EA010434B1 - Способ получения цитотоксических лимфоцитов - Google Patents
Способ получения цитотоксических лимфоцитов Download PDFInfo
- Publication number
- EA010434B1 EA010434B1 EA200401242A EA200401242A EA010434B1 EA 010434 B1 EA010434 B1 EA 010434B1 EA 200401242 A EA200401242 A EA 200401242A EA 200401242 A EA200401242 A EA 200401242A EA 010434 B1 EA010434 B1 EA 010434B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- fibronectin
- fragment
- cells
- induction
- cytotoxic
- Prior art date
Links
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 title claims abstract description 261
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 214
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 208
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 title claims abstract description 157
- 230000008569 process Effects 0.000 title abstract description 24
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims abstract description 273
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 claims abstract description 273
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 258
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 184
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 51
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 claims abstract description 37
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 451
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 91
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 76
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 75
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 73
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 49
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 48
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 48
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 28
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 25
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 19
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 claims description 18
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 claims description 18
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 16
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 16
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 claims description 14
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 13
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 13
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 13
- 230000010556 Heparin Binding Activity Effects 0.000 claims description 12
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 claims description 12
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 8
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 7
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 4
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 4
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 3
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 11
- 230000010339 dilation Effects 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 93
- 239000002957 persistent organic pollutant Substances 0.000 description 70
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 55
- 239000000306 component Substances 0.000 description 42
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 36
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 34
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 33
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 33
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 33
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 32
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 32
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 29
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 29
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 26
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 21
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 21
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 19
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 19
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 17
- 230000006870 function Effects 0.000 description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 15
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 14
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 14
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 14
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 12
- 101150114515 CTBS gene Proteins 0.000 description 11
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 11
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 11
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 10
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 9
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 8
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 8
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 8
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 7
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 7
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 7
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 6
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 6
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 6
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 5
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 4
- 210000003810 lymphokine-activated killer cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N calcein am Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(=O)C)C(OC(C)=O)=C1 BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 3
- -1 for example Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 238000002047 photoemission electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101100291853 Caenorhabditis briggsae uba-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100167365 Caenorhabditis elegans cha-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100291854 Caenorhabditis elegans moc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 101000957815 Culex pipiens Alpha-glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102100032817 Integrin alpha-5 Human genes 0.000 description 1
- 108010041014 Integrin alpha5 Proteins 0.000 description 1
- 108010042918 Integrin alpha5beta1 Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108700041567 MDR Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 229920001284 acidic polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000004805 acidic polysaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012645 endogenous antigen Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000003677 hemocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940000351 hemocyte Drugs 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 108700010900 influenza virus proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 238000001050 pharmacotherapy Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 210000004986 primary T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012744 reinforcing agent Substances 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
- C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4613—Natural-killer cells [NK or NK-T]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/464838—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/58—Adhesion molecules, e.g. ICAM, VCAM, CD18 (ligand), CD11 (ligand), CD49 (ligand)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Virology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к способу получения цитотоксических лимофоцитов, характеризующемуся тем, что способ включает в себя стадию осуществления по крайней мере одного из процессов - индукции, поддержания и экспансии цитотоксических лимфоцитов в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к способу получения цитотоксических лимфоцитов, используемых в области медицины.
Предшествующий уровень техники
Живой организм защищается от чужеродных веществ главным образом посредством иммунной реакции, и иммунная система образована различными клетками и продуцируемыми ими растворимыми факторами. Среди них ключевую роль играют лейкоциты, особенно лимфоциты. Лимфоциты классифицируют на два больших класса, В-лимфоциты (которые здесь могут называться В-клетками) и Тлимфоциты (которые здесь могут называться Т-клетками), и те, и другие специфически распознают антиген и воздействуют на этот антиген, защищая живой организм.
Т-клетки подразделяют на Т-хелперы, имеющие маркер СЭ4 (кластер дифференцировки) (здесь называемые Тх), главным образом принимающие участие в образовании антител и индукции различных иммунных ответов, и цитотоксические Т-клетки, имеющие маркер СЭ8 (Тс: цитотоксические Тлимфоциты, также называемые Т-киллерами, которые здесь могут называться СТЬ), главным образом проявляют цитотоксическую активность. СТЬ, которые играют наиболее важную роль в распознавании, разрушении и выведении опухолевых клеток, клеток, инфицированных вирусом, или т. п., не продуцируют антитела, специфически взаимодействующие с антигеном, как в случае В-клеток, а напрямую распознают и воздействуют на антигены (антигенный пептид) клеток-мишеней, которые связаны с молекулами главного комплекса гистосовместимости [МНС, который также может называться лейкоцитарным антигеном человека (НЬА) у людей] класса I, находящимися на поверхности мембраны клетки-мишени. В то же время рецептор Т-клеток (здесь называемый ТСК), находящийся на поверхности мембраны СТЬ, специфически распознает вышеупомянутые антигенные пептиды и молекулы МНС класса I и определяет, является ли данный антигенный пептид собственным или чужеродным. Клетка-мишень, определяемая как чужеродная, затем специфически разрушается и элиминируется под действием СТЬ.
В последние годы было пересмотрено отношение к терапии, такой как фармакотерапия и радиотерапия, которая может оказывать серьезное негативное влияние на пациента, и возрос интерес к иммунотерапии как к терапии, не оказывающей агрессивное воздействие на пациента. В частности, была отмечена эффективность адоптивной иммунотерапии, при которой СТЬ, способные специфически взаимодействовать с представляющим интерес антигеном, индуцируются ίη νίΐτο из лимфоцитов, полученных у человека с нормальной иммунной функцией, или лимфоцитов, количество которых повышено без индукции, и затем перенесенных пациенту. Например, предполагают, что на модели животных адоптивная иммунотерапия является эффективным способом лечения вирусной инфекции и рака [описано СгеепЬегд, Ρ. Ό., Абсапсех ίη 1шшипо1о§у, опубликовано в 1992; Кеиззет Р., е1 а1., Β1οο6, 78(5), 1373-1380 (1991)]. При таком лечении важно поддерживать или увеличить количество клеток в состоянии, при котором поддерживается или усиливается антигенспецифическая цитотоксическая активность СТЬ.
При адоптивной иммунотерапии, как описано выше, для получения терапевтического эффекта необходимо вводить цитотоксические лимфоциты в установленном количестве или выше. Иными словами, можно сказать, что основной проблемой является получение вышеуказанного количества клеток ίη νίΐτο за короткий период времени.
Для поддержания и усиления антигенспецифической цитотоксической активности СТЬ, для индукции специфической реакции СТЬ на антиген в основном использовали способ повторяющейся стимуляции представляющим интерес антигеном. Однако обычно в этом способе число полученных в конечном счете СТЬ может быть снижено, и поэтому не может быть получено достаточное количество клеток.
В качестве способа получения Т-клеток, эффективного для лечения заболевания, известна, например, адоптивная иммунотерапия, в которой используются опухоль-инфильтрирующие лимфоциты (Т1Ь), индуцированные высокими концентрациями 1Ь-2 [Ν. Епд1. 1. Меб., 316, 1310-1321 (1986); Κο^ι^Γβ 8. А. е1 а1, Ν. Еп§1. 1. Меб., 319(25), 1676-1680 (1988); Ηο М. е1 а1., Β1οο6, 81(8), 2093-2101 (1993)].
Затем был описан способ получения антигенспецифических СТЬ, в котором выделяли и нращивали СМУ-специфический клон СТЬ, используя собственные СМУ-инфицированные фибробласты и 1Ь-2 [К1ббе11 8. А. еΐ а1., 1. Iттиηο1., 146(8), 2795-2804 (1991)] или используя анти-СЭ3-моноклональное антитело (анти-СЭ3-тАЬ) и 1Ь-2 [К1ббе11 8. А. еΐ а1., 1. Iттиηο1. Мебюбз, 128(2), 189-201 (1990)].
Кроме того, в XVО 96/06929 описан способ КЕМ (способ быстрой экспансии). Этот способ КЕМ представляет собой способ разложения популяции первичных Т-клеток, содержащих антигенспецифические СТЬ и Тх за короткий период времени. Иными словами, этот способ характеризуется тем, что большое количество Т-клеток может быть получено путем пролиферации индивидуальных Т-клеточных клонов и что количество антигенспецифических СТЬ повышается при использовании анти-СП3-антител, 1Ь2 и РВМС (мононуклеары периферической крови), различных по своей способности к пролиферации под действием излучения, и клеток, инфицированных вирусом Эпштейна-Барр (здесь упоминаемом как ЕВУ).
Более того, в νθ 97/32970 описан модифицированный способ КЕМ, который представляет собой способ, в котором в качестве питающих клеток используют штамм недифференцированных клеток млекопитающего, экспрессирующих стимулирующий Т-клетки компонент, который отличается от РВМС
- 1 010434 тем, что снижает количество используемых РВМС.
Лимфокин-активированные клетки-киллеры (ЬАК-клетка) представляют собой функциональную клеточную популяцию, обладающую цитотоксической активностью, которую получают, добавляя 1Ь-2 к периферической крови (лейкоцитам периферической крови), крови из пуповины, тканевой жидкости или т.п., содержащей лимфоциты, и культивируя ίη νίίτο клетки в течение нескольких дней. Во время культивирования пролиферацию ЬАК-клетки дополнительно усиливают добавлением анти-СЭ3-антител и культивированием клеток. Таким образом, полученные ЬАК-клетки обладают неспецифической цитотоксической активностью в отношении различных раковых клеток и других мишеней. ЬАК-клетки также используют в адоптивной иммунотерапии, также, как и вышеуказанные СТЬ.
Как описано выше, использование 1Ь-2 необходим на стадии получения цитотоксических лимфоцитов, например, СТЬ, ЬАК-клеток, Т1Ь или т.п. Эти клетки в дальнейшем активируют путем присоединения 1Ь-2 к рецепторам интерлейкина 2 (1Ь-2В) на клеточной поверхности. Кроме того, известно, что 1Ь2В является маркером активации лимфоцитов. С этих точек зрения, важно усилить экспрессию 1Ь-2В на клеточной поверхности. Кроме того, при индукции СТЬ важно улучшить эффективность индукции клеток-предшественниц СТЬ, подвергнутых стимуляции антигеном в виде СТЬ, то есть увеличить долю (соотношение) СЭ8-положительных клеток в группе клеток после индукции.
Фибронектин представляет собой гигантский гликопротеин с молекулярной массой 250 тысяч, который находится в крови животных, на поверхности культивируемых клеток или во внеклеточном матриксе ткани, и известно, что он обладает различными функциями. Его доменная структура делится на семь частей (далее ссылка на фигуру), где в его аминокислотной последовательности находится три типа сходных последовательностей, и повторы каждой из этих последовательностей составляют полную последовательность. Три вида сходных последовательностей называют тип I, тип II и тип III. Среди них, тип III состоит из 71-96 аминокислотных остатков, где степень совпадения этих аминокислотных остатков составляет от 17 до 40%. В фибронектике имеется четырнадцать последовательностей типа III, среди которых 8-я, 9-я или 10-я последовательность (каждая здесь называется Ш-8, Ш-9 или Ш-10) содержится в клеточном связывающем домене, а 12-я, 13-я или 14-я последовательности (каждая здесь называется Ш-12, Ш-13 или Ш-14) содержатся в гепарин-связывающем домене. Кроме того, УЬА (антиген с поздней активацией)-5-связывающая область содержится в Ш-10, и его коровой последовательностью является ΒΟΌ8. Кроме того, на С-концевой стороне гепаринсвязывающего домена находится область, называемая ШС8. Область, называемая С8-1, состоящая из 25 аминокислот и обладающая связывающей активностью с УЬА-4, находится в ШС8 (Эеапе Р. Мотег, Фибронектин, ДСЛЭЕМИ'.’ РРЕ88 ГИС., 1-8 (1988); Кпшхика Р. е! а1., I. Вюейет. 110, 284-291 (1991); НапепЬетд Н. е! а1., Нитап Оепе Тйетару 8, 2193-2206 (1997)).
Подробное описание изобретения
Целью настоящего изобретения является способ получения цитотоксических лимфоцитов, обладающих высокоэффективной цитотоксической активностью, который соответствующим образом используется в области медицины.
Конкретно, настоящее изобретение относится:
[1] к способу получения цитотоксического лимфоцита, характеризующемуся тем, что данный способ включает в себя стадию осуществления по меньшей мере одного из процессов - индукции, поддержания и экспансии цитотоксических лимфоцитов - в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси;
[2] к способу в соответствии с вышеизложенным [1], где цитотоксические лимфоциты высокоэффективно экспрессируют рецепторы интерлейкина-2, по сравнению с цитотоксическими лимфоцитами, полученными путем осуществления по меньшей мере одного из процессов - индукции, поддержания и экспансии - в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси;
[3] к способу в соответствии с вышеуказанным [1], где в указанных цитотоксических лимфоцитах в большей степени присутствуют СЭ8-позитивные клетки, чем в цитотоксических лимфоцитах, полученных путем осуществления по меньшей мере одного из процессов - индукции, поддержания и экспансии в отсутствие фибронектина, его фрагмента или его смеси;
[4] к способу в соответствии с любым из вышеуказанных [1]-[3], где указанные цитотоксические лимфоциты высокоэффективно поддерживают цитотоксическую активность по сравнению с цитотоксическими лимфоцитами, полученными путем осуществления по меньшей мере одного из процессов - индукции, поддержания и экспансии - в отсутствие фибронектина, его фрагмента или его смеси;
[5] к способу в соответствии с любым из вышеуказанных [1]-[4], где фибронектин, его фрагмент или их смесь иммобилизованы на твердой фазе;
[6] к способу в соответствии с вышеизложенным [5], где твердая фаза представляет собой приспособление для клеточной культуры или носитель для клеточной культуры;
[7] к способу в соответствии с вышеизложенным [6], где приспособлением для клеточной культуры является чашка Петри, кювета или мешок, а носитель для клеточной культуры представляет собой бусы, мембрану или предметное стекло;
[8] к способу в соответствии с любым из вышеуказанных [1]-[4], где по меньшей мере один из про
- 2 010434 цессов - индукции, поддержания и экспансии цитотоксических лимфоцитов осуществляют в среде, содержащей фибронектин, его фрагмент или их смесь;
[9] к способу в соответствии с любым из вышеуказанных [1]-[8], где фрагмент фибронектина представляет собой полипептид, содержащий по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, представленных последовательностями 8ЕО Ш N0: 1-7 из списка последовательностей, или полипептид с заменой, делецией, вставкой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности вышеуказанного полипептида, где такой полипептид обладает функциями, эквивалентными функциям полипептида, указанного выше;
[10] к способу в соответствии с вышеуказанным [9], где фрагмент фибронектина обладает активностью клеточной адгезии и/или гепарин-связывающей активностью;
[11] к способу в соответствии с вышеуказанным [9], где фрагмент фибронектина представляет собой полипептид, выбранный из полипептидов, содержащих любую из аминокислотных последовательностей, показанных в 8Е0 Ш N0: 8-19 из списка последовательностей;
[12] к способу в соответствии с вышеуказанным [1], включающему в себя осуществление по меньшей мере одного из процессов - индукции, поддержания и экспансии цитотоксических лимфоцитов - в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси в приспособлении для клеточной культуры, содержащем среду, где данный способ удовлетворяет любому из следующих условий:
(a) отношение числа клеток вначале культивирования к площади культуры в приспособлении для клеточной культуры составляет от 1 до 5х105 клеток/см2; и (b) концентрация клеток в среде в начале культивирования составляет от 1 до 5х 105 клеток/мл;
[13] к способу в соответствии с вышеуказанным [12], где в указанном способе исключена стадия разбавления или стадия замены приспособления для клеточной культуры;
[14] к цитотоксическим лимфоцитам, полученным способом в соответствии с любым из вышеуказанных [1]-[13];
[15] к лекарственному средству, содержащему в качестве действующего компонента цитотоксические лимфоциты, полученные способом в соответствии с любым из вышеуказанных [1]-[13];
[16] к агенту, усиливающему экспрессию рецепторов интерлейкина-2 в клетке, характеризующемуся тем, что указанный агент содержит в качестве действующего компонента фибрснектин, его фрагмент или их смесь;
[17] к агенту в соответствии с вышеуказанным [16], где фрагмент фибронектина представляет собой полипептид, содержащий по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, представленных последовательностями 8Е0 Ш N0: 1-7 из списка последовательностей, или полипептид с заменой, делецией, вставкой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотой последовательности указанного выше полипептида, где данный полипептид обладает функциями, эквивалентными функциям полипептида, указанного выше;
[18] к агенту в соответствии с вышеуказанным [17], где фрагмент фибронектина обладает активностью клеточной адгезии и/или гепарин-связывающей активностью;
[19] к агенту в соответствии с вышеизложенным [17], где фрагмент фибронектина представляет собой полипептид, выбранный из полипептидов, содержащих любую из аминокислотных последовательностей, показанных в 8Е0 Ш N0: 8-19 из списка последовательностей;
[20] к агенту для повышения уровня (доли) СБ8-положительных клеток в лимфоцитах, характеризующемуся тем, что данный агент содержит в качестве действующего компонента фибронектин, его фрагмент или их смесь;
[21] к агенту в соответствии с вышеизложенным [20], где фрагмент фибронектина представляет собой полипептид, содержащий по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, представленных последовательностями 8Е0 Ш N0: 1-7 из списка последовательностей или полипептид с заменой, делецией, вставкой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности указанного выше полипептида, где данный полипептид обладает функциями, эквивалентными функциям полипептида, указанного выше;
[22] к агенту в соответствии с вышеизложенным [21], где фрагмент фибронектина обладает активностью клеточной адгезии и/или гепарин-связывающей активностью;
[23] к агенту в соответствии с вышеизложенным [21], где фрагмент фибронектина представляет собой полипептид, выбранный из полипептидов, содержащих любую из аминокислотных последовательностей, показанных в 8Е0 Ш N0: 8-19 из списка последовательностей;
[24] к агенту для повышения или поддержания цитотоксической активности цитотоксических лимфоцитов, характеризующемуся тем, что данный агент содержит в качестве действующего компонента фибронектин, его фрагмент или их смесь;
[25] агенту в соответствии с вышеизложенным [24], где фрагмент фибронектина представляет собой полипептид, содержащий по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, представленных последовательностями 8Е0 Ш N0: 1-7 из списка последовательностей, или полипептид с заменой, делецией, вставкой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной
- 3 010434 последовательности указанного выше полипептида, где данный полипептид обладает функциями, эквивалентными функциям полипептида, указанного выше;
[26] к агенту в соответствии с вышеизложенным [25], где фрагмент фибронектина обладает активностью клеточной адгезии и/или гепарин-связывающей активностью;
[27] к агенту в соответствии с вышеизложенным [25], где фрагмент фибронектина представляет собой полипептид, выбранный из полипептидов, содержащих любую из аминокислотных последовательностей, показанных в 8ЕР ΙΌ N0: 8-19 из списка последовательностей;
[28] к способу повышения экспрессии рецепторов интерлейкина-2 в цитотоксических лимфоцитах, характеризующемуся тем, что данный способ включает в себя стадию осуществления по меньшей мере одного из [процессов] - индукции, поддержания и экспансии цитотоксических лимфоцитов - в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси;
[29] к способу повышения уровня (доли) СП8-положительных клеток в цитотоксических лимфоцитах, характеризующемуся тем, что данный способ включает в себя стадию осуществления по меньшей мере одного из [процессов] - индукции, поддержания и экспансии цитотоксических лимфоцитов - в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси;
[30] к способу повышения или поддержания цитотоксической активности цитотоксических лимфоцитов, характеризующемуся тем, что данный способ включает в себя стадию осуществления по меньшей мере одного из [процессов] - индукции, поддержания и экспансии цитотоксических лимфоцитов - в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси;
[31] к способу в соответствии с любым из вышеуказанных [1]-[13], дополнительно включающему в себя стадию трансдукции чужеродного гена в цитотоксический лимфоцит; и [32] к способу в соответствии с вышеуказанным [31], где указанный чужеродный ген трансдуцируют, используя ретровирус, аденовирус, адено-ассоциированный вирус или вирус обезьян.
На чертеже схематически представлена доменная структура фибронектина.
Наилучший способ осуществления данного изобретения
Настоящее изобретение было осуществлено на основании полученных данных о том, что в цитотоксических лимфоцитах, полученных в присутствии фибронектина и/или его фрагмента, поддерживается высокая цитотоксическая активность, значительно повышается уровень экспрессии 1Ь-2К и доля 0Ό8положительных клеток.
В этой связи, здесь получение цитотоксических лимфоцитов относится к стадии, выключающей в себя стадию, включающую в себя каждую стадию индукции (активации), поддержания и экспансии клеток, или их объединенные стадии. Получение цитотоксических лимфоцитов согласно изобретению также относится к культивированию цитотоксических лимфоцитов.
Настоящее изобретение будет конкретно описано ниже.
(1) Фибронектин и его фрагмент, используемые в настоящем изобретении.
Фибронектин и его фрагмент, указанные здесь, могут быть получены из природного источника или могут быть искусственно синтезированы. Фибронектин и его фрагмент могут быть получены, по существу, в чистом виде из материала природного происхождения, на основании описания КиоПайй Е. е! а1. [1. Бю1. СНет., 256(14), 7277-7281 (1981)]. Выражение «по существу, чистый фибронектин или фрагмент фибронектина», как указано здесь, означает, что этот фибронектин и фрагмент фибронектина, по существу, не содержат других белков и т.п., присутствующих вместе с фибронектином в природе. И вышеуказанный фибронектин, и его фрагмент могут быть использованы в настоящем изобретении сами по себе или в разных типах смесей.
Полезная информация, относящаяся к фрагментам фибронектина, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, и способами получения этих фрагментов может быть получена из публикаций КттИика Е., е! а1. [1. Вюсйет., 110, 284-291 (1991)], КогпЬгПш А. В. е! а1. [ЕМВО 1., 4(7), 17551759 (1985)], 8екщисЫ К., е! а1. [ВюсйетйФу, 25(17), 4936-4941 (1986)], и др.
В настоящем изобретении примером фрагмента фибронектина служит, например, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мер, с любой областью из областей ΙΙΙ-8 (аминокислотная последовательность, показанная в 8 Ер ΙΌ N0: 1 в списке последовательностей), ΙΙΙ-9 (аминокислотная последовательность, показанная в 8ЕР ΙΌ N0: 2 в списке последовательностей), ΙΙΙ-10 (аминокислотная последовательность, показанная в 8ЕР ΙΌ N0: 3 в списке последовательностей), ΙΙΙ-12 (аминокислотная последовательность, показанная в 8ЕР ΙΌ N0: 4 в списке последовательностей), ΙΙΙ-13 (аминокислотная последовательность, показанная в 8ЕР ΙΌ N0: 5 в списке последовательностей), ΙΙΙ-14 (аминокислотная последовательность, показанная в 8ЕР ΙΌ N0: 6 в списке последовательностей) и С8-1 (аминокислотная последовательность, показанная в 8ЕР ΙΌ N0: 7 в списке последовательностей) (см фигуру).
Кроме того, предпочтительно, чтобы в качестве фрагмента был использован фрагмент, обладающий активностью клеточной адгезии и/или гепаринсвязывающей активностью. Активность клеточной адгезии может быть оценена путем анализа связывания фрагмента (его связывающего клетку домена), используемого согласно изобретению, с клеткой, с использованием известного способа. Например, способ, указанный выше, включает в себя способ ^ййатк Ό. А., е! а1. |На1иге, 352, 438-441 (1991)]. Данный способ
- 4 010434 представляет собой способ определения связывания клетки с фрагментом, иммобилизованном на культуральной чашке. Кроме того, гепаринсвязывающая активность может быть оценена путем анализа связывания фрагмента (его гепаринсвязывающего домена), используемого согласно изобретению, с гепарином, с использованием известного способа. Например, связывание данного фрагмента с гепарином можно оценить тем же способом, используя гепарин, например, меченый гепарин, вместо клетки в вышеупомянутом способе ^1Шаш5 Ό. А. с1 а1.
Кроме того, примером фрагмента фибронектина служит полипептид, выбранный из
С-274 (аминокислотная последовательность, показанная в 8ЕС ΙΌ N0: 8 в списке последовательностей),
Н-271 (аминокислотная последовательность, показанная в 8ЕС ΙΌ N0: 9 в списке последовательностей),
Н-296 (аминокислотная последовательность, показанная в 8ЕС ΙΌ N0: 10 в списке последовательностей),
СН-271 (аминокислотная последовательность, показанная в 8ЕС ΙΌ N0: 11 в списке последовательностей),
СН-296 (аминокислотная последовательность, показанная в 8ЕС ΙΌ N0: 12 в списке последовательностей) или
С-С81 (аминокислотная последовательность, показанная в 8ЕС ΙΌ N0: 13 в списке последовательностей).
Каждый из вышеупомянутых фрагментов СН-271, СН-296, С-274 и С-С81 представляет собой полипептид с доменом клеточного связывания со связывающей активностью в отношении УЬА-5. Также СС81, Н-296 или СН-296 представляет собой полипептид с доменом клеточного связывания со связывающей активностью в отношении УЬА-4. Кроме того, Н-271, Н-296, СН-271 или СН-296 представляет собой полипептид с гепаринсвязывающим доменом.
В настоящем изобретении также может быть использован фрагмент, в котором каждый из приведенных выше доменов модифицирован. Гепаринсвязывающий домен фибронектина состоит из трех последовательностей типа ΙΙΙ (ΙΙΙ-12, ΙΙΙ-13 и ΙΙΙ-14). Согласно изобретению также может быть использован фрагмент, содержащий гепарин-связывающий домен с делецией одной или двух последовательностей типа ΙΙΙ. Например, примерами данных фрагментов могут служить СНУ-8 9 (аминокислотная последовательность, показанная в 8ЕС ΙΌ N0: 14 из списка последовательностей), СНУ-90 (аминокислотная последовательность, показанная в 8ЕС ΙΌ N0: 15 из списка последовательностей) или СНУ-92 (аминокислотная последовательность, показанная в 8ЕС ΙΌ N0: 16 из списка последовательностей), представляющие собой фрагмент, в котором сайт клеточного связывания фибронектина (УЬА-5 связывающий домен: с Рго1239 по 8ег1515) и одна из последовательностей типа ΙΙΙ являются связанными, или СНУ-179 (аминокислотная последовательность, показанная в 8 ЕС ΙΕ) N0: 17 из списка последовательностей) или СНУ-181 (аминокислотная последовательность, показанная в 8ЕС ΙΌ N0: 18 из списка последовательно стей), представляющие собой фрагмент, в котором сайт клеточного связывания фибронектина и две последовательности типа ΙΙΙ являются связанными. СНУ-89, СНУ-90 и СНУ-92 содержат ΙΙΙ-13, ΙΙΙ-14 и ΙΙΙ12, соответственно, а СНУ-179 содержит ΙΙΙ-13 и ΙΙΙ-14, а СНУ-181 содержит ΙΙΙ-12 и ΙΙΙ-13, соответственно.
Кроме того, в настоящем изобретении может быть использован фрагмент с добавлением дополнительной аминокислоты к каждому из вышеупомянутых фрагментов. Например, данный фрагмент может быть получен добавлением желаемой аминокислоты к каждому вышеуказанному фрагменту в соответствии со способом получения Н-275-Суч, описанном в примерах получения, изложенных ниже. Например, Н-275-Суч (аминокислотная последовательность, показанная в 8ЕС ΙΌ N0: 19 из списка последовательностей) представляет собой фрагмент с гепаринсвязывающим доменом фибронектина и остатком цистеина на С-конце.
Фрагментом, используемым в настоящем изобретении, может быть фрагмент, содержащий полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности с заменой, делецией, вставкой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности полипептида, составляющего фрагмент, по меньшей мере, частично содержащий аминокислотную последовательность природного фибронектина, приведенную в качестве примера выше, где полипептид обладает действием, эквивалентным действию данного фрагмента, при условии получения желаемых эффектов согласно изобретению.
Предпочтительно, чтобы замещение или т.п. аминокислот, осуществляемое в объемах, при которых могут изменяться физико-химические характеристики, и т.п., свойственные полипептиду, были в пределах сохранения функции полипептида. Например, замена или т.п. аминокислот выгодна в объемах, при которых характеристики, свойственные данному полипептиду (например, гидрофобность, гидрофильность, электрический заряд, рК и пр.) существенно не изменяются. Например, заменой аминокислот является замена в пределах каждой группы: 1) глицина, аланина; 2) валина, изолейцина, лейцина; 3) аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, аспарагина, глутамина; 4) серина, треонина; 5) лизина, аргинина; 6) фенилаланина, тирозина. Делецией, добавлением или вставкой аминокислот является делеция,
- 5 010434 добавление или вставка аминонокислот с характеристиками, сходными с характеристиками окружения подлежащего сайта в полипептиде в пределах, в которых характеристики окружения подлежащего сайта по существу не изменяются.
Кроме того, под фразой «имеющий эквивалентную функцию» понимают, что имеется, по меньшей мере, любая из функций: (ί) функция поддержания цитотоксической активности цитотоксического лимфоцита, (ίί) функция усиления уровня экспрессии 1Б-2К или (ίίί) функция увеличения доли СЭ8положительных клеток. Обладает ли фрагмент, содержащий полипептид с аминокислотной заменой или пр., этими функциями или нет может быть соответствующим образом подтверждено способом, описанным в примерах, изложенных ниже. Кроме того, в качестве фрагмента, содержащего полипептид с аминокислотной заменой или пр., предпочтительным является фрагмент, обладающий активностью клеточной адгезии и/или гепаринсвязывающей активностью. Активность клеточная адгезии и гепаринсвязывающая активность могут быть оценены в соответствии с вышеуказанными способами определения этих активностей.
В настоящем изобретении в качестве фрагмента, содержащего полипептид с аминокислотной заменой или пр., также может быть использован, например, фрагмент с одной или несколькими аминокислотами, введенными в качестве связующего звена между двумя различными доменами.
В этой связи, в качестве фибронектина рег §ег в настоящем изобретении так же может быть использован полипептид с аминокислотной последовательностью, имеющей замену, делецию, вставку или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, составляющей полипептид фибронектина, где данный полипептид обладает по меньшей мере одной из функций (ί)-(ίίί), указанных выше.
Фрагмент фибронектина, о котором здесь идет речь, также может быть получен из генетического рекомбинанта в соответствии с описанием, например, патента США № 5198423. Например, каждый из фрагментов Н-271 (8ЕО ГО N0: 9), Н-296 (8ЕО ГО N0: 10), СН-271 (8ЕО ГО N0: 11) и СН-296 (8ЕО ГО N0: 12) и способ получения этих фрагментов подробно описаны в описании к данному патенту.
Кроме того, вышеупомянутый фрагмент С-274 (8Е0 ГО N0: 8) может быть получен в соответствии со способом, описанным в патенте США № 5102988. Более того, фрагмент С-С81 (8Е0 ГО N0: 13) может быть получен в соответствии со способом, описанным в Бюллетене патентов Японии № 3104178. Каждый из фрагментов СНУ-89 (8ЕО ГО N0: 14), СНУ-90 (8ЕО ГО N0: 15) или СНУ-179 (8ЕО ГО N0: 17) может быть получен в соответствии со способом, описанным в Бюллетене патентов Японии № 2729712. Кроме того, фрагмент СНУ-181 (8Е0 ГО N0: 18) может быть получен по способу, описанному в \У0 97/18318. Фрагмент СНУ-92 (8Е0 ГО N0: 16) может быть получен методами генной инженерии с использованием плазмиды, сконструированной обычным способом на основе плазмиды, описанной в литературе со ссылкой на Бюллетень патентов Японии № 2729712 и \У0 97/18318.
Эти фрагменты или фрагменты, которые могут быть получены из этих фрагментов обычным образом, могут быть получены с использованием микроорганизмов, депонированных в 1п1егпа1юпа1 Ра1еШ 0тдаш8т Перокйату, №Шопа1 1п5Ши1е о£ Айуапсей 1пйи51па1 8аепсе апй Тесйпо1оду, ТкикиЬа Сеп1та1 6, 11, НщаЧи 1-сйоте, ТкикиЬа-кЫ, 1Ьагак1-кеп, 1арап (Ζίρ сойе 305-8566) под нижеприведенными инвентарными номерами, или модифицированием плазмиды, которую несет каждый микроорганизм, известным способом.
ЕЕКМ ВР-2264 (ЕзсйепсЫа сой с плазмидой, кодирующей Н-271, дата депонирования: 30 января
1989);
ЕЕКМ ВР-2800 (ЕксйепсЫа сой с плазмидой, кодирующей СН-296, дата депонирования: 12 мая 1989);
ЕЕКМ ВР-2799 (ЕксйепсЫа сой с плазмидой, кодирующую Н-271, дата депонирования: 12 мая 1989);
ЕЕКМ ВР-7420 (ЕксйепсЫа сой с плазмидой, кодирующую Н-296, дата депонирования: 12 мая
1989);
ЕЕКМ ВР-1915 (ЕксйепсЫа сой с плазмидой, кодирующую С-274, дата депонирования: 17 июня 1988);
ЕЕКМ ВР-5723 (ЕксйепсЫа сой с плазмидой, кодирующую С-С81, дата депонирования: 5 марта
1990);
ЕЕКМ Р-12182 (ЕксйепсЫа сой с плазмидой, кодирующую СНУ-89, дата депонирования: 8 апреля
1991); и
ЕЕКМ Р-12183 (ЕксйепсЫа сой с плазмидой, кодирующую СНУ-179, дата депонирования: 8 апреля 1991).
Поскольку фибронектин представляет собой гигантский гликопротеин, для промышленной цели и с целью получения лекарственного средства не так уж легко получать и использовать природный белок. Более того, в большом количестве фибронектин находится в плазме живого организма. Следовательно, при получении фибронектина из плазмы, используемой как препарат крови, существует риск контаминации сопутствующими компонентами, помимо фибронектина, поэтому необходимо учитывать риск с точки зрения безопасности. Кроме того, поскольку фибронектин представляет собой многофункциональный
- 6 010434 белок, необходимо учитывать некоторые недостатки, причиной которых являются области, отличные от областей, проявляющих эффект согласно способу в соответствии с настоящим изобретением, в зависимости от обстоятельств его применения. В связи с этим, с точки зрения доступности, удобства обработки и безопасности в настоящем изобретении предпочтительно использовать фрагмент фибронектина, более предпочтительно использовать фрагмент рекомбинантного фибронектина, полученный, как описано выше. Кроме того, особенно предпочтительно использовать фрагмент фибронектина, который обладает эффектом, таким как улучшение экспансии доли лимфоцитов, увеличивая уровень экспрессии 1Ь-2К в размножающихся лимфоцитах или увеличивая долю СЭЗ-положительных клеток в популяции экспансивных лимфоцитов, как описано ниже. Кроме того, молекулярная масса данного фрагмента фибронектина, используемого в настоящем изобретении, предпочтительно составляет, но конкретно не ограничиваясь этими, от 1 до 200 кДа, более предпочтительно от 5 до 190 кДа и еще более предпочтительно от 10 до 180 кДа.
(2) Способ получения цитотоксических лимфоцитов согласно настоящему изобретению.
Далее будет конкретно описан способ получения цитотоксических лимфоцитов согласно настоящему изобретению. Способом согласно настоящему изобретению является способ получения цитотоксических лимфоцитов, включающий в себя осуществление, по меньшей мере, любого из процессов - индукции, поддержания и экспансии цитотоксических лимфоцитов - в присутствии указанного выше фибронектина, его фрагмента или их смеси.
Используемый здесь термин «цитотоксические лимфоциты» означает группу клеток, содержащих цитотоксические лимфоциты. В узком смысле, в некоторых случаях цитотоксические лимфоциты могут относиться только к цитотоксическом лимфоцитам, содержащимся в вышеуказанной группе клеток. Кроме того, получение цитотоксических лимфоцитов согласно изобретению включает в себя любой из процессов - индукции, начиная от клеток-предшественниц, которые могут превращаться в лимфоциты согласно изобретению, и заканчивая лимфоцитами, обладающими цитотоксической активностью, поддержание цитотоксических лимфоцитов и экспансию цитотоксических лимфоцитов, с использованием цитотоксических лимфоцитов и/или клеток-предшественниц.
Цитотоксические лимфоциты согласно изобретению включают в себя, конкретно ими не ограничиваясь, например, цитотоксические Т-клетки (СТЬ), лимфокин-активированные клетки-киллеры (ЬЛКклетка), опухоль-инфильтрирующие лимфоциты (Т1Ь), ΝΚ-клетки и пр., где каждая клетка обладает антигенспецифической цитотоксической активностью.
В настоящем изобретении клетка-предшественница, которая может превращаться в цитотоксический лимфоцит, то есть клетка-предшественница, которая способна дифференцироваться в лимфоцит, представляет собой, например, РВМС, ΝΚ-клетки, наивные клетки, клетки памяти, гемопоэтические стволовые клетки, мононуклеарные клетки пуповинной крови и пр. Кроме того, поскольку клетка представляет собой гемоцит, эту клетку можно использовать в качестве клетки-предшественницы согласно изобретению. Могут быть непосредственно использованы любые клетки, выделенные из живого организма, или могут быть использованы клетки, которые подвергались замораживанию для хранения. В связи с этим в способе получения цитотоксических лимфоцитов согласно изобретению также может быть использован материал, содержащий вышеуказанные клетки, например, кровь, такая как периферическая кровь или пуповинная кровь; материал, полученный путем удаления компонентов, такой как эритроциты и плазма крови; костномозговая жидкость; и пр.
Одна из главных особенностей этого способа получения цитотоксических лимфоцитов согласно изобретению состоит в том, что эти цитотоксические лимфоциты получают в присутствии эффективного компонента, выбранного из фибронектина, его фрагментов или их смеси.
В способе согласно изобретению индукцию, поддержание и/или экспансию цитотоксических лимфоцитов обычно осуществляют в среде, содержащей данные компоненты в присутствии вышеупомянутого эффективного ингредиента согласно изобретению.
Например, в способе согласно изобретению, когда предполагается индукция или экспансия цитотоксических лимфоцитов, число клеток (цитотоксических лимфоцитов и/или клеток-предшественниц) в начале культивирования, используемых в настоящем изобретении конкретно не ограничено. Например, это число предпочтительно составляет от 1 до 1 х 108 клеток/мл. Кроме того, условия культивирования конкретно не ограничены, и могут быть использованы обычные условия культивирования клеток. Например, клетки можно культивировать в при 37°С в присутствии 5% СО2 и т.п. Кроме того, среда может, заменяться свежей средой с подходящими интервалами.
Среда, используемая в способе получения цитотоксических лимфоцитов согласно изобретению, конкретно не ограничена, и может быть использована известная среда, полученная путем смешения компонентов, необходимых для поддержания и роста цитотоксических лимфоцитов или клетокпредшественниц. Например, может быть использована коммерчески доступная среда. Такие среды, кроме основных компонентов, могут содержать подходящие белки, цитокины и другие компоненты. Предпочтительно в настоящем изобретении используется среда, содержащая 1Ь-2. Концентрация 1Ь-2 в среде составляет, конкретно этим не ограничиваясь, например, предпочтительно от 0,01 до 1 х 105 Ед/мл, более
- 7 010434 предпочтительно - от 0,1 до 1 х 104 Ед/мл.
Кроме того, клетка-предшественница, которая может превращаться в цитотоксический лимфоцит, может быть культивирована в среде, дополнительно содержащей антитело против ΟΌ3. Концентрация антитела против ΟΌ3 в среде составляет, конкретно этим не ограничиваясь, например, предпочтительно от 0,01 до 100 мкг/мл. Антитело против 0Ό3 может быть добавлено для активации рецепторов лимфоцитов. Также, помимо приведенного выше, может быть добавлен лимфоцит-стимулирующий фактор, такой как лецитин. Концентрация данного компонента в среде конкретно не ограничена, при условии, что достигаются желательные эффекты. Помимо одновременного присутствия этих компонентов, которое достигается при растворении этих компонентов в среде, они могут быть иммобилизированы на соответствующей твердой фазе, например на приспособлении для клеточной культуры (включая любую из открытых и закрытых систем), например на чашке Петри, колбе или мешке, или на носителе для клеточной культуры, таком как бусы, мембрана или предметное стекло. Материалы таких твердых фаз конкретно не ограничены, при условии, что эти материалы могут быть использованы для клеточной культуры. В том случае, когда компоненты иммобилизованы, например, на вышеуказанном приспособлении, предпочтительно иммобилизовать данное количество каждого компонента в количестве среды, помещаемой в данное приспособление, таким образом, чтобы среда имела сходную пропорцию с желаемой концентрацией, при которой данные компоненты используются как компоненты, растворенные в среде, при помещении данной среды в приспособление. Количество иммобилизованных компонентов конкретно не ограничено, при условии, что достигаются желательные результаты. Вышеуказанный носитель используется путем погружения носителя в культуральную среду в приспособлении для клеточной культуры во время культивирования клеток. В том случае, когда вышеуказанные компоненты иммобилизованы на вышеупомянутом носителе, предпочтительно иммобилизовать данное количество каждого компонента в количестве среды, помещенной в данное оборудование, так, чтобы среда имела сходную пропорцию с желаемой концентрацией, при которой данные компоненты используются как компоненты, растворенные в среде, при помещении носителя в среду. Количество иммобилизованных компонентов конкретно не ограничено, при условии, что достигаются желательные результаты.
В обоих случаях иммобилизация вышеупомянутых компонентов может осуществляться известным способом, например, способом иммобилизации фрагмента фибронектина, изложенным ниже.
Более того, вместе с вышеуказанными компонентами можно использовать соединение, выбранное из группы, состоящей из кислых полисахаридов, кислых олигосахаридов, кислых моносахаридов и их солей, которые эффективны для индукции цитотоксических Т-клеток, обладающих антигенспецифической цитотоксической активностью, как описано в \УО 02/14481, или вещество, выбранное из нижеследующих пунктов (Ά)-(Ό):
(A) вещество со связующей активностью в отношении ΟΌ44;
(B) вещество, способное регулировать сигнал, возникающий при связывании лиганда ΟΌ44 с СЭ44;
(C) вещество, способное ингибировать связывание фактора роста с рецептором фактора роста; и (Ό) вещество, способное регулировать сигнал, возникающий при связывании фактора роста с рецептором фактора роста.
Примером вышеуказанного вещества со связующей активностью в отношении ΟΌ44 может служить, например, лиганд ΟΌ44 и/или антитело против ΟΌ44. Вещество, способное регулировать сигнал, возникающий при связывании лиганда ΟΌ44 и 0Ό44. включает в себя, например, различные ингибиторы фосфоферментов. Вещество, способное ингибировать связывание фактора роста с рецептором фактора роста, включает в себя, например, вещество с активностью связывания с фактором роста и образующее комплекс с фактором роста, тем самым ингибируя связывание фактора роста с рецептором фактора роста, или вещество с активностью связываниия с рецептором фактора роста, тем самым ингибируя связывание фактора роста и рецептором фактора роста. Кроме того, вещество, способное регулировать сигнал, возникающий при связывании фактора роста с рецептором фактора роста, включает в себя, например, различные ингибиторы фосфоферментов. Концентрация этих компонентов в среде конкретно не ограничена, при условии, что могут достигаться желательные результаты. Также эти компоненты могут быть использованы для иммобилизации на соответствующей твердой фазе, как указано выше, в дополнение к совместному присутствию этих компонентов в среде при растворении данных компонентов в указанной среде.
В данном случае каждое из различных веществ, указанных выше, может быть использовано отдельно или в смеси двух или более разновидностей таких веществ.
В настоящем изобретении фраза «в присутствии вышеуказанного эффективного ингредиента» относится к тому факту, что эффективный ингредиент находится в состоянии, когда вышеуказанный эффективный ингредиент может проявлять свою функцию при проведении индукции, поддержания и экспансии цитотоксических лимфоцитов, и реализация существующего способа конкретно не ограничена. Например, в том случае, когда используется эффективный ингредиент, растворенный в среде, содержание данного эффективного ингредиента согласно изобретению в среде, в которой проводят культивирование, конкретно не ограничено, при условии, что достигаются желательные результаты. Содержание эффективного ингредиента составляет, например, предпочтительно от 0,01 до 1000 мкг/мл, более пред
- 8 010434 почтительно от 0,1 до 1000 мкг/мл, еще более предпочтительно от 1 до 100 мкг/мл. Кроме одновременного присутствия эффективного ингредиента при растворении этого эффективного ингредиента в среде, как указано выше, в данном случае может быть использована иммобилизация на соответствующей твердой фазе, например, на приспособлении для клеточной культуры (в том числе в любой из открытых и закрытых систем), например на чашке Петри, колбе или мешке, или на носителе для клеточной культуры, например бусах, мембране или предметном стекле. С точки зрения введения культивированных цитотоксических лимфоцитов в живой организм, желательно, чтобы вышеупомянутый эффективный ингредиент был иммобилизован, но этот факт конкретно не ограничен.
В том случае, когда различные компоненты, указанные выше, или эффективный ингредиент согласно изобретению иммобилизованы на твердой фазе, цитотоксические лимфоциты могут быть легко отделены от эффективного ингредиента или пр., после получения лимфоцитов способом согласно изобретению лишь путем отделения от твердой фазы, с тем, чтобы предотвратить загрязнение лимфоцитов эффективным ингредиентом.
В том случае, когда эффективный ингредиент согласно изобретению иммобилизован, например, на вышеуказанном приспособлении, предпочтительно иммобилизовать данное количество каждого эффективного ингредиента в количество среды, помещаемой в приспособление, так, чтобы среда имела пропорцию, сходную с желаемой концентрацией, при которой эффективный ингредиент используется как растворенный в среде эффективный ингредиент, при помещении среды в оборудование. Количество эффективного ингредиента конкретно не ограничено, при условии, что достигаются желательные результаты. В том случае, когда эффективный ингредиент иммобилизован на вышеуказанном носителе, предпочтительно иммобилизовать данное количество каждого эффективного ингредиента в количестве среды, помещаемой в приспособление, так, чтобы среда имела пропорцию, сходную с желаемой концентрацией, при которой эффективный ингредиент используется как растворенный в среде эффективный ингредиент, при помещении носителя в среду. Количество действующего ингредиента особым образом не ограничено, при условии, что достигаются желательные результаты.
Например, иммобилизацию фрагмента фибронектина можно проводить в соответствии со способами, описанными в \УО 97/18318 и \УО 00/09168.
При определении уровня экспрессии 1Ь-2В цитотоксическими лимфоцитами, полученными способом согласно изобретению, было показано значительное увеличение уровня экспрессии 1Ь-2В по сравнению с таковым в цитотоксических лимфоцитах, полученных при осуществлении по меньшей мере одного из процессов - индукции, поддержания и экспансии - в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси. В данном случае, уровень экспрессии 1Б-2К можно определить известным способом, например, с помощью, антитела против 1Б-2К
Как описано выше, цитотоксические лимфоциты, полученные способом согласно изобретению, имеют повышенный уровень экспрессии 1Б-2К 1Ь-2В представляет собой маркер активации, который экспрессируется на поверхности активированных Т-клеток, и при экспрессии этой молекулы активируется продукция цитокинов, цитотоксическая активность, активность пролиферации или т.п. Следовательно, цитотоксические лимфоциты, полученные способом согласно изобретению, представляют собой группу клеток с высокой функциональной активностью.
Кроме того, поскольку цитотоксические лимфоциты, полученные способом согласно изобретению, имеют повышенный уровень экспрессии 1Ь-2В, эти цитотоксические лимфоциты обладают повышенной чувствительностью к стимуляции 1Ь-2, при добавлении в среду, или 1Ь-2, продуцируемого клеткамипредшественницами цитотоксических лимфоцитов, самими лимфоцитами или совместно с другими присутствующими клетками. Поэтому цитотоксические лимфоциты могут быть активированы самим по себе даже в окружении меньшего количества 1Ь-2 (например, в живом организме или пр.).
Кроме того, в цитотоксических лимфоцитах, полученных способом согласно изобретению, присутствующее относительное содержание (СЭ8-позитивных) клеток с маркером СЭ8 выше по сравнению с относительным содержанием в цитотоксических лимфоцитах, полученных при осуществлении по меньшей мере любого одного из процессов - индукции, поддержания и экспансии - в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси. Этот факт имеет некоторые преимущества, например, 1) СЭ8позитивные клетки продуцируют цитокин, такой как интерферон-γ, тем самым вызывая иммунологическую активацию, изменяя баланс хелперных Т-клеток в сторону ТЫ доминантной системы, 2) СЭ8позитивные клетки относятся к клеточным иммуноцитам, которые могут эффективно устранять чужеродное вещество, такое как вирус или опухолевую клетку, 3) при получении СЭ8-позитивных клеток количество этих СЭ8-позитивных клеток может быть увеличено при культивировании клеток способом согласно изобретению, при этом СЭ8-позитивные клетки очищают обычным способом с помощью магнитных бус или проточного цитометра, 4) цитотоксические лимфоциты подходящим образом используют в качестве клеток-предшественниц во время индукции СТЬ из-за большего соотношения СЭ8позитивных клеток, 5) даже если клеточная популяция имеет более низкое отношение СЭ8-позитивных клеток, ее можно культивировать, увеличивая отношение СЭ8-позитивных клеток, и пр. Следовательно, способ согласно изобретению является очень эффективным для получения цитотоксических лимфоцитов.
- 9 010434
В данном случае, отношение СГОЗ-позитивных клеток в цитотоксических лимфоцитах, полученных способом согласно изобретению, может быть определено, например, с использованием антитела против СЭ8. но конкретно этим не ограничиваясь.
Кроме того, цитотоксические лимфоциты, главным образом СТЬ, полученные в соответствии со способом согласно изобретению, имеют прекрасные характеристики, такие как отсутствие резкого снижения цитотоксической активности, что наблюдалось ранее, даже когда клетки после культивирования поддерживали в течение длительного периода времени, или при пролиферации клеток. Другими словами, цитотоксические лимфоциты сохраняет высокую цитотоксическую активность по сравнению с цитотокскческими лимфоцитами, полученными при осуществлении, по меньшей мер, любого из процессов индукции, поддержания и экспансии - в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси. Следовательно, стабильную цитотоксическую активность лимфоцитов можно поддерживать, клонируя цитотоксические лимфоциты. Кроме того, индуцированные СТЬ могут пролиферировать и размножаться путем стимуляции СТЬ антигеном, различными видами цитокинов или антителом против СЬ3. Для поддержания и экспансии лимфоцитов может быть использован любой известный способ, без конкретного ограничения.
Поддержание вышеупомянутых цитотоксических лимфоцитов относится к поддержанию цитотоксических лимфоцитов при сохранении их цитотоксической активности. Условия культивирования во время поддержания конкретным образом не ограничены, и могут быть использованы условия, используемые при поддержании обычной клеточной культуры. Например, клетки можно культивировать в условиях при 37°С в присутствии 5% СО2 и пр. Кроме того, среду можно заменять свежей средой с подходящими интервалами времени. Используемая среда и другие используемые вместе с ней компоненты и пр., являются такими же, как указано выше.
Одной из главных особенностей поддержания и экспансии цитотоксических лимфоцитов в способе согласно изобретению является тот факт, что данный способ включает в себя, соответственно, непрерывное культивирование и экспансию цитотоксических лимфоцитов в среде в присутствии эффективного ингредиента согласно изобретению, т.е. фибронектина, его фрагмента или их смеси. В соответствии с экспансией, число клеток цитотоксических лимфоцитов может увеличиваться в стадии поддержания цитотоксической активности цитотоксических лимфоцитов. Другими словами, как один вариант осуществления способа согласно изобретению, здесь предлагается способ экспансии цитотоксических лимфоцитов.
В способе экспансии цитотоксическых лимфоцитов согласно изобретению условия культивирования конкретно не ограничены, и могут быть использованы условия, используемые для культивирования обычной клеточной культуры. Например, клетки можно культивировать в условиях при 37°С в присутствии 5% СО2 и пр. Кроме того, среду можно заменять свежей средой в подходящие интервалы времени. Используемая среда и другие используемые вместе с ней компоненты и пр. являются такими же, как указано выше.
В соответствии со способом экспансии согласно изобретению, например, в случае экспансии СТЬ, экспансия в течение 14 дней дает увеличение числа клеток СТЬ в 100-1000 раз. Кроме того, в качестве одного из примеров экспансии, культивирование в течение 7 дней клеток ЬЛК дает увеличение числа клеток ЬЛК в 200 раз, и примерно в 1000 раз - при культивировании этих клеток в течение 9 дней. Более того, полученные таким образом цитотоксические лимфоциты, в особенности СТЬ, обладают более высокой цитотоксической активностью по сравнению с СТЬ, полученными обычным способом экспансии цитотоксических лимфоцитов, например, КЕМ-способом или модифицированным КЕМ-способом. Результаты настоящего изобретения, описанные выше, могут быть подтверждены путем определения цитотоксической активности СТЬ или пр., при экспансии способом согласно изобретению, в соответствии со способом, описанным в примерах, представленных ниже.
Кроме того, способ получения цитотоксических лимфоцитов согласно изобретению имеет особенность, заключающуюся в том, что культивирование может быть происходить при низком числе клеток. Для проведения адоптивной иммунотерапии требуется большое количество лимфоцитов, но у пациента трудно получить большое количество лимфоцитов. Кроме того, при обычной экспансии цитотоксических лимфоцитов необходимо выбирать приспособление для клеточной культуры с соответствующей площадью для культивирования, в зависимости от числа используемых клеток, и культивировать в соответствующем количестве среды. Другими словами, обычно культивирование начинают в условиях высокой плотности, когда количество (число) клеток на площадь культивирования в приспособлении для клеточной культуры [т.е. площадь (см2) поверхности приспособления, контактирующая со средой] составляет от 1 х 106 клеток/см2 или более, и концентрация клеток составляет от 1 х 106 клеток/мл или более. В тех случаях, когда культивирование проводят в условиях ниже этого уровня клеток, коэффициент экспансии [отношение числа клеток после экспансии к числу клеток до экспансии (число клеток после экспансии/число клеток до экспансии)] становится очень низким, в результате чего требуется длительный период культивирования для получения цитотоксических лимфоцитов в большом количестве. Следовательно, в настоящий момент большое число лимфоцитов получают обычно, например, начиная культивирование с небольшим приспособлением для клеточной культуры, а затем используя поэтапное, широ
- 10 010434 комасштабное приспособление для клеточной культуры, или увеличивая число приспособлений для клеточных культур и методик повторных разведений. Как описано выше, для обычной экспансии цитотоксических лимфоцитов требуется большое количество культур.
В соответствии со способом согласно изобретению, даже в том случае, когда культивирование начинают с небольшого количества клеток, клетки могут быть культивированы с высоким коэффициентом экспансии, не зависимо от размера приспособления для клеточной культуры. Следовательно, сложная методика, такая как замена приспособления для клеточной культуры, и методика разьедения, описанные выше, становятся ненужными. Другими словами, в соответствии со способом согласно изобретению, экспансия цитотоксических лимфоцитов может быть удовлетворительно проведена с помощью способов культивирования с использованием одного приспособления для клеточной культуры, т.е. с помощью одной культуральной системы. Следовательно, способ согласно изобретению представляет собой способ получения цитотоксических лимфоцитов, который исключает стадию разведения или стадию замены приспособления для клеточной культуры. Главным образом, в том случае, когда в соответствии со способом согласно изобретению проводят экспансию ЬЛК-клеток, ЬЛК-клетки могут быть экспансированы при добавлении в приспособление для клеточной культуры большого объема клеток, которые могут давать ЬЛК-клетки, и среды, и при добавлении к ней только 1Ь-2 на последующих стадиях. Настоящее изобретение очень эффективно в том аспекте, что с помощью простой методики может быть получено большое количество ЬЛК-клеток. В данном случае предпочтительно для получения более высокого коэффициента экспансии в качестве эффективного ингредиента согласно изобретению использовать фрагмент фибронектина. Как описано выше, в соответствии со способом согласно изобретению, необходимое количество цитотоксического лимфоцита может быть получено за более короткий период времени.
Например, когда по меньшей мере любой один из процессов - индукции, поддержания и экспансии цитотоксического лимфоцита начинают при небольшом числе клеток в приспособлении для клеточной культуры, содержащем среду, в присутствии эффективного ингредиента согласно изобретению, данная индукция, поддержание или экспансия может проводиться с использованием количества клеток, удовлетворяющего условиям, выбранным из следующих (а) и (Ь) в начале культивирования:
(a) соотношение количества клеток к площади культуры в используемом приспособлении для клеточной культуры составляет предпочтительно от 1 до 5 х 105 клеток/см2, более предпочтительно от 10 до 1 х 105 клеток/см2, особенно предпочтительно от 1 х 102 до 5 х 104 клеток/см2; и (b) концентрация клеток в среде составляет предпочтительно от 1 до 5 х 105 клеток/мл, более предпочтительно от 10 до 1 х 105 клеток/мл, особенно предпочтительно от 1 х 102 до 5 х 104 клеток/мл.
Количество клеток, в используемом здесь смысле, относится к числу цитотоксических лимфоцитов и/или клеток-предшественниц.
Кроме того, в способе согласно изобретению может быть приведен в качестве примера способ, включающий в себя проведение по меньшей мере любого одного из [процессов] - индукции, поддержания и экспансии цитотоксических лимфоцитов - в одной культуральной системе, в котором исключена стадия замены приспособления для клеточной культуры или стадия процедуры разведения.
Способ согласно изобретению будет раскрыт на примере получения СТЬ.
Индукцию СТЬ проводят путем инкубации (культивирования) клеток-предшественниц, способных к дифференцировке в СТЬ, вместе с соответствующими антигенпредставляющими клетками в присутствии вышеуказанного эффективного ингредиента, например, в любой среде, для получения СТЬ, способных распознавать желаемый антиген. Клетки-предшественницы конкретно не ограничены, при условии, что клетки-предшественницы представляют собой клетки, находящиеся на стадии, предшествующей стадии образования данной СТЬ-клетки, для которой предопределена дифференцировка в СТЬ, и включают в себя, например, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), наивные клетки, клетки памяти, мононуклеарные клетки пуповинной крови, гемопоэтические стволовые клетки и пр. Антигенпредставляющие клетки конкретно не ограничены, при условии, что данные клетки способны представлять антиген для его распознавания Т-клетками. В настоящем изобретении могут использоваться, например, мононуклеарные клетки, В-клетки, Т-клетки, макрофаги, дендритные клетки, фибробласты или пр., которые могут представлять желаемый антиген.
В настоящем изобретении условия культивирования для клетки-предшественницы, или тому подобное, во время получения СТЬ могут быть, например, приведены в соответствие с общеизвестными условиями [см., например, Сайег 1. е1 а1., 1ттиио1оду 57(1), 123-129 (1986)].
Кроме того, клетка может быть культивирована совместно с подходящей питающей клеткой. В том случае, когда СТЬ культивируют совместно с питающей клеткой, желательно, чтобы среда представляла собой среду, подходящую для обеспечения жизнедеятельности и роста как СТЬ, так и питающей клетки. В качестве среды может быть использована коммерчески доступная среда.
Питающая клетка, используемая для способа согласно изобретению, особым образом не ограничена, при условии, что данная питающая клетка стимулирует СТЬ совместно с анти-СЭЗ антителом для активации Т-клеточного рецептора. В настоящем изобретении, например, используют РВМС или Вклетку, трансформированную вирусом Эпштейна-Барр (ΕΒΥ-Β-клетка). Обычно питающую клетку ис
- 11 010434 пользуют после лишения ее пролиферативной активности посредством излучения или пр. В этой связи, содержание питающей клетки в среде может быть определено в соответствии с известными условиями. Например, данное содержание составляет предпочтительно от 1 х 105-7 клеток/мл.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в качестве питающей клетки используют невирусинфицированную клетку, например, клетку, иную, чем ЕВУ-В-клетка. Используя невирусинфицированную клетку, можно устранить возможность того, что ЕВУ-В-клетка смешается с развивающимся СТЬ, тем самым, повышая безопасность при медицинском лечении с использованием СТЬ, таком как адоптивная иммунотерапия.
Антигенпредставляющая клетка может быть получена путем добавления антигенного пептида к клетке, обладающей способностью представлять антиген, тем самым давая возможность клетке представлять данный антигенный пептид на ее поверхности [см., например, Вепбпагек М. А. с1 а1., 1. 1ттипо1. 147(12), 4047-4053 (1991)]. Кроме того, в том случае, когда клетка, обладающая антигенпредставляющей способностью, обладает способностью процессировать антиген, к данной клетке добавляют антиген, посредством чего антиген внедряется в клетку и процессируется в ней, и фрагментированные антигенные пептиды представляются на клеточной поверхности. В этой связи, в том случае, когда добавляют антигенный пептид к клетке, обладающей способностью представлять антиген, антигенный пептид соответствует МНС-рестрикции использующейся антигенпредставляющей клетки и индуцируется соответсвующая СТЬ.
В этой связи, антиген, используемый в настоящем изобретении, особым образом не ограничивается и включает в себя, например, экзогенные антигены, такие как бактерии и вирусы, эндогенные антигены, такие как антигены, ассоциированные с опухолью (раковые антигены), и пр.
Согласно изобретению предпочтительно, чтобы антигенпредставляющую клетку делали непролиферирующей. Для того чтобы сделать клетку непролиферирующей, клетку можно, например, подвергнуть облучению Х-лучами или пр., или обработать агентом, таким как митомицин.
Согласно изобретению общие условия для инкубации (совместного культивирования) клеткипредшественника, способной дифференцироваться в СТЬ, вместе с антигенпредставляющей клеткой в присутствии действующего ингредиента, выбранного из фибронектина, его фрагмента или их смеси, для индукции СТЬ, могут быть известными условиями [см., например, Вепбпагек М. А. е1 а1., 1. 1ттипо1., 147(12), 4047-4053 (1991)]. Условия совместного культивирования особым образом не ограничены, и могут быть использованы условия, обычно используемые для клеточной культуры. Например, клетки можно культивировать в условиях при 37°С в присутствии 5% СО2, и пр. Совместное культивирование обычно проводят примерно в течение от 2 до 15 дней, в течение этого времени антигенпредставляющую клетку можно заменить свежеприготовленной клеткой для повторной стимуляции. Кроме того, среда может быть заменена свежей средой в соответствующие интервалы времени.
СТЬ, полученные способом согласно изобретению, обладают способностью специфически распознавать желаемый антиген, например, специфически разрушать клетку, имеющую данный антиген, своей цитотоксической активностью. Эта цитотоксическая активность СТЬ может быть оценена известным способом. Например, цитотоксическая активность СТЬ против клетки-мишени, меченной радиоактивным веществом, флуоресцентным веществом или пр., может быть оценена путем определения радиоактивности или интенсивности флуоресценции, приписываемой клетке-мишени, разрушенной под действием СТЬ. Кроме того, ее можно определить путем определения количества цитокина, такого как СМС8Е или ΙΕΝ-γ, высвобождаемого антигенспецифически из СТЬ или клетки-мишени. Помимо этого, цитотоксическая активность может быть непосредственно подтверждена использованием антигенного комплекса пептид-МНС, в котором данный пептид помечен флуоресцентным красителем или пр. В этом случае, например, СТЬ приводят в контакт с первым флуоресцентным маркером, соединенным с СТЬспецифическим антителом, а затем с антигенным комплексом пептид-МНС, в котором данный пептид соединяют со вторым флуоресцентным маркером, и наличие клетки с двойной меткой выявляют с помощью ЕАС8-анализа (активированная флуоресценцией сортировка клеток), посредством чего может быть оценена цитотоксическая активность СТЬ.
В этой связи, способ развития СТЬ согласно изобретению особым образом не ограничен, при условии, что вышеупомянутый действующий ингредиент находится в культуре, используемой в данном способе. Настоящее изобретение также охватывает вариант осуществления, в котором данный способ проводят в присутствии вышеупомянутого действующего ингредиента в культуре в общепринятом способе развития СТЬ, помимо описанного выше, т.е. культивирование клетки-предшественника или подобной, проводят в присутствии действующего ингредиента согласно изобретению (например, путем добавления вышеупомянутого действующего ингредиента к среде, используемой в данной культуре).
Далее способ культивирования ЬАК-клетки будет раскрыт подробно.
Культивирование ЬАК-клетки проводят путем инкубации клетки, которая может быть превращена в ЬАК-клетку, вместе с 1Ь-2 в присутствии вышеупомянутого действующего ингредиента. Данная клетка, которая может быть превращена в ЬАК-клетку, включает в себя, особо ими не ограничиваясь, например, мононуклеарную клетку периферической крови (РВМС), ΝΧ-клетку, мононуклеарную клетку пупо
- 12 010434 винной крови, гемопоэтическую стволовую клетку, компонеты крови, содержащие эти клетки, и пр.
Кроме того, основные условия для культивирования ЬЛК-клетки могут быть установлены в соответствии с известными условиями [например, см. 8а1Ьо Кодаки (Се11 Тесйио1о§у), 14(2), 223-227 (1995); 8шЬо Ва1уо(Се11 СиИиге) 17(6), 192-195 (1991); ТНЕ ЬЛМСЕТ, 356, 802-807 (2000); Сштеи! Рго1осо18 ίη 1ттиио1о§у, 5ирр1етеЩ 17, υΝΙΤ 7.7]. Условия совместного культивирования особым образом не ограничены, и могут быть использованы условия, которые используют для обычной клеточной культуры. Например, культивирование можно проводить в условиях при 37°С в присутствии 5% СО2 и пр. Такое совместное культивирование обычно проводят примерно в течение от 2 до 15 дней. Кроме того, среда может быть заменена свежей средой в соответствующие интервалы времени.
Таким же образом, как и для вышеупомянутой индукции, поддержания или развития СТЬ- или ЬДК-клетки, в отношении Т1Ь, группа клеток, обладающая высокой цитотоксической активностью, может быть получена культивированием данных клеток в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси. В настоящем изобретении отсутствуют особые ограничения в процедурах активации этих клеток, при условии, что фибронектин, его фрагмент или их смесь присутствует совместно с ними, и данные процедуры могут быть проведены с использованием среды, подходящей для культивирования или активации вышеупомянутых клеток. В отношении используемого количества фибронектина, его фрагмента или их смеси, способа добавления компонента и пр., подходящие количества и способы могут быть выбраны в соответствии с вышеупомянутым способом.
В соответствии с вышеупомянутым способом получения цитотоксического лимфоцита согласно изобретению, здесь получают цитотоксический лимфоцит, у которого цитотоксическая активность сохранена на высоком уровне, уровень экспрессии 1Ь-2К значительно повышен и повышена доля СЭ8позитивных клеток, среди цитотоксических лимфоцитов, который подходит для использования в медицине. Соответственно, в качестве одного варианта осуществления способа согласно изобретению, здесь дополнительно предложен способ повышения экспрессии рецептора интерлейкина-2 в цитотоксическом лимфоците, включающий в себя проведение, по меньшей мере, любой из стадий: индукции, обеспечения жизнедеятельности и развития цитотоксического лимфоцита в присутствии действующего ингредиента согласно изобретению; способ повышения соотношения СО8-позитивной клетки в цитотоксическом лимфоците, включающий в себя проведение любой из стадий: индукции, обеспечения жизнедеятельности и развития цитотоксического лимфоцита в присутствии действующего ингредиента согласно изобретению; и способ повышения или сохранения цитотоксической активности в цитотоксическом лимфоците, включающий в себя проведение по меньшей мере любой из стадий: индукции, обеспечения жизнедеятельности и развития цитотоксического лимфоцита в присутствии действующего ингредиента согласно изобретению.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается агент для усиления экспресии 1Ь-2К на клеточной поверхности, который включает в себя в качестве действующего ингредиента фибронектин, его фрагмент или их смесь. Данный усиливающий агент включает в себя сам действующий ингредиент и дополнительно другой необязательный ингредиент, например, среду, белок и цитокин (предпочтительно Ι6-2). подходящие для активируемой клетки, и другие желательные компоненты. Также среда, содержащая вышеупомянутый усиливающий агент, может быть использована в качестве среды для усиления экспресии 1Ь-2К в цитотоксическом лимфоците. Вышеупомянутая среда необязательно содержит основные компоненты для клеточной культуры. Здесь усиливающий агент и среда для усиления экспресии 1Ь-2К, упомянутые выше, могут быть приготовлены с использованием действующего ингредиента согласно изобретению в соответствии с изестным способом. Содержание действующего ингредиента согласно изобретению, и подобного, в усиливающем агенте или в среде для усиления экспрессии 1Ь-2К, упомянутые выше, особым образом не ограничиваются, при условии, что достигаются жела.тельные результаты согласно изобретению. Например, данное содержание может быть подходящим образом определено в соответствии с содержанием действующего ингредиента и пр., в вышеупомянутой среде, по желанию используемой в способе согласно изобретению. Кроме того, вышеупомянутый усиливающий агент может быть введен непосредственно в живой организм, посредством чего может быть усилена экспрессия 1Ь-2К на клетке в живом организме.
Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается агент для повышения соотношения СО8-позитивной клетки в популяции культивируемых лимфоцитов, характеризующийся тем, что данный агент содержит в качестве действующего ингредиента фибронектин, его фрагмент или их смесь. Агент, повышающий соотношение, включает в себя сам действующий ингредиент и дополнительно другой необязательный ингредиент, например, среду, белок и цитокин (предпочтительно 1Ь-2), подходящие для активируемой клетки, и другие желательные компоненты. Также среда, содержащая вышеупомянутый агент, повышающий соотношение, может быть использована в качестве среды для повышения соотношения (доли) СО8-позитивных клеток в цитотоксическом лимфоците. Вышеупомянутая среда необязательно содержит основные компоненты для клеточной культуры. Здесь агент, повышающий соотношение клеток, и среда для повышения соотношения, упомянутая выше, могут быть получены с использованием действующего ингредиента настоящего изобретения в соответствии с известным способом. Содержание действующего ингредиента настоящего изобретения и пр. в повышающем соотноше
- 13 010434 ние агенте или среде для повышения соотношения (доли) СЭЗ-позитивных клеток, упомянутого выше, может быть подходящим образом определено при желании таким же образом, как в случае вышеупомянутого агента для экспрессии 1Ь-2К и пр. Кроме того, вышеупомянутый повышающий соотношение агент может быть непосредственно введен в живой организм, посредством чего может быть повышена доля цитотоксических лимфоцитов в живом организме. В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается агент для повышения или сохранения цитотоксической активности в цитотоксическом лимфоците, характеризующийся тем, что данный агент содержит в качестве действующего ингредиента фибронектин, его фрагмент или их смесь. Данный повышающий или сохраняющий агент содержит сам действующий ингредиент и дополнительно другой необязательный ингредиент, например, среду, белок и цитокин (предпочтительно 1Ь-2), подходящие для активируемой клетки, и другие желательные компоненты. Также данная среда, содержащая вышеупомянутый повышающий или сохраняющий агент, может быть использована в качестве среды для повышения или сохранения цитотоксической активности в цитотоксическом лимфоците. Вышеупомянутая среда необязательно содержит основные компоненты для клеточной культуры. Здесь, повышающий или сохраняющий агент и среда для повышения или сохранения, упомянутые выше, могут быть приготовлены с использованием действующего ингредиента согласно изобретению в соответствии с известным способом. Содержание действующего ингредиента согласно изобретению в повышающем или сохраняющем агенте и среде для повышения или сохранения, упомянутых выше, особым образом не ограничивается, при условии, что достигаются желательные результаты согласно изобретению. Например, содержание может быть подходящим образом определено в соответствии с содержанием действующего ингредиента в среде, упомянутой выше, по желанию используемой в способе согласно изобретению. Кроме того, вышеупомянутый повышающий или сохраняющий агент может быть введен непосредственно в живой организм, посредством чего может быть повышена или сохранена активность цитотоксического лимфоцита в живом организме.
Более того, агент, усиливающий экспрессию, агент, повышающий соотношение, и агент для повышения или сохранения цитотоксической активности, упомянутые выше, могут быть в форме, когда данные компоненты иммобилизованы на соответствующей твердой фазе, например приспособлении для клеточной культуры, например чашке Петри, колбе или мешке (в том числе и открытой системы, и закрытой системы), носителе клеточной культуры, таком как бусы, мембрана или покровное стекло.
Обычно в лимфоцитсодержащей культуре, полученной с использованием способа получения цитотоксического лимфоцита, описанного выше, примешаны клетки, иные, чем цитотоксический лимфоцит, например, хелперная Т-клетка. Однако поскольку лимфоциты, обладающие цитотоксической активностью, содержатся в большом количестве в лимфоцитсодержащей культуре, полученной согласно изобретению, данные клетки в культуре могут быть собраны из культуры с помощью центрифугирования или пр., и непосредственно использованы в качестве цитотоксического лимфоцита, полученного способом согласно изобретению. Более того, если вышеупомянутый действующий ингредиент или пр., иммобилизован на приспособлении для клеточной культуры или пр., отсутствует риск примешивания данного компонента, или пр., в полученный в результате цитотоксический лимфоцит.
Кроме того, клеточная популяция (или культура), богатая цитотоксическими лимфоцитами, может быть дополнительно выделена из культуры известным способом и использована как цитотоксический лимфоцит согласно изобретению. Другими словами, способ получения цитотоксического лимфоцита, полученного способом согласно изобретению, может включать в себя стадию отбора клеточной популяции, богатой цитотоксическими лимфоцитами, из культуры, полученной данным способом.
Способ отбора клеточной популяции, богатой цитотоксическими лимфоцитами, особым образом не ограничен. Данный способ иллюстрируется, например, способом, включающим в себя селективный сбор только желаемой клетки из культуры с использованием приспособления для клеточной культуры или носителя, с которым связано антитело против антигена кх:еточной поверхности, экспрессируемого на поверхности желаемой клетки, например, анти-СЭ8-антитело, или способом с использованием проточного цитометра. Вышеупомянутый носитель иллюстрируется магнитными бусами или колонкой. Кроме того, клеточная популяция, богатая желаемыми клетками, может быть получена путем удаления с помощью адсорбирования клеток, помимо желаемой клетки, из культуры. Например, Т-клетка-хелпер может быть удалена из культуры лимфоцитов с использованием антитела против антигена клеточной поверхности, экспрессируемого на поверхности Т-клетки-хелпера, например анти-СЭ4-антитела. На этой стадии также может быть использован проточный цитометр. Клеточная популяция, богатая цитотоксическими лимфоцитами, полученными таким образом, обладает цитотоксической активностью большей силы по сравнению с цитотоксической активностью клеточной популяции, собранной неселективно из культуры, так что данная клеточная популяция может быть особенно предпочтительно использована в медицине.
Далее в настоящем изобретении предложены цитотоксические лимфоциты, полученные способом получения цитотоксических лимфоцитов согласно изобретению, упомянутым выше. Данные лимфоциты, особенно СТЬ, обладают высокой цитотоксической активностью, которая характеризуется тем, что существует небольшое снижение цитотоксической активности, даже когда лимфоциты подвергают продолжительному культивированию или развитию на протяжении длительного периода времени. Кроме того, в настоящем изобретении предложено лекарственное средство (терапевтический агент), содержа
- 14 010434 щее данные лимфоциты в качестве действующего ингредиента. Главным образом вышеупомянутый терапевтический агент, содержащий данные лимфоциты, соответствующим образом используют в адоптивной иммунотерапии. В адоптивной иммунотерапии лимфоциты, обладающие цитотоксической активностью, подходящей для лечения пациента, вводят пациенту, например, внутривенно. Терапевтический агент может быть получен, например, посредством смешивания лимфоцита, полученного способом согласно изобретению, в качестве действующего ингредиента, например, с известным органическим или неорганическим носителем, подходящим для неперорального введения, эксципиентом, стабилизирующим агентом и пр., в соответствии со способом, известным в области фармакологии. В этой связи, различные условия для данного терапевтического агента, такие как содержание лимфоцита согласно изобретению в терапевтическом агенте и доза терапевтического агента, могут быть определены соответствующим образом согласно известной адоптивной иммунотерапии.
Способ получения цитотоксических лимфоцитов согласно изобретению дополнительно может включать в себя стадию трансдукции чужеродного гена в лимфоцит. Другими словами, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложен способ получения цитотоксических лимфоцитов, включающих в себя стадию трансдукции чужеродного гена в цитотоксический лимфоцит. Здесь термин «чужеродный» относится к тому, что является чужеродным лимфоциту, в который трансдуцируют ген.
Способа получения цитотоксических лимфоцитов согласно изобретению, в особенности способ развития цитотоксических лимфоцитов, усиливает способность репликации ДНК культивируемых лимфоцитов. Следовательно, включение стадии трансдукции гена в способ получения цитотоксических лимфоцитов согласно изобретению может способствовать усилению генной трансдукции.
Способы трансдукции чужеродного гена особым образом не ограничены, и подходящий способ может быть выбран из известного способа трансдукции гена. Стадию трансдукции гена можно проводить на любой заданной стадии во время получения цитотоксических лимфоцитов. Например, предпочтительно проводить данную стадию одновременно с любой стадией вышеупомянутой индукции, обеспечения жизнедеятельности и/или развития лимфоцита, или после данной стадии, с точки зрения производительности труда.
Как вышеупомянутый способ трансдукции гена, любые способы с использованием живого вектора и способы без использования вектора могут быть использованы в настоящем изобретении. Подробности этих способов уже были описаны в многочисленных изданиях.
Вышеупомянутый вирусный вектор особым образом не ограничен, и используют известный вирусный вектор, обычно используемый в способе трансдукции гена, например, ретровирусный вектор, лентивирусный вектор, аденовирусный вектор, аденоассоциированный вирусный вектор, вектор обезьяньего вируса, вектор вируса коровьей оспы, вектор вируса Сендай или пр. Особенно предпочтительно использовать в качестве вирусного вектора ретровирус, аденовирус, аденоассоциированный вирус или обезьяний вирус. В качестве вышеупомянутого вирусного вектора предпочтительными являются векторы, у которых отсутствует способность к репликации, для того, чтобы вирусный вектор не мог самореплицироваться в инфицированной клетке.
Ретровирусный вектор используют для целей генной терапии или пр., поскольку в вектор в хромосомной ДНК клетки может быть стабильно введен чужеродный ген и вектор может быть трансдуцирован. Поскольку данный вектор обладает высоким инфицирующим действием на клетку во время митоза и пролиферации, трансдукцию гена предпочтительно проводят в способе получения цитотоксических лимфоцитов, например, на стадии развития.
В качестве способа трансдукции гена без использования вирусного вектора здесь может быть использован, но особым образом не ограничен, например, способ с использованием носителя, такого как липосома или лиганд-полилизин, способ фосфата кальция, способ электропорации, метод пушки частицами и пр. В этом случае трансдуцированный чужеродный ген включен в плазмидную ДНК или линейную ДНК.
Чужеродный ген, трансдуцированный в цитотоксический лимфоцит, в настоящем изобретении особым образом не ограничен, и может быть выбран произвольный ген, который желательно трансдуцировать в вышеупомянутую клетку. В качестве гена, описанного выше, помимо гена, кодирующего белок (например, фермент, цитокин, рецептор и пр.), может быть использован, например, ген, кодирующий антисмысловую нуклеиновую кислоту или рибозим. Кроме того, одновременно можно трансдуцировать соответствующий маркерный ген, который обладает способностью к селекции клетки, в которую трансдуцирован ген.
Вышеупомянутый чужеродный ген может быть, например, вставлен в вектор, плазмиду и пр., так, чтобы данный чужеродный ген экспрессировался под контролем соответствующего промотора и использовался. Кроме того, для достижения эффективной транскрипции гена в векторе может находиться другой регуляторный элемент, который кооперируется с промотором или сайтом инициации транскрипции, например, энхансерная последовательность или терминальная последовательность. Кроме того, с целью вставки чужеродного гена в хромосому лимфоцита, в который трансдуцируют данный ген путем гомологичной рекомбинации, например, чужеродный ген может быть расположен между фланкирующими по
- 15 010434 следовательностями, включающими нуклеотидные последовательности, гомологичные нуклеотидным последовательностям, расположенным с обеих сторон желаемого целевого сайта вставки данного гена в хромосому. Трансдуцируемый ген может представлять собой ген, встречающийся в природе или полученный искусственным путем, или может представлять собой ген, в котором молекулы ДНК, имеющие происхождение, связаны известным способом, таким как лигирование. Более того, чужеродным геном может быть ген, имеющий последовательность, в которой в природную последовательность введена мутация, в зависимости от его назначения.
В соответствии со способом согласно изобретению, например, ген, кодирующий фермент, ассоциированный с лекарственной устойчивостью, используемый для лечения пациентов, больных раком и пр., трансдуцируют в цитотоксический лимфоцит, тем самым придавая лимфоциту устойчивость к лекарственному средству. В том случае, если используют цитотоксический лимфоцит, описанный выше, адоптивная иммунотерапия и лекарственная терапия могут быть объединены, и, следовательно, может быть достигнут более высокий терапевтический эффект. Ген устойчивости к лекарственным средствам иллюстрируется, например, геном устойчивости ко многим лекарственным средствам.
С другой стороны, в отличие от вышеупомянутого варианта осуществления, ген трансдуцируют в лимфоцит с тем, чтобы придать чувствительность к определенному лекарственному средству, тем самым придавая чувствительность к данному лекарственному средству. В этом случае лимфоцит после трансплантации в живой организм может быть удален посредством введения данного лекарственного средства. Ген, придающий чувствительность к лекарственному средству, иллюстрируется, например, геном тимидинкиназны.
Примеры
Настоящее изобретение будет более конкретно описано примерами, не ограничивающими объем настоящего изобретения.
Препаративный пример 1. Получение фрагмента фибронектина.
(1) Получение фрагмента фибронектина.
Фрагмент Н-271, полученный из фибронектина человека, получали из ЕксйепсЫа со11 ΗΒ101/ρΗΌ101 (РЕЕМ ВР-2264) в соответствии со способом, описанным в патенте США № 5198423.
Кроме того, фрагменты Н-296, СН-271 и СН-296, полученные из фибронектина человека, каждый получали из культуры, получаемой культивированием ЕксйепсЫа со11 ΗΒ101/ρΗΌ102 (РЕЕМ ВР-7420), ЕксйепсЫа соИ ΗΒ101/ρ^101 (РЕЕМ ВР-2799) или ЕзсйепсЫа со11 ΗΒ101/ρ№102 (РЕЕМ ВР-2800), в соответствии со способом, описанным в вышеупомянутом бюллетене.
Фрагмент С-274, полученный из фибронектина человека, получали из культуры, полученной культивированием ЕксйепсЫа со11 ^М109/ρΤР7221 (РЕЕМ ВР-1915), в соответствии со способом, описанным в патенте США № 5102988.
Фрагмент С-С81, полученный из фибронектина человека, получали из культуры, получаемой культивированием ЕксйепсЫа со11 ΗΒ101/ρС825 (РЕЕМ ВР-5723) в соответствии со способом, описанным в Бюллетене патентов Японии № 3104178.
Каждый фрагмент ΟΗν-89 и ΟΗν-179, полученный из фибронектина человека, получали из культуры, полученной культивированием ЕксйепсЫа со11 ΗΒ101/ρСΗV89 (РЕЕМ Р-12182) или ЕксйепсЫа со11 ΗΒ101/ρСΗV179 (РЕЕМ Р-12183), в соответствии со способом, описанным в Бюллетене патентов Японии № 2729712.
Кроме того, ΟΗν-90, фрагмент, извлеченный из фибронектина человека, готовили в соответствии со способом, описанным в Бюллетене патентов Японии № 2729712. Конкретно, плазмиду ρΟΗν90 конструировали в соответствии с методикой, описанной в бюллетене, и после этого культивировали трансформант несущий плазмиду, и из культуры получали ΟΗν-90.
Фрагмент ΟΗν-181, полученный из фибронектина человека, получали путем конструирования плазмиды (ρί.Ήν181). содержащей ДНК, кодирующую ΟΗν-181, в соответствии со способом, описанным в \У0 97/18318, с последующим культивированием ЕксйепсЫа со11 ΗΒ101/ρСΗV181, в которую вводили данную плазмиду, и фрагмент получали из культуры так же, как для вышеуказанного ΟΗν-179.
(2) Получение ΟΗν-92
Как и в случае плазмиды ρΟΗν181 для экспрессии вышеуказанного полипептида ΟΗν-181, была сконструирована плазмида ΟΗν92 с делецией в области кодирования ΙΙΙ-13 области в области кодирования ΟΗν-181. Процедуру получения делеции осуществляли в соответствии со способами получения делеции кодирующей области ΙΙΙ-14 из плазмиды ρΟΗν179, как описано в патенте Японии Са/еИе № 2729712.
ЕксйепсЫа со11 ПВ101 (ЕксйепсЫа со11 ΗΒ101/ρСΗV92), трансформированную вышеупомянутой плазмидой ρΟΗν92, культивировали, и осуществляли процедуры очиски в соответствии со способом очистки полипептида ΟΗν-89, описанным в патенте Японии Са/еИе № 2729712, с получением из полученной культуры чистого препарата ΟΗν-92.
(3) Получение Η-275-Ογ§.
Плазмиду для экспрессии полипептида Η-275-Ονδ конструировали в соответствии с нижеуказанными способами. Конкретно, плазмиду рСН102 получали из ЕксйепсЫа со11 НВ101/рСН102 (РЕЕМ ВР
- 16 010434
2800). РСК. проводили, используя праймер 128 с нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕЦ 10 N0: 20 в списке последовательностей, и праймер 14А с нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 21 в списке последовательностей, с вышеуказанной плазмидой в качестве образца, с получением фрагмента ДНК размером приблизительно 0,8 т.п.н., кодирущего гепаринсвязывающий полипептид фибронектина. Полученный фрагмент ДНК расщепляли ΝοοΙ и ВатН1 (оба производятся Такага Βίο Шс.); и затем лигировали с ρТV118N (производство Такага Βίο !пс.). расщепленной NсοI и ВатН1, для получения плазмиды рКН1.
Плазмидный вектор ρΙΝΙΙΙ-отрА! [СйтауеЬ 1. с1 а1., ЕМВО 1., 3(10), 2437-2442 (1984)] расщепляли ВатН1 и НшсП (производство Такага Βίο Шс.), собирали фрагмент ДНК размером около 0,9 т.п.н., содержащий концевую область липопротеина. Этот фрагмент смешивали и лигировали с вышеупомянутой плазмидой рКН1, которую расщепляли ВатШ и Н1пс[[, с получением плазмиды рКН1-Т, содержащей 1ас-промотор, фрагмент ДНК, кодирующий гепарин связывающий полипептид и концевую область липопротеина, в указанном порядке.
Взаимодействие для РСК осуществляли, используя праймер Сук-А с нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 22 в списке последовательностей, и праймер Сук-8 с нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 23 в списке последовательностей с этой плазмидой рКН1-Т в качестве образца. После этого, собранный амплифицированный фрагмент ДНК расщепляли №Й (производство Такага Вю Шс.), и фрагмент ДНК затем лигировался сам на себя. Циклическую ДНК, полученную таким образом, расщепляли 8ре[ и 8са! (производство Такага Вю Ечс.) с получением фрагмента ДНК размеров 2,3 т.п.н., и полученный фрагмент смешивали и лигировали с фрагментов ДНК размером 2,5 т.п.н., полуенным при расщеплении плазмиды рКН1-Т 8ρеI и 8саI (производство Такага Вю Ιηο), с получением плазмиды рКН-Сук. Плазмида кодирует полипептид Н-275-Сук, в котором в N концевую часть вышеупомянутого Н-271 были добавлены четыре аминокислоты Ме1-А1а-А1а-8ет, а в Сконец Н-271 был добавлен дополнительный Сук.
Полипептид Н-275-Сук получали следующим способом.
ЕксйепсЫа сοI^ НВ 101 трансформировали вышеупомянутой плазмидой рКН-Сук (ЕксйепсЫа сοI^ НВ101/рКН-Сук), культивировали в течение ночи при 37°С в 120 мл среды ЬВ. Клетки, собранные из клеточной культуры, суспендировали в 40 мл буфере для лизиса (50 мМ ТП8-НС1, 1 мМ ЕЭТА, 150 мМ №С1, 1 мМ ЭТТ, 1 мМ РМ8Р, рН 7,5) и суспензию подвергали обработке ультрафиолетом для разрушения клеток. Супернатант, полученный центрифугированием, помещали на колонку ШТтар-гепарин (производство Рйаттааа), уравновешенную буфером для очистки (50 мМ Тпк-НС1, рН 7,5). Неадсорбированную на колоке фракцию промывали тем же буфером и затем проводили элюирование буфером для очистки, содержащим концентрационный градиент 0-1 М №С1. Элюат анализировали с помощью электрофореза на 8Э8-полиакриламидном геле, и фракции, соответствующие молекулярной массе Н-275-Сук, собирали, получая очищенный препарат Н-275-Сук.
Пример 1. Коэффициент СЭ8-положительных клеток в СТЬ-клетках.
(1) Выделение и хранение клеток РВМС.
У здоровых индивидуальных доноров собирали компонент крови, содержащий НЬА-А2,1, полученный на основании имеющейся информации. Собранный компонент крови 2-кратно разбавляли РВ8(-), помещали на Ρ^сο11-ρа^ие (производство Рйатташа) и центрифугировали при 500 х д в течение 20 мин. В среднем слое пипеткой собирали мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и промывали. Собранные РВМС суспенидровали в растворе для хранения, содержащем 90% РВ8 (производство Вю ^Ыйакет)/10% ΌΜ80 (производство 8ЮМА), и хранили в жидком азоте. В течение индукции СТЬ, хранящиеся РВМС быстро размораживали на водяной бане при 37°С и промывали средой КРΜI 1640 (производство Вю ^Ыйакет), содержащей 10 мкг/мл Ипаке (производство Са1Ьюс11ет). После этого с помощью метода окрашивания трипановым синим подсчитывали количество живых клеток, и клетки использовали в каждом эксперименте.
(2) Индукция СТЬ памяти против вируса гриппа.
Индукцию СТЬ памяти против вируса гриппа осуществляли, частично изменяя способ Вейпатек е1 а1. [1. Iттиηο1οду, 147(12), 4047-4053 (1991)]. Конкретно, РВМС, полученные в пункте (1) примера 2, суспенировали в среде КРΜI 1640 (производство Вю ^Ыйакет), содержащей 5% сыворотки человека АВ-типа, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ Ь-глутамина (вышеуказанные вещества были произведены Вю ^Ыйакет), 10 мМ НЕРЕ8 (производство Nака1а^ (сксщс), 1% стрептомицина-пенициллина (производство Οί^ο ВКЬ) (называемые здесь просто «5НКРМЬ>) так, чтобы концентрация составляла от 1 до 4 х 106 клеток/мл. После этого суспензию помещали в 24-луночный планшет для культуры клеток (производство Ρа1сοη) в объеме 1 мл/лунку, и клетки инкубировали во влажном инкубаторе с 5% С02 при 37°С в течение 1,5 ч для отделения моноцитов, адгезированных на пластике. После этого неадгезированные клетки собирали, используя среду КРΜI 1640, и хранили на льду как прореагировавшие клетки. Для выделения моноцитов добавляли 0,5 мл каждого 5НКРМТ, содержащего в качестве антигена пептида 5 мкг/мл эпитопа пептида, полученного из белка вируса гриппа (А2,1связывающий пептид получали из белка матрикса, последовательность которого показана в 8ЕЦ ΙΌ N0:
- 17 010434 в списке последовательностей), и 1 мгк/мл микроглобулина β2 (производство 8спр§). Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч и затем клетки облучали рентгеновскими лучами (5500К), с получением антигенпредставляющих клеток. Раствор пептида удаляли отсасыванием из каждой лунки, и лунки промывали средой ΚΡΜΙ 1640. После этого прореагировавшие клетки, которые до этого хранили на льду, аспирировали в 5ΗΚΡΜΙ, так, чтобы концентрация составляла от 0,5 до 2 х 106 клеток/мл, и суспензию добавляли к антигенпредставляющим клеткам в количестве 1 мл на лунку. В это время каждый фрагмент фибронектина (здесь называемый «ΕΝίϊ»), описанный в получении в примере 1, добавляли так, чтобы конечная концентрация составила 10 мкг/мл. Группу без добавления ΕΝίϊ определяли как контроль. Планшет культивировали при 37°С в присутствии 5% СЭ2. На второй день после инициации культуры в каждую лунку добавляли по 1 мл 5ΗΚΡΜΙ, содержащего 60 Ед/мл 1Ь-2 (производство 8й1опод1 & Со., Ыб.) и 10 цд/мл ΕΝίτ (контроль содержал только 1Ь-2). Также на пятый день удаляли половину супернатанта культуры и добавляли по 1 мл каждой среды, содержащей 1Ь-2 и ΕΝίτ (контроль содержал только 1Ь-2), таким же образом, как указано выше. На седьмой день антигенпредставляющие клетки получали тем же способом, что и описанный выше, и затем прореагировавшие клетки, которые культивировали в течение одной недели, суспендировали в 5ΗΚΡΜΙ, так, чтобы концентрация составила от 0,5 до 2 х 106 клеток/мл. К антигенпредставляющим клеткам, полученным в количестве 1 мл/лунку, добавляли суспензию для повторной стимуляции. Вместе с суспензией к ним добавляли ΕΝίτ, так, чтобы окончательная концентрация составила 10 мкг/мл (добавление в контроль не осуществляли). На седьмой день после повторной стимуляции к каждой лунке добавляли 1 мл 5ΗΚΡΜΙ, содержащего 60 Ед/мл 1Ь-2 и 10 мкг/мл ΕΝίτ (контроль содержал только ΙΕ-2). Также на пятый день половину супернатанта культуры удаляли и добавляли по 1 мл каждой среды, содержащей те же компоненты, как и перед удалением. Культуру культивировали еще два дня, таким образом, индуцируя СТЬ.
(3) Определение цитотоксической активности СТЬ Цитотоксическую активность СТЬ, полученных в пункте (2) примера 1, на четырнадцатый день после первичной индукции оценивали способом определения цитотоксической активности, используя кальцеин-АМ [К. ЫсЫейей с1 а1., ί. Ιιηιηι.ιηο1ο§κα1 Μοίΐιобк, 172(2), 227-239 (1994)]. В-клетки, трансформированные ЕВУ и содержащие НЬА-А2,1 (название клеток: 221А2.1), которые культивировали в течение ночи вместе с этитопом пептида или в отсутствии эпитопа пептида, суспендировали в среде ΚΡΚΙ 1640, содержащей 5% ЕВ8 (производство Вю ^Ыйакег) так, чтобы концентрация составила 1 х 106 клеток/мл. После этого к суспензии добавляли кальцеин-АМ (производство ЦоШе), так, чтобы окончательная концентрация составила 25 мкМ, и клетки культивировали при 37°С в течение 1 ч. Клетки промывали средой, не содержащей кальцеин-АМ, и затем смешивали с К562-клетками (АТСС ССЬ-243) в количестве 20 больше, чем клеток, с получением клетокмишеней, меченных кальцеином. К562-клетки использовали для исключения неспецифической цитотоксической активности ΝΚ-клеток, находящихся в смеси с прореагировавшими клетками.
СТЬ памяти, полученные в пункте (2) примера 1, поэтапно разбавляли 5ΗΚΡΜΙ так, чтобы концентрация составляла от 1 х 105 до 9 х 106 клеток/мл, как эффекторные клетки. После этого каждое разведение переносили в каждую лунку 96-луночного планшета для культуры клеток в количестве 100 мкл/лунку. В лунки добавляли клетки-мишени, меченные кальцеином, с получением коцентрации 1 х 105 клеток/мл в количестве 100 мкл/лунку в каждой. Планшет, содержащий вышеуказанную клеточную суспензию, центрифугировали при 400 х д в течение 1 мин, и затем инкубировали во влажном инкубаторе с СО2 при 37°С в течение 4 ч. Через 4 ч из каждой лунки отбирали 100 мкл супернатанта культуры, и количество высвобожденного кальцеина (интенсивность флуоресценции) в супернатант культуры определяли, используя флуоресцентный счетчик для планшетов (485 нм/538 нм). Цитотоксическую активность СТЬ подсчитывали с помощью следующего равенства 1:
Равенство 1. Цитотоксическая активность (%) = [(найденное значение в каждой лунке - минимальное высвобожденное количество)/(максимальное высвобожденное количество - минимальное высвобожденное количество)] х 100.
В вышеуказанном равенстве минимальное высвобожденное количество представляет собой количество высвобожденного кальцеина в лунке, содержащей только клетки-мишени и К562 клетки, что показывает количество естественно освобожденного кальцеина из клеток-мишеней. Кроме того, максимальное высвобожденное количество представляет собой количество высвобожденного кальцеина при полном лизисе клеток при добавлении к клеткам-мишеням 0,1% поверхностно-активного вещества Тгйоп X100 (производство Ν;·ι1<;·ι1;·ιί (екдие). В результате цитотоксическая активность индуцировалась сразу после индукции, но была значительная разница между цитотоксической активностью при добавлении ΕΝίτ в процессе индукции или в его отсутствие.
(4) Определение относительного содержания СЦ8-положительных клеток в клеточной популяции СТЬ.
СТЬ, которые были получены в пункте (2) примера 1, в количестве 2 х 105 клеток, фиксировали ΡВ8 (производство Νικκυι), содержащим 1% параформальдегида (производство ЫакаЫ (екдие), и затем промывали ΡВ8. Зафиксированные клетки суспендировали в 100 мкл ΡВ8, содержащего 1% В8А (производство 8ΙΟΜΑ), и добавляли ^С1 мыши, меченный ΕIТС или мышиное антитело против человеческого
- 18 010434
ί.Ό8. меченное ПТС (оба произведены ИАКО), а затем смесь инкубировали на льду в течение 30 мин. После инкубации клетки промывали РВ8 и снова суспендировали в РВ8, содержащем 1% параформальдегида. Клетки подвергали проточной цитометрии, используя РАС8 УаШаде (производство Вес!оп И1скίηκοη), и определяли относительное содержание СЭ8-положительных клеток. Результаты показаны на табл. 1.
Таблица 1
Фрагмент фибронектина Относительное содержание
СО8-положительных клеток <υ
| Контроль (без добавления ГИ£г) | 60,2 |
| СН-296 | 88,8 |
| СН-271 | 65,7 |
| Н-271 | 81,4 |
| С-274 | 86,2 |
| Η-275-Сув | 79, 0 |
| СНУ-8 9 | 70,2 |
| СНУ-90 | 77,0 |
| СНУ-181 | 73,1 |
| Контроль(без добавления ЕЫ£г) | 33,0 |
| Н-296 | 40,1 |
| С-С51 | 41,6 |
| СНУ-92 | 44, 0 |
| СНУ-179 | 37,8 |
Как показано в табл. 1, в группе с добавлением различных фрагментов фибронектина в процессе индукции СТЬ процент СИ8-положительных клеток на четырнадцатый день после первичной индукции СТЬ был высоким по сравнению со значением в контроле без добавления этих фрагментов фибронектина. Другими словами, было определено, что СТЬ могут быть индуцированы с большей пролиферативной активностью СИ8-положительных клеток в присутствии фрагмента фибронектина.
Пример 2. Индукция экспрессии рецепторов интерлейкина-2.
(1) Индукция СТЬ памяти против вируса гриппа.
Индукцию СТЬ памяти против вируса гриппа проводили тем же способом, описанным в пункте (2) примера 1, используя РВМС, которые выделяли и хранили так же, как описано в пункте (1) примера 1. Цитотоксическая активность СТЬ на четырнадцатый день после первичной индукции оценивали тем же способом, описанным в пункте (3) примера 1. В результате не было получено значительных различий между цитотоксической активностью при добавлении ΡΝίτ в процессе индукции или в его отсутствие.
(2) Определение процента экспрессии рецепторов интерлейкина -2 в СТЬ.
Процент экспрессии рецепторов интерлейкина-2 ЦЬ^В) в СТЬ, полученных в пункте (1) примера 2 на четырнадцатый день после первичной индукции, определяли в соответствии со способом, описанным в пункте (4) примера 1. Здесь, в этом способе, мышиное антитело против человеческого СИ8, меченное ПТС, меняли на мышиное антитело против человеческого ^-2^(0025), меченное ПТС (производство ИАКО). Результаты представлены в табл. 2.
Таблица 2
| Фрагмент | фибронектина | Процент содержания клеток, экспрессирующих ΙΣ-2Ε (%} |
| Контроль | (без добавления ГЫ£г) | 29,8 |
| СН-296 | 65,9 | |
| Н-296 | 59,4 | |
| Н-271 | 54,6 | |
| С-274 | 61,5 | |
| Η-275-Суз | 78,2 | |
| СНУ-89 | 82,3 | |
| СНУ-90 | 48,3 | |
| СНУ-92 | 55,6 | |
| СНУ-179 | 50,3 | |
| СНУ-181 | 44,8 | |
| Контроль | (без добавления Гй£г) | 46, 9 |
| СН-271 | 60,9 | |
| С-С31 | 72,3 |
Как показано в табл. 2, во всех случаях индукции СТЬ путем добавления различных фрагментов фибронектина в клетках популяции наблюдалось увеличение процента экспрессии Π-ΣΗ. Другими сло
- 19 010434 вами, было определено, что СТЬ могут быть индуцированы с большим уровнем экспрессии ГЬ-2К при проведении индукции в присутствии фрагмента фибронектина.
Пример 3. Экспансия СТЬ.
(1) Индукция СТЬ памяти против вируса гриппа.
Индукцию СТЬ памяти против вируса гриппа проводили тем же способом, описанным в пункте (2) примера 1, используя РВМС, которые выделяли и хранили так же, как описано в пункте (1) примера 1. Цитотоксическая активность СТЬ на четырнадцатый день после первичной индукции оценивали тем же способом, описанным в пункте (3) примера 1. В результате не было получено значительных различий между цитотоксической активностью при добавлении РЖг в процессе индукции или в его отсутствие.
(2) Экспансия СТЬ.
СТЬ, полученные в пункте (1) примера 3, промывали 5НΚРΜI и затем суспендировали с получением суспензии с концентрацией 3 х 104 клеток/мл. В это время аллогенные РВМС, не содержание НЬАА2,1, которые собирали тем же способом, описанным в пункте (1) примера 1, облучали рентгеновскими лучами (3300В), и клетки промывали средой и суспендировали с получением суспензии с концентрацией от 2 до 5 х 106 клеток/мл. Эти СТЬ (3 х 104 клетки) и аллогенные РВМС (от 4 до 10 х 106 клеток) суспендировали в 10 мл 5НΚРΜI или среды ΚΡΜΙ 1640 (производство Βίο ^Ыйакег), содержащей 10% Нус1опе ΡΒ8, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ Ь-глутамина (все произведены Βίο ^Ыйакег), 10 мМ НЕРЕ8 (производство пака1а1 1ечцие) и 1% стрептомицин-пенициллина (производство 61Ьсо ВВЬ) (здесь называемой просто 10Нус1опеВРМ[) и затем добавляли анти-СБ3-антитело (производство 1ап5чеп-Куотеа) так, чтобы конечная концентрация составляла 50 нг/мл. Смесь помещали в колбу объемом 12,5 см2 (производство Ра1соп), и клетки культивировали во влажном инкубаторе с С02 при 37°С в течение 14 дней. В процессе культивирования добавляли РШг. так, чтобы конечная концентрация составляла 10 мкг/мл, что было аналогично добавлению в процессе индукции СТЬ. Также к контрольной группе, где индукцию проводили без добавления Р№г, РШг не добавляли. При этом культивировании для стимуляции совсем не добавляли пептид. На первый день после начала экспансии добавляли ГЬ-2, так, чтобы конечная концентрация составляла 120 Ед/мл. Кроме того, на четвертый день после инициализации культуры и в последующие дни через каждые 2-3 дня проводили процедуру удаления половины супернатанта культуры и затем добавления 5 мл 5НΚРΜI, содержащей 60 Ед/мл ГЬ-2 или ЮНуДопеКРМф в каждую колбу. В процессе культивирования РШг в той же концентрации добавляли к среде в группе, где был добавлен РШг. На четырнадцатый день после начала экспансии цитотоксическую активность СТЬ определяли тем же способом, описанным в пункте (3) примера 1. Степень, при которой сохранялась цитотоксическая активность перед экспансией, рассчитывали как «поддержание цитотоксической активности (%)».
«Поддержание цитотоксической активности (%)» рассчитывали в соответствии со следующим равенством 2.
Равенство 2. Поддержание цитотоксической активности (%) = [цитотоксическая активность (%) после экспансии/цитотоксическая активность (%) перед экспансией] х 100.
Полученные результаты представлены в табл. 3. В табл. отношение Е/Т означает отношение числа эффекторных клеток (Е) к числу клеток-мишеней (Т).
- 20 010434
Таблица 3
| Среда | Фрагмент | фибронектина | Поддержание цитотоксической | ||
| активности отношение Е/Т = | (¾) 3 | ||||
| 5ΗΚΡΜΙ | контроль | (без | добавления | 17,3 | |
| ГЫ£г) | |||||
| СН-271 | 53,5 | ||||
| Н-296 | 49, 3 | ||||
| С-С31 | 49,3 | ||||
| СНУ-92 | 66,2 | ||||
| 10Нус1опеКРМ1 | контроль | (без | добавления | 48,1 | |
| ГКГг) | |||||
| СН-271 | 250,8 | ||||
| Н-296 | 162,3 | ||||
| Н-271 | 72,2 | ||||
| С-С31 | 100,2 | ||||
| СНУ-92 | 157,8 | ||||
| Среда | Фрагмент | фибронектина | Поддержание |
цитотоксической активности (%) отношение Е/Т = 10
| 10Нус1опеНРМ1 | контроль (без добавления | 46,3 |
| ΓΝ£γ) | ||
| СНУ-89 | 69, 0 | |
| СНУ-90 | 75,6 | |
| Среда | Фрагмент фибронектина | Поддержание |
цитотоксическом активности (%) отношение Е/Т = 3
| 10Нус1опеР.РМ1 | контроль ЕП£г) СН-296 | (без | добавления | 70, 4 113,5 |
| 10Нус1опеКРМ1 | контроль | (без | добавления | 79,3 |
| ЕЫ£г) | ||||
| СНУ-179 | 190, 0 | |||
| СНУ-181 | 94,5 |
Как показано в табл. 3, специфическая высокоэффективная цитотоксическая активность СТЬ в группе с добавлением различных фрагментов фибронектина во время индукции и экспансии, поддерживалась даже после экспансии в течение 14 дней по сравнению с активностью в контроле без добавления фрагмента фибронектина. Другими словами, было определено, что СТЬ могут экспансироваться в состоянии, при котором в течение долгого периода времени сохраняется высокая цитотоксическая активность при проведении индукция и экспансии в присутствии фрагмента фибронектина.
Пример 4. Экспрессия 1Ь-2К в клеточной популяции после экспансии СТЬ.
(1) Индукция СТЬ памяти против вируса гриппа.
Индукцию СТЬ памяти против вируса гриппа проводили тем же способом, описанным в пункте (2) примера 1, используя РВМС, которые выделяли и хранили так же, как описано в пункте (1) примера 1. Цитотоксическая активность СТЬ на четырнадцатый день после первичной индукции оценивали тем же способом, описанным в пункт (3) примера 1. В результате не было получено значительных различий между цитотоксической активностью при добавлении ΡΝίτ в процессе индукции или в его отсутствие.
(2) Определение показателя экспрессии рецепторов интерлейкина -2 в экспансированных СТЬ.
СТЬ, полученные в пункте (1) примера 4, экспансировали тем же способом, описанным в пункте (2) примера 3. Процент клеток с экспрессией 1Ь-2К определяли для СТЬ после экспансии, полученных тем же способом, что и в пункте (2) примера 2. Результаты представлены в табл. 4.
- 21 010434
Таблица 4
Фрагмент фибронектина Относительное содержание клеток, экспрессирующих 1Ь2К (%)
| Контроль (без добавления ГЫТг) | 19,5 |
| СН-271 | 45,3 |
| Н-296 | 47,7 |
| Н-271 | 43,3 |
| С-274 | 53, 5 |
| С-СЗ | 39,7 |
| СНУ-891 | 28,6 |
| СНУ-90 | 60,0 |
| СНУ-179 | 53,7 |
| СНУ-181 | 50,3 |
| Контроль СН-296 | (без | добавления | ΓΝ£γ) | 26,8 36,1 |
| Контроль | (без | добавления | РМг) | 18,4 |
| Η-275-Суз | 56,5 | |||
| СНУ-92 | 59,9 |
Как показано в табл. 4, во всех группах с добавлением различных фрагментов фибронектина во время индукции и экспансии СТЬ наблюдалось увеличение в клеточной популяции процента клеток, экспрессирующих ΙΤ-2Κ
Другими словами, было определено, что СТЬ могут быть экспансированы с повышенным уровнем экспрессии ΙΕ-2Κ при проведении индукции и экспансии СТЬ в присутствии фрагмента фибронектина.
Пример 5. Индукция и экспансия СТЬ в присутствии фибронектина.
(1) Индукция СТЬ памяти против вируса гриппа.
Индукцию СТЬ памяти против вируса гриппа проводили тем же способом, описанным в пункте (2) примера 1, используя РВМС, которые выделяли и хранили так же, как описано в пункте (1) примера 1. При индукции фибронектина (производство Са1Ьюсйет), в планшет добавляли ЕНГг, так, чтобы конечная концентрация составляла 10 мкг/мл (в контроле добавление не проводили). Цитотоксическую активность СТЬ определяли на четырнадцатый день после начала индукции тем же способом, описанным в пункте (3) примера 1. В результате не было получено значительных различий между цитотоксической активностью при добавлении фибронектина в процессе индукции или в его отсутствие.
(2) Определение процента экспрессии рецепторов интерлейкина -2 в СТЬ.
Процент клеток, экспрессирующих ΙΕ-2Κ, определяли на СТЬ, полученных в пункте (1) примера 5 тем же способом, описанным в пункте (2) примера 2. Результаты показаны в табл. 5.
Таблица 5
Фибронектин Процент содержания клеток, экспрессирующих 1Ь-2К (%)
Контроль {без добавления 34,0 фибронектина)
Фибронектин 64,6
Как показано в табл. 5, в СТЬ, индуцированных в присутствии фибронектина, наблюдалось увеличение уровня экспрессии ΙΕ-2Κ в клетках популяции.
Другими словами, было определено, что СТЬ могут быть индуцированы с повышенным уровнем экспрессии ΙΕ-2Κ при проведении индукции СТЬ в присутствии фрагмента фибронектина.
(3) Экспансия СТЬ.
СТЬ, полученные в пункте (1) примера 5, экспансировали тем же способом, описанным в пункте (2) примера 3. Во время экспансии к группе, в которую во время индукции был добавлен фибронектин, добавляли фибронектин (производство Са1Ыосйет), так, чтобы окончательная концентрация составляла 10 мкг/мл (добавление в контроль не осуществлялось). Цитотоксическую активность полученных СТЬ определяли тем же способом, описанным в пункте (3) примера 1, и степень поддержания цитотоксической активности до экспансии подсчитывали как «поддержание цитотоксической активности (%)».
Полученные результаты представлены в табл. 6.
- 22 010434
Таблица 6
| Фибронектин | Поддержание активности Е/Т = 3 | цитотоксической (%) отношение |
| Контроль (без | добавления | 48,1 |
| фибронектина) | ||
| Фибронектин | 148,9 |
Как показано в табл. 6, группа, в которой индукция и экспансия СТЬ проводилась в присутствии фибронектина, сохранялась высокая цитотоксическая активность. С другой стороны, цитотоксическая активность в контроле, без добавления фибронектина во время индукции и экспансии СТЬ, была несомненно ниже. Другими словами, было определено, что СТЬ могут экспансироваться в состоянии, при котором в течение долгого времени периода сохраняется специфическая цитотоксическая активность, при добавлении фибронектина во время индукции и экспансии СТЬ.
Пример 6. Экспансия СТЬ в присутствии иммобилизованного фрагмента фибронектина (ΡΝ).
(1) Иммобилизация фрагмента ΡΝ.
Фрагмент фибронектина иммобилизовали на приспособлении (сосуде) для культивирования, используя нижеследующий эксперимент. Конкретно, в каждую лунку 24-луночного планшета для культуры клеток и в 12,5 см2 колбу добавляли РВ8, содержащий различные фрагменты фибронектина (окончательная концентрация: 10 мкг/мл) в количестве от 1 до 2 мл. Планшет и колбу инкубировали при комнатной температуре в течение 5 ч, и затем хранили при 4°С перед использованием. Кроме того, перед использованием планшет и колбу дважды промывали РВ8.
(2) Индукция СТЬ памяти против вируса гриппа.
Индукция СТЬ памяти против вируса гриппа осуществляли в соответствии со способом, описанным в пункте (2) примера 1, используя выделенные РВМС, и хранили в соответствии со способом, описанным в пункте (1) примера 1. Во время индукции в качестве приспособления использовали планшет с иммобилизованным ΡΝίτ (для контроля использовали планшет без иммобилизованного ΡΝίτ). Цитотоксическую активность СТЬ после индукции оценивали тем же способом, описанным в пункте (3) примера 1. В результате не было получено значительных различий между цитотоксической активностью в присутствии или в отсутствие иммобилизованного на планшете ΡΝίτ в процессе индукции.
(3) Экспансия СТЬ.
СТЬ, полученные в пункте (2) примера 6, экспансировали тем же способом, описанным в пункте (2) примера 3. Во время экспансии в качестве приспособления для культуры использовали колбы с различными иммобилизованными на них ΡΝίτ (для контроля использовали планшет без иммобилизованного ΡΝίτ). Кроме того, в качестве среды использовали среду 10Нус1опеКРМ1.
Степень, в которой сохранялась цитотоксическая активность СТЬ, экспансированных таким образом, по сравнению с активностью до экспансии оценивали как «поддержание цитотоксической активности (%)».
Полученные результаты представлены в табл. 7.
Таблица 7
| Фрагмент фибронектина | Поддержание | цитотоксической |
| активности | (¾) отношение | |
| Е/Т = 3 | ||
| Контроль (без иммобилизации ГЫЕг) | 4Э, 1 | |
| СН-271 | 95,4 | |
| Н-296 | 95,0 | |
| Н-271 | 133,9 | |
| С-С31 | 73,3 | |
| Η-275-Суз | 137,7 | |
| СНУ-92 | 92, 7 |
Контроль (без иммобилизации ЕЫ£г) 18,7
СН296 67,4
- 23 010434
| С-С31 | 78,5 |
| СНУ-89 | 90, 3 |
| СНУ-90 | 73,0 |
| СНУ-179 | 112,5 |
| СНУ-181 | 25, 6 |
Как показано в табл. 7, в группе, в которой во время индукции и экспансии СТЬ использовалось приспособление для клеточной культуры (планшет, колба) с иммобилизованным фрагментом фибронектина, СТЬ сохраняли специфическую высокую цитотоксическую активность даже после экспансии. С другой стороны, в контроле, в котором во время индукции и экспансии СТЬ использовалось приспособление для клеточной культуры (планшет, колба) без иммобилизованного фрагмента фибронектина, цитотоксическая активность была заметно ниже. Другими словами, было определено, что СТЬ могут экспансироваться в состоянии, при котором в течение долгого периода сохраняется высокая цитотоксическая активность по сравнению со случаем, когда фрагмент растворяли в среде, используя иммобилизованный фрагмент фибронектина.
Пример 7. Процент содержания СЭЗ-положительных клеток в клеточной популяции после экспансии СТЬ.
(1) Индукция СТЬ памяти против вируса гриппа.
Индукцию СТЬ памяти против вируса гриппа проводили тем же способом, описанным в пункте (2) примера 1, используя РВМС, которые выделяли и хранили так же, как описано в пункте (1) примера 1. Цитотоксическую активность СТЬ на четырнадцатый день после первичной индукции оценивали тем же способом, описанным в пункте (3) примера 1. В результате не было получено значительных различий между цитотоксической активностью при добавлении ΡΝ& в процессе индукции или в его отсутствие.
(2) Определение процента содержания СЦ8-положительных в экспансированных СТЬ.
СТЬ, полученные в пункте (1) примера 7, экспансировали тем же способом, описанным в пункте (2) примера 3. Процент содержания СЦ8-положительных клеток определяли в СТЬ после экспансии, полученных тем же способом, описанным в пункте (4) примера 1. Результаты представлены в табл. 8.
Таблица 8
| Фрагмент | фибронектина | Процент содержания | С68- | ||
| положительных клеток | (%> | ||||
| Контроль | (без | добавления | ГК£г) | 40,9 | |
| СН-296 | 85,1 | ||||
| СН-271 | 72,1 | ||||
| Н-271 | 83, 9 | ||||
| Контроль | (без | добавления | ΓΝίτ) | 75,4 | |
| Н-296 | 87,2 | ||||
| С-С31 | 86,5 | ||||
| Контроль | (без | добавления | ГЯ£г) | 33,4 | |
| СНУ-90 | 72, 9 | ||||
| СНУ-92 | 51,6 | ||||
| СНУ-179 | 57 | ||||
| СНУ-131 | 63,5 |
Как показано в табл. 8, во всех группах с добавлением различных фрагментов фибронектина во время индукции и экспансии СТЬ наблюдали увеличение процента содержания СЦ8-положительных клеток в клеточной популяции после экспансии.
Другими словами, было определено, что СТЬ могут быть экспансированы со значительной пролиферацией СЦ8-положительных клеток при проведении индукции и экспансии СТЬ в присутствии фрагмента фибронектина.
Пример 8. Индукция экспрессии рецепторов интерлейкина-2 в СТЬ, индуцированных в присутствии иммобилизоавнных фрагментов фибронектина.
(1) Иммобилизация фрагмента ΡΝ.
Фрагмент фибронектина иммобилизировали на приспособлении для культуры клеток (сосуд) тем же способом, как описано в пункте (1) примера 6.
(2) Индукция СТЬ памяти против вируса гриппа.
Индукцию СТЬ памяти против вируса гриппа осуществляли в соответствии со способом, описанным в пункте (2) примера 1, используя РВМС, которые выделяли и хранили в соответствии со способом,
- 24 010434 описанным в пункте (1) примера 1. Во время индукции использовали планшет с иммобилизированными ΕΝίϊ. как в пункте (1) примера 8, в качестве приспособления для культуры клеток (для контроля использовали планшет без иммоблизированного ΕΝίϊ). Цитотоксическую активность СТЬ после индукции оценивали тем же способом, как описано в пункте (3) примера 1. В результате не было получено значительных различий между цитотоксической активностью в присутствии или в отсутствие иммоблизированного ΕΝίϊ на планшете в процессе индукции. (3) Экспансия СТЬ.
СТЬ, полученные в пункте (2) примера 8, экспансировали тем же способом, как описано в пункте (2) примера 3. Во время экспансии, в качестве приспособления для культуры клеток использовали колбу с иммобилизированными на ней ΕΝίϊ, полученную в пункте (1) примера 8, (для контроля использовали планшет без иммоблизированного ΕΝίϊ). Кроме того, в качестве среды использовали 10Нус1опеКРМ1.
Процент клеток, экспрессирующих 1Ь-2К, определяли тем же способом, как описано в пункте (2) примера 2, в СТЬ, полученных до и после экспансии.
Полученные результаты представлены в табл. 9.
Таблица 9
| Фрагмент фибронектина | Процентное содержание клеток, экспрессирующих 1Ь-2К до экспансии (%) | Процентное содержание клеток, экспрессирующих 1Ь2К после экспансии (%) |
| Контроль (без | 14, 4 | 6, 8 |
| иммобилизации | ||
| РЫ£г) | ||
| СН-296 | 68,1 | 34,0 |
| СН-271 | 28,3 | 14,7 |
| Н-296 | 21, 3 | 22,9 |
| С-274 | 30,3 | 20, 5 |
| С-С31 | 56,8 | 34,1 |
| Η-275-Суз | 43,6 | 17,2 |
| СНУ-69 | 34,6 | 36,8 |
| СНУ-90 | 47,3 | 29,1 |
| СНУ-92 | 37,2 | 13,0 |
| СНУ-179 | 52,3 | 16,3 |
| СНУ-181 | 37,4 | 18,3 |
Как показано в табл. 9, в группе СТЬ, в которой во время индукции и экспансии СТЬ использовали приспособление для культуры клеток (планшет, колба) с иммобилизированным фрагментом фибронектина, наблюдали увеличение процента клеток, экспрессирующих 1Ь-2К, по сравнению с контрольной группой как до, так и после экспансии. Другими словами, было определено, что СТЬ могут быть экспансированы с поддержанием высокого уровня экспрессии 1Ь-2К по сравнению с уровнем экспрессии в среде с растворенным фрагментом, при использовании иммобилизированного фрагмента фибронектина.
Пример 9. Индукция клеток, экспрессирующих на поверхности СЬ8-клеток рецептор интерлейкина-2.
(1) Индукция СТЬ памяти против вируса гриппа.
Индукцию СТЬ памяти против вируса гриппа осуществляли тем же способом, как описано в пункте (2) примера 1, используя РВМС, которые выделяли и хранили тем же способом, как описано в пункте (1) примера 1. Цитотоксическую активность СТЬ на четырнадцатый день после инициации индукции оценивали тем же способом, как описано в пункте (3) примера 1. В результате не было получено значительных различий между цитотоксической активностью в присутсвии или в отсутствие добавления ΕΝίϊ в процессе индукции.
(2) Определение процента СТЬ, экспрессирующих рецепторы интерлейкин-2.
Процент экспрессии рецептора интерлейкина-2 (1Ь-2К) в СТЬ (главным образом, на поверхности СО8-клеток), полученных в пункте (1) примера 9, на четырнадцатый день после инициации индукции определяли в соответствии со способом, описанным в пункте (4) примера 1. Здесь, в этом способе, в качестве первичного антитела использовали мышиное антитело против человеческого СЭ8, меченное Е1ТС, а в качестве вторичного антитела использовали мышиное антитело против человеческого 1Ь2К(СО25), меченное РЕ (производство ЭЛКО). Результаты показаны в табл. 10.
- 25 010434
Таблица 10
| Фрагмент фибронектина | Процент содержания С08/1Ь-2К-двойной положительной клеточной популяции (%) |
| Контроль (без добавления | 30,7 |
| СН-296 | 56, 8 |
Как показано в табл. 10, в СТЬ, индуцированных путем добавления различных фрагментов фибронектина, наблюдалось увеличение экспрессии 1Ь-2К в СЭЗ-положительной клеточной популяции. Другими словами, было определено, что проводя индукцию в присутствии фрагмента фибронектина, можно индуцировать СТЬ с повышенным уровнем экспрессии 1Ь-2К на поверхности СЬ8-клеток.
Пример 10. Относительное содержание СО8-положительных клеток в клеточной популяции до и после экспансии СТЬ (сравнение фибронектина с фрагментами фибронектина).
(1) Индукция СТЬ клеток против вируса гриппа.
Индукцию СТЬ-клеток против вируса гриппа осуществляли тем же способом, как описано в пункте (2) примера 1, используя РВМС, которые выделяли и хранили тем же способом, как описано в пункте (1) примера 1. Цитотоксическую активность СТЬ на четырнадцатый день после начала индукции оценивали тем же способом, как описано в пункте (3) примера 1. В результате не было получено значительных различий между цитотоксической активностью при добавлении ΡΝίτ в процессе индукции или в его отсутствие.
(2) Определение относительного содержания СЭЗ-положительных клеток в экспансированных СТЬ.
СТЬ, полученные в пункте (1) примера 10, экспансировали тем же способом, как описано в пункте (2) примера 3. Относительное содержание СЭЗ-положительных клеток определяли перед и после экспансии СТЬ, полученных тем же способом, как описано в пункте (4) примера 1. Результаты представлены в табл. 11.
Таблица 11
| Относительное | Относительное | |
| содержание 0ϋ8- | содержание | СЬ8- |
| положительных клеток | положительных | клеток |
| перед экспансией (%) | после экспансии (%) |
| Контроль (без | 50,5 | 31,2 |
| добавления ΓΝίτ) | ||
| Фибронектин | 67,3 | 22,5 |
| Н-271 | 75,1 | 51,3 |
| СНУ-90 | 71,3 | 43,5 |
Как показано в табл. 11, во всех группах с добавлением различных фрагментов фибронектина во время индукции и экспансии СТЬ наблюдали увеличение относительного содержания СЬ8положительных клеток в клеточной популяции до экспансии и после экспансии по сравнению с содержанием в контрольной группе.
Другими словами, было определено, что СТЬ могут быть полезно экспансированы со значительной пролиферацией СЬ8-положительных клеток, как перед экспансией, так и после экспансии, при проведении процессов - индукции и экспансии - СТЬ в присутствии фрагментов фибронектина по сравнению с присутствием фибронектина рег §е.
Пример 11. Индукция экспрессии 1Ь-2К в клеточной популяции перед и после экспансии СТЬ (сравнение фибронектина и фрагментов фибронектина).
(1) Индукция СТЬ клеток против вируса гриппа.
Индукция СТЬ клеток против вируса гриппа осуществляли тем же способом, как описано в пункте (2) примера 1, используя РВМС, которые выделяли и хранили тем же способом, как описано в пункте (1) примера 1. Цитотоксическую активность СТЬ на четырнадцатый день после начала индукции оценивали тем же способом, как описано в пункте (3) примера 1. Цитотоксическую активность СТЬ на четырнадцатый день после начала индукции оценивали тем же способом, описанным в пункте (3) примера 1. В результате не было получено значительных различий между цитотоксической активностью при добавлении ΡΝίτ в процессе индукции или в его отсутствие.
(2) Определение относительного содержания клеток, экспрессирующих 1Ь-2К в экспансированных СТЬ.
СТЬ, полученные в пункте (1) примера 11, экспансировали тем же способом, как описано в пункте (2) примера 3. Относительное содержание клеток, экспрессирующих ГЬ-2К, в СТЬ определяли до и после
- 26 010434 экспансии тем же способом, описанным в пункте (2) примера 2. Результаты представлены в табл. 12. Таблица 12
| Относительное | Относительное | ||
| содержание клеток, | содержание клеток. | ||
| экспрессирующих 1Ь-2К | экспрессирующих И- | ||
| перед экспансией (%) | 2К после экспансии | ||
| (%) | |||
| Контроль | (без | 34,0 | 15, 3 |
| добавления | ΡΝίΓ) | ||
| Фибронектин | 64,6 | 50,6 | |
| Н-271 | 76, 6 | 76,8 |
Как показано в табл. 12, во всех группах с добавлением фрагментов фибронектина во время индукции и экспансии СТЬ, наблюдали увеличение относительного содержания клеток, экспрессирующих 1Ь2К, в клеточной популяции перед экспансией и после экспансии по сравнению с содержанием в контрольной группе. Увеличение соотношения было очень высоким по сравнению с группой, в которую добавляли фибронектин.
Другими словами, было определено, что СТЬ могут быть полезно экспансированы со значительной пролиферацией клеток, экспрессирующих 1Ь-2К, как перед экспансией, так и после экспансии, при проведении индукции и экспансии СТЬ в присутствии фрагмента фибронектина, по сравнению с фибронектином рег 8е.
Пример 12. Экспансия СТЬ (сравнение фибронектина с фрагментами фибронектина).
(1) Индукция СТЬ клеток против вируса гриппа.
Индукция СТЬ клеток против вируса гриппа осуществляли тем же способом, как описано в пункте (2) примера 1, используя РВМС, которые выделяли и хранили тем же способом, как описано в пункте (1) примера 1. Цитотоксическую активность СТЬ на четырнадцатый день после начала индукции оценивали тем же способом, как описано в пункте (3) примера 1. В результате не было получено значительных различий между цитотоксической активностью при добавлении фобронектина и ΡΝίϊ в процессе индукции или в его отсутствие.
(2) Экспансия СТЬ.
СТЬ, полученные в пункте (2) примера 12, экспансировали тем же способом, как описано в пункте (2) примера 3. Кроме того, в качестве среды использовали 10Нус1оиеКРМ1.
Уровень, на котором поддерживалась цитотоксическая активность, экспансированных таким образом СТЬ по сравнению с уровнем до экспансии, оценивали как «поддержание цитотоксической активности (%)».
Полученные результаты представлены в табл. 13.
Таблица 13
| Поддержание цитотоксической активности (%} отношение Е/Т = 3 | |
| Контроль (без добавления ГН£г) | 48,1 |
| Фибронектин | 148,9 |
| СН-271 | 250,8 |
Как показано в табл. 13, в группе СТЬ с добавлением фрагмента фибронектина во время индукции и экспансии, поддерживалась специфическая, высокая цитотоксическая активность даже после экспансии через 14 дней по сравнению с контрольной группой без добавления фрагментов фибронектина. Эта активность была также очень высокой по сравнению с группой с добавлением фибронектина.
Другими словами, было определено, что СТЬ могут быть полезно экспансированы в состоянии, когда в течение длительного времени поддерживается высокая цитотоксическая активность, если проводить индукцию и экспансию в присутствии фрагмента фибронектина по сравнению с присутствием фибронектина рег §е.
Пример 13. Определение кратности экспансии в культуре клеток ЬЛК (лимфокин-активированные клетки-киллеры).
(1) Иммобилизация антител против СЭ3 человека и ΡΝ или фрагментов ΡΝ.
Антитела против СЭ3 человека и фибронектин или фрагменты ΡΝ иммобилизировали на приспособлении для культуры клеток (сосуд), используя нижеследующий эксперимент. Конкретно, 1 мл (в случае 24-луночного планшета) или 2 мл (в случае колбы с объемом 12,5 см2) каждого РВБ, содержащего
- 27 010434 антитела против С1)3 человека (производство 1аи88еи-Куо^а) (конечная концентрация 5 мкг/мл), добавляли в 24-луночный планшет для культуры или колбу с объемом 12,5 см2 (производство Ра1сои). Во время добавления к группе с добавлением фибронектина или фрагментов ΕΝ добавляли фибронектин или каждый фрагмент фибронектина (ΡΝΓγ), перечисленные в получании примера 1, так, чтобы конечная концентрация составила 10 мкг/мл (в случае 24-луночного планшета) или 25 мкг/мл (в случае колбы с объемом 12,5 см2). В качестве контроля также использовалась группа без добавления фибронектина и ΕΝ&.
После этого, приспособления для культуры клеток инкубировали при комнатной температуре в течение 5 ч, перед использованием приспособления для культуры клеток хранили при 4°С. Сразу перед использованием, из этих приспособлений для культуры клеток удаляли отсасыванием РВ8, содержащий антитело и ΡΝΓγ, и затем каждую лунку дважды промывали РВ8, и затем один раз средой ХУ1УО20 (производство Вю ^Ыйакег), содержащей 5% человеческой сыворотки типа АВ (производство Вю УЪШакег) и 1% стрептомицин-пенициллина (производство П1ВСО ВВЬ) (здесь называемой просто 5НХУ1УО20), и приспособления для культуры клеток использовали в каждом эксперименте.
(2) Индукция и культивирование ЬЛК-клеток.
РВМС, которые были получены в пункте (1) примера 1, суспендировали в 5НХУ1УО20 так, чтобы концентрация составляла 0,5 до 1 х 106 клеток/мл, и затем суспензию помещали в планшет с иммобилизированными антителами против С1)3 человека, или в планшете с иммобилизированными антетелами против СЭ3 и фибронектином или ΡΝίΐ, полученную в пункте (1) примера 13, в объеме 1 мл/лунка, и к ней добавляли ГЬ-2 (производство 8Ыоиод1 & Со., ЬМ.) так, чтобы конечная концентрация составляла 1000 Ед/мл. Эти планшеты культивировали при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культуры). На второй и третий день после начала культурирования, добавляли 5НХУ1УО20, содержащий 1000 Ед/мл ГЬ-2 в объеме 1 мл/лунка. На четвертый день после начала культивирования, культуральную среду, надлежащим образом разведенную 5НХУ1УО20, переносили в свежую колбу без иммобилизированных антител, и добавляли ГЬ-2 так, чтобы конечная концентрация составляла 500 Ед/мл. Продолжали культивирование, культурную среду должным образом разводили 5НХУ1УО20 каждые 2 или 3 дня тем же способом как на пятый день после начала культурирования, и добавляли ГЬ-2 так, чтобы конечная концентрация составляла 300-500 Ед/мл. Начиная с седьмого и заканчивая пятнадцатым днем от начала культивирования культуры, методом окрашивания трипановым синим подсчитывали число живых клеток, и подсчитывали кратность экспансии путем сравнения числа клеток в начале культивирования. Результаты представлены в табл. 14.
Таблица 14
| День культивирования | ΓΝ/фрагмент | ΓΝ | Кратность экспансии (кратность) | |
| 7 день | Контроль | (без | иммобилизации | х 103 |
| ΓΝ/ΓΝ£γ) | ||||
| Фибронектин | х 233 | |||
| СН-296 | х 218 | |||
| Н-296 | х 247 | |||
| 9 день | Контроль | (без | иммобилизации | х 250 |
| ΓΝ/ΡΝίΓ) Фибронектин | х 1190 | |||
| СН-296 | х 1286 | |||
| Н-296 | х 1075 | |||
| 11 день | Контроль | (без | иммобилизации | х 576 |
| ΕΝ/ΕΝ£γ) | ||||
| Фибронектин | х 2304 | |||
| СН-296 | х 1728 | |||
| Н-296 | х 2088 | |||
| Контроль | (без | иммобилизации | х 660 | |
| ΓΝ/ΓΝΕγ) | ||||
| С-С51 | х 1170 | |||
| 15 день | Контроль | (без | иммо били з ации | х 1980 |
| ΓΝ/ΓΝ£γ) | ||||
| Фибронектин | х 3348 | |||
| СН-296 | х 5364 | |||
| Контроль ΕΝ/ΕΝ£γ) | (без | иммобилизации | х 2906 | |
| С-С31 | х 5117 |
- 28 010434
Как показано в табл. 14, в группе, где использовались приспособления для культуры клеток с иммобилизироваными фрагментами фибронектина каждого типа, на ранней стадии индукции ЬАК-клеток, кратность экспансии ЬАК-клеток была выше, по сравнению с экспансией в контрольной группе. Кроме того, кратность экспансии группы с иммобилизированными фрагментами фибронектина каждого типа была выше, чем экспансия группы, где использовались приспособления для культуры клеток с иммобилизированным фибронектином на пятнадцатый день после начала культивирования. Следовательно, было определено, что в случае, когда экспансию проводят в течение долгого периода времени, индукция и культивирование ЬАК-клеток предпочтительней проводить с большей кратностью экспресисии в присутствии фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток ЬАК, чем в присутствии фибронектина рег 8е.
Пример 14. Определение уровня пролиферации в культуре клеток ЬАК.
(1) Индукция и культивирование ЬАК-клеток.
Индукцию и культивирование ЬАК-клеток осуществляли тем же способом, как описано в пункте (2) примера 13. Рассчитывали уровень пролиферации клеток, начиная с четвертого и заканчивая седьмым днем начала культивирования на этой стадии. Результаты представлены в табл. 15.
Таблица 15
| Число клеток в первоначальной культуре | Фрагмент | фибронектина | Уровень пролиферации с | |
| 4-ого день | по 7-ой (кратность) | |||
| 5 х 105клеток/мл | Контроль | (без иммобилизации | 2,7 | кратность |
| ЕВД | ||||
| СН-296 | 16,9 | кратность | ||
| Контроль | (без иммобилизации | 33,5 | кратность | |
| ΕΝίτ) | ||||
| Н-296 | 49,5 | кратность | ||
| 1 х 106 клеток/мл | Контроль | (без иммобилизации | 6,2 | кратность |
| ГЫ£г) | ||||
| СН-296 | 20,4 | кратность | ||
| Контроль | (без иммобилизации | 23,5 | кратность | |
| ΕΝίΓ) | ||||
| Н-296 | 43,5 | кратность |
Как показано в табл. 15, в группе, в которой использовали приспособления для культуры клеток с иммобилизированными фрагментами фибронектина каждого типа, на ранней стадии индукции ЬАКклеток, уровень пролиферации ЬАК-клеток, начиная с четертого и заканчивая седьмым днем начала культивирования, была выше, по сравнению с экспансией в контрольной группе. Другими словами было определено, что ЬАК-клетки могут быть индуцированы и культивировали с более быстрым уровнем пролифираци в присутствии фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции ЬАК-клеток.
Пример 15. Определение кратности экспансии в культуре ЬАК-клеток (индукция и культивирование ЬАК-клеток из небольшого числа клеток).
(1) Индукция и культивирование ЬАК-клеток.
Индукция и культивирование ЬАК-клеток осуществляли тем же способом, описанным в пункте (2) примера 13. В этот период, клеточную концентрацию в начальной культуре доводили до концентрации от 2 х 105 до 1 х 106 клеток/мл (от 1 х 105 до 5 х 105 клеток/см2). На пятнадцатый день от начала культивирования, подсчитывали число живых клеток методом окрашивания трипановым синим, и подсчитывали кратность экспансии по сравнению с числом клеток в начале культивирования. Результаты представлены в табл. 16.
Таблица16
Число клеток в Фрагмент фибронектина Кратность первоначальной культуре экспансии (кратность) х 105 клеток/мл Контроль (без х 48,6 (1 X 105 клеток/см2) иммобилизации Н-1£г) СН-296 х 1004 х 105 клеток/мл Контроль (без х 433 (2,5 х 105 клеток/см2) иммобилизации ЕНГг) СН-296 х1094 х 106 клеток/мл Контроль (без х 1020 (5 х 105 клеток/см2) иммобилизации ГК£г) СН-296 х 1476
- 29 010434
Как показано в табл. 16, в группе, в которой использовали приспособления для культуры клеток с иммобилизированным фрагментов фибронектина каждого типа во время индукция ЬЛК-клеток, экспансию с высокой кратностью наблюдали на пятнадцатый день от начала культивирования, независимо от количества клеток в начале культивирования. Напротив, в контрольной группе, кратность экспансии на пятнадцатый день от начала культивирования была ниже, если в начале культивирования было мало клеток. Другими словами, было определено, что ЬЛК-клетки могут быть индуцированы и культивированы с высокой кратностью экспансии в присутствии фрагмента фибронектина во время индукции ЬЛК-клеток с низким числом клеток, независимо от числа клеток в начале культивирование.
Пример 16. Определение кратности экспансии в культуре ЬЛК-клеток.
(Индукция и культивирование ЬЛК-клеток с низким количеством клеток/культивирование без процедуры разведения).
(1) Индукция и культивирование ЬЛК-клеток.
РВМС, которые были получены в пункте (1) примера 1, суспендировали в 5НХУ1УО20 так, чтобы концентрация составляла 1 х 104 клеток/мл, и затем суспензию помещали в планшет с иммобилизированными антителами против СИЗ человека, или в 6-луночный планшет с иммобилизированными антетелами против СИЗ и фибронектином или ΕΝίτ, полученную в пункте (1) примера 13, в объеме 1 мл/лунка. В лунки добавляли четыре миллилитра 5НХУ1УО20 (1 х 103 клеток/см* 1 2) и 1Ь-2 (производство 8Ыоиод1 & Со., Ый.) так, чтобы конечная концентрация составляла 500 Ед/мл. Эти планшеты культивировали при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культуры). На второй, третий и четвертый день после начала культурирования, добавляли 1Ь-2 так, чтобы конечная концентрация составила 500 Ед/мл. Продолжали культивирование, и начиная с седьмого и заканчивая пятнадцатым днем от начала культивирования культуры каждые 2 или 3 дня добавляли 1Ь-2 так, чтобы конечная концентрация составляла 500 Ед/мл. Во время добавления процедуры разведения культуральной среды не осуществляли.
На пятнадцатый день от начала культивирования число живых клеток подсчитывали методом окрашивания трипановым синим, и подсчитывали кратность экспансии путем сравнения с числом клеток в начале культивирования. Результаты представлены в табл. 17.
Таблица17
| День | ΓΝ/ΕΉ фрагмент | Кратность | экспансии | |
| культивирования | (кратность) | |||
| 15 день | Контроль | (без | X | 15 |
| иммобилизации | ΡΝ/ΓΝ£γ) | |||
| Фибронектин | X | 628 | ||
| СН-296 | X | 773 | ||
| Н-296 | X | 960 |
Как показано в табл. 17, в группе, в которой использовали приспособления для культуры клеток с иммобилизированным фрагментов фибронектина каждого типа во время индукция ЬЛК-клеток с низким числом клеток, экспансию с высокой кратностью наблюдали на пятнадцатый день после начала культивирования без необходимости разведения клеток во время индукции. Также, кратность экспансии была высока по сравнению с группой, в которой использовали приспособления для культуры клеток с иммобилизированным фибронектином. В противоположность этому, в контрольной группе клетки практически не пролифериловали даже на пятнадцатый день после начала культивирования. Другими словами, было определено, что ЬЛК-клетки могут быть индуцированы и культивированы с высокой кратностью экспансии в присутствии фибронектина или фрагмента фибронектина, предпочтительно, фрагмента фибронектина, во время индукция ЬЛК-клеток с низким числом клеток, без необходимости проведения разведения.
Пример 17. Индукция экспрессии 1Ь-2К в ЬЛК-клетках.
(1) Индукция и культивирование ЬЛК-клеток.
Индукцию и культивирование ЬЛК-клеток осуществляли тем же способом, описанным в пункте (2) примера 13.
(2) Определение уровня экспрессии 1Ь-2К в ЬЛК-клетках.
Уровень экспрессии 1Ь-2К в ЬЛК-клетках, которые подвергали индукции и культивированию в пункте (1) примера 17, определяли в соответствии со способом, описанным в пункте (2) примера 2. Результаты представлены в табл. 18. В табл. относительное содержание клеток, экспрессирующих 1Ь-2К (%), показано как уровень экспрессии 1Ь-2К (%).
- 30 010434
Таблица 18
| День культивирования | ΓΝ/ΓΝ фрагмент | Уровень экспрессии ΙΣΣΕ (%) |
| 4 День | Контроль (без иммобилизации | 8 6,5 |
| ΓΝ/ΕΝίΓ) | ||
| Фибронектин | 97,2 | |
| СН-296 | 97, 6 | |
| Н-296 | 97,7 | |
| С-С31 | 94,9 | |
| 7 День | Контроль (без иммобилизации | 59, 3 |
| ΡΝ/ΕΝίΓ) | ||
| Фибронектин | 77,6 | |
| СН-296 | 90,4 | |
| Н-296 | 89,1 | |
| С-С51 | 65,8 |
Как показано в табл. 18, в группе, в которой использовали приспособления для культуры клеток с иммобилизированным фрагментов фибронектина каждого типа на ранией стадии индукции ЬАК-клеток, во время культивирования на поврехности ЬАК-клеток наблюдали высокий уровень экспрессии ^-2Κ Также этот уровень экспрессии Ι^2Β был высок даже по сравнению с группой, в которй использовали приспособления для культуры клеток с иммобилизированным фибронектином. Другими словами, было определено, что ЬАК-клетки могут быть индуцированы и культивированы с полезным уровнем экспрессии ^-2Β, выше, чем в присутствии фибронектина рег че, в присутствии фрагментов фибронектина во время индукция ЬАК-клеток.
Пример 18. Индукция экспрессии Ι^2Β в ЬАК-клетках.
(1) Индукция и культивирование ЬАК-клеток.
Индукцию и культивирование ЬАК-клеток осуществляли тем же способом, описанным в пункте (2) примера 13.
(2) Определение уровня экспрессии Ι^2Β в ЬАК-клетках.
Уровень экспрессии Ι^2Β на поверхности СБ4-клеток и СБ8 ЬАК-клеток, которые подвергали индукции и культивированию в пункте (1) примера 17, определяли на семнадцатый день в соответствии со способом, описанным в пункте (2) примера 9. Здесь в этой методике в качестве первичных антител использовали мышиные антитела против СБ4 человека, меченные ΡΠΌ, и в качестве вторичных антител использовали мышиные антитела против ^-2Κ(ΟΏ25) человека, меченные РЕ. Результаты представлены в табл. 19.
Таблица 19
Фрагмент фибронектина Относительное Относительное содержание клеток содержание клеток
СО4/1Д-2К (%) СО8/1Ь-2В (%)
| Контроль | (без | 20,5 | 49,4 |
| иммобилизации | ΕΝ/ΡΝίΓ) | ||
| СН-296 | 41,2 | 61,6 | |
| С-С31 | 24,4 | 54,6 |
Как показано в табл. 19, в группе, в которой использовали приспособления для культуры клеток с иммобилизированным фрагментов фибронектина каждого типа на ранней стадии индукции ЬАК-клеток, во время культивирования может быть индуцирован высокий уровень экспрессии Ι^2Β на поверхности ЬАК-клеток (как на СБ4-положительных, так и СБ8-положительных клетках). Другими словами, было определено, что ЬАК-клетки могут быть индуцированы и культивированы с высоким уровнем экспрессии Ι^2Β на поверхности как на СБ4-положительных, так и СБ8-положительных клеток в присутствии фрагмента фибронектина во время индукция ЬАК-клеток.
Пример 19. Относительное содержание СБ8-положительных клеток в клеточной популяции ЬАК.
(1) Индукция и культивирование ЬАК-клеток.
Индукцию и культивирование ЬАК-клеток осуществляли тем же способом, описанным в пункте (2) примера 13.
(2) Определение относительного содержания СБ8-положительной клеточной популяции в ЬАК
- 31 010434 клетках.
Относительное содержание СЦ8-положительных клеток в ЬЛК-клетках, которые подвергали индукции и культивированию в пункте (1) примера 19, определяли на пятнадцатый день в соответствии со способом, описанным в пункте (4) примера 1. Результаты представлены в табл. 20.
Таблица 20
| Фрагмент фибронектина | Относительное содержание 008- положительных клеток (%) |
| Контроль (без иммобилизации | 42, 9 |
| ЕЫ/га£г) | |
| СН-296 | 72,1 |
| Н-296 | 76, 0 |
Как показано в табл. 20, в группе, в которой использовали приспособления для культуры клеток с иммобилизированным фрагментов фибронектина каждого типа на ранней стадии индукции ЬЛК-клеток, во время культивирования может идуцироваться высокое относительное содержание СЭ8положительных клеток в ЬЛК-клетках. Другими словами, было определено, что ЬЛК-клетки могут быть индуцированы и культивированы с высоким относительным содержанием СЦ8-положительных клеток в ЬЛК-клетках в присутствии фибронектина во время индукция ЬЛК-клеток.
Пример 21. Определение кратности экспансии в культуре ЬЛК-клеток.
(2) Индукция и культивирование ЬЛК-клеток.
РВМС, которые были получены в пункте (1) примера 1, суспендировали в 5НХУ1УО20 так, чтобы концентрация составляла 0,5 до 1 х 106 клеток/мл, и затем суспензию помещали в планшет с иммобилизированными антителами против СЭ3 человека, или в планшет с иммобилизированными антетелами против СЭ3 и ΡΝίτ, полученную в пункте (1) примера 13, в объеме 1 мл/лунка, и к ней добавляли 1Ь-2 (производство 8Ыоиод1 & Со., Ыб.) так, чтобы конечная концентрация составляла 1000 Ед/мл. Эти планшеты культивировали при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культуры). На второй и третий день после начала культурирования добавляли 5НХУ1УО20. содержащий 1000 Ед/мл 1Ь-2 в объеме 1 мл/лунка. На четвертый день после начала культивирования, культуральную среду, надлежащим образом разведенную 5НХУ1УО20, переносили в свежую колбу без иммобилизированных антител, и добавляли 1Ь-2 так, чтобы конечная концентрация составляла 500 Ед/мл. На восьмой или девятый день после начала культивирования, культивированную среду, надлежащим образом разведенную 5НХУ1УО20, переносили в колбу с иммобилизованными антителами против СЬ3 человека или в колбу с иммобилизованными антителами против СЭ3 человека и ΡΝίτ (при условии, что при иммобилизации использовалась концентрация антител против СЬ3 человека равная 0,5 мкг/мл), полученную тем же, как описано в пункте (1) примера 13, и добавляли 1Ь-2 так, чтобы конечная концентрация составляла 500 Ед/мл. На одиннадцатый или двенадцатый день после начала культивирования культуральную среду, надлежащим образом разбавленную 5НХУ1УО20, переносили в свежую колбу без иммобилизованных антител, и добавляли 1Ь-2 так, чтобы окончательная концентрация составляла 500 Ед/мл. На пятнадцатый день от начала культивирования, подсчитывали число живых клеток методом окрашивания трипановым синим и подсчитывали кратность экспансии путем сравнения числа клеток в начале культивирования. Результаты представлены в табл. 21 и 22. В табл. «донор» обозначает доноров РВМС.
Таблица 21
| Донор | Фрагмент | Стиьфлляиин на 0-сй день | Стимуляция на 8-ей | Кратность |
| фибронектина | после начала | день после начала | экспансии | |
| культивррования | культивирования | (кратность) | ||
| А | Контроль (без | АпМ-СПЗ | Нет | х 80 |
| иммобилизации | ΑηΙζΐ-СПЗ | АпЫ-СОЗ | х 38 | |
| ΓΝ£γ) | ||||
| СН-296 | АпС1-СОЗ+СН-296 | Нет | х 1452 | |
| АпЫ-СОЗ+СН-296 | АпЫ-СОЗ | х 1620 | ||
| АпС1-СОЗ+СН-296 | АпЧ-СОЗ+СН-296 | х 2700 | ||
| Б | Контроль (без | Αηίΐ-Οϋ3 | Нет | к 710 |
| иммобилизации ЕМ£г) | АпЫ-СЭЗ | АпЫ-ССЗ | х 2363 | |
| СН-296 | АпЫ-СОЗ+СН-296 | Нет | х 504 | |
| АпЫ-СОЗ+СН-296 | Апы-СЭЗ | х 54 68 | ||
| АпЫ-СОЗ+СН-296 | АпЪ1-СОЗ+СН-296 | х 14243 |
| С | Контроль (без | АпСх-СОЗ | Нет | X | 1805 |
| иммобилизации ΓΝ£γ) | Αηίζχ-СОЗ | АпЬх-СОЗ | X | 4200 | |
| СН-296 | Ап£х-С03+СН-29б | ЛПЫ.-С03+СН-294 | X | 35700 | |
| Н-296 | АпЬх-СОЗ+Н-296 | АпЪх-СДЗ+Н-296 | X | 16950 |
- 32 010434
Таблица 22
| Донор | Фрагмент фибронектина | Стимуляция на 0-ой день после начала культивирования | Стимуляция на 9ый день после начала культивирования | Кратность экспансии (кратность) | |
| В | Οοηΐχοί | АпМ-СоЗ | Нет | X | 2074 |
| (ИзЛЬсиО Иммобилизация οί ГЫ£г) | АпЫ-СОЗ | Αηίϊ-СОЗ | X | 2890 | |
| СН-296 | АпС1-С03+СН-296 | АПГ1-СОЗ+СН-296 | X | 38400 | |
| СН-271 | АпЫ-СбЗ+СН-271 | Ап£1-СОЗ+СН-271 | X | 12672 | |
| Н-296 | Αη£ί-€03+Η-296 | АгЛ1-СРЗ+Н-29б | X | 67584 | |
| Н-271 | АпЫ-С03+Н-271 | Αηίζί-Οϋ3+Η-271 | X | 8755 | |
| С-274 | АпЫ-СОЗ+С-274 | АпС1-СОЗ+С-274 | X | 8525 | |
| С-С31 | Ап£1-С03+С-С51 | АпЫ-СВЗ+С-С31 | X | 9677 | |
| СНУ-90 | АпЪ1-СбЗ+СНУ-90 | АпШ-СОЗ+СНУ-ЭО | X | 10138 | |
| СНУ-179 | АпЫ-С03+СНУ-179 | Ап£1-СВЗ+СНУ-179 | X | 8294 | |
| СНУ-181 | АпЫ-СЭЗ+СН7-181 | АпЫ-ССЗ+СНУ-181 | X | 5760 |
Как показано в табл. 21 и 22, в группе, в которой использовали приспособления для культуры клеток, на которые на ранней стадии и промежуточной стадии индукции ЬАК-клеток неоднократно иммобилизировали фрагменты фибронектина каждого типа и антитела против ΟΏ3, кратность экспансии ЬАК-клеток была высокой, по сравнению с контрольной группой. Эти уровни экспансии были гораздо выше уровня экспансии в группе, в которой использовали приспособления для культуры клеток, на которые на ранней стадии и промежуточной стадии индукции ЬАК-клеток неоднократно иммобилизировали антитела против ΟΏ3. Другими словами, было определено, что ЬАК-клетки могут быть индуцированы и культивированы с высокой кратностью экспансии при стимуляции с использованием фрагментов фибронектина и антител против ΟΏ3 человека на ранней стадии и промежуточной стадии индукции ЬАК клеток.
Пример 21. Определение уровня пролиферации в культурах ЬАК-клеток.
(1) Индукция и культивирование ЬАК-клеток.
Индукцию и культивирование ЬАК-клеток осуществляли тем же способом, описанным в пункте (1) примера 20. Расчитывали уровень пролиферации клеток, начиная с четвертого дня по восьмой день от начала культивирования, и уровень пролиферации клеток, начиная с одиннадцатого по пятнадцатый день от начала культивирования в данных методиках. Результаты представлены в табл. 23 и 24.
| Таблица 23 | |||||
| Донор | Фрагмент фибронектина | Стимуляция на 0ой день после начала культивирования | Стимуляция на 8ой день после начала культивирования | Уровень пролиферации с 11 по 15 день (кратность) | |
| А | Контроль | (без | Анти-СОЗ | нет | 6,7 |
| иммобилизации | кратность | ||||
| РЫ£г) | Анти-СОЗ | Анти-СОЗ | 8,3 | ||
| кратность | |||||
| СН-296 | Анти-СОЗ+СН-296 | Нет | 2, 6 | ||
| кратность | |||||
| Анти-СОЗ+СН-296 | Анти-СОЗ | 5,5 | |||
| кратность | |||||
| Анти-СОЗ+СН-296 | Анти-СОЗ+СН-296 | И, 1 | |||
| кратность | |||||
| В | Контроль | (без | Анти-СОЗ | нет | 7,4 |
| иммобилизации | крайность | ||||
| ГЫ£г) | Анти-СОЗ | Анти-СбЗ | 17,5 | ||
| кратность | |||||
| СН-296 | Анти-СОЗ+СН-296 | нет | 0, 9 | ||
| кратность | |||||
| Анти-СОЗ+СН-296 | Анти-СОЗ | 19,8 | |||
| кратность | |||||
| Анти-СОЗ+СН-296 | Анти-СОЗ+СН-296 | 60,3 | |||
| кратность | |||||
| С | Контроль | (без | Анти-СбЗ | нет | 5,2 |
| иммобилизации | кратность | ||||
| ΓΝ£γ) | Анти-СОЗ | Анти-СОЗ | 22,2 | ||
| кратность | |||||
| СН-296 | Анти-СОЗ+СН-296 | Анти-СОЗ+СН-296 | 94,0 | ||
| кратность | |||||
| Н-296 | Анти-СОЗ+Н-296 | Анти-СОЗ+Н-296 | 35,0 | ||
| кратность |
- 33 010434
Таблица 24
| Донор | Фрагмент фибронектина | Стимуляция на 0-ой день после начала культивирования | Стимуляция на 9-ой день после начала культивирования | Уровень пролиферещии с 11 по 15 день (кратность) |
| В | Контроль (без | Анти-СВЗ | нет | 5,7 кратность |
| иммобилизации | Анти-СБЗ | Анти-СОЗ | 15,6 кратность | |
| кмег) | ||||
| СН-296 | Анти-СОЗ+СН-296 | Анти-СДЗ+СН-296 | 55,6 кратность | |
| СН-271 | Анти-СОЗ+СН-271 | Анти-СОЗ+СН-271 | 25,0 кратность | |
| Н-296 | Анти-СОЗ+Н-296 | Анти-СОЗ+Н-296 | 88,9 кратность | |
| Н-271 | Анти-СОЗ+Н-271 | Анти-СОЗ+Н-271 | 23,8 кратность | |
| С-274 | Анти-СОЗ+С-274 | Анти-СОЗ+С-274 | 61,7 кратность | |
| С-С51 | Анти-СОЗ+С-С51 | Анти-СО3+С-С51 | 28,0 кратность | |
| СНУ-90 | Анти-СОЗ+СНУ-90 | Анти-СОЗ+СНУ-90 | 44,0 кратность | |
| СНУ-179 | Анти-СОЗ+СНУ-179 | Анти-СОЗ+СНУ-179 | 32,7 кратность | |
| СНУ-181 | Анти-СОЗ+СНУ-181 | Анти-СОЗ+СНУ-181 | 41,7 кратность |
Как показано в табл. 23 и 24, в группе, в которой использовали приспособления для культуры клеток, на которые на ранней стадии и промежуточной стадии индукции ЬАК-клеток неоднократно иммобилизировали фрагменты фибронектина каждого типа и антитела против СО3, уровень пролиферации ЬАК-клеток был выше в более поздней стадии индукции по сравнению с контролем. Эти уровни пролиферации были гораздо выше уровня пролиферации ЬАК-клеток в более поздней стадии индукции в группе, в которой использовали приспособления для культуры клеток, на которые на ранней стадии и промежуточной стадии индукции ЬАК-клеток неоднократно иммобилизировали только антитела против СО3. Другими словами, было определено, что ЬАК-клетки могут быть индуцированы и культивированы с высоким уровнем пролиферации при стимуляции с использованием фрагментов фибронектина и антител против СО3 человека на ранней стадии и промежуточной стадии индукции ЬАК-клеток.
Пример 22. Индукция экспрессии Ш-2К в ЬАК-клеткх.
(1) Индукция и культивирование ЬАК-клеток.
(1) Индукция и культивирование ЬАК-клеток.
Индукцию и культивирование ЬАК-клеток осуществляли тем же способом, описанным в пункте (1) примера 20.
(2) Определение уровня экспрессии Ш-2К в ЬАК-клетках Уровень экспрессии Ш-2К в ЬАК-клетки, которые подвергали индукции и культивированию в пункте (1) примера 22, определяли на пятнадцатый день в соответствии со способом, описанным в пункте (2) примера 2. Результаты представлены в табл. 25 и 26. В табл. относительное содержание клеток, экспрессирующих 1Ь-2К (%) показано как уровень экспрессии Ш-2К (%).
Таблица 25
| Фрагмент фибронектина | Стимуляция на 0-ой день после начала культивирования | Стимуляция на 9-ой день после начала культивирования | Относительное содержание клеток, экспрессирующих 1Ь-2К (%) |
| Контроль (без | Анти-СОЗ | нет | 4,8 |
| иммобилизации | Анти-СОЗ | Анти-СОЗ | 32, 6 |
| Шг) | |||
| СН-296 | Анти-СОЗ+СН-296 | нет | 2, 5 |
| Анти-СОЗ+СН-296 | Анти-СОЗ | 72,3 | |
| Анти-СОЗ+СН-296 | Анти-СОЗ+СН-296 | 94,7 | |
| Н-296 | Анти-СОЗ+Н-296 | нет | 1, 4 |
| Анти-СОЗ+Н-296 | Анти-СОЗ | 50,2 | |
| Анти-СОЗ+Н-296 | Анти-СОЗ+Н-296 | 39,6 | |
| Таблица 26 | |||
| Фрагмент | Стимуляция на 0-ой | Стимуляция на 9-ой | Относительное |
| фибронектина | день после начала | день после начала | содержание |
| культивирования | культивирования | клеток, | |
| экспрессирующих | |||
| 1Д-2К (%) | |||
| Контроль (без | Анти-СОЗ | Нет | 4,8 |
| иммобили з ации | Анти-СОЗ | Анти-СОЗ | 18,0 |
| КЫ£г) | |||
| СН-296 | Анти-СОЗ+СН-296 | Анти-СОЗ+СН-296 | 84, 0 |
| СН-271 | Анти-СОЗ+СН-271 | Анти-СОЗ+СН-271 | 67,1 |
| Н-296 | Анти-СОЗ+Н-296 | Анти-СОЗ+Н-296 | 79, 9 |
| Н-271 | Анти-СОЗ+Н-271 | Анти-СОЗ+Н-271 | 51, 6 |
| С-274 | Анти-СйЗ+С-274 | Анти-СОЗ+С-274 | 66, 4 |
| С-С51 | Анти-С03+С-С51 | Анти—СОЗ+С-С51 | 72, 5 |
| СНУ-90 | Анти-СОЗ+СНУ-ЗО | Анти-СОЗ+СНУ-90 | 52, 6 |
| СНУ-179 | Анти-СОЗ+СНУ-179 | Анти-СОЗ+СНУ-179 | 63, 4 |
| СНУ-181 | Анти-СОЗ+СНУ-181 | Анти-СОЗ+СНУ-181 | 68,3 |
- 34 010434
Как показано в табл. 25 и 26, в группе, в которой использовали приспособления для культуры клеток, на которые на ранней стадии и промежуточной стадии индукции ЬАК-клеток неоднократно иммобилизировали фрагменты фибронектина каждого типа и антитела против СЭ3, уровень экспрессии [И-2 на поверхности ЬАК-клеток на пятнадцатый день после начала культивирования был высокий по сравнению с контролем. Эти уровни экспрессии !Ь-2 были гораздо выше уровня экспрессии [И-2 в группе, в которой использовали приспособления для культуры клеток, на которые на ранней стадии и промежуточной стадии индукции ЬАК-клеток неоднократно иммобилизировали только антитела против СЬ3. Другими словами, было определено, что ЬАК-клетки могут быть индуцированы и культивированы с высокой экспрессией !Ь-2 при стимуляции с использованием фрагментов фибронектина на ранней стадии и промежуточной стадии индукции ЬАК-клеток.
Пример 23. Определение уровня СО8-положительных ЬАК-клеток.
(1) Индукция и культивирование ЬАК-клеток.
Индукция и культивирование ЬАК-клеток осуществляли тем же способом, описанным в пункте (1) примера 20.
(2) Определение относительного содержания СО8-положительных клетко в популяции ЬАК-клетки. Относительное содержание СО8-положительных клеток в клеточной популяции ЬАК-клетки, которые индуцировали и культивировали в пункте (1) примера 23, определяли на пятнадцатый день в соответсвии со способом, описанным в пункте (4) примера 1. Результаты представлены в табл. 27.
Таблица 27
| Фрагмент | Стимуляция на 0-ой | Стимуляция на 8-ой | Относительное |
| фибронектина | день после начала | день после начала | содержание СЭ8- |
| культивирования | культивирования | положительных | |
| клеток | |||
| Контроль (без | Анти-СОЗ | нет | 42, 9 |
| иммобилизация | Анти-СЕЗ | Анти-СОЗ | 55, 2 |
| ГЫ£г) | |||
| СН-296 | Анти-С03+СН296 | нет | 72, 1 |
| Анти-СОЗ+СН29б | Анти-СОЗ | 85, 2 | |
| Анти-СОЗ+СН296 | Анти-СОЗ+СН-296 | 75,9 | |
| Н-296 | Анти-СЕЗ+Н296 | нет | 76, 0 |
| Анти-СЕЗ+Н296 | Анти-СОЗ | 82, 0 | |
| Анти-СО34-Н296 | Анти-СЭЗ+Н296 | 77, 1 |
Как показано в табл. 27, в группе, в которой использовали приспособления для культуры клеток, на которые на ранней стадии и промежуточной стадии индукции ЬАК-клеток неоднократно иммобилизировали фрагменты фибронектина каждого типа и антитела против СЭ3, относительное содержание СЭ8положительных клеток в клеточной популяции ЬАК-клетки была высокой на пятнадцатый день от начала культивирования, по сравнению с контролем. Это относительное соединение СО8-положительных клеток было гораздо выше содержания СО8-положительных клеток в группе, в которой использовали приспособления для культуры клеток, на которые на ранней стадии и промежуточной стадии индукции ЬАК-клеток неоднократно иммобилизировали антитела против СЬ3. Другими словами, было определено, что ЬАК-клетки могут быть индуцированы и культивированы с высоким относительным содержанием СО8-положительных клеток при стимуляции с использованием фрагментов фибронектина на ранней стадии и промежуточной стадии индукции ЬАК-клеток.
Независимый текст перечня последовательностей
8ЕЦ Ш N0: 1; частичный участок фибронектина, называемый Ш-8.
8ЕЦ Ш N0: 2; частичный участок фибронектина, называемый Ш-9.
8ЕЦ Ш N0: 3; частичный участок фибронектина, называемый Ш-10.
8ЕЦ Ш N0: 4; частичный участок фибронектина, называемый Ш-12.
8ЕЦ Ш N0: 5; частичный участок фибронектина, называемый Ш-13.
8ЕЦ Ш N0: 6; частичный участок фибронектина, называемый Ш-14.
8ЕЦ Ш N0: 7; частичный участок фибронектина, называемый С8-1.
8ЕЦ Ш N0: 8; фрагмент фибронектина, называемый С-274.
8ЕЦ Ш N0: 9; фрагмент фибронектина, называемый Н-271.
8ЕЦ Ш N0: 10; фрагмент фибронектина, называемый Н-296.
8ЕЦ Ш N0: 11; фрагмент фибронектина, называемый СН-271.
8ЕЦ Ш N0: 12; фрагмент фибронектина, называемый СН-296.
8ЕЦ Ш N0: 13; фрагмент фибронектина, называемый С-С81.
8ЕЦ Ш N0: 14; фрагмент фибронектина, называемый СНУ-89.
8ЕЦ Ш N0: 15; фрагмент фибронектина, называемый СНУ-90.
8ЕЦ Ш N0: 16; фрагмент фибронектина, называемый СНУ-92.
8ЕЦ Ш N0: 17; фрагмент фибронектина, называемый СНУ-179.
- 35 010434
8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 18; фрагмент фибронектина, называемый СНУ-181.
8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 19; фрагмент фибронектина, называемый Н-275-Сук.
8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 20; праймер 128.
8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 21; праймер 14А.
8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 22; праймер Су§-Л.
8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 23; праймер Су§-8.
8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 24; сконструированный пептид на основании матриксного белка вируса гриппа.
Промышленное применение В соответствии со способом получения цитотоксических лимфоцитов согласно изобретению, были получены цитотоксические лимфоциты в которых сохранялась высокая цитотоксическая активность, значительно увеличивался уровень экспрессии ГЬ-2К и увеличивался процент СО8-положительных клеток. Лимфоциты могут быть подходящим образом использоваться, например, в адоптивной иммунотерапии. Следовательно, вероятно способ согласно изобретению внесет большой вклад в область медицины.
- 36 010434
Список последовательностей <110> ΤΑΚΆΚΑ ΒΙΟ 1ЫС.
<120> Способ получения лимфоцитов с цитотоксической активностью <130> 03-О21-РСТ <150> ДР 2002-34414 <151> 2002-03-25 <160> 24 <210> 1 <211> 87 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> частичная область фибронектина, называемая II1-8 <400> 1
| Рго 1 | ТНг | Азр | Ьеи Агд РНе 5 | ТНг Азп | 11е С1у 10 | Рго | Азр | ТНг | МеН Агд 15 | |||||
| ν»ι | ТНг | Тгр | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | 11е | Азр | Ьеи | ТНг | Азп | РНе | Ьеи |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Ча1 | Агд | Туг | Зег | Рго | Уа1 | Ьуз | Азп | С1и | С1и | Азр | Уа1 | А1а | С1и | Ьеи |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Зег | Не | Зег | Рго | Зег | Азр | Азп | А1а | Уа1 | Уа1 | Ьеи | ТНг | Азп | Ьеи | Ьеи |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Рго | С1у | ТНг | 31и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Зег | Уа1 | Туг | С1и | С1п |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| Н13 | С1и | Зег | ТНг | Рго | Ьеи | Агд | (31у | Агд | <31п | ьуз | ТНг | |||
| 80 | 85 |
<210> 2 <211> 90 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> частичная область фибронектина, называемая ΙΙΙ-9 <400> 2
| б!у Ьеи 1 | Азр Зег | Рго 5 | ТНг (31у 11е Азр | РНе Зег Азр 11е ТНг А1а | ||||||||||
| 10 | 15 | |||||||||||||
| Азп | Зег | РНе | ТНг | Уа1 | Н1з | Тгр | 11е | А1а | Рго | Агд | А1а | ТНг | 11е | ТНг |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| С1у | Туг | Агд | 11е | Агд | Н13 | Н13 | Рго | <31и | Н1з | РНе | Зег | С1у | Агд | Рго |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Агд | С1и | Азр | Агд | Уа1 | Рго | Н13 | Зег | Агд | Азп | Зег | Не | ТНг | Ьеи | ТНг |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Азп | Ьеи | ТНг | Рго | С1у | ТНг | <31и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Не | Уа1 | А1а | Ьеи |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| Азп | С1у | Агд | 61и | <31и | Зег | Рго | Ьеи | Ьеи | Не | <31у | 51п | (31п | Зег | ТНг |
| 80 | Θ5 | 90 |
<210> 3 <211> 94 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> частичная область фибронектина, называемая ΙΙΙ-10
- 37 010434 <400> 3
| УаЬ 1 | Зег | Азр УаЬ | Рго 5 | Агд | Азр | Ьеи | СЬи УаЬ 10 | УаЬ АЬа | АЬа | ТЫ | Рго 15 | |||
| ТЬг | Зег | Ьеи | Ьеи | ЬЬе | Зег | Тгр | Азр | АЬа | Рго | АЬа | УаЬ | ТЬг | Уа1 | Агд |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Туг | Туг | Агд | ЬЬе | ТЬг | Туг | СЬу | СЬи | ТЬг | СЬу | СЬу | Азп | Зег | Рго | УаЬ |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| СЬп | СЬи | РЬе | ТЬг | УаЬ | Рго | СЬу | Зег | Ьуз | Зег | ТЬг | АЬа | ТЬг | ЬЬе | Зег |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| СЬу | Ьеи | Ьуз | Рго | СЬу | Уа1 | Азр | Туг | ТЫ | Ые | ТЬг | УаЬ | Туг | АЬа | УаЬ |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| ТЬг | •СЬу | Агд | СЬу | Азр | Зег | Рго | АЬа | Зег | Зег | Ьуз | Рго | Ые | Зег | ЬЬе |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||
| Азп | Туг | Агд | ТЬг |
<210> 4 <2Ь1> 92 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> частичная область фибронектина, называемая ΙΙΙ-12 <400> 4
| АЬа 1 | Ые | Рго | АЬа | Рго 5 | ТЬг | Азр Ьеи | Ьуз | РЬе ЬО | ТЬг | С1п | УаЬ | ТЬг | Рго Ь5 | |
| ТЬг | Зег | Ьеи | Зег | А1а | СЬп | Тгр | ТЬг | Рго | Рго | Азп | УаЬ | СЬп | Ьеи | ТЬг |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| СЬу | Туг | Агд | УаЬ | Агд | УаЬ | ТЬг | Рго | Ьуз | СЬи | Ьуз | ТЬг | СЬу | Рго | Меб |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Ьуз | СЬи | Ые | Азп | Ьеи | АЬа | Рго | Азр | Зег | Зег | Зег | УаЬ | УаЬ | УаЬ | Зег |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| СЬу | Ьеи | Меб | Уа1 | АЬа | ТЬг | Ьуз | Туг | СЬи | УаЬ | Зег | УаЬ | Туг | АЬа | Ьеи |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| Ьуз | Азр | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Зег | Агд | Рго | АЬа | СЬп | СЬу | УаЬ | УаЬ | ТЬг | ТЬг |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||
| Ьеи | СЬи |
<210> 5 <211> 89 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> частичная область фибронектина, называемая ΙΙΙ-13 <400> 5
| Азп | УаЬ | Зег | Рго | Рго | Агд | Агд | АЬа | Агд | УаЬ | ТЫ | Азр | АЬа | ТЬг | СЬи |
| Ь | 5 | 10 | Ь5 | |||||||||||
| ТЬг | ТЬг | ЬЬе | ТЬг | ЬЬе | Зег | Тгр | Агд | ТЫ | Ьуз | ТЬг | СЬи | ТЬг | Ые | ТЬг |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| СЬу | РЬе | СЬп | УаЬ | Азр | А1а | УаЬ | Рго | АЬа | Азп | СЬу | СЬп | ТЬг | Рго | ЬЬе |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| СЬп | Агд | ТЬг | Ые | Ьуз | Рго | Азр | УаЬ | Агд | Зег | Туг | ТЬг | ЬЬе | ТЬг | СЬу |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Ьеи | СЬп | Рго | С1у | ТЬг | Азр | Туг | Ьуз | Ые | Туг | Ьеи | Туг | ты | Ьеи | Азп |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| Азр | Азп | АЬа | Агд | Зег | Зег | Рго | УаЬ | УаЬ | Ые | Азр | А1а | Зег | ТЬг | |
| 80 | 85 |
<210> 6 <211> 90
- 38 010434 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> частичная область фибронектина, называемая ИЬ-14 <400> 6
| АЬа Ые 1 | Азр | АЬа | Рго 5 | Зег Азп Ьеи | Агд | РЬе 10 | Ьеи | АЬа | ТЫ | ТЬг | Рго 15 | |||
| Азп | Зег | Ьеи | Ьеи | УаЬ | Зег | Тгр | СЬп | Рго | Рго | Агд | АЬа | Агд | Ые | ТЬг |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| СЬу | туг | Ые | ЬЬе | Ьуз | Туг | СЬи | Ьуз | Рго | СЬу | Зег | Рго | Рго | Агд | СЬи |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| УаЬ | УаЬ | Рго | Агд | Рго | Агд | Рго | СЬу | УаЬ | ТЬг | СЬи | АЬа | ТЬг | ЬЬе | ТЬг |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| СЬу | Ьеи. | СЬи | Рго | еьу | ТЬг | СЬи | Туг | ТЬг | Не | Туг | УаЬ | Ые | АЬа | Ьеи |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| Ьуз | Азп | Азп | СЬп | Ьуз | Зег | СЬи | Рго | Ьеи | Ые | СЬу | Агд | Ьуз | Ьуз | ТЬг |
85 90 <210> 7 <211> 25 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> частичная область фибронектина, называемая СЗ-1 <400> 7
| Азр | СЬи | Ьеи | Рго | СЬп | Ьеи | УаЬ | ТЬг | Ьеи | Рго НЬз | Рго Азп Ьеи НЬз |
| Ь | 5 | ЬО | 15 | |||||||
| СЬу | Рго | СЬи | ЬЬе | Ьеи | Азр | УаЬ | Рго | Зег | ТЬг |
25 <210> 8 <211> 274 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> фрагмент фибронектина, называемый С-274 <400> й
| Рго | ТЬг | Азр | Ьеи | Агд | РЬе | ТЫ | Азп | Ие | СЬу | Рго | Азр | ТЬг | Меб | Агд |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
| УаЬ | ТЬг | Тгр | АЬа | Рго | Рго | Рго | Зег | ЬЬе | Азр | Ьеи | ТЬг | Азп | РЬе | Ьеи |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| УаЬ | Агд | Туг | Зег | Рго | УаЬ | Ьуз | Азп | СЬи | СЬи | Азр | УаЬ | А1а | СЬи | Ьеи |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Зег | Ие | Зег | Рго | Зег | Азр | Азп | АЬа | Уа1 | Уа1 | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | Ьеи |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Рго | СЬу | ТЬг | СЬи | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | УаЬ | Зег | Зег | УаЬ | Туг | СЬи | СЬп |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| НЬз | СЬи | Зег | ТЬг | Рго | Ьеи | Агд | СЬу | Агд | СЬп | Ьуз | ТЬг | СЬу | Ьеи | Азр |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||
| Зег | Рго | ТЬг | СЬу | Не | Азр | РЬе | Зег | Азр | ЬЬе | ТЬг | А1а | Азп | Зег | РЬе |
| 95 | 100 | 105 | ||||||||||||
| ТЬг | УаЬ | НЬз | Тгр | Ые | АЬа | Рго | Агд | АЬа | ТЬг | Ие | ТЬг | 61 у | Туг | Агд |
| 110 | 115 | 120 | ||||||||||||
| ЬЬе | Агд | НЬз | НЬз | Рго | СЬи | НЬз | РЬе | Зег | 61 у | Агд | Рго | Агд | С1и | Азр |
| 125 | 130 | 135 | ||||||||||||
| Агд | УаЬ | Рго | НЬз | Зег | Агд | Азп | Зег | Не | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | ТЬг |
| 140 | 145 | 150 |
- 39 010434
| Рго | С1у | ТЬг | С1и | Туг 155 | Уа1 | Уа1 | Зег | 11е Уа1 А1а 160 | Ьеи | Азп | 51у | Агд 165 | ||
| С1и | С1и | 5ег | Рго | Ьеи | Ьеи | 11е | С1у | С1п | С1п | Зег | ТЬг | Уа1 | Зег | Азр |
| 170 | 175 | 180 | ||||||||||||
| Уа1 | Рго | Агд | Авр | Ьеи | С1и | Уа1 | Уа1 | А1а | А1а | ТЬг | Рго | ТЬг | Зег | Ьеи |
| 185 | 190 | 195 | ||||||||||||
| Ьеи | Не | Зег | Тгр | Азр | А1а | Рго | А1а | Уа1 | ТЫ | Уа1 | Агд | Туг | Туг | Агд |
| 200 | 205 | 210 | ||||||||||||
| Не | ТЬг | Туг | С1у | С1и | ТЬг | С1у | 51 у | Азп | Зег | Рго | Уа1 | 61п | 51и | РЬе |
| 215 | 220 | 225 | ||||||||||||
| ТЬг | Уа1 | Рго | 61у | Зег | Ьуз | Зег | ТЬг | А1а | ТЬг | Не | Зег | 51 у | Ьеи | Ьуз |
| 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Рго | 61у | Уа1 | Азр | Туг | ТЬг | Не | ТЬг | Уа1 | Туг | А1а | Уа1 | ТЬг | С1у | Агд |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||
| С1у | Авр | Зег | Рго | А1а | Зег | Зег | Ьуз | Рго | Не | Зег | Х1е | Азп | Туг | Агд |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||
| ТЬг | С1и | Не | Азр |
<210> 9 <211> 271 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> фрагмент фибронектина, называемый Н-271 <400> 9
| А1а 1 | Не | Рго | А1а | Рго 5 | ТЬг | Азр | Ьеи | Ьуз | РЬе 10 | ТЬг | 61п | Уа1 | ТЫ | Рго 15 |
| ТЬг | Зег | Ьеи | Зег | А1а | С1п | Тгр | ТЬг | Рго | Рго | Азп | Уа1 | С1п | Ьеи | ТЬг |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| 61у | Туг | Агд | Уа1 | Агд | Уа1 | ТЬг | Рго | Ьуз | С1и | Ьуз | ТЬг | б1у | Рго | Мек |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Ьуз | С1и | Т1е | Азп | Ьеи | А1а | Рго | Азр | Зег | Зег | Зег | Уа1 | Уа1 | Уа1 | Зег |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Й1у | Ьеи | Мек | Уа1 | А1а | ТЬг | Ьуз | Туг | С1и | Уа1 | Зег | Уа1 | Туг | А1а | Ьеи |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| Ьуз | Азр | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Зег | Агд | Рго | А1а | С1п | С1у | Уа1 | Уа1 | ТЬг | ТЬг |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||
| Ьеи | 51и | Азп | Уа1 | Зег | Рго | Рго | Агд | Агд | А1а | Агд | Уа1 | ТЬг | Азр | А1а |
| 95 | 100 | 105 | ||||||||||||
| ТЬг | С1и | ТЬг | ТЬг | Не | ТЬг | Не | Зег | Тгр | Агд | ТЬг | Ьуз | ТЫ | С1и | ТЬг |
| 110 | 115 | 120 | ||||||||||||
| Не | ТЬг | 51у | РЬе | С1п | Уа1 | Азр | А1а | Уа1 | Рго | А1а | Азп | С1у | С1п | ТЫ |
| 125 | 130 | 135 | ||||||||||||
| Рго | Не | С1п | Агд | ТЬг | Не | Ьуз | Рго | Азр | Уа1 | Агд | Зег | Туг | ТЬг | Не |
| 140 | 145 | 150 | ||||||||||||
| ТЬг | С1у | Ьеи | С1п | Рго | С1у | ТЬг | Азр | Туг | Ьуз | Не | Туг | Ьеи | Туг | ТЬг |
| 155 | 160 | 165 | ||||||||||||
| Ьеи | Азп | Азр | Азп | А1а | Агд | Зег | Зег | Рго | Уа1 | Уа1 | Не | Азр | А1а | Зег |
| 170 | 175 | 180 | ||||||||||||
| ТЬг | А1а | Не | Азр | А1а | Рго | Зег | Азп | Ьеи | Агд | РЬе | Ьеи | А1а | ТЬг | ТЬг |
| 185 | 190 | 195 | ||||||||||||
| Рго | Азп | Зег | Ьеи | Ьеи | νβΐ | Зег | Тгр | С1п | Рго | Рго | Агд | А1а | Агд | Не |
| 200 | 205 | 210 | ||||||||||||
| ТЬг | С1у | Туг | Не | Не | Ьуз | Туг | С1и | Ьуз | Рго | С1у | Зег | Рго | Рго | Агд |
| 215 | 220 | 225 | ||||||||||||
| С1и | Уа1 | Уа1 | Рго | Агд | Рго | Агд | Рго | С1у | Уа1 | ТЬг | С1и | А1а | ТЬг | Не |
| 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| ТЬг | 51у | Ьеи | С1и | Рго | С1у | ТЬг | 51 и | Туг | ТЬг | Не | Туг | Уа1 | 11е | А1а |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||
| Ьеи | Ьуз | Азп | Азп | С1п | Ьуз | Зег | 51и | Рго | Ьеи | Не | С1у | Агд | Ьуз | Ьуз |
| 260 | 265 | 270 |
- 40 010434
ТЬг <210> 10 <211> 296 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> фрагмент фибронектина, называемый Н-296 <400> 10
| А1а 1 | ЬЬе | Рго АЬа | Рго ТЬг 5 | Азр Ьеи | Ьуз | РЬе 10 | ТЬг | СЬп | УаЬ ТЬг | Рго 15 | ||||
| ТЬг | Зег | Ьеи | Зег | АЬа | СЬп | Тгр | ТЬг | Рго | Рго | Азп | УаЬ | СЬп | Ьеи | ТЬг |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| СЬу | Туг | Агд | УаЬ | Агд | УаЬ | ТЬг | Рго | Ьуз | СЬи | Ьуз | ТЬг | СЬу | Рго | Меб |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Ьуз | СЬи | 11е | Азп | Ьеи | АЬа | Рго | Азр | Зег | Зег | Зег | УаЬ | УаЬ | УаЬ | Зег |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| СЬу | Ьеи | Меб | УаЬ | АЬа | ТЬг | Ьуз | Туг | СЬи | УаЬ | Зег | УаЬ | Туг | АЬа | Ьеи |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| Ьуз | Азр | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Зег | Агд | Рго | АЬа | СЬп | СЬу | УаЬ | УаЬ | ТЬг | ТЬг |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||
| Ьеи | СЬи | Азп | УаЬ | Зег | Рго | Рго | Агд | Агд | АЬа | Агд | УаЬ | ТЬг | Азр | АЬа |
| 95 | 100 | 105 | ||||||||||||
| ТЬг | СЬи | ТЬг | ТЬг | ЬЬе | ТЬг | ЬЬе | Зег | Тгр | Агд | ТЬг | Ьуз | ТЬг | СЬи | ТЬг |
| 110 | 115 | 120 | ||||||||||||
| Не | ТЬг | СЬу | РЬе | СЬп | УаЬ | Азр | АЬа | УаЬ | Рго | АЬа | Азп | СЬу | СЬп | ТЬг |
| 125 | 130 | 135 | ||||||||||||
| Рго | ЬЬе | СЬп | Агд | ТЬг | ЬЬе | Ьуз | Рго | Азр | УаЬ | Агд | Зег | Туг | ТЬг | ЬЬе |
| 140 | 145 | 150 | ||||||||||||
| ТЬг | СЬу | Ьеи | СЬп | Рго | СЬу | ТЬг | Азр | Туг | Ьуз | Не | Туг | Ьеи | Туг | ТЬг |
| 155 | 160 | 165 | ||||||||||||
| Ьеи | Азп | Азр | Азп | АЬа | Агд | Зег | Зег | Рго | УаЬ | УаЬ | Не | Азр | АЬа | Зег |
| 170 | 175 | 180 | ||||||||||||
| ТЬг | АЬа | Не | Азр | АЬа | Рго | Зег | Азп | Ьеи | Агд | РЬе | Ьеи | АЬа | ТЬг | ТЬг |
| 185 | 190 | 195 | ||||||||||||
| Рго | Азп | Зег | Ьеи | Ьеи | УаЬ | Зег | Тгр | СЬп | Рго | Рго | Агд | АЬа | Агд | ЬЬе |
| 200 | 205 | 210 | ||||||||||||
| ТЬг | СЬу | Туг | Не | ЬЬе | Ьуз | Туг | СЬи | Ьуз | Рго | СЬу | Зег | Рго | Рго | Агд |
| 215 | 220 | 225 | ||||||||||||
| СЬи | УаЬ | УаЬ | Рго | Агд | Рго | Агд | Рго | СЬу | УаЬ | ТЬг | СЬи | АЬа | ТЬг | ЬЬе |
| 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| ТЬг | СЬу | Ьеи | СЬи | Рго | СЬу | ТЬг | СЬи | Туг | ТЬг | Не | Туг | УаЬ | Не | АЬа |
| 24 5 | 250 | 255 | ||||||||||||
| Ьеи | Ьуз | Азп | Азп | СЬп | Ьуз | Зег | СЬи | Рго | Ьеи | ЬЬе | СЬу | Агд | Ьуз | Ьуз |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||
| ТЬг | Азр | СЬи | Ьеи | Рго | СЬп | Ьеи | УаЬ | ТЬг | Ьеи | Рго | НЬз | Рго | Азп | Ьеи |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||
| НЬз | СЬу | Рго | СЬи | ЬЬе | Ьеи | Азр | УаЬ | Рго | Зег | ТЬг |
290 295 <210> 11 <211> 549 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> фрагмент фибронектина, называемый СН-271 <400> 11
Рго ТЬг Азр Ьеи Агд РЬе ТЬг Азп 11е СЬу Рго Азр ТЬг Меб Агд
- 41 010434
10 15
| Уа1 ТЬг Тгр | А1а | Рго Рго Рго 20 | Зег | 11е Азр 25 | Ьеи | ТЫ | Азп | РЬе | Ьеи 30 | |||||
| Уа1 | Агд | Туг | Зег | Рго | Уа1 | Ьуз | Азп | С1и | 61и | Азр | Уа1 | А1а | 61и | Ьеи |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Бег | 11е | Зег | Рго | Зег | Азр | Азп | А1а | Уа1 | Уа1 | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | Ьеи |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Рго | 61у | ТЬг | С1и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Бег | Уа1 | Туг | 61и | 61п |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| Н1з | С1и | Зег | ТЬг | Рго | Ьеи | Агд | С1у | Агд | С1п | Ьуз | ТЬг | 61у | Ьеи | Азр |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||
| Зех | Рго | ТЬг | С1у | 11е | Азр | РЬе | Зег | Азр | Не | ТЬг | А1а | Азп | Бег | РЬе |
| 95 | 100 | 105 | ||||||||||||
| ТЬг | Уа1 | НЬз | Тгр | Не | А1а | Рго | Агд | А1а | ТЬг | Не | ТЫ | 61у | Туг | Агд |
| 110 | 115 | 120 | ||||||||||||
| Не | Агд | Низ | Низ | Рго | С1и | Н1з | РЬе | Зег | 61 у | Агд | Рго | Агд | б1и | Азр |
| 125 | 130 | 135 | ||||||||||||
| Агд | Уа1 | Рго | Н1 5 | Зег | Агд | Азп | Зег | Не | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | ТЬг |
| 140 | 145 | 150 | ||||||||||||
| Рго | С1у | ТЬг | 61и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Не | Уа1 | А1а | Ьеи | Азп | С1у | Агд |
| 155 | 160 | 165 | ||||||||||||
| С1и | 61и | Зег | Рю | Ьеи | Ьеи | Не | С1у | 61п | 61п | Зех | ТЬг | Уа1 | Бег | Азр |
| 170 | 175 | 180 | ||||||||||||
| Уа1 | Рго | Агд | Азр | Ьеи | 61и | Уа1 | Уа1 | АТа | А1а | ТЬг | Рго | ТЬг | Зег | Ьеи |
| 185 | 190 | 195 | ||||||||||||
| Ьеи | Не | Зег | Тгр | Азр | А1а | Рго | А1а | Уа1 | ТЬг | Уа1 | Агд | Туг | Туг | Агд |
| 200 | 205 | 210 | ||||||||||||
| Не | ТЬг | Туг | С1у | С1и | ТЬг | 61у | С1у | Азп | Зег | Рго | Уа1 | С1п | 61и | РЬе |
| 215 | 220 | 225 | ||||||||||||
| ТЬг | Уа1 | Рго | С1у | Зег | Ьуз | Зег | ТЬг | А1а | ТЬг | Не | Зег | 61у | Ьеи | Ьуз |
| 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Рго | С1у | Уа1 | Азр | Туг | ТЬг | Не | ТЬг | Уа1 | Туг | А1а | Уа1 | ТЬг | 61у | Агд |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||
| 61 у | Азр | Зег | Рю | А1а | Зег | Зег | Ьуз | Рго | Не | Бег | Не | Азп | Туг | Агд |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||
| ТЬг | С1и | 11е | Азр | Ьуз | Рго | Бег | МеД | А1а | Не | Рго | А1а | Рго | ТЬг | Азр |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||
| Ьеи | Ьуз | РЬе | ТЬг | 61п | Уа1 | ТЬг | Рго | ТЬг | Зег | Ьеи | Зег | А1а | 61п | Тгр |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||
| ТЬг | Рго | Рго | Азп | Уа1 | С1п | Ьеи | ТЬг | 61у | тух | Агд | Уа1 | Агд | Уа1 | ТЬх |
| 305 | 310 | 315 | ||||||||||||
| Рго | Ьуз | С1и | Ьуз | ТЬг | С1у | Рго | МеД | Ьуз | 61и | Не | Азп | Ьеи | А1а | Рго |
| 320 | 325 | 330 | ||||||||||||
| Азр | Бег | Бег | Зег | Уа1 | Уа1 | Уа1 | Зег | С1у | Ьеи | МеД | Уа1 | А1а | ТЬг | Ьуз |
| 335 | 340 | 345 | ||||||||||||
| Туг | 51и | Уа1 | Зег | Уа1 | Туг | А1а | Ьеи | Ьуз | Азр | ТЫ | Ьеи | ТЫ | Зег | Агд |
| 350 | 355 | 360 | ||||||||||||
| Рго | А1а | Б1п | С1у | Уа1 | Уа1 | ТЬг | ТЫ | Ьеи | 61и | Азп | Уа1 | Зег | Рго | Рго |
| 365 | 370 | 375 | ||||||||||||
| Агд | Агд | А1а | Агд | Уа1 | ТЬг | Азр | А1а | ТЬг | 61и | ТЬг | ТЬг | Не | ТЫ | Не |
| 380 | 385 | 390 | ||||||||||||
| Зег | Тгр | Агд | ТЬг | Ьуз | ТЬг | С1и | ТЬг | Не | ТЬг | 61у | РЬе | 61п | Уа1 | Азр |
| 395 | 400 | 405 | ||||||||||||
| А1а | Уа1 | Рго | А1а | Азп | С1у | С1п | ТЬг | Рго | Не | 61п | Агд | ТЬГ | Не | Ьуз |
| 410 | 415 | 420 | ||||||||||||
| Рго | Азр | Уа1 | Агд | Зег | Туг | ТЬг | Не | ТЬг | 61у | Ьеи | 61п | Рго | С1у | ТЬг |
| 425 | 430 | 435 | ||||||||||||
| Азр | Туг | Ьуз | Не | Туг | Ьеи | Туг | ТЬг | Ьеи | Азп | Азр | Азп | А1а | Агд | Зех |
| 440 | 445 | 450 | ||||||||||||
| Зег | Рго | Уа1 | Уа1 | Не | Азр | А1а | Зег | ТЬг | А1а | Не | Азр | А1а | Рго | Зег |
| 455 | 460 | 465 | ||||||||||||
| Азп | Ьеи | Агд | РЬе | Ьеи | А1а | ТЫ | ТЫ | Рго | Азп | Зег | Ьеи | Ьеи | Уа1 | Зег |
| 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| Тгр | С1п | Рго | Рго | Агд | А1а | Агд | Не | ТЬг | 61у | Туг | Не | 11е | Ьуз | Тух |
- 42 010434
| 485 | 490 | 495 | ||||||||||||
| 51и | Ъуз | Рго | С1у | Зег | Рго | Рго | Агд | С1и | Уа1 | Уа1 | Рго | Агд | Рго | Агд |
| 500 | 505 | 510 | ||||||||||||
| Рго | 61у | Уа1 | ТЬг | С1и | А1а | ТЬг | Не | ТЬг | С1у | Ьеи | <31и | Рго | С1у | ТЬг |
| 515 | 520 | 525 | ||||||||||||
| С1и | Туг | ТЬг | Не | Туг | 17а 1 | Не | А1а | Ъеи | Ъуз | Азп | Азп | 61П | Ъуз | Зег |
| 530 | 535 | 540 | ||||||||||||
| С1и | Рго | Ъеи | Не | 61у | Агд | Ъуз | Ьуз | ТЬг |
545 <210> 12 <211> 574 <212> РИТ <213> Искусственная последовательность <220>
<22 3> фрагмент фибронектина, называемый СН-296 <400> 12
| Рго 1 | ТЬг | Азр Ьеи Агд 5 | РЬе | ТЬг | Азп | Не б1у Рго Азр 10 | ТЫ МеЪ | Агд 15 | ||||||
| Уа1 | ТЬг | Тгр | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | Не | Азр | Ьеи | ТЬг | Азп | РЬе | Ьеи |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Уа1 | Агд | Туг | Зег | Рго | Уа1 | Ъуз | Азп | С1и | 61и | Азр | Уа1 | А1а | С1и | Ьеи |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Зег | Не | Зег | Рго | Зег | Азр | Азп | А1а | Уа1 | Уа1 | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | Ьеи |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Рго | 61у | ТЬг | 61и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Зег | Уа1 | Туг | 61и | С1п |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| НЪз | С1и | Зег | ТЬг | Рго | Ьеи | Агд | 61у | Агд | 61п | Ъуз | ТЬг | 61у | Ьеи | Азр |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||
| Зег | Рго | ТЬг | С1у | Не | Азр | РЬе | Зег | Азр | Не | ТЬг | А1а | Азп | Зег | РЬе |
| 95 | 100 | 105 | ||||||||||||
| ТЬг | Уа1 | Н1з | Тгр | Не | А1а | Рго | Агд | А1а | ТЬг | Не | ТЬг | 61у | Туг | Агд |
| 110 | 115 | 120 | ||||||||||||
| Не | Агд | Н1з | Н15 | Рго | 61и | ΗΪ3 | РЬе | Зег | 61у | Агд | Рго | Агд | 61и | Азр |
| 125 | 130 | 135 | ||||||||||||
| Агд | Уа1 | Рго | Н15 | Зег | Агд | Азп | Зег | Не | ТЬг | Ъеи | ТЬг | Азп | Ьеи | ТЬг |
| 140 | 145 | 150 | ||||||||||||
| Рго | С1у | ТЬг | С1и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Не | 17а 1 | А1а | Ьеи | Азп | 61у | Агд |
| 155 | 160 | 165 | ||||||||||||
| 61и | 61и | Зег | Рго | Ьеи | Ьеи | 11е | 61у | С1п | 61п | Зег | ТЬг | Уа1 | Зег | Азр |
| 170 | 175 | 180 | ||||||||||||
| Уа1 | Рго | Агд | Азр | Ьеи | 61и | Уа1 | Уа1 | А1а | А1а | ТЬг | Рго | ТЬг | Зег | Ьеи |
| 185 | 190 | 195 | ||||||||||||
| Ьеи | Не | Зег | Тгр | Азр | А1а | Рго | А1а | 17а 1 | ТЬг | 17а 1 | Агд | Туг | Туг | Агд |
| 200 | 205 | 210 | ||||||||||||
| 11е | ТЬг | Туг | 61 у | 61и | ТЬг | 61у | С1у | Азп | Зег | Рго | 17а 1 | 61п | 61и | РЬе |
| 215 | 220 | 225 | ||||||||||||
| ТЬг | Уа1 | Рго | 61у | Зег | Ъуз | Зег | ТЬг | А1а | ТЬг | Не | Зег | 61у | Ьеи | Ьуз |
| 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Рго | 31у | Уа1 | Азр | Туг | ТЬг | Не | ТЬг | Уа1 | Туг | А1а | Уа1 | ТЬг | 61у | Агд |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||
| 61у | Азр | Зег | Рго | А1а | Зег | Зег | Ьуз | Рго | Не | Зег | Не | Азп | Туг | Агд |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||
| ТЬг | 61и | Не | Азр | Ьуз | Рго | Зег | Мег | А1а | 11е | Рго | А1а | Рго | ТЬг | Азр |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||
| Ъеи | Ъуз | РЬе | ТЬг | 61п | Уа1 | ТЬг | Рго | ТЬг | Зег | Ъеи | Зег | А1а | С1п | Тгр |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||
| ТЬг | Рго | Рго | Азп | Уа1 | С1п | Ьеи | ТЬг | 61у | Туг | Агд | Уа1 | Агд | Уа1 | ТЬг |
| 305 | 310 | 315 | ||||||||||||
| Рго | Ъуз | 61и | Ьуз | ТНг | 61у | Рго | МеЬ | Ьуз | 61и | Не | Азп | Ьеи | А1а | Рго |
| 320 | 325 | 330 |
- 43 010434
| Азр Зег Зег Зег Уа1 Уа1 | Уа1 | Зег С1у | Ьеи 340 | Мей Уа1 А1а | ТЬг | Ьуз 345 | ||||||||
| 335 | ||||||||||||||
| Туг | 61и | Уа1 | Зег | Уа1 | Туг | А1а | Ьеи | Ьуз | Азр | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Зег | Агд |
| 350 | 355 | 360 | ||||||||||||
| Рго | А1а | 61п | С1у | Уа1 | Уа1 | ТЬг | ТЬг | Ьеи | 61и | Азп | Уа1 | Зег | Рго | Рго |
| 365 | 370 | 375 | ||||||||||||
| Агд | Агд | А1а | Агд | Уа1 | ТЬг | Азр | А1а | ТЬг | 01и | ТЬг | ТЬг | Не | ТЬг | Не |
| 380 | 385 | 390 | ||||||||||||
| Зег | Тгр | Агд | ТЬг | Ьуз | ТЬг | С1и | ТЬг | Не | ТЫ | 61у | РЬе | 01п | Уа1 | Азр |
| 395 | 400 | 405 | ||||||||||||
| А1а | Уа1 | Рго | А1а | Азп | С1у | С1п | ТЬг | Рго | Не | 61п | Агд | ТЬг | Не | Ьуз |
| 410 | 415 | 420 | ||||||||||||
| Рго | Азр | Уа1 | Агд | Зег | Туг | ТЬг | Не | ТЬг | 01 у | Ьеи | С1п | Рго | С1у | ТЬг |
| 425 | 430 | 435 | ||||||||||||
| Азр | Туг | Ьуз | Не | Туг | Ьеи | Туг | ТЬг | Ьеи | Азп | Азр | Азп | А1а | Агд | Зег |
| 440 | 445 | 450 | ||||||||||||
| Зег | Рго | Уа1 | Уа1 | Не | Азр | А1а | Зег | ТЬг | А1а | Не | Азр | А1а | Рго | Зег |
| 455 | 460 | 465 | ||||||||||||
| Азп | Ьеи | Агд | РЬе | Ьеи | А1а | ТЬг | ТЬг | Рго | Азп | Зег | Ьеи | Ьеи | Уа1 | Зег |
| 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| Тгр | 01п | Рго | Рго | Агд | А1а | Агд | Не | ТЬг | 01 у | Туг | 11е | 11е | Ьуз | Туг |
| 485 | 490 | 495 | ||||||||||||
| 61и | Ьуз | Рго | С1у | Зег | Рго | Рго | Агд | 01 и | Уа1 | Уа1 | Рго | Агд | Рго | Агд |
| 500 | 505 | 510 | ||||||||||||
| Рго | С1у | Уа1 | ТЬг | С1и | А1а | ТЬг | Не | ТЬг | С1у | Ьеи | С1и | Рго | С1у | ТЬг |
| 515 | 520 | 525 | ||||||||||||
| С1и | Туг | ТЬг | 11е | Туг | Уа1 | Не | А1а | Ьеи | Ьуз | Азп | Азп | 01п | Ьуз | Зег |
| 530 | 535 | 540 | ||||||||||||
| С1и | Рго | Ьеи | Не | С1у | Агд | Ьуз | Ьуз | ТЬг | Азр | 01и | Ьеи | Рго | С1п | Ьеи |
| 545 | 550 | 555 | ||||||||||||
| Уа1 | ТЬг | Ьеи | Рго | Н1з | Рго | Азп | Ьеи | (Из | 01у | Рго | 01и | Не | Ьеи | Азр |
| 560 | 565 | 570 | ||||||||||||
| Уа1 | Рго | Зег | ТЬг |
<210> 13 <211> 302 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> фрагмент фибронектина, называемый С-С31 <400> 13
| Рго 1 | ТЬг | Азр | Ьеи | Агд РЬе ТЬг Азп 5 | 11е | 01у 10 | Рго | Азр | ТЬг | Мей | Агд 15 | |||
| Уа1 | ТЬг | Тгр | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | 11е | Азр | Ьеи | ТЬг | Азп | РЬе | Ьеи |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Уа1 | Агд | Туг | Зег | Рго | Уа1 | Ьуз | Азп | С1и | 01и | Азр | Уа1 | А1а | С1и | Ьеи |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Зег | Не | Зег | Рго | Зег | Азр | Азп | А1а | Уа1 | Уа1 | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | Ьеи |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Рго | 01 у | ТЬг | 01и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Зег | Уа1 | Туг | 61и | 61п |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| Н1з | С1и | Зег | ТЬг | Рго | Ьеи | Агд | С1у | Агд | С1п | Ьуз | ТЬг | С1у | Ьеи | Азр |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||
| Зег | Рго | ТЬг | С1у | Не | Азр | РЬе | Зег | Азр | Не | ТЬг | А1а | Азп | Зег | РЬе |
| 95 | 100 | 105 | ||||||||||||
| ТЬг | Уа1 | Н1з | Тгр | Не | А1а | Рго | Агд | А1а | ТЬг | Не | ТЬг | 01у | Туг | Агд |
| 110 | 115 | 120 | ||||||||||||
| Не | Агд | ΗΪ3 | Н1з | Рго | 61и | ΗΪ3 | РЬе | Зег | 01у | Агд | Рго | Агд | 01 и | Азр |
| 125 | 130 | 135 | ||||||||||||
| Агд | Уа1 | Рго | Н1з | Зег | Агд | Азп | Зег | 11е | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | ТЬг |
| 140 | 145 | 150 |
- 44 010434
| Рго | 61у | ТЬг 61и Туг 155 | Уа1 | Уа1 | Зег | Не Уа1 160 | А1а | Ьеи | Азп | С1у | Агд 165 | |||
| 61и | 61и | Зег | Рго | Ьеи | Ьеи | Не | 51у | 61п | 61п | Зег | ТЬг | Уа1 | Зег | Азр |
| 170 | 175 | 180 | ||||||||||||
| Уа1 | Рго | Агд | Азр | Ьеи | С1и | Уа1 | Уа1 | А1а | А1а | ТЬг | Рго | ТЬг | Зег | Ьеи |
| 185 | 190 | 195 | ||||||||||||
| Ьеи | Ые | Зег | Тгр | Азр | А1а | Рго | А1а | Уа1 | ТЫ | Уа1 | Агд | Туг | Туг | Агд |
| 200 | 205 | 210 | ||||||||||||
| Не | ТЬг | Туг | 51 у | С1и | ТЬг | С1у | 61у | Азп | Зег | Рго | Уа1 | С1п | 61и | РЬе |
| 215 | 220 | 225 | ||||||||||||
| ТЬг | Уа1 | Рго | 61у | Зег | Ьуз | Зег | ТЬг | А1а | ТЬг | Не | Зег | С1у | Ьеи | Ьуз |
| 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Рго | С1у | Уа1 | Азр | Туг | ТЬг | Не | ТЬг | Уа1 | Туг | А1а | Уа1 | ТЬг | С1у | Агд |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||
| 61у | Азр | Зег | Рго | А1а | Зег | Зег | Ьуз | Рго | Не | Зег | Не | Азп | Туг | Агд |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||
| ТЬг | С1и | Не | Азр | Ьуз | Рго | Зег | Азр | С1и | Ьеи | Рго | С1п | Ьеи | Уа1 | ТЫ |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||
| Ьеи | Рго | Н13 | Рго | Азп | Ьеи | Н1з | С1у | Рго | С1и | Не | Ьеи | Азр | Уа1 | Рго |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||
| Зег | ТЬг |
<210> 14 <211> 367 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> фрагмент фибронектина, называемый СНУ-89 <400> 14
| Рго ТЬг Азр Ьеи Агд | РЬе | ТЬг | Азп | Не С1у Рго 10 | Азр | ТЬг | МеЕ | Ахд 15 | ||||||
| 1 | 5 | |||||||||||||
| Уа1 | ТЬг | Тгр | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | Не | Азр | Ьеи | ТЬх | Азп | РЬе | Ьеи |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Уа1 | Агд | Туг | Зег | Рго | Уа1 | Ьуз | Азп | 51и | 61и | Азр | Уа1 | А1а | С1и | Ьеи |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Зег | Не | Зег | Рго | Зег | Азр | Азп | А1а | Уа1 | Уа1 | Ьеи | ТЬх | Азп | Ьеи | Ьеи |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Рго | 61у | ТЬг | 01 и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Зег | Уа1 | Туг | б1и | 61П |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| Н1з | С1и | Зег | ТЬг | Рго | Ьеи | Агд | С1у | Агд | 61п | Ьуз | ТЬг | С1у | Ьеи | Азр |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||
| Зег | Рго | ТЬг | С1у | 11е | Азр | РЬе | Зег | Азр | Не | ТЬг | А1а | Азп | Зех | РЬе |
| 95 | 100 | 105 | ||||||||||||
| ТЬг | Уа1 | ΗΪ3 | Тгр | Не | А1а | Рго | Агд | А1а | ТЬг | Не | ТЬг | 61у | Туг | Агд |
| 110 | 115 | 120 | ||||||||||||
| Не | Агд | Н1з | НХЗ | Рго | 61и | Н1з | РЬе | Зег | 61 у | Агд | Рхо | Агд | С1и | Азр |
| 125 | 130 | 135 | ||||||||||||
| Агд | Уа1 | Рго | Н1з | Зег | Агд | Азп | Зег | Не | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | ТЬг |
| 140 | 145 | 150 | ||||||||||||
| Рго | 61у | ТЬг | 31и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | 11е | Уа1 | А1а | Ьеи | Азп | О1у | Агд |
| 155 | 160 | 165 | ||||||||||||
| С1и | (Ии | Зег | Рго | Ьеи | Ьеи | Не | б1у | С1п | <31п | Зех | ТЬх | Уа1 | Зех | Азр |
| 170 | 175 | 180 | ||||||||||||
| Уа1 | Рго | Агд | Азр | Ьеи | 51и | Уа1 | Уа1 | А1а | А1а | ТЬх | Рхо | ТЬг | Зег | Ьеи |
| 185 | 190 | 195 | ||||||||||||
| Ьеи | 11е | Зег | Тгр | Азр | А1а | Рго | А1а | Уа1 | ТЬг | Уа1 | Агд | Туг | Туг | Ахд |
| 200 | 205 | 210 | ||||||||||||
| Ые | ТЬг | Туг | С1у | С1и | ТЬг | С1у | 61у | Азп | Зех | Рхо | Уа1 | С1п | С1и | РЬе |
| 215 | 220 | 225 | ||||||||||||
| ТЬг | Уа1 | Рго | 61у | Зег | Ьуз | Зег | ТЬг | А1а | ТЙГ | Не | Зег | С1у | Ьеи | Ьуз |
| 230 | 235 | 240 |
- 45 010434
| Рго | С1у | Уа1 Азр | Туг ТНг 245 | Не ТНг Уа1 | Туг А1а Уа1 250 | ТЬг | О1у | Агд 255 | ||||||
| 61у | Азр | Зег | Рго | А1а | Зег | Зег | Ьуз | Рго | Не | Зег | Не | Азп | Туг | Агд |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||
| ТНг | С1и | Не | Азр | Ьуз | Рго | Зег | МеН | Азп | Уа1 | Зег | Рго | Рго | Агд | Агд |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||
| А1а | Агд | Уа1 | ТНг | Азр | А1а | ТЫ | 01и | ТЬг | ТЬг | Не | ТЬг | Не | Зег | Тгр |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||
| Агд | ТНг | Ьуз | ТНг | С1и | ТНг | Не | ТЬг | 61у | РЬе | С1п | Уа1 | Азр | А1а | Уа1 |
| 305 | 310 | 315 | ||||||||||||
| Рго | А1а | Азп | 01у | 01П | ТНг | Рго | Не | С1п | Агд | ТЬг | Не | Ьуз | Рго | Азр |
| 320 | 325 | 330 | ||||||||||||
| Уа1 | Агд | Зег | Туг | ТНг | Не | ТНг | С1у | Ьей | 61п | Рго | 61у | ТЫ | Азр | Туг |
| 335 | 340 | 345 | ||||||||||||
| Ьуз | Не | Туг | Ьей | Туг | ТЬг | Ьей | Азп | Азр | Азп | А1а | Агд | Зег | Зег | Рго |
| 350 | 355 | 360 | ||||||||||||
| Уа1 | Уа1 | Не | Азр | А1а | Зег | ТНг | ||||||||
| 365 |
<210> 15 <211> 363 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> фрагмент фибронектина, называемый СНУ-9О <400> 15
| Рго ТНг Азр Ьей Агд РНе ТНг Азп 11е 61у | Рго Азр | ТНг | меб | Агд 15 | ||||||||||
| 1 | 5 | 10 | ||||||||||||
| Уа1 | ТЬг | Тгр | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | 11е | Азр | Ьей | ТНг | Азп | РЬе | Ьей |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Уа1 | Агд | Туг | Зег | Рго | Уа1 | Ьуз | Азп | С1и | С1и | Азр | Уа1 | А1а | С1и | Ьей |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Зег | 11е | Зег | Рго | Зег | Азр | Азп | А1а | Уа1 | Уа1 | Ьей | ТЬг | Азп | Ьей | Ьей |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Рго | С1у | ТЬг | 61и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Зег | Уа1 | Туг | С1и | 01п |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| Н1з | С1и | Зег | ТЬг | Рго | Ьей | Агд | С1у | Агд | Θΐη | Ьуз | ТНг | 01 у | Ьей | Азр |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||
| Зег | Рго | ТЬг | 01 у | Не | Азр | РЬе | Зег | Азр | Не | ТЬг | А1а | Азп | Зег | РЬе |
| 95 | 100 | 105 | ||||||||||||
| ТНг | Уа1 | Н1з | Тгр | 11е | А1а | Рго | Агд | А1а | ТЫ | Не | ТНг | 01 у | Туг | Агд |
| 110 | 115 | 120 | ||||||||||||
| Не | Агд | Н1з | Н1з | Рго | С1и | ΗΪ3 | РЬе | Зег | б1у | Агд | Рго | Агд | 01 и | Азр |
| 125 | 1зо | 135 | ||||||||||||
| Агд | Уа1 | Рго | Н1з | Зег | Агд | Азп | Зег | Не | ты | Ьеа | ТЬг | Азп | Ьей | ТЬг |
| 140 | 145 | 150 | ||||||||||||
| Рго | С1у | ТЬг | С1и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Не | Уа1 | А1а | Ьей | Азп | С1у | Агд |
| 155 | 160 | 165 | ||||||||||||
| С1и | 61и | Зег | Рго | Ьей | Ьей | Не | 61у | 01п | С1п | Зег | ТЬг | Уа1 | Зег | Азр |
| 170 | 175 | 180 | ||||||||||||
| Уа1 | Рго | Агд | Азр | Ьей | С1и | Уа1 | Уа1 | А1а | А1а | ТЬг | Рго | ТЬг | 8ег | Ьей |
| 185 | 190 | 195 | ||||||||||||
| Ьей | Не | Зег | Тгр | Азр | А1а | Рго | А1а | Уа1 | ТЬг | Уа1 | Агд | Туг | Туг | Агд |
| 200 | 205 | 210 | ||||||||||||
| Не | ТЬг | Туг | 01у | С1и | ТЬг | 61у | С1у | Азп | Зег | Рго | Уа1 | 01 п | 01 и | РЬе |
| 215 | 220 | 225 | ||||||||||||
| ТЬг | Уа1 | Рго | 01 у | Зег | Ьуз | Зег | ТЬг | А1а | ТЬг | 11е | Зег | 01 у | Ьей | Ьуз |
| 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Рго | С1у | ν«1 | Азр | Туг | ТЬг | Не | ТЬг | Уа1 | Туг | А1а | Уа1 | ТЫ | 01 у | Агд |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||
| 01 у | Азр | Зег | Рго | А1а | Зег | Зег | Ьуз | Рго | Не | Зег | Не | Азп | Туг | Агд |
- 46 010434
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||
| ТЬг | С1и | Не | Азр | Ъуз | Рго | Зег | Мек | АЪа | 11е | Азр | АЪа | Рго | Зег | Азп |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||
| Ьей | Агд | РЬе | Ьей | А1а | ТЬг | ТЫ | Рго | Азп | Зег | Ъеи | Ъеи | Уа1 | Зег | Тгр |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||
| С1п | Рго | Рго | Агд | А1а | Агд | 11е | ТЬг | СЪу | Туг | Не | Не | Ъуз | Туг | СЪи |
| 305 | 310 | 315 | ||||||||||||
| Ъуз | Рго | СЪу | Зег | Рго | Рго | Агд | СЪи | Уа1 | Уа1 | Рго | Агд | Рго | Агд | Рго |
| 320 | 325 | 330 | ||||||||||||
| СЪу | Уа1 | ТЬг | СЪи | АЪа | ТЪг | Не | ТЬг | СЪу | Ъеи | СЪи | Рго | СЪу | ТЬг | СЪи |
| 335 | 340 | 345 | ||||||||||||
| Туг | ТЬг | Не | Туг | Уа1 | Не | А1а | Ъеи | Ъуз | Азп | Азп | СЪп | Ъуз | Зег | СЪи |
| 350 | 355 | 360 | ||||||||||||
| Рго | Ьей | Не | СЪу | Агд | Ъуз | Ъуз | ТЬг | |||||||
| 365 |
<210> 16 <211> 370 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> фрагмент фибронектина, называемый С№-92 <400> 16
| Рго ТЬг Азр 1 | Ъеи Агд РЬе 5 | ТЪг | Азп Не | С1у 10 | Рго | Азр ТЬг | Мек | Агд 15 | ||||||
| Уа1 | ТЬг | Тгр | АЪа | Рго | Рго | Рго | Зег | Не | Азр | Ъеи | ТЬг | Азп | РЬе | Ъеи |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Уа1 | Агд | Туг | Зег | Рго | Уа1 | Ъуз | Азп | СЪи | СЪи | Азр | Уа1 | АЪа | СЪи | Ъеи |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Зег | Не | Зег | Рго | Зег | Азр | Азп | АЪа | Уа1 | Уа1 | Ъеи | ТЬг | Азп | Ъеи | Ъеи |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Рго | СЪу | ТЬг | СЪи | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Зег | Уа1 | Туг | СЪи | СЪп |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| НЪз | СЪи | Зег | ТЬг | Рго | Ъеи | Агд | С1у | Агд | СЪп | Ъуз | ТЫ | СЪу | Ъеи | Азр |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||
| Зег | Рго | ТЬг | СЪу | 11е | Азр | РЬе | Зег | Азр | Не | ТЬг | А1а | Азп | Зег | РЬе |
| 95 | 100 | 105 | ||||||||||||
| ТЬг | УаЪ | НЪз | Тгр | Не | АЪа | Рго | Агд | АЪа | ТЬг | Не | ТЬг | СЪу | Туг | Агд |
| 110 | 115 | 120 | ||||||||||||
| Не | Агд | НЪз | НЪз | Рго | СЪи | НЪз | РЬе | Зег | СЪу | Агд | Рго | Агд | СЪи | Азр |
| 125 | 130 | 135 | ||||||||||||
| Дгд | Уа1 | Рго | НЪз | Зег | Агд | Азп | Зег | Не | ТЬг | Ъеи | ТЬг | Азп | Ъеи | ТЫ |
| 140 | 145 | 150 | ||||||||||||
| Рго | СЪу | ТЬг | 61и | Туг | Уа1 | УаЪ | Зег | Не | Уа1 | АЪа | Ъеи | Азп | СЪу | Агд |
| 155 | 160 | 165 | ||||||||||||
| СЪи | СЪи | Зег | Рго | Ъеи | Ъеи | Не | СЪу | СЪп | 61п | Зег | ТЬг | УаЪ | Зег | Азр |
| 170 | 175 | 180 | ||||||||||||
| Уа1 | Рго | Агд | Азр | Ъеи | СЪи | Уа1 | Уа1 | АЪа | АЪа | ТЬг | Рго | ТЬг | Зег | Ъеи |
| 185 | 190 | 195 | ||||||||||||
| Ъеи | 11е | Зег | Тгр | Азр | АЪа | Рго | АЪа | УаЪ | ТЬг | УаЪ | Агд | Туг | Туг | Ахд |
| 200 | 205 | 210 | ||||||||||||
| Не | ТЬг | Туг | 61 у | СЪи | ТЬг | 61у | 61у | Азп | Зег | Рго | Уа1 | СЪп | С1и | РЬе |
| 215 | 220 | 225 | ||||||||||||
| ТЬг | УаЪ | Рго | СЪу | Зег | Ъуз | Зег | тьг | АЪа | ТЬг | Не | Зег | СЪу | Ъеи | Ъуз |
| 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Рго | СЪу | Уа1 | Азр | Туг | ТЬг | 11е | ТЬг | УаЪ | Туг | АЪа | Уа1 | ТЫ | С1у | Агд |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||
| СЪу | Азр | Зег | Рго | АЪа | Зег | Зег | Ъуз | Рго | Не | Зег | Не | Азп | Туг | Агд |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||
| ТЬг | СЪи | Не | Азр | Ъуз | Рго | Зег | Мек | АЪа | Не | Рго | АЪа | Рго | ТЫ | Азр |
| 275 | 280 | 285 |
- 47 010434
| Ьеи | Ьуз | РЬе | ТЬг | 61п Уа1 290 | ТЫ | Рго ТЬг | Зег 295 | Ьеи Зег | А1а С1п | Тгр 300 | ||||
| ТЫ | Рго | Рго | Азп | Уа1 | 61п | Ьеи | ТЬг | С1у | Туг | Агд | Уа1 | Агд | Уа1 | ТЫ |
| 305 | 310 | 315 | ||||||||||||
| Рго | Ьуз | С1и | Ьуз | ТЬг | С1у | Рго | МеЬ | Ьуз | С1и | Не | Азп | Ьеи | А1а | Рго |
| 320 | 325 | 330 | ||||||||||||
| Азр | Зег | Зег | Зег | Уа1 | Уа1 | Уа1 | Зег | С1у | Ьеи | Ме± | Уа1 | А1а | ТЬг | Ьуз |
| 335 | 340 | 345 | ||||||||||||
| Туг | С1и | Уа1 | Зег | Уа1 | Туг | А1а | Ьеи | Ьуз | Азр | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Зег | Агд |
| 350 | 355 | 360 | ||||||||||||
| Рго | А1а | С1п | С1у | Уа1 | Уа1 | ТЬг | ТЬг | Ьеи | 61и | |||||
| 365 | 370 |
<210 17 <211> 457 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> фрагмент фибронектина, называемый СНУ-179 <4С0> 17
| Рго ТЬг Азр Ьеи Агд | РЬе | ТЬг | Азп | Не | С1у 10 | Рго | Азр ТЬг | МеХ | Агд 15 | |||||
| 1 | 5 | |||||||||||||
| Уа1 | ТЫ | Тгр | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | 11е | Азр | Ьеи | ТЬг | Азп | РЬе | Ьеи |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Уа1 | Агд | Туг | Зег | Рго | Уа1 | Ьуз | Азп | 01и | С1и | Азр | 7а1 | А1а | 61и | Ьеи |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Зег | Не | Зег | Рго | Зех | Азр | Азп | А1а | Уа1 | Уа1 | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | Ьеи |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Рго | С1у | ТЬг | С1и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | ν31 | Зег | Зег | Уа1 | Туг | С1и | б1п |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| Нхз | С1и | Зег | ТЬг | Рго | Ьеи | Агд | 61у | Агд | С1п | Ьуз | ТЬг | 61у | Ьеи | Азр |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||
| Зег | Рго | ТЫ | 61у | 11е | Азр | РЬе | Зег | Азр | Не | ТЬг | А1а | Азп | Зег | РЬе |
| 95 | 100 | 105 | ||||||||||||
| ТЫ | Уа1 | ΗΪ3 | Тгр | Не | А1а | Рго | Агд | А1а | ТЬг | Не | ТЬг | б1у | Туг | Агд |
| 110 | 115 | 120 | ||||||||||||
| Не | Агд | ΗΪ3 | Ηί з | Рго | 01и | Н1з | РЬе | Зег | С1у | Агд | Рго | Агд | С1и | Азр |
| 125 | 130 | 135 | ||||||||||||
| Агд | Уа1 | Рго | Низ | Зег | Агд | Азп | Зег | 11е | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | ТЫ |
| 140 | 145 | 150 | ||||||||||||
| Рго | С1у | ТЬг | 01 и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | 11е | Уа1 | А1а | Ьеи | Азп | С1у | Агд |
| 155 | 160 | 165 | ||||||||||||
| 61и | С1и | Зег | Рго | Ьеи | Ьеи | Не | С1у | 01п | 01п | Зег | ТЬг | Уа1 | Зег | Азр |
| 170 | 175 | 180 | ||||||||||||
| Уа1 | Рго | Агд | Азр | Ьеи | С1и | Уа1 | Уа1 | А1а | А1а | ТЬг | Рго | ТЬг | Зег | Ьеи |
| 135 | 190 | 195 | ||||||||||||
| Ьеи | Не | Зег | Тгр | Азр | А1а | Рго | А1а | Уа1 | ТЬг | Уа1 | Агд | Туг | Туг | Агд |
| 200 | 205 | 210 | ||||||||||||
| 11е | ТЬг | Туг | С1у | С1и | ТЬг | 01у | 61у | Азп | Зег | Рго | Уа1 | С1п | С1и | РЬе |
| 215 | 220 | 225 | ||||||||||||
| ТЬг | Уа1 | Рго | 01у | Зег | Ьуз | Зег | ТЬг | А1а | ТЬг | Не | Зег | С1у | Ьеи | Ьуз |
| 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Рго | 01 у | Уа1 | Азр | Туг | ТЬг | Не | ТЬг | Уа1 | Туг | А1а | Уа1 | ТЬг | С1у | Агд |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||
| С1у | Азр | Зег | Рго | А1а | Зег | Зег | Ьуз | Рго | Не | Зег | Не | Азп | Туг | Агд |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||
| ТЬг | С1и | 11е | Азр | Ьуз | Рго | Зег | МеЬ | Азп | Уа1 | Зег | Рго | Рго | Агд | Агд |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||
| А1а | Агд | Уа1 | ТЬг | Азр | А1а | ТЫ | 61и | ТЬг | ТЫ | Не | ТЬг | Не | Зег | Тгр |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||
| Агд | ТЬг | Ьуз | ТЬг | С1и | ТЬг | Не | ТЫ | С1у | РЬе | С1п | Уа1 | Азр | А1а | Уа1 |
- 48 010434
| 305 | 310 | 345 | ||||||||||||
| Рго | АЬа | Азп | СЬу | СЬп | ТЬг | Рго | Ые | СЬп | Агд | ТЬг | ЬЬе | Ьуз | Рго | Азр |
| 320 | 325 | 330 | ||||||||||||
| Уа1 | Агд | Зег | Туг | ТЬг | Ые | ТЬг | С1у | Ьеи | СЬп | Рго | СЬу | ТЬг | Азр | Туг |
| 335 | 340 | 345 | ||||||||||||
| Ьуз | ЬЬе | Туг | Ьеи | Туг | ТЬг | Ьеи | Азп | Азр | Азп | АЬа | Агд | Зег | Зег | Рго |
| 350 | 355 | 360 | ||||||||||||
| Уа1 | УаЬ | Ые | Азр | АЬа | Зег | ТЬг | АЬа | ЬЬе | Азр | АЬа | Рго | Зег | Азп | Ьеи |
| 365 | 370 | 375 | ||||||||||||
| Агд | РЬе | Ьеи | АЬа | ТЬг | ТЬг | Рго | Азп | Зег | Ьеи | Ьеи | УаЬ | Зег | Тгр | СЬп |
| 380 | 385 | 390 | ||||||||||||
| Рго | Рго | Агд | АЬа | Агд | Ые | ТЬг | СЬу | Туг | ЬЬе | ЬЬе | Ьуз | Туг | СЬи | Ьуз |
| 395 | 400 | 405 | ||||||||||||
| Рго | СЬу | Зег | Рго | Рго | Агд | СЬи | УаЬ | УаЬ | Рго | Агд | Рго | Агд | Рго | СЬу |
| 410 | 445 | 420 | ||||||||||||
| Уа1 | ТЬг | СЬи | АЬа | ТЬг | Ые | ТЬг | СЬу | Ьеи | СЬи | Рго | СЬу | ТЬг | СЬи | Туг |
| 425 | 430 | 435 | ||||||||||||
| ТЬг | ЬЬе | Туг | УаЬ | Ые | АЬа | Ьеи | Ьуз | Азп | Азп | С1п | Ьуз | Зег | СЬи | Рго |
| 440 | 445 | 450 | ||||||||||||
| Ьеи | ЬЬе | СЬу | Агд | Ьуз | Ьуз | ТЬг | ||||||||
| 455 |
<210> 19 <211> 459 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> фрагмент фибронектина, называемый СНУ-181 <400> 18
| Рго 1 | ТЬг | Азр | Ьеи Агд 5 | РЬе ТЬг Азп | Ые | СЬу Рго 10 | Азр ТЬГ | Меб | Агд 15 | |||||
| УаЬ | ТЬг | Тгр | АЬа | Рго | Рго | Рго | Зег | Ые | Азр | Ьеи | ТЬг | Азп | РЬе | Ьеи |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| УаЬ | Агд | Туг | Зег | Рго | УаЬ | Ьуз | Азп | СЬи | СЬи | Азр | УаЬ | АЬа | СЬи | Ьеи |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Зег | Ые | Зег | Рго | Зег | Азр | Азп | АЬа | УаЬ | УаЬ | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | Ьеи |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Рго | СЬу | ТЬг | СЬи | Туг | УаЬ | УаЬ | Зег | УаЬ | Зег | Зег | УаЬ | Туг | СЬи | СЬп |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| НЬз | СЬи | Зег | ТЬг | Рго | Ьеи | Агд | СЬу | Агд | СЬп | Ьуз | ТЬг | СЬу | Ьеи | Азр |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||
| Зег | Рго | ТЬг | СЬу | Ые | Азр | РЬе | Зег | Азр | Ые | ТЬг | АЬа | Азп | Зег | РЬе |
| 95 | 100 | 105 | ||||||||||||
| ТЬг | Уа1 | НЬз | Тгр | Ые | АЬа | Рго | Агд | АЬа | ТЬг | Ые | ТЬг | СЬу | Туг | Агд |
| ыо | 115 | 120 | ||||||||||||
| Ые | Агд | НЬз | НЬз | Рго | СЬи | НЬз | РЬе | Зег | СЬу | Агд | Рго | Агд | СЬи | Азр |
| 125 | 130 | 135 | ||||||||||||
| Агд | УаЬ | Рго | НЬз | Зег | Агд | Азп | Зег | Ые | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | ТЬг |
| 140 | 145 | 150 | ||||||||||||
| Рго | СЬу | ТЬг | СЬи | Туг | УаЬ | УаЬ | Зег | Ые | УаЬ | АЬа | Ьеи | Азп | СЬу | Агд |
| 155 | 160 | 165 | ||||||||||||
| СЬи | СЬи | Зег | Рго | Ьеи | Ьеи | Ые | С1у | СЬп | СЬп | Зег | ТЬг | УаЬ | Зег | Азр |
| 170 | 175 | 180 | ||||||||||||
| УаЬ | Рго | Агд | Азр | Ьеи | СЬи | УаЬ | УаЬ | АЬа | АЬа | ТЬг | Рго | ТЬг | Зег | Ьеи |
| 185 | 190 | 195 | ||||||||||||
| Ьеи | ЬЬе | Зег | Тгр | Азр | АЬа | Рго | АЬа | Уа1 | ТЬг | УаЬ | Агд | Туг | Туг | Агд |
| 200 | 205 | 210 | ||||||||||||
| ЬЬе | ТЬг | Туг | СЬу | СЬи | ТЬг | СЬу | СЬу | Азп | Зег | Рго | Уа1 | СЬп | СЬи | РЬе |
| 215 | 220 | 225 | ||||||||||||
| ТЬг | УаЬ | Рго | СЬу | Зег | Ьуз | Зег | ТЬг | АЬа | ТЬг | Ые | Зег | СЬу | Ьеи | Ьуз |
| 230 | 235 | 240 |
- 49 010434
| Рго | 61у | УаЬ | Азр | Туг 245 | ТЬг | Ие ТЬг Уа1 | Туг 250 | АЬа | Уа1 | ТЬг | 61 у | Агд 255 |
| 31 у | Азр | Зег | Рго | АЬа | Зег | Зег Ьуз Рго | Ие | Зег | Ие | Азп | Туг | Агд |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||
| ТЬг | ОЬи | Ие | Азр | Ьуз | Рго | Зег Мек А1а | Ие | Рго | АЬа | Рго | ТЬг | Азр |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||
| Ьеи | Ьуз | РЬе | ТЬг | 31п | УаЬ | ТЬг Рго ТЬг | Зег | Ьеи | Зег | А1а | СЬп | Тгр |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||
| ТЬг | Рго | Рго | Азп | УаЬ | ОЬп | Ьеи ТЬг 31у | Туг | Агд | Уа1 | Агд | УаЬ | ТЬг |
| 305 | 310 | 315 | ||||||||||
| Рго | Ьуз | 61и | Ьуз | ТЬг | 61у | Рго Мек Ьуз | С1и | Ие | Азп | Ьеи | А1а | Рго |
| 320 | 325 | 330 | ||||||||||
| Азр | Зег | Зег | Зег | Уа1 | Уа1 | УаЬ Зег 61у | Ьеи | Мек | УаЬ | АЬа | ТЬг | Ьуз |
| 335 | 340 | 345 | ||||||||||
| Туг | ОЬи | УаЬ | Зег | УаЬ | Туг | А1а Ьеи Ьуз | Азр | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Зег | Агд |
| 350 | 355 | 360 | ||||||||||
| Рго | АЬа | 31 η | СЬу | УаЬ | УаЬ | ТЬг ТЬг Ьеи | СЬи | Азп | Уа1 | Зег | Рго | Рго |
| 365 | 370 | 375 | ||||||||||
| Агд | Агд | А1а | Агд | УаЬ | ТЬг | Азр А1а ТЬг | 61и | ТЬг | ТЬг | Ие | ТЬг | Ие |
| 380 | 385 | 390 | ||||||||||
| Зег | Тгр | Агд | ТЬг | Ьуз | ТЬг | О1и ТЬг Ие | ТЬг | С1у | РЬе | ОЬп | УаЬ | Азр |
| 395 | 400 | 405 | ||||||||||
| АЬа | Уа1 | Рго | А1а | Азп | 31у | С1п ТЬг Рго | Ие | С1п | Агд | ТЬг | Ие | Ьуз |
| 410 | 415 | 420 | ||||||||||
| Рго | Азр | УаЬ | Агд | Зег | Туг | ТЬг Ие ТЬг | 6Ьу | Ьеи | ОЬп | Рго | 61у | ТЬг |
| 425 | 430 | 435 | ||||||||||
| Азр | Туг | Ьуз | Ие | Туг | Ьеи | Туг ТЬг Ьеи | Азп | Азр | Азп | А1а | Агд | Зег |
| 440 | 445 | 450 | ||||||||||
| Зег | Рго | Уа1 | УаЬ | Ие | Азр | АЬа Зег ТЬг | ||||||
| 455 |
<210> 19 <211> 276 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> фрагмент фибронектина, называемый Η-275-Суз <400> 19
| Меб 1 | А1а | А1а | Зег | АЬа 5 | Ие | Рго | АЬа | Рго ТЬг 10 | Азр Ьеи | Ьуз | РЬе | ТЬг 15 | ||
| 61п | Уа1 | ТЬг | Рго | ТЬг | Зег | Ьеи | Зег | АЬа | 61п | Тгр | ТЬг | Рго | Рго | Азп |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| УаЬ | 61п | Ьеи | ТЬг | 61у | Туг | Агд | УаЬ | Агд | УаЬ | ТЬг | Рго | Ьуз | ОЬи | Ьуз |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| ТЬг | 61 у | Рго | Мек | Ьуз | 61и | Ие | Азп | Ьеи | АЬа | Рго | Азр | Зег | Зег | Зег |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| УаЬ | Уа1 | УаЬ | Зег | 61 у | Ьеи | Мек | УаЬ | А1а | ТЬг | Ьуз | Туг | С1и | УаЬ | Зег |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| УаЬ | Туг | АЬа | Ьеи | Ьуз | Азр | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Зег | Агд | Рго | АЬа | 61п | 01у |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||
| УаЬ | УаЬ | ты | ТЬг | Ьеи | 01 и | Азп | УаЬ | Зег | Рго | Рго | Агд | Агд | АЬа | Агд |
| 95 | 100 | 105 | ||||||||||||
| УаЬ | ТЬг | Азр | А1а | ТЬг | 61 и | ТЬг | ТЬг | Ие | ТЬг | Ие | Зег | Тгр | Агд | ТЬг |
| 110 | 115 | 120 | ||||||||||||
| Ьуз | ТЬг | СЬи | ты | Ие | ТЬг | СЬу | РЬе | СЬп | УаЬ | Азр | АЬа | УаЬ | Рго | АЬа |
| 125 | 130 | 135 | ||||||||||||
| Азп | СЬу | СЬп | ТЬг | Рго | Ие | СЬп | Агд | ТЬг | Ие | Ьуз | Рго | Азр | УаЬ | Агд |
| 140 | 145 | 150 | ||||||||||||
| Зег | Туг | ТЬг | Ие | ТЬг | СЬу | Ьеи | СЬп | Рго | СЬу | ТЬг | Азр | Туг | Ьуз | Ие |
| 155 | 160 | 165 | ||||||||||||
| Туг | Ьеи | Туг | ТЬг | Ьеи | Азп | Азр | Азп | АЬа | Агд | Зег | Зег | Рго | УаЬ | УаЬ |
- 50 010434
| 170 | 175 | 180 | ||||||||||||
| Не | Азр | А1а | Зег | ТЬг | АЬа | Не | Азр | АЬа | Рго | 5ег | Азп | Ьеи | Агд | РЬе |
| 185 | 190 | 195 | ||||||||||||
| Ьеи | А1а | ТЬг | ТНг | Рго | Азп | Зег | Ьеи | Ьеи | УаЬ | 5ег | Тгр | СЬп | Рго | Рго |
| 200 | 205 | 210 | ||||||||||||
| Агд | А1а | Агд | Не | ТЬг | С1у | Туг | Не | Не | Ьуз | Туг | СЬи | Ьуз | Рго | С1у |
| 215 | 220 | 225 | ||||||||||||
| Зег | Рго | Рго | Агд | СЬи | Уа1 | УаЬ | Рго | Агд | Рго | Агд | Рго | СЬу | УаЬ | ТЬг |
| 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| С1и | А1а | ТЬг | 11е | ТЬг | СЬу | Ьеи | СЬи | Рго | СЬу | ТЬг | СЬи | Туг | ТЬг | 11е |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||
| Туг | Уа1 | 11е | АЬа | Ьеи | Ьуз | Азп | Азп | СЬп | Ьуз | Зег | СЬи | Рго | Ьеи | 11е |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||
| С1у | Агд | Ьуз | Ьуз | ТЬг | Суз |
275 <210> 20 <211> 38 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер 123 <400> 20 ааассабддс адсбадсдсб аЬЬссбдсас саасбдас 38 <210> 21 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер 14А <400> 21 аааддабссс ЬаасЬадбсб ЬСЬСссЬг. со ааЬсад Г@36 <210> 22 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер Суз-А <400> 22
| аааадсддсс дсбадсдсаа | дссаьддбсь | дЬЬЬссЬдЬд | 40 | |
| <210> | 23 | |||
| <211> | 41 | |||
| <212> | ДНК | |||
| <213> | Искусственная последовательность | |||
| <220> | ||||
| <223> | праймер Суз-З | |||
| <4 00> | 23 | |||
| аааадсддсс дсасбадбдс | абадддаЬсс | ддсЬдадсаа с | 41 |
<210> 24 <211> 9 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Пептид, сконструированный на основе матричного белка, полученного из вируса гриппа <400> 24
С1у Не Ьеи С1у РЬе Уа1 РЬе ТЬг Ьеи
5
- 51 010434
Claims (31)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ получения цитотоксических лимфоцитов, предусматривающий проведение по меньшей мере одной из стадий - индукции, поддержания и экспансии в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси, причем полученные цитотоксические лимфоциты отличаются повышенной экспрессией рецептора интерлейкина-2 по сравнению с цитотоксическими лимфоцитами, полученными в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси.
- 2. Способ получения цитотоксических лимфоцитов, предусматривающий проведение по меньшей мере одной из стадий - индукции, поддержания и экспансии в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси, причем полученные цитотоксические лимфоциты содержат больший процент СЭ8положительных клеток по сравнению с цитотоксическими лимфоцитами, полученными в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси.
- 3. Способ получения цитотоксических лимфоцитов, предусматривающий проведение по меньшей мере одной из стадий - индукции, поддержания и экспансии в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси, причем полученные лимфоциты обладают более высокой цитотоксической активностью по сравнению с таковой лимфоцитов, полученных в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси.
- 4. Способ получения цитотоксических лимфоцитов, предусматривающий проведение по меньшей мере одной из стадий - индукции, поддержания и экспансии в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси, причем полученные цитотоксические лимфоциты обладают более высокой кратностью экспансии по сравнению с таковой цитотоксических лимфоцитов, полученных в отсутствие фибронектина, его фрагментов или их смеси.
- 5. Способ по любому из пп.1-4, согласно которому фибронектин, его фрагмент или их смесь иммобилизированы на твердой фазе.
- 6. Способ по п.5, согласно которому твердой фазой является приспособление для клеточной культуры или носитель в клеточной культуре.
- 7. Способ по п.6, согласно которому приспособлением для клеточной культуры является чашка Петри, колба или мешок, а носителем в клеточной культуре являются бусы, мембрана или покровное стекло.
- 8. Способ по любому из пп.1-4, согласно которому по меньшей мере одну из стадий - индукцию, поддержание и экспансию цитотоксических лимфоцитов проводят в культуральной среде, содержащей фибронектин, его фрагмент или их смесь.
- 9. Способ по любому из пп.1-8, согласно которому фрагмент фибронектина представляет собой полипептид, содержащий по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, представленных последовательностями ЗЕР ΙΌ N0: 1-7, или полипептид с заменой, делецией, вставкой или добавлением одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности указанного полипептида, обладающий теми же самыми свойствами, что и исходный полипептид.
- 10. Способ по п.9, согласно которому фрагмент фибронектина обладает активностью клеточной адгезии и/или гепаринсвязывающей активностью.
- 11. Способ по п.9, согласно которому фрагментом фибронектина является полипептид, содержащий любую из аминокислотных последовательностей, представленных последовательностями ЗЕр ΙΌ N0: 819.
- 12. Цитотоксические лимфоциты, полученные способом по любому из пп.1-11.
- 13. Лекарственное средство для адаптивной иммунотерапии, содержащее в качестве действующего компонента цитотоксические лимфоциты, полученные способом по любому из пп.1-11.
- 14. Применение фибронектина, его фрагмента или их смеси в качестве действующего начала для усиления экспрессии рецептора интерлейкина-2 цитотоксическими лимфоцитами.
- 15. Применение по п.14, где фрагмент фибронектина представляет собой полипептид, содержащий по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, представленных последовательностями ЗЕр ΙΌ N0: 1-7, или полипептид с заменой, делецией, вставкой или добавлением одной или более аминокислот в аминокислотную последовательность указанного полипептида, обладающий теми же самыми свойствами, что и исходный полипептид.
- 16. Применение по п.15, где фрагмент фибронектина обладает активностью клеточной адгезии и/или гепаринсвязывающей активностью.
- 17. Применение по п.15, где фрагмент фибронектина представляет собой полипептид, содержащий любую из аминокислотных последовательностей, представленных последовательностями ЗЕр ΙΌ N0: 819.
- 18. Применение фибронектина, его фрагмента или их смеси в качестве действующего начала для повышения процента СЭ8-положительных клеток в популяции культивируемых цитотоксических лимфоцитов.
- 19. Применение по п.18, где фрагмент фибронектина представляет собой полипептид, содержащий по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, представленных последовательностями- 52 0104348ЕЦ ΙΌ N0: 1-7, или полипептид с заменой, делецией, вставкой или добавлением одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности указанного полипептида, обладающий теми же самыми свойствами, что и исходный полипептид.
- 20. Применение по п.19, где фрагмент фибронектина обладает активностью клеточной адгезии и/или гепаринсвязывающей активностью.
- 21. Применение по п.19, где фрагмент фибронектина представляет собой полипептид, содержащий любую из аминокислотных последовательностей, представленных в 8ЕЦ ΙΌ N0: 8-19.
- 22. Применение фибронектина, его фрагмента или их смеси в качестве действующего начала для повышения цитотоксической активности культивируемых лимфоцитов.
- 23. Применение по п.22, где фрагмент фибронектина представляет собой полипептид, содержащий по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, представленных последовательностями 8ЕЦ ΙΌ N0: 1-7, или полипептид с заменой, делецией, вставкой или добавлением одной или более аминокислот в аминокислотную последовательность указанного полипептида, обладающий теми же самыми свойствами, что и исходный полипептид.
- 24. Применение по п.23, где фрагмент фибронектина обладает активностью клеточной адгезии и/или гепаринсвязывающей активностью.
- 25. Применение по п. 23, где фрагмент фибронектина представляет собой полипептид, содержащий любую из аминокислотных последовательностей, представленных последовательностями 8ЕЦ ΙΌ N0: 819.
- 26. Способ повышения экспрессии рецептора интерлейкина-2 цитотоксическими лимфоцитами, характеризующийся тем, что осуществляют по меньшей мере одну из стадий - индукции, поддержания и экспансии в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси, причем экспрессия рецептора интерлейкина-2 цитотоксическими лимфоцитами повышена по сравнению с экспрессией цитотоксическими лимфоцитами, полученными в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси.
- 27. Способ повышения процента СО8-положительных клеток в популяции культивируемых цитотоксических лимфоцитов, характеризующийся тем, что осуществляют по меньшей мере одну из стадий индукции, поддержания и экспансии в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси, причем доля СО8-положительных клеток в популяции культивируемых лимфоцитов повышена по сравнению с таковой лимфоцитов, полученных в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси.
- 28. Способ повышения цитотоксической активности лимфоцитов, характеризующийся тем, что осуществляют по меньшей мере одну из стадий - индукции, поддержания и экспансии в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси, причем цитотоксическая активность лимфоцитов повышена по сравнению с таковой лимфоцитов, полученных в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси.
- 29. Способ по любому из пп.1-11, дополнительно предусматривающий стадию трансдукции чужеродного гена в цитотоксические лимфоциты.
- 30. Способ по п.29, согласно которому указанный чужеродный ген трансдуцируют, используя ретровирус, аденовирус, аденоассоциированный вирус.
- 31. Способ по п.30, согласно которому указанный вирус является вирусом обезьян.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002084414 | 2002-03-25 | ||
| PCT/JP2003/003575 WO2003080817A1 (en) | 2002-03-25 | 2003-03-25 | Process for producing cytotoxic lymphocyte |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200401242A1 EA200401242A1 (ru) | 2005-04-28 |
| EA010434B1 true EA010434B1 (ru) | 2008-08-29 |
Family
ID=28449211
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200401242A EA010434B1 (ru) | 2002-03-25 | 2003-03-25 | Способ получения цитотоксических лимфоцитов |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US8728811B2 (ru) |
| EP (3) | EP2305796B1 (ru) |
| JP (1) | JP4406566B2 (ru) |
| KR (2) | KR100895231B1 (ru) |
| CN (3) | CN100591760C (ru) |
| AT (1) | ATE491021T1 (ru) |
| AU (2) | AU2003221073B2 (ru) |
| CA (1) | CA2479288C (ru) |
| DE (1) | DE60335253D1 (ru) |
| EA (1) | EA010434B1 (ru) |
| ES (3) | ES2356814T3 (ru) |
| HK (2) | HK1079543A1 (ru) |
| MX (1) | MXPA04009287A (ru) |
| TW (2) | TWI334442B (ru) |
| WO (1) | WO2003080817A1 (ru) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE60232083D1 (de) | 2001-08-15 | 2009-06-04 | Takara Bio Inc | Expansionskulturverfahren für antigenspezifische zytotoxische t-lymphozyten |
| WO2003080817A1 (en) | 2002-03-25 | 2003-10-02 | Takara Bio Inc. | Process for producing cytotoxic lymphocyte |
| KR20060039940A (ko) * | 2003-08-22 | 2006-05-09 | 다카라 바이오 가부시키가이샤 | 세포 상해성 림프구의 제조 방법 |
| GB0409775D0 (en) * | 2004-04-30 | 2004-06-09 | Mabtech Ab | Assay |
| JP4929174B2 (ja) * | 2005-08-17 | 2012-05-09 | タカラバイオ株式会社 | リンパ球の製造方法 |
| JP4741906B2 (ja) * | 2005-08-31 | 2011-08-10 | タカラバイオ株式会社 | リンパ球の製造方法 |
| CA2623735A1 (en) * | 2005-09-30 | 2007-04-12 | Takara Bio Inc. | Method for production of t cell population |
| JPWO2007142300A1 (ja) * | 2006-06-09 | 2009-10-29 | タカラバイオ株式会社 | リンパ球の製造方法 |
| WO2008008435A2 (en) * | 2006-07-14 | 2008-01-17 | Rutgers, The State University | Methods, systems, and compositions for extracellular matrix production |
| WO2008111430A1 (ja) * | 2007-03-09 | 2008-09-18 | Takara Bio Inc. | γδＴ細胞集団の製造方法 |
| JPWO2008143014A1 (ja) * | 2007-05-11 | 2010-08-05 | タカラバイオ株式会社 | がん治療剤 |
| US8470966B2 (en) * | 2007-08-10 | 2013-06-25 | Protelica, Inc. | Universal fibronectin type III binding-domain libraries |
| WO2009119793A1 (ja) | 2008-03-27 | 2009-10-01 | タカラバイオ株式会社 | 遺伝子導入細胞の製造方法 |
| US20120142109A1 (en) | 2009-08-25 | 2012-06-07 | Yoshinori Katayama | Method for producing t cell population under presence of retinoic acid |
| CN102597223B (zh) | 2009-09-11 | 2017-05-10 | 宝生物工程株式会社 | 生产天然杀伤细胞的方法 |
| CN102762719A (zh) * | 2009-12-08 | 2012-10-31 | 威尔森沃尔夫制造公司 | 用于过继细胞疗法的细胞培养的改进方法 |
| US8956860B2 (en) | 2009-12-08 | 2015-02-17 | Juan F. Vera | Methods of cell culture for adoptive cell therapy |
| US20140154206A1 (en) | 2011-05-19 | 2014-06-05 | Toray Industries, Inc. | Immunity induction agent |
| CN115094036A (zh) | 2016-04-08 | 2022-09-23 | 爱默蕾大学 | 使用基于细胞的疗法治疗癌症和传染病的方法 |
| EP3572502B1 (en) | 2017-01-20 | 2023-01-11 | Kyoto University | Method for producing cd8alpha +beta + cytotoxic t cells |
| EP3744832A4 (en) * | 2018-01-25 | 2021-11-24 | Takara Bio Inc. | LYMPHOCYTE PRODUCTION PROCESS |
| TW202204609A (zh) | 2020-03-31 | 2022-02-01 | 國立大學法人京都大學 | Ｔ前驅細胞的製造方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989001942A1 (en) * | 1987-08-25 | 1989-03-09 | Regents Of The University Of Minnesota | Polypeptides with fibronectin activity |
| JPH04297494A (ja) * | 1991-03-26 | 1992-10-21 | Fuji Photo Film Co Ltd | ペプチド誘導体とその用途 |
| JPH06306096A (ja) * | 1993-02-26 | 1994-11-01 | Fuji Photo Film Co Ltd | ペプチド誘導体及びその用途 |
| JP2001314183A (ja) * | 2000-02-29 | 2001-11-13 | Japan Science & Technology Corp | キラー活性を増強したリンパ球 |
Family Cites Families (51)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8516421D0 (en) | 1985-06-28 | 1985-07-31 | Biotechnology Interface Ltd | Fibronectins |
| DE3788796T2 (de) | 1986-10-20 | 1994-05-05 | Life Technologies Inc | Serumfreies medium zur proliferation von lymphokin-aktivierten töterzellen. |
| JP2561131B2 (ja) * | 1988-06-30 | 1996-12-04 | 寳酒造株式会社 | 細胞接着活性ポリペプチド |
| GB8909916D0 (en) | 1989-04-29 | 1989-06-14 | Delta Biotechnology Ltd | Polypeptides |
| US5198423A (en) | 1989-05-26 | 1993-03-30 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Functional polypeptide containing a cell binding domain and a heparin binding domain of fibronectin |
| GR1001034B (el) | 1989-07-21 | 1993-03-31 | Ortho Pharma Corp | Μεθοδος διεγερσης του πολλαπλασιασμου λεμφοκυτταρων περιφερειακου αιματος. |
| US5188959A (en) * | 1989-09-28 | 1993-02-23 | Trustees Of Tufts College | Extracellular matrix protein adherent t cells |
| JP3104178B2 (ja) | 1990-03-30 | 2000-10-30 | 寶酒造株式会社 | 機能性ポリペプチド |
| JP2729712B2 (ja) | 1991-04-23 | 1998-03-18 | 寳酒造株式会社 | 機能性ポリペプチド |
| JPH07102131B2 (ja) | 1991-07-15 | 1995-11-08 | 日本石油株式会社 | ヒトリンパ球の癌細胞に対する傷害活性を高める方法 |
| JPH06172203A (ja) | 1992-12-02 | 1994-06-21 | Takara Shuzo Co Ltd | フィブロネクチンレセプター産生異常細胞抑制剤 |
| GB9315810D0 (en) | 1993-07-30 | 1993-09-15 | Univ London | Stabilised materials |
| DE4336399A1 (de) | 1993-10-26 | 1995-04-27 | Augustinus Dr Med Bader | Verfahren zur Verbesserung der Matrixbedingungen bipolar adhärierter Hepatozyten und zur Herstellung eines entsprechend konfigurierten Zellkulturkits |
| US6821778B1 (en) * | 1993-12-01 | 2004-11-23 | The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Methods for using dendritic cells to activate gamma/delta-T cell receptor-positive T cells |
| DE4412794A1 (de) * | 1994-04-14 | 1995-12-14 | Univ Ludwigs Albert | Verfahren zur Herstellung von dendritischen Zellen, so erhaltene Zellen und Behälter zur Durchführung dieses Verfahrens |
| GB9413029D0 (en) | 1994-06-29 | 1994-08-17 | Common Services Agency | Stem cell immobilisation |
| US5827642A (en) * | 1994-08-31 | 1998-10-27 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes |
| EP0795606B1 (en) * | 1994-11-29 | 2000-08-16 | Takara Shuzo Co. Ltd. | Process for producing transformed cell |
| WO1996016674A1 (en) | 1994-12-01 | 1996-06-06 | New England Deaconess Hospital Corporation | In vitro t-lymphopoiesis system |
| US7067318B2 (en) * | 1995-06-07 | 2006-06-27 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods for transfecting T cells |
| CA2220226C (en) * | 1995-05-04 | 2008-10-21 | Carl H. June | Improved methods for transfecting t cells |
| US6692964B1 (en) * | 1995-05-04 | 2004-02-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Methods for transfecting T cells |
| JP3391941B2 (ja) | 1995-06-15 | 2003-03-31 | アサヒビール株式会社 | 余剰汚泥の処理方法 |
| WO1997001194A1 (de) | 1995-06-21 | 1997-01-09 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Elektrochemisches festelektrolyt-zellsystem |
| JPH0925299A (ja) | 1995-07-13 | 1997-01-28 | Sumitomo Electric Ind Ltd | Ｃｄ４４リガンド |
| EP0852618A1 (en) | 1995-07-25 | 1998-07-15 | Celltherapy Inc. | Autologous immune cell therapy: cell compositions, methods and applications to treatment of human disease |
| DE19537494C2 (de) | 1995-09-25 | 1997-10-02 | Desitin Arzneimittel Gmbh | Kreatin zum Schutz von neuralem Gewebe |
| EP0873049B1 (en) | 1995-09-29 | 2006-05-10 | Indiana University Research and Technology Corporation | Methods for enhanced virus-mediated dna transfer using molecules with virus- and cell-binding domains |
| US6472204B1 (en) | 1995-11-13 | 2002-10-29 | Kiyozo Asada | Methods for retroviral mediated gene transfer employing molecules, or mixtures thereof, containing retroviral binding domains and target cell binding domains |
| US6734014B1 (en) * | 1996-02-08 | 2004-05-11 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Methods and compositions for transforming dendritic cells and activating T cells |
| ATE476496T1 (de) * | 1996-03-04 | 2010-08-15 | Calyx Bio Ventures Inc | Modifizierte schnellvermehrungsmethode ('modified-rem') zur in vitro vermehrung von t-lymphozyten |
| CA2247131A1 (en) | 1996-03-04 | 1997-09-12 | Targeted Genetics Corporation | Modified rapid expansion methods ("modified-rem") for in vitro propagation of t lymphocytes |
| JPH1029952A (ja) | 1996-07-16 | 1998-02-03 | Takara Shuzo Co Ltd | ヒト免疫不全ウイルス感染の制御用組成物および制御方法 |
| IL129094A0 (en) | 1996-09-23 | 2000-02-17 | Ontogeny Inc | Hematopoietic stem cells and methods for generating such cells |
| EP1012238A4 (en) | 1997-01-31 | 2003-03-05 | Epimmune Inc | CELLS WITH PEPTIDES OR ANTIGENS WITH PEPTIDES |
| JP3591286B2 (ja) | 1997-04-24 | 2004-11-17 | セイコーエプソン株式会社 | タイミング調整方法、印字装置及び調整パターン作成方法 |
| TWI239352B (en) * | 1997-07-23 | 2005-09-11 | Takara Bio Inc | Gene transfer method with the use of serum-free medium |
| EP1042360A2 (en) | 1997-12-24 | 2000-10-11 | Corixa Corporation | Compounds for immunotherapy and diagnosis of breast cancer and methods for their use |
| EP1047708B1 (en) | 1997-12-24 | 2007-09-26 | Bracco International B.V. | Peptide chelators that predominately form a single stereoisomeric species upon coordination to a metal center |
| AU8780198A (en) | 1998-08-11 | 2000-03-06 | United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, The | A method of transducing mammalian cells, and products related thereto |
| CN1225285C (zh) * | 1999-03-23 | 2005-11-02 | 宝生物工程株式会社 | 基因治疗剂 |
| US6797514B2 (en) * | 2000-02-24 | 2004-09-28 | Xcyte Therapies, Inc. | Simultaneous stimulation and concentration of cells |
| JP2004500095A (ja) | 2000-02-24 | 2004-01-08 | エクサイト セラピーズ， インコーポレイテッド | 細胞の同時の刺激および濃縮 |
| AU2001278734A1 (en) * | 2000-08-16 | 2002-02-25 | Takara Bio Inc. | Method of extensive culture of antigen-specific cytotoxic t cells |
| EP1401495A4 (en) * | 2001-06-01 | 2005-11-23 | Xcyte Therapies Inc | T CELL-INDUCED TISSUE PARA- TURE AND REGENERATION |
| DE60232083D1 (de) * | 2001-08-15 | 2009-06-04 | Takara Bio Inc | Expansionskulturverfahren für antigenspezifische zytotoxische t-lymphozyten |
| JP4759890B2 (ja) | 2001-09-12 | 2011-08-31 | 大日本印刷株式会社 | パール調印刷物の印刷濃度管理方法 |
| US7745140B2 (en) * | 2002-01-03 | 2010-06-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool |
| WO2003080817A1 (en) | 2002-03-25 | 2003-10-02 | Takara Bio Inc. | Process for producing cytotoxic lymphocyte |
| JP4406607B2 (ja) | 2002-08-26 | 2010-02-03 | オンコセラピー・サイエンス株式会社 | ペプチド及びこれを含む医薬 |
| KR20060039940A (ko) | 2003-08-22 | 2006-05-09 | 다카라 바이오 가부시키가이샤 | 세포 상해성 림프구의 제조 방법 |
-
2003
- 2003-03-25 WO PCT/JP2003/003575 patent/WO2003080817A1/ja active Application Filing
- 2003-03-25 CN CN03811464A patent/CN100591760C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-25 EA EA200401242A patent/EA010434B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2003-03-25 MX MXPA04009287A patent/MXPA04009287A/es active IP Right Grant
- 2003-03-25 TW TW092106632A patent/TWI334442B/zh not_active IP Right Cessation
- 2003-03-25 CN CN2011102215061A patent/CN102321579A/zh active Pending
- 2003-03-25 ES ES03712887T patent/ES2356814T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-25 KR KR1020067027270A patent/KR100895231B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2003-03-25 AU AU2003221073A patent/AU2003221073B2/en not_active Ceased
- 2003-03-25 EP EP10184353A patent/EP2305796B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-25 DE DE60335253T patent/DE60335253D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-25 AT AT03712887T patent/ATE491021T1/de not_active IP Right Cessation
- 2003-03-25 US US10/509,055 patent/US8728811B2/en active Active
- 2003-03-25 EP EP03712887A patent/EP1496109B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-25 ES ES10184353T patent/ES2397319T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-25 ES ES10185168T patent/ES2396447T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-25 EP EP10185168A patent/EP2305793B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-25 CN CN2009102171437A patent/CN101735981B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-03-25 TW TW099128980A patent/TW201043699A/zh unknown
- 2003-03-25 JP JP2003578546A patent/JP4406566B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-25 KR KR1020047014928A patent/KR100786054B1/ko active IP Right Grant
- 2003-03-25 CA CA2479288A patent/CA2479288C/en not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-12-12 HK HK05111402.4A patent/HK1079543A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-07-31 US US11/831,423 patent/US20080227204A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-11-12 AU AU2008243221A patent/AU2008243221B2/en not_active Ceased
-
2010
- 2010-11-15 HK HK10110610.7A patent/HK1144105A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2014
- 2014-04-10 US US14/250,227 patent/US8975070B2/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989001942A1 (en) * | 1987-08-25 | 1989-03-09 | Regents Of The University Of Minnesota | Polypeptides with fibronectin activity |
| JPH04297494A (ja) * | 1991-03-26 | 1992-10-21 | Fuji Photo Film Co Ltd | ペプチド誘導体とその用途 |
| JPH06306096A (ja) * | 1993-02-26 | 1994-11-01 | Fuji Photo Film Co Ltd | ペプチド誘導体及びその用途 |
| JP2001314183A (ja) * | 2000-02-29 | 2001-11-13 | Japan Science & Technology Corp | キラー活性を増強したリンパ球 |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA010434B1 (ru) | Способ получения цитотоксических лимфоцитов | |
| AU2006298188B2 (en) | Method for production of T cell population | |
| KR101279172B1 (ko) | 림프구의 제조 방법 | |
| EP3730515B1 (en) | A fully-human t cell receptor specific for the 369-377 epitope derived from the her2/neu (erbb2) receptor protein | |
| US8927273B2 (en) | Process for producing cytotoxic lymphocytes | |
| US8216837B2 (en) | Method of producing lymphocytes | |
| JP4741906B2 (ja) | リンパ球の製造方法 | |
| JPWO2008143255A1 (ja) | 細胞集団の製造方法 | |
| MX2008004225A (es) | Metodo para la produccion de una poblacion de celulas t |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |