CN102665720A

CN102665720A - 组合

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Publication number: CN102665720A
Application number: CN2010800564396A
Authority: CN
Inventors: K.奥格; K.E.巴克曼; J.D.格雷肖克; T.吉尔默; S.拉克雷; S.R.莫里斯
Original assignee: ViiV Healthcare Co
Current assignee: ViiV Healthcare Co
Priority date: 2009-10-12
Filing date: 2010-10-12
Publication date: 2012-09-12
Also published as: AU2010307043A1; CA2777561A1; EA201270537A1; EA020965B1; ZA201202416B; JP2013507442A; WO2011046894A1; MX2012004259A; EP2488184A1; US20120202822A1; AU2010307043C1; AU2010307043B2; BR112012008519A2; IL219103A0; KR20120097496A; EP2488184A4

Abstract

本发明涉及治疗哺乳动物中癌症的方法，以及涉及用于这种治疗的药物组合。具体地，该方法涉及包括MEK抑制剂：N-{3-[3-环丙基-5-(2-氟-4-碘-苯基氨基)6,8-二甲基-2,4,7-三氧代-3,4,6,7-四氢-2H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-1-基]苯基}乙酰胺或其可药用盐或溶剂化物，和PI3激酶抑制剂：2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺或其可药用盐的新组合，包括该组合的药物组合物，以及使用该组合治疗癌症的方法。

Description

组合

技术领域

本发明涉及治疗哺乳动物中癌症的方法，以及涉及用于这种治疗的组合。具体地，该方法涉及包括B-Raf抑制剂：N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺或其可药用盐或溶剂化物，以及PI3K抑制剂：2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺或其可药用盐的组合，含有该组合的药物组合物，以及在治疗癌症中使用该组合的方法。

发明背景

对过度增殖疾病包括癌症的有效治疗一直是肿瘤学领域的目标。一般而言，癌症从控制细胞***、分化和细胞凋亡的正常过程中的失调而产生。凋亡(程序性细胞死亡)在胚胎发育和各种疾病的发病机制中起重要作用，所述疾病如变性神经元疾病(degenerative neuronal diseases)、心血管疾病和癌症。一种最常见的涉及激酶调节凋亡的研究途径是从细胞表面生长因子受体向细胞核的细胞信号传导(Crews and Erikson,Cell,74:215-17,1993)。

酶的一个重要的大家族是蛋白激酶家族。目前，存在约500种不同的已知的蛋白激酶。蛋白激酶起到催化不同的蛋白质中氨基酸侧链磷酸化的作用，其是通过向所述氨基酸侧链转移ATP-Mg²⁺复合物的γ-磷酸盐来进行催化。这些酶控制细胞内部中的大量的信号处理，从而通过蛋白质中的丝氨酸、苏氨酸以及酪氨酸残基的羟基的反向磷酸化控制细胞功能、生长、分化以及破坏(凋亡)。研究证明蛋白激酶是多种细胞功能的关键调节剂，所述细胞功能包括信号转导、转录调节、细胞运动、以及细胞***。已经显示一些致癌基因编码蛋白激酶，表明激酶在肿瘤生成过程中起重要作用。这些过程是高度调节的，通常通过复杂的互相结合的途径来调节，其中每个激酶本身受到一种或多种激酶调节。因此，异常的或不适当的蛋白激酶活性可能会导致与此类异常激酶活性相关的疾病状态的增加，所述疾病包括良性和恶性的增殖性病症，以及由免疫和神经***不适当激活导致的疾病。由于它们的生理学关联性、多样性以及普遍性，蛋白激酶已经变成了最重要的和在生物化学和医学研究中得到广泛研究的一类酶。

酶的蛋白激酶家族通常被分成两个主要的亚族：蛋白酪氨酸激酶和蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶，基于它们磷酸化氨基酸残基来分类。蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶(PSTK)包括环AMP-和环GMP-依赖性蛋白激酶、钙和磷脂依赖性蛋白激酶、钙-和钙调蛋白依赖性蛋白激酶、酪蛋白激酶、细胞***周期蛋白激酶等。这些激酶通常是细胞质的或与细胞的颗粒部分关联，可能是通过锚定蛋白关联。异常的蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性涉及或有可能涉及大量病理学问题，例如类风湿性关节炎、银屑病、感染性休克、骨丢失、多种癌症以及其它增殖性疾病。因此，丝氨酸/苏氨酸激酶和它们是其中的一部分的信号转导途径是药物设计的重要靶标。酪氨酸激酶磷酸化酪氨酸残基。在细胞调节中，酪氨酸激酶起到相当重要的作用。这些激酶包括分子(诸如生长因子以及激素)的一些受体，包括表皮生长因子受体、胰岛素受体、血小板衍生生长因子受体等。研究已经显示多种酪氨酸激酶是跨膜蛋白质，并且它们的受体域位于细胞外表面以及它们的激酶域在内部。还在进行大量的工作以识别酪氨酸激酶的调节因子(modulator)。

促细胞***剂-活化的蛋白质激酶(MAPK)/细胞外信号调节激酶(ERK)激酶(下文称为MEK)已知与大量细胞过程的调节相关。Raf家族(B-Raf，C-Raf等)激活MEK家族(MEK-1,MEK-2等)和MEK家族激活ERK家族(ERK-1和ERK-2)。广泛来说，RAF/MEK/ERK途径的信号传导活化控制mRNA转移。这包括与细胞周期相关的基因。因此，该途径的过度活化会引起不受控制的细胞增殖。由ERK过度活化造成的RAF/MEK/ERK途径的失调在所有人恶性肿瘤中约30%被发现(Allen,LF,et al.Semin.Oncol.2003.30(5 Suppl 16):105-16)。活化的BRAF突变型已经在特定的肿瘤类型(例如黑素瘤)中被高频率鉴定出来(Davies,H.et al.Nature.2002.417:949-54)。在人类癌症中出现的所有确定的BRAF的突变型中的约90%是外显子15中的T1799颠换突变型，其导致V600E/D/K(T1799A)氨基酸取代(Wellbrock,C.等人，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004.5:875-85；Wan,PT et al.Cell.2004.116:855-67)。该突变型可能会拟态调节磷酸化并且与野生型相比增加BRAF活性约10倍(Davies,H.等人，Nature.2002.417：949-54)。这类激活突变型频率以及途径依赖使突变型的BRAF成为极其受关注的靶标。

磷酸肌醇3-激酶(PI3K)途径在人癌症中是一种最常见的活化途径。对该途径在肿瘤发生和肿瘤进展中的功能和重要性已经有很好的了解(Samuels& Ericson.Curr.Opp in Oncology,2006.18:77-82)。PI3K-AKT信号转导可能是细胞存活、增殖和代谢的非常重要的调节器。这包括雷帕霉素哺乳动物靶标(mTOR)的激活，其是PI3K蛋白质家族成员以及细胞生长和翻译的直接调节剂。因此，肿瘤中PI3K/AKT/mTOR信号传导的失调有助于显示大量的恶性肿瘤标志的细胞表型，其包括不受限的繁殖潜能和逃避凋亡(Hanahan &Weinberg,Cell.2000.100:57-70)。

PI3K家族由15个蛋白质构成，这15个蛋白质具有序列同源性，特别是在激酶结构域内；然而，它们具有不同的底物特异性以及调节模式(Vivanco& Sawyers.Nat.Rev.Cancer,2002.2:489-501)。含I类PI3-激酶磷酸化的肌醇的脂质，已知为在3位为磷脂酰肌醇(PtdIns)。通过这些激酶将I类家族成员的一级底物，PtdIns-4,5-P2(PIP2)，转化为PtdIns-3,4,5-P3(PIP3)。PIP3是重要的第二信使，其将含有普列克底物蛋白(pleckstrin)同源性结构域的蛋白质募集至细胞膜，它们在此处被活化。这些蛋白中研究最多的是促进细胞存活、生长和增殖的AKT。基于激活，AKT移动到细胞质和细胞核，并在此其磷酸化大量基质，包括mTOR(TORC1)。除了AKT，PI3K激活其它途径，其它途径涉及致癌作用诸如PDK1、CDC42和RAC1(Samuels & Ericson.Curr.Opp in Oncology,2006.18:77-82)。

在对人类肿瘤的研究中，可以通过不同的机理出现PI3K/AKT/mTOR信号转导途径的激活。该途径的基因失调是常见的并且以多种方式出现(在Samuels & Ericson.Curr.Opp in Oncology,2006.18:77-82中综述)。PIK3CA基因(编码PI3K的p110α催化亚基)的激活突变型在大量人类肿瘤中出现，所述肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌和结肠直肠癌。该基因的激活DNA扩增在一些不同的肿瘤类型中出现的频率较低。在PI3K的p85α调节亚基(PIK3R1)上的突变，认为其会中断PIK3R1和PIK3CA之间的C2-iSH2相互作用，出现在卵巢癌、恶性胶质瘤以及结肠直肠癌中。肿瘤抑制剂PTEN通常被突变、缺失或后生沉默(epigenetically silenced)，该肿瘤抑制剂使PIP3去磷酸化从而产生PIP2，由此其可以作为PI3K途径的抑制剂。最终，可以通过DNA扩增或AKT的突变来从遗传学上从PI3K的下游激活该途径；但是这些基因事件在人类癌肿中出现的频率很低。已知抑制PI3K亚型，尤其是PI3Kα对于治疗癌症是有用的(参见例如WO 05/121142、WO 08/144463、WO 08/144464、WO 07/136940)。

有用的是提供一种新的，单一或组合疗法，该疗法向受癌症作用的个体提供更有效的和/或增强的治疗。

发明内容

本发明的一个实施方案提供了一种组合，其含有：

(i)结构(I)的化合物：

N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺(以下称为化合物A)，或其可药用盐；以及

(ii)结构(II)的化合物：

2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺(以下称为化合物B)或其可药用盐。

本发明的一个实施方案提供治疗需要的人中癌症的方法，其包括向该人体内给药治疗有效量的化合物A或其可药用盐或溶剂化物和化合物B或其可药用盐的组合。

本发明的一个实施方案提供治疗需要的人中癌症的方法，其包括向该人体内给药治疗有效量的化合物A或其可药用盐或溶剂化物和化合物B或其可药用盐的组合，

其中所述组合在规定的期间内给药，和

其中所述组合给药一段持续时间。

其中，顺序给药化合物A和B。

发明详述

本发明涉及显示抗增殖活性的组合。适当地，该方法涉及通过共同给药下列化合物治疗癌症的方法：N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺(化合物A)或其可药用盐或溶剂化物，适当地为其二甲基亚砜溶剂化物，该化合物由结构I表示：

和2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺(化合物B)或其可药用盐；该化合物由下述结构表示：

在国际申请PCT/US2009/042682号(国际申请日2009年5月4日；国际公开WO 2009/137391号以及WO 2009/137391的国际公开日)中公开并要求保护的化合物A及其可药用盐，它们特别在癌症治疗中用作B-Raf活性的抑制剂，该文献的全文公开在此引入作为参考，化合物A为实施例58的化合物。化合物A可以根据国际申请PCT/US2009/042682号中的说明制备。

合适地，化合物A为甲磺酸盐的形式。本领域技术人员可以根据国际申请PCT/US2009/042682(国际申请日2009年5月4日)号中的说明制备该盐形式。

在国际申请PCT/US2008/063819号(国际申请日2008年5月16日；国际公开号WO 2008/1444463，以及国际公开日2008年11月27日)中公开并要求保护的化合物B及其可药用盐，它们特别在癌症治疗中用作PI3K活性的抑制剂，该文献的全文公开在此引入作为参考，化合物B为实施例345的化合物。化合物B可以根据在国际申请PCT/US2008/063819号中的说明制备。

适当地，化合物B为游离碱的形式。

给药治疗有效量的本发明的组合相对于单个的组分化合物是有利的，因为与单独给药治疗有效量的的组分化合物相比，该组合将会提供一个或多个下列改进的性质：i)与活性最大的单个药物(agent)相比有更大的抗癌作用，ii)协同效应的或高度协同效应的抗癌活性，iii)提供增强的抗癌活性和减少的副作用的给药方案，iv)毒性作用减少，v)治疗窗口增加，或者vi)组分化合物中的一个或两者的生物利用度增加。

本发明的化合物可以形成溶剂化物，其可以理解为由溶质(在本发明中，化合物A或其盐和/或化合物B或其盐)和溶剂形成的各种化学计量的复合物。用于本发明目的的溶剂不可以干扰溶质的生物学活性。合适溶剂的实例包括但不限于：水、甲醇、二甲基亚砜、乙醇和乙酸。适当地，所使用的溶剂为可药用的溶剂。合适的可药用溶剂的实例包括但不限于：水、二甲基亚砜、乙醇和乙酸。适当地，所用的溶剂为水。

本领域技术人员可以容易地制备本发明化合物的可药用盐。

因此，本发明还包括使用本发明的组合治疗癌症的方法，其中给药以前药形式的化合物A或其可药用盐或溶剂化物和/或化合物B或其可药用盐。本领域技术人员可以容易地制备本发明化合物的可药用前药。

当涉及给药方案(dosing protocol)，术语“天”、“每天”等是指日历上一天内的时间，其从子夜开始，结束于下一个子夜。

如本文所使用的，术语“治疗”及其相关表述表示治疗性治疗。当涉及具体的病症时，治疗表示：(1)改善或预防该病症的一个或多个生物学表现的状况，(2)干扰(a)引起或响应于该病症的生物学级联中的一个或多个点，或(b)该病症的一个或多个生物学表现，(3)减轻与该病症或其治疗相关联的一个或多个症状、作用或副作用，或者(4)减缓该病症的进展，或者减缓该病症的一个或多个生物学表现。由此，也包括了预防性治疗。本领域技术人员将会理解“预防”不是绝对的术语。在医学中，将“预防”理解为预防性给药以基本上减少病症或其生物学表现的可能性或严重性，或者以延缓这种病症或其生物学表现的开始。例如，当受治疗者被认为处于患癌症的高风险时，例如当受治疗者具有强大的癌症家族史时或者当受治疗者已经暴露于致癌物时，预防性治疗是合适的。

如本文所使用的，术语“有效量”表示产生研究者或临床医师所寻求的例如组织、***、动物或人的生物学或药学响应的药物或药用制剂的量。此外，术语“治疗有效量”表示，与没有接受该量的相应受治疗者相比，引起疾病、病症或副作用的改进治疗、治愈、预防或减轻的量，或者引起疾病或病症的进展的速率降低的量。该术语还包括在其范围内有效地增强正常生理功能的量。

术语“周期性地给药”或其变形表示以具有休药期(drug holiday)的形式给药。休药期(有时也称为药物假期(drug vacation)、药物疗法假期、计划性间断治疗(structured treatment interruption)或策略性间断治疗(strategic treatmentinterruption))是指病人停止进行药物疗法一段时间；无论从几天到几个月。

如本文所使用的，术语“组合”及其相关表述表示同时给药或者以任何分开的顺序给药治疗有效量的化合物A或其可药用盐或溶剂化物和化合物B或其可药用盐。优选地，如果给药不是同时的，那么所述化合物以相互紧密相邻的时间给药。此外，化合物是否以相同的剂型给药是无关紧要的，例如一个化合物可以局部给药，另一个化合物可以口服给药。适当地，这两个化合物均口服给药。

如本文所使用的，术语“组合试剂盒”，表示用于给药根据本发明的化合物A或其可药用盐或溶剂化物和化合物B或其可药用盐的一种或多种药物组合物。当该两种化合物同时给药时，所述组合试剂盒可以含有在单个药物组合物如片剂或在分开的药物组合物中的化合物A或其可药用盐或溶剂化物和化合物B或其可药用盐。当不同时给药所述化合物时，所述组合试剂盒将含有在分开的药物组合物中的化合物A或其可药用盐或溶剂化物和化合物B或其可药用盐。该组合试剂盒可以包括在单个包装中的分开的药物组合物中，或在分开包装中的分开药物组合物中的化合物A或其可药用盐或溶剂化物和化合物B或其可药用盐。

在一个方面中提供了包含下列成分的组合试剂盒：

化合物A或其可药用盐或溶剂化物，以及可药用载体；和

化合物B或其可药用盐，以及可药用载体。

在本发明的一个实施方案中，该组合试剂盒包含下列成分：

化合物A或其可药用盐或溶剂化物，以及可药用载体；和

化合物B或其可药用盐，以及可药用载体，

其中所述成分以适于顺序、分开和/或同时给药的形式提供。

在一个实施方案中，该组合试剂盒包含：

第一容器，其包含化合物A或其可药用盐或溶剂化物，以及可药用载体；和

第二容器，其包含化合物B或其可药用盐，以及可药用载体，和用于容纳所述第一容器和第二容器的容器装置。

所述“组合试剂盒”还可以提供说明书，如剂量和给药说明书。这些剂量和给药说明书可以为向医师提供的资料(kind)，例如药物产品标签，或者它们可以为由医师提供的资料，如向患者提供的说明书。

除非另有说明，在本文所述的所有给药方案中，给药化合物的方案没有必要在治疗开始时开始，也没有必要在治疗结束时终止，仅要求给药该两种化合物的连续天数以及任选仅给药组分化合物中仅一种的连续的天数，或者所指明的给药方案-包括所给予的化合物量，在治疗过程中的一些点发生。

如本文所使用的术语“化合物A²”表示---化合物A或其可药用盐或溶剂化物---。

如本文所使用的术语“化合物B²”表示---化合物B或其可药用盐---。

适当地，本发明的组合“在规定的期间内”给药。

如本文所使用的术语“规定的期间(specified period)”及其类似表达，表示给药化合物A²和化合物B²中的一个以及给药化合物A²和化合物B²中的另一个之间的时间间隔。除非另有说明，规定的期间可以包括同时给药。当一天一次给药本发明的两个化合物时，规定的期间是指在一天内给药化合物A²和化合物B²。当给药本发明的一个或两个化合物一天多于一次时，基于首次给药各化合物的具体日期计算规定的期间。在计算规定的期间时，不考虑在该具体日期中首次给药后所有本发明化合物的给药。

适当地，如果在“规定的期间”内给药所述化合物而不同时给药，它们均可以在彼此相隔约24小时内给药-在该情况中，所述规定的期间将为约24小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约12小时内给药–在该情况中，所述规定的期间将为约12小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约11小时内给药-在该情况中，所述规定的期间将为约11小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约10小时内给药-在该情况中，所述规定的期间将为约10小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约9小时内给药-在该情况中，所述规定的期间将为约9小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约8小时内给药-在该情况中，所述规定的期间将为约8小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约7小时内给药-在该情况中，所述规定的期间将为约7小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约6小时内给药-在该情况中，所述规定的期间将为约6小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约5小时内给药-在该情况中，所述规定的期间将为约5小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约4小时内给药-在该情况中，所述规定的期间将为约4小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约3小时内给药-在该情况中，所述规定的期间将为约3小时；适当地，它们可以在彼此相隔约2小时内给药-在该情况中，所述规定的期间将为约2小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约1小时内给药-在该情况中，所述规定的期间将为约1小时。如本文所使用的，化合物A²和化合物B²的给药相隔小于约45分钟被认为是同时给药。

适当地，当本发明的组合给药一段“规定的期间”时，各化合物共同给药一段“持续时间”。

如本文所使用的术语“持续时间”及其类似表述，表示给药本发明的两个化合物指定数目的连续天数。

关于“规定的期间”给药：

适当地，两个化合物在规定的期间内给药至少一天-在该情况中，所述持续时间为至少一天；适当地，在治疗过程中，两个化合物在规定的期间内给药至少连续3天-在该情况中，所述持续时间为至少3天；适当地，在治疗过程中，两个化合物在规定的期间内给药至少连续5天-在该情况中，所述持续时间为至少5天；适当地，在治疗过程中，两个化合物在规定的期间内给药至少连续7天-在该情况中，所述持续时间为至少7天；适当地，在治疗过程中，两个化合物在规定的期间内给药至少连续14天-在该情况中，所述持续时间为至少14天；适当地，在治疗过程中，两个化合物在规定的期间内给药至少连续30天-在该情况中，所述持续时间为至少30天。

适当地，如果所述化合物不在“规定的期间(during a specifiled period)”给药，那么它们就顺序给药。如本文所使用的术语“顺序给药”及其相关表述，表示一天一次给药化合物A²和化合物B²中的一个一天或连续多天，接着一天一次给药化合物A²和化合物B²中的另一个连续两天或更多天。同样地，本发明还包括在顺序给药化合物A²和化合物B²中的一个以及给药化合物A²和化合物B²中的另一个之间所使用的休药期。如本文所使用的，休药期为在顺序给药化合物A²和化合物B²中的一个之后和在给药化合物A²和化合物B²中的另一个之前不给药化合物A²也不给药化合物B²的间隔天数。休药期为选自以下的间隔天数：1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天和14天。

关于顺序给药(sequential administration)：

适当地，给药化合物A²和化合物B²中的一个连续2~30天，接着任选的休药期，接着给药化合物A²和化合物B²中的另一个连续2~30天。适当地，给药化合物A²和化合物B²中的一个连续2~21天，接着任选的休药期，接着给药化合物A²和化合物B²中的另一个连续2~21天。适当地，给药化合物A²和化合物B²中的一个连续2~14天，接着1~14天的休药期，接着给药化合物A²和化合物B²中的另一个连续2~14天。适当地，给药化合物A²和化合物B²中的一个连续3~7天，接着3~10天的休药期，接着给药化合物A²和化合物B²中的另一个连续3~7天。

适当地，化合物B²首先连续给药，接着任选的休药期，接着给药化合物A²。适当地，给药化合物B²连续3~21天，接着任选的休药期，接着给药化合物A²连续3~21天。适当地，给药化合物B²连续3~21天，接着1~14天的休药期，接着给药化合物A²连续3~21天。适当地，给药化合物B²连续3~21天，接着3~14天的休药期，接着给药化合物A²连续3~21天。适当地，给药化合物B²连续21天，接着任选的休药期，接着给药化合物A²连续14天。适当地，给药化合物B²连续14天，接着1~14天的休药期，接着给药化合物A²连续14天。适当地，给药化合物B²连续7天，接着3~10天的休药期，接着给药化合物A²连续7天。适当地，给药化合物B²连续3天，接着3~14天的休药期，接着给药化合物A²连续7天。适当地，给药化合物B²连续3天，接着3~10天的休药期，接着给药化合物A²连续3天。

应当理解，“规定的期间”给药和“顺序”给药可以接着重复给药(dosing)或者可以接着交替给药方案，休药期可以在重复给药或交替给药方案之前。

适当地，作为本发明组合的一部分的化合物A²的给药量为选自约10mg~约300mg；适当地，所述量选自约30mg~约280mg；适当地，所述量选自约40mg~约260mg；适当地，所述量选自约60mg~约240mg；适当地，所述量选自约80mg~约220mg；适当地，所述量选自约90mg~约210mg；适当地，所述量选自约100mg~约200mg，适当地，所述量选自约110mg~约190mg，适当地，所述量选自约120mg~约180mg，适当地，所述量选自约130mg~约170mg，适当地，所述量选自约140mg~约160mg，适当地，所述量为150mg。因此，作为本发明组合的一部分的化合物A²的给药量为选自约10mg~约300mg。例如，作为本发明组合的一部分的化合物A²的给药量可以选自10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg、160mg、165mg、170mg、175mg、180mg、185mg、190mg、195mg、200mg、205mg、210mg、215mg、220mg、225mg、230mg、235mg、240mg、245mg、250mg、255mg、260mg、265mg、270mg、275mg、280mg、285mg、290mg、295mg和300mg。适当地，一天1~4次给药所选量的化合物A²。适当地，一天2次给药所选量的化合物A²。适当地，一天1次给药所选量的化合物A²。适当地，化合物A²的给药将从负荷剂量(loadingdose)开始。适当地，该负荷剂量将为维持剂量的2~100倍的量；适当地2~10倍；适当地2~5倍；适当地为2倍；适当地为3倍；适当地为4倍；适当地为5倍。适当地，所述负荷剂量给药1~7天；适当地1~5天；适当地1~3天；适当地为1天；适当地为2天；适当地为3天，接着为维持剂量给药方案。

适当地，作为本发明组合的一部分的化合物B²的给药量选自约0.25mg~约75mg；适当地，所述量选自约0.5mg~约50mg；适当地，所述量选自约1mg~约25mg；适当地，所述量选自约2mg~约20mg；适当地，所述量选自约4mg~约16mg；适当地，所述量选自约6mg~约12mg；适当地，所述量为约10mg。因此，作为本发明组合的一部分的化合物B²的给药量选自约0.5mg~约50mg。例如，作为本发明组合的一部分的化合物B²的给药量可以为0.5mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、20mg、21mg、22mg、23mg、25mg、26mg、27mg、28mg、29mg、30mg、35mg、40mg、45mg或50mg。

如本文所使用的，针对化合物A²和化合物B²详细说明的所有量表示为每剂量给药游离的或未成盐的和未溶剂化的化合物的量。

本发明的方法还可以与其他治疗癌症的治疗方法一起使用。

尽管对于治疗应用而言，治疗有效量的本发明的组合可以以粗化学品(raw chemical)给药，但是优选该组合以一种或多种药物组合物存在。因此，本发明还提供药物组合物，其包括化合物A²和/或化合物B²以及一种或多种可药用载体。本发明的组合如上文所述。所述载体在以下意义上必须是可接受的：与制剂中其他成分相容，能够形成药用制剂以及对其接受者无害。根据本发明的其他方面，还提供了制备药物制剂的方法，该方法包括混合化合物A²和/或化合物B²与一种或多种可药用载体。如上文所示，所用药物组合中的这些要素可以以分开的药物组合物存在，或者一起配制成一种药物制剂。

药物制剂可以以含有预定量的活性成分/单位剂量的单位剂型存在。如本领域技术人员所已知的，活性成分的量/剂量取决于所治疗的病症、给药途径和患者的年龄、体重和状况。优选的单位剂量制剂为那些含有每日剂量或亚剂量或其合适部分的活性成分的单位剂量。此外，这些药物制剂可以通过药物领域公知的任何方法制备。

化合物A²和化合物B²可以通过任何适合的途径给药。合适的途径包括经口、经直肠、经鼻、局部(包括含服(buccal)和舌下)、经***和肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、真皮内、鞘内和硬膜外)。可以理解优选途径可随着例如该组合的受治疗者的病症和所治疗的癌症而变化。还可以理解各个药物可以通过相同或不同的途径给药，化合物A²和化合物B²可以一起配制成药物组合物/制剂。

将本发明的化合物或组合混合成方便的剂型，如胶囊、片剂或可注射制剂。可以使用固体或液体药用载体。固体载体包括：淀粉、乳糖、硫酸钙二水合物、石膏粉、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、***胶、硬脂酸镁和硬脂酸。液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、盐水和水。类似地，载体可以包括延时释放材料，如单独的或与蜡混合的甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。固体载体的量变化范围广，但是优选约25mg~约1g/剂量单位。当使用液体载体时，该制剂合适的为糖浆、酏剂、乳剂、软明胶胶囊剂、无菌可注射液体(如安瓿)或者含水或非含水液体混悬剂的形式。

例如，对于片剂或胶囊剂形式的口服给药，活性药物组分可以与口服的、无毒的可药用惰性载体如乙醇、甘油、水等混合。粉末剂通过将所述化合物研磨成合适的细小尺寸并与类似粉末化的药用载体(如可食用碳水化合物，例如，淀粉或甘露醇)混合而制备。还可以存在调味剂、防腐剂、分散剂和着色剂。

应当理解，除了上述成分之外，所述制剂可以含有在本领域中与所关注制剂类型相关的其他试剂，例如适于口服给药的试剂可以包括调味剂。

如所说明的，将治疗有效量的本发明组合(化合物A²与化合物B²组合)给药于人。典型地，给药的治疗有效量的本发明药物将取决于许多因素，包括，例如，受治疗者的年龄和重量、需要治疗的精确病症、该病症的严重程度、制剂的性质和给药途径。最后，治疗有效量依据主治医师的决定。

根据已知的方法测试本发明的组合的功效、有利和协同效应性质。适当地，一般根据以下的联合细胞增殖实验测试本发明的组合的功效、有利和协同效应性质。在96或384-孔板中在适于各细胞类型，且补充了10%FBS和1%青霉素/链霉素的培养基中将细胞铺板，并在37℃、5%CO₂温育过夜。使用化合物A²的稀释液(10个稀释液，包括无化合物、0.50~10μM以3-倍稀释液)以格栅方式处理细胞，并用化合物B²(10个稀释液，包括无化合物、0.10~1.0μM3-倍稀释液)处理，并如上述再温育72小时。在一些情况中，以交错方式添加化合物，并且可以将温育时间延长到最高达7天。使用CellTiter-Glo

试剂根据制造商的实验规范测量细胞生长，在PerkinElmerEnVision^TM阅读器上读取信号(设为发光模式，0.5秒一个读数)。如下所述对数据进行分析。

结果表达为t=0时的值的百分比，并且针对化合物浓度作图。t=0时的值归一化为100%，并且表示添加化合物时存在的细胞数。各个化合物和/或化合物组合的细胞响应如下确定：使用用于Microsoft Excel软件的IDBSXLfit plug-in对细胞存活力-浓度进行4参数曲线拟合，并确定50%抑制细胞生长所需要的浓度(gIC₅₀)。背景校正通过减去不含细胞的孔中的值来进行。对于各药物组合，组合指数(Combination Index,CI)、超过最高单药物的量(Excess Over Highest Single Agent，EOHSA)和超过Bliss的量(Excess OverBliss，EOBliss)根据例如记载于Chou and Talalay(1984)Advances in EnzymeRegulation,22,37至55；和Berenbaum,MC(1981)Adv.Cancer Research,35,269-335中的已知方法计算。

由于本发明的组合在上述测定中具有活性，因此它们在癌症治疗中显示出有利的治疗实用性。

适当地，本发明涉及治疗选自下列的癌症或减轻其严重性的方法：脑癌(神经胶质瘤)、恶性胶质瘤、星形细胞瘤、多形性恶性胶质瘤、Bannayan-Zonana综合征、考登病、Lhermitte-Duclos病、乳腺癌、炎性乳腺癌、维尔姆斯肿瘤、尤因肉瘤、横纹肌肉瘤、室管膜细胞瘤、成神经管细胞瘤、结肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、肝癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、***癌、肉瘤、骨肉瘤、骨巨细胞瘤、甲状腺癌，

淋巴母细胞T细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、慢性中性粒细胞性白血病、急性淋巴母细胞T细胞性白血病、浆细胞瘤、免疫母细胞大细胞白血病、套细胞白血病、多发性骨髓瘤巨核母细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性巨核细胞白血病、前髓细胞性白血病、红白血病，

恶性淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、非-何杰金淋巴瘤、淋巴母细胞T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤，

神经母细胞瘤、膀胱癌、膀胱上皮癌、肺癌、外阴癌、子***、子宫内膜癌、肾癌、间皮瘤、食管癌、唾液腺癌、肝细胞癌、胃癌、鼻咽癌、颊癌、口腔癌、GIST(胃肠道间质瘤)和睾丸癌。

适当地，本发明涉及治疗选自下列的癌症或减轻其严重性的方法：脑癌(神经胶质瘤)、恶性胶质瘤、Bannayan-Zonana综合征、考登病、Lhermitte-Duclos病、乳腺癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、肝癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、***癌、肉瘤和甲状腺癌。

适当地，本发明涉及治疗选自下列的癌症或减轻其严重性的方法：卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌和***癌。

适当地，本发明涉及治疗选自下列的癌症或减轻其严重性的方法：肺癌、胰腺癌和结肠癌。

适当地，本发明涉及治疗下述癌症或减轻其严重性的方法，所述癌症是确定生物标志的野生型或突变型。

适当地，本发明涉及治疗Raf野生型或突变型的癌症和PI3K/PTEN野生型或突变型的癌症或减轻其严重性的方法。该方法包括Raf和PI3K/PTEN均为野生型、Raf和PI3K/PTEN均为突变型、Raf为突变型和PI3K/PTEN为野生型以及Raf为野生型和PI3K/PTEN为突变型的患者。

术语“野生型”，如本领域中所理解的，是指在未经基因修饰的天然种群中存在的多肽或多核苷酸序列。本领域中还应当理解的是，“突变型”包括，分别与野生型多肽或多核苷酸中相应的氨基酸或核酸相比，具有至少一个对氨基酸或核酸的修饰的多肽或多核苷酸序列。在术语突变型中包括单核苷酸多态性(SNP)，其中，与最普遍存在的(野生型)核酸链相比，单个碱基对差异存在于核酸链序列中。

通过已知的方法鉴定生物标志野生型或突变型癌症和PI3K/PTEN野生型或突变型癌症。

例如，野生型或突变型的Ras/Raf或PI3K/PTEN肿瘤细胞可以通过DNA扩增和测序技术、DNA和RNA检测技术(分别包括但不限于RNA印迹(Northern blot)和DNA印迹(Southern blot))和/或各种生物芯片和阵列技术鉴定。野生型和突变型多肽可以通过多种技术包括但不限于免疫诊断学技术如ELISA、蛋白质印迹(Western blot)、免疫细胞化学进行检测。适当地，可以使用焦磷酸解激活的聚合反应(PAP)和/或PCR方法。Liu，Q et al;HumanMutation 23:426-436(2004)。

本发明提供了一种包含N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺或其可药用盐或溶剂化物和2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺或其可药用盐的组合。

本发明还提供了一种包含N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺或其可药用盐或溶剂化物和2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺或其可药用盐的组合，其用于治疗。

本发明还提供了一种包含N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺或其可药用盐或溶剂化物和2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺或其可药用盐的组合，其用于治疗癌症。

本发明还提供了一种药物组合物，其包含N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺或其可药用盐或溶剂化物和2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺或其可药用盐的组合。

本发明还提供了一种组合试剂盒，其包含N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺或其可药用盐或溶剂化物和2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺或其可药用盐。

本发明还提供了一种包含N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺或其可药用盐或溶剂化物和2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺或其可药用盐的组合在制备药物中的用途。

本发明还提供了一种包含N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺或其可药用盐或溶剂化物和2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺或其可药用盐在制备治疗癌症的药物中的用途。

本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者给药N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺或其可药用盐或溶剂化物和2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺或其可药用盐的组合。

下面的实施例仅用于解释本发明，不以任何方式限制本发明的范围。

实验说明

在国际申请PCT/US2009/042682号(国际申请日2009年5月4日；国际公开WO 2009/137391号以及WO 2009/137391的国际公开日)中公开并要求保护N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺(化合物A)以及可药用盐，它们特别在癌症治疗中用作B-Raf活性的抑制剂，该文献的全文公开在此引入作为参考，化合物A为实施例58的化合物。化合物A可以根据国际申请PCT/US2009/042682号中的说明制备。

适合用于本发明组合的PI3K抑制剂，特别是2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺，

可以根据国际专利公开WO 2008/1444463号(实施例345)来制备。

研究#1：由化合物A、化合物B以及它们的组合诱导的在肿瘤细胞系中的体外细胞生长抑制和细胞凋亡

结肠癌细胞系

实验准备

利用来自人结肠癌的一组细胞系(n=25)(表1)进行了化合物A和化合物B的组合药物测试。商购了细胞系[从ATCC(Manassas，VA，美国)或DSMZ(Braunschweig，德国)]，使其在补充有2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠以及10%胎牛血清的RPMI-1640中生长，且在潮湿的培养箱中在37℃以及5%CO₂下保持。

实验方案

固定比例药物组合检测

从图1中可以看出固定比例药物组合检测的稀释设计。首先，在100%二甲基亚砜(DMSO)中制备10mM母液形式的测试化合物。接着，利用DMSO稀释该化合物。在96孔微量滴定板中，在行B-E中，利用3倍系列稀释液水平地稀释第一测试化合物(称为化合物A)10个稀释点。在另一个96孔微量滴定板中，在行D-G中，利用3倍系列稀释液水平地稀释第二测试化合物(称为化合物B)10个稀释点。利用来自每个药物滴定板中的等体积来混合两个化合物并加入到细胞培养基中。从而得到在细胞培养基中以1:50稀释的药物。在行B和行C中单独滴加(titrate)了化合物A，而只有化合物B的则投入(dose)到滴定板的行F和G中。在添加到细胞中之前，在细胞培养基中另外进行了药物的1:10稀释。将药物添加到细胞中从而进一步1:2稀释药物。从药物滴定板到细胞的总稀释率为1:1000。化合物B的最终给药浓度为0.1-1000.0nM，且化合物A的最终给药浓度为0.5-10000.0nM。阳性对照由培养基组成，该培养基含有0.1%的DMSO以及细胞并且没有药物。阴性对照由含有0.1%DMSO的培养基组成。

在96孔微量滴定板中利用合适的接种密度来进行检测，该合适的接种密度是根据针对每个细胞系的在先的研究确定的。在给药之后，将细胞系于37℃、5%CO₂，在潮湿的空气中温育72小时。利用CellTiter Glo(PromegaCorporation，Madison，WI，美国)试剂根据制造商的实验规范来测量细胞增殖。利用CellTiter Glo溶液处理滴定板并利用Molecular Devices SpectraMaxM5(Sunnyvale，CA，美国)光吸收酶标仪(plate reader)分析了RLU(相对光单位)。

数据分析

结果表达为在化合物添加时存在的细胞数量值(T₀)的百分比，并且针对化合物浓度作图。将百分比强度值用于Microsoft Excel软件的IDBS XLfitplug-in的模型205中，从而利用4参数逻辑拟合计算出gIC₅₀值。背景校正通过减去不含细胞的孔中的值来进行。生长窗的中点(gIC₅₀)处于加入化合物之时(T=0)的细胞数目和用DMSO处理的对照细胞生长72小时之时的细胞数目之间的中点。将响应曲线底部的强度值(Y_min)除以在零点时的细胞数(T₀)得到细胞死亡的量度(Y_min/T₀)。Y_min/T₀低于1的值表明与更高的值相比该治疗对诱导细胞死亡具有更强的能力。对于重复检测，对所有的响应量度(response metrics)取平均值以表示结果。

利用三个独立的量度来分析化合物B和化合物A对于生长抑制的组合效果。

数据分析

1.超过最高单药物的量(EOHSA)-用于测量药物组合效果的一个标准准则是分析在绝对条件下对于细胞生长抑制的效果。在这种情况下，将药物的组合与更为具有响应性的两个单独治疗(单个药物)进行比较。对于每个组合实验，沿着曲线产生相对于每个药物单独的最高单个药物的百分比效果。这种“超过最高单药物的量(EOHSA)”的量度是用于评价药物组合的协同效应的标准之一。(BorisyAA Elliott PJ，Hurst NW，Lee MS，Lehar J，Price ER，Serbedzija G，Zimmermann GR，Foley MA，Stockwell BR，Keith CT.Systematicdiscovery of multicomponent therapeutics.Proc Natl Acad Sci U S A.2003 Jun24;100(13):7977-82)

2.Bliss协同效应-通常用于确定组合药物协同效应的第二个准则是评价超过Bliss独立作用或“相加作用(additivity)”的过量抑制作用(Bliss，C.I，Mexico，DF，The Toxicity of Poisons Applied Jointly.Annals of Applied Biology1939，Vol 26，Issue 3，August 1939)。该模型设想独立地利用下式计算两个化合物的组合响应：

得分(score)=E_a+E_b-(E_a*E_b)

其中E_a是化合物A的效果(或抑制率)，并且E_b是化合物B的效果。将两个化合物的组合的最终效果与它们通过Bliss预测的相加作用相比，沿着响应曲线得到每个剂量的协同分数。

3.组合指数(CI)-用于评价协同效应的第三个准则是来自Chou和Talalay的组合指数(CI)(Chou TC，Talalay P.Quantitative analysis ofdose-effectrelationships:the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors.AdvEnzyme Regul.1984;22:27-55)。下列公式是用于以不同作用机理作用的化合物的模型(彼此非排他性公式)。

CI值越低组合可能具有的协同效应越大。CI大于1表示所研究的组合可能是拮抗的。对于25%(IC₂₅)和75%(IC₇₅)的抑制浓度的CI得分还可通过将上式中每个化合物的IC₅₀用各自的抑制浓度代替得到。

将强度百分比值用于Microsoft Excel软件的IDBS XLfit plug-in的模型205中，从而利用4参数逻辑拟合计算出gIC₅₀值。生长窗的中点(gIC₅₀)处于加入化合物之时(T=0)的细胞数目和用DMSO处理的对照细胞生长72小时之时的细胞数目之间的中点。将响应曲线底部的强度值(Y_min)除以在零点时的细胞数(T₀)得到细胞死亡的量度(Y_min/T₀)。Y_min/T₀低于1的值表明与更高的值相比该治疗对诱导细胞死亡具有更强的能力。

对于EOHSA和Bliss，协同效应得分必须在实验中的两个技术重复试验中均观察到，从而才可以适当地确定(协同效应、适中的协同效应等)。每个组合实验包含将两个化合物作为单个药物的重复试验，以及该组合的技术重复试验(technical replicate)。

在极低浓度(例如剂量1、剂量2)下，EOHSA和Bliss的协同效应得分变化较大，通常从分析中排除。相反地，在最高浓度(剂量10)(远落在治疗剂量的范围之外)下的协同效应得分通常从分析中排除，因为认为观察的效果更易于发生偏离目标的事件。

针对EOHSA和Bliss协同效应测量，针对每个剂量沿着响应曲线产生得分。将得分分类为“拮抗效应”(<-10)、“相加效应”(-10~10)、“适中的协同效应”(10~20)或“协同效应”(>20)。取决于解释哪一个模型，这些得分反映超过最高药物的百分比或高于Bliss相加的百分比。

对于组合指数，CI越低，组合可能具有越大的协同效应。得分为0~0.7被认为是协同效应，而得分在0.7~0.9被认为是适中的协同效应。对于组合指数，所有其它得分表示不表示协同效应。

对于组合中有1种化合物未达到25%的抑制浓度的那些细胞系，不能计算CI值，在CI一栏标出的是“NA”。

细胞系突变数据

针对KRAS、BRAF、PIK3CA以及PTEN基因的情况，对点突变数据进行了整理。数据源是以癌症数据库体细胞突变目录(Catolog of SomaticMutations in Cancer database)(COSMIC)的一部分发表的癌症细胞系突变筛选数据(Bamford S.et al.Br.J.Cancer.2004.91:355-58)。为了保证用于增殖分析的细胞系的鉴定与COSMIC数据库中的相符，对在敏感性筛选中的那些细胞系和COSMIC中的那些细胞系进行了基因型的比较。具体地，如下进行：

1.使用Affymetrix 500K‘SNP Chip’(Affymetrix，Inc.，Sunnyvale，CA)以及RLMM算法(Rabbee & Speed，Bioinformatics，2006.22:7-12)计算每个细胞系的基因型。

2.鉴定每个细胞系与对于每个具有COSMIC中的突变分布的那些预先计算的细胞系的基因型匹配。

3.基于基因型匹配来对于每个细胞系确定突变状态。

结果

在细胞系的亚类中，所有基因均突变。在60%(15/25)的样品中发现了KRAS基因突变，而在40%(10/25)样品中发现了PIK3CA基因突变，在20%(5/25)样品中发现了BRAF基因突变，在4%(1/25)的细胞系中发现了PTEN基因突变(数据参见表1)。

对于利用PI3K抑制剂化合物B和BRAF抑制剂化合物A的组合处理的每个细胞系，进行了协同效应程度的复杂分类。明显地，由于数据质量较低，将细胞系SW1116从分析中排除。当至少一个量度被评分为协同效应时，认为细胞系具有协同效应。通过该准则，细胞系中的54%(13/24)显示协同效应。Y_min/T₀比值，与更高的值比较，该值<1显示更高的细胞净细胞死亡(cell netcell death)，与最具细胞毒性的单个药物比较在细胞系的79%(19/24)中该值降低。组合给药化合物A和B得到在细胞系的71%(17/24)中Y_min/T₀比例<1。结肠癌细胞系的协同效应和细胞毒性数据列在表2中。

表1.在组合研究中使用的一组结肠癌细胞系的得分

表1关键词

细胞系=细胞系名称

诊断/组织学=组织的病理诊断

KRAS/BRAF/PIK3CA/PTEN=突变状态；WT=野生型

表2.对于每个结肠癌细胞系的基本测量和协同效应

表2关键词：

细胞系=肿瘤衍生的细胞系

gIC₅₀=引起50%生长抑制所需的化合物浓度(nM)

Y_min=在存在化合物B时的最小细胞生长(相对于DMSO对照)，以T=0(化合物B添加时的细胞数量)时的百分比表示。负数表示相对于T=0时细胞的净损失(net loss)。

Y_min/T₀=Y_min值除以T0值，其中Y_min是得自浓度响应曲线且T0值表示在化合物添加时的细胞的数量(CTG测量值)。

EOHSA=超过最高单药物量的量度

BLISS=Bliss协同效应量度

Comb指数=组合指数得分

研究#2：BRAF(化合物A)和PI3K抑制剂(化合物B)对于来自编码在MAPK和AKT/PI3K途径中的不同突变的多种来源的癌症细胞系的体外组合研究

在384孔板中进行了药物组合实验。在适合每种细胞类型的补充了10%FBS和1%青霉素/链霉素的培养基中以500细胞/孔将细胞铺板，并在37℃、5%CO₂温育过夜。以矩阵的方式检测了16种浓度的每个药物的2倍稀释液对细胞生长的抑制。针对BRAF抑制剂化合物A的试验浓度为10μM~0.3nM，且针对PI3K抑制剂(化合物B)为5μM~0.15nM。用化合物组合处理细胞并在37℃温育72小时。使用CellTiter-Glo

试剂根据制造商的实验规范测量细胞生长，在PerkinElmer EnVision^TM读取器上读取信号(设定为发光模式，0.5秒一个读数)。结果是以相对于利用DMSO处理的细胞的抑制百分比的形式表示的，并且背景校正通过减去不含细胞的孔中的值来进行。

针对该研究的目的，使用超过最高单药物的量(EOHSA)来确定每个化合物之间的协同效应的程度。关于EOHSA计算的详细描述可以参照上文。简单来说，将化合物A在“a”浓度的响应(R_a)(相对于未处理样品的抑制百分比且针对培养基归一化)以及化合物B在“b”浓度的响应(R_b)与化合物A和化合物B的混合物分别在浓度“a”和“b”的响应(R_ab)进行比较。公式：

R_ab比R_a和R_b中较高值大10%=相加效应

R_ab比R_a和R_b中较高值小10%=拮抗效应

使用该公式，如果R_ab高于R_a和R_b中最高值10%或更多，则认为药物组合具有“相加效应”。如果R_ab小于R_a和R_b中最高值10%或更多，则认为药物组合具有“拮抗效应”。在这种情况下，与“拮抗效应”细胞系相比，认为“相加效应”细胞系更具有协同效应。

在16X16矩阵中响应与组合处理的相加效应方式的组合的数列举和总结在表3中。在该表中，我们标出对于给定细胞系更为有益的组合(灰色方框)>测试组合中的20%(256个测试的组合中的51个组合)显示相加效应，通过其大于10%超过最高单药物的量(10%EOHSA)来确定。

表3：PI3K和BRAF抑制剂对于多种癌症细胞系的组合效应

这些数据表明PI3K和BRAF抑制剂的组合对于多种癌症细胞系是有效的，多种癌症细胞系是来自独立于在MAPK或AKT/PI3K途径中的关键癌基因的突变状态的多种来源，因为多种药物组合(>20%)显示抑制活性>10%超过最高单药物的量(EOHSA)。

研究#3：化合物A、化合物B和它们的组合在肿瘤细胞系中的体外细胞生长抑制

方法：

细胞系和生长条件

黑素瘤A375PF11细胞系来自A375(ATCC)。12R5-1、12R5-3、12R8-1、12R8-3、16R5-2、16R6-3和16R6-4为来自A375PF11细胞的混合种群的单细胞克隆，选择其在浓度1200和1600nM的化合物A中生长。所有的细胞系在含有10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基中培养。

细胞生长抑制检测和组合数据分析

所有的细胞均至少培养72小时，然后细胞铺板。在对所有细胞都在含10%FBS的RPMI培养基的96孔组织培养板(NUNC 136102)中以1000细胞/孔检测细胞。铺板后约24小时，使细胞暴露于化合物的十个三倍的系列稀释液，或者暴露于在含10%FBS的RPMI培养基中的，以化合物A对化合物B的恒定摩尔比为1:10的这两个药物的组合十个三倍系列稀释液。细胞在化合物的存在下温育3天。通过添加Cell Titer Glo

(Promega)根据制造商的实验规范确定ATP水平。简单来说，将Cell Titer Glo

加入各板中，温育30分钟，然后在SpectraMax L光吸收酶标仪上读取发光信号(0.5秒整合时间)。

在用化合物或各化合物的组合处理三天后，与用载体(DMSO)处理的细胞比较信号，以此评估细胞生长的抑制。计算相对于用载体(DMSO)处理的对照孔细胞的细胞生长。当y=50%载体对照时用非线性回归内插(interpolate)得到抑制50%对照细胞生长的化合物浓度(IC₅₀)，公式为y=(A+(B-A)/(1+(C/x)^D)))，其中A为最小响应(y_min)，B为最大响应(y_max)，C为曲线的拐点(EC₅₀)，D为希尔系数(Hill coefficient)。

对效能的组合作用使用组合指数(CI)评估，组合指数使用后向***(back-interpolated)的IC₅₀值以及Chou和Talalay推导的彼此非排他性方程计算(Chou TC,Talalay P.Quantitative analysis of dose-effect relationships:thecombined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors.Adv Enzyme Regul1984;22:27-55.)。对CI的详细描述参见上文。一般而言，CI值<0.9，在0.9和1.1之间，或者>1.1，分别表明协同效应、相加效应和拮抗效应。一般而言，CI数越小，协同效应的强度越大。

对响应程度的组合作用通过超过最高单药物的量(EOHSA)定量表示，其基于非线性混合的概念，如Peterson和Novick(2007)，以及Peterson(2010)[Peterson JJ，Novick SJ.J Recept Signal Transduct Res 2007;27(2-3)：125-46，Peterson J.Frontiers of Bioscience S2，483-503.2010]所详细描述的。EOHSA值定义为，由所述组合产生的相比于最佳单个药物在该组合中的组分剂量水平时的改善的增加(在此，表示为“百分比点”(ppt)差异)。对于EOHSA的计算的详细描述参见上文。对于单个药物和组合治疗，将细胞暴露于固定的剂量比的化合物，并且将剂量响应曲线拟合于实验数据，并且使用回归模型进行分析。沿着剂量响应曲线在指定的IC₅₀总剂量水平处，确定剂量组合(相应于IC₅₀)以作出EOHSA统计学结论。更具体地，对于涉及以剂量d1的药物1和以剂量d2的药物2的组合药物实验，(即总剂量等于d1+d2)，如果组合时的平均响应好于对剂量d1的药物1或剂量d2的药物2的平均响应，被认为具有正EOHSA。

结果：

在一组人黑素瘤细胞系中确定BRAF抑制剂化合物A、PI3K抑制剂化合物B和它们的组合对于细胞生长抑制的作用。关于BRAF突变状态的平均IC₅₀(来自至少两个独立的实验)和各IC₅₀处的组合作用总结于表4中。具有BRAF V600E突变的A375PF 11细胞对于化合物A(IC₅₀=0.059μM)或化合物B(IC₅₀=0.048μM)单个药物均高度敏感。通过A375PF11细胞中的CI值0.74说明化合物A和化合物B的组合具有协同效应。对于单个化合物B，7个化合物A抗性克隆(来自A375PF11黑素瘤细胞系的12R8-3、12R8-1、12R5-3、16R5-2、16R6-3、16R6-4和12R5-1)显示0.041~0.212μM范围的IC₅₀，对于化合物A和化合物B的组合具有针对化合物A范围为0.256~0.0.731μM的IC₅₀，和针对化合物B范围为0.026~0.073μM的IC₅₀。化合物A和化合物B的组合在黑素瘤细胞系中显示出提高的细胞生长抑制，其EOHSA值在3~34ppt之间。

表4.化合物A、化合物B和它们的组合在人肿瘤细胞系中对细胞生长的抑制

表4.

表4关键词：

IC₅₀：化合物以单个药物时的浓度，或者化合物A或化合物B在当化合物A和化合物B=10:1摩尔比的组合中的浓度，该浓度减少细胞生长50%；

CI；组合指数；N/A=无法获得

EOHSA：超过最高单药物的量，以百分比形式测定。

实施例1-胶囊组合物

按照下面表I中所示比例，将各成分填充标准双部分硬明胶胶囊中，制备用于给药本发明组合的口服剂型。

表I

实施例2-胶囊组合物

按照下面表II中所示比例，将各成分填充标准双部分硬明胶胶囊中，制备用于给药本发明化合物之一的口服剂型。

表II

实施例3-胶囊组合物

按照下面表III中所示比例，将各成分填充标准双部分硬明胶胶囊中，制备用于给药本发明化合物之一的口服剂型。

表III

实施例4-片剂组合物

用10%的明胶溶液，将下面表IV所示的蔗糖、微晶纤维素和本发明组合中的化合物按所示的比例混合和造粒。将湿的颗粒筛分，干燥，并与淀粉、滑石和硬脂酸混合；然后筛分并压制成片剂。

表IV

实施例5-片剂组合物

用10%的明胶溶液，将下面表V所示的蔗糖、微晶纤维素和本发明组合中的一种化合物按所示的比例混合和造粒。将湿的颗粒筛分，干燥，并与淀粉、滑石和硬脂酸混合；然后筛分并压制成片剂。

表V

实施例6-片剂组合物

用10%的明胶溶液，将下面表VI所示的蔗糖、微晶纤维素和本发明组合中的一种化合物按所示的比例混合和造粒。将湿的颗粒筛分，干燥，并与淀粉、滑石和硬脂酸混合；然后筛分并压制成片剂。

表VI

尽管上面已经说明了本发明的优选实施方案，但是应当理解，本发明并不限于本文中所公开的明确说明，而且保留在权利要求书范围内的所有修改的权利。

Claims

1.一种组合，其含有：

(i)结构(I)的第一化合物：

或其可药用盐或溶剂化物；和

(ii)第二化合物，其为结构(II)的化合物：

或其可药用盐。

2.根据权利要求1的组合，其中所述结构(I)的化合物为甲磺酸盐的形式，所述结构(II)的化合物为游离碱的形式。

3.一种组合试剂盒，其包含根据权利要求1或权利要求2的组合以及一种或多种可药用载体。

4.根据权利要求1~3中任一项所述的组合，其中所述结构(I)的化合物的量为选自10mg~300mg的量，并且每天给药该量1~4次，以及所述结构(II)的化合物的量为选自0.5mg~20mg的量，并且每天给药该量一次。

5.一种组合试剂盒，其包括根据权利要求1~4中任一项所述的组合以及一种或多种可药用载体。

6.治疗需要的人中癌症的方法，其包括向该人体内给药治疗有效量的N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺或其可药用盐以及2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺的组合，

其中所述组合在规定的期间内给药，和

其中所述组合给药一段持续时间。

7.根据权利要求6的方法，其包括向该人体内给药治疗有效量的N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺甲磺酸盐和2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺的组合，

其中所述组合在规定的期间内给药，和

其中所述组合给药一段持续时间。

8.根据权利要求6的方法，其中N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺或其可药用盐的量选自约10mg~约300mg，并且每天给药该量1~3次，以及2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺的量选自约0.5mg~约10mg。

9.根据权利要求6的方法，其中N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺或其可药用盐的量选自约70mg~约260mg，并且每天给药该量2次，以及2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺的量选自约0.5mg~约6mg。

10.根据权利要求8的方法，其中在每天彼此相隔12小时内给药N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺或其可药用盐，和2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺至少连续7天的周期，任选接着重复一个或多个周期。

11.根据权利要求6的方法，其中在每天彼此相隔12小时内给药N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺甲磺酸盐，和2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺至少连续14天的周期，任选接着重复一个或多个周期。

12.治疗需要的人中癌症的方法，其包括一个或多个给药周期，其中每个所述周期包括：

(1)向所述人给药约10~300mg的N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺或其可药用盐或溶剂化物，每天给药1~4次，给药1~30天；以及

(2)向所述人周期性地给药约0.05mg~10mg的2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺或其可药用盐或溶剂化物。

13.治疗需要的人中癌症的方法，其包括一个或多个给药周期，其中每个所述周期包括：

(1)向所述人给药约70~260mg的N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺或其可药用盐或溶剂化物，每天给药1~4次，给药1~30天；以及

(2)向所述人周期性地给药约0.5mg~5mg的2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺或其可药用盐或溶剂化物，给药1~30天。

14.治疗需要的人中癌症的方法，其包括一个或多个给药周期，其中每个所述周期包括：

(1)向所述人给药约0.05~10mg的2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺或其可药用盐或溶剂化物，每天给药1或2次，给药1~30天；以及

(2)向所述人周期性地给药约10~300mg的N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺或其可药用盐或溶剂化物，给药1~30天。

15.治疗需要的人中癌症的方法，其包括一个或多个给药周期，其中每个所述周期包括：

(1)向所述人给药约0.5~5mg的2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺或其可药用盐或溶剂化物，每天给药1或2次，给药1~30天；以及

(2)向所述人周期性地给药约70~260mg的N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺或其可药用盐或溶剂化物，给药1~30天。

16.根据权利要求12或13的方法，其中每2~4天给药2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺一次。

17.根据权利要求12或13的方法，其中每5~7天给药2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺一次。

18.根据权利要求12或13的方法，其中每8~15天给药2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺一次。

19.根据权利要求14或15的方法，其中每2~4天给药N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺甲磺酸盐一次。

20.根据权利要求14或15的方法，其中每5~7天给药N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺甲磺酸盐一次。

21.根据权利要求14或15的方法，其中每8~15天给药N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺甲磺酸盐一次。

22.治疗需要的人中癌症的方法，其包括一个或多个重复给药周期，其中每个所述周期包括向所述人给药约10~300mg的N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺或其可药用盐或溶剂化物，每天给药1~4次，给药5~14天，接着向所述人给药约0.05mg~10mg的2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺或其可药用盐或溶剂化物，给药5~14天。

23.治疗需要的人中癌症的方法，其包括一个或多个重复给药周期，其中每个所述周期包括向所述人给药约70~260mg的N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺或其可药用盐或溶剂化物，每天给药1~2次，给药5~14天，接着向所述人给药约0.5mg~5mg的2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺或其可药用盐或溶剂化物，给药5~14天。

24.根据权利要求12~23中任一项的方法，其中所述癌症是黑素瘤或结肠癌。

25.根据权利要求24的方法，其中所述癌症是BRAF突变型。

26.根据权利要求1~4中任一项的组合，其中所述第二化合物为游离碱的形式。

27.用于治疗的根据上述权利要求中任一项的组合。

28.用于治疗癌症的根据权利要求1~4中任一项的组合。

29.药物组合物，其包括根据权利要求1~4中任一项的组合以及可药用载体。

30.根据权利要求1~4中任一项的组合在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

31.根据权利要求8或9的方法，其中所述癌症是黑素瘤、肺癌、胰腺癌、乳腺癌或结肠癌。

32.根据权利要求17的方法，其中所述癌症是黑素瘤或结肠癌。

33.根据权利要求32的方法，其中所述癌症是BRaf突变型。

34.根据权利要求12~15中任一项的方法，其中所述癌症是在用BRaf抑制剂治疗之后发展的黑素瘤。

35.根据权利要求12~15中任一项的方法，其中所述癌症是对BRaf抑制剂具有抗性的黑素瘤。

36.根据权利要求12~15中任一项的方法，其中所述癌症是在用BRaf抑制剂治疗之后发展的结肠癌。

37.根据权利要求12~15中任一项的方法，其中所述癌症是对BRaf抑制剂具有抗性的结肠癌。