EA020965B1 - Способ и фармацевтическая комбинация для лечения рака - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к способу лечения рака у млекопитающего и к фармацевтическим комбинациям, которые можно применять при таком лечении. В частности, способ относится к новой комбинации, включающей в себя ингибитор МЕК: N-{3-[3-циклопропил-5-(2-фтор-4-йод-фениламино)-6,8-диметил-2,4,7-триоксо-3,4,6,7-тетрагидро-2Н-пиридо[4,3-d]пиримидин-1-ил]фенил}ацетамид или его фармацевтически приемлемые соль или сольват и ингибитор PI3-киназы: 2,4-дифтор-N-{2-(метилокси)-5-[4-(4-пиридазинил)-6-хинолинил]-3-пиридинил}бензолсульфонамид или его фармацевтически приемлемую соль, к фармацевтическим композициям, включающим в себя указанные соединения, и к способам применения таких комбинаций при лечении рака.

Description

Настоящее изобретение относится к способу лечения рака у млекопитающего и к комбинации, которую можно применять для такого лечения. В частности, указанный способ относится к новой комбинации, включающей в себя ингибитор В-Ра£ Ы-{3-[5-(2-амино-4-пиримидинил)-2-(1,1-диметилэтил)-1,3тиазол-4-ил]-2-фторфенил}-2,6-дифторбензолсульфонамид или его фармацевтически приемлемые соль или сольват и ингибитор ΡΙ3Κ 2,4-дифтор-Ы-{2-(метилокси)-5-[4-(4-пиридазинил)-6-хинолинил]-3пиридинил}бензолсульфонамид или его фармацевтически приемлемую соль, к фармацевтическим композициям, включающим эти вещества, и к способам применения таких комбинаций при лечении рака.

Предпосылки создания изобретения

Эффективное лечение гиперпролиферативных заболеваний, включая рак, является постоянной задачей онкологии. Как правило, рак является результатом дерегуляции нормальных процессов, контролирующих деление клеток, дифференцировку и апоптозную гибель клеток. Апоптоз (запрограммированная гибель клетки) играет важную роль в эмбриональном развитии и в патогенезе многих заболеваний, таких как нейродегенеративные заболевания, сердечно-сосудистые заболевания и рак. Одним из наиболее изученных путей, связанных с регуляцией апоптоза, является система клеточных сигналов, передаваемых к ядру от рецепторов ростовых факторов на клеточной поверхности (Сге\У5 апб Епкзои, Се11, 74: 215-17, 1993).

Одним из больших и важных семейств ферментов является семейство протеинкиназ. В настоящее время известно примерно 500 разных протеинкиназ. Протеинкиназы служат для катализа реакций фосфорилирования боковых цепей аминокислот во многих белках, перенося γ-фосфат комплекса ΑΤΡ-Мд²' к указанной боковой цепи аминокислоты. Эти ферменты регулируют большинство сигнальных процессов внутри клеток и тем самым управляют клеточной функцией, ростом, дифференцировкой и разрушением (апоптозом), осуществляя обратимое фосфорилирование гидроксильных групп в остатках серина, треонина и тирозина в белках. Исследования показали, что протеинкиназы являются ключевыми регуляторами многих клеточных функций, включая передачу сигналов, регуляцию транскрипции, подвижность клеток и клеточное деление. Было также показано, что несколько протеинкиназ кодируются онкогенами, что предполагает определенную роль, исполняемую киназами в онкогенезе. Эти процессы являются весьма регулируемыми, часто посредством сложных и переплетающихся путей, где каждая киназа сама будет регулироваться одной или более другими киназами. Поэтому аномальная или неадекватная протеинкиназная активность может быть одной из причин увеличения частоты патологических состояний, которые связаны с подобной аномальной киназной активностью, включая доброкачественные и злокачественные пролиферативные расстройства, а также заболевания, обусловленные неадекватной активацией иммунной и нервной систем. Вследствие их физиологической значимости, разнообразия и повсеместной распространенности протеинкиназы стали одним из наиболее важных семейств ферментов, обстоятельно изучаемых в биохимических и медицинских исследованиях.

Протеинкиназное семейство ферментов обычно классифицируют как разделенное на два главных подсемейства: тирозиновые протеинкиназы и серин/треониновые протеинкиназы, соответственно тем аминокислотным остаткам, которые они фосфорилируют. Серин/треониновые киназы (Р8ТК) включают в себя сАМР- и сОМР-зависимые протеинкиназы, кальций- и фосфолипид-зависимую протеинкиназу, кальций- и кальмодулин-зависимые протеинкиназы, казеинкиназы, протеинкиназы цикла клеточного деления и другие. Эти киназы обычно являются цитоплазматическими или связанными с фракциями внутриклеточных частиц (возможно, посредством якорных белков). Считается, что аномальная активность серин/треониновой протеинкиназы задействована в ряде патологий, таких как ревматоидный артрит, псориаз, септический шок, остеопороз, многие виды рака и других пролиферативных заболеваний. Поэтому серин/треониновые киназы и пути передачи сигналов, частью которых они служат, являются важными целями при разработке лекарственных средств. Тирозинкиназы фосфорилируют тирозиновые остатки. Тирозинкиназы также играют важную роль в клеточной регуляции. Эти киназы включают в себя несколько рецепторов для таких молекул, как ростовые факторы и гормоны, включая рецептор эпидермального фактора роста, рецептор инсулина, рецептор тромбоцитарного фактора роста и другие. Исследования показали, что многие тирозинкиназы представляют собой трансмембранные белки, рецепторные домены которых находятся на внешней стороне клетки, а их киназные домены расположены внутри. Ведется и большая работа по идентификации модуляторов тирозинкиназ.

Киназа митоген-активируемого белка (МАРК)/киназа, регулируемая внешнеклеточным сигналом (ЕРК) (далее в настоящем документе обозначаемая как МЕК), как известно, участвует в регуляции многих клеточных процессов. Семейство МЕК (МЕК-1, МЕК-2 и т.п.) активируется семейством Ра£ (В-Ра£, С-Ра£ и т.п.), а семейство ЕРК (ЕРК-1 и ЕРК-2) активируется семейством МЕК. В широком смысле, сигнальная активность пути РАЕ/МЕК/ЕРК регулирует трансляцию мРНК. Это включает в себя гены, относящиеся к клеточному циклу. Поэтому гиперактивация этого пути может приводить к неконтролируемой клеточной пролиферации. Дерегуляция пути РАЕ/МЕК/ЕРК, обусловленная гиперактивацией ЕРК, наблюдается приблизительно в 30% всех злокачественных новообразований человека (А11еи, Ь.Е., е1 а1. 8еш1п. Опсо1., 2003, 30 (5 8ирр1. 16): 105-16). Активирующие ВРАЕ-мутации идентифицированы с высокой частотой в специфических типах опухолей (например, в меланомах) (Όη\®5. Н. е1 а1. ИаШге,

- 1 020965

2002, 417: 949-54). Приблизительно 90% всех идентифицированных ВКАР-мутаций, встречающихся в злокачественных опухолях человека, представляют собой трансверсии Т1799 в экзоне 15, результатом чего является аминокислотная замена У600 Ε/ϋ/Κ(Τ1799Α) (Ае11Ъгоск, С. е! а1. ΝηΙ. Кеу. Мо1. Се11 ΒίοΙ., 2004, 5: 875-85; Аап, Ρ.Τ. е! а1. Се11, 2004, 116: 855-67). Эта мутация, по-видимому, имитирует регуляторное фосфорилирование и повышает активность ВКЛР примерно в 10 раз по сравнению с диким типом (Эау1е8, Н. е! а1. №1иге, 2002, 417: 949-54). Частота этой активирующей мутации и путь, который к ней приводит, делают мутацию ВКЛР исключительно привлекательной мишенью.

Путь фосфоинозитид-3-киназы (ΡΙ3Κ) относится к путям, наиболее часто активируемым при раке человека. Функция и значение этого пути в онкогенезе и развитии опухоли хорошо установлены (§ашиеК & Епеюп. Сигг. Орр ίη Опсо1оду, 2006, 18: 77-82). Передача сигналов ΡΙ3Κ-ΑΚΤ, по-видимому, является ключевым модулятором клеточной жизнеспособности, пролиферации и метаболизма. У млекопитающего это включает в себя активацию мишени рапамицина (тТОК), которая является членом белкового семейства ΡΙ3Κ и прямым регулятором клеточного роста и трансляции. Таким образом, дерегуляция сигнального пути ΡΙ3Κ/ΑΚΤ/ώΤΟΚ, происходящая в опухолях, вносит свой вклад в проявление клеточного фенотипа, демонстрирующего множественные признаки злокачественности, к которым относятся неограниченный потенциал воспроизводства и избегание апоптоза (Напайап & АешЪегд, Се11, 2000, 100: 57-70).

Семейство ΡΙ3Κ состоит из 15 белков с гомологичными последовательностями (в частности, в их киназных доменах); однако они имеют разную субстратную специфичность и по-разному регулируются (У1уапсо & За\\уег5. №1. Кеу. Сапсег, 2002, 2: 489-501). ΡI3-киназы класса Ι фосфорилируют липиды, содержащие инозит, известные как фосфатидилинозиты (Ρΐά^δ), в положении 3. Первичный субстрат членов семейства класса Ι, соединение Ρΐά1η8-4,5-Ρ2 (ΡΙΡ2), этими киназами преобразуется в соединение (ΡΙΡ3). ΡΙΡ3 является критическим вторичным мессенджером, который связывает белки, содержащие плекстрин-гомологичный домен, с клеточной мембраной, где они активируются. Наиболее изученным из этих белков является ΑΚΤ, который стимулирует жизнеспособность клетки, рост и пролиферацию. После активации ΑΚΤ перемещается в цитоплазму и ядро, где он фосфорилирует множество субстратов, к которым относится и тΤΟΚ (ТОКС1). Кроме ΑΚΤ, киназа ΡΙ3Κ активирует и другие пути, связанные с онкогенезом, такие как ΡΌΚ1, СЭС42 и КАС1 (8атие18 & Епсюп. Сигг. Орр. т Опсо1оду,

2006, 18: 77-82).

При исследовании опухолей человека активация сигнального пути ΡI3Κ/ΑΚΤ/тΤΟΚ может проявиться посредством многих механизмов. Обычной является генетическая дерегуляция указанного пути, которая может проявиться различным образом (см. обзор 8атие18 & Епсюп. Сигг. Орр. т Опсо1оду, 2006 18: 77-82). Активирующие мутации гена ΡIΚ3СА (кодирующего каталитическую субъединицу р110а киназы ΡΙ3Κ) проявляется во многих опухолях человека, включая рак молочной железы, яичника, эндометрия и ободочной и прямой кишки. Активирующие амплификации ДНК этого гена также проявляются менее часто в ряде других типов опухолей. Мутации регуляторной субъединицы р85 α киназы ΡΙ3Κ (Ж3К1), которые нарушают С2-1§Н2-взаимодействие между ΡΚΒ^ и ΡIΚ3СΑ, проявляются при раке яичника, глиобластоме и раке ободочной и прямой кишки. Онкосупрессор ΡΤΕΝ, который дефосфорилирует ΡΙΡ3, генерируя ΡΙΡ2, и, таким образом, действует как ингибитор пути ΡΙ3Κ, обычно является мутированным, подвергнутым делеции или инактивированным эпигенетически. И наконец, указанный путь может также быть генетически активированным уже после ΡΙ3Κ посредством амплификации ДНК или мутации ΑΚΤ; однако при раке у человека эти генетические события проявляются значительно менее часто. Известно, что ингибирование изоформ ΡΙ3Κ (в частности, ΡΙ3Κ-α) является полезным при лечении рака (см., например, АО 05/121142, АО 08/144463, АО 08/144464, АО 07/136940).

Было бы полезно предоставить новую монотерапию или комбинированную терапию, которая предоставляла бы более эффективное и/или успешное лечение индивида, страдающего от проявлений рака.

Сущность изобретения

Один вариант осуществления настоящего изобретения предоставляет комбинацию, содержащую:

(ί) соединение структуры (Ι)

Ν-{ 3-[5-(2-амино-4-пиримидинил)-2-( 1,1 -диметилэтил)-1,3-тиазол-4-ил] -2-фторфенил} -2,6-дифторбензолсульфонамид (далее в настоящем документе называемый соединением А) или его фармацевтически приемлемую соль;

- 2 020965 (ίί) соединение структуры (II)

2,4-дифтор-Н-{2-(метилокси)-5-[4-(4-пиридазинил)-6-хинолинил]-3-пирцдинил}бензолсульфонамид (далее в настоящем документе называемый соединением В) или его фармацевтически приемлемую соль.

Один вариант осуществления настоящего изобретения предоставляет способ лечения рака у человека, нуждающегося в этом, который включает в себя введение ίη νίνο терапевтически эффективного количества комбинации соединения А или его фармацевтически приемлемых соли или сольвата и соединения В или его фармацевтически приемлемой соли такому человеку.

Один вариант осуществления настоящего изобретения предоставляет способ лечения рака у человека, нуждающегося в этом, который включает в себя введение ίη νίνο терапевтически эффективного количества комбинации соединения А или его фармацевтически приемлемых соли или сольвата и соединения В или его фармацевтически приемлемой соли указанному человеку, где указанную комбинацию вводят в пределах определенного периода и где указанную комбинацию вводят в течение некоторого времени.

Один вариант осуществления настоящего изобретения предоставляет способ лечения рака у человека, нуждающегося в этом, который включает в себя введение ίη νίνο терапевтически эффективного количества комбинации соединения А или его фармацевтически приемлемых соли или сольвата и соединения В или его фармацевтически приемлемой соли такому человеку, где соединения А и В вводят последовательно.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к комбинациям, которые демонстрируют антипролиферативную активность. Соответственно указанный способ относится к способам лечения рака посредством совместного введения Ы-{3-[5-(2-амино-4-пиримидинил)-2-( 1,1 -диметилэтил)-1,3-тиазол-4-ил] -2-фторфенил}2,6-дифторбензолсульфонамида (соединения А) или его фармацевтически приемлемых соли или сольвата (соответственно диметилсульфоксидного сольвата), причем данное соединение представлено структурой I

и 2,4-дифтор-Ы-{2-(метилокси)-5-[4-(4-пиридазинил)-6-хинолинил]-3-пиридинил}бензолсульфонамида (соединения В) или его фармацевтически приемлемой соли; причем данное соединение представлено следующей структурой

Соединение А раскрыто и заявлено вместе с его фармацевтически приемлемыми солями как применимое в качестве ингибитора активности В-Ка£, в частности, при лечении рака, в международной заявке на патент № РСТ/И82009/042682, имеющей дату международной подачи 04 мая 2009 г., номер международной публикации νθ 2009/137391 и дату международной публикации νθ 2009/137391, полное раскрытие которой включено в настоящий документ посредством ссылки, где соединение А представляет собой соединение примера 58. Соединение А может быть получено так, как описано в международной заявке на патент № РСТ/И82009/042682.

Соответственно соединение А находится в форме метансульфонатной соли. Эта солевая форма может быть получена квалифицированным специалистом в данной области техники по описанию в между- 3 020965 народной заявке на патент № РСТ/И82009/042682, имеющей дату международной подачи 4 мая 2009 г.

Соединение В раскрыто и заявлено вместе с его фармацевтически приемлемыми солями как применимое в качестве ингибитора активности Р13К, в частности, при лечении рака, в международной заявке на патент № РСТ/и§2008/063819, имеющей дату международной подачи 16 мая 2008 г., номер международной публикации νθ 2008/1444463 и дату международной публикации 27 ноября 2008 г., полное раскрытие которой включено в настоящей документ посредством ссылки, где соединение В представляет собой соединение примера 345. Соединение В может быть получено так, как описано в международной заявке на патент № РСТ/и§2008/063819.

Соответственно соединение В находится в форме свободного основания.

Введение терапевтически эффективного количества комбинаций согласно настоящему изобретению является более полезным, чем введение индивидуальных соединений-компонентов, поскольку указанные комбинации предоставят одно или более из следующих улучшенных свойств по сравнению с индивидуальным введением терапевтически эффективного количества соединения-компонента: ί) больший противоопухолевый эффект, чем у наиболее активного единичного агента, ίί) синергичная или высоко синергичная противоопухолевая активность, ίίί) протокол дозирования, который обеспечивает повышенную противоопухолевую активность с пониженным профилем побочных эффектов, ίν) снижение профиля токсичных эффектов, ν) увеличение терапевтического окна или νί) увеличение биодоступности одного или обоих соединений-компонентов.

Соединения согласно настоящему изобретению могут образовывать сольват, который понимают как комплекс с переменной стехиометрией, образованный растворенным веществом (в настоящем изобретении это соединение А или его соль и/или соединение В или его соль) и растворителем. В целях настоящего изобретения такие растворители не должны ухудшать биологическую активность растворенного вещества. Примеры подходящих растворителей включают в себя, но не ограничиваются ими, воду, метанол, диметилсульфоксид, этанол и уксусную кислоту. Соответственно применяемый растворитель представляет собой фармацевтически приемлемый растворитель. Примеры подходящих фармацевтически приемлемых растворителей включают в себя, без ограничения, воду, диметилсульфоксид, этанол и уксусную кислоту. Соответственно в качестве растворителя применяют воду.

Фармацевтически приемлемые соли соединений согласно настоящему изобретению легко получают квалифицированные специалисты в данной области техники.

Кроме того, в настоящем документе предусмотрен способ лечения рака с применением комбинации согласно настоящему изобретению, где соединение А или его фармацевтически приемлемые соль или сольват и/или соединение В или его фармацевтически приемлемую соль вводят в виде пролекарств. Фармацевтически приемлемые пролекарства соединений согласно настоящему изобретению легко получают квалифицированные специалисты в данной области техники.

В ссылках на протокол дозирования термины день, в день и т.п. относятся ко времени в пределах одного календарного дня, который начинается в полночь и заканчивается в следующую полночь.

Термин лечение и его производные, используемые в настоящем документе, означают терапевтическую терапию. В ссылке на конкретное патологическое состояние термин лечить означает (1) улучшать или предупреждать одно или более из биологических проявлений патологического состояния, (2) влиять противодействующим образом (а) в одной или более точек биологического каскада, приводящего к указанному патологическому состоянию или ответственного за указанное патологическое состояние, или (Ь) на одно или более биологических проявлений указанного патологического состояния, (3) облегчать один или более симптомов, эффектов или побочных эффектов, связанных с указанным патологическим состоянием или его лечением, или (4) замедлять прогрессивное развитие указанного патологического состояния или одного или более из биологических проявлений указанного патологического состояния. Тем же предусмотрено и профилактическое лечение. Квалифицированный специалист в данной области признает, что предупреждение не является абсолютным термином. В медицине предупреждение понимают как профилактическое введение лекарственного средства для существенного уменьшения вероятности патологического состояния или его тяжести либо его биологического проявления или как задержку начала развития такого патологического состояния или его биологического проявления. Профилактическая терапия уместна, например, тогда, когда считают, что субъект имеет высокий риск развития рака, как, например, тогда, когда субъект имеет семейный анамнез, отягощенный онкологическим заболеванием или когда субъект был подвергнут воздействию канцерогена.

Термин эффективное количество, используемый в настоящем документе, означает то количество лекарственного средства или фармацевтического агента, которое будет улучшать биологическую или медицинскую реакцию ткани, системы, животного или человека и поиском которого занимается, например, исследователь или клиницист. Кроме того, термин терапевтически эффективное количество означает любое количество, которое по сравнению с соответствующим субъектом, не получавшим такого количества, имеет результатом улучшение лечения, выздоровление, предупреждение или облегчение заболевания, расстройства или побочного эффекта или уменьшение скорости прогрессивного развития заболевания или расстройства. Кроме того, данный термин охватывает и количества, эффективные для повышения нормальной физиологической функции.

- 4 020965

Термин периодическое введение или его варианты означает, что лекарственное средство вводят человеку с промежуточными периодами отдыха от лекарств. Отдых от лекарств (иногда также называемый лекарственными каникулами, медикаментозными каникулами, структурным прерыванием лечения или стратегическим прерыванием лечения) имеет место тогда, когда пациент приостанавливает прием медикамента(ов) на период времени от нескольких дней до нескольких месяцев.

Термин комбинация и его производные, используемые в настоящем документе, означают либо одновременное введение, либо любой вариант раздельного последовательного введения терапевтически эффективного количества соединения А или его фармацевтически приемлемых соли или сольвата и соединения В или его фармацевтически приемлемой соли. В тех случаях, когда введение не является одновременным, предпочтительно вводить соединения с небольшим интервалом времени между ними. Кроме того, одинаковость дозированных форм каждого из вводимых соединений не имеет значения; например одно соединение можно вводить местно, а другое соединение можно вводить перорально. Предпочтительно пероральное введение обоих соединений.

Термин комбинированный набор, используемый в настоящем документе, означает фармацевтическую композицию или фармацевтические композиции, которые применяют для введения соединения А или его фармацевтически приемлемых соли или сольвата и соединения В или его фармацевтически приемлемой соли согласно настоящему изобретению. Когда оба соединения вводят одновременно, комбинированный набор может содержать соединение А или его фармацевтически приемлемые соль или сольват и соединение В или его фармацевтически приемлемую соль в единой фармацевтической композиции (такой как таблетка) или в раздельных фармацевтических композициях. Когда соединения вводят не одновременно, комбинированный набор будет содержать соединение А или его фармацевтически приемлемые соль или сольват и соединение В или его фармацевтически приемлемую соль в раздельных фармацевтических композициях. Комбинированный набор может содержать соединение А или его фармацевтически приемлемые соль или сольват и соединение В или его фармацевтически приемлемую соль в раздельных фармацевтических композициях в единой упаковке или в раздельных фармацевтических композициях в раздельных упаковках.

В одном аспекте настоящего изобретения предоставлен комбинированный набор, включающий в себя компоненты:

соединение А или его фармацевтически приемлемые соль или сольват в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем и соединение В или его фармацевтически приемлемая соль в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения комбинированный набор содержит следующие компоненты:

соединение А или его фармацевтически приемлемые соль или сольват в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем и соединение В или его фармацевтически приемлемая соль в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, где компоненты предоставлены в форме, которая соответствует последовательному, раздельному и/или одновременному введению.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения комбинированный набор содержит первый контейнер, содержащий соединение А или его фармацевтически приемлемые соль или сольват в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем и второй контейнер, содержащий соединение В или его фармацевтически приемлемую соль в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем и контейнерное средство для содержания указанных первого и второго контейнеров.

Комбинированный набор может быть также снабжен инструкцией, такой как инструкция по дозированию и введению. Такие инструкции по дозированию и введению могут быть в форме, предназначенной для врача (например, в виде товарной этикетки), или они могут быть в форме, предоставляемой врачом (например, в виде инструкции пациенту).

Если не определено иначе, во всех протоколах дозирования, описанных в настоящем документе, режим введения соединений не должен начинаться с началом лечения и заканчиваться с окончанием лечения; требуется только, чтобы число последовательных дней, в которые вводят оба соединения, и оптимальное число последовательных дней, в которые вводят только одно из соединений-компонентов, или указанный протокол дозирования (включая количество вводимого соединения) имели место в некоторой точке в курсе лечения.

Термин соединение А², используемый в настоящем документе, означает соединение А или его фармацевтически приемлемые соль или сольват.

Термин соединение В², используемый в настоящем документе, означает соединение В или его фармацевтически приемлемая соль.

Предпочтительно комбинации согласно настоящему изобретению вводят в пределах определенного периода.

- 5 020965

Термин определенный период и его производные, используемые в настоящем документе, означают интервал времени между введением одного из членов группы, состоящей из соединения А² и соединения В², и другого члена группы, состоящей из соединения А² и соединения В². Если не определено иначе, определенный период может включать в себя одновременное введение. Когда оба соединения согласно настоящему изобретению вводят один раз в день, определенный период относится к введению соединения А² и соединения В² в течение одного дня. Когда оба соединения согласно настоящему изобретению или одно из них вводят более одного раза в день, определенный период рассчитывают, основываясь на первом введении каждого соединения в конкретный день. При расчете определенного периода не учитывают никакие введения соединения согласно настоящему изобретению, следующие за первым введением в течение конкретного дня.

Соответственно, если соединения вводят в пределах определенного периода и не одновременно, их оба вводят с интервалом между ними, не превышающим примерно 24 ч, в этом случае указанный интервал будет составлять примерно 24 ч; соответственно их оба будут вводить с интервалом между ними, не превышающим 12 ч, в этом случае указанный интервал будет составлять примерно 12 ч; соответственно их оба будут вводить с интервалом между ними, не превышающим 11 ч, в этом случае указанный интервал будет составлять примерно 11 ч; соответственно их оба будут вводить с интервалом между ними, не превышающим 10 ч, в этом случае указанный интервал будет составлять примерно 10 ч; соответственно их оба будут вводить с интервалом между ними, не превышающим 9 ч, в этом случае указанный интервал будет составлять примерно 9 ч; соответственно их оба будут вводить с интервалом между ними, не превышающим 8 ч, в этом случае указанный интервал будет составлять примерно 8 ч; соответственно их оба будут вводить с интервалом между ними, не превышающим 7 ч, в этом случае указанный интервал будет составлять примерно 7 ч; соответственно их оба будут вводить с интервалом между ними, не превышающим 6 ч, в этом случае указанный интервал будет составлять примерно 6 ч; соответственно их оба будут вводить с интервалом между ними, не превышающим 5 ч, в этом случае указанный интервал будет составлять примерно 5 ч; соответственно их оба будут вводить с интервалом между ними, не превышающим 4 ч, в этом случае указанный интервал будет составлять примерно 4 ч; соответственно их оба будут вводить с интервалом между ними, не превышающим 3 ч, в этом случае указанный интервал будет составлять примерно 3 ч; соответственно их оба будут вводить с интервалом между ними, не превышающим 2 ч, в этом случае указанный интервал будет составлять примерно 2 ч; соответственно их оба будут вводить с интервалом между ними, не превышающим 1 ч, в этом случае указанный интервал будет составлять примерно 1 ч. В настоящем документе введение соединения А² и соединения В² с интервалом между ними менее 45 мин рассматривается как одновременное введение.

Соответственно, когда комбинацию согласно настоящему изобретению вводят в течение определенного периода, соединения будут вводить совместно в течение некоторого времени.

Термин в течение некоторого времени и его производные, используемые в настоящем документе, означают, что оба соединения согласно настоящему изобретению вводят в течение указанного числа последовательных дней.

Относительно определенного периода введения.

Соответственно оба соединения будут вводить в пределах определенного периода, по меньшей мере в течение одного дня, в этом случае понятие в течение некоторого времени будет означать по меньшей мере один день; соответственно в течение курсового лечения оба соединения будут вводить в пределах определенного периода, по меньшей мере в течение 3 последовательных дней, в этом случае понятие в течение некоторого времени будет означать по меньшей мере 3 дня; соответственно в течение курсового лечения оба соединения будут вводить в пределах определенного периода, по меньшей мере в течение 5 последовательных дней, в этом случае понятие в течение некоторого времени будет означать по меньшей мере 5 дней; соответственно в течение курсового лечения оба соединения будут вводить в пределах определенного периода, по меньшей мере в течение 7 последовательных дней, в этом случае понятие в течение некоторого времени будет означать по меньшей мере 7 дней; соответственно в течение курсового лечения оба соединения будут вводить в пределах определенного периода, по меньшей мере в течение 14 последовательных дней, в этом случае понятие в течение некоторого времени будет означать по меньшей мере 14 дней; соответственно в течение курсового лечения оба соединения будут вводить в пределах определенного периода, по меньшей мере в течение 30 последовательных дней, в этом случае понятие в течение некоторого времени будет означать по меньшей мере 30 дней.

Соответственно, если соединения не вводят в течение определенного периода, их вводят последовательно. Термин последовательное введение и его производные, используемые в настоящем документе, означают, что один из членов группы, состоящей из соединения А² и соединения В², вводят один раз в день в течение одного или более последовательных дней, а другой член группы, состоящей из соединения А² и соединения В², последовательно вводят один раз в день в течение двух или более последовательных дней. Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрен период отдыха от лекарств, используемый между последовательным введением одного из членов группы, состоящей из соединения А² и соединения В², и другого члена группы, состоящей из соединения А² и соединения В². Термин период отдыха от лекарств, используемый в настоящем документе, означает период, состоящий из дней после

- 6 020965 последовательного введения одного из членов группы, состоящей из соединения А² и соединения В², и перед введением другого члена группы, состоящей из соединения А² и соединения В², когда не вводят ни соединение А², ни соединение В². Соответственно отдых от лекарств будет составлять период, образованный днями, число которых выбрано из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14 дней.

Относительно последовательного введения.

Соответственно один из членов группы, состоящей из соединения А² и соединения В², вводят в течение 2-30 последовательных дней, за которыми следует необязательный отдых от лекарств, за которым следует введение другого члена группы, состоящей из соединения А² и соединения В², в течение 2-30 последовательных дней. Соответственно один из членов группы, состоящей из соединения А² и соединения В², вводят в течение 2-21 последовательных дней, за которыми следует необязательный отдых от лекарств, за которым следует введение другого члена группы, состоящей из соединения А² и соединения В², в течение 2-21 последовательных дней. Соответственно один из членов группы, состоящей из соединения А² и соединения В², вводят в течение 2-14 последовательных дней, за которыми следует необязательный отдых от лекарств в течение 1-14 дней, за которым следует введение другого члена группы, состоящей из соединения А² и соединения В², в течение 2-14 последовательных дней. Соответственно один из членов группы, состоящей из соединения А² и соединения В², вводят в течение 3-7 последовательных дней, за которыми следует необязательный отдых от лекарств в течение 3-10 дней, за которым следует введение другого члена группы, состоящей из соединения А² и соединения В², в течение 3-7 последовательных дней.

Соответственно соединение В² будут вводить первым в последовательности, после чего последует необязательный отдых от лекарств, за которым последует введение соединения А². Соответственно соединение В² вводят в течение 3-21 последовательных дней, за которыми следует необязательный отдых от лекарств, за которым следует введение соединения А² в течение 3-21 последовательных дней. Соответственно соединение В² вводят в течение 3-21 последовательных дней, за которыми следует отдых от лекарств в течение 1-14 дней, за которым следует введение соединения А² в течение 3-21 последовательных дней. Соответственно соединение В² вводят в течение 3-21 последовательных дней, за которыми следует отдых от лекарств в течение 3-14 дней, за которым следует введение соединения А² в течение 321 последовательных дней. Соответственно соединение В² вводят в течение 21 последовательного дня, за которым следует необязательный отдых от лекарств, за которым следует введение соединения А² в течение 14 последовательных дней. Соответственно соединение В² вводят в течение 14 последовательных дней, за которыми следует отдых от лекарств в течение 1-14 дней, за которым следует введение соединения А² в течение 14 последовательных дней. Соответственно соединение В² вводят в течение 7 последовательных дней, за которыми следует отдых от лекарств в течение 3-10 дней, за которым следует введение соединения А² в течение 7 последовательных дней. Соответственно соединение В² вводят в течение 3 последовательных дней, за которыми следует отдых от лекарств в течение 3-14 дней, за которым следует введение соединения А² в течение 7 последовательных дней. Соответственно соединение В² вводят в течение 3 последовательных дней, за которыми следует отдых от лекарств в течение 3-10 дней, за которым следует введение соединения А² в течение 3 последовательных дней.

При этом понимается, что за введением с определенным периодом и последовательным введением может следовать повторное дозирование или может следовать альтернативный протокол дозирования, а период отдыха от лекарств может предшествовать повторному дозированию или альтернативному протоколу дозирования.

Соответственно количество соединения А², вводимого в качестве части комбинации согласно настоящему изобретению, будет представлять собой некоторое количество, выбранное в диапазоне от примерно 10 до примерно 300 мг; соответственно данное количество будет выбранным в диапазоне от примерно 30 до примерно 280 мг; соответственно данное количество будет выбранным в диапазоне от примерно 40 до примерно 260 мг; соответственно данное количество будет выбранным в диапазоне от примерно 60 до примерно 240 мг; соответственно данное количество будет выбранным в диапазоне от примерно 80 до примерно 220 мг; соответственно данное количество будет выбранным в диапазоне от примерно 90 до примерно 210 мг; соответственно количество будет выбранным в диапазоне от примерно 100 до примерно 200 мг, соответственно данное количество будет выбранным в диапазоне от примерно 110 до примерно 190 мг, соответственно данное количество будет выбранным в диапазоне от примерно 120 до примерно 180 мг, соответственно данное количество будет выбранным в диапазоне от примерно 130 до примерно 170 мг, соответственно данное количество будет выбранным в диапазоне от примерно 140 до примерно 160 мг, соответственно данное количество будет составлять 150 мг. Согласно этому количество соединения А², вводимого в качестве части комбинации согласно настоящему изобретению, будет представлять собой некоторое количество, выбранное в диапазоне от примерно 10 до примерно 300 мг. Например, количество соединения А², вводимого в качестве части комбинации согласно настоящему изобретению, подходящим образом выбирают из 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295 и 300 мг. Соответственно выбранное количество соединения А² вводят от 1 до 4 раз в день. Соответственно выбранное количество соеди- 7 020965 нения А² вводят два раза в день. Соответственно выбранное количество соединения А² вводят один раз в день. Соответственно введение соединения А² будут начинать в виде нагрузочной дозы. Соответственно нагрузочная доза будет составлять количество, в 2-100 раз превышающее поддерживающую дозу; предпочтительно от 2 до 10 раз; предпочтительно от 2 до 5 раз; предпочтительно в 2 раза; предпочтительно в 3 раза; предпочтительно в 4 раза; предпочтительно в 5 раз. Соответственно нагрузочную дозу будут вводить в течение 1-7 дней; предпочтительно в течение 1-5 дней; предпочтительно в течение 1-3 дней; предпочтительно в течение 1 дня; предпочтительно в течение 2 дней; предпочтительно в течение 3 дней, за которыми последует протокол поддерживающего дозирования.

Соответственно количество соединения В², вводимого в качестве части комбинации согласно настоящему изобретению, будет представлять собой некоторое количество, выбранное в диапазоне от примерно 0,25 до примерно 75 мг; соответственно данное количество будет выбранным в диапазоне от примерно 0,5 до примерно 50 мг; соответственно данное количество будет выбранным в диапазоне от примерно 1 до примерно 25 мг; соответственно данное количество будет выбранным в диапазоне от примерно 2 до примерно 20 мг; соответственно данное количество будет выбранным в диапазоне от примерно 4 до примерно 16 мг; соответственно данное количество будет выбранным в диапазоне от примерно 6 до примерно 12 мг; соответственно данное количество будет составлять примерно 10 мг. Согласно этому количество соединения В², вводимого в качестве части комбинации согласно настоящему изобретению, будет представлять собой некоторое количество, выбранное в диапазоне от примерно 0,5 до примерно 50 мг. Например, количество соединения В², вводимого в качестве части комбинации согласно настоящему изобретению, может составлять 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 или 50 мг.

При использовании в настоящем документе все количества, приведенные для соединения А² и соединения В², указаны как вводимое количество свободного соединения или его несолевой и несольватированной формы, приходящееся на дозу.

Способ согласно настоящему изобретению можно также применять с другими терапевтическими способами лечения рака.

Хотя для применения в терапии фармацевтически эффективные количества комбинаций согласно настоящему изобретению можно вводить в виде сырьевых химикатов, предпочтительно представлять указанные комбинации в виде фармацевтической композиции или фармацевтических композиций. Согласно этому настоящее изобретение дополнительно предоставляет фармацевтические композиции, которые включают в себя соединение А² и/или соединение В² и один или более из фармацевтически приемлемых носителей. Комбинации согласно настоящему изобретению являются такими, как описано выше. Носитель(и) должен быть приемлемым в смысле совместимости с другими ингредиентами рецептуры, допустимыми к использованию в фармацевтическом препарате и не вредным для его реципиента. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предоставлен способ получения фармацевтического препарата, включающий в себя смешивание соединения А² и/или соединения В² с одним или более из фармацевтически приемлемых носителей. Как указано выше, такие элементы применяемой фармацевтической комбинации могут быть представлены в отдельных фармацевтических композициях или собраны в одном фармацевтическом препарате.

Фармацевтические препараты могут быть представлены в формах единичных доз, содержащих заданное количество активного ингредиента в единичной дозе. Как известно квалифицированным специалистам в данной области техники, количество активного ингредиента в дозе будет зависеть от конкретного патологического состояния, подвергаемого лечению, пути введения и возраста, массы и состояния пациента. Предпочтительными единичными дозированными препаратами являются такие препараты, которые содержат суточную дозу активного ингредиента или ее суб-дозу или некоторую подходящую часть. Кроме того, такие фармацевтические препараты можно получать любым из способов, хорошо известных в фармацевтической области.

Соединение А² и соединение В² можно вводить любым подходящим путем. К подходящим путям относятся пероральное, ректальное, интраназальное, наружное (включая буккальное и сублингвальное), вагинальное и парентеральное (включая подкожное, внутримышечное, внутривенное, внутрикожное, интратекальное и эпидуральное) введение. Следует понимать, что предпочтительность пути меняется, например, в зависимости от состояния реципиента комбинации и природы рака, лечение которого необходимо осуществлять. Следует также понимать, что каждый из вводимых агентов можно вводить одинаковыми или разными путями и что в фармацевтической композиции/препарате можно объединять соединение А² с соединением В².

Соединения или комбинации согласно настоящему изобретению включают в состав традиционных дозированных форм, таких как капсулы, таблетки или инъецируемые препараты. Применяют твердые или жидкие фармацевтические носители. Твердые носители включают в себя крахмал, лактозу, дигидрат сульфата кальция, каолин, сахарозу, тальк, желатин, агар, пектин, камедь акации, стеарат магния и стеариновую кислоту. Жидкие носители включают в себя сироп, арахисовое масло, оливковое масло, физиологический раствор соли и воду. Сходным образом, носитель может включать в себя материал, замедляющий высвобождение, такой как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат (один или с воском).

- 8 020965

Количество твердого носителя варьируют в широких пределах, но предпочтительно оно будет составлять от примерно 25 мг до примерно 1 г на дозированную единицу. Когда применяют жидкий носитель, препарат будет подходящим образом в форме сиропа, эликсира, эмульсии, мягкой желатиновой капсулы, стерильной инъецируемой жидкости, такой как ампула, или водной или неводной жидкой суспензии.

Например, для перорального введения в форме таблетки или капсулы активный лекарственный компонент можно комбинировать с пероральным нетоксичным фармацевтически приемлемым инертным носителем, таким как этанол, глицерин, вода и т.п. Порошки готовят, растирая соединение до подходящего тонкого размера и смешивая с фармацевтическим носителем, таким как съедобный углевод (как, например, крахмал или маннит), растертым таким же образом. Могут также присутствовать отдушки, консерванты, дисперсанты и окрашивающие средства.

Следует понимать, что в дополнение к вышеуказанным ингредиентам препараты могут включать в себя другие агенты, традиционные в данной области и относящиеся к рассматриваемому типу препарата (например, препараты для перорального введения могут включать в себя отдушки).

Как указано, терапевтически эффективные количества комбинаций согласно настоящему изобретению (соединение А² в комбинации с соединением В²) вводят человеку. Как правило, терапевтически эффективное количество вводимых веществ согласно настоящему изобретению будет зависеть от ряда факторов, включающих в себя, например, возраст и массу субъекта, конкретное состояние, требующее лечения, тяжесть этого состояния, природу лекарственной формы и путь введения. Окончательное суждение о терапевтически эффективном количестве будет выносить лечащий врач.

Комбинации согласно настоящему изобретению испытывают на эффективность, полезность и синергические свойства по известным процедурам. Соответственно комбинации согласно настоящему изобретению испытывают на эффективность, полезность и синергические свойства, применяя, как правило, следующую комбинацию клеточно-пролиферативных исследований. Клетки высевают в 96- или 384луночные планшеты в культуральных средах, соответствующих каждому клеточному типу, с добавлением 10% ΡΒδ и 1% пенициллина со стрептомицином и инкубируют в течение ночи при 37°С и 5% СО₂. Клетки обрабатывают в решетчатом порядке разбавлениями соединения А² (10 трехкратных разбавлений, начиная от 0,50-10 мкМ, включая среду без соединения), а также обрабатывают соединением В² (10 трехкратных разбавлений, начиная от 0,10-1,0 мкМ, включая среду без соединения) и инкубируют, как указано выше, в течение следующих 72 ч. В некоторых случаях соединения добавляют в шахматном порядке и время инкубации продлевают до 7 дней. Рост клеток измеряют, применяя реагент Се11Тйег-О1о® по протоколу изготовителя, а сигнал считывают на планшет-ридере РегкшЕ1тег Εηνίκίοη™ в флуоресцентном режиме с 0,5-секундной регистрацией. Анализ данных проводят, как описано ниже.

Результаты выражают в процентах от значения, зарегистрированного при 1=0, и представляют в виде графика зависимости от концентрации соединения. Значение при 1=0, нормализованное к 100%, представляет число клеток, присутствующих во время добавления испытуемого соединения. Клеточную реакцию определяют для каждого соединения и/или каждой комбинации соединений, используя кривые 4параметрической аппроксимации зависимости выживаемости клеток от концентрации, полученные с использованием приложения ΙΌΒδ ХЬй1 для программы Мюгокой Ехсе1, и определяя концентрацию, требующуюся для 50%-ного ингибирования роста клеток (§1С₅₀). Поправку на фон делают, вычитая значения, полученные для лунок, не содержавших клеток. Для каждой комбинации лекарственных средств рассчитывают комбинационный индекс (С1), превышение максимума единичного агента (ΕΟΗδΑ) и превышение по Блиссу (ΕΟΒΙίκκ), применяя известные методики, как описано у Сйои и Та1а1ау (1984) Αάνаηсе5 ίη Εη/уте Кедц1а1юп, 22, 37-55 и у ВегепЬаит, МС (1981) Αάν. Сапсег КекеагсЬ, 35, 269-335.

Поскольку комбинации согласно настоящему изобретению являются активными в вышеуказанных тестах, они тем самым демонстрируют терапевтические качества, полезные для лечения рака.

Соответственно настоящее изобретение относится к способу лечения или уменьшения тяжести формы рака, выбранной из группы, включающей в себя опухоли мозга (глиомы), глиобластомы, астроцитомы, мультиформную глиобластому, синдром Баннаяна-Зонана, болезнь Каудена, болезнь ЛермиттаДюкло, рак молочной железы, воспалительный рак молочной железы, опухоль Вильмса, саркому Юинга, рабдомиосаркому, эпендимому, медуллобластому, рак толстой кишки, рак головы и шеи, рак почки, рак легкого, рак печени, меланому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, саркому, остеосаркому, гигантоклеточную остеобластому, рак щитовидной железы, лимфобластный Тклеточный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, лейкоз ворсистых клеток, острый лимфобластный лейкоз, острый миелогенный лейкоз, хронический нейтрофильный лейкоз, острый лимфобластный Т-клеточный лейкоз, плазмоцитому, иммунобластный крупноклеточный лейкоз, лимфому из клеток мантийной зоны, множественную миелому, мегакариобластный лейкоз, острый мегакариоцитарный лейкоз, промиелоцитарный лейкоз, эритролейкоз, злокачественную лимфому, лимфому Ходжкина, не-ходжкинскую лимфому, лимфобластную Т-клеточную лимфому, лимфому Беркитта, фолликулярную лимфому, нейробластому, рак мочевого пузыря, рак уротелия, рак легкого, рак вульвы, рак шейки матки, рак эндометрия, рак почки, мезотелиому, рак пищевода, рак слюнной железы, гепатоцеллюлярный рак, рак желудка, носоглоточный рак, буккальный рак, рак полости рта,

- 9 020965

ΟΙδΤ (§35ΐΓθίηΙθ5ΐίηα1 к!гота1 (итог, желудочно-кишечную стромальную опухоль) и рак яичка.

Соответственно настоящее изобретение относится к способу лечения или уменьшения тяжести формы рака, выбранной из группы, включающей в себя опухоли мозга (глиомы), глиобластомы, синдром Баннаяна-Зонана, болезнь Каудена, болезнь Лермитта-Дюкло, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак головы и шеи, рак почки, рак легкого, рак печени, меланому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, саркому и рак щитовидной железы.

Соответственно настоящее изобретение относится к способу лечения или уменьшения тяжести формы рака, выбранной из группы, включающей в себя рак яичника, рак молочной железы, рак поджелудочной железы и рак предстательной железы.

Соответственно настоящее изобретение относится к способу лечения или уменьшения тяжести формы рака, выбранной из группы, включающей в себя рак легкого, рак поджелудочной железы и рак толстой кишки.

Соответственно настоящее изобретение относится к способу лечения или уменьшения тяжести рака, который относится либо к дикому типу, либо к мутанту определенного биологического маркера(ов).

Соответственно настоящее изобретение относится к способу лечения или уменьшения тяжести рака, который относится либо к дикому типу, либо к мутанту для Как и либо к дикому типу, либо к мутанту для Р13К/Р!еи. Это включает в себя пациентов с раком дикого типа как для Как, так и для ΡΙ3Κ/ΡΤΕΝ, как с мутантом для ΡΙ3Κ/ΡΤΕΝ, так и с мутантом для Как, а также с мутантом для ΡΙ3Κ/ΡΤΕΝ.

Термин дикий тип, как его понимают в данной области, относится к полипептидной или полинуклеотидной последовательности, которая встречается в нативной популяции без генетической модификации. Как также понимают в данной области, термин мутант включает в себя полипептидную или полинуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере одну модификацию аминокислоты или нуклеиновой кислоты по сравнению с соответствующей аминокислотой или нуклеиновой кислотой, найденной в полипептиде или полинуклеотиде дикого типа соответственно. В термин мутант включен и однонуклеотидный полиморфизм (δΝΡ), при котором существует различие в единственной паре оснований в последовательности цепи нуклеиновой кислоты по сравнению с последовательностью цепи нуклеиновой кислоты, найденной как наиболее преобладающая (дикий тип).

Формы рака, которые относятся либо к дикому типу, либо к мутанту для биологического маркера(ов) и либо к дикому типу, либо к мутанту для ΡI3Κ/Ρΐеη идентифицируют известными способами.

Например, опухолевые клетки дикого типа или мутанта Как/Как или ΡΙ3Κ/ΡΤΕΝ можно идентифицировать, используя технику амплифицирования и секвенирования ДНК, технику детектирования ДНК и РНК, включая, но не ограничиваясь ими, нозерн-блоттинг и саузерн-блоттинг соответственно и/или различные технологии с использованием биочипов и массивов. Полипептиды дикого типа и мутантные полипептиды можно детектировать разнообразными способами, включающими в себя, но не ограничивающимися ими, иммунодиагностические методики, такие как ΕΕΙδΆ, вестерн-блоттинг или иммуноцитохимию. Соответственно можно применять полимеризацию, активированную пирофосфоролизом (РАР), и/или методики с ПЦР; Ьш, Ц. е! а1., Нитап Ми!айои, 23:426-436 (2004).

Настоящее изобретение предоставляет комбинацию, включающую в себя ^{3-[5-(2-амино-4пиримидинил)-2-( 1,1 -диметилэтил)-1,3-тиазол-4-ил] -2-фторфенил}-2,6-дифторбензолсульфонамид или его фармацевтически приемлемые соль или сольват и 2,4-дифтор-Л-{2-(метилокси)-5-[4-(4пиридазинил)-6-хинолинил]-3-пиридинил}бензолсульфонамид или его фармацевтически приемлемую соль.

Настоящее изобретение также предоставляет комбинацию, включающую в себя ^{3-[5-(2-амино-4пиримидинил)-2-( 1,1 -диметилэтил)-1,3-тиазол-4-ил] -2-фторфенил}-2,6-дифторбензолсульфонамид или его фармацевтически приемлемые соль или сольват и 2,4-дифтор-Л-{2-(метилокси)-5-[4-(4пиридазинил)-6-хинолинил]-3-пиридинил}бензолсульфонамид или его фармацевтически приемлемую соль, для применения в терапии.

Настоящее изобретение также предоставляет комбинацию, включающую в себя И-{3-|5-(2-амино-4пиримидинил)-2-( 1,1 -диметилэтил)-1,3-тиазол-4-ил] -2-фторфенил}-2,6-дифторбензолсульфонамид или его фармацевтически приемлемые соль или сольват и 2,4-дифтор-Л-{2-(метилокси)-5-[4-(4пиридазинил)-6-хинолинил]-3-пиридинил}бензолсульфонамид или его фармацевтически приемлемую соль, для применения при лечении рака.

Настоящее изобретение также предоставляет фармацевтическую композицию, включающую в себя комбинацию ^{3-[5-(2-амино-4-пиримидинил)-2-(1,1-диметилэтил)-1,3-тиазол-4-ил]-2-фторфенил}-2,6дифторбензолсульфонамида или его фармацевтически приемлемых соли или сольвата и 2,4-дифтор-Л{2-(метилокси)-5-[4-(4-пиридазинил)-6-хинолинил]-3-пиридинил}бензолсульфонамида или его фармацевтически приемлемой соли.

Настоящее изобретение также предоставляет комбинированный набор, включающий в себя Ν-{3[5-(2-амино-4-пиримидинил)-2-(1,1-диметилэтил)-1,3-тиазол-4-ил]-2-фторфенил}-2,6-дифторбензолсульфонамид или его фармацевтически приемлемые соль или сольват и 2,4-дифтор-Л-{2-(метилокси)-5-[4-(4пиридазинил)-6-хинолинил]-3-пиридинил}бензолсульфонамид или его фармацевтически приемлемую соль.

- 10 020965

Настоящее изобретение также предоставляет применение комбинации, включающей в себя Ν-{3-[5(2-амино-4-пиримидинил)-2-( 1,1 -диметилэтил)-1,3-тиазол-4-ил] -2-фторфенил}-2,6-дифторбензолсульфонамид или его фармацевтически приемлемые соль или сольват и 2,4-дифтор-Ш{2-(метилокси)-5-[4-(4пиридазинил)-6-хинолинил]-3-пиридинил}бензолсульфонамид или его фармацевтически приемлемую соль, при изготовлении лекарственного средства.

Настоящее изобретение также предоставляет применение комбинации, включающей в себя Ν-{3-[5(2-амино-4-пиримидинил)-2-( 1,1 -диметилэтил)-1,3-тиазол-4-ил] -2-фторфенил}-2,6-дифторбензолсульфонамид или его фармацевтически приемлемые соль или сольват и 2,4-дифтор-Ш{2-(метилокси)-5-[4-(4пиридазинил)-6-хинолинил]-3-пиридинил}бензолсульфонамид или его фармацевтически приемлемую соль, при изготовлении лекарственного средства для лечения рака.

Настоящее изобретение также предоставляет способ лечения рака, который включает в себя введение комбинации Ш{3-[5-(2-амино-4-пиримидинил)-2-( 1,1 -диметилэтил)-1,3-тиазол-4-ил] -2-фторфенил}2,6-дифторбензолсульфонамида или его фармацевтически приемлемых соли или сольвата и 2,4-дифторШ{2-(метилокси)-5-[4-(4-пиридазинил)-6-хинолинил]-3-пиридинил}бензолсульфонамида или его фармацевтически приемлемой соли субъекту, нуждающемуся в этом.

Следующие примеры предназначены только для иллюстрации и не имеют целью какое бы то ни было ограничение объема настоящего изобретения.

Экспериментальные подробности.

Ш{3-[5-(2-Амино-4-пиримидинил)-2-(1,1-диметилэтил)-1,3-тиазол-4-ил]-2-фторфенил}-2,6-дифторбензолсульфонамид (соединение А) раскрыт и заявлен вместе с его фармацевтически приемлемыми солями, как применимый в качестве ингибитора активности В-КаР, в частности, при лечении рака, в международной заявке на патент № РСТ/и§2009/042682 (где соединение А представляет собой соединение примера 58), имеющей международную дату подачи 4 мая 2009 г., номер международной публикации \УО 2009/137391 и дату международной публикации \УО 2009/137391, полное раскрытие которой включено в настоящий документ посредством ссылки. Соединение А можно получать, как описано в международной заявке на патент № РСТ/и§2009/042682.

Ингибиторы Р13К, которые подходят для применения в комбинации согласно настоящему изобретению, в частности 2,4-дифтор-Ш{2-(метилокси)-5-[4-(4-пиридазинил)-6-хинолинил]-3пиридинил} бензолсульфонамид

можно получать согласно международной публикации патента № \УО08/144463 (пример 345).

Исследование #1. Ингибирование клеточного роста ίη νίίτο и индукция апоптоза соединением А, соединением В и их комбинацией в линиях опухолевых клеток.

Линии клеток рака толстой кишки.

Экспериментальный(е) препарат(ы).

Комбинированные фармакологические испытания с соединениями А и В проводили, используя набор клеточных линий различных форм рака толстого кишечника человека (η=25) (табл. 1). Клетки указанных линий приобретали коммерчески [от АТСС (Манатах, УА, υδΑ) или ΌδΜΖ (ВгашъЛнусщ. Оегтапу)] и выращивали в КРМ1-1640 с добавлением 2 мМ глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 10% эмбриональной телячьей сыворотки при 37°С и 5% СО₂ во влажном инкубаторе.

Экспериментальные протоколы.

Испытание лекарственных средств при постоянном соотношении

Схему разбавления при испытании лекарственных средств, проводимом при их постоянном соотношении, можно видеть на чертеже. Сначала готовили 10 мМ запасные растворы испытуемых соединений в 100%-ном диметилсульфоксиде (ΌΜδΟ). Дальнейшие разбавления соединений выполняли с ΌΜδΟ. Первое испытуемое соединение (обозначенное как соединение А) разбавляют горизонтально в 96-луночном микротитровальном планшете в рядах В-Е, используя 3-кратное серийное разбавление для 10 разбавляемых точек. Второе испытуемое соединение (обозначенное как соединение В) разбавляют горизонтально в отдельном 96-луночном микротитровальном планшете в рядах Ό-О, используя 3кратное серийное разбавление для 10 разбавляемых точек. Эти два соединения комбинируют в клеточных культуральных средах, используя равные объемы из каждого планшета. Результатом этого является 50-кратное разбавление лекарственных средств в клеточных культуральных средах. Соединение А индивидуально титруют в рядах В и С, тогда как в рядах Р и О на этом планшете дозируют только соединение В. Перед добавлением к клеткам лекарственные средства дополнительно разбавляют 1:10 в клеточных культуральных средах. Результатом добавления лекарственных средств к клеткам является дальнейшее двукратное разбавление лекарственных средств. Общее разбавление лекарственного средства на планшете при добавлении к клеткам составляет 1:1000. Диапазон конечных дозируемых концентраций для соединения В составлял 0,1-1000,0 нМ, а для соединения А - 0,5-10000,0 нМ. Положительный контроль состоит из культуральных сред с 0,1% ΌΜδΟ и клеток без лекарственного средства. Отрицательный кон- 11 020965 троль состоит из раствора культуральных сред с 0,1% ΌΜδΟ.

Исследования проводили в 96-луночных микротитровальных планшетах с необходимой плотностью посева, определенной в предварительных исследованиях для каждой линии клеток. После дозирования линии клеток инкубируют при 37°С и 5% СО₂ во влажном воздухе течение 72 ч. Пролиферацию клеток измеряли, используя реагент Се11ТИег С1о (Рготеда Согрогайои, МаШзои, ^1, υδΑ) согласно протоколу изготовителя. Планшеты обрабатывают раствором Се11ТПег С1о и записывают КЬи (относительные световые единицы), используя планшет-ридер Мо1еси1аг Эе\1сез 5рее1гаМа.\ М5 (5иппууа1е. СА, υδΑ).

Анализ данных.

Результаты выражают в процентах от числа клеток, присутствующих во время добавления соединения (Т₀), и строят график зависимости от концентрации соединения (одного или более). Значения процента интенсивности использовали в модели 205 приложения ΙΌΒδ ХЬй! для Мюгозой Е\се1 для расчета значений д1С₅₀ с применением 4-параметрической логистической аппроксимации. Поправку на фон делали, вычитая значения, полученные для лунок, не содержавших клеток. Средняя точка окна роста (д1С₅₀) попадает на середину интервала между числом клеток во время добавления соединения и ростом контрольных клеток, обработанных ΌΜδΘ в 72 ч. Число клеток в нулевое время делят на значение интенсивности в минимуме кривой ответа (У_тт), генерируя меру для гибели клеток (У_тт/Т₀). Значение Х_тт/Т₀, меньшее единицы, указывает на более сильный эффект обработки по сравнению с более высокими значениями. Все результаты измерений ответа, полученные в парных анализах, представляли в усредненном виде.

Для анализа комбинаторных эффектов использовали три независимых результата измерений ингибирования роста, вызываемого соединением В и соединением А.

Анализ данных.

Для анализа комбинаторных эффектов использовали три независимых результата измерений ингибирования роста, обусловленного соединением В и соединением А.

1. Превышение максимума единичного агента (ΕΟΗδΑ). Одним из стандартных критериев для измерения комбинаторных эффектов лекарственных средств является анализ влияния этих эффектов на ингибирование клеточного роста в абсолютных единицах. В этом случае комбинацию лекарственных средств сравнивают с более действенным из двух индивидуальных способов обработки (единичный агент). Для каждой дозы на кривой в эксперименте с каждой комбинацией определяют эффект в процентах от максимального эффекта, получаемого при применении единичного агента. Эта мера превышения максимума единичного агента (ΕΟΗδΑ) представляет собой один из критериев, применяемых для оценки синергизма в комбинации лекарственных средств (Войзу А.А., ЕШой Р.Р, Нигз! Ν.^., Ьее Μ.δ., ЬеЬаг 1., Рйсе Е.Й., δе^Ъебζ^^а С., 2иптегтапп С.Й., Ро1еу Μ.Α., δЮск\γе11 В.Й., КейЬ С.Т. δуз1ета1^с Шзсоуегу ой тиШсотроиеи! Шегареийсз, Ргос №11 Αсаб δ^ υδΑ, 2003, йт 24, 100 (13): 7977-82).

2. Синергизм по Блиссу. Второй критерий, часто применяемый для определения синергизма комбинации, представляет собой оценку превышения ингибирования над независимостью по Блиссу или над аддитивностью (Вйзз, С.1., Μе\^со. Ό.Ρ., ТЬе То\юйу ой Ро1зоиз Αρρ^ά 1ош11у. Αηиа1з ой Αρρ^ά Вю1оду, 1939, Уо1. 26, 1ззие 3, Αидиз1, 1939). Данная модель предполагает наличие комбинированного ответа двух соединений, независимо используя следующее уравнение:

где Е_а представляет собой эффект (или процент ингибирования) соединения А, а Е_Ъ представляет собой эффект соединения В. Конечный эффект комбинации двух соединений сравнивают с их предсказываемой аддитивностью по Блиссу и рассчитывают итоговый синергизм для каждой дозы на кривой ответа.

3. Комбинационный индекс (С1). Третьим критерием для оценки синергизма является комбинационный индекс (С1), рассчитываемый по способу СЬои и Та1а1ау (СЬои Т.С., Та1а1ау Р. ЦиаиЫаЬуе апа1уз1з ой бозе-еГГес! ге1а1юизЫрз: 1Ье сотЪшеб ейес1з ой ти1Ьр1е бгидз ог еп/уте 1п1йЪйогз„ Αάν Еп/уте Кеди1, 1984, 22: 27-55). Следующее уравнение представляет собой модель, применяемую для соединений, которые имеют разные механизмы действия (взаимно неисключительная формула) „ , „ . ОЗпа.Ь (θ.ϊηα:ύϊθ3ηα:1))

Комбинационный индекс =— -+ —-+4—»)

Чем меньше С1, тем большим синергизмом потенциально обладает комбинация. С1, превышающий единицу, предполагает, что комбинация может быть антагонистичной. Значения С1 рассчитывают и для концентраций, соответствующих 25%-ному и 75%-ному ингибированию (1С₂₅ и 1С₇₅ соответственно), заменяя в вышеуказанной формуле значение 1С₅₀ для каждого соединения соответствующей ингибирующей концентрацией.

Значения процента интенсивности использовали в модели 205 приложения ХЬй! для Μ^с^озоГ1 Е\се1 для расчета значений д1С₅₀ с применением 4-параметрической логистической аппроксимации. Средняя точка окна роста (д1С₅₀) попадает на середину интервала между числом клеток во время добавления соединения и ростом контрольных клеток, обработанных ΌΜδΟ в 72 ч. Число клеток в нулевое время (Т₀)

- 12 020965 делят на значение интенсивности в минимуме кривой ответа (Ущт), генерируя меру для гибели клеток (¥_т1п/То).

Значение У_т1п/Т₀, меньшее единицы, указывает на более сильный эффект обработки по сравнению с более высокими значениями.

Для ΕΟΗδΆ и анализа по Блиссу итоговый синергизм должен быть виден в обоих технических повторениях, выполненных в эксперименте, и представлен соответствующими обозначениями (синергизм, умеренный синергизм и т.п.). Эксперимент для каждой комбинации включает в себя по паре измерений (технических дубликатов), выполняемых отдельно для каждого из соединений (как единичных агентов) и для их комбинации.

Значения итогового синергизма для ΕΟΗ8Ά и анализа по Блиссу при крайне низких концентрациях (например, дозы 1, 2) подвержены большим вариациям и их обычно исключают из анализа. С другой стороны, значения итогового синергизма при самых высоких концентрациях (доза 10), находящихся далеко за пределами диапазона терапевтических доз, обычно исключают из анализа по причине того, что наблюдаемые эффекты являются более подверженными к посторонним отклонениям.

Для изменений синергизма по ΕΟΗ8Ά и Блиссу итоговые значения определяют для каждой дозы на кривой ответа. Их относят к категориям Антагонизм (<-10), Аддитивность (от -10 до 10), Умеренный синергизм (от 10 до 20) и Синергизм (>20). В зависимости от интерпретируемой модели эти значения отражают процент превышения максимально эффективного агента или процент превышения аддитивности по Блиссу.

Для комбинационного индекса характерно, что чем меньше С1, тем большим синергизмом потенциально обладает комбинация. Значения от 0 до 0,7 считают синергичными, тогда как значения от 0,7 до 0,9 рассматривают как умеренно синергичные. Все остальные значения комбинационного индекса не свидетельствуют о наличии синергизма.

Для тех клеточных линий, с которыми не была достигнута концентрация 25%-ного ингибирования, вызываемого одним из соединений в комбинации, значение С1 рассчитать невозможно, и для С1 сделана пометка недоступно.

Данные о мутациях в клеточных линиях.

Данные о точечных мутациях сопоставляли по статусу для генов ККА8, ВКАЕ, Р1К3СА и ΡΤΕΝ. Источником данных являются данные скрининга мутаций в линиях опухолевых клеток, опубликованных как соотсветствующая часть в Са!а1од оГ 8отайс Ми1айоп8 ίη Сапсег Да1аЬа5е (СО8М1С) (ВатГогД 8. с1 а1. Вг. 1. Сапсег., 2004, 91:355-58). Для того чтобы убедиться в том, что идентичность клеточных линий, использованных в исследовании пролиферации, соответствовала сведениям из базы данных СО8М1С, выполняли сравнение генотипа между клеточными линиями в скрининге и в базе СО8М1С. Конкретно, это заключалось в следующем:

1) расчет генотипа для каждой клеточной линии с использованием ЛГГу1пс1п.\ 500К '8ΝΡ СЫр' (АГГуте1п.\. 1пс., 8иппууа1е, СА) и алгоритма КЕММ (КаЬЬее & 8рееД, ВютГоппайсх. 2006, 22: 7-12);

2) идентификация совпадений генотипа каждой клеточной линии с генотипом, рассчитанным предварительно для каждой клеточной линии, имеющей мутационный профиль, указанный в СО8М1С;

3) присваивание мутационного статуса для каждой клеточной линии на основании совпадений генотипов.

Результаты

Все гены в подгруппе клеточных линий были мутированными. Генные мутации ККА8 были найдены в 60% (15/25) образцов, тогда как Р1К3СА был мутированным в 40% (10/25), ВКАЕ - в 20% (5/25), а ΡΤΕΝ - в 4% (1/25) клеточных линий (найденные данные представлены в табл. 1).

Для каждой клеточной линии, обработанной комбинацией соединения В (ингибитор Р13К) и соединения А (ингибитор ВКАЕ) проведено комплексное определение принадлежности к категориям степени синергизма. Следует отметить, что клеточная линия 8А1116 была исключена из анализов вследствие низкого качества данных. Клеточные линии рассматривали как обладающие синергизмом, когда по меньшей мере одно измерение было оценено как синергичное. Согласно этому критерию 54% (13/24) клеточных линий показывали синергизм. Отношения У_т1п/Т₀, где значения, меньшие единицы, показывают более высокую степень общей гибели клеток по сравнению с более высокими значениями, были пониженными в 79% (19/24) клеточных линий по сравнению с наиболее цитотоксичным единичным агентом. Комбинированное дозирование соединений А и В давало отношения У_т1п/Т₀, меньшие единицы, в 71% (17/24) клеточных линий. Данные о синергизме и цитотоксичности для линий раковых клеток толстого кишечника представлены в табл. 2.

- 13 020965

Таблица 1

Характеристики линий раковых клеток толстого кишечника, использованных в исследованиях комбинаций

Клеточная Д линия	Щагноэ/Гистология	ККАЗ	Р1КЗСА	ВЕАГ	РТЕЫ
НТ29	Карцинома	№Г	1345ΟΑ	1799Т>А	МТ
8М948	Аде нокарцинома	182А>Т	1624ОА	МГ	мт
Т84	Карцинома	38С>А	16240>А	МТ	мг
НСТ15	Аде но карцинома	38ОА	1633ОА	МТ	МТ
НСТ8	Аденокарцинома	38С>А	1бззе>А	МТ	МТ
ЦЫ11	Карцинома	38ОА	1633ОА	МТ	МТ
ЫС1Н508	Аденокарцинома	МТ	1бззе>А	1786ОС	мт
Ь8174Т	Аденокарцинома	3 5С>А	3140А>С	МТ	мт
нстиб	Карцинома	38<3>А	3140А>С	мт	мг
ЕКО	Карцинома	МТ	3140ΑΧ3	1799Т>А	мг
8Н1463	Карцинома	34С>Т	МТ	МТ	МТ
3Μ837	Адено карцинома	34ОТ	мт	МТ	мт
ЗИ1116	Карцинома	350>Т	мт	МТ	ИТ
8М480	Аденокарцинома	350>Т	мт	МТ	ИТ
ЗН40Э	Карцинома	3 5ОТ	мг	МТ	ИТ
ИС1Н747	Аденокарцинома	38ОА	мт	ИТ	ИТ
Ь21034	Аденокарцинома	436С>А	мг	мт	мт
НСС2998	Карцинома	436ОА	мг	мт	мт
НС1Н716	Аденокарцинома	МТ	мг	мт	мт
ЫС1Н630	Аденокарцинома	МТ	мг	мт	мт
КМ12	Аденокарцинома	МТ	мт	мт	800<Зе1А, 3850>Т
2М48	Аде нокарцинома	МТ	мг	мт	МТ
СОЬО320ПМ	Аденокарцинома	МТ	мт	мт	МТ
СО1Ю205	Аденокарцинома	МТ	мт	1799Т>А	мт
ЗМ1417	Аденокарцинома	МТ	мт	1799Т>А	мт

Ключ к табл. 1:

клеточная линия - наименование клеточной линии; диагноз/гистология - патологический диагноз ткани; ΚΚΑ8/ΒΚΑΡ/ΡΙΚ3ΟΑ/ΡΤΕΝ - мутационный статус; №Т - дикий тип.

- 14 020965

Результаты измерения основных параметров и категории синергизма для каждой из клеточных линий толстого кишечника

Таблица 2

Клеточная линия	Соединение А	Соединение В	Комбинация	Категория синергизма
?1С{о (нМ)	Увш/То	31С50 (нМ)		дю,, (нМ)	ΪΒ1»/Τθ	ВОНЗА	Блисс	Комб. индекс
СОБО205	7,3	1,2	12,0	1,4	2,7	<0,1	Умеренный	Нет синергизма	Синергизм
СОЬО320ЭМ	>10000	4,9	4,7	1, 5	8,2	1,2	Умеренный	Нет синергизма	Синергизм
ϋΙ,ΟΙ	198, б	6,7	20,5	1,8	66,4	1,1	Синергизм	Нет синергизма	Синергизм
НСС2998	2396,1	2,8	4,7	0, 9	19,3	0,7	Умеренный	Нет синергизма	Нет синергизма
НСТ116	>10000	9,2	34,2	4,1	94,2	1,3	Синергизм	Нет синергизма	Синергизм
НСТ15	>10000	6,1	7,2	2,4	48,9	1,3	Нет синергизма	Умеренный
НСТ8	>10000	9,2	8,4	1,6	42,9	1,3	Умеренный	Умеренный
НТ29	17,2	4, 0	7,4	2,0	4,0	0,8	Умеренный	Умеренный	Синергизм
КМ12	>10000	8,8	22,1	1,4	373,4	1,7	Нет синергизма	Нет синергизма
Б31034	>10000	1,9	1,4	0, 5	3,6	0,5	Умеренный	Нет синергизма
Б3174Т	>10000	7,0	34,1	0,8	332,9	0,8	Смешанный	Синергизм
ЫС1Н508	365, 6	2,1	1,2	0,5	4,2	0,4	Умеренный	Умеренный	Синергизм
ЫС1Н630	5000,0	1,9	18,3	0,9	2,4	0,7	Синергизм	Синергизм
ΝΟΙΗ716	>10000	1,3	1,1	0,7	0,1	0,5	Умеренный	Умеренный	Синергизм
ΝΟΙΗ747	>10000	1,3	2,7	0,5	0,2	0,2	Синергизм	Синергизм	Синергизм
ККО	8951,3	6,7	10,9	3,0	15,1	0,3	Синергизм	Синергизм
ЗМ1417	245, 6	1,1	1,4	1,3	0,6	0,6	Синергизм	Умеренный	Синергизм
5Ν1463	>10000	1,9	8,2	0,9	142,5	0,5	Умеренный	Синергизм
5М403	>10000	2,7	1,5	0,5	7,4	0,5	Нет синергизма	Нет синергизма
8М48	>10000	4,7	2,6	0,4	29,4	0,7	Умеренный	Умеренный
ЗМ480	>10000	2,9	5,4	1,1	93,5	1, 1	Синергизм	Умеренный
8И837	>10000	2,3	6,4	0,8	8,3	0,5	Умеренный	Умеренный
5И948	>10000	1,5	0,3	0,4	1,3	0,4	Нет синергизма	Нет синергизма
Т84	>10000	2,0	6,0	0,7	5004,7	0,6	Нет синергизма	Умеренный

Ключ к табл. 2:

клеточная линия - линия опухолевых клеток;

д1С50 - концентрация соединения (нМ), требующаяся для 50%-ного ингибирования роста;

У_тй1 - минимальный клеточный рост в присутствии соединения В (относительно контроля с ΌΜ8Θ), измеренный в процентах от значения при Т=0 (число клеток во время добавления соединения В). Отрицательное значение указывает общую утрату клеток относительно значения при Т=0. Утт/Т = значение Утт, поделенное на значение Т0, когда Утт определяют по кривой зависимости ответа от концентрации, а значение Т0 представляет собой число клеток во время добавления соединения (измерение СТО).

ЕОН8А - определение степени превышения максимума единичного агента;

Блисс - определение синергизма по Блиссу; комб. индекс - значение комбинационного индекса.

Исследование № 2. Исследования ΐη νΐΐίο комбинации ингибиторов ВКАР (соединение А) и Р13К (соединение В) на линиях раковых клеток разного происхождения, кодирующих разные мутации в путях МАРК и АКТ/Р13К.

Эксперименты с комбинациями лекарственных средств проводили на 384-луночных планшетах. Клетки высевали в 384-луночные планшеты по 500 клеток на лунку в культуральных средах, подходящих для каждого типа клеток, с добавлением 10% РВ8 и 1% пенициллина/стрептомицина и инкубировали в течение ночи при 37°С, 5% СО2. Шестнадцать концентраций при 2-кратном разбавлении каждого лекарственного средства испытывали в виде матрицы на ингибирование клеточного роста. Концентрации, испытанные для ингибитора ВКАР (соединения А), составляли от 0,3 нМ до 10 мкМ, а для ингибитора Р13К (соединения В) - от 0,15 нМ до 5 мкМ. Клетки обрабатывали комбинацией соединений и инкубировали при 37°С в течение 72 ч. Рост клеток измеряли с использованием реагента СеИТйег-ОЬ® по протоколу изготовителя, сигналы считывали на планшет-ридере РегкшЕ1тег Εηνΐδΐοη™, настроенном в режиме люминесценции с 0,5-секундной регистрацией. Результаты выражены в процентах ингибирования по сравнению с клетками, обработанными ЭМ8О; поправку на фон делали, вычитая значения, полученные для лунок, не содержавших клеток.

Для целей настоящего исследования результаты измерений превышения максимума единичного агента (ЕОН8А) использовали для определения степени синергизма с каждым из соединений. Подробное

- 15 020965 описание расчетов ΕΟΗδΑ можно найти выше. В кратком изложении: реакцию (процент ингибирования по сравнению с необработанными образцами, нормализованный к средам без клеток) на воздействие соединения А при концентрации а (Ка) и реакцию на соединение В при концентрации Ь (К_Ь) сравнивают с реакцией на смесь соединений А и В при концентрациях а и Ь (К_аЬ) соответственно. Уравнение:

КаЬ>10% более высокого значения среди К_а и К_Ь = аддитивность,

КаЬ<-10% более высокого значения среди К_а и К_Ь = антагонизм.

Согласно этой формуле, если К_аЬ не менее чем на 10% превышает наибольшее значение между К_а и К_Ь, комбинацию лекарственных средств считают аддитивной. Если К_аЬ не менее чем на 10% является меньшим, чем наибольшее значение между К_а и К_Ь, комбинацию лекарственных средств считают антагонистичной. В этом случае аддитивные клеточные линии считают более синергичными, чем антагонистические клеточные линии.

Те сочетания в матрице 16x16, которые реагировали аддитивно на обработку комбинацией, были перенумерованы и сведены в табл. 3. В этой таблице авторы настоящего изобретения отметили серым цветом ту комбинацию на данной клеточной линии, которая представляется более удовлетворительной, более 20% испытанных комбинаций (51 комбинация из испытанных 256) показали аддитивность, определенную по значению, большему чем 10%-ное превышение максимума единичного агента (10% ΕΟΗδΑ).

Таблица 3

Комбинационный эффект ингибиторов ΡΙ3Κ и ВКАЕ на разных линиях раковых клеток

Происхождение	Клеточные ЛИНИН	МАРК	ΡΙ3Κ/ΡΤΕΗ	Число комбинаций лекарственных средств и БОНЗА	%> чем БОНЗА
Кожа	А375Р	ВЕАРУьииЕ	нт/нт	101	39
Толстая кишка	ЕКО	вкаёХ	Н1047Е/ИТ	126	49
Кожа	АЮЮ	ΒΕΑΡν600Ε	ИТ1 С1б5_*404<1е	68	27
Кожа	ЗК-МЕЬ-5	ΒΚΛΡ7ξτπΕ ΝΕΑ5012ν	ИТ/ίπο	110	43
Легкое	А-549	КЕАЗ0123	ИТ/ИТ	39	15
Толстая кишка	ЬоЦо	КЕАЗН12°	НТ/НТ	50	20
Толстая кишка	НСТ116	КЕА5о12°	Н1047Е/НТ	51	20
Кожа	ЗК-МЕЬ-2	ЫЕАЗаь1к	ИТ/ИТ	62	24

Легкое	Н1299	ЫЕАЗО1>1К	ИТ/ИТ	67	26
Саркома	НТ-1080	ЦЕА5°Ь1К	ИТ/ИТ	89	35
Молочная железа	ΜΌΑ-ΜΒ- 231	ΝΚΑ3061*	ИТ/ИТ	88	34

Эти данные демонстрируют, что комбинация ингибиторов ΡΙ3Κ и ВКАЕ является полезной для воздействия на многие линии раковых клеток разного происхождения независимо от мутационного статуса ключевых онкогенов в пределах путей МАРК или ΑΚΤ/ΡΙ3Κ, поскольку многие комбинации лекарственных средств (>20%) показали ингибирующую активность, большую чем 10%-ное превышение максимума единичного агента (ΕΘΗδΑ).

Исследование № 3. Ингибирование клеточного роста ίη νίίτο соединением А, соединением В и их комбинацией в линиях опухолевых клеток.

Методики.

Клеточные линии и условия роста.

Линию меланомы А375РЕ11 получали из А375 (АТСС). 12К5-1, 12К5-3, 12К8-1, 12К8-3, 16К5-2, 16К6-3 и 16К6-4 представляют собой моноклоны, произведенные из смешанных популяций клеток А375РЕ11, которые были отобраны для выращивания в присутствии соединения А до концентраций 1200 и 1600 нМ. Все линии культивировали в среде КРМ1 1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ΕΒδ).

Исследование ингибирования клеточного роста и анализ данных для комбинации.

Все клетки культивировали в течение не менее 72 ч перед посевом в планшеты. Клетки испытывали в 96-луночном планшете для культивирования тканей (ИИИС 13 6102) в среде КРМ1, содержащей 10% ΕΒδ для всех клеток, посеянных в количестве 1000 клеток на лунку. Примерно через 24 ч после посева

- 16 020965 клетки подвергали воздействию десятью трехкратными разбавлениями соединения или комбинации двух агентов при постоянном молярном отношении соединения А к соединению В, равном 1:10, в средах ΚΡΜΙ, содержащих 10% ΡΒδ. Клетки инкубировали в присутствии соединений в течение 3 дней. Уровни АТР определяли, добавляя Се11 ТПсг О1о® (Рготеда) по протоколу изготовителя. В кратком изложении: на каждый планшет добавляли Се11 ТНег О1о®, инкубировали в течение 30 мин, после чего считывали люминесцентный сигнал на планшет-ридере Брес1гаМах Ь с 0,5-секундным временем интегрирования.

Ингибирование клеточного роста оценивали после обработки соединением или комбинацией соединений в течение трех дней и сравнивая сигнал с клетками, обработанными растворителем (ΌΜδΟ). Клеточный рост рассчитывали относительно контрольных лунок, обработанных растворителем (ΌΜδΘ). Концентрацию соединения, которая ингибирует 50% контрольного клеточного роста (1С₅₀), интерполировали при у, равном 50% контроля с растворителем, используя нелинейную регрессию по уравнению у=(А+(В-А)/(1+(С/х)^ЛИ))), где А представляет собой минимальный ответ (у_тт), В представляет собой максимальный ответ (у_тах), С представляет собой точку перегиба кривой (ЕС₅₀), а Ό представляет собой коэффициент Хилла.

Влияние комбинаций на эффективность оценивали, используя комбинационный индекс (С1), который рассчитывали посредством обратной интерполяции значений 1С₅₀ и взаимно неисключительного уравнения, выведенного СНои и Та1а1ау (СНои Т.С., Та1а1ау Р. РиаиШаНуе аиа1ук1к ой боке-еГГес! ге1айоикЫрк: (Не сотЫиеб еГГес(к ой ти1йр1е бгидк ог еп/уте 1иЫЫ1ог5, Α6ν Εη/уте Кеди1, 1984, 22: 27-55.). Подробное описание С1 приведено выше. Как правило, значение С1 <0,9, между 0,9 и 1,1 или >1,1 указывает на синергизм, аддитивность и антагонизм соответственно. Обычно чем меньше значение С1, тем больше сила синергизма.

Комбинационные эффекты на величину реакции рассчитывали по превышению максимума единичного агента (ΕΟΗδΑ), основанному на концепции нелинейного смешивания, как подробно описано у Ре!егкоп и №\1ск (2007) и у Ре!егкоп (2010) [Ре!егкоп II, №\1ск δ.Ι 1 Кесер! δ^дηа1 Тгапкбис! Кек, 2007, 27 (2-3): 125-46, Ре1егкои 1. Ргоийегк ой Вюкаеисе δ2, 483-503, 2010]. Значения ΕΟΗδΑ определены как увеличение эффективности (в данном случае в виде разности процентных пунктов (рр!к)), произведенное комбинацией по сравнению с наилучшим единичным агентом, взятым на уровне той его дозы, в какой он присутствует в комбинации. Подробности расчета ΕΟΗδΑ можно найти выше. Для обработки единичным агентом и комбинацией клетки подвергали воздействию соединениями при фиксированном отношении доз, а кривые зависимости ответа от дозы аппроксимировали по экспериментальным данным и анализировали с использованием регрессионных моделей. Для получения статистического заключения о ΕΟΗδΑ при конкретных общих уровнях доз 1С₅₀ на кривой зависимости ответа от дозы определяли комбинацию доз (соответствующих 1С₅₀). Более конкретно, для эксперимента с комбинацией лекарственного средства 1 в дозе 61 и лекарственного средства 2 в дозе 62 (т.е. общая доза равняется 61+62) делается вывод о том, что имеется положительное ΕΟΗδΑ, если средний ответ при воздействии комбинации является лучшим, чем средний ответ при воздействии лекарственного средства 1 в дозе б1 или лекарственного средства 2 в дозе б2.

Результаты.

Эффект ингибирования клеточного роста ингибитором ΒΚΑΡ (соединением А) и ингибитором Р13К (соединением В) и их комбинацией определяли в группе линии клеток меланомы человека. Средние значения 1С₅₀ (по меньшей мере из двух независимых экспериментов) и эффекты комбинации компонентов, взятых при их 1С₅₀, сведены в табл. 4 вместе с мутационным статусом ΒΚΑΡ. Клетки Α375ΡΡ11 с мутацией ΒΚΑΡ ν600Ε были высоко чувствительными как к соединению А (1С₅₀=0,059 мкМ), так и к соединению В (1С₅₀=0,048 мкМ), взятым в виде единичных агентов. Комбинация соединения А и соединения В была синергичной, о чем свидетельствует значение С1, равное 0,74 в клетках Α375ΡΡ11. Семь клонов, резистентных к соединению Α (12К8-3, 12К8-1, 12К5-3, 16К5-2, 16К6-3, 16К6-4 и 12К5-1, произведенных из линий клеток меланомы Α375ΡΡ11), демонстрировали значения 1С₅₀ в диапазоне от 0,041 до 0,212 мкМ в ответ на одно соединение В и отвечали на комбинацию соединения А и соединения В значениями 1С₅₀ в диапазоне от 0,256-0,0,731 мкМ для соединения А и от 0,026 до 0,073 мкМ для соединения В. Комбинация соединения А и соединения В показывала повышение ингибирования клеточного роста в линиях меланомы со значениями ΕΟΗδΑ в диапазоне 3-34 рр!к.

- 17 020965

Ингибирование клеточного роста соединением А, соединением В и их комбинацией в линиях человеческих опухолевых клеток

Таблица 4

Линии опухолевых клеток	Мутационный статус	Значения Ю50 в мкМ (с	оеднее ± станд. откл.)	Комбинационный эффект при 1С50
Единичный агент	Комбинация соединений А и В при молярном отношении 10:1
ККАЗ/ВЕАР	Соединение А	Соединение В	Соединение А Соединение В	С1	ЕОНЗА (ррбз)
2 О X ЯЗ ч 01 2	А375РГ11	ΒΕΑΡ_ν600Ε	0,059±0,011	0,048±0,009	0,044±0,019	0,004±0,002	0,74±0,03	8±2
12К5-1	ΒΕΑΡ_ν600Ε	>10	0,212±0,038	0,643±0,227	0,064±0,023	Ν/Α	34±1
12К5-3	ΒΕΑΡ_ν600Ε	>10	0,088±0,002	0,505±0,085	0,050+0,009	Ν/Α	12±2
12Е8-1	ΒΒΑΡ_ν600Ε	>10	0,103±0,01б	0,680±0,182	0,068±0,018	Ν/Α	10±2
12К8-3	ВЕАР_У600Е	>10	0,129±0,024	0,б12±0,008	0,061±0,001	Ν/Α	23±4
16К5-2	ΒΕΑΡ_ν600Ε	>10	0,041±0,018	0,256±0,057	0,026±0,00б	Ν/Α	7±3
16К6-3	ΒΕΑΡ_ν600Ε	>10	0,080±0,017	0,731±0,204	0,073±0,020	Ν/Α	3±3
16К6-4	ΒΕΑΡ_ν600Ε	>10	0,0б1±0,010	0,408±0,031	0,041±0,003	Ν/Α	13±6

Ключ к табл. 4:

1С₅₀ - концентрация соединения в качестве единичного агента или концентрация соединения А или В в комбинации, когда молярное отношение соединение А к соединению В равно 10:1, которые снижают клеточный рост на 50%;

С1 - комбинационный индекс;

Ν/Α - неприменимо;

ЕОН8А - превышение максимума единичного агента, измеренное в процентах.

Пример 1. Композиция капсулы.

Пероральную дозированную форму для введения комбинации согласно настоящему изобретению производят, наполняя стандартную двухчастную твердую желатиновую капсулу ингредиентами в пропорциях, показанных ниже в табл. I.

Таблица I

Ингредиенты Количества

Ы-{3-[5-(2-амино-4-пиримидинил)-2-(1,1- 100 мг диметилэтил)-1,З-тиазол-4-ил]-2-фторфенил}-2,6дифторбензолсульфонамид (Соединение А)

2,4-дифтор-Ы-{2-(метилокси)-5-[4-(4-пиридазинил)-б- 10 мг хинолинил]-3-пиридинил}бензолсуль фонамид (Соединение В)

Маннит 250 мг

Тальк 50 мг

Стеарат магния 20 мг

Пример 2. Композиция капсулы.

Пероральную дозированную форму для введения одного из соединений согласно настоящему изобретению производят, наполняя стандартную двухчастную твердую желатиновую капсулу ингредиентами в пропорциях, показанных ниже в табл. II.

Т аблица II

ИНГРЕДИЕНТЫ КОЛИЧЕСТВА^-

N-{3-[5-(2-амино-4-пиримидинил)-2-(1,1- 100 мг диметилэтил)-1,З-тиазол-4-ил]-2-фторфенил}-2,6дифторбензолсульфонамид (Соединение А)

Маннит	200	МГ
Тальк	320	мг
Стеарат магния	80	мг

Пример 3. Композиция капсулы.

Пероральную дозированную форму для введения одного из соединений согласно настоящему изобретению производят, наполняя стандартную двухчастную твердую желатиновую капсулу ингредиентами в пропорциях, показанных ниже в табл. III.

- 18 020965

Таблица III

ИНГРЕДИЕНТЫ КОЛИЧЕСТВА

2,4-дифтор-Ы-{2-{метилокси)-5-[4-(4-пиридазинил)- 10 мг

6-хинолинил]-3-пиридинил}бензолсульфонамид (Соединение В)

Маннит 50 мг

Тальк 25 мг

Стеарат магния 2 мг

Пример 4. Композиция таблетки.

Сахарозу, микрокристаллическую целлюлозу и соединения комбинации согласно настоящему изобретению, как показано ниже в табл. IV, смешивают и гранулируют в указанных пропорциях с 10%-ным раствором желатина. Влажные гранулы просеивают, сушат, смешивают с крахмалом, тальком и стеариновой кислотой, после чего опять просеивают и прессуют в таблетки.

Таблица IV

ИНГРЕДИЕНТЫ КОЛИЧЕСТВА

Ν-{3-[5-(2-амино-4-пиримидинил)-2-(1,1- 100 мг диметилэтил)-1,3-тиазол-4-ил]-2-фторфенил)-2,6дифторбензолсульфонамид (Соединение А)

2,4-дифтор-Ы-{2-(метилокси)-5-[4-(4-пиридазинил)-б- 10 мг хинолинил]-3-пиридинил}бензолсульфонамид {Соединение В)

Микрокристаллическая целлюлоза	250	МГ
Сахароза	50	мг
Крахмал	50	мг
Тальк	20	мг
Стеариновая кислота	2	мг

Пример 5. Композиция таблетки.

Сахарозу, микрокристаллическую целлюлозу и одно из соединений комбинации согласно настоящему изобретению, как показано ниже в табл. V, смешивают и гранулируют в указанных пропорциях с 10%-ным раствором желатина. Влажные гранулы просеивают, сушат, смешивают с крахмалом, тальком и стеариновой кислотой, после чего опять просеивают и прессуют в таблетки.

Таблица V

ИНГРЕДИЕНТЫ КОЛИЧЕСТВА

N-{3-[5-(2-амино-4-пиримидинил)-2-(1,1- 100 мг диметилэтил)-1,З-тиазол-4-ил]-2-фторфенил}-2,бдифторбензолсульфонамид (Соединение А)

Микрокристаллическая целлюлоза	300	МГ
Сахароза	40	мг
Крахмал	20	мг
Тальк	10	мг
Стеариновая кислота	5	мг

Пример 6. Композиция таблетки.

Сахарозу, микрокристаллическую целлюлозу и одно из соединений комбинации согласно настоящему изобретению, как показано ниже в табл. V, смешивают и гранулируют в указанных пропорциях с 10%-ным раствором желатина. Влажные гранулы просеивают, сушат, смешивают с крахмалом, тальком и стеариновой кислотой, после чего опять просеивают и прессуют в таблетки.

- 19 020965

Таблица VI

ИНГРЕДИЕНТЫ КОЛИЧЕСТВА^-

2,4-дифтор-Ц-{2-(метилокси|-5-[4-(4-пиридазинил)-6- 10 мг хинолинил]-3-пиридинил)Сензолсульфонамид (Соединение В)

Микрокристаллическая целлюлоза 60 мг

Сахароза 5 мг

Крахмал 10 мг

Тальк 5 мг

Стеариновая кислота 2 мг

Хотя предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения проиллюстрированы выше, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается точными инструкциями, раскрытыми в настоящем документе, и что сохраняется право на все модификации, проводимые в пределах объема нижеследующих пунктов формулы изобретения.

Claims (20)

1. Комбинация, включающая:

(ί) первое соединение, представляющее собой И-{3-[5-(2-амино-4-пиримидинил)-2-(1,1диметилэтил)-1,3-тиазол-4-ил]-2-фторфенил}-2,6-дифторбензолсульфонамид структуры (I) или его фармацевтически приемлемые соль или сольват; и (ίί) второе соединение, представляющее собой 2,4-дифтор-И-{2-(метилокси)-5-[4-(4-пиридазинил)6-хинолинил]-3-пиридинил}бензолсульфонамид структуры (II) или его фармацевтически приемлемую соль.

2. Комбинация по п.1, где соединение структуры (I) находится в форме метансульфонатной соли, а соединение структуры (II) находится в форме свободного основания.

3. Комбинация по любому из пп.1 или 2, где количество соединения структуры (I) представляет собой количество, выбранное в диапазоне от 10 до 300 мг для введения от 1 до 4 раз в день, а количество соединения структуры (II) представляет собой количество, выбранное в диапазоне от 0,5 до 20 мг для введения один раз в день.

4. Комбинация по любому из пп.1-3, где указанное второе соединение находится в форме свободного основания.

5. Комбинация по любому из предшествующих пунктов для применения в терапии.

6. Комбинация по любому из пп.1-3 для применения при лечении рака.

7. Фармацевтическая композиция, включающая в себя комбинацию по любому из пп.1-3 вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

8. Применение комбинации по любому из пп.1-3 для изготовления лекарственного средства для лечения рака.

9. Комбинированный набор, включающий комбинацию по любому одному из пп.1-3 вместе с фармацевтически приемлемым носителем или фармацевтически приемлемыми носителями.

10. Способ лечения рака у человека, нуждающегося в этом, который включает введение ίη νίνο терапевтически эффективного количества комбинации И-{3-[5-(2-амино-4-пиримидинил)-2-(1,1диметилэтил)-1,3-тиазол-4-ил]-2-фторфенил}-2,6-дифторбензолсульфонамида или его фармацевтически приемлемой соли и 2,4-дифтор-И-{2-(метилокси)-5-[4-(4-пиридазинил)-6-хинолинил]-3-пириди- 20 020965 нил}бензолсульфонамида указанному человеку.

11. Способ по п.10, который включает введение ίη νίνο терапевтически эффективного количества комбинации метансульфонатной соли Ц-{3-[5-(2-амино-4-пиримидинил)-2-(1,1-диметилэтил)-1,3-тиазол4-ил]-2-фторфенил}-2,6-дифторбензолсульфонамида и 2,4-дифтор-Ц-{2-(метилокси)-5-[4-(4-пиридазинил)-6-хинолинил] -3 -пиридинил}бензолсульфонамид указанному человеку.

12. Способ по п.10, где количество Ц-{3-[5-(2-амино-4-пиримидинил)-2-(1,1-диметилэтил)-1,3тиазол-4-ил]-2-фторфенил}-2,6-дифторбензолсульфонамида или его фармацевтически приемлемой соли выбирают в диапазоне от примерно 10 до примерно 300 мг и это количество вводят от 1 до 3 раз в день, а количество 2,4-дифтор-Ц-{2-(метилокси)-5-[4-(4-пиридазинил)-6-хинолинил]-3-пиридинил}бензолсульфонамида выбирают в диапазоне от примерно 0,5 до примерно 10 мг.

13. Способ по п.10, где количество Ц-{3-[5-(2-амино-4-пиримидинил)-2-(1,1-диметилэтил)-1,3тиазол-4-ил]-2-фторфенил}-2,6-дифторбензолсульфонамида или его фармацевтически приемлемой соли выбирают в диапазоне от примерно 70 до примерно 260 мг и это количество вводят дважды в день, а количество 2,4-дифтор-Ц-{2-(метилокси)-5-[4-(4-пиридазинил)-6-хинолинил]-3-пиридинил}бензолсульфонамида выбирают в диапазоне от примерно 0,5 до примерно 6 мг.

14. Способ по п.10, где метансульфонатную соль Ц-{3-[5-(2-амино-4-пиримидинил)-2-(1,1диметилэтил)-1,3-тиазол-4-ил]-2-фторфенил}-2,6-дифторбензолсульфонамида и количество 2,4-дифторЦ-{2-(метилокси)-5-[4-(4-пиридазинил)-6-хинолинил]-3-пиридинил}бензолсульфонамида вводят в пределах 12 ч один после другого каждый день в течение периода, составляющего по меньшей мере 14 последовательных дней, за которыми следует, необязательно, один или более повторных циклов.

15. Способ по п.12, где Ц-{3-[5-(2-амино-4-пиримидинил)-2-(1,1-диметилэтил)-1,3-тиазол-4-ил]-2фторфенил}-2,6-дифторбензолсульфонамид или его фармацевтически приемлемую соль и 2,4-дифтор-Ц{2-(метилокси)-5-[4-(4-пиридазинил)-6-хинолинил]-3-пиридинил}бензолсульфонамид вводят в пределах 12 ч один после другого каждый день в течение периода, составляющего по меньшей мере 7 последовательных дней, за которыми следует, необязательно, один или более повторных циклов.

16. Способ по п.12 или 13, где указанный рак представляет собой меланому, рак легкого, поджелудочной железы, молочной железы или толстой кишки.

17. Способ лечения рака у человека, нуждающегося в этом, который включает один или более повторяющихся циклов дозирования, где каждый указанный цикл включает в себя введение человеку примерно от 10 до 300 мг Ц-{3-[5-(2-амино-4-пиримидинил)-2-(1,1-диметилэтил)-1,3-тиазол-4-ил]-2фторфенил}-2,6-дифторбензолсульфонамида или его фармацевтически приемлемых соли или сольвата от 1 до 4 раз в день в течение 5-14 дней, за которыми следует введение человеку примерно от 0,5 до 10 мг 2,4-дифтор-Ц-{2-(метилокси)-5-[4-(4-пиридазинил)-6-хинолинил]-3-пиридинил}бензолсульфонамида или фармацевтически приемлемых соли или сольвата в течение 5-14 дней.

18. Способ лечения рака у человека, нуждающегося в этом, который включает один или более повторяющихся циклов дозирования, где каждый указанный цикл включает в себя введение человеку примерно от 70 до 260 мг Ц-{3-[5-(2-амино-4-пиримидинил)-2-(1,1-диметилэтил)-1,3-тиазол-4-ил]-2фторфенил}-2,6-дифторбензолсульфонамида или его фармацевтически приемлемых соли или сольвата 12 раза в день в течение 5-14 дней, за которыми следует введение человеку примерно от 0,5 до 5 мг 2,4дифтор-Ц-{2-(метилокси)-5-[4-(4-пиридазинил)-6-хинолинил]-3-пиридинил}бензолсульфонамида или фармацевтически приемлемых соли или сольвата в течение 5-14 дней.

19. Способ по любому из пп.17 или 18, где указанный рак представляет собой меланому или рак толстой кишки.

20. Способ по п.18, где указанный рак представляет собой мутант ВКАР.