EA018700B1

EA018700B1 - МОДИФИЦИРОВАННЫЕ РАСТВОРИМЫЕ СЛИТЫЕ КОНСТРУКЦИИ РЕЦЕПТОРА FGF И Fc С УЛУЧШЕННОЙ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

Info

Publication number: EA018700B1
Application number: EA200970515A
Authority: EA
Inventors: Марк Несбит; Беатрис Камерон; Франсис БЛАНШ; Сильви Сорделло; Селин Николацци; Марк Тромб
Original assignee: Авентис Фарма С.А.
Priority date: 2006-11-28
Filing date: 2007-11-28
Publication date: 2013-10-30
Also published as: EP2092069A2; US8481487B2; CY1112435T1; MX2009005692A; KR20090102769A; TW200839012A; SI2092069T1; MY145914A; AR063975A1; BRPI0719290A2; AU2007326985B2; PE20081250A1; AU2007326985C1; ECSP099361A; EP2092069B1; US20100061979A1; WO2008065543A3; CO6190564A2; EP2092069B2; JP2010510801A

Abstract

Изобретение относится к модифицированным растворимым слитым конструкциям рецептора FGF и Fc, содержащим слияние растворимого фрагмента или домена части рецептора FGF (нацеливающий или связывающий компонент) с Fc-областью части иммуноглобулина (компонент с эффекторной функцией), обладающим улучшенной биологической активностью, включая активности в отношении ADCC/CDC, содержащим их композициям и способу получения таких модифицированных растворимых слитых молекул рецептора FGF и Fc.

Description

Область изобретения и введение

Изобретение относится к модифицированным растворимым слитым конструкциям рецептора ЕСЕ и Ес, содержащим слияние растворимого фрагмента или домена рецептора ЕОЕ с Ес-областью иммуноглобулина, обладающим улучшенной биологической активностью, содержащим их композициям и способу получения таких модифицированных растворимых слитых молекул рецептора ЕОЕ и Ес. В частности, модифицированные растворимые слитые конструкции рецептора ЕОЕ и Ес обладают улучшенной антиангиогенной активностью и противоопухолевыми активностями в отношении антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности, а именно ЛИСС (антителозависимая клеточная цитотоксичность) и/или СЭС (комплементзависимая цитотоксичность), и, таким образом, пригодны в лечении рака, метастатических опухолей и для замедления роста опухоли у субъекта. Изобретение дополнительно относится к способам ингибирования роста опухоли и способам лечения или предотвращения патологических ситуаций, включая в качестве неограничивающих примеров рак молочной железы, меланому, лейкоз, метастазы в мозге, рак почки, первичную меланому, первичный рак толстой кишки, первичный рак мочевого пузыря, младенческую гемангиому, рак яичника, рак предстательной железы и рак легкого.

Предпосылки и актуальность изобретения

Ангиогенез, т.е. образование новых кровеносных сосудов из предсуществующих, включает сложную координацию пролиферации эндотелиальных клеток, миграции, деградации базальной мембраны и организации новых сосудов (Ιί е! а1., 1998, ЕА8ЕВ 1. 12:1731-1738). Местное, неконтролируемое высвобождение ангиогенных факторов роста и/или изменения продукции природных ангиогенных ингибиторов с последующим изменением ангиогенного равновесия (Наиайаи е! а1., 1996, Се11. 86:353-64) несут ответственность за неконтролируемую пролиферацию эндотелиальных клеток, которая имеет место в ходе неоваскуляризации опухоли и при связанных с ангиогенезом заболеваниях (Ео1ктап, 1995, №11. Меб. 1:27-31).

Идентифицированы многочисленные природные индукторы ангиогенеза, в том числе члены семейства фактора роста эндотелия сосудов (УЕСЕ), ангиопоэтины, трансформирующие факторы роста α и β (ТСЕ-α и -β), факторы роста тромбоцитов (РИСЕ), фактор некроза опухолей α (ΤΝΕ-α), интерлейкины, хемокины и члены семейства фактора роста фибробластов (ЕСЕ). Эти мощные ангиогенные факторы часто сверхэкспрессируются опухолевыми тканями (Ргек!а, 2005, Су!окте & Сго\\!11 Еас!огк Кеу1е\\ъ. 16:159-178; Стоке, 2005, Су!окше & Сго\\!11 Еас!огк Ке\зе\\ъ. 16:179-186). Действительно, ЕСЕ и более конкретно ЕСЕ2, сверхэкспрессируются в многочисленных видах рака человека, включая меланому (На1аЬап, 1996, 8етш Опсо1. 23:673-81; Напаба, 2001, Сапсег Век. 61:5511-5516), лейкоз (Кте.)с1 е! а1., 2001 Ьеикет1а. 15:228-37, В1екег е! а1., 2003, Сапсег Век. 63:7241-7246), рак почки (Напаба, 2001, Сапсег Век. 61:5511-5516), рак толстой кишки (Такк1, 2006, Сапсег Век. 66:1191-1198), рак яичника (^Ы!^от!й е! а1., 2005, С11п Сапсег Век. 11:4282-4288, Сап е! а1., 2006, Рйатт Век. 23:1324-31), рак предстательной железы (А1дпег е! а1., 2002 Опсодепе, 21:5733-42; КлтаЫ-Аббо е! а1., 2004, Епбосг Ве1а! Сапсег. 11:709-24) и рак легкого (Такапат1 е! а1., 1996, Ра!йо1 Век Ргас!. 192:1113-20; Уо1т е! а1., 1997, Апбсапсег Век. 17:99-103; Вга!!к!гот е! а1., 1998, Апбсапсег Век. 18:1123-1127). Кроме того, сверхэкспрессия ЕСЕ2 может коррелировать с хеморезистентностью определенных видов рака, включая виды рака мочевого пузыря, молочной железы, головы и шеи (Сап е! а1., 2006, Рйатт Век. 23:1324-31). Что касается членов семейства ЕСЕ, то, поскольку ЕСЕ, секретируемые опухолевыми клетками, обладают аффинностями к боковым цепям гликозаминогликанов клеточной поверхности и протеогликанам матрикса, эти секретируемые ЕСЕ наиболее вероятно секвестрируются около опухолевых клеток, образуя резервуары ЕСЕ. Эта особенность делает направленность на ЕСЕ хорошей стратегией для направления активной молекулы, для которой необходима стабильно экспрессируемая и легко доступная молекула-мишень. Различные продукты на основе антител в настоящее время используют в качестве лекарственных средств, и несколько видов моноклональных антител (тАЬ) в настоящее время одобрены в различных областях терапии, таких как онкология, воспаление, инфекционные заболевания и сердечно-сосудистые заболевания. Эти тАЬ вызывают уничтожение опухолевых клеток посредством множества механизмов, включая мобилизацию иммунной системы (Натк, 2004, Байсе! Опсо1, 5:292-302). Ес-фрагмент тАЬ отвечает за эти иммуноопосредованные эффекторные функции, которые включают два главных механизма: антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (АЭСС) и комплементзависимую цитотоксичность (СЭС). АЭСС возникает, если тАЬ сначала связывается посредством своего антигенсвязывающего участка со своей мишенью на опухолевых клетках, и затем Ес-часть узнается специфическими Ес-рецепторами (ЕсВ) на эффекторных клетках (т.е. ΝΚ, нейтрофилах, макрофагах...), которые атакуют клетку-мишень. СЭС представляет собой процесс, в котором каскад разных белков комплемента активируется при связывании тАЬ с С1ц. что ведет к образованию С3Ь на поверхности покрытых антителами опухолевых клеток рядом с участком активации комплемента. Присутствие С3Ь контролирует образование атакующего мембрану комплекса С5-С9, который может встраиваться в мембрану для лизирования опухолевых клеток (8йаткеу, 2007, СА Сапсег 1 С1ш, 56:226-243). Способность тАЬ стимулировать АЭСС зависит от их изотипа. Антитела 1дС1 и 1дС3 хорошо связываются с ЕсВ, в то время как антитела 1дС4 и 1дС2 связываются слабо. Способность тАЬ в отношении СЭС также зависит от изотипа тАЬ. 1дС3 и, в меньшей степе

- 1 018700 ни, 1дС1 представляют собой наиболее эффективные изотипы в отношении стимуляции классического каскада комплемента. шЛЬ 1дС2 в меньшей степени эффективны в отношении активации каскада комплемента, в то время как 1дС4 не способен это делать (81готе, 2007, ТПе Опсо1ощ5Е 12:1084-1095).

Использование слитого белка, который может обладать, как и антитела, двойной функциональностью, где связывающаяся часть осуществляет специфическое нацеливание, и эффекторная часть способна индуцировать лизис клеток-мишеней путем мобилизации иммунной системы, представляет собой один из аспектов этих терапевтических стратегий. Кроме того, чтобы быть пригодной в терапии, желательно, чтобы эта молекула обладала полезными фармакокинетическими свойствами РК. Ре-фрагмент может заметно повышать время полужизни в сыворотке модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора ЕСЕ и Рс, но все еще существует потребность в слитом белке с более продолжительным временем полужизни в сыворотке. Наконец, если этот слитый белок следует использовать в качестве лекарственного средства, то необходимо, чтобы его получение являлось надежным, эффективным и обладало подходящей продуктивностью.

Таким образом, существует потребность в слитом белке с активностями в отношении ЛИСС и/или ΟΌΟ нацеленном на ЕСЕ для лечения рака, метастатических опухолей и для замедления роста опухолей у субъекта, с улучшенными характеристиками РК, и который можно эффективно продуцировать.

Заявители в данной работе обнаружили, что растворимые слитые белки из растворимой части рецептора ЕСЕ (связывающего или направляющего компонента) и Рс-части (компонента с эффекторной функцией) (&ЕСРВ-Рс), которые модифицированы таким образом, чтобы обладать характерным гликановым профилем, фактически обладают, по существу, улучшенными видами биологической активности, включая активности в отношении ЛИСС и/или СЭС, и их, таким образом, можно использовать в качестве эффективных антиангиогенных и противоопухолевых лекарственных средств для лечения неконтролируемого клеточного роста или рака. Эти модифицированные растворимые слитые белки обладают полезными свойствами РК вследствие их уровня сиалирования, и их можно получать с соответствующей продуктивностью и минимальной агрегацией благодаря их паттерну гликозилирования.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение, таким образом, относится к модифицированному растворимому рецептору РСР-Рс, содержащему слияние растворимого фрагмента или домена рецептора РСР с Рс-областью иммуноглобулина, где, по меньшей мере, занят 5-й участок Ν-гликозилирования компонента рецептора РСР и где не более чем 45% Ν-гликанов компонента рецептора РСР не имеют сиалильных групп. Кроме того, согласно дополнительному предпочтительному варианту осуществления изобретения заняты 3-й, 4-й, 6-й и 7-й участки Ν-гликозилирования компонента рецептора РСР. Предпочтительно заняты все участки Νгликозилирования. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления среднее количество сиаловой кислоты на Ν-гликан в компоненте рецептора РСР слитых конструкций по изобретению составляет по меньшей мере 0,9; более предпочтительно оно составляет по меньшей мере 1,2. Каждая молекула Ν-гликана модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора РСР и Рс согласно настоящему изобретению содержит 3 остатка маннозы, в среднем от 1,5 до 3,0 остатков галактозы, от 3,5 до 5 остатков Ν-ацетилглюкозамина и от 0,6 до 1 остатка фукозы.

Настоящее изобретение также относится к модифицированным растворимым слитым конструкциям рецептора РСР и Рс, содержащим слияние растворимого фрагмента или домена рецептора РСР с Рсобластью иммуноглобулина, где заняты все участки Ν-гликозилирования, и где не более чем 45% Νгликанов компонента рецептора РСР не имеют сиалильных групп, и где Ν-гликан Рс-области является фукозилированным на 60-100%. В одном из вариантов осуществления растворимый фрагмент или домен рецептора РСР представляет собой растворимый или внеклеточный домен рецептора 1 РСР (&ЕСРК.1) или рецептора 2 РСР (8РСРВ2). В другом варианте осуществления растворимый фрагмент или домен рецептора РСР представляет собой растворимый или внеклеточный домен рецептора 1 РСР изотипа или варианта 111с (кРСРК! (111с)), или рецептора 2 РСР изотипа 111с (8РСРК.2 (111с)).

Согласно предпочтительному варианту осуществления модифицированная растворимая слитая конструкция рецептора РСР и Рс кодируется полинуклеотидом, обладающим нуклеотидной последовательностью, как представлено на 8ЕО ΙΌ Νο. 1, или полинуклеотидом, обладающим по меньшей мере 80% идентичностью с нуклеотидной последовательностью 8ЕО ΙΌ Νο. 1. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления модифицированная растворимая слитая конструкция рецептора РСР и Рс по изобретению обладает аминокислотной последовательностью, как представлено на 8ЕО ΙΌ Νο. 2, или последовательностью, обладающей по меньшей мере 95, 97, 98 или 99% идентичностью с последовательностью, как представлено в 8ЕО ΙΌ Νο. 2.

Модифицированная растворимая слитая конструкция рецептора РСР и Рс по изобретению обладает активностью в отношении ЛЭСС и/или СЭС и, таким образом, пригодна для лечения заболеваний, таких как рак. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим такие модифицированные растворимые слитые конструкции рецептора РСР и Рс.

Настоящее изобретение дополнительно относится к сочетанию модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора РСР и Рс с химиотерапевтическим средством или биотерапевтическим средством с противоопухолевыми и/или антиангиогенными свойствами.

- 2 018700

Другим объектом настоящего изобретения является способ лечения рака или способ предотвращения или замедления роста опухоли и уменьшения объема и метастазирования опухолей, включающий введение субъекту модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора ЕСЕ и Ес по настоящему изобретению в терапевтически эффективном количестве.

Краткое описание фигур

На фиг. 1А и В представлены карты экспрессирующих векторов для 8ΙΑΤ6 (8Т3САЬ3) и В4СТ1(В4САЬТ1) соответственно.

На фиг. 2А и В представлены последовательность нуклеиновой кислоты (8ЕЦ ΙΌ Νο. 9) и аминокислотная последовательность (8ЕЦ ΙΌ Νο. 10) В4СТ1(В4САЬТ1) для экспрессии с рХЬ4551.

На фиг. ЗА и В представлены последовательность нуклеиновой кислоты (8ЕЦ ΙΌ Νο. 11) и аминокислотная (8ЕЦ ΙΌ Νο. 12) последовательность 81АТ6 (8Т3САЬ3) для экспрессии с рХЬ4544.

Фиг. 4А соответствует последовательности нуклеиновой кислоты кЕСЕЕ2-Ес для экспрессии с рХЬ4410, рХЬ4429 или рХЬ4636 (8ЕЦ ΙΌ Νο. 1), фиг. 4В соответствует аминокислотной последовательности кЕСЕК2-Ес (участки Ν-гликозилирования указаны полужирным шрифтом), кодируемой рХЬ4410, рХЬ4429 или рХЬ4636 (8ЕЦ ΙΌ Νο. 2), фиг. 4С соответствует аминокислотной последовательности 8ЕСЕК2 (8ЕЦ ΙΌ Νο. 4), фиг. 4Ό соответствует аминокислотной последовательности Ес (8ЕЦ ΙΌ Νο. 6), фиг. 4Е соответствует аминокислотной последовательности линкера, и фиг. 4Е соответствует аминокислотной последовательности сигнального пептида (8ЕЦ ΙΌ Νο. 8). Он представляет собой сигнальный пептид, описанный для интерлейкина-2. Наблюдали, что слияние этого пептида выше последовательности, представленной 8ЕЦ ΙΌ Νο. 2, приводит к секретируемому белку с однородной Ν-концевой аминокислотной последовательностью.

Фиг. 5 представляет собой схематическое представление стратегии, использованной для конструирования рХЬ4 636, кодирующей кЕСЕК2-Ес и глутаминсинтетазу.

На фиг. 6А и В представлены карты экспрессирующих векторов рХЬ4429 для кЕСЕЕ2-Ес и ЭНЕЕ, и рХЬ4417, кодирующей ген устойчивости к неомицину.

Фиг. 7 представляет собой график, на котором представлена корреляция между средним количеством сиаловой кислоты на Ν-гликан 8ЕСЕЕ2 и клиренсом кЕСЕЕ2-Ес в крови. Оптимальное соотношение > 1,2. Предпочтительное соотношение > 0,9.

На фиг. 8 представлен 8Э8-РАСЕ (невосстанавливающие условия) 1 мкг кЕСЕЕ2-Ес, инкубируемого в отсутствие (-) или в присутствии (+) ПНГазы Е. М: маркер молекулярной массы.

На фиг. 9 представлено положение Ν-гликанов и нумерация в димере кЕСЕР2-Ес. Нумерация начинается от Ν-концевой аминокислотной последовательности ЕСЕЕ2 (ЕСЕЕ2_НиМАН) таким образом, что положение Ν1 соответствует Акп83, Ν2 - Акп123, Ν3 - Акп228, Ν4 - Акп241, Ν5 - Акп 265, Ν6 - Акп 297, Ν7 - Акп318, Ν8 - Акп331. Положение Ν297 соответствует положению Акп Ес (!дС1) человека.

Фиг. 10 представляет собой график, на котором представлена кинетика исчезновения белка кЕСЕЕ2-Ес (квадраты) в крови с течением времени вплоть до 72 ч.

На фиг. 11 представлено количество выявленного белка кЕСЕЕ2-Ес в плазме и печени, выраженное в % от инъецируемой дозы.

Фиг. 12 представляет собой график анализа объема опухоли А549 после лечения вплоть до 40 суток (100 мкг/мышь/введен: треугольники; 300 мкг/мышь/введен: квадраты; 500 мкг/мышь/введен: закрашенные круги; контроль с РВ8: незакрашенные круги).

Фиг. 13 представляет собой график анализа массы опухоли А549 после лечения на 40 сутки.

Фиг. 14 представляет собой график анализа объема опухоли Н460 после лечения вплоть до 22 суток (группа, подвергнутая лечению: закрашенные круги; контрольная группа с РВ8: незакрашенные круги).

Фиг. 15 представляет собой график анализа массы опухоли Н460 после лечения на 22 сутки.

Фиг. 16 представляет собой график оценки ш νίΐτο активности в отношении АЭСС для кЕСЕЕ2-Ес на опухолевых клетках Н460 и А549.

На фиг. 17 представлены графики анализа объема опухоли А549 при имплантации в три линии мышей, т.е. 8СГО (фиг. 17А), ΝΟΌ/δΟΌ (фиг. 17В) и 8СГО/Ьд (фиг. 17С), вплоть до 41 суток (кЕСЕР2-Ес, 100 мкг/мышь/введен: ромбы; контроль с РВ8: незакрашенные круги).

На фиг. 18 представлены графики анализа объема опухоли Н460 при имплантации в три линии мышей, т.е. 8СГО (фиг. 18А), ΝΟΌ/δΟΌ (фиг. 18В) и 8СГО/Ьд (фиг. 18С), вплоть до 22 суток (кЕСЕР2-Ес, 100 мкг/мышь/введен: ромбы; контроль с РВ8: незакрашенные круги).

На фиг. 19А представлена карта плазмиды, кодирующей кЕСЕЕ2-Ес (А265 ш Ес), и на фиг. 19В представлена последовательность белка кЕСЕЕ2-Ес (А265 в Ес) (8ЕЦ ΙΌ Νο. 14). Положение 392 представляет собой положение мутации в Ес-домене (Акр2 65А1а) и оно отмечено полужирным шрифтом.

Фиг. 20 представляет собой график, на котором представлен анализ объема опухоли Н460 при имплантации в линии голых мышей вплоть до 23 суток (незакрашенные круги: контроль с РВ8; ромбы: кЕСЕР2-Ес, 500 мкг/мышь/введен; незакрашенный квадрат: 8ЕСЕР2-Ес (А265Ес), 500 мкг/мышь/введен). **: р<0,01 по сравнению с контролем, послеэкспериментальный тест Αηονа и Ньюмана-Кеулса).

Подробное описание

На протяжении этого описания заявители ссылаются на журнальные статьи, патентные документы,

- 3 018700 опубликованные ссылки, веб-страницы, информацию в отношении последовательностей, доступную в базах данных, и другие источники информации. Специалист в данной области может использовать полное содержание любого из цитированных источников информации для осуществления и применения аспектов этого изобретения. Каждый цитированный источник информации конкретно приведен здесь в качестве ссылки в полном объеме. Части этих источников можно включать в этот документ при возможности или потребности. Однако значение любого термина или фразы, конкретно определенных или объясненных в этом описании, не следует модифицировать посредством содержания любого из источников. Описание и примеры, которые следуют далее, приведены исключительно в качестве иллюстрации объема этого изобретения и содержания этого описания. Специалист в данной области может разработать и сконструировать многочисленные модификации перечисленных ниже примеров без отступления от объема этого изобретения.

Настоящее изобретение относится к растворимым слитым белкам, содержащим домены рецепторов РОР. Изобретение, в общем, относится к фрагментам, доменам и, в особенности, к растворимым или внеклеточным доменам рецептора РОР. Внеклеточный домен рецептора РОР связан с соответствующим слитым партнером, таким как Рс-компонент иммуноглобулина. Таким образом, в самом широком смысле, модифицированные растворимые слитые рецепторы РОР по изобретению могут являться белками, фрагментами, доменами, внеклеточными доменами, растворимыми доменами рецептора РОР (РОРК), и любой из них связан со слитым партнером, в особенности, со слитым партнером на основе Рс-области.

Данным заявителем обнаружено, что модифицированная растворимая слитая конструкция рецептора РОР и Рс, содержащая слияние растворимого домена рецептора РОР и Рс-области иммуноглобулина, где не более чем 45% Ν-гликанов не имеют сиалильных групп, обладает предпочтительными свойствами. Преимущества паттерна сиалирования модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора РОР и Рс по изобретению включают лучший фармакокинетический профиль и улучшенную устойчивость к расщеплению ίη νίνο.

Как правило, Ν-гликаны присоединяются котрансляционно посредством специфических остатков аспарагина (Άδη).

Консенсусная последовательность А8п-Х-8ег/Тйг (где X представляет собой любую аминокислоту за исключением Рго) является необходимой, но не достаточной потому, что локальная вторичная структура может детерминировать присоединение (1еГГеи8 е1 а1., 2006, №11иге Вю1есйпо1оду 24:1241). Как предполагают, несколько факторов отвечают за то, что участки Ν-гликозилирования не заняты (1опез е1 а1., 2005, ВюсЫтюа е1 Вюрйузюа Лс1а 1726:121). Несколько участков Ν-гликозилирования присутствуют в растворимых рецепторах РОР по изобретению. Например, существуют 8 участков Ν-гликозилирования во внеклеточном домене РОРК2111С (см. фиг. 9). Ν-гликаны содержат консервативный олигосахаридный кор, связанный с Αδη. Этот кор образован тремя маннозными (Мап) и двумя Ν-ацетилглюкозаминовыми (О1сNΑсδ) моносахаридными остатками. Дополнительные О1сNΑс в норме связаны с помощью β 1,2связи с а6-Мап или а3-Мап, где Ν-ацетилнейраминовая кислота (№иАса2,6), галактоза (Оаф1,4), фукоза (Риса1,6) и разделяющий О1сNΑс (β 1,4) могут присутствовать или отсутствовать (1еГГег18 еГ а1., 2006, №1Шге Вю1есйпо1оду 24:1241).

Заявителем показано, что присутствие Ν-гликана на 5-ом участке Ν-гликозилирования от Ν-конца компонента РОРК придает предпочтительные свойства в отношении продуктивности и слабой агрегации, как показано в экспериментальных примерах. В частности, в отсутствие гликозилирования этого конкретного участка продуктивность существенно снижается, в то время как агрегация усиливается. Кроме того, присутствие этого Ν-гликана, как обнаружено, является необходимым для связывания РОР.

Настоящее изобретение, таким образом, относится к модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора РОР и Рс, содержащей слияние растворимого домена рецептора РОР и Рс-области иммуноглобулина, где, по меньшей мере, занят 5-й участок Ν-гликозилирования компонента рецептора РОР, и не более чем 45% Ν-гликанов указанного компонента рецептора РОР не имеют сиалильных групп.

Согласно дополнительному варианту осуществления изобретения заняты 3-й, 4-й, 6-й и 7-й участки Ν-гликозилирования компонента рецептора РОР. Если, по меньшей мере, 7 участков Νгликозилирования компонента рецептора РОР гликозилированы, то слитая конструкция по изобретению обладает даже лучшими свойствами в отношении продуктивности и слабой агрегации. Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к слитой конструкции растворимого фрагмента или домена рецептора РОР и Рс-области иммуноглобулина, где, по меньшей мере, занято 7 участков Νгликозилирования, и не более чем 45% Ν-гликанов слитой конструкции рецептора РОР и Рс не имеют сиалильных групп. В конкретном варианте осуществления изобретению заняты все участки Νгликозилирования.

В другом аспекте модифицированная растворимая слитая конструкция рецептора РОР и Рс по изобретению содержит среднее количество сиаловой кислоты на Ν-гликан компонента рецептора РОР, по меньшей мере, равное 0,9, т.е. это количество может составлять 0,9 или любую величину больше 0,9. В предпочтительном варианте осуществления модифицированная растворимая слитая конструкция рецеп

- 4 018700 тора ЕСЕ и Ес по изобретению содержит среднее количество сиаловой кислоты на Ν-гликан, по меньшей мере, равное 1,2. Такое соотношение, как обнаружено заявителем, обеспечивает максимальную концентрацию в крови растворимого слитого рецептора ЕСЕ по изобретению, которая может являться сравнимой с оптимальной концентрацией в крови, найденной для Ес-молекул.

Настоящее изобретение дополнительно относится к модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора ЕСЕ и Ес, содержащей слияние растворимого фрагмента или домена рецептора ЕСЕ с Ес-областью иммуноглобулина, где заняты все участки Ν-гликозилирования, и где не более чем 45% Νгликанов компонента рецептора ЕСЕ не имеют сиалильных групп, и где Ν-гликаны Ес-области не фукозилированы. В другом варианте осуществления модифицированная растворимая слитая конструкция рецептора ЕСЕ и Ес по изобретению частично фукозилирована, например, фукозилирована на 0-60%. В другом варианте осуществления модифицированная растворимая слитая конструкция рецептора ЕСЕ и Ес по изобретению полностью фукозилирована. В предпочтительном варианте осуществления модифицированная растворимая слитая конструкция рецептора ЕСЕ и Ес по изобретению фукозилирована на 60100%. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления каждая молекула Ν-гликана модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора ЕСЕ и Ес согласно настоящему изобретению дополнительно содержит 3 остатка маннозы и в среднем от 1,5 до 3,0 остатков галактозы, от 3,5 до 5 остатков Ν-ацетилглюкозамина на молекулу гликана и от 0,6 до 1 остатка фукозы.

Согласно изобретению модифицированная растворимая слитая конструкция рецептора ЕСЕ и Ес связывается с лигандом ЕСЕ с высокой аффинностью. Например, указанная слитая конструкция связывается с ЕСЕ2 с величиной К_с, измеренной с помощью В1асоге™, находящейся между 1 и 5 нМ. В предпочтительном варианте осуществления изобретения величина К указанной слитой конструкции для ЕСЕ2, измеренной с помощью В1асоге™, составляет приблизительно 1,5 нМ.

Такие модифицированные слитые конструкции, как описано выше, пригодны в качестве мощных и терапевтически эффективных ингибиторов роста опухолей. Действительно, заявителем показано, что модифицированные растворимые слитые конструкции рецептора ЕСЕ и Ес по изобретению способны к ингибированию роста опухоли ίη νίνο. Более того, указанные модифицированные растворимые слитые конструкции рецептора ЕСЕ и Ес по изобретению способны запускать ответы в виде АЭСС и/или СЭС как ίη νίίτο, так и ίη νίνο. В качестве молекул, эффективно опосредующих АЭСС и/или СЭС, эти соединения в особенности пригодны для лечения сверхэкспрессирующих ЕСЕ раковых опухолей.

Последовательности ЕСЕК, используемые для соединений на основе ЕСЕК, полноразмерного ЕСЕК или фрагментов ЕСЕК, синтетических последовательностей ЕСЕК, внеклеточных доменов, растворимых доменов или их слитых конструкций, можно выбрать из любых доступных или известных последовательностей. ЕСЕК принадлежит к тирозинкиназному семейству рецепторов и к семейству иммуноглобулиновых (1д) супергенов. В трансмембранных формах рецептора тирозинкиназный домен является внутриклеточным, и Ц-подобные домены являются внеклеточными. Как трансмембранная, так и секретируемая формы связываются с ЕСЕ. Существует по меньшей мере четыре гена, которые кодируют ЕСЕК, которые обладают общей структурой из двух или трех внеклеточных иммуноглобулин-(1д)-подобных петель (1д1-1д111) и одного внутриклеточного тирозинкиназного домена. Также известны продукты альтернативного сплайсинга, из экзонов, кодирующих внеклеточную область, что приводит к нескольким формам рецептора. Третья 1д-подобная петля дает по меньшей мере три варианта рецептора, и две трансмембранных формы получаются при альтернативном сплайсинге двух экзонов (ШЬ и 111с), кодирующих вторую половину петли III. Например, селективный участок полиаденилирования, предшествующий экзонам 111Ь и 111с, используют для получения растворимой формы ЕСЕК1 (111а). У человека и мыши сплайсированный вариант 1д111а ЕСЕК1 кодирует белок, который явным образом не обладает гидрофобным трансмембранным доменом и может, таким образом, являться секретируемой или растворимой формой рецептора. Соединения на основе ЕСЕК могут также содержать последовательности из ЕСЕК1 (белковый локус на ΝΟΒΙ, ΝΡ_075598); ЕСЕК2 (белковый локус на NСВI, ΝΡ_000132); ЕСЕК3 (белковый локус на NСВI, Ρ22607) и ЕСЕК4 (белковый локус на NСВI, ΝΡ_002002) (К1е1ег е( а1., 1991, Сго\\111 Еасΐοτ8 5:115-127).

Растворимые формы рецепторов ЕСЕ, содержащие внеклеточные домены, также рассмотрены в патентах США Νο. 5288855; 6656728; №О 91/00916; №О 92/00999; №О 00/46380; №О 2005/016966; №О 2005/113295; №О 2006/113277; №О 2007/014123; и европейском патенте 529076. Фрагменты, домены или растворимые или внеклеточные домены ЕСЕК, как применяют по изобретению, могут включать фрагмент ЕСЕК, который является внеклеточным в своей нативной форме или состоит изо всей секретируемой формы или ее части в естественных условиях. Более того, последовательности ЕСЕК, как применяют по этому изобретению, могут представлять собой последовательности, конкретно описанные или перечисленные, и последовательности, обладающие приблизительно 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91 или 90% идентичностью аминокислотной последовательности по сравнению с полноразмерной полипептидной последовательностью, описанной или представленной, или обладающие приблизительно 95, 90, 85, 80 или 75% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты по сравнению с кодирующей полипептид областью нуклеиновых кислот, кодирующих последовательности ЕСЕК по изобретению. Фраг

- 5 018700 мент или домен может также содержать дополнительные аминокислоты или другие области ЕСЕК при условии, что эти дополнительные аминокислоты или области не нарушают или значительно не снижают возможность использования соединения на основе ЕСЕК, как описано в этом изобретении. Полипептид или слитый белок, состоящий в существенной степени из домена или фрагмента ЕСЕК, может содержать другие аминокислоты, при условии, что сохраняются способность к экспрессии в клетке млекопитающих и связывание с ЕСЕ и, не обязательно, кроме того, при условии, что сохраняется способность замедлять клеточный рост или снижать степень васкуляризации.

В одном из вариантов осуществления растворимый фрагмент или домен рецептора ЕСЕ является растворимым или внеклеточным доменом рецептора 1 ЕСЕ (кЕСЕК1) или рецептора 2 ЕСЕ (кЕСЕК2).

Выбранные фрагменты ЕСЕК1 и ЕСЕК2 могут обладать одной или несколькими из следующих мутаций: Ν-концевая делеция 1-7 аминокислот; или Ν-концевое замещение; делеция последовательности петли 1; делеция последовательности кислого участка. Полинуклеотиды, кодирующие мутанты по аминокислотной последовательности, можно получать множеством способов, известных в данной области, включая в качестве неограничивающих примеров олигонуклеотид-опосредованный (или сайтнаправленный) мутагенез, РСК-мутагенез и кассетный мутагенез ранее полученной мутантной или немутантной версии интересующей молекулы (см., например, Кипке1, 1985, Ргос Να11 Асаб 8е1 И8Л 82:488).

В другом варианте осуществления растворимый фрагмент или домен рецептора ЕСЕ представляет собой растворимый или внеклеточный домен рецептора 1 ЕСЕ изотипа 111с (кЕСЕК1 (111с)) и рецептора 2 ЕСЕ изотипа 111с (кЕСЕК2(Шс)).

Предпочтительные варианты осуществления включают растворимый фрагмент или домен рецептора 2 ЕСЕ изотипа или варианта 111с, кодируемый полинуклеотидом, обладающим последовательностью 8ЕО ГО Νο. 3, и/или обладающий аминокислотной последовательностью 8ЕО ГО Νο. 4, или последовательностью по меньшей мере с 95, 97, 98 или 99% идентичностью с 8ЕО ΙΌ Νο. 4.

Согласно этому последнему варианту осуществления модифицированная растворимая слитая конструкция рецептора ЕСЕ и Ес (кЕСЕК2-Ес) по настоящему изобретению успешно обладает высокой аффинностью в отношении своего естественного лиганда ЕСЕ2 или высокой величиной К_с порядка наномолей, находящейся между 1 и 5 нМ и, более конкретно, составляющей приблизительно 1,5 нМ.

Конкретные примеры доменов иммуноглобулинов включают без ограничения Ес-область молекулы иммуноглобулина; шарнирную область молекулы иммуноглобулина; СНд-область молекулы иммуноглобулина; СН₂-область молекулы иммуноглобулина; СН₃-область молекулы иммуноглобулина; СН₄область молекулы иммуноглобулина; и легкую цепь молекулы иммуноглобулина и гуманизированные варианты любой из них. Последовательности этих областей также доступны специалисту в данной области (см., например, Ниск е1 а1., 1986, №с1е1с Аабк Кек. 14:1779).

Как применяют в описании и формуле изобретения, Ес-область иммуноглобулина или Ес означает карбоксиконцевую часть константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Ес-области, в частности, важны для детерминирования биологических функций иммуноглобулина, и эти биологические функции называют эффекторными функциями. Как известно в данной области тяжелые цепи подклассов иммуноглобулинов содержат четыре или пять доменов: 1дМ и 1дЕ обладают пятью доменами тяжелой цепи, и 1дА, Ι§Ό и 1дС обладают четырьмя доменами тяжелой цепи. Ес-область 1дА, Ι§Ό и 1дС представляет собой димер доменов шарнирная область-СН₂-СН₃, и у 1дМ и 1дЕ она представляет собой димер доменов шарнирная область-СН₂-СН₃-СН₄. Кроме того, СН₃-домен 1дМ и 1дЕ структурно эквивалентен СН₂домену 1дС, и СН₄-домен 1дМ и 1дЕ является гомологом СН₃-домена 1дС (см., Е. Раи1, еб., 1993, Еипбатеп!а1 1ттипо1о§у, Кауеп Ргекк, №\ν Уогк, №\ν Уотк). Любая из известных Ес-областей может являться пригодной в качестве Ес-области в модифицированных растворимых слитых конструкциях рецептора ЕСЕ и Ес по изобретению.

В одном из вариантов осуществления ген, кодирующий Ес-область 1дС человека (Есу), получают с помощью обратной транскрипции и РСК с использованием РНК, полученной из лейкоцитов человека, и соответствующих 5'- и З'-праймеров. Полученные в результате фрагменты ДНК содержат полные последовательности шарнирной области, СН₂- и СН₃-доменов 1дС, и их можно использовать в качестве матрицы для получения вариантов, в которых замещены определенные аминокислоты, как известно в данной области. Праймер, кодирующий пептидный линкер, включающий необязательный участок для фермента рестрикции, можно встроить в ходе процесса РСК. Полученные в результате фрагменты ДНК вставляют в несущий вектор и подтверждают секвенированием ДНК.

Предпочтительно используют Ес-область иммуноглобулина гамма-1, которая включает по меньшей мере часть шарнирной области, СН|-область. СН₂-область и СН₃-область. Кроме того, Ес-область иммуноглобулина гамма-1 может представлять собой Ес с удаленным СН1 или Ес с удаленным СН₂ и включает часть шарнирной области и СН₃-область, где СН1- и/или СН₂-область можно удалить. Ес с удаленным СН₂ описан у С1Шек е! а1., (1990, Нит. АпОЬоб. НуЬпботак, 1:47).

Наиболее предпочтительно Ес-область 1дС1 содержит последовательность, кодируемую полинуклеотидом, обладающим последовательностью 8ЕО ГО №. 5, и/или аминокислотную последовательность, как представлено на 8ЕО ГО №. 6, или последовательность по меньшей мере с 95% идентичностью с 8ЕО ГО №. 6. Однако Ес-области других классов иммуноглобулинов, 1дА, Ι§Ό, 1дЕ и 1дМ, могут также

- 6 018700 являться пригодными в качестве Ес-области.

Кроме того, можно получить делеционные конструкции этих Ес-областей, в которых удалены один или несколько константных доменов. Специалист в данной области может получить такие делеционные конструкции с использованием хорошо известных способов молекулярной биологии. Кроме того, используемая Ес-область может представлять собой область, которая обладает приблизительно 99% или приблизительно 98%, или приблизительно 95%, или приблизительно 90%, или приблизительно 85%, или приблизительно 80%, или приблизительно 75% аминокислотной идентичностью с областью, представленной на 8ЕО ΙΌ Νο. 6.

Конкретные мутации по сравнению с 8ЕО ΙΌ Νο. 6, которые можно отобрать и использовать по отдельности или в любом сочетании, представляют собой: делецию или замещение одного из Сук внутри первых 20 Ν-концевых аминокислот; делецию Сук в положении 5 в 8ЕО ΙΌ Νο. 6; или замещение Сук в положении 5. Выбранная последовательность Ес-области может заметным образом увеличить время полужизни в сыворотке модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора ЕСЕ и Ес.

Модифицированная растворимая слитая конструкция рецептора ЕСЕ и Ес по изобретению может содержать шарнирную или спейсерную область, которую можно использовать между растворимой частью рецептора и Ес-областью (Ак11кспа/1 с1 а1., 1997, Ситгеп! Ορίπίοη ίη 1ттиио1о§у, 9:195-200). Примеры включают гибкий пептидный линкер приблизительно с 20 или менее аминокислотами в длину. Более предпочтительно пептидный линкер может представлять собой по меньшей мере три аминокислоты в длину и/или пептидный линкер, содержащий две или более из следующих аминокислот: глицин, серин, аланин и треонин. В предпочтительном варианте осуществления пептидный линкер не включает участок расщепления протеазой. Наиболее предпочтительный линкер представляет собой 8АЬ (8ет-А1а-Ееи).

Настоящее изобретение также относится к конструированию полинуклеотидов, кодирующих модифицированную растворимую слитую конструкцию рецептора ЕСЕ и Ес согласно настоящему изобретению, а также вектор, способный экспрессировать модифицированную растворимую слитую конструкцию рецептора ЕСЕ и Ес при введении в соответствующую клетку-хозяина. Согласно предпочтительному варианту осуществления полинуклеотид, кодирующий модифицированную растворимую слитую конструкцию рецептора ЕСЕ и Ес, обладает последовательностью 8ЕО ΙΌ Νο. 1 или последовательностью, обладающей по меньшей мере 80% идентичностью с 8ЕО ΙΌ Νο. 1. Как применяют здесь, вектор понимают как обозначающий любую нуклеиновую кислоту, содержащую интересующую нуклеотидную последовательность и способную к введению в клетку-хозяина и, не обязательно, к экспрессии кодируемого белка или полипептида. Векторы включают линейные нуклеиновые кислоты, плазмиды, фагмиды, космиды и т.п., все они известны специалисту в данной области. Полинуклеотиды, кодирующие ЕСЕК или слитое соединение по изобретению, а также векторы, содержащие эти нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, в которые эти векторы можно ввести, также конкретным образом включены в объем изобретения.

Наиболее предпочтительно слитые молекулы по изобретению кодируются ДНК, содержащей внеклеточный домен ЕСЕК, слитый на С-конце с Есу1-областью гена иммуноглобулина γ1 человека. Есу1область гена иммуноглобулина γ1 содержит, по меньшей мере, часть шарнирного домена и СН₃-домена или по меньшей мере часть шарнирного домена, СН₂-домена и СН₃-домена. ДНК, кодирующая химерные полипептидные молекулы согласно настоящему изобретению, может представлять собой свою геномную конфигурацию или свою конфигурацию в виде кДНК. Сигнальные пептиды можно использовать для эффективной инициации транспорта белка через мембрану эндоплазматического ретикулума. Сигнальные последовательности хорошо охарактеризованы в данной области, и известно, что они, как правило, содержат от 16 до 30 аминокислотных остатков, хотя возможны и другие размеры. Подробное рассмотрение последовательностей сигнальных пептидов представлено у νοη Нерпе (1986, №.1с1ею Аабк Кек., 14:4683). Согласно предпочтительному варианту осуществления сигнальный пептид получают из сигнального пептида интерлейкина-2 (8ЕО ΙΌ Νο. 8), как известно в данной области. Заявителем замечено, что слияние этого пептида с внеклеточным доменом ЕСЕК дает секретируемый белок с гомогенной Νконцевой аминокислотной последовательностью, что не имеет места в случае, если использовать эндогенный сигнальный пептид ЕСЕК.

Экспрессирующий вектор, содержащий последовательности, кодирующие модифицированную растворимую слитую конструкцию рецептора ЕСЕ и Ес по изобретению, помещенную под управление соответствующих транскрипционных и трансляционных регуляторных последовательностей, можно конструировать с помощью технологии рекомбинантных ДНК, как известно в данной области. Такой экспрессирующий вектор вводят в клетку-хозяина любым способом, известным специалисту в данной области. Полученную в результате клетку, содержащую вектор, затем выращивают для продукции модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора ЕСЕ и Ес или ее фрагмента, с использованием любого способа, известного специалисту в данной области.

Согласно изобретению, можно использовать множество экспрессионных систем для экспрессии модифицированных растворимых слитых молекул рецептора ЕСЕ и Ес. В одном из аспектов такие экспрессионные системы представляют собой носители, с помощью которых интересующие кодирующие

- 7 018700 последовательности можно получать и затем очищать, но также представляют собой клетки, которые могут, при транзиентной трансфекции соответствующими нуклеотидными кодирующими последовательностями, экспрессировать модифицированную растворимую слитую молекулу рецептора ЕСЕ и Ес по изобретению ίη зби. Клетки млекопитающих обычно используют для экспрессии рекомбинантной модифицированной растворимой слитой молекулы рецептора ЕСЕ и Ес, в особенности для экспрессии полноразмерной рекомбинантной модифицированной растворимой слитой молекулы рецептора ЕСЕ и Ес. Например, клетки млекопитающих, такие как клетки НЕК293 или СНО, в сочетании с вектором, содержащим сигнал для экспрессии, таким как сигнал, несущий элемент промотора главного промежуточного раннего гена цитомегаловируса человека, представляют собой эффективную систему для экспрессии модифицированных растворимых слитых конструкций рецептора ЕСЕ и Ес по изобретению (Еоеск1пд е! а1., 1986, Сепе 45:101; Соскеб е! а1., 1990, Вю/Тесбпо1оду 8:2).

Кроме того, клетку-хозяина выбирают так, что она модулирует экспрессию встроенных последовательностей или модифицирует и процессирует продукт гена желаемым специфическим образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессинг белковых продуктов могут являться важными для функции белка. Разные клетки-хозяева обладают характеристиками и специфическими механизмами для посттрансляционного процессинга и модификации белков и генных продуктов. Соответствующие линии клеток или системы-хозяева выбирают так, чтобы обеспечить правильную модификацию и процессинг экспрессируемой интересующей модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора ЕСЕ и Ес. Таким образом, можно использовать эукариотические клетки-хозяева, которые обладают клеточными механизмами для правильного процессинга первичного транскрипта, гликозилирования генного продукта. Такие клетки-хозяева млекопитающих включают без ограничения клетки СНО, СО8, НЕК293, 3Т3 или миеломы. Клетку-хозяина можно совместно трансфицировать двумя или более экспрессирующими векторами, включая вектор, экспрессирующий белок по изобретению. Например, клетку-хозяина можно трансфицировать первым вектором, кодирующим модифицированный растворимый слитый полипептид рецептора ЕСЕ и Ес, как описано выше, и вторым вектором, кодирующим полипептид гликозилтрансферазы. Альтернативно, второй вектор может экспрессировать малую интерферирующую РНК против гликозилтрансферазы.

Для долговременной, высокопродуктивной продукции рекомбинантных белков, предпочтительна стабильная экспрессия. В одном из вариантов осуществления изобретения можно сконструировать линии клеток, которые стабильно экспрессируют модифицированную растворимую слитую молекулу рецептора ЕСЕ и Ес. Вместо использования экспрессирующих векторов, которые содержат вирусные ориджины репликации, клетки-хозяева трансформируют ДНК под управлением соответствующих экспрессионных регуляторных элементов, включая промоторы, энхансеры, терминаторы транскрипции, участки полиаденилирования и другие соответствующие последовательности, известные специалисту в данной области, и селектируемый маркер. После ведения чужеродной ДНК сконструированным клеткам можно дать возможность расти в течение одних или двух суток в обогащенной среде и затем перенести в селективную среду. Селектируемый маркер на рекомбинантной плазмиде сообщает устойчивость в отношении селекции и дает возможность клеткам стабильно интегрировать плазмиду в хромосому и развиться в линию клеток.

Ряд систем селекции можно использовать согласно изобретению, включая в качестве неограничивающих примеров гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (\У1д1ег е! а1., 1977, Се11 11:223), гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (8хуЬа1зка е! а1., 1992, Ргос №а!1 Асаб 8с1 И8А 48:202), селекции с помощью глутаматсинтетазы в присутствии метионинсульфоксимида (Абт Эгид Эе1 Вет, 2006, 58:671 и вебсайт или литература от бопха Сгоир Ыб.) и аденинфосфорибозилтрансферазы (Ьо^у е! а1., 1980, Се11 22:817) в клетках !к, бдрб или арб, соответственно. Также устойчивость к антиметаболитам можно использовать в качестве основы для селекции на следующие гены: бЫг, который придает устойчивость к метотрексату (\У1д1ег е! а1., 1980, Ргос №111 Асаб δα И8А 77:357); др!, который придает устойчивость к микофеноловой кислоте (МцШдап е! а1., 1981, Ргос №а!1 Асаб δα И8А 78:2072); пео, который придает устойчивость к аминогликозиду С-418 (\Уи е! а1., 1991, ВюШегару 3:87); и будто, который придает устойчивость к гигромицину (8ап1егге е! а1., 1984, Сепе 30:147). Способы, известные в данной области технологии рекомбинантных ДНК, можно обычным образом использовать для селекции требуемого рекомбинантного клона, и такие способы описаны, например, в АизиЬе1 е! а1., ебз., Сиггеп! Рго!осо1з ш Мо1еси1аг Вю1оду, 1обп \УПеу & 8опз (1993). Уровни экспрессии модифицированной растворимой слитой молекулы рецептора ЕСЕ и Ес можно повышать путем амплификации вектора. Если маркер в векторной системе, экспрессирующей модифицированную растворимую слитую конструкцию рецептора ЕСЕ и Ес, можно амллифицировать, то повышение уровня ингибитора, присутствующего в культуре, будет повышать количество копий маркерного гена. Так как амплифицируемая область ассоциирована с геном, кодирующим модифицированную растворимую слитую конструкцию рецептора ЕСЕ и Ес по изобретению, продукция указанной модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора ЕСЕ и Ес также возрастет (Сгоизе ей а1., 1983, Мо1 Се11 Вю1 3:257).

Специалисту в данной области известен ряд факторов, которые влияют на уровень гликозилирования гликопротеина. Например, модифицированные клетки-хозяева млекопитающих можно использовать

- 8 018700 для изменения профиля гликозилирования модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора ЕСЕ и Ес путем повышения или снижения экспрессии гликозилтрансферазы. Такие модифицированные клетки-хозяева млекопитающих включают без ограничения клетки СНО, СО8, НЕК293, РЕК.С6, 3Т3, ΥΒ2/0 и миеломы (81ап1еу е! а1., 1986, ЛгсЫуез о£ ВюсйешШгу апб ВюрЬузкз, 249:533; Моп е! а1., 2006, Вю!есйпо1оду апб Вюеидтеегтд 94:68; СЫНаги е! а1., 1998, ВюсЫет. 1. 336:647; Итапа е! а1., 1999 №11иге Вю!есйпо1оду 17:176). Специалисту в данной области также известно, что факторы биопроцессинга влияют на биосинтез олигосахаридов гликопротеинов (СоосЫее е! а1., 1994, Сигг Ορίη Вю!есйпо1. 5:546). Эффект условий культивирования клеток, таких как концентрация глюкозы или ионов аммония, рН, сыворотка, и эффекты других факторов биопроцессинга, таких как скорость роста клеток, время культивирования, влияют на Ν-связанное гликозилирование (Вю!есйпо1. Вюепд. 39:327 (1993); Вю1есЬпо1. Вюепд. 68:370 (2000); Вю/!есйпо1оду 11:720 (1993); Су!о!есйпо1оду 17:13 (1995); Вюсйет 1. 272:333 (1990)). Известно также, что в дополнение к клеткам-хозяевам и факторам биопроцессинга, на процессинг олигосахаридов влияют местное окружение в каждом участке Ν-гликозилирования, в зависимости от местного окружения гликопротеина. Различия от участка к участку могут быть значительными, как те, которые наблюдают для !-РА, или могут включать более тонкие отличия в разветвлении и конечном процессинге, как те, которые наблюдают для трех участков Ν-гликозилирования ЕРО (СоосЫее е! а1., 1991, Вю/Тесйпо1оду 9:1347).

После осуществления продукции модифицированную растворимую слитую конструкцию рецептора ЕСЕ и Ес по изобретению можно очищать любым способом, известным в данной области для очистки молекулы иммуноглобулина, например хроматографией (например, ионообменной, аффинной, в частности по аффинности к белку А для Ес, и т.п.), центрифугированием, по дифференциальной растворимости или с помощью любого другого общепринятого способа очистки белков.

Количественное определение сиаловой кислоты (остатков Ν-ацетилнейраминовой кислоты), анализ углеводного состава и количественное олигосахаридное картирование Ν-гликанов в очищенных модифицированных растворимых слитых белках рецептора ЕСЕ и Ес можно осуществлять в существенной степени, как описано ранее (8аббю е! а1. МеШобк Мо1. Вю1. 194:23-36 (2002) и Апити1а е! а1. С1усоЬю1оду 8:685-694 (1998)).

Слитые белки, содержащие растворимые домены рецептора ЕСЕ, можно продуцировать способами для любой другой экспрессируемой или биологически активной слитой конструкции млекопитающих, с которыми знакомы специалисты в данной области, с соответствующими изменениями. Например, как сообщалось, способы сочетания Ес-областей 1дС с доменами цитокинов и растворимых рецепторов можно применить для конструирования и продукции соединений ЕСЕК по изобретению (см., например, Сароп е! а1., Х/Пиге. 337:525-531 (1989); Скатов е! а1., Тгепбк Вю!ескпо1., 14:52-60 (1996); И8 5116964, 5349053 и 5541087). Другие примеры слитых белков рецептор-1д, которые можно применять, включают примеры в И8 5726044, 5707632 и 5750375. Так как внеклеточные домены рецептора ЕСЕ обладают значительной степенью гомологии с семейством иммуноглобулиновых генов, и внеклеточный домен ЕСЕК содержит 1д-подобные сегменты, использование Ес-областей является особенно предпочтительным. В одном из примеров слитая конструкция представляет собой гомодимерный белок, связанный посредством остатков цистеина в шарнирной области 1дС Ес, что приводит к молекуле с характеристиками, сходными с молекулой 1дС. Одним из преимуществ использования Ес-области является увеличенное время полужизни в циркуляции. Кроме того, модификации по гликозилированию модифицированных растворимых слитых белков рецептора ЕСЕ и Ес по изобретению приводят к улучшению фармакокинетических свойств, так как слитые конструкции по изобретению обладают фармакокинетическими профилями ш У1уо, сравнимыми с 1дС человека сходного изотипа.

Дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу получения модифицированного растворимого слитого белка рецептора ЕСЕ и Ес, содержащего фрагмент или домен ЕСЕК, гибкий пептидный линкер и вариант 1дС Ес человека, где способ включает: (а) получение линии клеток, происходящей из СНО; (Ь) выращивание линии клеток в условиях, таких, что происходит экспрессия рекомбинантного слитого белка; и (с) очистка экспрессируемого белка со стадии (Ь). В этом случае, предпочтительно гибкий пептидный линкер, содержащий, по меньшей мере, приблизительно 3 аминокислоты между растворимым рецептором ЕСЕ и вариантом 1дС Ес человека, содержит две или более аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из глицина, серина, аланина и треонина. В дополнительных и связанных вариантах осуществления линкерный пептид отсутствует или представляет собой только одну аминокислоту в длину. В предпочтительном варианте осуществления пептидный линкер не содержит участок расщепления протеазой. Наиболее предпочтительный линкер представляет собой 8АЬ (8ег-А1а-Ьеи).

Предпочтительно модифицированный растворимый слитый белок рецептора ЕСЕ продуцируют в клетках СНО суспензионным способом, как описано здесь в примерах.

Как здесь показано в примерах, модифицированные растворимые слитые конструкции рецептора ЕСЕ и Ес по настоящему изобретению обладают противоопухолевой активностью, по меньшей мере, посредством индукции ответов в виде АЭСС и/или СЭС и, таким образом, пригодны при лечении метастатических опухолей и заболеваний, таких как рак. Один из аспектов изобретения, таким образом, отно

- 9 018700 сится к модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора ЕСЕ и Ес, как описано выше, с активностями в отношении АЭСС и/или СЭС.

Особый интерес представляют модифицированные растворимые слитые конструкции рецептора ЕСЕ и Ес с повышенной способностью опосредовать клеточные цитотоксические эффекторные функции, такие как АЭСС. Такие белки можно получать, производя одиночные или множественные замещения в Ес-области молекулы, таким образом, изменяя ее взаимодействие с Ес рецепторами. Способы конструирования таких мутантов можно найти, например, в Бахаг с1 а1. (2006, Ргос. №111. Асаб. 8сЕ И.8.А. 103 (11):4005-4010) и Ока/ак1 е1 а1. (2004, 1. Мо1. Бю1. 336(5):1239-49). См. также МО 03/074679, МО 2004/029207, МО 2004/099249, МО 2006/047350, МО 2006/019447, МО 2006/105338, МО 2007/041635. Также возможно использование линий клеток, конкретным образом сконструированных для продукции улучшенных модифицированных растворимых слитых конструкций рецептора ЕСЕ и Ес. В частности, эти линии обладают измененным регулированием пути гликозилирования, приводя к модифицированным растворимым слитым конструкциям рецептора ЕСЕ и Ес, которые слабо фукозилированы или даже полностью дефукозилированы. Такие линии клеток и способы их конструирования описаны, например, в 81ипка\\а е1 а1. (2003, 1. Бю1. Сйет. 278 (5):3466-3473), Ееггага е1 а1. (2006, 1. Вю1. Сйет. 281(8):5032-5036; 2006, Вю1есЬпо1. Вюепд. 93(5):851-61), ЕР 1331266, ЕР 1498490, ЕР 1498491, ЕР 1676910, ЕР 1792987 и МО 99/54342.

Способы ингибирования роста опухоли у субъекта и способы лечения или предотвращения метастазирования у субъекта, включающие введение эффективного количества таких модифицированных растворимых слитых конструкций рецептора ЕСЕ и Ес, как описано выше, представляют собой аспект изобретения. Изобретение, таким образом, также относится к модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора ЕСЕ и Ес, как описано выше, в качестве лекарственного средства. Настоящее изобретение также относится к применению модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора ЕСЕ и Ес, как описано выше, для получения лекарственного средства для лечения или ингибирования роста опухоли у субъекта. Другой аспект изобретения относится к фармацевтическим композициям модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора ЕСЕ и Ес по изобретению. Фармацевтические композиции по изобретению, как правило, содержат модифицированную растворимую слитую конструкцию рецептора ЕСЕ и Ес по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Как применяют здесь, фармацевтически приемлемый носитель включает все без исключения растворители, буферы, солевые растворы, диспергенты, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические и замедляющие всасывание средства и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Тип носителя можно выбрать на основе намеченного способа введения. В различных вариантах осуществления носитель пригоден для внутривенного, внутрибрюшинного, подкожного, внутримышечного, местного, трансдермального или перорального введения. Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или коллоидные растворы и стерильные порошки для получения ех (етрога стерильных растворов или коллоидных растворов для инъекций. Использование сред и средств для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области. Как подробно рассмотрено ниже в данном описании, дополнительные активные соединения можно также вносить в композиции, такие как противораковые и/или антиангиогенные средства; в частности, дополнительное активное соединение может являться антиангиогенным средством, химиотерапевтическим средством или низкомолекулярным средством. Типичную фармацевтическую композицию для внутривенной инфузии можно получать таким образом, чтобы она содержала 250 мл стерильного раствора Рингера и 100 мг сочетания. Фактические способы получения парентерально вводимых соединений хорошо известны или очевидны специалистам в данной области и описаны более подробно, например, в ВеттЦоп'з Рйагтасеийса1 8с1епсе, 17(Н еб., Маск РиЫЦЫпд Сотрапу, Еаз1оп. Ра. (1985) и его 18-ом и 19-ом изданиях, которые приведены здесь в качестве ссылки.

Модифицированную растворимую слитую конструкцию рецептора ЕСЕ и Ес по изобретению можно также получать с носителями и формуляциями с контролируемым высвобождением, включая имплантаты и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать биоразлагаемые и биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевую кислоту, коллаген, полиортоэфиры, полимолочную кислоту и сополимеры полимолочной, полигликолевой кислот (РЬС). Специалистам в данной области, как правило, известно множество способов получения таких формуляций.

Модифицированную растворимую слитую конструкцию рецептора ЕСЕ и Ес в композиции предпочтительно получают в формуляций в эффективном количестве. Эффективное количество относится к количеству, эффективному, в необходимых дозировках и в течение необходимых периодов времени, для достижения требуемого результата, такого как модуляция активности ЕСЕ и/или ЕСЕК и индукция ответов в виде АЭСС и/или СЭС. Терапевтически эффективное количество означает количество, достаточное для оказания влияния на курс лечения состояния конкретного заболевания. Терапевтически эффективное количество представляет собой также количество, в котором любые токсические или вредные эффекты перевешиваются терапевтически благоприятными эффектами.

Для терапевтических применений модифицированные растворимые слитые конструкции рецептора

- 10 018700

ЕСЕ и Ес по изобретению вводят млекопитающему, предпочтительно человеку, в фармацевтически приемлемой лекарственной форме, такой как формы, рассмотренные выше, включая формы, которые можно вводить человеку внутривенно в виде болюса или непрерывной инфузией в течение периода времени, внутримышечным, внутрибрюшинным, интрацереброспинальным, подкожным, внутрисуставным, интрасиновиальным, интратекальным, пероральным, местным или ингаляционным способами. Модифицированные растворимые слитые конструкции рецептора ЕСЕ и Ес также соответствующим образом вводят интратуморальным, перитуморальным, внутриочаговым или околоочаговым способами для вызывания местных, а также системных терапевтических эффектов. Как ожидают, внутрибрюшинный способ особенно пригоден, например, при лечении опухолей яичника.

Режимы дозирования можно приспосабливать для обеспечения оптимального ответа. Например, можно вводить одиночный болюс, можно вводить несколько отдельных доз с течением времени, или дозу можно пропорционально понижать или повышать. Композиции по изобретению можно вводить субъекту для влияния на активность клеточного роста у субъекта. Как применяют здесь, термин субъект предназначен для включения живых организмов, у которых имеет место ЕСЕ-зависимый клеточный рост, и, в частности, включает млекопитающих, таких как кролики, собаки, кошки, мыши, крысы, обезьяны, их трансгенные виды и человека.

Модифицированные растворимые слитые конструкции рецептора ЕСЕ и Ес и фармацевтические композиции по изобретению пригодны при лечении или предотвращении множества видов рака, включая (в качестве неограничивающих примеров) следующее: карциному, включая карциному мочевого пузыря, молочной железы, толстой кишки, головы и шеи, почки, включая почечноклеточную карциному, печени, легкого, яичника, поджелудочной железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы и кожи; включая плоскоклеточную карциному; гематопоэтические опухоли лимфоидного происхождения, включая лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, В-клеточную лимфому, Тклеточную лимфому, лимфому Беркитта; гематопоэтические опухоли миелоидного происхождения, включая острый и хронический миелогенные лейкозы и промиелоцитарный лейкоз; опухоли мезенхимального происхождения, включая фибросаркому и рабдомиосаркому; другие опухоли, включая меланому, семиному, тератокарциному, нейробластому и глиому; опухоли центральной и периферической нервной системы, включая астроцитому, нейробластому, глиому и шванномы; опухоли мезенхимального происхождения, включая фибросаркому, рабдомиосаркому и остеосаркому; и другие опухоли, включая меланому, пигментную ксеродерму, кератоакантому, семиному, фолликулярный рак щитовидной железы и тератокарциному, и другие виды рака, которые еще не определены, но которые вызываются сверхэкспрессией ЕСЕ. В предпочтительном варианте осуществления модифицированную растворимую слитую конструкцию рецептора ЕСЕ и Ес по изобретению применяют для лечения меланомы, лейкоза, рака почки, рака толстой кишки, рака яичника, рака предстательной железы, рака легкого, рака мочевого пузыря, рака молочной железы или рака головы и шеи.

Настоящее изобретение, таким образом, относится к применению модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора ЕСЕ и Ес, описанной выше, для получения лекарственного средства для лечения или ингибирования связанных с раком заболеваний у субъекта. Аспект или цель настоящего изобретения состоит в предоставлении способа лечения заболеваний и процессов, которые возникают в результате пролиферации раковых клеток, и композиции для лечения или подавления роста рака. Другой аспект изобретения состоит в предоставлении композиций и способов, пригодных для генной терапии для регуляции рака. Способ по настоящему изобретению можно применять, в частности, для лечения меланомы, лейкоза, рака почки, рака толстой кишки, рака яичника, рака предстательной железы, рака легкого, рака мочевого пузыря, рака молочной железы или рака головы и шеи.

Эффективность модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора ЕСЕ и Ес по предотвращению или лечению заболевания можно улучшать введением указанной слитой конструкции последовательно или в сочетании с другим средством, которое эффективно для этих целей, таким как фактор некроза опухолей (ТЫЕ), антагонист, способный ингибировать или нейтрализовать ангиогенную активность кислого или основного фактора роста фибробластов (ЕСЕ), фактора роста тромбоцитов (РЭСЕ) или фактора роста гепатоцитов (НСЕ), антагонист, способный ингибировать или нейтрализовать коагулирующие активности тканевого фактора, белка С или белка 8 (смотри νΟ 91/01753), антагонист, такой как антитела, способный связываться с рецептором НЕК2 (смотри И8 5772997), или одно или несколько общепринятых терапевтических средств, таких как, например, алкилирующие средства, антагонисты фолиевой кислоты, антиметаболиты метаболизма нуклеиновых кислот, антибиотики, аналоги пиримидина, 5-фторурацил, цисплатин, пуриновые нуклеозиды, амины, аминокислоты, триазоловые нуклеозиды или кортикостероиды.

В другом аспекте изобретения введение сочетают с введением терапевтически эффективного количества химиотерапевтического средства, такого как, например, таксол (паклитаксел) или таксотер (доцетаксел).

Химиотерапевтические средства включают в качестве неограничивающих примеров антимикротрубочковые средства, такие как дитерпеноиды и алкалоиды барвинка; координационные комплексы платины; алкилирующие средства, такие как аналоги горчичного газа, оксазафосфорины, алкилсульфонаты,

- 11 018700 нитрозомочевины и триазены; антибиотические средства, такие как антрациклины, актиномицины и блеомицины; ингибиторы топоизомеразы II, такие как эпиподофиллотоксины; антиметаболиты, такие как аналоги пуринов и пиримидинов и антифолатные соединения; ингибиторы топоизомеразы I, такие как камптотецины; гормоны и аналоги гормонов; ингибиторы путей передачи сигнала; ингибиторы ангиогенеза, связанного с нерецепторной тирозинкиназой; иммунотерапевтические средства; проапоптотические средства; и ингибиторы передачи сигнала в клеточном цикле. Кроме того, способы по изобретению можно сочетать с другим противораковым лечением, антиангиогенным средством или химиотерапевтическим средством или радиотерапией.

Предпочтительным примером является доцетаксел или таксотер. Другие примеры включают гемцитабин, цисплатин, дитерпеноиды и алкалоиды барвинка, паклитаксел, винбластин, винкристин и винорелбин, карбоплатин, циклофосфамид, мелфалан и хлорамбуцил, бусульфан, кармустин, дакарбазин, циклофосфамид, мелфалан, хлорамбуцил, бусульфан, кармустин, дакарбазин, антинеопластические средства, включая в качестве неограничивающих примеров, актиномицины, такие как дактиномицин, антроциклины, такие как даунорубицин и доксорубицин, блеомицины, эпиподофиллотоксины, этопозид и тенипозид; антиметаболические неопластические средства, 5-фторурацил, метотрексат, цитарабин, меркаптопурин, тиогуанин, камптотецины, иринотекан-НС1 и топотекан-НС1.

Можно также выбрать множество различных химиотерапевтических средств или противораковых полипептидов. Источники информации, такие как ююю.с11П1са11г1а15.доу. \ν\ν\ν.ηοόί.η1ιη.πί1ι и \\л\л\\йгид5.еот. содержат ссылки на полипептиды и средства, которые можно выбрать.

Другие средства, например антиангиогенные средства или химиотерапевтические средства, могут присутствовать во вводимой композиции, или их можно вводить по отдельности. В одном из аспектов изобретения введение осуществляют с другим активным средством или одновременно или по отдельности, или последовательно с течением времени. Если введение осуществляют одновременно, то два активных средства можно сочетать в одной фармацевтической композиции, содержащей две композиции, такой как таблетка или гелевая капсула. С другой стороны, два активных средства, при одновременном или неодновременном введении, могут присутствовать в отдельных фармацевтических композициях. Для этой цели, сочетание может находиться в виде набора, содержащего, с одной стороны, модифицированную растворимую слитую конструкцию рецептора ЕСЕ и Ес, как описано выше, и, с другой стороны, второе активное средство, где модифицированная растворимая слитая конструкция рецептора ЕСЕ и Ес, как описано выше, и второе активное средство находятся в разных отделениях и предназначены для введения одновременно, по отдельности или последовательно с течением времени.

Сочетание согласно настоящему изобретению можно вводить в особенности при противоопухолевой терапии в сочетании с химиотерапией, белковой терапией (т.е., с использованием терапевтического средства, такого как антитела или рекомбинантный белок), генной терапией, радиотерапией, иммунотерапией, хирургическим вмешательством или их сочетанием. Длительная терапия равновозможна в качестве адъювантной терапии в контексте других стратегий лечения, как описано выше.

Примеры, которые следуют далее, только иллюстрируют объем этого изобретения и содержание этого описания. Специалист в данной области может разработать и сконструировать множество модификаций примеров, перечисленных ниже, без отступления от объема этого изобретения.

Примеры

Пример 1. Продукция &ЕСЕК.2-Ес с высоким содержанием сиаловой кислоты и низким клиренсом в крови в НЕК293.

кДНК, кодирующие а-1,4-галактозилтрансферазу человека (В4СТ1) (8ЕО ΙΌ Νο. 9) или β-2,3сиалилтрансферазу человека (8ΙΆΤ6) (8ЕС ΙΌ Νο. 11), получали из клональной коллекции (ΙπνίίΓΟβοπ) и клонировали в экспрессирующий вектор млекопитающих рХЬ4214, экспрессия с которого управляется промотором СМУ. Тот же экспрессирующий вектор также использовали для клонирования слитого белка 8ЕСЕВ2-Ес и получения рХЬ4410. Карта плазмид рХЬ4551, кодирующей В4СТ1, рХЬ4544, кодирующей 8ΙΆΤ6, и рХЬ4410, кодирующей модифицированную растворимую слитую конструкцию ЕСЕКГШсЕс (обозначенную здесь как &ЕСЕВ2-Ес), а также нуклеиновая кислота и соответствующая аминокислотная последовательность В4СТ1 (фиг. 2), 8ΙΆΤ6 (фиг. 3) и 8ЕСЕВ2-Ес (фиг. 4А и В), представлены на фиг. 1 и 5. 8ЕСЕВ2-Ес продуцировали в прикрепленных клетках НЕК293 ΕΒΝΑ (ΙπνίίΓΟβοπ) транзиентной трансфекцией одной тремя экспрессионными плазмидами, кодирующими &ЕСЕВ2-Ес, В4СТ1 или 8ΙΑΤ6 в комплексе с 1ЕТ ΡΕΙ (О-Вюден). Соотношение плазмид составляло 90/5/5 для рХЕ4410/рХЕ4544/рХЬ4551. Соотношение плазмид нужно было оптимизировать для обеспечения оптимальной продуктивности и качества полипептида &ЕСЕВ2-Ес. Секретируемые белки собирали через восемь суток после трансфекции и центрифугировали. Белки очищали аффинной хроматографией на протеин-С-сефарозе (Атегайат В^аемсе^) после элюции с колонки 100 мМ глицином/НС1, рН 2,7. Из белков &ЕСЕК2-Ес получали формуляцию в РВ8 и фильтровали через 0,22 мкм. Концентрацию белка определяли анализом тюгоВС (йИегсйип).

Количественное определение сиаловой кислоты, анализ углеводного состава и количественное олигосахаридное картирование Ν-гликанов в очищенных белках 8ЕСЕК2-Ес осуществляли в существенной степени, как описано ранее (8аййю е! а1. 2002. Ме!йой§ Мо1. Вю1. 194:23-36 и Ашти1а е! а1. 1998. С1усо

- 12 018700

Ыо1оду 8:685-694). Во-первых, остатки сиаловой кислоты высвобождали после мягкого гидролиза 5РОРК2-Рс и осуществляли флуоресцентное мечение орто-фенилендиамином, и разделяли обращеннофазной НРЬС. Индивидуальные пики детектировали флуоресцентной детекцией (возбуждение 230 нм; испускание 425 нм), идентифицировали и количественно определяли сравнением со стандартами Νацетилнейраминовой и Ν-гликолилнейраминовой кислот. Во-вторых, углеводный состав определяли после кислотного гидролиза образцов &РСРК2-Рс для высвобождения индивидуальных моносахаридов. После гидролиза получали производные моносахаридов (нейтральных Сахаров и аминосахаров) с помощью антраниловой кислоты и затем разделяли обращенно-фазной НРЬС, и детектировали флуоресцентной детекцией (возбуждение 360 нм; испускание 425 нм). Индивидуальные пики идентифицировали и количественно определяли сравнением со стандартами моносахаридов. В-третьих, олигосахариды ферментативно высвобождали с помощью ПНГ азы Р и флуоресцентно метили антраниловой кислотой перед разделением по количеству в них остатков сиаловой кислоты с помощью нормальной фазово-анионной обменной НРЬС на колонке АзаЫрак-ЫЖР (Рйеиотеиех). Меченые гликаны детектировали и количественно определяли детекцией флуоресценции (возбуждение 360 нм; испускание 425 нм). Среднее количество сиаловой кислоты на Ν-гликан в домене РОРК2 вычисляли на основе общего количества моль Νгликана на моль РСРЯ2-Рс и моль Ν-гликана на моль Рс после высвобождения Рс папаином.

Очищенные белки 5РОРВ2-Рс инъецировали в хвост мышей 8\\тзз Шбе (Сйаг1ез Кдуег). Всего использовали трех мышей на партию белка. Кровь собирали через 6 ч после инъекции 500 мкг зРОРКГ-Рс, получали плазму и концентрацию РОРК.2-РС определяли с помощью ЕЬ18А с использованием двухвалентного способа с помощью моноклональных антител против РОРК2 человека (Κ.&Ό хух1ет) и конъюгированных поликлональных антител против 1дО-НКР человека (Р1егсе) (2 анализа в 2 разведениях в трех параллелях). В контрольных экспериментах мышей предварительно обрабатывали фетуином и асиалофетуином за один час перед инъекцией 8РОРК.2-Рс.

На табл. 1 суммировано состояние продукции разных партий зРОРКГ-Рс, Ν-гликановый профиль и моносахаридный состав каждой партии и концентрация в плазме 5РОРК2-Рс спустя 6 ч после внутривенной инъекции мышей.

Таблица 1. Содержание Ν-гликанов и фармакокинетика РОРК.2-РС, продуцируемого в НЕК293.

Экспрессируемый белок в ΗΕΚ293ΕΒΝΑ	ЗЕСЕК2-ЕС	5ЕСГК2-ГС + 3ΙΑΤ6	5ГСГК2-ЕС + 5ΙΑΤ6 4 В4СТ1
% сиалированных форм вЕСГР.2-Ес:
1-несиалированный	69%	46%	34%
2-моносиалированный	23%	19%	22 %
2-дисиалированный	6%	26%	35 %
3-трисиалированный	1,5%	10%	10%
Содержание сиаловой кислоты
1 пмоль Ν-ацетилнейраминовой кислоты на пмоль $ЕСЕВ2-Ес	3,4	6,4	6,8
2-среднее количество сиаловой кислоты на Ν-гликан $Е(ЗЕК2“Гс	0,4		1
Моносахаридный состав Νгликанов зЕСЕР.2-Ес на три манноэы

- 13 018700

1-глюкозамин (количество на три маннозы)	4,3	4, 1	4,1
2-галактоза (количество на три маннозы)	1,5	1, 4	1, 6
Количество фукозы в Ν-гликанах Ес на три маннозы	0,73	0, 61	0, 63
Клиренс в крови
[зГСГР.2-Гс] в плазме спустя 6 часов после инъекции ί.ν. (нг/мл)	258		20000
[3ΕΌΓΚ2-Γο] в плазме спустя 6 часов после инъекции ί.ν. (нг/мл) при предварительной обработке мышей фетуином	229	не определяли	не определяли
[5ЕСГК2~Ес] в плазме спустя 6 часов после инъекции ί.ν. (нг/мл) при предварительной обработке мышей асиалофетуином	19276	не определяли	не определяли

Улучшенный паттерн сиалирования слитых белков 8ЕСЕВ2-Ес, продуцированных в ΗΕΚ293ΕΒΝΑ, показан при транзиентной совместной экспрессии слитого белка с а-1,4-галактозилтрансферазой человека или в-2,3-сиалилтрансферазой человека. Это значительное улучшение статуса сиалирования показано снижением в 2 раза процентной доли несиалированных гликанов, повышением в 2 раза суммарного содержания сиаловой кислоты на моль белка и повышением в 2,5 раза среднего количества сиаловой кислоты на Ν-гликан. Известное содержание моносахаридов не было затронуто (см. табл. 1).

Это повышение в 2,5 раза сиалированных Ν-гликанов прямо коррелировало со значительным улучшением фармакокинетических параметров &ЕСЕК2-Ее. В частности, возрастание в 100 раз количества &ЕСЕК.2-Ее в плазме было измерено спустя 6 после инъекции ί.ν. мышей.

Также происходило улучшение фармакокинетики в 100 раз при предварительной обработке мышей асиалофетуином в сравнении с предварительной обработкой фетуином. Асиалофетуин, но не фетуин, как известно, связывается с асиалогликопротеиновым рецептором в печени (Α8ΟΡΚ.) (\УеЬб1ег с1 а1., 2003, ХепоЬюбса 33:945).

Взятые вместе, эти результаты указывают на то, что специфическое связывание с асиалогликопротеиновым рецептором посредством экспонированных концевых остатков галактозы из Ν-гликана отвечает за клиренс &РСЕЯ2-Ес, в то время как присутствие одной сиаловой кислоты на Ν-гликан на &РСЕК.2-Ес значительно снижает этот клиренс.

Пример 2. Скрининг стабильных клонов СНО, экспрессирующих белок 8ЕСЕВ2-Ес со среднем количеством остатков сиаловой кислоты на Ν-гликан ЕСЕВ2 более 1,2, для оптимальной фармакокинетики.

Экспрессионную плазмиду млекопитающих рХЬ4636 для стабильной экспрессии 8ЕСЕВ2-Ес в клетках СНО получали из плазмиды рЕЕ14.4, кодирующей селективный маркер глутаминсинтетазу (Ропха). и плазмиды рХЬ4410, содержащей последовательность кДНК, кодирующей 8ЕСЕВ2-Ес, фиг. 5. Плазмиду рХЬ4636 вводили в клетки СНО Κ1 с помощью нуклеофекции с использованием набора Νυс1еоГас1ог с линией клеток АМАХА, как рекомендовано поставщиком. Трансфицированные клетки переносили в селективную среду, и после размножения клеток семь лучших полуклонов-продуцентов СНО/С8 (8С# 9, 11, 26, 58, 112, 118, 170) скринировали на содержание сиаловой кислоты в очищенных молекулах &РСЕВ2-Ес. Два полуклона с самым высоким содержанием сиаловой кислоты (8С# 11 и 118) отбирали для клонирования и увеличения масштаба продукции; в частности, клон из 8С# 118 далее описан как СС111.

Хотя молекулы &ЕСЕВ2-Ес, полученные изо всех полуклонов, обладали высоким содержанием сиаловой кислоты, они не обладали одинаковой фармакокинетикой. Интересно отметить наблюдение, что из двух полуклонов (8С# 11 и 118) &РСЕВ2-Ес с наиболее высоким содержанием сиаловой кислоты приводил к самой высокой концентрации &ЕСЕВ2-Ес в крови спустя 6 ч после инъекции ί.ν. мышей, как описано в табл. 2. И из двух клонов (8С# 9 и 170) &ЕСЕВ2-Ес с самым низким содержанием сиаловой кислоты обладал самой низкой концентрацией &ЕСЕВ2-Ес в крови спустя 6 ч после инъекции ί.ν. мышей.

- 14 018700

Таблица 2. Стабильные клоны СНО, экспрессирующие белок кЕСЕК2-Ес с соотношением остатков сиаловой кислоты на Ν-гликан 8ЕСЕК2 более 1,2 для оптимальной фармакокинетики

Очищенный 5ЕСГК2-РС из полуклона СНО-СЗ ЗС#	ЗС# 9	ЗС# 11	ЗС# 26	ЗС# 58	ЗС# 112	ЗС# 118	ЗС# 170
% сиалированных форм зЕСГК2-Гс 1-несиалированный	50	42	^_ 4 8”	48 ’	^_4 5^—	43 53
2-моносиалированный	28	30	30	30	30	30	28
3-дисиалированный	14	18	14	15	16	17	13
4-трисиалированный	8	10	7	8	9	10	6
Среднее количество сиаловой кислоты на Ν-гликан зГСЕ’КЗ-Е’с	1,07	1,45				1,29	0, 98
[зЕ’СЕ’Кг-Е’с] / [ЗЕСГК2Гс]тах [зГСГК2-Гс] обнаружен в плазме спустя 6 часов после инъекции ί.ν. [зГСГй2-Гс]тах обнаружен для 8С# 11	55%	100%				81%	45%

Скрининг клонов на основе высокой степени сиалирования Ν-гликана кЕСЕК2-Ес обладает предсказательной силой в отношении оптимальных параметров фармакокинетики кЕСЕК2-Ес.

Пример 3. Корреляция между средним количеством сиаловой кислоты на Ν-гликан 8ЕСЕК2 и клиренсом кЕСЕК2-Ес в крови.

В другом эксперименте, сходном с экспериментом, описанным в примере 2, стабильные клоны СНО/ЭНЕК, экспрессирующие 8ЕСЕК2-Ес, получали с использованием селекции в отношении ОНЕК и системы амплификации с соответствующими экспрессионными плазмидами млекопитающих рХЬ4429 и рХЬ4417 (фиг. 6). Эти клоны СНО-ЭНЕК также скринировали на содержание сиаловой кислоты на молекулу кЕСЕК2-Ес и также анализировали клиренс кЕСЕК2-Ес, продуцируемого этими клонами.

Среднее количество сиаловой кислоты на Ν-гликан в домене ЕСЕК2 подсчитывали на основе суммарного количества моль Ν-гликана на моль ЕСЕК2-ЕС и моль Ν-гликана на моль Ес, полученного после высвобождения Ес папаином. Результаты, представленные на фиг. 7, показывают, что соотношение остатков сиаловой кислоты на Ν-гликан ЕСЕК2 более 1,2 обеспечивает оптимальную концентрацию кЕСЕК2-Ес в крови по сравнению с оптимальной концентрацией в крови, найденной для молекул Ес. Только отобранные клоны достигали этого оптимального соотношения.

Таким образом, скрининг клонов по соотношению остатков сиаловой кислоты на Ν-гликан ЕСЕК2 позволяет специалисту предсказать низкий клиренс кЕСЕК2-Ес в крови.

Пример 4. Аминокислотная последовательность слитого белка кЕСЕК2-Ес.

Белок кЕСЕК2-Ес, кодируемый плазмидой рХЬ4410 или рХЬ4636, или рХЬ4429 (фиг. 5 и 6), представляет собой слитый белок последовательности растворимого ЕСЕК2 человека и Ес-фрагмента, полученного из последовательности ΙβΟ1 человека.

Последовательность полинуклеотида, кодирующего кЕСЕК2-Ес, представлена на 8Е0 ΙΌ Νο. 1 и на фиг. 4А. Сходным образом, полная аминокислотная последовательность белка кЕСЕК2-Ес представлена на 8Е0 ΙΌ Νο. 2 на фиг. 4В. Аминокислоты положений с 1 по 350 соответствуют изотипу ЕСЕК2ШС (см. фиг. 4С, 8ЕО ΙΌ Νο. 4) и являются аминокислотами положений с 27 по 376, описанными в 8\\1ккРго1 (ЕСЕК2_НЦМА^. Аминокислоты положений с 354 по 584 являются аминокислотами ΙβΟ1 положений с 99 по 329, как описано в 8\\1ккРго1 (ЮНС1_НИМА^; см. фиг. 4Ό и 8ЕО ΙΌ Νο. 6. Аминокислоты положений с 351 по 353 представляют собой аминокислоты синтетического линкера 8АБ (8ег А1а Ьеи), см. фиг. 4Е.

Пример 5. Определение содержания Ν-гликана кЕСЕК2-Ес, продуцируемого стабильным клоном СНО СС111.

Были оптимизированы условия для продукции кЕСЕК2-Ес, таким образом, чтобы соотношение остатков сиаловой кислоты на Ν-гликан 8ЕСЕК2 могло превышать 1,2. Этот пример предоставляет условия для достижения этого состояния.

В биореактор 5-Ь СеШдеп (Νον Вгипк\\1ск). заполненный 4,4 л безбелковых сред СЭ-СНО с добав

- 15 018700 лением 100 мкм М8Х и IX добавок О8, высевали клон ОС111 с начальной плотностью клеток из расчета 3,5х10⁵ клеток/мл и культивировали при 37°С. Применяли аэрацию барботированием с использованием смеси кислорода, азота, воздуха и диоксида углерода или чистого кислорода и насыщение воздуха растворенным кислородом поддерживали из расчета 30%. рН поддерживали при 7,2 добавлением диоксида углерода и инжекцией 1 М бикарбоната натрия в культуральную среду. Используемая скорость перемешивания составляла 110 об/мин с использованием импеллера с подъемом клеток. Осуществляли непрерывную подпитку питательным раствором (450 г/л глюкозы) для поддержания глюкозы на целевом уровне из расчета 2-3 г/л. Подпитку начинали на 5 сутки, когда остаточная концентрация глюкозы достигала 2,5 г/л. Непрерывную подпитку питательными веществами осуществляли на основе предполагаемого клеточного роста и потребления глюкозы, со скоростью подпитки добавками, равной скорости потребления глюкозы. Концентрацию глутамата поддерживали из расчета 1-3 ммоль/л пульсовым добавлением после ежедневного контроля в отключенном режиме. Осуществляли наблюдение культуры клеток в отношении количества клеток, жизнеспособности и метаболитов (глюкозы, лактата, глутамина, аммиака и глутамата), и в отношении концентрации продукта в ходе фазы продукции. Культивирование останавливали при снижении жизнеспособности клеток до 55% и осуществляли сбор культуры. Собранную культуру клеток осветляли, и 8РОРК2-Рс очищали аффинной хроматографией (РгохеруА. М1Шроге) и двумя стадиями ионообменной хроматографии, затем стерильно фильтровали и хранили в фосфатносолевом буфере перед дальнейшим анализом и тестированием ш νί\Ό.

Кажущаяся молекулярная масса 8РОРК2-Рс, полученная с помощью анализа 8Э8-РАСЕ в невосстанавливающих условиях, составляла 180 кДа. Это отличалось от теоретической молекулярной массы 130 кДа, вычисленной на основе аминокислотной последовательности гомодимера 8РОРК2-Рс. Это значительное различие между кажущейся и вычисленной молекулярной массами объяснялось дополнительным наличием приблизительно 30% Ν-гликанов, см. табл. 3. Действительно, при расщеплении 8РОРК2Рс пептид-Ы-гликозидазой Р (ПНГаза Р, Коске) с последующим анализом 8Э8-РАСЕ в невосстанавливающих условиях, молекулярная масса дегликозилированного зРОРК2-Рс составила приблизительно 160 кДа (фиг. 7). Углеводный состав и Ν-гликановый профиль 8РОРК2-Рс проанализирован, как описано в примере 1, и представлен в табл. 3.

Таблица 3. Углеводный состав и Ν-гликановый профиль зРОРК2-Рс, продуцируемого в оптимальных условиях

Экспрессируемый белок из стабильного клона СНО-СЗ 6С111	зГОГК2-Гс
% сиалированных форм зГСГК2-Гс
1-несканированный	30 %
2-моносиалированный	34%
3-дисиалированный	23%
4-трисканированный	13%
Среднее количество сиаловой кислоты на Νгликан ЗЕСГК2	1,34
Моносахаридный состав Ν-гликанов зГСГЕ2-Гс на три маннозы
1-глюкозамин (количество на три маннозы)	4,9
2-галактоза (количество на три маннозы)	2,7
3~фукоза (количество на три маннозы)	0,96
Состав фукозы в Ν-гликане Ус на три маннозы	1,1

В сравнении с результатами, представленными на табл. 2, зРОРК2-Рс, полученный из клона ОС111 в оптимальных условиях, обладал более значительным сиалированием Ν-гликана, чем 8РОРК2-Рс, полученный из полуклона 8С#118, родителя клона ОС111, продуцируемого в стандартных условиях. Например, % несиалированных форм снижался с 43 до 30%.

На основе суммарного количества моль Ν-гликана на моль РОРК2-РС и моль Ν-гликана на моль Рс, полученного после высвобождения Рс папаином, измерено, что семь Ν-гликанов приходится на РОРК2. Таким образом, большинство участков домена РОРК2 почти все полностью заняты.

Пример 6. Участки Ν-гликозилирования важны для аффинности и продуктивности РОР.

Слитый белок 8РОРК2-Рс обладает восемью участками Ν-гликозилирования в домене РОРК2 и одним в Рс-домене, см. фиг. 8 и табл. 5 для определения положений Ν-гликана Ν1-Ν8. Получены белки 4493 и 4565, два варианта вРОРК2-Рс, которые больше не обладают 1д-подобным доменом 1. 4493 обла

- 16 018700 дал характеристиками, сходными с ЕСЕК2-ЕС дикого типа, происходящим из рХЬ4636, в терминах продуктивности и связывания с ЕСЕ-2 или гепарином. В то же время, 4565, в котором осуществили мутагенез всех участков гликозилирования в домене ЕСЕК2 (замещение Ν на О), не смог быть охарактеризован вследствие более чем 50-кратного снижения продуктивности мутанта, см. табл. 4.

Таблица 4. Физико-химические характеристики вариантов &ЕСЕК2-Ес

&елка	Участки Ν- гли козилирования в домене ГСГН2	Аминокислотный остаток в участке Ν-гликозилирования	Продукция (мг/л)	Связывание с ЕСЕ-2**	Связывание с гепарином
				КД 10’ м)	[иаС1] для элюции с гепарина (ММ)
4410	8 (с N1 по N8)	N	75	1,39	370
4493	6 Се N3 по N8)	N	67	1,19	442
4565	6 (с N3 по N3}	й	< 1	не определяли	не определяли

** Связывание с ЕСЕ-2 определяли на приборе ΒΙΑοοτο™ с использованием модели двустадийной реакции с изменением конформации, как описано в Сатуаедет е! а1., Вюсйет. 1. 7 Арг. 2005/В120050156. В кратком изложении интегрирование осуществляли на полной сенсограмме за исключением областей объемного эффекта. Диапазон концентрации выбирали между 1 и 8 нМ. Способ одновременной кинетики ка/кб дает возможность измерять две ка и две кб, исходя из следующих уравнений:

ка1 и кб1 для А+В^» АВ ка2 и кб2 для АВ АВ*, которые могут представлять димеризацию комплексов (ЕСЕ - ЕСЕК2-Ес).

Константу диссоциации К_с вычисляли из следующей формулы:

1____________________ (ка-ι / кбО х (1 + ка₂/ кб₂)

Согласно двум опубликованным конкурирующим моделям (симметричная двухконцевая модель от Μοίιηιηηκ^ί и асимметричная модель от РеПедпш), участки с Ν3 по Ν7 могут потенциально взаимодействовать с аминокислотными остатками или ЕСЕ1 или ЕСЕК2с, и/или взаимодействовать с гепарином, в то время как маловероятно, что участок Ν8 вовлечен во взаимодействия во всех кристаллических структурах (РеПедпш е! а1. 2000. №1Шге 407:1029; 1ЬгаЫт1 е! а1. 2005 Μο1. Се11. Βίο1. 25:671).

На основе вышеизложенной информации уместно исследовать участки Ν-гликозилирования в положениях с Ν3 по Ν7 путем замещения соответствующего Αδη на Ст и путем сохранения положения Ν8 без изменений для обеспечения значительной продуктивности. Позиционное влияние Ν-гликанов на физико-химические характеристики &ЕСЕК2-Ес оценивали статистически в двухуровневом дробном факторном эксперименте. Выбирали пять переменных (занятость участка гликозилирования в положениях с Ν3 по Ν7) и исследовали 16 независимых конструкций. Планирование дробного эксперимента 2^5-1 и анализ данных осуществляли, как описано (81аЙ5бс5 ίοτ ЕхрептеШетк, С. Βοχ Еб., №111еу, 1978).

План дробного факторного эксперимента

Сайт-специфичные варианты Ν-гликозилирования проектировали на основе 4493 и факторного плана на двух уровнях с пятью переменными (с Ν3 по Ν7), которые могли находиться или на плюсуровне (Ν) или на минус-уровне (С). План являлся дробным с 16 конструкциями (2^5-1, т.е. разрешение плана V), позволяя идентифицировать основные эффекты и 2-факторные взаимодействия, но соединяя 2факторные взаимодействия с 3-факторными.

плазмидных конструкций получили с помощью последовательной РСК и клонированием для получения замещения Ν на С в положении Ν3, Ν4, Ν5, Ν6 или Ν7, но сохраняя положение Ν8 и участок Νгликозилирования Ес-домена без изменений. Эти варианты белка отличались от 4493 только 2- или 4точечными мутациями, перечисленными в табл. 5.

- 17 018700

Таблица 5. Матрица плана

	Состояние положения Νгликозилирования
Положение Азп на Фиг. 9	Конструкция		N3	N5	N6	N7	N9	N297 (ГС)
Положение Азп на Г6ЕК2 ΗϋΜΑΝ		228	241	265	297	318	331
	4572	-	-	-	-	+	+	4-
	4570	+	-	-	-	-	4-	4-
	4577	-	+	-	-	-	+	+
	4571	+	+	-	-	4-	4-	4-
	4587	-	-	4-	-	-	4-	+
	4585	+	-	4-	-		+	+
	4586	-	+	+	-	+	4-	4-
	4573	+	+	4-	-	-	4-	4-
	4574	-	-	-	4-	-	+	+
	4575	4-	-	-	+	+	4-	4-
	4588	-	+	-	4-	4-	4-	4-
	4576	+	+	-	4-	-	4-	+
	4579	-	-		+	4-	4-	4-
	4569	+	-	+	+	-	+	+
	4578	-	4-	4-	4-	-	4-	+
	4493	4-	+		-Η	4-	4-	4-

спланированных конструкций тестировали на продукцию в малом масштабе. Два варианта (4572 и 4574) являлись очень плохими продуцентами (приблизительно 2 мг/л). Оставшиеся 14 конструкций продуцировали в масштабе литра и из них производили очистку параллельно в стандартных условиях с приемлемым выходом продукта. Их затем анализировали путем δΌδ-РАСЕ, гель-фильтрации, В1Лсоге™. Результаты анализировали со статистическим дробным факторным разрешением - 2^5-1 ΌΟΕ.

Продуктивность

Ν-гликозилирование в Ν3, Ν4, Ν5, Ν6, Ν7 обладало положительным вкладом в продуктивность. Сходный количественный эффект имел место для всех исследованных положений (т.е. Ν3, Ν4, Ν5, Ν6 и Ν7), и отсутствовал значимый эффект двухфакторных взаимодействий.

Таблица 6. Продуктивность

Конструкция	Титр (мг/л} из продукции 1 л
4572	0
4570	13
4577	9
4571	34
4587	5
4585	40
4586	42
4573	32
4574	0
4575	30
4588	37
4576	27
4579	30
4569	54
4578	37
4493	67

Ответ (мг/л)	Переменная
28	Среднее значение
17	N3
14	N4
20	N5
13	N6
13	N7
-8	Ν3-Ν4
3	Ν3-Ν5
1	Η3-Ν6
-2	Ν3-Ν7
-2	Ν4-Ν5
-1	Ν4-Ν6
6	Ν4-Ν7
4	Ν5-Ν6
0	Ν5-Ν7
-1	Ν6-Ν7

Агрегация

Очищенные белки анализировали гель-фильтрацией (Зирегбех 2000) для количественного определения процентной доли высокомолекулярных форм (ΗΜΨ; %) в очищенных препаратах. Наиболее высокое значение (наихудший случай) 80,2% ΗΜΑ получили для 4587 и использовали в анализе ΌΟΕ для двух конструкций (4572 и 4574), продукцию которых не могли получить (среднее значение процентной доли величины ΗΜΑ, полученной для 14 конструкций, также использовали для сравнения, что приводило к сходному результату). Ν-гликозилирование в положении Ν5 и, в меньшей степени, в положении Ν6 не способствовало возникновению форм ΗΜΑ. Взаимодействие Ν5-Ν6 обладало сходным эффектом на агрегацию.

- 18 018700

Таблица 7. Образование агрегатов

Конструкция	ИМИ (%)
4572	80
4570	73,0
4577	71, 6
4571	72, 1
4587	80,2
4585	47,5
4586	47,7
4573	57, 5
4574	80
4575	69, 6
4588	71,8
4576	72, 9
4579	35,2
4569	12,0
4578	39, 4
4493	3,6

Ответ (мг/л)	Переменная
57	Среднее значение
-12	N3
-5	N4
-33	N5
-18	N6
-7	N7
6	Ν3-Ν4
-8	Ν3-Ν5
-5	Ν3-Ν6
2	Ν3-Ν7
-2	Ν4-Ν5
3	Ν4-Ν6
-4	Ν4-Ν7
-18	Ν5-Ν6
-6	Ν5-Ν7
1	Ν6-Ν7

Связывание с ЕСЕ-2

Аффинность связывания с ЕСЕ-2 определяли с помощью В1Лсоге™ для каждой конструкции. Значения константы диссоциации (К_с) между 0,49 и 2,31 нМ получали для конструкций, для которых показана измеримая аффинность. Для конструкций, которые не связываются с ЕСЕ-2 или не продуцируются, значение 10 нМ использовали для анализа ΌΟΕ. Ν-гликозилирование в положении N5 и, в меньшей степени, в положениях N6 и N3 обладало положительным эффектом на связывание с ЕСЕ-2. Взаимодействия Ν3-Ν5 и Ν5-Ν6 обладали значительным положительным эффектом в отношении связывания, в то время как взаимодействия Ν3-Ν6 и Ν4-Ν7 обладали отрицательным эффектом в отношении связывания.

Таблица 8. Связывание с ЕСЕ-2

Конструкция	К_о (нМ)
4572	10
4570	10
4577	10
4571	10
4587	10
4585	2,7
4586	10
4573	0, 49
4574	10
4575	10
4588	10
4576	10
4579	2,31
4569	0, 99
4578	0, 66
4493	1, 19

Ответ (мг/л)	Переменная
6,8	Среднее значение
-2,2	N3
-0, 5	N4
-6, 5	N5
-2,3	N6
0,5	N7
0,0	Ν3-Ν4
-2,2	Ν3-Ν5
2,0	Ν3-Ν6
0,1	Ν3-Ν7
-0, 5	Ν4-Ν5
0,1	Ν4-Ν6
2,0	Ν4-Ν7
-2,3	Ν5-Ν6
0,5	Ν5-Ν7
0,0	Ν6-Ν7

Это разрешение V 2^5-1 ΌΟΕ выявило, что Ν-гликозилирование обладало положительным влиянием на продуктивность в положениях Ν3, Ν4, Ν5, Ν6, Ν7; обладало положительным влиянием на связывание с ЕСЕ-2 в положениях Ν5 » Ν6 и Ν3; и не способствовало появлению высокомолекулярных молекул во всех положениях, особенно Ν5>Ν6.

Таким образом, занятость Ν-гликана является обязательной в положении Ν5 и рекомендуемой в положениях Ν3, Ν4, Ν6 и Ν7 соответственно (положение 265, 228, 241, 297 и 318 соответственно на ЕСЕК2__ΗυΜΑΝ (8^1ззрго1).

Пример 7. Фармакокинетика слитого белка зЕСЕК2-Ес

В примере 7 зЕСЕК2-Ес представляет собой слитый белок, соответствующий аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ Νο. 2 со средним количеством сиаловой кислоты на Ν-гликан 8ЕСЕК2, равным 1,3. Трех мышей на временную точку инъецировали 500 мкг слитого белка в хвостовую вену. В разные моменты времени после инъекции продукта забирали кровь, на фиг. 10 показана концентрация белка в плазме и печени. На фиг. 11 показано количество выявленного белка в ранние моменты времени в плазме и печени, выраженное в процентной доли от инъецируемой дозы.

Фармакокинетические параметры подсчитывали с использованием анализа без компартментализации. Время полувыведения подсчитывали с помощью последних 6 значений данных, которые давали наилучшее соответствие с логлинейной конечной фазой (табл. 9).

- 19 018700

Таблица 9

Параметр	Единицы	ЗЕСГК2-ГС
^/₂	час	70, 1
Т1азС	час	72, 0
С1ааЁ	мкг/мл	27, 6
АиС1аз1:	час*мкг/мл	3138
С1оЬз	мл/час/кг	4,2
У35	мл/кг	406

АИС1а81 - площадь под кривой от времени введения дозы до последней измеримой концентрации. С1<>Ьк - суммарный клиренс в организме для экстраваскулярного введения.

С1ак1 - концентрация, соответствующая Т1ак1.

ΐ¹ _/2 - конечное время полужизни.

Т1ак1 - время последней измеримой (ненулевой) концентрации.

Узз - оценка объема распределения в стационарном состоянии.

После внутривенного введения для кЕСЕЕ2-Ес показан благоприятный фармакокинетический профиль с продолжительным временем полувыведения (почти 3 суток) и сниженным суммарным клиренсом в организме. Объем распределения был ограниченным и ниже суммарного объема воды в организме, что позволяет предположить ограниченное распределение в тканях. При 72 ч концентрация кЕСЕЕ2-Ес в плазме остается очень высокой, и клиренс также является хорошим. Фармакокинетические параметры кЕСЕЕ2-Ес хорошо совместимы с использованием этого слитого белка в качестве лекарственного средства. Фактически, как показано в примерах, концентрация в плазме после внутривенной инъекции мышей является, по существу, высокой, и клиренс остается очень низким спустя 72 ч после инъекции. Важно отметить, что кинетика расщепления кЕСЕЕ2-Ес ш νίνο является также очень низкой, так как кЕСЕЕ2Ес оказался только частично расщепленным (40% после 18 ч), и концентрация полноразмерных молекул оставалась без изменения до 72 ч.

Таким образом, для слитой молекулы, как представлено на 8ЕЦ ΙΌ Νο. 2, и среднего количества сиаловой кислоты на Ν-гликан 8ЕСЕК.2 равного 1,3, показан благоприятный фармакокинетический профиль с продолжительным временем полувыведения (почти 3 суток) и удовлетворительным суммарным клиренсом в организме.

Пример 8. Эффективность слитого белка кЕСЕЕ2-Ес в модели подкожной опухоли А549

В этом примере кЕСЕЕ2-Ес представляет собой слитый белок, соответствующий аминокислотной последовательности ЗЕЦ ΙΌ Νο. 2 со средним количеством сиаловой кислоты на Ν-гликан кЕСЕЕ2, равным 1,3.

Модель подкожной опухоли А549

Линию клеток А549 идентифицировали в качестве опухолевой линии клеток для оценки эффективности кЕСЕЕ2-Ес. Заявителем показано ш νίΐτο, что эта линия клеток экспрессирует ЕСЕ2 и также, что кЕСЕЕ2-Ес может прекращать аутокринную пролиферацию этих клеток. Модель подкожной опухоли А549 реализована заявителем на голых мышах Ва1Ь/с. Более того, опухоль ш νίνο экспрессирует ЕСЕ2.

В этом эксперименте эффективность молекулы кЕСЕЕ2-Ес оценивали на модели роста опухоли А549. Продукты инъецировали подкожно два раза в неделю. Оценивали разные дозы, т.е. 25, 15 и 5 мг/кг кЕСЕЕ2-Ес.

После полного анализа изменения объема опухоли, три группы, подвергнутые лечению кЕСЕЕ2-Ес, статистически отличались по развитию опухоли от группы, обработанной РВ8. кЕСЕЕ2-Ес оказывает эффект на рост опухоли в этой модели в дозе 5 мг/кг два раза в неделю.

Схема эксперимента

5х10⁶ клеток А549 в 200 мкл инъецировали подкожно голым мышам Ва1Ь/с на 0 сутки. После инъекции клеток, в те же сутки мышей случайным образом распределяли в количестве 4 по четырем группам исходя из массы тела. Обработки начинали после случайного распределения спустя сутки после инъекции клеток. Каждая группа получала подкожно 500, 300 или 100 мкг/мышь/введение, что соответствует соответственно 25, 15 и 5 мг/кг, два раза в неделю: понедельник и среда, в течение 39 суток.

Результаты Анализ объема опухоли

Как представлено на фиг. 12, объем опухоли анализировали вплоть до 40 суток. Группы 100 мкг (треугольники), 300 мкг (квадраты) и 500 мкг/мышь/введение (закрашенные круги) статистически отличались от группы с РВ8 (незакрашенные круги). Авторы настоящего изобретения сделали вывод, что кЕСЕР2-Ес снижает рост опухоли в дозе 25, 15 и 5 мг/кг.

Масса опухоли на 40 сутки

Как представлено на фиг. 13, опухоли собирали и взвешивали в конце эксперимента. Группы 100 мкг, 300 мкг и 500 мкг/мышь/введение статистически отличались от группы с РВ8. Авторы настоящего изобретения сделали вывод, что кЕСЕР2-Ес согласно настоящему изобретению снижал массу опухоли в дозе 25, 15 и 5 мг/кг.

- 20 018700

Динамика роста опухоли в группах кЕСЕВ2-Ес_100, кЕСЕВ2-Ес_300 и кЕСЕВ2-Ес_500 статистически отличалась от динамики в группе, обработанной РВ8. Слитый белок кЕСЕВ2-Ес согласно настоящему изобретению (аминокислотная последовательность 8Е0 ΙΌ №. 2 со средним количеством сиаловой кислоты на Ν-гликан 8ЕСЕВ2, равным 1,3) способен в существенной степени замедлять рост опухоли в дозе 5 мг/кг.

Пример 9. Эффективность слитого белка кЕСЕВ2-Ес в модели подкожной опухоли Н460.

В Примере 9 кЕСЕВ2-Ес представляет собой слитый белок, соответствующий аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ №. 2 со средним количеством сиаловой кислоты на Ν-гликан 8ЕСЕВ2, равным

1,6.

Модель подкожной опухоли Н460

Линию клеток Н460 идентифицировали в качестве опухолевой линии клеток для оценки эффективности кЕСЕВ2-Ес. 1п уйго показано, что эта линия клеток экспрессирует ЕСЕ2. В этом эксперименте эффективность кЕСЕВ2-Ес оценивали по росту опухоли. Продукты инъецировали подкожно два раза в неделю в дозе 25 мг/кг. После полного анализа динамики объема опухоли оказалось, что кЕСЕВ2-Ес замедлял рост опухоли.

Схема эксперимента

5х10⁶ клеток Н460 в 200 мкл инъецировали подкожно в правую подвздошную область голых мышей Ва1Ь/с на 0 сутки. После инъекции клеток, в сутки инокуляции клеток (0 сутки) мышей случайным образом распределяли по измеренной массе тела и размещали по группам лечения.

Лечение проводили два раза в неделю подкожными инъекциями (200 мкл) в течение 3 последовательных недель (понедельник и пятница). Первое введение осуществляли на 1 сутки после инокуляции клеток для максимизации воздействия обработки на клетки.

Результаты Анализ объема опухоли

На фиг. 14 представлен анализ объема опухоли вплоть до 22 суток. Авторы настоящего изобретения сделали вывод о том, что кЕСЕВ2-Ес в существенной степени снижает рост опухоли.

Анализ массы опухоли

На фиг. 15 представлен анализ массы опухоли на 22 сутки. Авторы настоящего изобретения сделали вывод о том, что 8ЕСЕВ2-Ес в существенной степени снижает массу опухоли. Динамика роста опухоли в группе с кЕСЕВ2-Ес статистически отличалась от динамики в группе, обработанной РВ8. Авторы настоящего изобретения сделали ясный вывод о том, что слитый белок согласно настоящему изобретению (аминокислотная последовательность 8ЕО ΙΌ №. 2 со средним количеством сиаловой кислоты на Ν-гликан 8ЕСЕК2, равным 1,6) способен в существенной степени замедлять рост опухоли Н460 в дозе 25 мг/кг.

Пример 10. Оценка активности ш уйго в отношении АЭСС слитого белка кЕСЕВ2-Ес на линиях клеток А549 и Н460.

В этом примере кЕСЕВ2-Ес представляет собой слитый белок, соответствующий аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ №. 2 со средним количеством сиаловой кислоты на Ν-гликан 8ЕСЕК2 более

1,6. Способность кЕСЕВ2-Ес опосредовать активность ш уйго в отношении АЭСС оценивали на обеих выбранных моделях опухолевых клеток Н460 и А549 (см. Примеры 8 и 9).

Схема эксперимента

Опухолевые клетки (А549 и Н460) в РВ8 с 2% В8А (1 млн/мл) инкубировали 30 мин при 4°С с 500 нг/мл ЕСЕ2 (В&О8ук!етк) и 2 мкг/мл кЕСЕВ2-Ес или контрольным 1дС1 человека (81дта). Опухолевые клетки разводили ВРМ1 с 1% ЕВ8 и инкубировали в 96-луночном планшете исходя из 5000 клеток на лунку. Очищенные ΝΚ добавляли в соотношении ΝΚ/опухолевые клетки как 20/1 и 6/1. Планшеты инкубировали 4 ч при 37°С, затем центрифугировали и титровали в супернатанте лактатдегидрогеназу (набор ВОСНЕ). 100% лизис получали с использованием 0,2% тритона Х100. Специфическую АЭСС, индуцируемую кЕСЕВ2-Ес, вычисляли согласно требованиям производителя.

Результаты

Результаты, представленные на фиг. 16, показывают лизис опухолевых клеток, опосредованный натуральными киллерными клетками (ΝΚ) в присутствии кЕСЕВ2-Ес, в обеих линиях опухолевых клеток А549 и Н460 близко к 25% при соотношении 20/1 (ΝΚ/опухолевые клетки), указывая на то, что кЕСЕВ2Ес способен опосредовать эффект АЭСС на эти опухолевые клетки.

Пример 11. Оценка ш у|уо активности в отношении АЭСС и СЭС слитого белка кЕСЕВ2-Ес в модели подкожной опухоли А549.

1,6.

Модель подкожной опухоли А549

Линию клеток А549 идентифицировали в качестве опухолевой линии клеток для оценки эффективности кЕСЕВ2-Ес, так как эти клетки экспрессируют ЕСЕ2 ш у|уо на высоком уровне и чувствительны к кЕСЕВ2-Ес-опосредованной АЭСС ш уйго.

- 21 018700

Линии мышей

Три разные линии мышей (мыши 8СГО, ΝΘΩ/ΞΟΙΩ и 8СГО/Ьд) выбрали для оценки способности кЕСЕК2-Ес опосредовать активности в отношении АЭСС и/или СЭС ίη у1уо. У мышей 8СГО сохранены функции ΝΚ и комплемента, и они способны к развитию ответов АЭСС и СЭС, и их выбрали в качестве положительного контроля. Мыши ΝΟΌ/8ΟΌ не обладают ни функцией ΝΚ, ни способностью стимулировать активность комплемента, и они неспособны к развитию активностей ни в отношении АЭСС, ни в отношении СЭС. Мыши 8СГО/Ьд не обладают функцией ΝΚ и не способны к развитию активности в отношении АЭСС.

В этом эксперименте эффективность линии молекул кЕСЕК2-Ес оценивали на опухоли А549, имплантированной подкожно трем разным линиям мышей. кЕСЕК2-Ес инъецировали подкожно два раза в неделю в дозе 5 мг/кг в течение всего курса исследования.

Схема эксперимента

А549 имплантировали подкожно мышам 8СГО, ΝΟΌ/8ΟΌ и ЗСГО/Ьд, как описано ранее (см. Пример 8). Лечение проводили два раза в неделю подкожными инъекциями в течение 6 последовательных недель. В течение курса исследования массу тела и объем опухоли измеряли два раза в неделю.

Результаты

Как представлено на фиг. 17, объем опухоли анализировали вплоть до 41 суток в 3 экспериментах. У мышей 8СГО группа, подвергнутая лечению кЕСЕК2-Ес из расчета 5 мг/кг (ромбы), статистически отличалась от контрольной группы (незакрашенные круги), и для нее показано ингибирование опухоли (вычисленное как 100 - (объем в группе, подвергнутой лечению/объем в контрольной группех100)) на 39%. У мышей ΝΟΌ/8ΟΌ кЕСЕК2-Ес из расчета 5 мг/кг не обладал активностью. У мышей 8СГО/Ьд кЕСЕК2-Ес исходя из 5 мг/кг частично восстанавливал свою активность (ингибирование опухоли = 18%). Согласно этим результатам, механизмы СЭС и АЭСС вносят вклад в эффективность 8ЕСЕК2-ЕС.

Пример 12. Оценка ίη у1уо активностей в отношении АЭСС и СЭС слитого белка кЕСЕК2-Ес в модели подкожной опухоли Н460

В этом примере кЕСЕК2-Ес представляет собой слитый белок, соответствующий аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ №. 2 со средним количеством сиаловой кислоты на Ν-гликан 8ЕСЕК2 более

1,6.

Модель подкожной опухоли Н460

Линию клеток Н460 идентифицировали в качестве опухолевой линии клеток для оценки эффективности кЕСЕК2-Ес, эти клетки экспрессируют ЕСЕ2 ίη у1уо на высоком уровне и чувствительны к &ЕСЕК2Ес-опосредованной АЭСС ίη νίΙΐΌ.

Линии мышей

Как описано ранее в примере 11, три линии мышей с разными иммунными функциями (мыши 8СГО, ΝΟΌ/8ΟΌ и 8СГО/Ьд) были отобраны для оценки способности кЕСЕК2-Ес опосредовать активности в отношении АЭСС и/или СЭС ίη у1уо в Н460.

В этом эксперименте эффективность молекулы кЕСЕК2-Ес оценивали на опухоли Н460, имплантированной подкожно мышам трех разных линий. кЕСЕК2-Ес инъецировали подкожно два раза в неделю в дозе 25 мг/кг в течение всего курса исследования.

Схема эксперимента

Н460 имплантировали подкожно мышам 8СГО, ΝΟΌ/8ΟΌ и ЗСГО/Ьд, как описано ранее (смотри Пример 9). Лечение проводили два раза в неделю подкожными инъекциями в течение 3 последовательных недель. В течение курса исследования массу тела и объем опухоли измеряли два раза в неделю.

Результаты

Как представлено на фиг. 18, объем опухоли анализировали вплоть до 22 суток в 3 экспериментах. У мышей 8СГО группа, подвергнутая лечению кЕСЕК2-Ес, исходя из 25 мг/кг (ромбы), статистически отличалась от контрольной группы (незакрашенные круги), и для нее показано ингибирование опухоли на 29%. У мышей ΝΟΌ/8ΟΌ для кЕСЕК2-Ес, исходя из 5 мг/кг, наблюдали потерю активности с ингибированием опухоли на 14%. У мышей 8СГО/Ьд кЕСЕК2-Ес, исходя из 5 мг/кг, восстанавливал всю свою активность (ингибирование опухоли = 32%). В этих исследованиях, а также как отмечено для модели опухоли А549 (см. СρηМеρ 11), механизмы СЭС и АЭСС давали вклад в эффективность §ЕСЕК2-Ес.

Пример 13. Оценка эффективности ίη у1уо §ЕСЕК2-Ес в сравнении с кЕСЕК2-Ес (А265 Ес) в модели подкожной опухоли Н460.

В 8Ые1бк а! а1. описана точечная мутация Акр265А1а в Ес-домене ΙβΟ1 человека, обозначенная как А265 Ес, которая приводила к снижению связывания со всеми рецепторами ЕсуК и очень низкой антителозависимой клеточной цитотоксичности (2001 I. Бю1. Сйет. 276:6591). Эту точечную мутацию вводили в последовательность ДНК, кодирующую Ес-домен §ЕСЕК2-Ес, плазмиды рХЬ4547 (фиг. 19), давая в результате полинуклеотидную последовательность, представленную как 8ЕО ΙΌ №. 13. Стабильные клоны №/№1^, экспрессирующие кЕСЕК2-Ес (А265 Ес) (8ЕО ΙΌ №. 14), получали с использованием селекции с ЭНЕК и системы амплификации с помощью соответствующих экспрессионных плазмид млекопитающих рХЬ4547 и рХЬ4417, как описано в примере 3. Белок §ЕСЕК2-Ес (А265 Ес) затем продуци- 22 018700 ровали и очищали для исследований т νί\Ό. Подтверждено, что содержание в нем гликана сходно с содержанием гликана, найденным для зЕСЕК2-Ес, продуцируемого в примерах 3 или 5.

Экспрессируемый белок из стабильного СНО-ϋΗΓΚ	зГСГН2-Гс (А265 Ес)
% сиалированных форм 5РСГК2-Ес
1-несиалированный	40%
2-моносиалнрованный	28%
З-дисиалированный	22%
4-трисиалированный	10%
Моносахаридный состав Ν-гликанов 3ΕΌΓΚ2- Гс на три маннозы
1-глюкозамин (количество на три маннозы)	4,35
-галактоза (количество на три маннозы)	2, 74
3-фукоза (количество на три маннозы)	0, 89

Модель подкожной опухоли 460

Линию клеток Н460 идентифицировали в качестве опухолевой линии клеток для оценки эффективности зЕСЕК2-Ес; эти клетки экспрессировали ЕСЕ2 т νί\Ό на высоком уровне и были чувствительны к зЕСЕК2-Ес-опосредованной АЭСС т νί!ΐΌ.

В этом эксперименте эффективность молекулы зЕСЕК2-Ес и модифицированной молекулы зЕСЕК2-Ес (А265 Ес) оценивали на опухоли Н460, имплантированной подкожно голым мышам.

Схема эксперимента

Н460 имплантировали подкожно голым мышам Ва1Ь/С, как описано ранее (см. Пример 9). Лечение проводили два раза в неделю в течение всего курса исследования. В течение курса исследования массу тела и объем опухоли измеряли два раза в неделю.

Результаты

Как представлено на фиг. 20, объем опухоли анализировали вплоть до 23 суток. Группа, подвергнутая лечению зЕСЕК2-Ес из расчета 25 мг/кг (ромбы), статистически отличались от контрольной группы (незакрашенные круги), и для нее показано ингибирование опухоли на 50%. Модифицированный зЕСЕР2-Ес (А265 Ес), исходя из 25 мг/кг, обладал потерей активности с ингибированием опухоли только на 25% (N8). Мутация внутри Ес зЕСЕК2-Ес (А265 Ес) вызывала снижение активности.

Так как показано, что эта модификация снижает антителозависимую клеточную цитотоксичность, пример 13 дает непрямое доказательство того, что зЕСЕК2-Ес действует т νί\Ό посредством механизма, включающего АЭСС.

- 23 018700

Список последовательностей <110> СЕЫТЕДЮК <120> МОДИФИЦИРОВАННЫЕ РАСТВОРИМЫЕ СЛИТЫЕ КОНСТРУКЦИИ РЕЦЕПТОРА ЕСЕ И Ес С УЛУЧШЕННОЙ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ <130> ГК2006-С84 РСТ <150> ЕР 06291824.8 <151> 2006-11-28 <150> Е? 07290042.6 <151> 2007-01-11 <160> 14 <170> РакепРГп версии 3.3 <210> 1 <211> 1755 <212> ДНК <213> Ното заргепэ <220>

<221> СПБ <222> (1) . . 11755)

<400> 1

асе ТЬг 5

аса ТЬг

кка Деи

дад С1и

сса Рго

даа С1и 10

дад С1и

сса Рго

аск ТЬг

ааа Ьуз 15

Рас Туг

48

кка Деи 1

дкк Уа 1

дад С1и

дак Азр

саа

акс

кек

саа

сса

даа

дкд

Дас

дкд

дек

дса

сса

ддд

дад

кед

ска

96

С1п

11е

Бег

С1п

Рго

С1и

Уа1

Туг

Уа1

А1а

Рго

С1у

С1и

Зег

Ьеи

20

25

30

дад

дкд

сдс

рдс

скд

ккд

ааа

дак

дсс

дкд

акс

адк

кдд

аск

аад

144

С1и

Уа1

Агд

Суз

Деи.

Ьеи

Ьуз

Азр

А1а

Уа1

Не

Зег

Тгр

ТЬг

Ьуз

35

40

45

дак

ддд

дкд

сас

ккд

ддд

ссс

аас

аа к

адд

аса

дкд

екк

ак к

ддд

дад

192

Аэр

С1у

Уа1

Н13

Деи

С1у

Рго

Азп

А5П

Агд

ТЬг

УаЬ

Ьеи

11е

С1у

С1и

50

55

60

Рас

ккд

сад

ака

аад

ддс

дсс

асд

сек

ада

дас

Рсс

ддс

скс

как

дек

240

Туг

Деи

С1п

Не

Ьуз

С1у

А1а

ТЬг

Рго

Агд

Азр

Зег

С1у

Ьеи

Туг

А1а

65

70

75

80

Рдк

аск

дсс

адк

адд

аск

дка

дас

адк

даа

аск

кдд

Рас

ккс

акд

дкд

288

Суэ

ТЬг

А1а

Зег

Агд

ТЬг

Уа1

Азр

Зег

С1и

ТЬг

Тгр

Туг

РЬе

Мек

Уа1

85

90

95

аак

дкс

аса

дак

дсс

акс

кса

ксс

дда

дак

дад

дак

дас

асе

дак

336

Азп

ТЬг

Азр

А1а

Не

Зег

Б1у

Азр

С1и

Азр

ТЬг

Азр

100

105

110

ддк

дед

даа

дак

ккк

дкс

адк

дад

аас

адк

аас

аад

ада

дса

сса

384

□ 1у

А1а

С1и

Азр

РЬе

Уа1

Зег

61и

Азп

5ег

Азп

Ьуз

Агд

А1а

Рго

115

120

125

Рас

кдд

асе

аас

аса

даа

аад

акд

даа

аад

едд

оке

сак

дек

дкд

сок

4 32

Туг

Тгр

ТЬг

Азп

ТЬг

С1и

Ьуз

Мек

С1и

Ьуз

Агд

Ьеи

Н1 з

А1а

Уа1

Рго

- 24 018700

130 135 140

дед А1а 145

дсс А1а

аас Азп

асе ТЬг

дес Уа1

аад Ьуз 150

гее Рке

сдс Агд

еде Суз

сса Рго

дсс А1а 155

ддд С1у

аас Азп

сса Рго

асд Мес 160

480

сса

асе

аСд

едд

ссд

ааа

аас

ддд

аад

дад

есс

аад

сад

дад

саС

528

Рго

ТЬг

МеС

Агд

Тгр

Ьеи

Ьуз

Азп

С1у

Ьуз

С1и

Р1че

Ьуз

С1п

<31и

Н15

165

170

175

еде

асе

дда

ддс

Сас

аад

деа

еда

аас

сад

сас

едд

аде

сес

аес

аСд

576

Агд

Не

С1у

Туг

Ьуз

Уа1

Агд

Азп

С1п

Н15

Тгр

Зег

Ьеи

Не

МеС

180

185

190

даа

аде

дед

дСс

сса

Ссе

дас

аад

дда

ааС

еае

асе

еде

дед

дад

624

С1и

Зег

νβΐ

Уа1

Рго

Зег

Азр

Ьуз

С1у

Азп

Туг

Τ1ΊΓ

Суз

Уа1

С1и

195

200

205

ааС

даа

Сас

ддд

Ссс

аес

ааС

сас

асд

еас

сас

сСд

дас

дее

дед

дад

672

Азп

С1и

Туг

С1у

Зег

11е

АЗП

Н13

ТЬг

Туг

Н15

Ьеи

Азр

Уа1

Уа 1

С1и

210

215

220

еда

сед

СсС

сас

едд

ссс

аес

ССС

саа

дсс

дда

сСд

ссд

дса

ааС

дсс

720

Агд

Зег

Рго

Н1з

Агд

Рго

11е

Ьеи

С1п

А1а

31у

Ьеи

Рго

А1а

Азп

А1а

225

230

235

240

Есе

аса

дЬд

дСс

дда

дас

деа

дад

еее

дес

Сдс

аад

дее

Сас

адЬ

768

Зег

ТЬг

Уа1

С1у

31у

Азр

Уа1

С1и

РОе

Уа1

Суз

Ьу5

Уа1

Туг

Зег

245

250

255

дае

дсс

сад

ссс

сас

аес

сад

едд

аес

аад

сас

дед

даа

аад

аас

ддс

816

Азр

А1а

С1п

Рго

Н1з

Не

С1п

Тгр

Не

Ьуз

Н1з

Уа1

С1и

Ьуз

Азп

С1у

260

265

270

аде

ааа

Сас

ддд

ссс

дас

ддд

сЬд

ссс

Сас

сес

аад

дее

сСс

аад

дсс

864

Зег

Ьуз

Туг

С1у

Рго

Азр

С1у

Ьеи

Рго

Туг

Ьеи

Ьуз

Уа1

Ьеи

Ьуз

А1а

275

280

285

дес

ддС

дее

аас

асе

асд

дас

ааа

дад

аее

дад

дее

сСс

СаС

аее

едд

912

А1а

С1у

Уа1

Азп

ТЬг

Ткг

Азр

Ьуз

С1и

11е

С1и

Уа1

Ьеи

Туг

Не

Агд

290

295

300

ааС

деа

асе

еее

дад

дас

дсС

ддд

даа

сас

асд

Сдс

сед

дед

ддС

ааС

960

Азп

Уа1

ТОг

РЬе

С1и

Азр

А1а

С1у

С1и

Туг

ТНг

Суз

Ьеи

А1а

С1у

Азп

305

310

315

320

ссс

асе

ддд

а Са

Осс

ссс

сас

есе

дса

едд

СОд

аса

дСС

сед

сса

дед

1008

Зег

Не

С1у

Не

Зег

РЬе

Н15

Зег

А1а

Тгр

Ьеи

ТЬг

νβΐ

Ьеи

Рго

А1а

325

330

335

ссс

дда

ада

даа

аад

дад

асе

аса

дс1

есс

сса

дас

сас

сед

еса

дед

1056

Рго

С1у

Агд

С1и

Ьуз

С1и

Не

ТЬг

А1а

Зег

Рго

Азр

Туг

Ьеи

Зег

А1а

340

345

350

сса

дад

ссс

ааа

СсС

дас

ааа

асС

сас

аса

еде

сса

ссд

Сдс

сса

1104

Ьеи

31и

Рго

Ьуз

Зег

Суз

Азр

Ьуз

ткг

Н15

ТР1Г

Суз

Рго

Суз

Рго

355

360

365

дса

ссс

даа

сес

ссд

ддд

дда

ссд

сса

дес

его

ссс

сес

ссс

сса

ааа

1152

А1а

Рго

С1и

Ьеи

С1у

Рго

Зег

Уа1

РНе

Ьеи

РЪе

Рго

Ьуз

370

375

380

ссс

аад

дас

асе

сес

аед

а1с

Гсс

едд

асе

ссе

дад

дес

аса

еде

дед

1200

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

Мее

11е

Зег

Агд

ТЬг

Рго

С1и

Уа1

ТЬг

Суз

Уа1

- 25 018700

385					390
дгд	дед	дас	дед	аде	сас	даа	дас	ссС
Уа1	Уа1	Азр	Уа1	Зег	Н15	С1и	Азр	Рго
				405
дЬд	дас	ддс	дЬд	дад	дСд	саС	ааС	дес
Уа1	Азр	С1у	Уа1	С1и	Уа1	Н13	Азп	А1а
			420					425
сад	сас	аас	аде	асд	Сас	еде	дед	дес
С1п	Туг	Азп	Зег	ТИг	Туг	Агд	Уа1	Уа1
		435					440
сад	дас	Сдд	сСд	ааС	ддс	аад	дад	Сас
С1л	Азр	Тгр	Ьеи	Азп	С1у	Ьу5	С1и	Туг
	450					4 55
дес	еСс	сса	дес	ссс	абс	дад	ааа	асе
А1а	Ьеи	Рго	А1а	Рго	11е	С1и	Ьуз	ТЬг
4 65					470
ссс	еда	даа	сса	сад	дед	Сас	асе	сед
Рго	Агд	С1и	Рго	С1п	Уа1	Туг	ТНг	Ьеи
				485
асе	аад	аас	сад	дСс	аде	сСд	асе	Ёдс
ТКг	Ьуз	Азп	С1л	7а1	Зег	Ьеи	ТИг	Суз
			500					505
аде	дас	аСс	дес	дСд	дад	едд	дад	аде
Зег	АЗр	Не	А1а	ν<51	С1и	Тгр	С1и	Зег
		515					520
Сае	аад	асе	асд	ссС	ссс	дед	сСд	дас
Туг	Ьуз	ТЬг	ТНг	Рго	Рго	Уа1	Ьеи	Азр
	530					535
Сае	аде	аад	еСс	асе	дСд	дас	аад	аде
Туг	Зег	Ьуз	Ьеи	ТЬг	УаХ	Азр	Ьуз	Зег
545					550
ССС	Сса	Сде	Ссс	дСд	аСд	саС	дад	дсС
РЬе	Зег	Суз	Зег	Уа1	Мее	Н15	С1и	АХа
				565
аад	аде	сСс	Ссс	сСд	СсС	сед	ддс	Сда
Ьуз	Зег	Ьеи	Зег	Ьеи	Зег	Рго	<31у
			580
<2Ю> :	?
<211> !	584
<212> 1	РКТ
<213> 1	Чото	Зар1епз
<4оо> ;	?
Ье и	Уа1	С1и	Азр	ТЬг	ТЪг	Ьеи	С1и	Рго
1				5
С1п	Не	Зег	С1п	Рго	С1и	УаХ	Туг	Уа1
			20					25

395	4 00
дад	дСс	аад	ЬЬс	аас	едд	Сае	1248
С1и 410	Уа1	Ьу5	РПе	Азл	Тгр 4 15	Туг
аад	аса	аад	сед	едд	дад	дад	1296
Ьуз	ТЬг	Ьуз	Рго	Агд 430	С1и	СХи
аде	дСс	сес	асе	дСс	сСд	сас	1344
Зег	Уа1	Ьеи	тЬг 445	Уа1	Ьеи	Н15
аад	еде	аад	дСс	Ссс	аас	ааа	1392
Ьуз	Суз	Ьуз 460	Уа1	Зег	Азл	Ьу5
аес	Ссс	ааа	дес	ааа	ддд	сад	1440
Не	Зег 475	Ьуз	АХа	Ьуз	С1у	С1п 480
ссс	сса	Ссс	едд	дас	дад	сед	1488
Рго 490	Рго	Зег	Агд	Азр	С1и 495	Ьеи
сСд	дСс	ааа	ддс	ССс	СаС	ссс	1536
Ьеи	Уа1	Ьуз	С1у	РЬе 510	Туг	Рго
ааС	999	сад	сед	дад	аас	аас	1584
АЗЛ	31у	С1п	Рго 525	С1и	Азл	АЗЛ
ССС	дас	ддс	Ссс	ССс	ССс	сЬс	1632
Зег	Азр	С1у 540	Зег	РЬе	РЛе	Ьеи
адд	Ьдд	сад	сад	ддд	аас	дСс	1680
Агд	Тгр 555	СХп	СХп	С1у	Азп	Уа1 560
сСд	сас	аас	сас	Сас	асд	сад	1728
Ьеи 570	Н15	Азл	Н1з	Туг	Τ1ΊΓ 575	С1л

1755

С1и 10	С1и	Рго	Рго	ТЬг	Ьуз 15	Туг
А1а	А1а	Рго	С1у	С1и 30	Зег	Ьеи

- 26 018700

С1и

Уа1

Агд 35

Суз

Беи

Бед

Буй

Азр 40

А1а

Уа1

11€

Зег 45

Тгр

ТЬг

Буз

Азр

С1у

7а1

Н13

Беи

С1у

Рго

Азп

Агд

ТЬг

Беи

Не

С1у

С1и

50

55

60

Туг

Беи

С1п

Не

Буз

С1у

А1а

ТЫ

Рго

Агд

Азр

5ег

61 у

Беи

Туг

А1а

65

70

75

80

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Агд

ТЬг

Уа1

Азр

Зег

61и

ТЬг

Тгр

Туг

РЬе

МеГ

Уа1

85

90

95

Азп

Уа1

ТЬг

Азр

А1а

Не

Зег

61у

Азр

С1и

Азр

ТЬг

Азр

100

105

НО

С1у

А1а

С1и

Азр

РЬе

Уа1

Зег

61и

Азп

Зег

Азп

Ά5Π

Буз

Агд

А1а

Рго

115

120

125

Туг

Тгр

Тм

Азп

ТЬг

61и

Ьуз

МеЬ

61и

Буз

Агд

Ъеи

Н13

А1а

Уа1

Рго

130

135

140

А1а

Азп

ТЬг

Уа1

Буз

РЬе

Агд

Суз

Рго

А1а

С1у

Азп

Рго

Мер

145

150

155

160

Рго

ТЬг

Не 6

Агд

Тгр

Беи

Буз

Азл

61 у

Бу5

61и

РЬе

Буз

С1п

61и

Н13

165

170

175

Агд

Не

61 у

61у

Туг

Ьуз

Уа1

Агд

Азп

61п

Н1 з

Тгр

Зег

Беи

11е

МеО

180

185

190

С1и

Зег

Уа1

Рго

Зег

Азр

Буз

61у

АЗП

Туг

ТЫ

Суз

7а1

Уа1

61и

195

200

205

Азп

С1и

Туг

61у

Зег

Г1е

Азп

Н1з

ТЬг

Туг

Н1з

Ьеи

Азр

Уа1

61и

210

215

220

Агд

Зег

Рго

Н13

Агд

Рго

11е

Беи

61п

А1а

61 у

Ъеи

Рго

А1а

Азп

А1а

225

230

235

240

Зег

ТЬг

Уа1

С1у

61у

Азр

Уа1

61и

РЬе

Уа1

Суз

Буз

νβΐ

Туг

Зег

245

250

255

Авр

А1а

61п

Рго

Н15

Не

61п

Тгр

11е

Буз

Н13

Уа1

61и

Буз

Азп

61у

260

265

270

Зег

Буз

Туг

61у

Рго

Азр

61у

Беи

Рго

Туг

Беи

Буз

Уа1

Беи

Буз

А1а

275

280

285

- 27 018700

А1а

С1у 290

Уа1

Азп

ТЬг

Азр 295

Буз

С1и

Не

С1и

Уа1 300

Беи

Туг

Не

Агд

Азп

Уа1

ТЬг

РЬе

С1и

Азр

А1а

С1у

С1и

Туг

ТЬг

Суз

Беи

А1а

С1у

Азп

305

310

315

320

Зег

Не

С1у

Не

Зег

РЬе

Н15

Зег

А1а

Тгр

Беи

ТЬг

Уа1

Беи

Рго

А1а

325

330

335

Его

С1у

Агд

С1и

Ьуз

С1и

Не

ТЬг

А1а

Зег

Рго

Азр

Туг

Беи

Зег

А1а

340

345

350

Беи

С1и

Рго

Буз

Зег

Суз

Азр

Буз

ТЬг

Низ

ТЬг

Суз

Рго

Суз

Рго

355

360

365

А1а

Рго

61и

Беи

С1у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Беи

РЬе

Рго

Буз

370

375

380

Его

Буз

Азр

ТЬг

Беи

Ме!

Не

Зег

Агд

ТЬг

Рго

С1и

Уа1

ТЬг

Суз

Уа1

385

390

395

400

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Н13

С1и

Азр

Рго

31и

Уа1

Буз

РЬе

Азп

Тгр

Туг

405

410

4 15

Уа1

Азр

С1у

Уа1

С1и

Уа1

Η1Ξ

Азп

А1а

Буз

ТЬг

Буз

Рго

Агд

С1и

Е1и

420

425

430

С1п

Туг

Азп

Зег

ТЬг

Туг

Агд

Уа1

Зег

Уа1

Беи

ТЬг

Уа1

Беи

Н1з

435

440

445

С1п

Азр

Тгр

Беи

Азп

С1у

Буз

С1и

Туг

Буз

Суз

Буз

Уа1

Зег

Азп

Буз

450

455

4 60

А1а

Беи

Рго

А1а

Рго

11е

С1и

Буз

ТЬг

11е

Зег

Буз

А1а

Буз

□ 1у

С1п

465

470

475

480

Рго

Агд

С1и

Рго

С1п

Уа1

Туг

ТЬг

Беи

Рго

Зег

Агд

Азр

С1и

Беи

485

490

495

ТЬг

Буз

Азп

С1п

Уа1

Зег

Беи

ТЬг

Суз

Беи

Уа1

Буз

С1у

РЬе

Туг

Рго

500

505

510

Зег

Аэр

11е

А1а

Уа1

С1и

Тгр

С1и

Зег

Азп

С1у

С1п

Рго

С1и

Азп

515

520

525

Туг

Буз

ТЬг

Рго

Уа1

Беи

Азр

Зег

Азр

С1у

Зег

РЬе

Беи

530

535

540

- 28 018700

Туг 545

Зег

Ьу5

Беи

ТО г

Уа1 550

Азр

Куз

Зег

Агд

Тгр С1п С1п 555

С1у

Аз η

Уа1 560

РОе

Зег

Су5

Зег

МеБ

Н13

61и

А1а

Беи

Н13

АЗП

Н13

Туг

ТЬг

С1п

565

570

575

Ьуз

Зег

Беи

Зег

Беи

Зег

Рго

01 у

580 <210> 3 <211> 1050 <212> ДНК <213> Ното 5ар1епв

<220> <221> ( <222>	205
(П ..	. С1050)
<400> :	3
сса	дгх	дад	даБ	асе	аса	сса	дад	сса
Беи 1		С1и	Азр	ТБг 5	ХЪг	Беи	С1и	Рго
саа	асе	ССБ	саа	сса	даа	дед	Бас	дед
31п	Не	Зег	С1п 20	Рго	С1и	Уа1	Туг	Уа1 25
дад	дбд	сдс	Сдс	сСд	ББд	ааа	даБ	дсс
31и	Уа1	Агд 35	Суз	Беи	Беи	Буз	Азр 40	А1а
даБ	ддд	дед	сас	сед	ддд	ссс	аас	аас
Азр	С1у 50	Уа1	Н13	Беи	С1у	Рго 55	Азп	Азп
Бас	ББд	сад	аБа	аад	ддс	дсс	асд	ссБ
Туг 65	Беи	С1п	Не	Буз	С1у 70	А1а	ТЬг	РГО
	асБ	дсс	адБ	адд	асе	дСа	дас	адС
Суз	ТЬг	А1а	Зег	Агд 95	ТНг	Уа1	Азр	Зег
аае	дсс	аса	дас	дсс	аБс	Беа	Бсс	дда
Азп	Уа1	ТЪи	Азр 100	А1а	11е	Зег	Зег	С1у 105
ддБ	дед	даа	даБ	ССБ	дес	адБ	дад	аас
С1у	А1а	С1и 115	Азр	РЛе	Уа1	Зег	С1и 120	Азп
Бас	Бдд	асе	аас	аса	даа	аад	аБд	даа
Туг	Тгр 130	ТНг	Азп	ТЛг	б1и	Буз 135	Мее	С1и
дед	дсс	аас	асе	дБс	аад	БББ	сдс	Оде
А1а 145	А1а	Азп	ТГ1Г	νβΐ	Буз 150	РЬе	Агд	Суз

даа С1и 10	дад С1и	сса Рго	сса Рго	асе Т1эг	ааа Буз 15	бас Туг	48
дсБ	дса	сса	ддд	дад	Сед	сба	96
А1а	А1а	Рго	01 у	С1и 30	Зег	Ьеи
дсс	дед	аБс	адБ	Бдд	асБ	аад	144
А1а	Уа1	11е	Зег 45	Тгр	ТКг	Ьуз
адд	аса	дед	сББ	асе	ддд	дад	192
Агд	ТЬг	Уа1 60	Беи	11е	С1у	51и
ада	дас	Осс	дде	СБС	СаБ	дсб	240
Агд	Азр 75	Зег	С1у	Беи	Туг	А1а Θ0
даа	асБ	Бдд	Сас	ББс	аСд	дБд	288
С1и 90	ТНг	Тгр	Туг	РБе	Мес 95	Уа1
даБ	даБ	дад	даБ	дас	асе	даб	336
Азр	Азр	С1и	Азр	Азр 110	ТЬг	Азр
адБ	аас	аас	аад	ада	дса	сса	384
Зег	Азп	Азп	Буз 125	Агд	А1а	Ргс
аад	едд	СБО	сае	дсБ	дБд	ссб	432
Буз	Агд	Беи 140	Н13	А1а	Уа1	Рго
сса	дсс	ддд	ддд	аас	сса	абд	480
Рго	А1а 155	С1у	С1у	Азп	Рго	Меб 160

сса Рго

асе ТЬг

аСд МеС

едд Агд

Едд Тгр 165

сЕд Ьеа

ааа Ьуз

аас Азп

ддд 31 у

аад Ьуз 170

дад С1и

ЕЕЕ РЬе

аад Ьуа

сад С1п

дад С1и 175

саЕ Н13

528

сдс

аЬС

дда

ддс

сас

аад

дЕа

еда

аас

сад

сас

Едд

аде

ебс

аЕЕ

аЕд

576

Агд

Не

С1 у

61у

Туг

Ьуз

7а1

Агд

Азп

С1п

Н1з

Тгр

Зег

Ьеи

Не

МеЕ

180

135

1Э0

даа

адС

дЕд

дЕс

сса

ЕсЕ

дас

аад

дда

ааЕ

ЕаЕ

асе

ЕдЕ

дЕд

дад

624

С1и

Зег

Уа1

РГО

Зег

Аар

Ьуз

61у

Азп

Туг

ТОг

Суз

7а1

Уа1

С1и

195

200

205

аа£

даа

Еас

ддд

Ссс

аЕс

ааЕ

сас

асд

Еас

сас

сЕд

даЕ

дЕЕ

дЕд

дад

672

Азп

С1и

Туг

С1у

Зег

11е

Азп

Н15

ТНг

Туг

Н1з

Ьеи

Азр

7а1

Уа1

С1и

210

215

220

еда

Сед

ССЕ

сас

едд

ссс

аге

сСс

саа

дес

дда

сЕд

сед

дса

ааЕ

дес

720

Агд

Зег

Рго

Н1з

Агд

Рго

Не

Ьеи

С1п

А1а

С1у

Ьеи

Рго

А1 а

Азп

А1а

225

230

235

240

вес

аса

дЕд

дЕс

дда

дас

дСа

дад

ЕЕЕ

дЕс

Еде

аад

дЕЕ

Еас

адЕ

768

Зег

ТНг

Уа1

С51у

С1у

Авр

ν^ι

61и

РЬе

Уа1

Суз

Ьуз

Уа1

Туг

Зег

245

250

255

да5

дес

сад

ссс

сас

аЕс

сад

Едд

абс

аад

сас

дЕд

даа

аад

аас

ддс

816

Азр

А1а

С1п

Рго

Н13

11е

С1п

Тгр

Не

Ьуз

Н1з

Уа1

С1и

Ьуз

Азп

С1у

260

265

270

аде

ааа

Еас

ддд

ссс

дас

ддд

сЕд

ссс

Еас

СЕС

аад

дЕЕ

сЕс

аад

дес

864

Зег

Ьуз

Туг

С1у

Рго

Аар

О1у

Ьеи

Рго

Туг

Ьеи

Ьуз

Уа1

Ьеи

Ьуз

А1а

275

280

285

дес

ддЕ

дЕЕ

аас

асе

асд

дас

ааа

дад

аЕЕ

дад

дЕЕ

сЕс

ЕаЕ

аЕЕ

едд

912

А1а

С1у

Уа1

Азп

ТЬг

Азр

Ьуз

С1и

Не

С1и

Уа1

Ьеи

Туг

11е

Агд

290

295

300

аас

дЕа

ас!

ЕЕЕ

дад

дас

дсЕ

ддд

даа

ЕаЕ

асд

Еде

ЕЕд

дед

ддЕ

ааЕ

960

Азп

Уа1

ТЪг

₽6е

С1и

Аар

А1а

С1у

С1и

Туг

ТЬг

Суз

Ьеи

А1а

С1у

Азп

305

310

315

320

ССС

аЕЕ

ддд

Оба

Ссс

ЕЕЕ

сас

ЕСЕ

дса

Едд

ЕЕд

аса

дЕЕ

сЕд

сса

дед

1008

2ег

11е

С1у

Не

Зег

Рбе

Н1з

Зег

А1 а

Тгр

Ьеи

ТКг

Уа1

Ьеи

Рго

А1а

325

330

335

ССС

дда

ада

даа

аад

дад

аЕЕ

аса

дсС

ЕСС

сса

дас

Еас

сЕд

1050

Рго

С1у

Агд

С1и

Вуз

С1и

Не

Тбг

А1а

Зег

Рго

Азр

Туг

Кеи

340

345

350

<210> <211> <212> <213>

4 350 РКТ Ното

зархепз

<400>

4

Веи Уа1 ΰ1и 1

Азр

ТПг 5

ТПг

Ьеи

С1и

Рго

61и 10

С1и

Рго

ТЬг

Ьуз 15

Туг

С1п 11е Зег

С1п 20

Рго

61и

Туг

Уа1 25

А1а

Рго

61у

С1и 30

Зег

Ьеи

- 30 018700

С1и Уа1

Агд 35

Суз

Ьеи

Туз

Азр 40

А1а

Уа1

11е

Зет 45

Тгр

ТЬг

Ьуз

Азр

С1у

Уа1

Нхз

Ьеи

С1у

Рго

Азп

Агд

ТЬг

Уа1

Ьеи

11е

С1у

С1и

50

55

60

Туг

Ьеи

С1п

11е

Ьуз

С1у

А1а

ТЬг

Рго

Агд

Азр

Зег

61у

Ьеи

Туг

А1а

65

70

75

80

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Агд

ТЬг

7а1

Азр

Зег

С1и

ТЬг

Тгр

Туг

РЬе

Мес

Уа1

85

90

95

Азп

Уа1

ТЬг

Азр

А1а

11е

Зег

С1у

Азр

С1и

Азр

ТЬг

Азр

100

105

110

С1у

А1а

С1и

Азр

РЬе

Уа1

Зег

С1и

Азп

Зег

Азп

Ьуз

Агд

А1а

Рго

115

120

125

Туг

тгр

ТЬг

Азп

ТЬГ

С1и

Ьуз

МеС

С1и

Ьуз

Агд

Ьеи

Н15

А1а

ν*1

Рго

130

135

140

А1а

Азп

ТЬг

Уа1

Ьуз

РЬе

Агд

Суз

Рго

А1а

С1у

61у

Азп

Рго

Мер

145

150

155

160

Рго

ТЬг

МеС

Агд

Тгр

Ьеи

Ьуз

Азп

С1у

Ьуз

С1и

РЬе

Ьуз

С1п

С1и

Н18

165

170

175

Агд

Не

С1у

Туг

Ьуз

Уа1

Агд

Азп

С1п

Н15

Тгр

Зег

Ьеи

11е

МеС

180

185

190

С,1ч

Зег

Уа1

Рго

Зег

Азр

Ьуз

31у

Азп

Туг

ТЬг

Суз

Уа1

С1и

195

200

205

Азп.

С1и

Туг

С1у

Зег

11е

Азп

Н15

ТЬг

Туг

Н13

Ьеи

Азр

νβΐ

Уа1

С1и

210

215

220

Агд

Зег

Рг о

Н1з

Агд

Рго

Не

Ьеи

С1п

А1а

С1у

Ьеи

Рго

А1а

Азп

А1а

225

230

235

240

Зег

ТЬг

7а1

νβΐ

С1у

Азр

Уа1

С1и

РЬе

Уа1

Суз

Ьуз

Уа1

Туг

Зег

245

250

255

Азр

А1а

С1п

Рго

Н13

11е

С1п

Тгр

11е

Ьуз

Н13

Уа1

С1и

Ьуз

Азп

С1у

260

265

270

Зег

Ьуз

Туг

С1у

Рго

Азр

С1у

Ьеи

Рго

Туг

Ьеи

Ьуз

Уа1

Ьеи

Ьуз

А1а

275

280

285

А1а	С1у 290	Уа1	Азп	ТНг	ТНг	Азр 295	Ьуз
Азп 305	Уа1	ТНг	РНе	С1и	Азр 310	А1а	С1у
Зег	Не	С1у	11е	Зег 325	РНе	Н13	Зег
Рго	С1у	Агд	С1и 340	Ьуз	С1и	Не	ΊΊίε
<210> <211> <212> <213>	5 696 ДНК Ното	зардепз

Н1и	Не	С1и	Уа1 300	Ьеи	Туг	11е	Агд
С1и	Туг	ТНг	Суз	Ьеи	А1а	С1у	Азп
		315					320
А1а	Тгр	Ьеи	ТНг	Уа1	Ьеи	Рго	А1а
	330					335
А1а	Зег	Рго	Азр	Туг	Ьеи
345					350

<220> <221> < <222>	ИЗ (1) .	.(696)
<4 00> !	5
дад	ссс	ааа	ЕСЕ	ЕдЕ	дас	ааа	асЕ	сас
С1и 1	Рго	Ьуз	Зег	Суз 5	Азр	Ьуз	ТНг	Нез
ССЕ	даа	СЕС	сЕд	ддд	дда	ссд	Еса	дЕс
Рго	С1и	Ьеи	Ьеи 20	С1у	С1у	Рго	Зег	Уа1 25
аад	дас	асе	СЕС	аЕд	аЕс	Есс	едд	асе
Ьуз	Азр	ТНг 35	Ьеи	МеЕ	Не	Зег	Агд 40	ТНг
дСд	дас	д£д	аде	сас	даа	дас	ссЕ	дад
Уа1	Азр 50	Уа1	Зег	Н13	С1и	Азр 55	Рго	С1и
дас	ддс	д^д	дад	дед	саЕ	ааЕ	дсс	аад
Азр 65	61у		С1и	Уа1	Н1з 70	Азп	А1а	Ьуз
Еас	аас	аде	асд	Еас	сдЕ	дед	дне	аде
Туг	Азп	5ег	ТНг	Туг 85	Агд	Уа1	Уа1	5ег
дас	Одд	сЕд	ааЕ	ддс	аад	дад	Еас	аад
Азр	Тгр	Ьеи	Азп 100	С1у	Ьуз	С1и	Туг	Ьуз 105
СЕС	сса	дсс	ссс	аЕс	дад	ааа	асе	аЕс
Ьеи	Рго	А1а 115	Рго	11е	С1и	Ьуз	ТНг 120	Не
еда	даа	оса	сад	дЕд	Еас	асе	сЕд	ссс
Агд	С1и 130	Рго	С1П	Уа 1	Туг	ТНг 135	Ьеи	Рго

аса ТНг 10	Еде Суз	сса Рго	ссд Рго	Еде Суз	сса Рго 15	дса А1а	48
ЕЕС	сЕс	ЕСС	ссс	сса	ааа	ссс	96
РНе	Ьеи	РНе	Рго	Рго 30	Ьуз	Рго
ссЕ	дад	дЕс	аса	Еде	дЕд	дЕд	144
Рго	С1и	Уа1	ТНг 45	Суз	Уа1	Уа1
дЕс	аад	ЕЕс	аас	Едд	Еас	дЕд	192
Уа1	Ьуз	₽Не 60	Азп	Тгр	Туг	Уа1
аса	аад	ссд	едд	дад	дад	сад	240
ТНг	Ьуз 75	Рго	Агд	С1и	61и	С1п 80
дЕс	сЕс	асе	дЕс	сЕ д	сас	сад	288
Уа1 90	Ьеи	ТНг	Уа1	Ьеи	Н1з 95	С1п
Еде	аад	дЕс	Есс	аас	ааа	дсс	336
Суз	Ьуз	Уа1	Зег	Азп но	Ьуз	А1а
Есс	ааа	дсс	ааа	ддд	сад	ссс	384
Зег	Ьуз	А1а	Ьуз 125	С1у	С1п	Рго
сса	Есс	едд	даЕ	дад	сЕд	асе	432
Рго	Зег	Агд 140	Азр	С1и	Ьеи	ТНг

- 32 018700

аад Ъуз 145

аас АЗЛ

сад 61л

дне Уа1

аде Зег

сБд Беи 150

асе ТЬг

Оде Суз

сод Беи

дБс Уа1

ааа Буз 155

ддс С1у

00с РЪе

Бао Туг

ссс РГО

аде Зег- 160

480

дас

аБс

дсс

дБд

дад

Одд

дад

аде

ааБ

ддд

сад

ссд

дад

аас

Бас

528

Азр

Не

А1а

Уа1

С1и

Тгр

С1и

Зег

Азп

С1у

С1п

Рго

С1и

Азп

Туг

165

170

175

аад

асе

асд

ссБ

сое

дод

сБд

дас

Осс

дас

ддс

Осс

ОБс

ББс

сБс

Бас

576

Буз

ТБг

ТЕ г

Рго

Уа1

Беи

Азр

Зег

Азр

С1у

Зег

РБе

РНе

Беи

Туг

180

185

190

аде

аад

сБс

асе

дед

дас

аад

аде

адд

Одд

сад

ддд

аас

дБс

БОС

624

Зег

Буз

Беи

ТЬг

Уа1

Азр

Буз

Зег

Агд

Тгр

С1п

С1у

Азп

Уа1

РКе

195

200

205

Беа

Идс

Нес

дЬд

аБд

сан

дад

дсБ

сод

сас

аас

сас

Нас

асд

сад

аад

672

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеБ

Н13

С1и

А1а

Беи

Н13

Азп

Н13

Туг

ТОг

С1п

Буз

210

215

220

аде

СБС

Осс

сид

БсБ

ссд

ддс

Ода

696

Зег

Бел

Зег

Беи

Зег

Рго

С1у

225

230

<210>

6

<211> :

231

<212> :

РИТ

<213> 1

4 ото

зар1елз

<400>

6

С1и

Рго

Буз

Зег

Суз

Азр

Буз

ТЪг

Н13

ТЬг

Суз

Рго

Суз

Рго

А1а

1

5

10

15

Рго

С1и

Бее

Беи

С1у

Рго

Зег

\Аа1

РЬе

Беи

РКе

Рго

Буз

Рго

20

25

30

Буз

Азр

ТЬг

Беи

МеБ

Не

Зег

Агд

ТЪг

Рго

С1и

Уа1

Ткг

Суз

7а1

Уа1

35

40

45

Уа1

Азр

νοί

Зег

Н13

С1и

Азр

Рго

С1и

Уа1

Буз

РЬе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

50

55

60

Азр

С1у

7а1

С1и

Уа1

Н13

Азл

А1а

Буз

ТЬг

Буз

Рго

Агд

С1и

С1л

65

70

75

80

Туг

АЗЛ

Зег

Три

Туг

Агд

νβΐ

Уа1

Зег

Уа1

Беи

ТНг

Уа1

Беи

Н13

С1п

85

90

95

Азр

Тгр

Беи

Азл

С1у

Буз

С1и

Туг

Буз

Суз

Буз

ν61

Зег

Азп

Буз

А1а

100

105

110

Бен

Рго

А1а

Рго

Не

С1и

Буз

ТЪг

11е

Зег

Буз

А1а

Ъуз

С1у

С1П

Рго

115

120

125

- 33 018700

Агд

С1и 130

Рго

С1п

Уа1

Туг

ТЬг 135

Ьеи

Рго

Зег

Агд 140

Азр

С1и

Ьеи

ТЪг

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1у

№е

Туг

Рго

Зег

145

150

155

160

Азр

11е

АЬа

Уа1

С1и

Тгр

31и

Зег

Азп

С1у

С1п

Рго

61и

Азп

Туг

165

170

175

Ьуз

ТЬг

Ткг

Рго

Уа1

Ьеи

А5р

Зег

Азр

С1у

Зег

Р11е

РКе

Ьеи

Туг

180

185

190

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

С1п

61 п

61у

Азп

Уа1

РЪе

195

200

205

Зег

Суз

5ег

Уа1

МеЬ

Н1з

С1и

А1а

Ьеи

Низ

Азп

Н1з

Туг

ТНг

С1п

Ьуз

210

215

220

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

С1у

225 230 <210> 7 <211> 60 <212> ДНК <213> Ното заргепз <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(60) <400> 7

асд МеС 1

Сас Ту г

адд Агд

аРд Мее

саа С1п 5

обе Ьеи

сСд Ьеи

РсЪ Зег

Сдс Суз

аи 11е 10

дса А1а

сРа Ьеи

адр Зег

си Ьеи

дса А1а 15

сер Ьеи

48

дес

асд

ааЬ

1са

60

Уа1

ТНг

Азп

5ег

<210> 8 <211> 20 <212> РКТ <21 3> Ното зарюпв <400>8

МеС Туг Агд МеЬ С1п Ьеи Ьеи Зег Суз 11е А1а Ьеи Зег Ьеи А1а Ьеи

1015

Уа1 ТЬг Азп Зег <210>9

- 34 018700 <211> 1197 <212> ДНК <213> Ното 5ар1епз <220>

<221> СЦ5 <222> (1 ) . . (1197)

<400> 9

аСд МеС 1

адд Агд

есс Беи

едд Агд

дад С1и 5

ссд Рго

с£с Ьеи

сед Беи

аде 5ег

ддс С1у 10

аде Зег

дсс А1а

дед А1а

аСд Мес

сса Рго 15

ддс СБу

48

дед

Ссс

сса

сад

едд

дсс

Где

еде

ссд

сСс

дед

дсс

Сдс

дсс

сСд

96

А1а

Зег

Беи

С1п

Агд

А1а

Суз

Агд

Беи

7а1

А1а

Уа1

Суз

А1а

Беи

20

25

30

сас

есс

ддс

дСс

асе

сСс

д«

Сас

сед

дсс

ддс

сдс

дас

сед

аде

144

Н15

Беи

СБу

Уа1

ТНг

Беи

Уа1

Туг

Беи

А1а

61у

Агд

Азр

Беи

Зег

35

40

45

сде

сед

ссс

саа

сед

дсс

дда

дСс

Ссс

аса

ссд

с£д

сад

ддс

Ссд

192

Агд

Беи

Рго

С1п

Беи

Уа1

С1у

Уа1

Зег

Тйг

Рго

Ьеи

С1п

СБу

Зег

50

55

60

аас

аде

дсс

аСс

ддд

сад

Ссс

ддд

дад

сСс

едд

асе

дда

240

Азп

Зег

А1а

Не

С1у

61п

Зег

С1у

С1и

Беи

Агд

ТНг

СБу

65

70

75

80

999

дсс

едд

сед

ссд

СсБ

ссС

сСа

ддс

дсс

Ссс

1:сс

сад

ссд

сдс

ссд

288

С1у

А1а

Агд

Рго

Беи

СБу

А1а

Зег

Бег-

С1п

Рго

Агд

Рго

85

90

95

ддб

ддс

дас

Ссс

аде

сса

дСс

дед

даС

СсС

ддс

ее!:

ддс

ссс

дсс

аде

336

С1у

Азр

Зег

Рго

Уа1

Азр

Зег

СБу

Рго

СБу

Рго

А1а

Зег

100

105

но

аас

ССд

асе

Сед

дСс

сса

дСд

ссс

сас

асе

дса

сСд

Ссд

ССд

ссс

384

Азп

Беи

ТГц-

Зег

Уа1

Рго

Уа1

Рго

Н15

ТБг

ТНг

А1а

Беи

Зег

Беи

Рго

115

120

125

дес

Сде

ссС

дад

Ссс

ссд

сед

сСС

дед

ддс

ссс

аСд

сСд

аСС

дад

432

А1а

Суз

Рго

СБи

С1и

Зег

Рго

Беи

Уа1

С1у

Рго

Мес

Беи

11е

СБи

130

135

140

ссс

аас

аСд

ссС

дСд

дас

сСд

дад

сСс

дСд

дса

аад

сад

аас

сса

ааС

480

РНе

Азп

Мер

Рго

Уа1

Азр

Беи

СБи

Беи

Уа1

А1а

Ьуз

61п

Азп

Рго

Азп

145

150

155

160

дЬд

аад

аСд

ддс

еде

СаС

дсс

ссс

адд

дас

Сдс

дБс

СсС

ссС

сас

528

Уа1

Буз

Мес

СБу

С1у

Агд

Туг

А1а

Рго

Агд

Азр

Суз

Уа1

Зег

Рго

Нбз

165

170

175

аад

дед

дсс

асе

аСс

аСС

сса

ССс

сдс

аас

едд

сад

дад

сас

сСс

аад

576

Буз

Уа1

А 1а

Не

Рго

РНе

Агд

Азп

Агд

С1п

С1и

Н13

Беи

Буз

180

185

190

Гас

5дд

сСа

СаС

РСд

саЬ

сса

дСс

сСд

сад

сде

сад

сСд

дас

624

Туг

Тгр

Беи

Туг

Беи

Н13

Рго

Уа1

Беи

С1п

Агд

С1п

Беи

Азр

195

200

205

СаС

ддс

асе

СаС

дсс

асе

аас

сад

дед

дда

дас

асе

аса

ССС

аас

еде

672

Туг

С1у

Не

Туг

Уа1

11е

Азп

С1п

А1а

С1у

Азр

ТНг

11е

РНе

Азп

Агд

- 35 018700

210

215

220

дсС

аад

сСс

ааП

дне

ддс

нее

саа

даа

дсс

сед

аад

дас

Са С

дас

720

А1а

Ьуз

Ьеи

Азп

Уа1

С1у

РЪе

01п

С1и

А1а

Ьеи

Ьуз

Азр

Туг

Азр

225

230

235

240

пас

асе

Сдс

ссс

дед

ссс

аде

дас

дед

дас

ССС

асе

сса

аСд

аас

дас

763

Туг

ТЬг

Суз

РКе

7а1

РЪе

Зег

Азр

7а1

Аэр

Ьеи

Не

Рго

Мес

Азп

Азр

245

250

255

сап

аас

дед

Пас

адд

где

пес

Сса

сад

сса

сдд

сае

аПС

Ссс

дне

дса

816

Н15

Азп

А1а

Туг

Агд

Суз

РЬе

Зег

С1п

Рго

Агд

Н1з

11е

Зег

Уа1

А1а

260

265

270

аСд

дас

аад

псп

дда

пес

аде

спа

сое

Пае

дпе

сад

Пас

ссс

дда

ддс

864

ЦеП

Азр

Ьуз

РНе

С1у

РЬе

Зег

Ьеи

Рго

Туг

Уа1

С1п

Туг

РЬе

31у

С1у

275

280

285

дПа

псе

дсп

сСа

аде

ааа

саа

сад

СПС

спа

асе

аПс

аас

дда

ССС

ссС

912

Уа1

Зег

А1а

Ьеи

Зег

Ьу5

С1п

РЬе

Ьеи

ТКг

11е

Азп

С1у

РЬе

Рго

290

295

300

ааП

аас

ПаП

Сдд

ддс

Сдд

дда

даа

дас

асе

ссс

аас

ада

960

Азп

Туг

Тгр

С1у

Тгр

С1у

61у

С1и

Азр

11е

РЬе

Азп

Агд

305

310

315

320

ССа

дПЬ

поп

ада

ддс

аПд

псе

аПа

СсС

сдс

сса

аас

дес

дед

дСс

ддд

1008

Ьеи

Уа1

РЬе

Агд

С1у

ЦеП

Зег

Не

Зег

Агд

Рго

Азп

А1а

νΗ

Уа1

С1у

325

330

335

адд

едо

сдс

аед

аПс

сдс

сас

Пса

ада

дас

аад

ааа

аас

даа

ссс

аас

1056

Агд

Суз

Агд

МеС

Не

Агд

Н13

Зег

Агд

Азр

Ьуз

Азп

131и

Рго

Азп

340

345

350

ССС

сад

адд

ССС

дас

еда

асе

дса

сас

аса

аад

дад

аса

аСд

СПС

СсС

1104

Рго

С1п

Агд

РЬе

Азр

Агд

11е

А1а

Н13

ТП1Г

Ьуз

С1и

ТНг

МеС

Ьеи

5ег

355

360

365

дас

ддп

п пд

аас

Пса

сПс

асе

Пас

сад

дед

сПд

даН

дСа

сад

ада

Пас

1152

Азр

С1у

Ьеи

Азп

Зег

Ьеи

ТПг

Туг

С1п

ш

Ьеи

Азр

νβΐ

С1п

Агд

Туг

370

375

380

оса

П + д

сап

асе

саа

асе

аса

дед

дас

аСс

ддд

аса

ссд

аде

Ьад

1197

рго

Ьеи

Туг

ТС1Г

С1п

Не

ТПг

Уа1

Азр

Не

С1у

Т1пг

Рго

Зег

385

390

395

<210> 10 <211> 398 <212> РВТ <213> Ното заргепз <400> 10

Мег 1

Агд

Ьеи

Агд

61и 5

Рго

Ьеи

5ег

С1у 10

Зег

А1а

МеЬ

Рго 15

С1у

А1а

Зег

Ьеи

С1П

Агд

А1а

Суз

Агд

Ьеи

νβΐ

А1а

Уа1

Суз

А1а

Ьеи

20

25

30

Н15 Ьеи С1у Уа1 ТЬг

Ьеи Уа1 Туг Туг

Ьеи А1а С1у Агд Азр Ьеи 8ег

Агд

Сеп 50

Рго

С1п

Ьеи

Уа1

С1у 55

Уа1

Зег

ТПг

Рго

Ьеи 60

61П

С1у

Зег

Азп

Зег

А1а

Не

С1у

С1п

Зег

С1у

С1и

Ьеи

Агд

ТОг

<31 у

65

70

75

80

С1у

А1а

Агд

Рго

Ьеи

С1у

А1а

Зег

С1п

Рго

Агд

Рго

85

90

95

С1у

Азр

Зег

Рго

Уа1

Азр

Зег

С1у

Рго

С1у

Рго

А1а

Зег

100

105

НО

Азп

Ьеи

ТКг

Зег

Уа1

Рго

Уа1

Рго

Н1з

ТО г

Тпг

А1а

Ьеи

Зег

Ьеи

Рго

115

120

125

А1а

Суз

Рго

<31и

С1и

Зег

Рго

Ьеи

Уа1

31у

Рго

МеЬ

Ьеи

Не

С1и

130

135

140

Р!ее

Азп

нее

Рго

Уа1

Азр

Ьеи

С1и

Ьеи

νβΐ

А1а

Ьуз

С1П

Азп

Рго

Азп

145

150

155

160

Уа1

Суз

Мег

С1у

Агд

Туг

А1а

Рго

Агд

Азр

Суз

Уа1

Зег

Рго

Н13

165

170

175

Ьуз

Уа1

А1а

11е

Не

Рго

Р1ее

Агд

Азп

Агд

С1п

С1и

Η1Ξ

Ьеи

Ьу5

180

185

190

Туг

Тгр

Ьеи

Туг

Ьеи

Н1з

Рго

Уа 1

Ьеи

61п

Агд

С1п

51п

Ьеи

Азр

195

200

205

Туг

С1у

11е

Туг

Уа1

Не

Азп

С1п

А1а

С1у

Азр

ТЪг

Не

РОе

Азп

Агд

210

215

220

А1а

Ьу£

Ьеи

Азп

Уа1

С1у

Рке

С1п

С1и

А1а

Ьеи

Ьуз

Азр

Туг

Азр

225

230

235

240

Туг

ТЬг

Суз

РАе

Уа1

РЬе

Зег

Азр

Уа1

Азр

Ьеи

Не

Рго

Мее

Азп

Азр

245

250

255

Н15

Азп

А1а

Туг

Агд

Суз

РЬе

Зег

С1п

Рго

Агд

Н13

Не

Зег

Уа1

А1а

260

265

270

МеС

Азр

Ьуз

РЪе

С1у

РЬе

Зег

Ьеи

Рго

Туг

Уа1

01п

Туг

РЬе

С1у

275

280

285

Уа1

5ег

А1а

Ьеи

Зег

Ьуз

С1п

<31п

РЬе

Ьеи

ТНг

Не

Азп

61у

Р1ее

Рго

290

295

300

- 37 018700

Азп 305

Азп Туг

Тгр

С1у

Тгр 310

С1у С1у

О1и

Азр

Азр 315

Азр

11е

РИе

Азп

Агд 320

Ьеи

Уа1

РЬе

Агд

С1у

МеС

Зег

11е

Зег

Агд

Рго

Азп

А1а

Уа1

С1у

325

330

335

Агд

Суз

Агд

МеС

Не

Агд

Н13

5ег

Агд

Азр

Луз

Ъуз

Азп

С1и

Рго

Азп

340

345

350

Рго

С1п

Агд

РРе

Азр

Агд

11е

А1а

Н1з

ТЬг

Ьуз

С1и

ТЬг

Мес

Леи

Зег

355

360

365

Азр

С1у

Леи

Азп

5ег

Теи

ТЬг

Туг

С1п

Уа1

Леи

Азр

Уа1

61п

Агд

Туг

370

37 5

380

Рго

Теи

Туг

ТНг

С1п

Не

ТЬг

7а1

Азр

11е

С1у

ТЪг

Рго

Зег

385

390

395

<210> 11 <211> 1128 <212> ДНК <213> Ното зар1еп5 <220>

<221> СОЗ <222> (1) . . (1128)

<4оо> :

и

сдс Агд

аа5 Азп

с5д Леи 10

с5д Леи

сСа Ьеи

дсс А1а

с5с Леи

5дс Суз 15

с5с Леи

48

алд МеО 1

дда С1у

С5С Леи

Ъ5д Леи

дСа Уа1 5

555 Рпе

дед Уа1

ЛЛЛ

сед

дЛа

с5д

дда

555

сед

5а5

5с5

дед

Сдд

аад

с5а

сас

55а

96

Рке

Ьеи

Уа1

Леи

С1у

РИе

Теи

Туг

Зег

А1а

Тгр

Луз

Леи

Н13

Леи

20

25

30

С5С

сад

гдд

дад

дас

Ссс

аа5

5са

д^д

д55

сСС

5СС

555

дас

5СС

144

Леи

С1п

Тгр

С1и

СТи

Азр

Зег

Азп

2ег

Уа1

Теи

Зег

Р11е

АЗр

Зег

35

40

45

дсЛ

дда

саа

аса

сСа

ддс

Сса

дад

535

дай

едд

сед

ддс

55С

обе

сЛд

192

А1а

С1у

С1п

ТЬг

Теи

С1у

Зег

С1и

Туг

Азр

Агд

Ьеи

Й1у

РЛе

Леи

50

55

60

аал

сСд

дас

ЛсЛ

ааа

с5д

ссС

дс5

даа

55а

дес

асе

аад

Лас

дса

аас

240

Азп

Теи

Азр

Зег

Ьуз

Леи

Рго

А1а

С1и

Леи

А1а

ТЪг

Туз

Туг

А1а

Азп

65

70

75

80

555

Сса

дад

дда

дес

5дс

аад

СС5

ддс

5а5

дсС

Сса

дсс

55д

а5 д

асд

288

РЬе

Зег

С1и

С1у

А1а

Суз

Туз

Рго

С1у

Туг

А1а

Зег

А1а

Леи

МеЛ

Т?1Г

85

90

95

дсс

асе

55с

ссс

едд

55с

Ссс

аад

сса

дса

ссс

аСд

55с

с5д

дал

дас

336

А1а

11е

РЕе

Рго

Агд

РЬе

Зег

Луз

Рго

А1а

Рго

МеС

Р11е

Леи

Азр

100

105

110

- 38 018700

Дсс $ег

еее РЬе

еде Агд 115

аад Ьуз

сдд Тгр

дсс А1а

ада Агд

асе Не 120

едд Агд

дад 61и

еес РЬе

дед Уа1

сед рго 125

ССЕ Рго

ССЕ РЬе

ддд 61у

384

акс

ааа

ддс

саа

дас

аас

сСд

асе

ааа

дсс

аСс

еед

Еса

дЕс

асе

ааа

4 32

11е

Ьуз

С31у

С1п

Азр

Азп

Ьеи

Не

Ьуз

А1а

11е

Ьеи

Зег

Уа1

ТЬг

Ьуз

130

135

140

дад

Еас

еде

сЕд

асе

ссС

дсс

ССд

дас

аде

сСс

сдс

Еде

сдс

Еде

480

С1и

Туг

Агд

Ьеи

ТЬг

Рго

А1а

Ьеи

Азр

Зег

Ьеи

Агд

Суз

Агд

Суз

145

150

155

160

акс

аЕс

дед

ддс

ааС

дда

ддс

дСС

есс

дсс

аас

аад

ССЕ

сЕд

ддд

Еса

528

11е

Не

Уа1

С1у

Азп

61 у

С1у

Уа1

Ьеи

А1а

Азп

Ьуз

5ег

Ьеи

С1у

Зег

165

170

175

еда

аес

дас

сас

дас

аес

дед

дСд

ада

сед

аас

сса

дса

сса

дед

576

Агд

Не

Азр

Туг

Азр

Не

Уа 1

Уа1

Агд

Ьеи

Азп

Зег

А1а

Рго

Уа1

180

185

190

ааа

ддс

ССС

дад

аад

дас

дед

ддс

аде

ааа

асд

аса

сСд

сдс

аЕс

асе

624

Ьуз

С1у

РЬе

С1и

Ьуз

Азр

Уа1

С1у

Зег

Ьуз

ТЬг

Ьеи

Агд

Не

ТЬг

195

200

205

Дас

ссс

дад

ддс

дсс

аСд

сад

едд

ссе

дад

сад

Рас

дад

сдс

даС

ЕСЕ

672

Туг

Рго

С1и

<31у

А1а

МеС

О1п

Агд

Рго

О1и

С1п

Туг

51и

Агд

Азр

Зег

210

215

220

ссс

С ίζ ь

дсс

сСс

дсс

ддс

ССс

аад

Сдд

сад

дас

еее

аад

кдд

ЕЕд

ааа

720

Ьеи

РЬе

Уа1

Ьеи

А1а

С1у

РЬе

Ьуз

Тгр

С1п

Азр

РЬе

Ьуз

Тгр

Ьеи

Ьуз

225

230

235

240

к ас

аЕс

дСс

Сас

аад

дад

ада

дед

ад!

дса

Сед

дае

ддс

ккс

сдд

ааа

768

Туг

11е

Уа1

Туг

Ьуз

С1и

Агд

νβΐ

Зег

А1а

Зег

Азр

61у

РЬе

Тгр

Ьуз

245

250

255

кек

дЕд

дсс

асе

еда

дед

ссс

аад

дад

ссс

ССЕ

дад

асе

еда

аСс

СЕС

816

Бег

Уа1

А1а

ТЬг

Агд

νβΐ

Рго

Ьуз

61и

Рго

С1и

11е

Агд

11е

Ьеи

260

265

270

аас

сса

сас

С Сс

асе

сад

дад

дсс

ССС

асе

сес

аес

ддс

сед

ссс

864

Азп

Рго

Тус

РЬе

Не

С1п

С1и

А1а

РЬе

ТЬг

Ьеи

11е

С1у

Ьеи

Рго

275

280

285

ккс

аас

ддс

ссс

аСд

ддс

едд

ддд

аас

аес

ссЕ

асе

екк

ддс

адС

912

РЬе

Азп

С1у

Ьеи

МеС

С1у

Агд

С1у

Азп

Не

Рго

ТЬг

Ьеи

С1у

Зег

290

295

300

дкд

дса

дед

асе

асд

дса

ста

сас

ддс

СдС

дас

дад

дед

дса

дЕс

дса

960

Уа1

А1а

Уа1

ТЬг

МеС

А1а

Ьеи

Н13

О1у

Суз

Азр

С1и

Уа1

А1а

Уа1

А1а

305

310

315

320

дда

1.11.

ддс

ЕаЕ

дас

аСд

аде

аса

ссс

аас

дса

ссс

сЕд

сас

Еас

ЕаЕ

1008

С1у

РЬе

С1у

Туг

Азр

МеС

Зег

ТЬг

Рго

Азп

А1а

Рго

Ьеи

Н15

Туг

325

330

335

дад

асе

дсс

еде

асд

дса

дсс

аСс

ааа

дад

Есс

Едд

асд

сас

ааЕ

аес

1056

С1и

ТЬг

Уа1

Агд

МеС

А1а

11е

Ьуз

О1и

Зег

Тгр

ТЬг

Н15

Азп

11е

340

345

350

сад

еда

дад

ааа

дад

еее

сСд

едд

аад

сСд

д!д

ааа

дсЕ

сдс

дЕс

аес

1104

С1п

Агд

С1и

Ьуз

С1и

РЬе

Ьеи

Агд

Ьуз

Ьеи

Уа1

Ьуз

А1а

Агд

Уа1

Не

ЗБ5

360

365

1128

асе ТЬг	да! Азр 370	сеа Беи	аде 5ег	адС 5ег	ддс С1у	аос 11е 375	Ода
<210> <211 > <212> <213> :	12 375 РЕТ Ното
<400>	12
мее 1	С1у	Беи	Беи	νβΐ 5	РЬе	Уа1	Агд
РЬе	Беи	Уа1	Беи 20	С1у	РЬе	Беи	Туг
Ьеи	С1п	Тгр 35	С1и	С1и	Азр	Зег	Азп 40
А1а	С1у 50	С1п	ТЫ	Беи	61у	Зег 55	С1и
Азп 65	Беи	Азр	Зег	Буз	Беи 70	Рго	А1а
РЬе	Зег	С1и	С1у	А1а 85	Суз	Буз	Рго
А1а	Не	РЬе	Рго 100	Агд	РЬе	Зег	Буз
Зег	РЬе	Агд 115	Буз	Тгр	А1а	Агд	11е 120
11е	Буз 130	01у	С1п	Азр	Азп	Беи 135	11е
61и 145	Туг	Агд	Беи	ТЬг	Рго 150	А1а	Беи
11е	Не	Уа1	С1у	Азп 165	С1у	С1 у	Уа1
Агд	11е	Азр	Азр 100	Туг	Азр	Не	Уа1
Буз	С1у	РЬе 195	С1и	Бу$	Азр	Уа1	С1у 200

АЗП	Беи 10	Беи	Беи	А1а	Беи	Суз 15	Беи
Туг 25	Зег	А1а	Тгр	Буз	Беи 30	Н13	Беи
Зег	Уа1	Уа1	Беи	Зег 45	РЬе	Азр	Зег
Туг	Азр	Агд	Беи 60	С1у	РЬе	Беи	Беи
61и	Беи	А1а 75	ТЬг	Буз	Туг	А1а	Азп 80
С1у	Туг 90	А1а	Зег	А1а	Беи	Мер 95	ТЫ
Рго 105	А1а	Рго	Ме1	РЬе	Беи 110	Азр	Азр
Агд	(3111	РЬе	Уа1	Рго 125	Рго	РЬе	С1у
Буз	А1а	11е	Беи 140	Зег	Уа1	ТЬг	Буз
Азр	Зег	Беи 155	Агд	Суз	Агд	Агд	Суз 160
Беи	А1а 170	Азп	Буз	Зег	Беи	С1у 175	Зег
Уа1 185	Агд	Беи	Азп	Зег	А1а 190	Рго	Уа1
Зег	Буз	ТЫ	ТЬг	Беи 205	Агд	11е	ТЬг

- 40 018700

Туг

Рго 210

С1и

С1у

А1а

Мес

С1п 215

Агд

Рго

СЬи

С1п

Туг 220

СЬи

Агд

Азр

Зег

Ьеи

РЬе

Уа1

Ьеи

А1а

С1у

РЬе

Ьуз

Тгр

С1п

Азр

РЬе

Ьуз

Тгр

Ьеи

Ьуз

225

230

235

240

Туг

Не

Уа1

Туг

Ьуз

С1и

Агд

Уа1

Зег

АЬа

Зег

Азр

С1у

РЬе

Тгр

Ьуз

245

250

255

Зег

Уа1

А1а

ТЬг

Агд

Уа1

Рго

Ьуз

С1и

Рго

СЬи

Не

Агд

Не

Ьеи

260

265

270

Азп

Рго

Туг

РЬе

11е

С1п

С1и

А1а

РЬе

ТЬг

Ьеи

11е

С1у

Ьеи

Рго

275

280

285

РЬе

Азп

АЗП

С1у

Ьеи

МеС

С1у

Агд

С1у

Азп

Не

Рго

ТЫ

Ьеи

СЬу

Зег

290

295

300

Уа1

А1а

Уа1

ТЬг

МеЕ

АЬа

Ьеи

Н13

С1у

Суз

Азр

СЬи

УаЬ

А1а

УаЬ

АЬа

305

310

315

320

С1у

РЬе

С1у

Туг

Азр

МеС

Зег

ТЬг

Рго

Азп

АЬа

Рго

Ьеи

Н18

Туг

325

330

335

С1и

ТЬг

Уа1

Агд

МеС

А1а

Не

Ьуз

СЬи

Зег

Тгр

ТЬг

Н13

Азп

Не

340

345

350

С1п

Агд

С1и

Ьуз

С1и

РЬе

Ьеи

Агд

Ьуз

Ьеи

УаЬ

Ьуз

А1а

Агд

УаЬ

Не

355

360

365

ТЬг

Азр

Ьеи

Зег

С1у

Не

370

375

<210>

13

<211>

1722

<212> ДНК

<213> 1

Ното

зар1епз

<220>

<221> СОЗ

<222> (1).

.(1722)

<400> 13

ССа дСС дад

дас

асе

аса

ССа

дад

сса

даа

дад

сса

асе

ааа

Сас

Ьеи УаЬ СЬи

Азр

ТЬг

1Ъг

Ьеи

С1и

Рго

СЬи

Рго

ТЬг

Ьуз

Туг

1

5

10

15

саа аСс СсС

саа

сса

даа

дСд

1ас

дСд

до С

дса

сса

999

дад

Сед

сСа

СЬп Не Зег

С1п

Рго

С1и

УаЬ

Туг

УаЬ

АЬа

Рго

С1у

СЬи

Зег

Ьеи

20

25

30

- 41 018700

дад С1и

дед 7а1

еде Агд 35

еде Суз

сед Ьеи

РРд Ьеи

ааа Ьуз

дар Азр 40

дсс А1а

дед Уа1

аРс Не

аде Зег 45

рдд Тгр

асе ТПг

аад Ьуз

144

даб

ддд

дрд

сас

еед

ддд

ссс

аас

азе

адд

аса

дед

сее

арр

ддд

дад

192

Азр

С1у

Н15

Ьеи

С1у

Рго

Азп

Агд

ТПг

Уа1

Ьеи

Не

С1у

С1и

50

55

60

Рас

ььд

сад

аса

аад

ддс

дсс

асд

сер

ада

дас

Рсс

ддс

сРс

Рас

дсе

240

Туг

Ьеи

С1п

11е

Ьуз

С1у

А1а

ТНг

Рго

Агд

Азр

Зег

61у

Ьеи

Туг

А1а

65

70

75

80

рдр

асС

дес

аде

адд

асЬ

дРа

дас

адР

даа

асР

едд

еас

РРс

аСд

дрд

288

Суз

ТЬг

А1а

Зег

Агд

ТЬг

7а1

Азр

Зег

С1и

ТНг

Тгр

Туг

РЬе

Мер

Уа1

85

90

95

ааР

дес

аса

дае

дсс

аРс

Рса

Рсс

дда

даР

дад

дае

дас

асе

дае

336

Азп

Уа1

ТЬг

Азр

А1а

Не

Зег

С1у

Азр

С1и

Азр

Т1аг

Азр

100

105

НО

ддС

дед

даа

даЬ

еее

дРс

адР

дад

азе

адР

аас

аад

ада

дса

сса

384

С1у

А1а

С1и

Азр

РЬе

7а1

Зег

С1и

Азп

Зег

Азп

Ьуз

Агд

А1а

Рго

115

120

125

Рас

едд

асе

аас

аса

даа

зад

аРд

даа

аад

едд

сес

саб

дсР

дед

сер

432

Туг

Тгр

ТЬг

Азп

Тке

С1и

Ьуз

МеР

С1и

Ьуз

Агд

Ьеи

Н13

А1а

7а1

Рсо

130

135

140

дед

дес

аас

асе

дес

аад

РРР

сдс

Сдс

сса

дсс

ддд

аас

сса

ард

480

А1а

Азп

ТЬе

7а1

Ьу5

РЬе

Агд

Суз

Рго

А1а

С1у

Азп

Рго

Мер

145

150

155

160

сса

асе

ард

едд

дрд

ааа

аас

ддд

аад

дад

еее

аад

сад

дад

саР

528

Рго

ТКг

Мер

Агд

Тгр

Ьеи

Ьуэ

Азп

С1у

Ьуз

С1и

РЬе

Ьуз

31п

С1и

Н13

165

170

175

еде

Эре

дда

ддс

еас

зад

дра

ода

аас

сад

сас

едд

аде

СРс

асе

аед

57 6

Агд

11е

С1у

Туг

Ьуз

Уа1

Агд

Азп

С1п

Н13

Тгр

Зег

Ьеи

Не

Мес

180

185

190

даа

аде

дрд

дес

сса

РСР

дае

аад

дда

ааР

РаР

асе

еде

дрд

дад

624

С1и

Зег

Уа1

Рго

5ег

Азр

Ьуз

С1у

Азп

Туг

ТЬг

Суз

Уа1

С1и

195

200

205

ааР

даа

Рас

ддд

есс

аРс

ааР

сас

асд

Рас

сас

сед

даб

дРР

дрд

дад

672

Азп

С1и

Туг

£1у

Зег

Не

АЗП

Н13

ТЬг

Туг

ΗΣ3

Ьеи

Азр

Уа1

61и

210

215

220

еда

Сед

сер

сас

едд

ссс

аре

СРС

саа

дсс

дда

сед

дса

ааР

дсс

720

Агд

Зег

РГО

Н1е

Агд

РГО

Не

Ьеи

С1п

А1а

С1у

Ьеи

Рго

А1а

Азп

А1а

225

230

235

240

Ьсс

аса

дрд

дРс

дда

дае

дРа

дад

РЬР

дРс

еде

аад

дРР

Рас

адР

768

Зег

ТЫ

Уа1

С1у

Азр

7а1

С1и

РГ1е

Уа1

Суз

Ьуз

νάΐ

Туг

Зег

245

250

255

даб

дес

сад

сес

сас

аРс

сад

едд

аРс

аад

сас

дед

даа

аад

аас

ддс

816

Азр

А1а

С1п

Рго

Н1£

11е

С1п

Тгр

11е

Ьуз

Η1Ξ

Уа1

01 и

Ьуз

Азп

С1у

260

265

270

аде

ааа

еас

ддд

ссс

дас

ддд

сРд

ссс

Рас

сРс

аад

дее

СРс

аад

дсс

864

Зег

Ьуз

Туг

31у

Рго

Азр

С1у

Ьеи

Рго

Туг

Ьеи

Ьуз

Уа1

Ьеи

Ьуз

А1а

275

280

285

- 42 018700

дсс А1а

ддЬ 61у 290

дЕЕ Уа1

аас Азп

асе ТЬг

асд ТЬг

дас Азр 295

ааа Ьуз

дад С1и

аЕЕ 11е

дад С1и

дЕЕ Уа1 300

сЕс Ьеи

ЕаЕ Туг

аЕ Е 11е

едд Агд

912

ааЕ

дПа

асе

гее

дад

дас

дсЕ

ддд

даа

ЕаЕ

асд

Еде

СЕд

дед

ддЕ

ааЕ

960

Азп

Уа1

ТЬг

РНе

С1и

Азр

А1а

<31у

С1и

Туг

ТЬг

Суз

Ьеи

А1а

С1у

Азп

305

310

315

320

есе

аЬЬ

ддд

ага

Ссс

еее

сас

ЕСЕ

дса

Едд

ЕЕд

аса

дЕЕ

сЕд

сса

дед

1008

Зег

Не

С1у

Не

Зег

РЬе

Н1з

Зег

А1а

Тгр

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

Рго

А1а

325

330

335

ссЕ

дда

ада

даа

аад

дад

аЕЕ

аса

дсЕ

ЕСС

сса

дас

ааа

асЕ

сас

аса

1056

Рго

С1у

Агд

С1и

Ьуз

С1и

Не

ТЬг

А1а

Зег

Рго

Азр

Ьуз

ТЬг

Н13

ТЬг

340

345

350

где

сса

ссд

еде

сса

дса

ссЕ

даа

сЕс

сЕд

ддд

дда

ссд

Еса

дЕс

ЕЕс

1104

Суз

Рго

Суэ

Рго

А1а

Рго

61и

Ьеи

С1у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

355

360

365

сЕс

ЕЕС

ссс

сса

ааа

ссс

аад

дас

асе

СЕС

аЕд

аЕс

Есс

едд

асе

ссЕ

1152

Ьеи

РЬе

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

МеЕ

11е

Зег

Агд

ТЬг

РЕО

370

375

380

дад

дЕс

аса

еде

дед

дЕд

дсс

дЕд

аде

сас

даа

дас

ССЕ

дад

дЕс

1200

С1и

Уа1

ТЬг

Суз

Уа 1

Уа1

А1а

Уа1

Зег

Н13

С1и

Азр

Рго

С1и

Уа1

385

390

395

400

аад

ПЕС

аас

Едд

еас

дЕд

дас

ддс

дЕд

дад

дЕд

саЕ

ааЕ

дсс

аад

аса

1248

Ьуз

РЬе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

С1у

Уа1

С1и

Уа1

Н13

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

405

410

415

аад

сед

едд

дад

сад

Еас

аас

аде

асд

Еас

сдЕ

дЕд

дЕс

аде

дЕс

1296

Ьуз

Рго

Агд

С1и

С1п

Туг

Азп

Зег

ТЬг

Туг

Агд

Уа1

Зег

Уа1

420

425

430

сЕс

асе

дЕс

сЕд

сас

сад

дас

Едд

сед

ааЕ

ддс

аад

дад

Еас

аад

Еде

1344

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

01п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

С1у

Ьуз

С1и

Туг

Ьуз

Суз

435

440

445

аад

дЕс

Псе

аас

ааа

дсс

сЕс

сса

дсс

ссс

аЕс

дад

ааа

асе

аЕс

ЕСС

1392

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Ьуа

А1а

Ьеи

Рго

А1а

Рго

11е

01и

Ьуз

ТЬг

Не

Зег

450

455

460

ааа

дсс

ааа

ддд

сад

ссс

еда

даа

сса

сад

дед

Еас

асе

сЕд

ссс

сса

1440

Ьуз

А1а

Ьуз

С1у

О1п

Рго

Агд

С1и

Рго

С1п

νβΐ

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

465

470

475

480

Есс

едд

даЕ

дад

сед

асе

аад

аас

сад

дЕс

аде

сЕд

асе

Еде

сЕд

дЕс

1488

Зег

Агд

Азр

С1и

Ьеи

ТЬг

Ьуз

Азп

61п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

7а1

485

490

495

ааа

ддс

ЕЕС

ЕаЕ

ССС

аде

дас

аЕс

дсс

дЕд

дад

Едд

дад

аде

ааЕ

ддд

1536

Ьуз

С1у

РЬе

Туе

Рго

5ег

Азр

11е

А1а

Уа1

61и

Тгр

61и

Зег

Азп

С1у

500

505

510

сад

ссд

дад

аас

еас

аад

асе

асд

ССЕ

ссс

дЕд

сЕд

дас

ЕСС

дас

1584

С1п

Рго

С1и

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

515

520

525

ддс

Осс

еес

ЕЕс

сес

еас

аде

аад

сес

асе

дЕд

дас

аад

аде

адд

Едд

1632

С1у

Зег

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

530

535

540

- 43 018700

сад

999

аас

дСс

ЬЬс

ьса

Ьдс

Ссс

дьд

аЬд

саЬ

дад

дес

сЬд

сас

С1п

б1п

С1у

Азп

νβΐ

РЬе

Зег

Суз

Зег

7а1

МеЬ

Н13

(31и

А1а

Ьеи

Н13

545

550

555

560

аас

сас

Рас

асд

сад

аад

аде

сЬс

Ьсс

сСд

ЬсЬ

ссд

ддЬ

Ьда

Азп

Н13

Туг

Ткг

С1п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

С1у

565

570

<210>

14

<211>

573

<212>

РКТ

<213>

Ното

зартепз

<400>

14

Ьеи

Уа1

С1и

Азр

ТИг

Τΐιί

Ьеи

С1и

Рго

С1и

Рго

Ткг

Ьуз

Туг

1

5

10

15

С1п

Не

Зег

С1п

Рго

Й1и

Уа1

Туг

νβΐ

А1а

Рго

61у

С1и

Зег

Ьеи

20

25

30

С1и

Уа1

Агд

Суз

Ьеи

Ьуз

Азр

А1а

Уа1

11е

Зег

Тгр

ТЬг

Ьуз

35

40

45

Азр

С1у

Уа1

Н1з

Ьеи

С1у

Рго

Азп

Агд

Т11Г

Уа1

Ьеи

11е

С1у

□ 1и

50

55

60

Туг

Ьеи

21п

Не

Ьуз

01у

А1а

ТЬг

Рго

Агд

Азр

Зег

61у

Ьеи

Туг

А1а

65

70

75

80

Суз

Т11Г

А1а

Зег

Агд

ТЬг

Уа1

Азр

Зег

С1и

ТЬг

Тгр

Туг

РНе

МеЬ

Уа1

85

90

95

Азп

Уа1

Т1аг

Азр

А1а

11е

Зег

С1у

Азр

С1и

Азр

ТЬг

Азр

100

105

110

С1у

А1а

01 и

Азр

РРе

Уа1

Зег

С1и

Азп

Зег

Азп

Ьуз

Агд

А1а

Рго

115

120

125

Туг

Тгр

ТЬг

Азп

ТЬг

С1и

Ьуз

МеЬ

С1и

Ьуз

Агд

Ьеи

Н13

А1а

Уа1

Рго

130

135

140

А1а

Азп

ТЫ

ν₃ι

Ьуз

ЕЪе

Агд

Суз

Рго

А1а

С1у

Азп

Рго

МеЬ

145

150

155

160

Рго

Т1пг

Ме5

Агд

Тгр

Ьеи

Ьуз

Азп

С1у

Ьуз

С1и

РЬе

Ьуз

С1п

С1и

Н15

165

170

175

Агд

Не

С1у

Туг

Ьуз

Уа1

Агд

Азп

С1п

Н1в

Тгр

Зег

Ьеи

Не

Неб

180

185

190

- 44 018700

С1и

Зег

Уа1 195

Уа1

Рго

Зег

Азр

Ьуз 200

С1у

Азп

Туг

ТНг

Суз 205

Уа1

С1и

Азп

С1и

Туг

С1у

Зег

11е

Азп

Н13

ТНг

Туг

Н13

Ьеи

Азр

νβΐ

Уа1

61и

210

215

220

Агд

Зег

Рго

Н13

Агд

Рго

11е

Ьеи

С1п

А1а

С1у

Ьеи

Рго

А1а

Азп

А1а

225

230

235

240

Зег

ТНг

Уа1

С1у

Азр

Уа1

С1и

РНе

Уа1

Суз

Ьуз

Уа1

Туг

Зег

245

250

255

Азр

А1а

С1п

Рго

Н13

11е

С1п

Тор

Не

Ьуз

Н13

Уа1

С1и

Ьуз

Азп

61у

260

265

270

Зег

Ьуз

Туг

С1у

Рго

Азр

С1у

Ьеи

Рго

Туг

Ьеи

Ьуз

Уа1

Ьеи

Ьуз

А1а

275

280

285

А1а

С1у

νβΐ

Азп

ТНг

Азр

Ьуз

С1и

Не

С1и

Уа1

Ьеи

Туг

Не

Агд

290

295

300

Азп

Уа1

ТНг

РНе

С1и

Азр

А1а

С1у

61и

Туг

ТНг

Суз

Ьеи

А1а

С1у

Азп

305

310

315

320

Зег

Не

31у

11е

Зег

РНе

Н15

Зег

А1а

Тгр

Ьеи

ТНг

Уа1

Ьеи

Рго

А1а

325

330

335

Рго

С1у

Агд

С1и

Ьуз

С1и

Не

ТНг

А1а

Зег

Рго

Азр

Ьуз

ТНг

Н13

ТНг

340

345

350

Суз

Рго

рго

Суз

Рго

А1а

Рго

С1и

Ьеи

С1у

Рго

Зег

Уа1

РНе

355

360

365

Ьеи

РНе

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТНг

Ьеи

МеЕ

Не

Зег

Агд

ТНг

Рго

370

375

380

С1и

Уа1

ТНг

Суз

Уа1

А1а

7а1

Зег

Н15

С1и

Азр

Рго

С1и

Уа1

385

390

395

400

Ьуз

РНе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

С1у

Уа1

С1и

Уа1

Н13

Азп

А1а

Ьуз

ТНг

405

410

415

Ьуз

Рго

Агд

С1и

С1п

Туг

Азп

Зег

ТНг

Туг

Агд

Уа1

Зег

Уа1

420

425

430

Ьеи

ТНг

Уа1

Ьеи

Н1з

αΐη

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

61у

Ьуз

С1и

Туг

Ьуз

Суз

435

440

445

- 45 018700

Ьуз

450

Зег

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи 455

Рго

А1а

Рго

11е

С1и 460

Ьуз

ТНг

Не

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

Шу

С1п

Рго

Агд

С1и

Рго

Шп

Уа1

Туг

ТО Г

Ьеи

Рго

465

470

475

480

Зег

Агд

Азр

Ши

Ьеи

ТНс

Ьуз

Азп

Шп

7а1

Зег

Ьеи

ТЦг

Суз

Ьеи

485

490

495

Ьуз

Шу

РНе

Тус

Рго

Зег

Азр

Не

А1а

УаЬ

Ши

Тгр

Ши

Зег

Азп

С ]_у

500

505

510

Шп

Рго

С1и

Азп

Тус

Ьуз

ТЬг

Т11Г

Рго

Ьеи

Азр

Зег

Азр

515

52 0

525

С1у

Зег

Р1>е

РЦе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

Τ1ΊΓ

νβΐ

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

530

535

540

С1п

С1у

Азп

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеЬ

Η1Ξ

Ши

А1а

Ьеи

Н13

54 5

550

555

560

Азп

Н1з

Туг

ТЬг

С1п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

Шу

565

570

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims

1. Модифицированная слитая конструкция растворимого фрагмента или домена рецептора ЕСЕ с Ес-областью иммуноглобулина (1д), где среднее количество сиаловой кислоты на Ν-гликан компонента рецептора ЕСЕ составляет 0,9 или выше, обладающая активностью в отношении АЭСС и/или СЭС, в которой занят, по меньшей мере, 5-й участок Ν-гликозилирования компонента рецептора ЕСЕ.

2. Модифицированная слитая конструкция по п.1, в которой среднее количество сиаловой кислоты на Ν-гликан компонента рецептора ЕСЕ составляет 1,2 или выше.

3. Модифицированная слитая конструкция по п.1 или 2, в которой не более чем 45% Ν-гликанов указанного компонента рецептора ЕСЕ не имеют сиалильной группы.

4. Модифицированная слитая конструкция по п.3, в которой, кроме того, заняты 3-, 4-, 6- и 7-й участки Ν-гликозилирования компонента рецептора ЕСЕ.

5. Модифицированная слитая конструкция по п.4, в которой занято по меньшей мере 7 участков Νгликозилирования компонента рецептора ЕСЕ.

6. Модифицированная слитая конструкция по п.5, в которой заняты все участки Νгликозилирования компонента рецептора ЕСЕ.

7. Модифицированная слитая конструкция по любому из предшествующих пунктов, в которой Νгликаны фукозилированы на 60-100%.

8. Модифицированная слитая конструкция по любому из предшествующих пунктов, которая содержит 3 остатка маннозы, в среднем от 1,5 до 3 остатков галактозы, в среднем от 3,5 до 5 остатков Νацетилглюкозамина и в среднем от 0,6 до 1 остатка фукозы на молекулу гликана.

9. Модифицированная слитая конструкция по любому из пп.1-6, в которой Ν-гликаны фукозилированы на величину до 60%.

10. Модифицированная слитая конструкция по любому из предшествующих пунктов, в которой рецептор ЕСЕ выбран из рецептора 1 ЕСЕ (ЕСЕК1) или рецептора 2 ЕСЕ (ЕСЕК2).

11. Модифицированная слитая конструкция по п.10, у которой величина К_с, измеренная посредством В1асоге™ для ЕСЕ2, находится между 1 и 5 нМ.

12. Модифицированная слитая конструкция по п.11, у которой величина К_с, измеренная посредством В1асоге™ для ЕСЕ2, составляет приблизительно 1,5 нМ.

13. Модифицированная слитая конструкция по п.10, в которой рецептор ЕСЕ выбран из рецептора 1 ЕСЕ изотипа 111с и рецептора 2 ЕСЕ изотипа 111с.

14. Модифицированная слитая конструкция по любому из предшествующих пунктов, в которой растворимый домен рецептора ЕСЕ имеет последовательность ЗЕО Ш №. 4 или последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична ЗЕО Ш №. 4.

15. Модифицированная слитая конструкция по любому из предшествующих пунктов, в которой Есобласть имеет последовательность ЗЕО Ш №. 6 или последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична 8ЕО Ш №. 6.

- 46 018700

16. Модифицированная слитая конструкция по любому из предшествующих пунктов, которая дополнительно содержит линкерную последовательность по меньшей мере из 3 аминокислотных остатков.

17. Модифицированная слитая конструкция по п.16, в которой линкерная последовательность представляет собой 8АЬ (8ег-А1а-Ьеи).

18. Модифицированная слитая конструкция по любому из предшествующих пунктов, которая имеет полипептидную последовательность 8ЕЦ Ш №о. 2 или последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична 8ЕЦ Ш №о. 2.

19. Модифицированная слитая конструкция по любому из предшествующих пунктов, которая дополнительно содержит сигнальный пептид 8ЕЦ Ш №о. 8.

20. Полинуклеотид, кодирующий модифицированную слитую конструкцию по любому из предшествующих пунктов.

21. Полинуклеотид по п.20, содержащий нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична нуклеотидной последовательности 8ЕЦ Ш №о. 1.

22. Вектор, содержащий полинуклеотид по п.20 или 21.

23. Клетка, содержащая вектор по п.22.

24. Применение модифицированной слитой конструкции по любому из пп.1-19 в качестве лекарственного средства для лечения рака.

25. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая модифицированную слитую конструкцию по любому из пп.1-19.

26. Фармацевтическая композиция по п.25, содержащая дополнительное терапевтическое средство.

27. Фармацевтическая композиция по п.26, в которой указанное дополнительное терапевтическое средство представляет собой антиангиогенное средство или химиотерапевтическое средство.

28. Фармацевтическая композиция по п.27, в которой указанное антиангиогенное средство представляет собой фактор некроза опухолей или антагонист кислого или основного фактора роста фибробластов (ЕСЕ), фактора роста гепатоцитов (НСЕ), тканевого фактора (ТЕ), белка С, белка 8, фактора роста тромбоцитов (РЭСЕ) или рецептора НЕВ2.

29. Фармацевтическая композиция по п.27, в которой указанное химиотерапевтическое средство выбрано из группы, включающей антимикротрубочковые средства; координационные комплексы платины; алкилирующие средства; антибиотические средства; ингибиторы топоизомеразы II; антиметаболиты; ингибиторы топоизомеразы I; гормоны и аналоги гормонов; ингибиторы ангиогенеза, связанного с нерецепторной тирозинкиназой; иммунотерапевтические средства; проапоптотические средства и ингибиторы передачи сигнала в клеточном цикле.

30. Фармацевтическая композиция по п.27, в которой указанное химиотерапевтическое средство выбрано из группы таксола и таксотера.

31. Применение модифицированной слитой конструкции по любому из пп.1-19 для получения лекарственного средства для лечения рака.

32. Применение по п.31, где указанное лекарственное средство может быть представлено в форме единой композиции или в форме комбинации различных лекарственных средств или композиций, где указанная композиция или лекарственное средство содержит дополнительное терапевтическое средство.

33. Применение по п.32, где указанное дополнительное терапевтическое средство представляет собой антиангиогенное средство или химиотерапевтическое средство.

34. Применение по п.33, где указанное антиангиогенное средство представляет собой фактор некроза опухолей или антагонист кислого или основного фактора роста фибробластов (ЕСЕ), фактора роста гепатоцитов (НСЕ), тканевого фактора (ТЕ), белка С, белка 8, фактора роста тромбоцитов (РЭСЕ) или рецептора НЕК2.

35. Применение по п.33, где указанное химиотерапевтическое средство выбрано из группы, включающей антимикротрубочковые средства; координационные комплексы платины; алкилирующие средства; антибиотические средства; ингибиторы топоизомеразы II; антиметаболиты; ингибиторы топоизомеразы I; гормоны и аналоги гормонов; ингибиторы ангиогенеза, связанного с нерецепторной тирозинкиназой; иммунотерапевтические средства; проапоптотические средства и ингибиторы передачи сигнала в клеточном цикле.

36. Применение по п.33, где указанное химиотерапевтическое средство выбрано из группы таксола и таксотера.

37. Применение по п.33, где указанный рак выбран из группы, содержащей карциномы, включая карциному мочевого пузыря, молочной железы, толстой кишки, головы и шеи, почки, в том числе почечно-клеточную карциному, печени, легкого, яичника, поджелудочной железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы и кожи, в том числе плоскоклеточную карциному; гематопоэтические опухоли лимфоидного происхождения, включая лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, В-клеточную лимфому, Т-клеточную лимфому, лимфому Беркитта; гематопоэтические опухоли миелоидного происхождения, включая острый и хронический миелогенные лейкозы и промиелоцитарный лейкоз; опухоли центральной и периферической нервной системы, включая астроцитому, нейробластому, глиому и шванномы; опухоли мезенхимального происхождения, включая фибросаркому, рабдомиосар

- 47 018700 кому и остеосаркому; и другие опухоли, включая меланому, пигментную ксеродерму, кератоакантому, семиному, фолликулярный рак щитовидной железы и тератокарциному.

38. Применение по п.37, где указанный рак выбран из группы, включающей меланому, лейкоз, рак почки, рак толстой кишки, рак яичника, рак предстательной железы, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак молочной железы и рак головы и шеи.