CN112126671B - 无乳链球菌Streptococus agalactiae治疗子宫内膜异位症的应用 - Google Patents

无乳链球菌Streptococus agalactiae治疗子宫内膜异位症的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，通过测序鉴定出链球菌属的无乳链球菌在子宫内膜异位症患者宫颈口定值异常增多。通过临床样本和构建子宫内膜异位症小鼠模型，研究发现无乳链球菌调控Ang‑2促进血管生成，进而加强了异位组织在腹腔的定值和侵袭能力。而加入替考拉宁抑制无乳链球菌后，子宫内膜异位症小鼠模型腹腔中异位症病灶的数量和大小受到明显抑制，从而确认了一个治疗子宫内膜异位症的新途径，为子宫内膜异位症的治疗提供新策略。

Description

无乳链球菌Streptococus agalactiae治疗子宫内膜异位症 的应用
技术领域
本发明涉及妇科技术领域，更具体的，涉及无乳链球菌Streptococus agalactiae治疗子宫内膜异位症的应用。
背景技术
子宫内膜异位症是活性子宫内膜细胞种植于宫腔外而导致的一种常见妇科疾病，具有病变广泛、组织形态多样、侵袭性和复发性等特点。该疾病影响约10％到15％的育龄妇女，而在***不育妇女中比例更是高达50％，且近几年发病率逐年上升，对女性健康造成巨大危害。其典型的临床症状是慢性盆腔疼痛、充血性痛经、月经大量出血、深度***困难和疲劳，由于缺乏有效治疗方式子宫内膜异位症患者遭受着巨大痛苦。目前的治疗手段以手术治疗和药物治疗为主，辅以中药治疗和辅助生殖技术，所取得的治疗效果有限，术后具有很高复发率。
关于子宫内膜异位症成因，目前被广泛接受的是桑普森理论，即子宫内膜异位症是由月经血逆行将***内脱落的子宫内膜组织带到宫腔外并植入引起的。此过程中，脱落逆行的子宫内膜经黏附、侵袭和血管生成等过程，得以种植、生长和形成子宫内膜异位症病灶。研究表明子宫内膜样上皮细胞在进入盆腔内并定植在其他组织后，异位子宫内膜组织迅速建立自己的血液供应，这是其成功定植和长期存活的先决条件。血管生成因子调控的新生血管生成被认为是子宫内膜异位症发生进展的一个关键因素。在众多调控血管生成的生长因子中，Ang-2的表达是血管新生起始的强化因素，与新生血管形成及加强关系密切。
除经血逆流、激素、免疫遗传和表观遗传等导致子宫内膜异位症的发生和发展的致病因素外，子宫内膜异位症患者生殖道微生物在促进子宫内膜异位症过程中扮演着重要的角色。更有研究发现宫内微生物的定植和先天免疫***的级联反应密切相关，共同促进了子宫内膜异位症的形成。有研究表明女性生殖道微生物在子宫内膜异位症的发生和发展过程中发挥了重要的作用，但其具体分子机制仍不清楚。因此，毫无疑问阐明女性生殖道微生物在子宫内膜异位症过程中的生物行为及分子机制，为临床治疗提供一种新的解决方法是迫切需要的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术缺乏子宫内膜异位症的有效诊断或/和治疗手段，首先提供了用于诊断子宫内膜异位症的方法。
本发明的第二个目的是提供一种用于治疗子宫内膜异位症的药物。
本发明的第三个目的是提供无乳链球菌Streptococus agalactiae在制备子宫内膜异位症的诊断试剂中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种用于诊断子宫内膜异位症的药物，所述药物包含无乳链球菌Streptococusagalactiae。
本发明首先通过子宫内膜异位症患者宫颈口分泌物16SrRNA测序，生物信息学分析结果发现，无乳链球菌丰度异常增加，且在患者宫颈口异常定植。因此，宫颈口无乳链球菌Streptococus agalactiae成为了子宫内膜异位症的分子标记，可以通过检测患者宫颈口内无乳链球菌Streptococus agalactiae的数量，确定是否患有子宫内膜异位症的可能。
其次，本发明还通过QPCR和ELISA实验发现，子宫内膜异位症患者宫颈口无乳链球菌定植丰度与血清中Ang-2表达水平呈明显正相关，两者联合能够显著提高诊断内异症的准确性。
因此，本发明所述的诊断子宫内膜异位症的方法，还包括用于检测血清Ang-2表达水平的物质。
本发明还通过构建子宫内膜异位症小鼠模型发现，抑制无乳链球菌显著降低子宫内膜异位症异位病灶的数量和大小，其中红色异位病灶变化尤为明显。
因此，本发明还提供一种用于治疗子宫内膜异位症的药物，所述药物包含用于抗宫颈口无乳链球菌Streptococus agalactiae的物质。优选的，所述药物为替考拉宁。
以往研究证实，新生血管的形成是子宫内膜在异位能够成功定植的必要条件。本发明首先研究发现了，宫颈口异位定植的无乳链球菌促进子宫内膜异位症的形成，在这个发现的基础上，进一步探索无乳链球菌与子宫内膜异位症的关系，由此得出新发现，宫颈口无乳链球菌的丰度与血清中Ang-2表达水平呈明显正相关，以往研究表明，Ang-2在介导新生血管的形成中发挥重要的作用。之后，通过加入替考拉宁抑制无乳链球菌研究发现，明显降低了子宫内膜异位症的数量和大小。因此，本发明强调子宫内膜异位症的形成受宫颈口无乳链球菌的影响，无乳链球菌通透上调Ang-2介导新生血管的形成，促进子宫内膜异位症的发生发展，而通过抑制无乳链球菌能达到抑制子宫内膜异位症发生发展的效果。
因此，优选的，本发明上述用于治疗子宫内膜异位症的药物还包括用于降低血清中Ang-2表达水平的物质。
本发明还提供无乳链球菌Streptococus agalactiae在制备子宫内膜异位症的诊断试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过测序鉴定出链球菌属的无乳链球菌在子宫内膜异位症患者宫颈口定值异常增多。通过临床样本和构建子宫内膜异位症小鼠模型，研究发现无乳链球菌调控Ang-2促进血管生成，进而加强了异位组织在腹腔的定值和侵袭能力。而加入替考拉宁抑制无乳链球菌后，子宫内膜异位症小鼠模型腹腔中异位症病灶的数量和大小受到明显抑制，从而确认了一个治疗子宫内膜异位症的新途径，为子宫内膜异位症的治疗提供新策略。
附图说明
图1为子宫内膜异位症患者宫颈口分泌物的生物信息学分析图，其中，EMS为子宫内膜异位症患者样品；
图2为标准溶液制备稀释示意图；
图3为Alpha多样性分析图，其中，Chaol反应菌群丰富度，Shannon代表多样性指数(菌群丰富度和均衡度的量化指标，对丰富性更敏感，值越大，样本多样性越大)，pielou_e代表菌群均匀度的衡量标准，值越高，菌群的均匀度越大(优势种越少)，Simpson代表多样性指数(菌群丰富度的定性测量。范围在0-1之间，值越大，样本多样性越大)；
图4为Alpha和Beta分析图，其中图4A为宫颈口微生物菌属多样性显著性分析；图4B为PLS-DA分析(左图，有监督分类，用于预测样本或样本分组的实际差异)和PCoA分析(右图，主要坐标分析，用于确定样本之间的变化)；
图5为差异富集菌属分析图；其中图5A为LEfSe分析图，图5B为***发育树图，图5C为无乳链球菌丰度散点图；
图6为子宫内膜异位症患者血清中Ang-2的表达情况，其中图6A为子宫内膜不同时期Ang-2的表达曲线，图6B为Ang-2的表达水平统计图；
图7为子宫内膜异位症患者相关菌属和血清中Ang-2的表达的关系，图7A为与子宫内膜异位症密切相关菌属与Ang-2的相关性分析，图7B为ROC分析，图7C为PICRUSt功能预测分析图；
图8为无乳链球菌对子宫内膜异位症的发生发展的影响实验；其中，左下侧纸上为小鼠腹腔子宫内膜异位病灶；
图9为无乳链球菌对子宫内膜异位症的红色病灶和白色病灶的影响。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
试验中所有受试者均签署知情同意书，患者一般资料差异无统计学意义。
实施例1子宫内膜异位症患者宫颈口微生物多样性分析
一、收集10例子宫内膜异位症患者宫颈口分泌物及10例体检正常人群的宫颈分泌物，通过16SrRNA测序结合生物信息学，经过OUT特征分析、***发育树构建，Alpha、Beta多样性分析，PCoA、NNMDS分析，PLS-DA，LEfSe分析及PICRUSt功能预测分析，结果如图1、3和4所示。从图1、图3和图4A到图5C中可以看出，相较于正常对照组，子宫内膜异位症患者宫颈口微生物多样性更加丰富；从图4B可以看出，相较于正常对照组，子宫内膜异位症患者宫颈口微生物多样性更加相似。上述说明，子宫内膜异位症患者宫颈口微生物多样性增加，且具有相似的微生物特征。
二、子宫内膜异位症患者宫颈口无乳链球菌定植情况分析
通过LDA分析及进化分支图展示，子宫内膜异位症差异富集的微生物菌属，从图5中可以看出，链球菌属在子宫内膜异位症患者宫颈口丰度增加，其中无乳链球菌变化最为明显。
三、子宫内膜异位症患者血清Ang-2表达情况分析
1、ELISA实验过程[R&D公司，Human Angiopoietin-2Immunoassay(CatalogNumber DANG20)]：
1.1、样品收集和储存，将所有试剂置于室温
(1)前期处理临床血清样本，分装储存于-80℃。
(2)实验前用冰盒，将样品放于冰上融化。
1.2、配制试剂
Wash buffer洗涤液：如果浓缩物中形成晶体，则温热至室温并轻轻混合直至晶体完全溶解。将20mL洗涤缓冲液浓缩液加入去离子水或蒸馏水中，以制备500mL洗涤缓冲液。480ml蒸馏水+20ml浓缩洗涤液＝500ml wash buffer。
底物溶液：颜色试剂A和B应在使用后15分钟内以相同的体积混合在一起。避光。每孔需要200μL所得混合物。
1.3、配制梯度标准品
(1)稀释Human Angiopoietin-2Standard(人类血管生成素2标准品)-请参见样品瓶标签。
用去离子水配制人血管生成素2标准品。制备30,000pg/mL的储备溶液，并在稀释前轻轻搅拌至少15分钟。
(2)使用聚丙烯管，用标准液稀释剂RD5-5倍比稀释30,000pg/mL的储备溶液形成浓度为：3000pg/mL、1500pg/mL、750pg/mL、375pg/mL、187.5pg/mL、93.7pg/mL、1500pg/mL、46.9pg/mL、0pg/mL等一系列不同浓度的标准液。
1.4、首先向每个孔中添加100μL分析稀释剂RD1-76
1.5、每孔添加50μL步骤1.3(2)中稀释好的标准液及血清样品。在室温下摇床上以(最大速度)500rpm±50rpm孵育2小时。
1.6、吸出每个孔并洗涤，重复该过程三次，总共洗涤四次。用洗涤缓冲液(400μL)填充每个孔进行清洗。在每个步骤中完全去除液体有利于充分洗涤。最后一次洗涤后，通过抽吸或倾析除去任何剩余的洗涤缓冲液。翻转平板并用干净的纸巾擦干。
1.7、向每个孔中添加200μL人血管生成素2偶联物，盖上新的胶带，在摇床上室温孵育2小时。
1.8、如步骤1.6中那样重复抽吸/清洗。
1.9、每孔加入200μL底物溶液，在室温下在台面上孵育30分钟，避光。
1.10、每孔加入50μL终止液，孔中的颜色应从蓝色变为黄色；如果孔中的颜色为绿色或颜色变化不均匀，请轻轻敲打板以确保彻底混合。
1.11、使用设置为450nm的酶标仪，在30分钟内确定每个孔的光密度；如果可以进行波长校正，则设置为540nm或570nm；如果没有波长校正，则从读数处减去540nm或570nm处的读数450纳米；该减法将校正板中的光学缺陷。在没有校正的情况下直接在450nm处进行的读数可能更高且更不准确。
1.12、结果的计算
平均每个标准品，对照品和样品的重复读数，并减去平均零标准光密度(OD)。
通过倍比稀释的标准液的浓度和对应的OD值，算出标准曲线，再根据标准曲线和待测样品的OD值，进而算出待测样品的浓度。
通过ELISA实验发现，与正常对照组相比，子宫内膜异位症患者血清Ang-2表达水平增加，其中在分泌期增加尤为明显(图6所示)。
四、子宫内膜异位症患者宫颈口无乳链球菌与血清Ang-2浓度的相关性分析
实验包括以下过程：
(1)提取前期子宫内膜异位症患者宫颈口分泌物测序结果中无乳链球菌的丰度值；
(2)筛选出前期测序患者对应的血样标本，按前述ELISA实验步骤检测Ang-2表达水平；
(3)SPSS进行相关统计学分析。
通过相关性分析发现，子宫内膜异位症患者宫颈口无乳链球菌丰度与血清Ang-2表达呈明显正相关，两者联合能够显著提高诊断内异症的准确性(图7A/B所示)；PICRUSt功能预测展示，宫颈口异常定植菌属主要涉及代谢相关通路。
五、无乳链球菌对子宫内膜异位症的影响研究
子宫内膜异位症小鼠模型构建：将C57BL/65雌性小鼠***分泌物连续涂片，筛选有完整发情周期小鼠作为供体鼠和受体鼠。供体小鼠注射***，使供体鼠都处于发情期。一周后处死，取子宫内膜剪碎至约1mm3，注射到受体小鼠腹腔，经***肌肉注射第7天和第14天解剖小鼠；取可疑病灶HE染色结果示，异位病灶一周后形成率100％，其典型HE图如图8所示，具体实验步骤如下：
实验步骤：
(一)筛选具有发情周期的小鼠
连续进行5天小鼠***细胞涂片，HE染色观察小鼠的发情周期变化，筛选具有相对正常的发情周期的小鼠；
HE染色步骤如下：
(1)小鼠***细胞常规涂片稍干后，95％乙醇固定10-15min；
(2)脱蜡：二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10min；
(3)水化：100％、90％、80％、70％乙醇各5min；
(4)自来水浸洗5min/3次；
(5)苏木素染色5min；
(6)5％乙酸分化；
(7)PBS返蓝3min；
(8)伊红染色1min；
(9)脱水：70％、80％、90％、100％乙醇各10s，二甲苯1min；
(10)中性树胶封片。
(二)建模
(1)称量小鼠体重，计算注射***的用量；(分子量：272.382；密度：1.17g/cm3；1cm3＝1ml；1mg＝1000ug＝1*106ng)
(2)建模前三天开始连续每天皮下注射注射98％***，100ng，使小鼠均统一处于统一发情周期-发情期；
(3)建模前进行小鼠***涂片，观察小鼠是否处于发情期，选择发情期小鼠作为供体鼠；
(4)取处于发情期的15只小鼠进行解剖，小心分离出子宫，剥离子宫内膜，放入装有PBS/生理盐水的6cm dish中，清洗掉血迹，裁剪成1mm*1mm的小块；
(5)用16号针头，吸取1ml经腹腔注射打入小鼠腹腔内；
(6)建模后第二天进行受体鼠皮下注射***，0.1mg/kg—1/d-1，每隔3天注射一次，以促进子宫内膜的生长；
(7)分别于21天解剖小鼠；
(8)CO2法处死小鼠，解剖，观察是否有病灶及小鼠子宫内膜(进行对比)；
(9)取可疑病灶，拍照后放入4％甲醛/多聚甲醛中固定。
(10)HE染色，显微镜下观察是否可疑部位是否具有子宫内膜的镜下形态，及其是否于小鼠正常子宫内膜周期一致。
(三)菌液和抗生素处理
(1)将从ATCC购买的无乳链球菌株(ATCC号：13813)和从人类生殖道上分离的无乳链球菌株，接种血琼脂平板，37℃，5％CO2培养24h后观察，长出无乳链球菌特有的乳白色单菌落，且有β溶血环。
(2)挑取上述单菌落，用脑心浸液肉汤(BHI)培养基摇菌扩大培养，24h后取扩增好的菌液为原液，将原液按照10倍稀释，依次稀释为1×101倍，1×102倍、1×103倍、1×104倍，1×105倍，1×106倍，1×107倍，1×108倍，取每一个稀释浓度涂板。37℃，5％CO2培养24h后，拍照，数菌落。按照菌落数计算原菌液的细菌数。
(3)在造模三天后，将ATCC标准菌株和无乳链球菌临床菌株按照每只老鼠1×105个/只/周进行腹腔注射。
(4)菌液注射第三天可进行抗生素处理，按照8mg/kg的量进行肌肉注射，前三天每天早晚注射两次，后改为每天注射一次，注射持续到最后处死。
从图8中可以看出，与对照组(Control)相比，无乳链球菌标准菌株(ATCC)和临床患者分离的临床无乳链球菌菌株明显增加了子宫内膜异位症异位病灶的数量和大小；替考拉宁抑制无乳链球菌明显减少了子宫内膜异位症异位病灶的数量和大小。上述结果说明，无乳链球菌能够促进子宫内膜异位症的发生发展，而通过替考拉宁抑制无乳链球菌能够减少子宫内膜异位症异位病灶的数量和大小，从而达到治疗子宫内膜异位症的效果。
六、无乳链球菌对红色异位病灶的数量和大小的影响
实验过程：
(1)通过前述实验步骤进行5天小鼠***细胞涂片观察小鼠的发情周期变化，初步判断30只小鼠均具有相对正常的发情周期；
(2)建模
2.1、称量小鼠体重，计算注射***的用量；(分子量：272.382；密度：1.17g/cm3；1cm3＝1ml；1mg＝1000ug＝1*106ng)；
2.2、建模前三天开始连续每天皮下注射注射98％***，100ng，使15只小鼠均统一处于统一发情周期-发情期；
2.3、建模前进行小鼠***涂片，观察小鼠是否处于发情期，选择发情期小鼠作为供体鼠；
2.4、取处于发情期的15只小鼠进行解剖，小心分离出子宫，剥离子宫内膜，放入装有PBS/生理盐水的6cm dish中，清洗掉血迹，裁剪成约1mm*1mm*1mm的小块；
2.5、用16号针头，吸取1ml经腹腔注射打入小鼠腹腔内；
2.6、建模后第二天进行受体鼠皮下注射***，0.1mg/kg—1/d-1，每隔3天注射一次，以促进子宫内膜的生长；
2.7、分别于14天，21天解剖一只小鼠；
2.8、CO2法处死小鼠，解剖，观察是否有病灶及小鼠子宫内膜(进行对比)；
2.9、取可疑病灶，放入4％甲醛/多聚甲醛中固定。
2.10、HE染色，显微镜下观察是否可疑部位是否具有子宫内膜的镜下形态，及其是否于小鼠正常子宫内膜周期一致。
从图9中可以看出，与对照组相比，无乳链球菌促进红色异位病灶的变化更为明显；而替考拉宁明显抑制红色异位病灶的数量和大小。红色异位病灶与血管生成明显相关，因此，综合上述结果提示，宫颈口无乳链球菌促进子宫内膜异位症的发生发展，通过无乳链球菌联合Ang-2有很大潜力预测子宫内膜异位症，靶向宫颈口无乳链球菌为治疗子宫内膜异位症提供了新策略。
本领域技术人员应该理解的是，本发明的使用不受限于上述特定应用。就本文描述或描绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。

Claims (2)

1.用于抗宫颈口无乳链球菌( Streptococus agalactiae) 的物质在制备治疗子宫内膜异位症的药物方面的应用，所述用于治疗子宫内膜异位症的药物还包括用于降低血清中Ang-2表达水平的物质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述用于抗宫颈口无乳链球菌(Streptococus agalactiae) 的物质为替考拉宁。
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