粒子が核酸を含むことを意味する。

「パルボウイルスベクター」は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む、組換えで生成されたパルボウイルス又はパルボウイルス粒子と規定される。パルボウイルスベクターの例には、例えば、アデノ随伴ウイルスベクターが含まれる。本明細書では、パルボウイルスベクター構築物は、ウイルスゲノム又はその一部、及び導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスは、小ＤＮＡウイルスである。パルボウイルス科は、２つの亜科に分けることができる：脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ）及び昆虫を含む無脊椎動物に感染するデンソウイルス亜科（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅ）。パルボウイルス亜科のメンバーはパルボウイルスと本明細書で呼ばれ、デペンドウイルス属を含む。それらの属名から推測されるように、デペンドウイルスのメンバーは、それらが細胞培養での増殖性感染のためにアデノウイルス又はヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスとの同時感染を通常必要とするという点で特異である。デペンドウイルス属には、ヒト（例えば、血清型１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３）又は霊長類（例えば、血清型１及び４）に通常感染するＡＡＶ、及び他の温血動物に感染する関連したウイルス（例えば、ウシ、イヌ、ウマ及びヒツジのアデノ随伴ウイルス）が含まれる。パルボウイルス及びパルボウイルス科の他のメンバーに関するさらなる情報は、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第３版１９９６年）の第６９章、Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｉ．Ｂｅｒｎｓ、「Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」に記載される。本発明はＡＡＶに限定されず、他のパルボウイルスに等しく適用することができることが理解されるが、便宜上、本発明はＡＡＶへの参照によって本明細書においてさらに例示され、記載される。したがって一実施形態では、パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つ、パルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つ、パルボウイルスＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質、並びに少なくとも１つのパルボウイルス逆方向末端反復配列はＡＡＶに、好ましくはヒトに感染する血清型のものに由来する。

全ての既知のＡＡＶ血清型のゲノム構成は、非常に類似している。ＡＡＶのゲノムは、長さが約５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）未満である線状の一本鎖ＤＮＡ分子である。逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）は、非構造複製（Ｒｅｐ）タンパク質及び構造ウイルス粒子（ＶＰ）タンパク質のための特異なコードヌクレオチド配列を挟む。ＶＰタンパク質（ＶＰ１、－２及び－３）は、カプシドを形成する。末端の１４５ｎｔ ＩＴＲは自己相補的であり、Ｔ字状のヘアピンを形成するエネルギー的に安定した分子内二重鎖が形成されるように構成される。これらのヘアピン構造はウイルスＤＮＡ複製の起点として機能し、細胞ＤＮＡポリメラーゼ複合体のためのプライマーの役目をする。哺乳動物細胞での野生型（ｗｔ）ＡＡＶ感染に続いて、Ｒｅｐ遺伝子（すなわち、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２）はＰ５プロモーター及びＰ１９プロモーターからそれぞれ発現され、両方のＲｅｐタンパク質はウイルスゲノムの複製及びパッケージングにおける役割を有する。Ｒｅｐ ＯＲＦにおけるスプライシング事象は、実際に４つのＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０）の発現をもたらす。しかし、哺乳動物細胞におけるＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質をコードするスプライスされていないｍＲＮＡは、ＡＡＶベクターの生成に十分であることが示された。昆虫細胞においても、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質は、ＡＡＶベクターの生成にとって十分である。３つのカプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３は、ｐ４０プロモーターからの単一のＶＰ読み枠から発現される。哺乳動物細胞におけるｗｔＡＡＶ感染は、カプシドタンパク質の生成のために、２つのスプライス受容部位の交互使用及びＶＰ２のＡＣＧ開始コドンの最適以下の利用の組合せに依存する。

「組換えパルボウイルス又はＡＡＶベクター」（又は、「ｒＡＡＶベクター」）は、本明細書において目的の１つ又は複数のポリヌクレオチド配列、目的の遺伝子、又は少なくとも１つのパルボウイルス若しくはＡＡＶの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接する「導入遺伝子」を含むベクターを指す。好ましくは、導入遺伝子（複数可）は、導入遺伝子（複数可）の各側に１つずつのＩＴＲが隣接する。そのようなｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びキャップ遺伝子生成物（すなわち、ＡＡＶ Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質）を発現する昆虫宿主細胞に存在するとき、感染性ウイルス粒子の中に複製してパッケージすることができる。ｒＡＡＶベクターがより大きな核酸構築物（例えば、染色体に、又はクローニング若しくはトランスフェクションのために使用されるプラスミド若しくはバキュロウイルスなどの別のベクターに）に組み込まれるならば、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶパッケージング機能及び必要なヘルパー機能の存在下で複製及びカプシド形成によって「レスキューする」ことができる「プロベクター」と一般的に呼ばれる。

（ｉｉ）のヌクレオチド配列は、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質のうちの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームを含むことが好ましい。好ましくは、ヌクレオチド配列は同じ血清型である。より好ましくは、ヌクレオチド配列は、組換えを最小化又は阻止するためにそれらがコドン最適化されるか、ＡＴ最適化されるか又はＧＣ最適化されることがあるという点で、互いと異なる。好ましくは、第１の発現カセットは、パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードする２つのヌクレオチド配列、すなわち、第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列を含む。好ましくは、パルボウイルスＲｅｐタンパク質の共通アミノ酸配列をコードする第１及び第２のヌクレオチド配列における差は、以下の１つ又は複数によって最大化される（すなわち、ヌクレオチド同一性が最小化される）：ａ）パルボウイルスＲｅｐ共通アミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列のコドンバイアスを変更すること；ｂ）パルボウイルスＲｅｐ共通アミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列のコドンバイアスを変更すること；ｃ）共通アミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列のＧＣ含有量を変更すること；及びｄ）共通アミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列のＧＣ含有量を変更すること。コドン最適化は、コドン使用頻度データベースで見出されるような、本発明の方法で使用される昆虫細胞、好ましくはスポドプテラ・フルジペルダのコドン使用頻度に基づいて実行することができる（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／を参照する）。コドン最適化のための好適なコンピュータプログラムは、当業者に利用可能である（例えば、Ｊａｙａｒａｊら、２００５年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（９）：３０１１～３０１６頁；及びインターネットを参照する）。或いは、最適化は、同じコドン使用頻度データベースを使用して手動で実行することができる。

導入遺伝子
一実施形態では、本発明は、パルボウイルス逆方向末端反復配列に隣接する導入遺伝子を含むヌクレオチド配列が第２の核酸構築物（第１の核酸構築物と異なる）の上に存在する細胞に関する。好ましい実施形態では、パルボウイルス逆方向末端反復配列に隣接する導入遺伝子を含むヌクレオチド配列は、第２の核酸構築物（第１の核酸構築物と異なる）の上に存在する。

本発明との関連で、「少なくとも１つのパルボウイルス逆方向末端反復ヌクレオチド配列」は、「Ａ」、「Ｂ」及び「Ｃ」領域とも呼ばれる大部分相補的な対称的に配置された配列を含むパリンドローム配列を意味すると理解される。ＩＴＲは、複製において「シス」の役割を有する部位、すなわち例えばＲｅｐ７８（又は、Ｒｅｐ６８）などのトランス作用性複製タンパク質のための認識部位である、複製起点として機能し、それはパリンドローム及びパリンドローム内部の特異的配列を認識する。ＩＴＲ配列の対称性の１つの例外は、ＩＴＲの「Ｄ」領域である。それは、特異である（１つのＩＴＲの中に相補体を有しない）。一本鎖ＤＮＡのニッキングは、ＡとＤ領域の間の接合部で起こる。それは、新規のＤＮＡ合成が開始する領域である。Ｄ領域は、通常パリンドロームの片側に位置し、核酸複製ステップに方向性を提供する。哺乳動物細胞内で複製するパルボウイルスは、一般的に２つのＩＴＲ配列を有する。しかし、Ａ領域及びＤ領域の両方の鎖の上の結合部位が対称的に位置し、パリンドロームの各側に１つずつあるようにＩＴＲを工学操作することが可能である。二本鎖環状ＤＮＡ鋳型（例えば、プラスミド）の上では、Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８に助けられた核酸複製は両方向に進行し、環状ベクターのパルボウイルス複製にとって単一のＩＴＲが十分である。したがって、１つのＩＴＲヌクレオチド配列を本発明との関連で使用することができる。しかし、好ましくは、２つ又は別の偶数の通常のＩＴＲが使用される。最も好ましくは、２つのＩＴＲ配列が使用される。好ましいパルボウイルスＩＴＲは、ＡＡＶ ＩＴＲである。より好ましくは、ＡＡＶ２ ＩＴＲが使用される。安全性の理由で、第２のＡＡＶの存在下で細胞への最初の導入の後にさらに増殖することのできない組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを構築することが望ましいかもしれない。レシピエントでの望ましくないベクター増殖を制限するそのような安全性機構は、米国特許出願公開第２００３１４８５０６号に記載されるキメラＩＴＲを有するｒＡＡＶを用いて提供することができる。

本明細書において、配列に別のエレメント（複数可）に隣接することに関する用語「隣接する」は、配列に対して上流及び／又は下流、すなわち５’及び／又は３’に隣接するエレメントのうちの１つ又は複数が存在することを示す。用語「隣接する」は、その配列が必ず連続していることを示すものでない。例えば、導入遺伝子をコードする核酸と隣接するエレメントの間に介在配列があってもよい。２つの他のエレメント（例えばＩＴＲ）が「隣接する」配列は、一方のエレメントが配列の５’に位置し、他方が配列の３’に位置することを示すが、それらの間に介在配列があってもよい。好ましい実施形態では、（ｉｖ）のヌクレオチド配列は、いずれかの側にパルボウイルス逆方向末端反復ヌクレオチド配列が隣接する。

本発明の実施形態では、少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲ配列に隣接する導入遺伝子（目的の遺伝子生成物をコードする）を含むヌクレオチド配列は、好ましくは、昆虫細胞で生成された組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターのゲノムに組み込まれる。好ましくは、導入遺伝子は哺乳動物細胞での発現のための目的の遺伝子生成物をコードする。好ましくは、導入遺伝子を含むヌクレオチド配列は、２つのパルボウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲヌクレオチド配列に隣接し、導入遺伝子は２つのパルボウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲヌクレオチド配列の間に位置する。好ましくは、目的の遺伝子生成物（哺乳動物細胞での発現のための）をコードするヌクレオチド配列は、それが２つの通常のＩＴＲの間に位置するか又は２つのＤ領域で工学操作されたＩＴＲのいずれかの側に位置するならば、昆虫細胞で生成された組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターに組み込まれる。

昆虫細胞で組換えＡＡＶビリオンの生成のために本発明で使用することができるＡＡＶ配列は、任意のＡＡＶ血清型のゲノムから導くことができる。一般的に、ＡＡＶ血清型はアミノ酸及び核酸レベルでかなりの相同性のゲノム配列を有し、遺伝子機能の同一のセットを提供し、本質的に物理的及び機能的に同等であるビリオンを生成し、事実上同一の機構によって複製し、アセンブルする。様々なＡＡＶ血清型のゲノム配列及びゲノム類似性の概要に関しては、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８９７９０；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０１９０１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０４３３０３；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６；Ｃｈｌｏｒｉｎｉら（１９９７年、Ｊ．Ｖｉｒ．７１：６８２３～３３頁）；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら（１９８３年、Ｊ．Ｖｉｒ．４５：５５５～６４頁）；Ｃｈｌｏｒｉｎｉら（１９９９年、Ｊ．Ｖｉｒ．７３：１３０９～１３１９頁）；Ｒｕｔｌｅｄｇｅら（１９９８年、Ｊ．Ｖｉｒ．７２：３０９～３１９頁）；及びＷｕら（２０００年、Ｊ．Ｖｉｒ．７４：８６３５～４７頁）を参照する。ＡＡＶ血清型１、２、３、４及び５は、本発明との関連で使用するためのＡＡＶヌクレオチド配列の好ましいソースである。好ましくは、本発明との関連で使用するためのＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４及び／又はＡＡＶ７に由来する。同様に、Ｒｅｐ（Ｒｅｐ７８／６８及びＲｅｐ５２／４０）コード配列は、好ましくはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４及び／又はＡＡＶ７に由来する。しかし、本発明との関連で使用するためのＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードする配列は、既知の４２血清型のいずれかから、より好ましくはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２若しくはＡＡＶ１３、又は例えばカプシドシャッフリング技術及びＡＡＶカプシドライブラリーによって得られた新規開発のＡＡＶ様粒子から、又は、Ａｎｃ－８０カプシドなどの新たに及び合成的に設計、開発又は発展させたカプシドからとることができる。

ＡＡＶ Ｒｅｐ及びＩＴＲ配列は、特にほとんどの血清型の間で保存されている。様々なＡＡＶ血清型のＲｅｐ７８タンパク質は、例えば８９％を超えて同一であり、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ及びＡＡＶ６の間のゲノムレベルでの全ヌクレオチド配列同一性はおよそ８２％である（Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌら、１９９９年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３（２）：９３９～９４７頁）。さらに、多くのＡＡＶ血清型のＲｅｐ配列及びＩＴＲは、哺乳動物細胞でのＡＡＶ粒子の生成において他の血清型からの対応する配列を効率的に交差相補する（すなわち、機能的に代行する）ことが知られている。米国特許出願公開第２００３１４８５０６号は、ＡＡＶ Ｒｅｐ及びＩＴＲ配列が昆虫細胞で他のＡＡＶ Ｒｅｐ及びＩＴＲ配列も効率的に交差相補することを報告している。

ＶＰタンパク質としても知られるＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオンの細胞向性を決定することが知られている。ＶＰタンパク質コード配列は、異なるＡＡＶ血清型の間でＲｅｐタンパク質及び遺伝子より有意に保存されていない。他の血清型の対応する配列を交差相補するＲｅｐ及びＩＴＲ配列の能力は、ある血清型（例えば、ＡＡＶ３）のカプシドタンパク質並びに別のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ２）のＲｅｐ及び／又はＩＴＲ配列を含む偽型化ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする。そのような偽型化ｒＡＡＶ粒子は、本発明の一部である。

改変された「ＡＡＶ」配列は、本発明との関連で、例えば昆虫細胞でのｒＡＡＶベクターの生成のために使用することもできる。そのような改変された配列は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２又はＡＡＶ１３ＩＴＲと、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれ以上のヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列同一性を有する配列（例えば、約７５～９９％のヌクレオチド配列同一性を有する配列）を含み、Ｒｅｐ又はＶＰを野生型ＡＡＶ ＩＴＲ、Ｒｅｐ又はＶＰ配列の代わりに使用することができる。

多くの点で他のＡＡＶ血清型に類似しているが、ＡＡＶ５は他の公知のヒト及びサルの血清型よりも他のヒト及びサルのＡＡＶ血清型と異なる。それを考慮すると、昆虫細胞ではｒＡＡＶ５の生成は他の血清型の生成と異なるかもしれない。ｒＡＡＶ５を生成するために本発明の方法が用いられる場合、複数の構築物の場合、１つ又は複数の構築物は、ＡＡＶ５ ＩＴＲを含むヌクレオチド配列、ＡＡＶ５ Ｒｅｐコード配列を含むヌクレオチド配列を集合的に含むことが好ましい（すなわち、ヌクレオチド配列はＡＡＶ５ Ｒｅｐ７８を含む）。そのようなＩＴＲ及びＲｅｐ配列は、所望により昆虫細胞でｒＡＡＶ５又は偽型化ｒＡＡＶ５ベクターの効率的な生成を得るように改変することができる。例えば、昆虫細胞でｒＡＡＶ５ベクターの生成を向上させるために、Ｒｅｐ配列の開始コドンを改変することができ、ＶＰスプライス部位を改変若しくは排除することができ、及び／又は、ＶＰ１開始コドン及び近くのヌクレオチドを改変することができる。

一般的に、ＩＴＲを含んでいる目的の遺伝子生成物は、長さが５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）以下である。別の実施形態では、過大なＤＮＡ分子、すなわち長さが５，０００ｎｔを超えるものは、本発明に記載されるＡＡＶベクターを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで発現させることができる。過大なＤＮＡは、５．５ｋｂｐの最大ＡＡＶパッケージング限界を超えるＤＮＡであるとここで理解される。したがって、通常５．０ｋｂより大きなゲノムによってコードされる組換えタンパク質を生成することができるＡＡＶベクターの産生も、実行可能である。

本明細書の上で規定される導入遺伝子を含むヌクレオチド配列は、したがって目的の遺伝子生成物をコードするヌクレオチド配列（哺乳動物細胞での発現のための）又は目的の遺伝子を標的にするヌクレオチド配列（哺乳動物細胞で目的の前記遺伝子を抑制するための）を含むことができ、昆虫細胞で複製する組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターにそれが組み込まれるように位置することができる。本発明との関連で、「目的の遺伝子生成物」を発現させるか又は抑制する特に好ましい哺乳動物細胞はヒト細胞であると理解される。本発明により生成した組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターでトランスフェクトした哺乳動物細胞での後の発現のために、任意のヌクレオチド配列を組み込むことができる。ヌクレオチド配列は例えばタンパク質をコードすることができるか、又はそれはＲＮＡｉ剤、すなわちＲＮＡ干渉が可能であるＲＮＡ分子、例えばｓｈＲＮＡ（短いヘアピンＲＮＡ）又はｓｉＲＮＡ（短い干渉ＲＮＡ）を発現することができる。「ｓｉＲＮＡ」は、哺乳動物細胞で有毒でない短い長さの二本鎖ＲＮＡである小さい干渉ＲＮＡを意味する（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４～９８頁；Ｃａｐｌｅｎら、２００１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：９７４２～４７頁）。好ましい実施形態では、導入遺伝子を含むヌクレオチド配列は２つのコードヌクレオチド配列を含むことができ、各々は哺乳動物細胞での発現のための目的の１つの遺伝子生成物をコードする。目的の生成物をコードする２つのヌクレオチド配列の各々は、昆虫細胞で複製する組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターにそれが組み込まれるように位置する。

哺乳動物細胞での発現のための目的の生成物は、治療的遺伝子生成物であってよい。治療的遺伝子生成物は、標的細胞中で発現されるときに所望の治療効果を提供する、ポリペプチド又はＲＮＡ分子（ｓｉ／ｓｈ／ｍｉＲＮＡ）又は他の遺伝子生成物であってもよい。所望の治療効果は、例えば望ましくない活性（例えばＶＥＧＦ）の除去、遺伝子欠損の相補性、疾患を引き起こす遺伝子の抑制、酵素活性の欠乏の修復、又は任意の他の疾患修飾効果であってよい。治療的ポリペプチド遺伝子生成物の例には、限定されずに、増殖因子、凝固カスケードの一部を形成する因子、酵素、リポタンパク質、サイトカイン、神経栄養因子、ホルモン及び治療的免疫グロブリン及びそのバリアントが含まれる。治療的ＲＮＡ分子生成物の例には、ポリグルタミン疾患、異常脂血症又は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を限定されずに含む疾患を抑制することにおいて有効なｍｉＲＮＡが含まれる。

本発明により生成される組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを使用して治療することができる疾患は、遺伝的原因又は基礎を一般的に有するもの以外、特に限定されない。例えば、開示されるベクターで治療することができる疾患には、限定されずに、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）、加齢性黄斑変性症、アルツハイマー病、関節炎、バッテン病、キャナバン病、１型シトルリン血症、クリグラーナジャー、鬱血性心不全、嚢胞性線維症、デュシェーヌ筋ジストロフィー、脂質異常症、糖原病Ｉ型（ＧＳＤ－Ｉ）、血友病Ａ、血友病Ｂ、遺伝性気腫、ホモ接合の家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）、レーバーの先天性黒内障、メチルマロン酸血症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠乏症（ＯＴＣ）、パーキンソン病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、脊髄筋萎縮症、麻痺、ウィルソン病、てんかん、ポンペ病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、テイ－サックス病、過シュウ酸尿症９ＰＨ－１、１型脊髄小脳失調（ＳＣＡ－１）、ＳＣＡ－３、ｕ－ジストロフィン、ＩＩ型若しくはＩＩＩ型ゴーシェ病、催不整脈性右心室心筋症（ＡＲＶＣ）、ファブリー病、家族性ブルセラ症（ＦＭＦ）、プロピオン酸血症、脆弱Ｘ症候群、レット症候群、ニーマン－ピック病及びクラベ病を含めることができる。発現される治療的遺伝子生成物の例には、Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、アルファ（ＮａＧＬＵ）、Ｔｒｅｇ１６７、Ｔｒｅｇ２８９、ＥＰＯ、ＩＧＦ、ＩＦＮ、ＧＤＮＦ、ＦＯＸＰ３、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子及びインスリンが含まれる。

或いは又はさらに、別の遺伝子生成物として、本明細書の上で規定される導入遺伝子を含むヌクレオチド配列は、細胞形質転換及び発現を調査するための選択マーカータンパク質の役目をするポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含むことができる。この目的のための好適なマーカータンパク質は、例えば、蛍光性タンパク質ＧＦＰ、並びに選択マーカー遺伝子ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＡＴ培地での選択のため）、細菌ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ハイグロマイシンＢでの選択のため）、Ｔｎ５アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（Ｇ４１８での選択のため）、及びジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）（メトトレキセートでの選択のため）、ＣＤ２０、低親和性神経成長因子遺伝子である。これらのマーカー遺伝子を得るためのソース及びそれらの使用方法は、前掲Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌで提供される。さらに、本明細書の上で規定される導入遺伝子を含むヌクレオチド配列は、必要と考えられる場合、本発明の組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターで形質導入した細胞から対象を治癒させることを可能にする、フェイルセーフ機構の役目をすることができるポリペプチドをコードするさらなるヌクレオチド配列を含むことができる。しばしば自殺遺伝子と呼ばれるそのようなヌクレオチド配列は、そのタンパク質が発現されるトランスジェニック細胞を死滅させることが可能である有毒物質にプロドラッグを変換することが可能であるタンパク質をコードする。そのような自殺遺伝子の好適な例には、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ遺伝子、又は単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス及び水痘－帯状疱疹ウイルスからのチミジンキナーゼ遺伝子のうちの１つが含まれ、その場合には、対象でトランスジェニック細胞を死滅させるプロドラッグとしてガンシクロビルを使用することができる（例えばＣｌａｉｒら、１９８７年、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３１：８４４～８４９頁を参照する）。

昆虫細胞での適切な発現のための、例えば野生型パルボウイルス配列を含む本明細書で規定されるヌクレオチド配列の様々な改変は、例えば、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（第３版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ」に記載される周知の遺伝子操作技術の適用によって達成される。コードタンパク質の収量を増加させる可能性のあるコード領域の様々なさらなる改変は、当業者に公知である。これらの改変は、本発明の範囲内にある。

細胞
本発明による細胞は、異種タンパク質の生成に好適である任意の細胞であってよい。好ましくは、細胞は昆虫細胞、より好ましくはバキュロウイルスベクターの複製を可能にし、培養で維持することができる昆虫細胞である。より好ましくは、昆虫細胞はｒＡＡＶベクターを含む組換えパルボウイルスベクターの複製も可能にする。例えば、使用される細胞株は、スポドプテラ・フルジペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞株又はカ細胞株、例えばヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）由来の細胞株からのものであってよい。好ましい昆虫細胞又は細胞株は、例えばＳ２（ＣＲＬ－１９６３、ＡＴＣＣ）、Ｓｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣＲ１、Ｓｆ９、Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２１、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４、ＭＧ－１、Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍ１、Ｈａ２３０２、Ｈｚ２Ｅ５、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）及びｅｘｐｒｅｓＳＦ＋（登録商標）（米国特許第６，１０３，５２６号；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ＣＴ、ＵＳＡ）を含む、バキュロウイルス感染に感受性である昆虫種からの細胞である。本発明による好ましい昆虫細胞は、組換えパルボウイルスベクターの生成のための昆虫細胞である。

当業者は、ヌクレオチド配列を昆虫ゲノムに安定して導入する方法、及びゲノム中のそのようなヌクレオチド配列を有する細胞を同定する方法を認識している。ゲノムへの組込みは、例えば、昆虫ゲノムの領域に高度に相同的であるヌクレオチド配列を含むベクターの使用によって助けることができる。トランスポゾンなどの特異的配列の使用は、ヌクレオチド配列をゲノムに導入する別の方法である。ゲノムへの組込みは、１つ又は複数のステップを通すものであってよい。用語「組み込まれる」への言及は、用語「安定して組み込まれる」も意味することは当業者であれば認識しているであろう。

一実施形態では、第１及び第２の核酸構築物のうちの少なくとも１つが細胞のゲノムに安定して組み込まれている、本発明による細胞が提供される。一実施形態では、第１の核酸構築物が、細胞のゲノムに安定して組み込まれている。代わりの実施形態では、第２の核酸構築物が、細胞のゲノムに安定して組み込まれている。さらなる実施形態では、第１及び第２の核酸構築物が、細胞のゲノムに安定して組み込まれている。

培養における昆虫細胞の成長条件、及び培養の昆虫細胞における異種生成物の生成は当技術分野で周知であり、例えば、昆虫細胞の分子工学に関する上記の引用文献（国際出願２００７／０４６７０３も参照する）に記載される。

「昆虫細胞適合ベクター」又は「ベクター」は、昆虫又は昆虫細胞の増殖性形質転換又はトランスフェクションが可能な核酸分子であることが理解される。例示的な生物学的ベクターには、プラスミド、線状核酸分子及び組換えウイルスが含まれる。それが昆虫細胞に適合する限り、任意のベクターを用いることができる。ベクターは昆虫細胞ゲノムに組み込むことができるが、昆虫細胞におけるベクターの存在は恒久的である必要はなく、一時的エピソームベクターも含まれる。ベクターは、公知の任意の手段、例えば細胞の化学的処理、エレクトロポレーション又は感染によって導入することができる。好ましい実施形態では、ベクターはバキュロウイルス、ウイルスベクター又はプラスミドである。より好ましい実施形態では、ベクターはバキュロウイルスである、すなわち、核酸構築物はバキュロウイルス発現ベクターである。バキュロウイルス発現ベクター及びそれらの使用方法は、例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓ及びＳｍｉｔｈ。１９８６年。Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌ．Ｎｏ．７５５５、Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、Ｔｅｘ．；Ｌｕｃｋｏｗ．１９９１年。出典Ｐｒｏｋｏｐら、Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ’ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、９７～１５２頁；Ｋｉｎｇ、Ｌ．Ａ．及びＲ．Ｄ．Ｐｏｓｓｅｅ、１９９２年、Ｔｈｅ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ、Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ、Ｄ．Ｒ．、Ｌ．Ｋ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ｖ．Ａ．Ｌｕｃｋｏｗ、１９９２年、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ及びＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｃ．Ｄ．、１９９５年、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３９巻；米国特許第４，７４５，０５１号；米国特許出願公開第２００３１４８５０６号；及び国際公開第０３／０７４７１４号に記載される。

組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの生成のために昆虫細胞で用いられる核酸構築物の数は、本発明では制限されない。しかし、好ましい実施形態では、組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの生成のために、２つ以下の核酸構築物が昆虫細胞で用いられる。好ましくは、２つの核酸構築物は、本明細書の上で規定される第１及び第２の核酸構築物である。好ましくは、第１の核酸構築物はＲｅｐ－Ｃａｐ構築物であり、したがってそれは第１、第２及び第３の発現カセットを好ましくは含み、それによって第１及び第２の発現カセットはそれぞれＲｅｐ７８／６８タンパク質及びＲｅｐ５２／４０タンパク質をコードし、第３の発現カセットはＣａｐタンパク質をコードする。第２の核酸構築物はＴｒａｎｓ構築物又はＣａｐ－Ｔｒａｎｓ構築物であり、したがって少なくとも１つのパルボウイルス逆方向末端反復配列に隣接する導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を少なくとも含む。

しかし好ましい（ＤｕｏＤｕｏＢａｃ）実施形態では、第２の核酸構築物は、好ましくはＣａｐタンパク質のための発現カセット、すなわち第４の発現カセットもさらに含む。好ましいＤｏｕＤｕｏＢａｃ実施形態では、第１の核酸構築物は：ｉ）パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたｄＥｌプロモーターを含む第１の発現カセット；ｉｉ）パルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたｐｏｌＨプロモーターを含む第２の発現カセット；並びにｉｉｉ）パルボウイルスＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードする、好ましくはＡＡＶ５ ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたｐｏｌＨプロモーターを含む第３の発現カセットを含み、それによって、より好ましくはＶＰ１開始コドンはＡＣＧである。第２の核酸構築物は、パルボウイルス逆方向末端反復配列に隣接する導入遺伝子、さらにパルボウイルスＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードする、好ましくはＡＡＶ５ ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたｐｏｌＨプロモーターを含む第４の発現カセットを含み、それによってより好ましくは、ＶＰ１開始コドンはＡＣＧである。この実施形態では、第４の発現カセットはしたがって好ましくは第３の発現カセットと同一である。好ましくは、この実施形態では、第２及び第１の核酸構築物は、５：１～１：１０の範囲内のモル比で、好ましくは１：１～１：８の範囲内、より好ましくは１：２～１：６の範囲内、及び最も好ましくは１：３～１：５の範囲内のモル比で、細胞の中に存在し、及び／又はその中にトランスフェクトされる。例えば、第１の核酸構築物はＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ６（配列番号１０）であってよく、第２の核酸構築物はＤｕｏＢａｃ ＣａｐＴｒａｎｓ１（配列番号１２）であってよく、ここで、好ましくは、第１及び第２の構築物は３：１のモル比で存在する。それによって、第２の構築物中の「Ｔｒａｎｓ」は２つのＩＴＲの間の目的の任意の遺伝子であってよいことが理解される。

パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、本明細書において、Ｒｅｐ７８若しくはＲｅｐ６８及び／又はＲｅｐ５２若しくはＲｅｐ４０タンパク質などの昆虫細胞におけるパルボウイルスベクター生成に必要とされ、十分である、非構造Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列であると理解される。パルボウイルスヌクレオチド配列は、好ましくはデペンドウイルスに、より好ましくはヒト又はサルのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に、最も好ましくはヒト（例えば、血清型１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、６、８及び９）又は霊長類（例えば、血清型１及び４）に通常感染するＡＡＶに由来する。パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例は配列番号３３で与えられ、それはＲｅｐタンパク質をコードするＡＡＶ血清型２配列ゲノムの一部を表す。Ｒｅｐ７８コード配列はヌクレオチド１１～１８７６を含み、Ｒｅｐ５２コード配列はヌクレオチド６８３～１８７６を含み、同じく配列番号３３及び１９で別々に表される。Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質の正確な分子量並びに翻訳開始コドンの正確な位置は、異なるパルボウイルスの間で異なることがあると理解される。しかし、当業者であれば、ＡＡＶ－２と別のパルボウイルスからのヌクレオチド配列における対応する位置を同定する方法を認識しているであろう。

好ましくは、本発明の核酸構築物は、昆虫細胞適合ベクターである。「昆虫細胞適合ベクター」又は「ベクター」は、Ｒｅｐ７８若しくはＲｅｐ６８及び／又はＲｅｐ５２若しくはＲｅｐ４０タンパク質などの昆虫細胞におけるパルボウイルスベクター生成に十分であると理解される。パルボウイルスヌクレオチド配列は、好ましくはデペンドウイルスに、より好ましくはヒト又はサルのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に、最も好ましくはヒト（例えば、血清型１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５及び６）又は霊長類（例えば、血清型１及び４）に通常感染するＡＡＶに由来する。パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例は、配列番号３３及び１９で与えられる。

したがって、代わりの実施形態では、細胞は昆虫細胞であり、ここで、第１及び第２の核酸構築物のうちの少なくとも１つは昆虫細胞適合ベクター、好ましくはバキュロウイルスベクターであり、少なくとも１つの発現カセットは少なくとも１つのバキュロウイルスエンハンサーエレメント及び／又は少なくとも１つのエクジソン応答エレメントを含み、好ましいエンハンサーエレメントはｈｒ１、ｈｒ２、ｈｒ２．０９、ｈｒ３、ｈｒ４、ｈｒ４ｂ及びｈｒ５からなる群から選択される。好ましい実施形態では、本発明は、パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードする単一のオープンリーディングフレームを含む１種類以下のヌクレオチド配列を含む昆虫細胞に関する。好ましくは、単一のオープンリーディングフレームはパルボウイルスＲｅｐタンパク質のうちの１つ又は複数をコードし、より好ましくはオープンリーディングフレームはパルボウイルスＲｅｐタンパク質の全てをコードし、最も好ましくは、オープンリーディングフレームは好ましくは少なくともＲｅｐ５２及びＲｅｐ７８タンパク質を昆虫細胞で発現させることができる完全長Ｒｅｐ７８タンパク質をコードする。本明細書において、昆虫細胞は、例えば多コピーエピソームベクターの中に単一タイプのヌクレオチド配列の複数のコピーを含むことができるが、これらは本質的に全く同一の核酸分子、又は少なくとも全く同一のＲｅｐアミノ酸配列をコードする核酸分子、例えば、遺伝子コードの同義性のために互いに異なるだけである核酸分子の複数のコピーであると理解される。パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードする単一タイプの核酸分子だけの存在は、Ｒｅｐ配列を含む異なるタイプのベクターに存在するような、昆虫細胞におけるパルボウイルス生成レベル（の安定性）に影響を及ぼす、欠陥のあるＲｅｐ発現構築物をもたらすかもしれない相同配列の間の組換えを回避する。

方法
さらなる態様では、本発明は細胞で組換えパルボウイルスビリオンを生成する方法であって：
ａ）本明細書で規定される細胞を組換えパルボウイルスビリオンが生成される条件下で培養するステップ；及び
ｂ）組換えパルボウイルスビリオンを回収するステップ
を含む方法を提供する。

回収は、好ましくは、抗ＡＡＶ抗体、好ましくは固定化された抗体を使用した、組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含むビリオンの親和性精製のステップを含む。抗ＡＡＶ抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。特に好適な抗体は、例えばラクダ又はラマから得られるような、単鎖ラクダ抗体又はその断片である（例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、２００１年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７７～３０２頁を参照する）。ｒＡＡＶの親和性精製のための抗体は、好ましくはＡＡＶカプシドタンパク質の上のエピトープに特異的に結合する抗体であり、それによって、好ましくはエピトープは複数のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質の上に存在するエピトープである。例えば、抗体はＡＡＶ２カプシドへの特異的結合に基づいて産生又は選択することができるが、同時に、それはＡＡＶ１、ＡＡＶ３及びＡＡＶ５カプシドに特異的に結合することもできる。

一実施形態では、細胞は昆虫細胞であり、及び／又はパルボウイルスビリオンはＡＡＶビリオンである。

さらなる実施形態では、ステップｂ）の組換えパルボウイルスビリオンの回収は、固定化抗パルボウイルス抗体、好ましくは単鎖ラクダ抗体又はその断片を使用した、ビリオンの親和性精製、及び３０～７０ｎｍの名目孔径を有するフィルターでの濾過のうちの少なくとも１つを含む。

したがって、一実施形態では、本発明は細胞で組換えパルボウイルスビリオンを生成する方法であって：
ａ）本明細書で規定される細胞を組換えパルボウイルスビリオンが生成される条件下で培養するステップ；及び
ｂ）組換えパルボウイルスビリオンを回収するステップ
を含む方法を提供し、ステップｂ）の組換えパルボウイルスビリオンの回収は、固定化抗パルボウイルス抗体、好ましくは単鎖ラクダ抗体若しくはその断片を使用した、ビリオンの親和性精製、又は３０～７０ｎｍの名目孔径を有するフィルターでの濾過のうちの少なくとも１つを含む。

さらなる態様では、本発明は、本発明の上記の方法で生成されるパルボウイルスビリオンのバッチに関する。「パルボウイルスビリオンのバッチ」は、本明細書において、任意選択で昆虫細胞の容器ごとの、同じラウンドの生成で生成される全てのパルボウイルスビリオンと規定される。好ましい実施形態では、本発明のパルボウイルスビリオンのバッチは、前記のような完全ビリオン：全ビリオンの比、及び／又は前記のような完全ビリオン：空の比を含む。

構築物とキット
さらなる態様では、本発明は本明細書で規定される第１の核酸構築物を提供する。一実施形態では、本明細書で規定される第２の核酸構築物が提供される。

さらなる態様では、本発明は、少なくとも本明細書で規定される第１の核酸構築物及び本明細書で規定される第２の核酸構築物を含むパーツのキット（ｋｉｔ ｏｆ ｐａｒｔｓ）を提供する。キットは、昆虫細胞及び／又は本明細書で規定されるヌクレオチド配列及び／又は昆虫細胞での発現のためのバキュロウイルスヘルパー機能をコードする核酸配列をさらに含むことができる。

発明の利点
本発明の発明者らは、誘導性プラスミドベクター（パルボウイルスレプリカーゼタンパク質を発現する）設計を２つの方法でさらに最適化した。

第１に、ＡＡＶ遺伝子発現の調節における代わりのバキュロウイルスプロモーターの使用を調査することによる。これまで、ＢＥＶ設定で、多面体プロモーター（ｐｏｌＨ）がＡＡＶ生成において最も研究されたプロモーターである（ｖａｎ Ｏｅｒｓ、Ｍ．Ｍ．ら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２０１５年１月；９６（Ｐｔ １）：６～２３頁）。ｐ１０などの代わりの後期プロモーターが宿主因子をｐｏｌＨと共有することが報告されているが（Ｇｈｏｓｈ、Ｓ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９８年９月；７２（９）：７４８４～９３頁）、他のバキュロウイルスプロモーターは異なる誘導強度及び時間的プロファイルを示すことが報告されている（Ｄｏｎｇ、Ｚ．Ｑ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｅｎｇ．２０１８年１２月４日；１２：３０；Ｌｉｎ、Ｃ．Ｈ及びＪａｒｖｉｓ、Ｄ．Ｌ．、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３年５月１０日；１６５（１）：１１～７頁；Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｓｏｌｉｓ、Ｍ．ら、ＰｅｅｒＪ．、２０１６年１月２８日；４：ｅ２１８３）。それにもかかわらず、昆虫細胞でのＡＡＶ生成のためのそれらの潜在的有用性は、これまで全く報告されていない。

第２に、宿主細胞に非常に毒性であるＡＡＶ Ｒｅｐの発現のよりタイトな調節もこの研究で探られる。バキュロウイルス相同領域（ｈｒ）２又はｈｒ２．０９エンハンサー配列のｐｏｌＨと組み合わせた使用が、誘導性ＯｎｅＢａｃプラットホームのためのデフォルト分子設計になっている（Ａｓｌａｎｉｄｉ、Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００９年３月３１日；１０６（１３）：５０５９～６４頁）。ここで、我々は、ＯｎｅＢａｃプラットホーム、特にＯｎｅＢａｃ Ｃａｐ Ｔｒａｎｓをグレードアップする目的で、他のバキュロウイルスｈｒと組み合わせた代わりのバキュロウイルスプロモーターの潜在的有用性を検査した。異なるバキュロウイルスプロモーター及びエンハンサーを異なる分子配座でも調査することによって、高い力価の高品質のＡＡＶバッチを与える、安定した頑強なＡＡＶ生成プラットホームを最終的にもたらすことができる、ＡＡＶ遺伝子（Ｃａｐ、Ｒｅｐ）の発現を最適化することを目指す。

本発明は、したがって、野生型（ｗｔ）の単一の又は分割されたカセットのＡＡＶ Ｒｅｐ又は他のＡＡＶ遺伝子発現を調節する誘導性発現構築物を形成するために、類似の又は異なる発現強度及び時間的プロファイルを有する代わりの及び非保存的バキュロウイルスプロモーター（ｐ１０、３９ｋ、ｐ６．９、ｐＳｅｌ１２０）の使用を提供する。これは、組換えバキュロウイルスのトランス活性化の後のシス：トランスプロモーター競合が起こりにくいという利点を有する、誘導性プラスミドベクター構築物の生成を可能にする。さらに、本発明によって提供される新規の非ｈｒ２－０．９バキュロウイルスｈｒエンハンサーは、非誘導条件下で漏出性がより低く、それによって、誘導性プラスミドベクター構築物からの毒性Ｒｅｐタンパク質のよりタイトな調節の利点を提供する。

本発明の追加の利益には、ＯｎｅＢａｃ及び昆虫細胞プラットホームに対して向上したＡＡＶ生成収量及び品質；より生存能力のある安定したＡＡＶパッケージング細胞を可能にする、スイッチが「オフ」のときにＲｅｐなどの有害なＡＡＶ遺伝子の発現がない、誘導性プロモーターの生成；及び分割カセットＲｅｐ ＡＡＶ設計の誘導性プラスミドベクターへの適応が含まれる。

示した実施例で、発明者は、生成物の品質及びベクター収量に及ぼす二重発現カセット（例えば、Ｂａｃ．Ｃａｐ－ＲｅｐとＢａｃ．Ｃａｐ－Ｔｒａｎｓ又はＢａｃ．Ｃａｐ－ＲｅｐとＢａｃ．Ｔｒａｎｓ）の使用の影響を検討することを目指す。実施例１で、発明者はｗｔＡＡＶ５及びＡＡＶ２／５の収量及び生成物品質に及ぼす二重Ｒｅｐ－Ｃａｐカセットの分子最適化の影響を特徴付ける。実施例２で、発明者は最適化されたｗｔＡＡＶ５ Ｃａｐ－Ｒｅｐ及び導入遺伝子バキュロウイルス（ＤｕｏＢａｃ）でｗｔＡＡＶ５を生成し、それを三重感染で生成されたｗｔＡＡＶ５に対して比較する。実施例３で、発明者はＤｕｏＢａｃ収量をより大きな生成規模対三重Ｂａｃ系に外挿する。最後に、実施例４で、発明者は、品質及びベクター収量に及ぼすＣａｐ－Ｔｒａｎｓ及びＣａｐ－Ｒｅｐ二重バキュロウイルス（ＤｕｏＤｕｏＢａｃ）の様々な組合せの使用の影響を検査し、これらを三重感染ｗｔＡＡＶ５生成と比較する。

方法及び材料
発現カセット
簡潔には、Ｃａｐ－Ｒｅｐ ＤｕｏＢａｃ構築物（ＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ１～７）は、ポリヘドリン（ＰｏｌＨ）又はＰ１０プロモーターの制御下のＣａｐカセット（ｗｔＡＡＶ５又はＡＡＶ２／５）及びＲｅｐカセットの組合せを含む。ここでは、Ｒｅｐカセットは、ＰｏｌＨ及びｄＩＥ１プロモーターによってそれぞれ制御されるＲｅｐ５２及びＲｅｐ７８によるスプリットデザインである。ＤｕｏＢａｃ ＣａｐＴｒａｎｓ１は、ＰｏｌＨプロモーターの制御下のｗｔＡＡＶ５ ＣａｐカセットをＢａｃＴｒａｎｓ４導入遺伝子カセットと組み合わせる。ＤｕｏＢａｃ及びＴｒｉｐｌｅＢａｃ ＡＡＶ生成のために、単一の発現カセット構築物も必要だった。これらの構築物は常に同じに保たれ、ＢａｃＣａｐ１又はＢａｃＣａｐ２、（ｗｔＡＡＶ５）、及びＢａｃＲｅｐ１、スプリットＲｅｐカセットである。図２は、カセットデザインで使用された配向を要約し、表１Ａ及び１Ｂは構築物ごとに使用された異なるプロモーター／開始コドン組合せを要約する。

細胞培養及びバキュロウイルス増幅
ＥｘｐｒｅｓＳＦ＋昆虫細胞を、２８℃で１３５ＲＰＭの振盪フラスコの中のＳＦ－９００ＩＩ ＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）で維持した。各実施例の生成のために、新鮮なバキュロウイルスを産生した。ここでは、ＥｘｐｒｅｓＳＦ＋細胞は、昆虫細胞１ｍｌにつき保存株３μｌの濃度の冷凍バキュロウイルス保存株で接種した。感染の開始の７２時間後に、１９００ｘｇで１５分間細胞を遠心分離し、細胞上清を保存することによって新鮮なバキュロウイルスを採取した。

ＡＡＶの生成及び精製
ＡＡＶ材料は、ｅｘｐｒｅｓＳＦ＋昆虫細胞を容積測定に基づいて二重発現カセット（Ｃａｐ－Ｒｅｐ及びＣａｐ－Ｔｒａｎｓ）若しくは単一の発現カセット（Ｃａｐ、Ｒｅｐ、Ｔｒａｎｓ）を含む新たに増幅させた組換えバキュロウイルスの様々な組合せ、又は二重発現（Ｃａｐ－Ｒｅｐ）及び単一の（Ｔｒａｎｓ）発現カセットの組合せと同時感染させることによって産生した。正確な比は、実施例に記載される。２８℃で７２時間のインキュベーションの後、細胞を溶解緩衝液（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍトリス－ＨＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１％Ｔｒｉｔｏｎ ｘ－１００、ｐＨ＝８．５）で１時間溶解した。次に、ゲノムＤＮＡを３７℃で１時間ベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ）で消化し、その後細胞デブリを１５分間の１９００ｘｇでペレットにした（未精製溶解物試料）。精製の開始まで、上清を４℃で保存した。次に、ＡＶＢセファロース（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるバッチ結合によって、ＡＡＶを未精製の溶解したバルク（ＣＬＢ）から精製した。簡潔には、ＡＶＢセファロース樹脂を０．２Ｍ ＨＰＯ_４ ｐＨ＝７．５緩衝液で洗浄し、その後透明にした未精製溶解物を樹脂に加え、８５ｒｐｍでのインキュベーター振盪の中で室温（ＲＴ）で２時間インキュベートした。樹脂を０．２Ｍ ＨＰＯ_４ ｐＨ＝７．５緩衝液で再び洗浄した。次に、結合したウイルスは、０．２ＭグリシンｐＨ＝２．５の添加により樹脂から溶出させた。溶出したウイルスのｐＨは、０．５Ｍトリス－ＨＣｌ ｐＨ＝８．５の添加によって直ちに中和し、さらなる使用まで－２０℃で保存した。

Ｑ－ＰＣＲによる滴定及びＡ２６０／Ａ２８０又はＨＰＬＣによる全体／完全の比の測定
未精製溶解物及び精製されたＡＡＶバッチのウイルス力価は、Ｑ－ＰＣＲによって決定した。Ｑ－ＰＣＲは、導入遺伝子のプロモーター領域に特異的なプライマーで実行した。Ｑ－ＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００迅速Ｑ－ＰＣＲシステムで実行した。精製されたＡＡＶバッチの全体／完全の比は、ＵＶ／可視光吸光分光分析によって測定した。１μｌの１０％ＳＤＳを１００μｌの精製ＡＡＶと混合し、７５℃で１０分間インキュベートした。熱処理の後、２６０及び２８０ｎｍでの吸光度をＮａｎｏｄｒｏｐで測定した。Ｓｏｍｍｅｒら２００３年によって記載される計算を使用して、ＡＡＶ材料の全体／完全の比を計算した。或いは、全粒子をＨＰＬＣによって測定した。ここでは、精製されたＡＡＶ材料はサイズ排除カラムにロードされる。カプシドピークの曲線下面積を積分することを通して、全粒子を決定する。その後、全粒子をＱ－ＰＣＲによって測定されたウイルス力価で割ることによって、全体／完全の比を計算する。

精製されたＡＡＶバッチの全タンパク質ゲル
精製されたＡＡＶバッチは、９５℃で５分間加熱した、１０％β－メルカプトエタノール（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を補った４×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Ｂｉｏｒａｄ）で希釈し、４～２０％ミニＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸステインフリーゲル（Ｂｉｏｒａｄ）にロードした。ＴＧＳ緩衝液（Ｂｉｏｒａｄ）中での２００ボルトでの３５分間の電気泳動の後、ゲルを紫外線の下に５分間曝露させ、Ｃｈｅｍｉｄｏｃタッチ撮影装置（Ｂｉｏｒａｄ）でバンドを可視化することによって、ゲル染色を発色させた。

ＨｅｌａＲＣ３２での感染性アッセイ
単一の感染性粒子に必要とされるゲノムコピー数（ｇｃ／ｉｐ）は、限界希釈をベースとした感染力価アッセイで決定した。簡潔には、ＡＡＶ由来のＲｅｐ及びＣａｐタンパク質を安定して発現するＨｅｌａＲＣ３２（ＡＴＣＣ）細胞は、１０反復でＡＡＶ希釈系列で形質導入し、５０のｗｔＡｄ５：ＨｅＬａＲＣ３２ ＭＯＩのＷＴアデノウイルス５（ｗｔＡｄ５）の有る無しで感染させた。プレートは３７℃で４８時間インキュベートし、ベクターゲノム特異的プライマープローブセットを使用したＱ－ＰＣＲによって、ウェルをベクターゲノムＤＮＡの有無について調査した。播種されたベクターゲノムあたりの感染性粒子の数は、Ｓｐｅａｒｍａｎ－Ｋａｒｂｅｒ法［５］により計算した。

ゲノムＡＡＶ ＤＮＡを用いたホルムアルデヒドゲル電気泳動
ゲノムＡＡＶ ＤＮＡを精製ＡＡＶバッチからＰＣＲ精製ヌクレオスピンキット（Ｍａｃｈｅｒｙ Ｎａｇｅｌ）を用いて単離した。電気泳動ランの前に、５００ｎｇのＡＡＶゲノムＤＮＡを、ホルムアルデヒドローディング緩衝液（１ｍｌの２０×ＭＯＰＳ、３．６ｍｌの３７％ホルムアルデヒド、６７％スクロース中の２ｍｌの５ｍｇ／ｍｌのＯｒａｎｇｅ Ｇ、ＭＱで１０ｍｌにした）の中で９５℃で１０分間変性させ、直ちに氷上に置いた。次に試料を６．６％ホルムアルデヒドを補充した１ｘＭＯＰＳ（４０ｍＭ ＭＯＰＳ、１０ｍＭ ＮａＡｃ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝８．０）で作成した１％アガロースゲル上で実行した。次に試料を２時間、１００ボルト、６．６％ホルムアルデヒドランニング緩衝剤を補充した１ｘＭＯＰＳ中で泳動した。泳動後、ＤＮＡをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて染色し、バンドをケミドックタッチイメージャー（Ｂｉｏｒａｄ）で視覚化した。

実験計画（ＤｏＥ）法
ＤｕｏＢａｃ及びＴｒｉｐｌｅＢａｃ系の全体：完全の比に及ぼす上流バイオプロセス分散の影響を研究するために、２つの研究を実験計画（ＤｏＥ）法及び分析にかけた。２つの研究はわずかに異なる方法を使用して実行したが、両方の場合において実験分散を振盪フラスコに導入し、同等の方法を使用してＡＡＶ精製を実行した。さらに、両方の研究のために、各実験条件のために２種類の分析を精製試料で実行した：ベクターゲノムコピー数（ｇｃ）を決定するためにｑＰＣＲを使用し、含有量に関係なく粒子の総量を決定するためにＳＥＣ－ＨＰＬＣを使用した。ゲノムコピーを含有する完全カプシドに対する全ＡＡＶカプシドの割合を表す、全体：完全の比を計算するために、これらの２つの測定基準をその後使用した。両試験の間の差は、２つの以降のセクションに記載される。

ＤｏＥ ＤｕｏＢａｃ系：設計空間及び実験プラットホーム
表２に掲載されるように中心複合計画（ＣＣＤ）により、Ｓｆ＋細胞のＤｕｏＢａｃ媒介形質導入の間に実験分散を導入した。これは、３反復中点で合計１７の実験条件（「生成培養」）を与えた。

増幅されたバキュロウイルス及び種細胞は、揺動運動バイオリアクター（ＢｉｏＷａｖｅ ＰＵ－Ｂｉｏｓｔａｔ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して１０Ｌウェーブバッグ（Ｆｌｅｘｓａｆｅ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）の中で産生した。この試験全体で使用した培地は、Ｓｆ９００ ＩＩ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）であった。全てのインキュベーションの設定は以下の通りであったＴ＝２８℃；２５ｒｐｍ及び８°の角度で撹拌；ＤＯ＝５０％；及び０．２Ｌ／分の気流速度。細胞の増幅のために１つの専用のバイオリアクターを５Ｌの作業容量、及び１．２×１０^６ＶＣ／ｍＬ（リアクターＡ）の初期ＶＣＤで使用した。リアクターＡの接種から１８．５時間後に、２つのバイオリアクターを０．８×１０^６ＶＣ／ｍＬの濃度及び５．２５Ｌ（リアクターＢ及びＣ）の作業容量で接種した。バキュロウイルスＢａｃＴｒａｎｓ５及びＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ３の別々の増幅のために、細胞接種の１８時間後に１５．７５ｍＬのバキュロウイルス作業種ウイルス（ＷＳＶ）をリアクターＢ及びＣに加えた。追加の４８時間のインキュベーション後に、全てのリアクターを採取した。生じた材料（細胞及びバキュロウイルス）は、ＡＡＶ生成培養を調製するために使用した。

生成培養のために、ＴＯＩ時のＶＣＤ及び培地組成を制御する形質導入の前に、新鮮培地交換ステップを実行した。この培地交換は３００ｇでの各種培養の弱い遠心分離を含み、上清を廃棄し、新鮮培地に細胞を再懸濁してＴＯＩ時の目標ＶＣＤを達成した。生成培養組成は、表２の規定により実行した。

７０時間後に、形質導入は、溶解（１０×溶解緩衝液の１０ｖ／ｖ％の添加、３７℃及び１３５ｒｐｍでの６０分間のインキュベーション）、ベンゾナーゼ処理（１ｍＬにつき１０単位のベンゾナーゼの添加、３７℃及び１３５ｒｐｍでの６０分間のインキュベーション）、清澄化（室温及び４１００ｇでの１５分間の遠心分離）及び濾過（真空下の０．２２μｍボトルトップフィルターによる濾過）の連続ステップによって終了した。偶発のウイルス不活性化のために、濾液を室温で１２時間インキュベートした。（１）０．２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．５中での（１：１の容量比）ＡＶＢセファロースＨＰ樹脂の調製；（２）２５０μＬの樹脂懸濁液の４０ｍＬの濾液への添加及び４０ｒｐｍで４時間のインキュベーション；（３）４１００ｇで５分間の樹脂の遠心分離；（４）０．２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．５によるペレットの洗浄；（５）４分間のインキュベーションの間の５００μＬの０．５Ｍグリシン／ＨＣｌ ｐＨ２．５を使用したペレットの抽出；（６）ベンチトップ遠心分離を使用した使用済みペレットの遠心分離；（７）２００μＬのトリス／ＨＣｌ ｐＨ８．５緩衝液を使用した上清の中和；及び（８）０．２２μｍ ＰＶＤＦシリンジフィルターによる中和された溶出液の濾過を含むバッチ結合親和性クロマトグラフィープロトコールを使用して、残りの濾液を精製した。精製された材料は、全体：完全の比を決定するためにｑＰＣＲ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析のために使用した。

結果
実施例１：ｗｔＡＡＶ５及びＡＡＶ２／５ Ｃａｐ－Ｒｅｐ ＤｕｏＢａｃ構築物の特徴付け
昆虫細胞でのＡＡＶ生成は、Ｒｅｐ、Ｃａｐ及びＴｒａｎｓカセットを含む３つのバキュロウイルスを同時感染させることによって一般的に実行される。全ての３つの成分が同時に細胞中に存在する統計的可能性を向上させるために、Ｃａｐ及びＲｅｐ発現カセットを単一のバキュロウイルスに移動させた（図１）。二重感染設定で生成されるｗｔＡＡＶ５及びＡＡＶ２／５の品質及び量を向上させることができるかどうか調査するために、発明者は単一のＲｅｐ発現カセットをスプリットＲｅｐ発現カセットに換え、Ｃａｐのプロモーター／ＶＰ１開始コドン組合せを最適化した。スプリットＲｅｐカセットの導入は、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ７８のタイミング及び発現強度へのより優れた制御を与えることができる。さらに、カプシドのＶＰ１２３比の最適化は、感染性ＡＡＶの生成のために必須である。

構築物ＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ１～７（表１Ａ及び図１）は、ｗｔＡＡＶ５及びＡＡＶ２／５ Ｃａｐの発現を最適化して、それらをスプリットＲｅｐカセットから発現されるＲｅｐとバランスさせるように設計した。これらの変化のＡＡＶベクター収量及び品質に及ぼす影響を調査するために、ＤｕｏＢａｃ生成を治療関連の導入遺伝子（ＢａｃＴｒａｎｓ４）で実行した。ＡＡＶは、５％の新たに増幅したＣａｐ－Ｒｅｐバキュロウイルス及び１％の新たに増幅した導入遺伝子バキュロウイルスを有するｅｘｐｒｅｓＳＦ＋昆虫細胞（５０ｍｌ）で生成した。生成の後、ウイルスを精製し、生じたＡＡＶ材料でいくつかのアッセイを実行した。ウイルス力価（Ｑ－ＰＣＲによる）は、未精製溶解物で決定した。全体／完全の比（ＨＰＬＣ／Ｑ－ＰＣＲによる）及びカプシド化学量（ＳＤＳ－Ｐａｇｅゲルによる）は、精製されたＡＡＶで決定した。１感染性粒子に必要とされるゲノムコピー数（ｇｃ／ＩＰ）は、ＨｅｌａＲＣ３２細胞における感染性アッセイで決定した。

図３は、ｗｔＡＡＶ５及びＡＡＶ２／５ ＤｕｏＢａｃ生成の未精製溶解物で測定したウイルス力価を要約する。高いウイルスの収量（＞１ｅ１１ ｇｃ／ｍｌ）は構築物ＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ２、５及び７で得られ、比較的低い収量は構築物ＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ１及び６で観察された。精製されたウイルスバッチの全体／完全の比は、全粒子／ｍｌ（ＨＰＬＣで決定した）をゲノムコピー／ｍｌ（Ｑ－ＰＣＲで決定した）で割ることによって決定された。一般的に、全てのＤｕｏＢａｃ構築物で低い全体／完全の比（＜２．０）が観察された（図４）。この観察は、通常５を越える、ＴｒｉｐｌｅＢａｃ ＡＡＶ生成で通常観察される全体／完全の比とかなり対照的である（実施例２を参照する）。精製されたＡＡＶのカプシド化学量は、ＳＤＳ－Ｐａｇｅゲル電気泳動によって決定された（図５、ＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ６のカプシド化学量は低いウイルス収量のために決定できなかった）。カプシド化学量は、どのＤｕｏＢａｃ構築物が使用されたかによってかなりの影響を受けた。ＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ３及び７は１：１：１０の正しいカプシド化学量を提示するが、ＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ２、４及び５は最適以下のカプシド化学量を提示する（ＤｕｏＢａｃＣａｐＲｅｐ２、４及び５では低いＶＰ１、又はＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ１の場合は非常に高いＶＰ１）。これらの変化がＡＡＶ感染性に及ぼす可能性のある影響は、ＨｅｌａＲＣ３２における限界希釈感染性アッセイによって決定された（図６）。ＡＡＶ感染性の結果は、カプシド化学量の結果を映した。ここでは、ＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ１、３及び６は、カプシドにおける正常であるか又は高いＶＰ１のために高い感染性（低いｇｃ／ｉｐ）を示した。一方、ＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ２、４及び５（高いｇｃ／ｉｐ）はカプシドにおける低い量のＶＰ１のために低減された感染性を示した。表３は、これらの実験からのデータを要約する。

これらの結果から、プロモーター競合はｗｔＡＡＶ５ ＤｕｏＢａｃ構築物のウイルス力価にかなりの影響を及ぼす（ｗｔＡＡＶ５、ＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ１及び６の場合ＰｏｌＨ Ｒｅｐ＋ＰｏｌＨ Ｃａｐ＝低い力価）が、ＡＡＶ２／５にはより少ない（ＡＡＶ２／５、ＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ３の場合ＰｏｌＨ Ｒｅｐ＋ＰｏｌＨ Ｃａｐ＝高い力価）ようである。ｗｔＡＡＶ５カセットの前にＰ１０プロモーターを導入することは力価（ＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ２）を向上させるが、最適以下のＶＰ１２３化学量をもたらす。ＶＰ１の前により強力な開始コドンを導入すること（二重ＡＴＧ）はＶＰ１２３化学量をレスキューし、高い力価（ＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ７）をもたらす。これはＣａｐＶＰ１のためのプロモータータイプ及び開始強度のバランスをとることが、正しいＡＡＶカプシド化学量で高い力価を生成するために必須であることを示す。さらに、同じバキュロウイルスでＲｅｐ及びＣａｐを組み合わせることによって、プロセスの複雑性が低減される。ＡＡＶ遺伝子のこの組合せは、全体／完全の比の明白な向上にさらにつながった。ＤｕｏＢａｃ ＡＡＶ生成がどのようにＴｒｉｐｌｅＢａｃ ＡＡＶ生成に匹敵するかは、実施例２で調べられる。

実施例２：ＡＡＶ５ ＤｕｏＢａｃ（Ｂａｃ．Ｃａｐ－Ｒｅｐ及びＢａｃ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）及び三重Ｂａｃ（Ｂａｃ．Ｃａｐ、Ｂａｃ．Ｒｅｐ Ｂａｃ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）ＡＡＶ生成の比較。

前の実施例は、同じバキュロウイルスの上でＣａｐ及びＲｅｐカセットを組み合わせ、Ｃａｐカセットを分子的に最適化することによって、向上したＡＡＶ生成物を生成することができることを示した。この実施例は、ＤｕｏＢａｃ及びＴｒｉｐｌｅＢａｃプロセスによって生成されたＡＡＶを比較する。２つの生成系ＤｕｏＢａｃ（ＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ７：Ｃａｐ ｗｔＡＡＶ５－Ｒｅｐ）を比較するために、生成をベクター収量及び品質に関してＴｒｉｐｌｅＢａｃ ＡＡＶ生成（ＢａｃＣａｐ１ ｗｔＡＡＶ５、ＢａｃＲｅｐ１）と比較した。レポーター及び２つの治療関連の導入遺伝子を、ＡＡＶ生成（ＢａｃＴｒａｎｓ１、３及び４）で使用した。ＡＡＶ生成を実行するために、ｅｘｐｒｅｓＳＦ＋昆虫細胞（５０ｍｌ又は２．５Ｌ）を新たに増幅されたバキュロウイルス保存株の複数の容量比で接種した。接種量は、培養量の１～５％の範囲であった。生成の後、ウイルスを精製し、いくつかのアッセイをその材料で実行した。ウイルス力価（Ｑ－ＰＣＲによりｇｃ／ｍｌで表す）は、未精製溶解物及び精製ＡＡＶで決定した。全体／完全の比（Ａ２６０／Ａ２８０による）及びＶＰ１２３比（ＳＤＳ－Ｐａｇｅゲルによる）は、精製されたＡＡＶ材料で決定した。

表４は５０ｍｌの生成結果を要約し、表５は２．５Ｌの生成結果を要約する。５０ｍｌ及び２．５Ｌスケールの両方で、ＤｕｏＢａｃ生成はウイルス収量及び全体／完全の比の両方でＴｒｉｐｌｅＢａｃ生成に優る。生成のために使用した接種量又は導入遺伝子によって、ＣＬＢにおける力価（ｇｃ／ｍｌ）は、同等のＴｒｉｐｌｅＢａｃ生成と比較してＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ７で４～１０倍向上した。生成から精製された全ゲノムコピーは、類似の倍率で増加した。興味深いことに、全体／完全の比もＤｕｏＢａｃプロセスで向上した。ここでは、使用した導入遺伝子はこのパラメータが向上させる量に影響するようであるが、全体／完全の比はＤｕｏＢａｃ生成において一貫して向上した（生成のために使用した導入遺伝子カセットによって概ね２～８倍）。ＶＰ１２３カプシドタンパク質の発現はＤｕｏＢａｃとＴｒｉｐｌｅＢａｃ ＡＡＶ生成の間で同一で（図７）、１：１：１０の理想的な化学量を維持していた。

同じバキュロウイルスの上でＣａｐ及びＲｅｐ発現カセットを組み合わせることによってプロセスの複雑性を低減することは、収量及び全体／完全の比の明白な向上をもたらした（図８）が、ＡＡＶの理想的なＶＰタンパク質化学量は維持された。ここでは調査されないが、３つから２つの変数への低減のために、プロセスの頑健性（バッチ間の変動）をＤｕｏＢａｃプロセスで向上させることができそうである。

実施例３：ＤｕｏＤｕｏＢａｃ（Ｂａｃ．Ｃａｐ－Ｒｅｐ及びＢａｃ．Ｃａｐ－Ｔｒａｎｓ）のＴｒｉｐｌｅＢａｃ ＡＡＶ（Ｂａｃ．Ｃａｐ、Ｂａｃ．Ｒｅｐ Ｂａｃ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）との比較
以前の研究は、ＴｒｉｐｌｅＢａｃ ＡＡＶ生成のＣａｐ：Ｒｅｐバキュロウイルス接種比が、ＡＡＶ生成の全体／完全の比及び力価収量に直接的な影響を及ぼすことを示した。ここでは、Ｒｅｐバキュロウイルス接種の増加は、カプシド生成及び全体／完全の比の低減をもたらした。対照的に、Ｃａｐバキュロウイルス接種比の増加は、全体／完全の比及び収量を増加させた。Ｒｅｐ及び導入遺伝子バキュロウイルスの両方にＣａｐカセットを導入し、それによって二重ＤｕｏＢａｃプロセス又はＤｕｏＤｕｏＢａｃプロセス（図１）を形成することによって、我々は、ＡＡＶ生成の間に細胞におけるＣａｐ：Ｒｅｐ比を制御するより多くの自由を有する。さらに、それは、我々がＴｒｉｐｌｅＢａｃ ＡＡＶプロセスで達成するのが不可能である（ＡＡＶ生成を阻害する高過ぎる接種量のために）Ｃａｐ：Ｒｅｐ生成比（特に高いＣａｐ比）を探ることを可能にするだろう。

この実施例では、昆虫細胞感染の間にＣａｐ：Ｒｅｐ比を変更することがＡＡＶ品質及び収量に及ぼす影響を調査することを目指しており、これはＤｕｏＢａｃ ＣａｐＴｒａｎｓ１のＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ６に対する接種比を変えることによって達成された。ＤｕｏＤｕｏＢａｃ ＡＡＶ生成は、ＴｒｉｐｌｅＢａｃ ＡＡＶ生成と比較された。ＡＡＶ生成は、５０ｍｌスケールでｅｘｐｒｅｓＳＦ＋昆虫細胞で実行した。接種量は、各バキュロウイルスで培養量の１～５％の範囲であった。生成の後、ウイルスをＡＶＢセファロースで精製した。ウイルス力価（Ｑ－ＰＣＲにより決定されたｇｃ／ｍｌ）は、未精製溶解物及び精製ＡＡＶで測定した。全体／完全の比（Ａ２６０／Ａ２８０による）及びカプシド組成（ＳＤＳ－Ｐａｇｅゲルによる）は、精製されたＡＡＶで決定した。さらに、ＡＡＶ粒子にパッケージされたゲノムＤＮＡは、ホルムアルデヒドゲル電気泳動によっても調査された。

表６は、ＤｕｏＤｕｏＢａｃ及びＴｒｉｐｌｅＢａｃ ＡＡＶ生成の結果を要約する。ＤｕｏＤｕｏＢａｃ生成のために、それは使用した接種条件、並びにＴｒｉｐｌｅＢａｃ ＡＡＶ生成で類似の比を達成するために必要とされるだろう同等の接種条件を掲載する。試験したＤｕｏＤｕｏＢａｃ ＡＡＶ生成の全てで、未精製溶解物でのベクター収量は、試験したＴｒｉｐｌｅＢａｃ生成の６～７ｅ＋１１と比較して７ｅ＋１１～１．４ｅ＋１２ｇｃ／ｍｌに低下し、これは最良のＤｕｏＤｕｏＢａｃ条件で２倍の力価上昇が観察されることを意味する。全てのＤｕｏＤｕｏＢａｃ生成の全体／完全の比は、ＴｒｉｐｌｅＢａｃ生成と比較して低減した。ＤｕｏＤｕｏＢａｃ生成を比較した場合、より多くのＲｅｐが存在したときにより低い全体／完全の比が一般的に観察され、より高い全体／完全の比はＣａｐの増加に関連付けされた。試験した最良の条件は、１：３のＤｕｏＢａｃ ＣａｐＴｒａｎｓ１のＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ６共感染に対する比であって、それは約１．５の全体／完全の比で、１．２ｅ＋１２ｇｃ／ｍｌのＣＬＢにおける平均力価をもたらした。その最も接近したＴｒｉｐｌｅＢａｃ同等物（５：５：１の比）と比較して、力価は２倍（１．２ｅ＋１２対６ｅ＋１１）向上し、全体／完全の比は概ね４倍（１．５対６）向上した。ＤｕｏＤｕｏＢａｃとＴｒｉｐｌｅＢａｃ生成の間でカプシドタンパク質ＶＰ－１、－２及び－３の発現を比較した場合、１：１：１０の類似した化学量が試験した全ての条件で観察された（図９）。これは、Ｒｅｐ及び導入遺伝子バキュロウイルスにＣａｐカセットを導入することが最適比を変更せず、それを１：１：１０に維持したことを示した。さらに、ＡＡＶ粒子にパッケージされたゲノムＤＮＡは、ＤｕｏＤｕｏＢａｃとＴｒｉｐｌｅＢａｃ生成の間で類似していた（図１０）。両方の生成から単離されたゲノムＡＡＶ ＤＮＡは、ホルムアルデヒドゲルで同一のバンドパターンをもたらした。主なバンドは長さが２．４ｋｂであり、ＢａｃＴｒａｎｓ４導入遺伝子の単一のコピーを表す。

要約すると、ＤｕｏＤｕｏＢａｃプロセスは、ＴｒｉｐｌｅＢａｃと比較してＢａｃ．Ｃａｐ－ＲｅｐのＢａｃ．Ｃａｐ－Ｔｒａｎｓに対する広範囲の接種比を使用して、向上したベクター収量及び完全対全体の比をもたらす。ＡＡＶ生成の間に生成細胞におけるＣａｐ：Ｒｅｐ比を変更する自由の増加は（２つのＣａｐ発現カセットの存在及び感染のために使用したバキュロウイルスの種の数の低減のため）、生成されるＡＡＶの全体／完全の比の舵取り及び最適化を可能にする。我々は、Ｒｅｐの増加はわずかに低い収量及び全体／完全の比をもたらすが、Ｃａｐの増加はより高い全体／完全の比をもたらすことを観察した。ＤｕｏＤｕｏＢａｃ生成は、ＴｒｉｐｌｅＢａｃと比較して収量及び全体／完全の比の変動を最小にする。さらに、ＤｕｏＤｕｏＢａｃ ＡＡＶ生成は、我々がＴｒｉｐｌｅＢａｃプロセスでうまく到達することができないＣａｐ：Ｒｅｐ比を探ることを可能にする。ＤｕｏＤｕｏＢａｃプロセスによって提供されるこの拡張された操作余地は、より頑強なＡＡＶ生成プロセスの開発を潜在的に可能にすることがある。

実施例４：ＤｕｏＤｕｏＢａｃ（Ｂａｃ．Ｃａｐ－Ｒｅｐ及びＢａｃ．Ｃａｐ－Ｔｒａｎｓ）のＤｕｏＢａｃ ＡＡＶ（Ｂａｃ．Ｃａｐ、Ｂａｃ．Ｒｅｐ Ｂａｃ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）との比較
４．１ 細胞培養及びバキュロウイルス増幅
ＥｘｐｒｅｓＳＦ＋昆虫細胞を、上記の条件下でＳＦ－９００ＩＩ ＳＦＭ培地の中で培養した。新鮮なバキュロウイルス接種原を、前記の通りに産生した。

４．２ １Ｌ振盪フラスコでのＤＯＥ研究
４．２．１ ＤＯＥ計画
２つの因子（０．３３～３％の範囲内の２つの増幅されたバキュロウイルスの容量感染比）及びそれらの相互作用を調査するために、中心複合計画（ＣＣＤ）を使用した。統計分析は、ＤｅｓｉｇｎＥｘｐｅｒｔ １１（Ｓｔａｔｅａｓｅ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）及びＪＭＰ １５（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用して実行した。回転式ＣＣＤ（α＝１．４１４）及び３つの中心点を使用して、二次応答表面モデルを作成した。濾過された未精製溶解バルク中のゲノムコピー力価及び全粒子のゲノムコピーに対する（ｔｐ／ｇｃ）比を、応答として設定した。統計的に有意なモデル項目（ｐ＜０．１）だけが各モデルで含まれ、段階的回帰を通して選択されたが、モデル階層は維持された。

４．２．２ ＡＡＶの生成及び精製
増幅されたバキュロウイルス及び種細胞（前培養）は、２８℃の１３５ｒｐｍの１Ｌ振盪フラスコの中で産生した。この試験全体で使用された培地は、ＳＦ９００ ＩＩ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）であった。前培養のＶＣＤに基づいて、４００ｍＬの最終作業容量中に１．３×１０^６ＶＣ／ｍＬの目標播種細胞密度を達成するために、計算された量の培養を各１Ｌ振盪フラスコに加える。必要に応じて培養量を４００ｍＬにするために、追加のＳＦ９００ ＩＩ培地を各振盪フラスコに加えた。１Ｌ振盪フラスコの中での細胞増量は、２８℃の１３５ｒｐｍで実行した。接種の１５～２１時間後に、増幅されたバキュロウイルス接種原のプールをＤＯＥ計画による容量感染比で加えた。感染後、設定温度を３０℃に上昇させ、１３５ｒｐｍで６８～７６時間培養を継続した。その後、１０％（ｖ／ｖ）の１０×溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ）を加えることによって培養を採取した。溶解を開始して３０分後、設定温度を３７℃に上昇させた。設定温度に到達したとき、ベンゾナーゼを加え（９単位／ｍＬ）、その後培養をさらに６０分間インキュベートした。未精製の溶解バルクの清澄化は、４１００ｇ及び室温（２０～２５℃）で１５分間の遠心分離、続いて０．２μｍメンブランフィルターによる濾過によって実行した。濾過されたバルクは、次にＣｙｔｉｖａからのＡＶＢセファロースＨＰ樹脂を使用して精製した。０．２Ｍグリシン／ＨＣｌ ｐＨ２．４緩衝液を使用して生成物を溶出し、６０ｍＭトリスｐＨ８．５を使用してその後中和した。精製された試料は、その後ｑＰＣＲ（ベクターゲノムコピー数、未精製溶解物中のＧＣ濃度を決定するために）及びＳＥＣ－ＨＰＬＣ（全ＡＡＶ粒子の全量を決定するために）によって分析した。表７の結果は、ＤｕｏＤｕｏＢａｃ系が２つのバキュロウイルスの広範囲の感染比にわたって同等のＤｕｏＢａｃ系より高いベクター収量を達成することを示す。

４．３ ２Ｌ撹拌タンクバイオリアクターでの生成
４．３．１ ＡＡＶの生成及び精製
増幅されたバキュロウイルス及び種細胞（前培養）は、２８℃の１３５ｒｐｍの１Ｌ振盪フラスコの中で産生した。この試験全体で使用された培地は、ＳＦ９００ ＩＩ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）であった。バキュロウイルスの各組合せのために、２つの２Ｌ撹拌タンクリアクター（ＳＴＲ、ＵｎｉＶｅｓｓｅｌ（登録商標）ＳＵ、Ｓａｔｏｒｉｏｕｓ）を使用してｒＡＡＶ生成を２反復で実行した。前培養のＶＣＤに基づいて、２Ｌの最終作業容量中に０．５×１０^６ＶＣ／ｍＬの目標播種細胞密度を達成するために、計算された量の培養を２Ｌ ＳＴＲに加える。必要に応じて培養量を２Ｌにするために、追加のＳＦ９００ ＩＩ培地を２Ｌ ＳＴＲに加えた。２Ｌ ＳＴＲの中での細胞増量は、２８℃で実行した。溶存酸素（ＤＯ）は、０．２Ｌ／分でのオーバレイを通した連続固定気流、及び１００～３００ｒｐｍの撹拌速度を使用した０～１５０ｃｃｍの流速のスパージャーを通した酸素添加によって３０％に維持された。接種の４３～４８時間後に、増幅されたバキュロウイルス接種原のプールを表８に示す容量感染比で加えた。感染後、設定温度を３０℃に上昇させ、上記の設定を使用して培養を継続した。

１０％（ｖ／ｖ）の１０×溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ）を加えることによって感染の６８～７６時間後に培養を採取した。溶解を開始して３０分後、設定温度を３７℃に上昇させた。設定温度に到達したとき、ベンゾナーゼを加え（９単位／ｍＬ）、その後培養をさらに６０分間インキュベートした。未精製の溶解バルクの清澄化は、４１００ｇ及び室温（２０～２５℃）で１５分間の遠心分離、続いて０．２μｍメンブランフィルターによる濾過によって実行した。濾過されたバルクは、次にＣｙｔｉｖａからのＡＶＢセファロースＨＰ樹脂を充填したカラムを使用して精製した。０．２Ｍグリシン／ＨＣｌ ２Ｍ尿素 ｐＨ２．４緩衝液を使用して生成物を溶出し、６０ｍＭトリス２Ｍ尿素ｐＨ８．５を使用してその後中和した。中和された溶出液は、次に５ｍＬ Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ膜（Ｐａｌｌ）にロードした。生成物溶出は６０ｍＭトリス１５０ｍＭ ＮａＣｌ ２Ｍ尿素ｐＨ８．５緩衝液を使用して実行し、その後Ｐｌａｎｏｖａ３５Ｎフィルター（０．０１ｍ^２）を使用してナノ濾過を実行した。最後に、５％スクロースを含有するリン酸緩衝食塩水（Ｍｅｒｃｋ）に対して生成物を限外濾過し、所望の量に濃縮した。

精製された試料は、その後ｑＰＣＲ（ベクターゲノムコピー数、未精製溶解物中のＧＣ濃度を決定するために）、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ（全ＡＡＶ粒子の全量を決定するために）、ＦＩＸ力価アッセイ及びＨｅｌａＲＣ３２での感染性アッセイによって分析した。表８は、ＤｕｏＤｕｏＢａｃ系（ＢａｃＣａｐＴｒａｎｓ１＋ＢａｃＣａｐＲｅｐ６）が、少なくともベクター収量、力価及び感染性に関して同等のＤｕｏＢａｃ系（ＢａｃＣａｐＲｅｐ６＋ＢａｃＴｒａｎｓ４）に優ることを示す。

参考文献：
1. Chaabihi, H., etal., Competition between baculovirus polyhedrin and p10 gene expression duringinfection of insect cells. J Virol, 1993. 67(5): p. 2664-71.
２． Hill-Perkins, M.S. and R.D. Possee, Abaculovirus expression vector derived from the basic protein promoter ofAutographa californica nuclear polyhedrosis virus. J Gen Virol, 1990. 71 ( Pt4): p. 971-6.
３． Pullen, S.S. and P.D. Friesen, Earlytranscription of the ie-1 transregulator gene of Autographa californica nuclearpolyhedrosis virus is regulated by DNA sequences within its 5' noncoding leaderregion. J Virol, 1995. 69(1): p. 156-65.
４． Bosma, B., et al., Optimization of viralprotein ratios for production of rAAV serotype 5 in the baculovirus system.Gene Ther, 2018. 25(6): p. 415-424.
５． Grieger, J.C., S. Snowdy, and R.J.Samulski, Separate basic region motifs within the adeno-associated virus capsidproteins are essential for infectivity and assembly. J Virol, 2006. 80(11): p.5199-210.

Claims (22)

1. ｉ）ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１のプロモーターを含む第１の発現カセットであって、細胞におけるその翻訳はパルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つを生成する、第１の発現カセット；
   ｉｉ）ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２の発現カセットであって、細胞におけるその翻訳はパルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つを生成する、第２の発現カセット；
   ｉｉｉ）パルボウイルスＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第３のプロモーターを含む第３の発現カセット；及び
   ｉｖ）少なくとも１つのパルボウイルス逆方向末端反復配列に隣接する導入遺伝子を含むヌクレオチド配列、
   を含む１つ又は複数の核酸構築物を含む細胞であって、
   前記第１及び第２の発現カセットのうちの少なくとも１つは、前記第３の発現カセットと共に第１の核酸構築物に存在し、
   前記１つ又は複数の核酸構築物による前記細胞のトランスフェクションの後、前記第１のプロモーターは前記第２及び前記第３のプロモーターの前に活性である、細胞。
2. 前記パルボウイルス逆方向末端反復配列に隣接する前記導入遺伝子を含む前記ヌクレオチド配列が、第２の核酸構築物に存在する、請求項１に記載の細胞。
3. 前記第２の核酸構築物が、パルボウイルスＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第４のプロモーターを含む第４の発現カセットをさらに含み、前記第１のプロモーターが前記第２、第３及び第４のプロモーターの前に活性であり、任意選択で前記第３及び第４のプロモーターが同一であり、任意選択で、前記第３及び第４の発現カセットの前記ヌクレオチド配列によってコードされる前記パルボウイルスＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質が同一である、請求項２に記載の細胞。
4. 前記パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つ並びに前記パルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つが、前記パルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つの第２のアミノ酸から最もＣ末端のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む共通アミノ酸配列を含み、前記パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つ並びに前記パルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つの前記共通アミノ酸配列が少なくとも９０％同一であり、前記パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つの前記共通アミノ酸配列をコードする前記ヌクレオチド配列並びに前記パルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つの前記共通アミノ酸配列をコードする前記ヌクレオチド配列が９０％未満同一である、請求項３に記載の細胞。
5. 前記パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つ並びに前記パルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つの前記共通アミノ酸配列が少なくとも９９％同一であり、好ましくは１００％同一である、請求項４に記載の細胞。
6. 前記パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つの前記共通アミノ酸配列をコードする前記ヌクレオチド配列が、前記パルボウイルスＲｅｐ５２及び４０のうちの少なくとも１つの前記共通アミノ酸配列をコードする前記ヌクレオチド配列と比較して、前記細胞のための改善されたコドン使用頻度バイアスを有するか、又は前記パルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つの前記共通アミノ酸配列をコードする前記ヌクレオチド配列が、前記パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つの前記共通アミノ酸配列をコードする前記ヌクレオチド配列と比較して、前記細胞のための改善されたコドン使用頻度バイアスを有し、好ましくは、前記パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つ並びに前記パルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つにおける前記共通アミノ酸配列をコードする前記ヌクレオチド配列の間のコドン適応指数の差が少なくとも０．２である、請求項４又は５に記載の細胞。
7. 前記第１のプロモーターが構成的プロモーターである、前記請求項のいずれか一項に記載の細胞。
8. 前記第２、第３及び第４のプロモーターのうちの少なくとも１つが誘導性プロモーターである、前記請求項のいずれか一項に記載の細胞。
9. 前記誘導性プロモーターが、ウイルス感染周期のより後期に誘導されるウイルスプロモーター、好ましくは前記ウイルスによる前記細胞のトランスフェクション又は感染の少なくとも２４時間後に誘導されるウイルスプロモーターである、請求項８に記載の細胞。
10. 前記第１及び第２の核酸構築物のうちの少なくとも１つが前記細胞のゲノムに安定して組み込まれている、前記請求項のいずれか一項に記載の細胞。
11. 前記細胞が昆虫細胞であり、前記第１及び第２の核酸構築物のうちの少なくとも１つが昆虫細胞適合ベクター、好ましくはバキュロウイルスベクターである、前記請求項のいずれか一項に記載の細胞。
12. ａ）前記第１のプロモーターがｄｅｌｔａＥｌプロモーター及びＥｌプロモーターから選択され；
    ｂ）前記第２、第３及び第４のプロモーターがｐｏｌＨプロモーター及びｐ１０プロモーターから選択される、
    請求項１１に記載の細胞。
13. 少なくとも１つの発現カセットが、少なくとも１つのバキュロウイルスエンハンサーエレメント及び／又は少なくとも１つのエクジソン応答エレメントを含み、好ましいエンハンサーエレメントはｈｒ１、ｈｒ２、ｈｒ２．０９、ｈｒ３、ｈｒ４、ｈｒ４ｂ及びｈｒ５からなる群から選択される、請求項１１又は１２に記載の細胞。
14. 前記細胞におけるその翻訳がパルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つだけを生成するｍＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列が、無傷（ｉｎｔａｃｔ）のパルボウイルスｐ１９プロモーターを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の細胞。
15. 前記パルボウイルスＲｅｐ７８及び６８タンパク質のうちの少なくとも１つ、前記パルボウイルスＲｅｐ５２及び４０タンパク質のうちの少なくとも１つ、前記パルボウイルスＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質、並びに前記少なくとも１つのパルボウイルス逆方向末端反復配列がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来する、前記請求項のいずれか一項に記載の細胞。
16. 前記第１の核酸構築物がＤｕｏＢａｃ ＣａｐＲｅｐ６（配列番号１０）であり、前記第２の核酸構築物がＤｕｏＢａｃ ＣａｐＴｒａｎｓ１（配列番号１２）であり、好ましくは前記第１及び第２の構築物が３：１のモル比で存在する、請求項４～１５のいずれか一項に記載の細胞。
17. 細胞で組換えパルボウイルスビリオンを生成する方法であって、
    ａ）請求項１～１６のいずれか一項に記載の細胞を、組換えパルボウイルスビリオンが生成される条件下で培養するステップ；及び
    ｂ）前記組換えパルボウイルスビリオンを回収するステップ
    含む方法。
18. 前記細胞が昆虫細胞であり、及び／又は前記パルボウイルスビリオンがＡＡＶビリオンである、請求項１７に記載の方法。
19. ステップｂ）の前記組換えパルボウイルスビリオンの回収が、固定化抗パルボウイルス抗体、好ましくは一本鎖ラクダ抗体又はその断片を使用した、前記ビリオンの親和性精製、又は３０～７０ｎｍの名目孔径を有するフィルターでの濾過のうちの少なくとも１つを含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
20. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の第１の核酸構築物。
21. 請求項２～１５のいずれか一項に記載の第２の核酸構築物。
22. 少なくとも請求項１～１５のいずれか一項に記載の第１の核酸構築物及び請求項２～１５のいずれか一項に記載の第２の核酸構築物を含む、パーツのキット（ｋｉｔ ｏｆ ｐａｒｔｓ）。

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